ELISA‐VIDITEST anti‐VCA EBV IgG a avidita IgG OD-095
Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: +420 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-VCA EBV IgG a avidita IgG - ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgG proti kapsidovému antigenu (VCA) viru Epsteina a Barrové (EBV) v séru (plazmě) a pro určení avidity IgG protilátek. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo asociovaných s EBV jako jsou infekční mononukleóza a chronická aktivní EBV infekce. Test se používá též při diagnostice Burkittova lymfomu, nasofaryngeálního karcinomu, karcinomů Waldayerova okruhu a k charakterizaci oportunních (oligo- nebo polyklonálních) lymfomů. Najde uplatnění při komplexní charakterizaci chronického únavového syndromu a řady imunodeficientních stavů, kde bývá EBV často aktivován. Soupravu lze také použít pro rozlišení primární a rekurentní infekce VCA EBV: Po primární infekci vytváří organismus převážně IgG protilátky s nízkou aviditou (vazebnou schopností) k virovým antigenům. Později začnou v důsledku selekce antigenem převládat protilátky s vysokou aviditou. Převaha nízkoavidních IgG protilátek (nízký relativní index avidity RAI) tedy svědčí o recentní primární infekci, kdežto jedinci s převahou vysokoavidních protilátek prodělali primární infekci v minulosti, a mají-li v současné době známky aktivní infekce VCA EBV, jedná se u nich o reaktivaci infekce. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-VCA EBV IgG a avidita IgG je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický antigen, který reprezentuje imunodominantní epitopy VCA komplexu. Jsou-li v testovaných sérech příslušné protilátky, navážou se na imobilizované proteiny. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgG značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. Při stanovení avidity je každé sérum je aplikováno paralelně na dvě jamky, přičemž příslušné protilátky se navážou na imobilizované antigeny. V dalším kroku je pak jedna jamka inkubována s promývacím roztokem, druhá jamka s roztokem močoviny. V první jamce zůstávají na antigen navázány specifické protilátky s vysokou i nízkou aviditou. V druhé jamce dochází vlivem koncentrovaného roztoku močoviny k uvolnění nízkoavidních protilátek a v komplexu s antigenem zůstávají jen protilátky s vysokou aviditou. Poměr mezi optickou denzitou jamky s roztokem močoviny a jamky s promývacím roztokem v procentech vyjadřuje relativní index avidity (RAI). 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku potažené směsí specifických antigenů STRIPS Ag 1,3 mL pozitivního kontrolního séra obsahujícího protilátky s vysokou aviditou (vysokoavidní kontrolní sérum) r.t.u.1) CONTROL HIGH AVID 1,3 mL pozitivního kontrolního séra obsahujícího protilátky s nízkou aviditou (nízkoavidní kontrolní sérum) r.t.u. CONTROL LOW AVID 1
2 x 12 ks 2 lahvičky 2 lahvičky
1,3 mL Standardu A=negativní kontrolní sérum, r.t.u. STA/CTRL1,3 mL Standardu D=Standard 1 (kalibrátor), r.t.u. ST D/ST 1 1,3 mL Standardu E=Standard 2 (pozitivní kontrolní sérum, r.t.u. ST E/ST 2 13 mL protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou (konjugát anti-IgG Px) r.t.u. CONJ 125 mL promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 100 mL ředicího roztoku r.t.u. DIL 13 mL roztoku močoviny r.t.u. UREA 13 mL chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 26 mL stop roztoku r.t.u. STOP Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci)
1 lahvička 2 lahvičky 1 lahvička 2 lahvičky 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 2 lahvičky 1 lahvička
Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISAVIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB-O, TMB-BF. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér a kontrolní séra. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (např. 5 μL séra + 500μL ředicího roztoku). Kontrolní séra (standardy) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte si pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku + 900 ml H2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na 32 až 37oC a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě 2 až 10oC. d. Konjugát anti-IgG Px, chromogensubstrátový roztok TMB, roztok močoviny a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP PRO KVALITATIVNÍ / SEMIKVANTITATIVNÍ STANOVENÍ PROTILÁTEK V SÉRU: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μL standardy a ředěnými testovanými vzorky podle schématu (viz Tab. 1): První jamku naplňte samotným ředicím roztokem DIL pro stanovení pozadí reakce. Dvě jamky naplňte Standardem 1 ST D/ST 1, který slouží jako kalibrátor. Další jamku negativním kontrolním sérem ST A/CTRL- a zbývající jamky ředěnými testovanými séry (S1, S2, …). Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum ST E/ST 2. Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte ST D/ST 1 na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Pro ověření správnosti kalibrace, 2
c.
d.
e. f.
g.
h.
návaznosti a variability testu doporučujeme zahrnout vzorek pozitivního referenčního séra (vaši vnitřní kontrolu) do každého běhu. Inkubujte 30 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μL promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-IgG Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 μL konjugátu anti-IgG Px r.t.u.. Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μL promývacího roztoku (viz bod c.). Odsajte a vyklepněte. Napipetujte do jamek po 100 μL chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (± 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. Zastavte reakci přidáním 100 μL stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm.
Tab. 1: Schéma aplikace vzorků 1 a
DIL
b
ST D/ST 1
c
ST D/ST 1
d
ST A/CTRL-
e
S1
f
S2
g
S3
h
S…
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
8. HODNOCENÍ TESTU: Kvalitativní a semikvantitativní hodnocení lze využít pouze pro stanovení protilátek v séru. Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem DIL (DIL = pozadí reakce) od hodnot kontrolních a testovaných sér. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Standardu 1 ST D/ST 1 ze dvou jamek. Pokud jste Standard 1 aplikovali na tři jamky a některá se liší o více jak 20% od průměru, nepoužívejte ji při výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že průměrnou Standardu 1 vynásobíte korekčním faktorem. Korekční faktor Standardu 1 se určuje pro každou šarži soupravy a je uveden v Certifikátu kontroly kvality pro danou šarži soupravy. 3
3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1. bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného vzorku cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90 - 1,10 +/1,11 - 3,00 + 3,01 - 5,00 ++ 5,01 - 8,00 +++ > 8,00 ++++ Příklad: Získaná OD Standardu 1 Průměrná hodnota OD Standardu 1 OD vzorku séra Korekční faktor Standardu 1 Cut-off hodnota Hodnota indexu
= 1,111; 1,143 = 1,127 = 0,800 = 0,18 = 1,127 x 0,18 = 0,203 = 0,800 / 0,203 = 3,94
Pozn.: Hodnocení +/ znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Ležíli sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 12 týdny později.
9. PRACOVNÍ POSTUP PRO STANOVENÍ AVIDITY IgG PROTILÁTEK: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet odlamovacích stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte jamky na odlamovacích stripech v duplikátech po 100 μL kontrolními séry a ředěnými testovanými séry následujícím způsobem (viz Tab. 2): První jamky stripů č. 1 a 2 naplňte samotným ředicím roztokem DIL pro stanovení pozadí reakce. Další řádek stripů 1 a 2 naplňte vysokoavidním kontrolním sérem CONTROL HIGH AVID a třetí řádek naplňte duplikátem nízkoavidního kontrolního séra CONTROL LOW AVID. Pokud chcete určit pozitivitu či negativitu testovaných sér na VCA IgG, nakapejte v jednom duplikátu také Standard 1 ST D/ST 1. Zbývající jamky naplňte v duplikátech ředěnými testovanými séry (S1, S2, S3, …). Každé sérum stačí aplikovat v jednom duplikátu jamek. Chcete-li vyloučit laboratorní chybu, aplikujte séra na dvě jamky příslušného stripu. Inkubujte 30 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μL promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. f. Napipetujte nejprve 100 μL promývacího roztoku v pracovní koncentraci WASH 1x do každé jamky sudých stripů (tj. strip 2, 4, 6, 8, 10 a 12), a potom 100 μL roztoku močoviny UREA r.t.u. do každé jamky lichých stripů (tj. strip 1, 3, 5, 7, 9 a 11). Inkubujte 10 minut (± 5 sec.) při laboratorní teplotě. 4
g. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μL promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. h. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-IgG Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 μL konjugátu anti-IgG Px r.t.u. Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě. i. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μL promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. j. Napipetujte do všech jamek po 100 μL chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (± 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. k. Zastavte reakci přidáním 100 μL stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. l. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimertu při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. Tab. 2: Schéma aplikace vzorků pro stanovení avidity IgG protilátek strip č. A B C D
UREA WASH 1 2 DIL DIL CONTROL CONTROL HIGH AVID HIGH AVID CONTROL CONTROL LOW AVID LOW AVID ST D/ST 1 ST D/ST 1
E
S1
S1
F
S2
S2
G
S3
S3
H
S4
S4
UREA 3 S5
WASH 4 S5
atd. 5
6
7
8
9
10
11
12
atd.
10. HODNOCENÍ TESTU STANOVENÍ AVIDITY IgG PROTILÁTEK: 10.1. Nejdříve odečtěte absorbance jamek se samotným ředicím roztokem DIL (DIL = pozadí reakce) od hodnot absorbancí kontrolních CONTROL HIGH AVID, CONTROL LOW AVID, příp. Standardu 1 ST D/ST 1 a testovaných sér. Upozornění: Hodnocení avidity protilátek lze provádět pouze u pozitivních sér VCA IgG. Pokud je testované sérum VCA IgG negativní nebo hraniční, nelze u něj relativní index avidity hodnotit. Pro posouzení pozitivity séra stačí využít orientačního hodnocení dle postupu viz. čl. 8.1 kvalitativní orientační hodnocení. 10.2. Pokud používáte dva duplikáty, spočítejte průměrné hodnoty OD kontrolních sér z jamek na stejném stripu. Spočítejte v procentech relativní index avidity RAI tj. poměr mezi optickou denzitou jamek s roztokem močoviny r.t.u. (liché stripy) a jamek s promývacím roztokem (sudé stripy). Obě kontrolní séra CONTROL HIGH AVID, CONTROL LOW AVID slouží jako vnitřní kontrola pro provedení testu a musí být proto zařazeny v každém prováděném testu. 10.3. Stanovte u kontrolních a testovaných sér hodnotu relativního indexu avidity RAI v procentech tak, že hodnotu OD séra s roztokem močoviny vynásobíte číslem 100 a vydělíte hodnotou OD séra s promývacím roztokem: 5
OD séra s roztokem močoviny x 100 OD séra s promývacím roztokem
= relativní index avidity RAI v %
HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota RAI v % Vyhodnocení < 40 % 40 % - 60 % > 60 %
indikace protilátek s nízkou aviditou nerozhodná oblast indikace protilátek s vysokou aviditou
Příklad: Získaná OD kontrolního séra s roztokem močoviny = 1,770; 1,718 Průměrná hodnota OD kontrolního séra s roztokem močoviny = 1,744 Získaná OD kontrolního séra s promývacím roztokem = 1,845; 1,904 Průměrná hodnota OD kontrolního séra s promývacím roztokem = 1,875 Výpočet RAI v % = (1,744 x 100) / 1,875 = 93 % 11. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: VCA IgG
VCA IgM -
VCA IgA -
+ +
+ +
+
+ +
+ +
+ -
+/-
+ -
+ -
+ -
+ -
+
-
+ vysoká avidita
-
+
-
+
-
+ vysoká avidita
+
+
+ +
+ +
-
+ nízká avidita + nízká avidita + nízká → vysoká avidita
EA (D) IgG -
EBNA-1 EBNA-1 Stadium EBV infekce IgG IgM EBV negativní Primární EBV infekce + (časná fáze) + Primární EBV infekce (transientní fáze) Primární EBV infekce (fáze rekonvalescence) Seropozitivní bez známek aktivní EBV infekce Reaktivovaná EBV infekce
Pro vyšetření protilátek proti dalším antigenům nabízí VIDIA spol. s r.o. tyto soupravy: ELISA-VIDITEST anti-EBNA-1 EBV IgG a IgM; ELISA-VIDITEST anti-VCA EBV IgM a IgA; ELISA-VIDITEST anti-EA (D) EBV IgG. Pro konfirmaci výsledků lze použít IF-VIDITEST anti-VCA EBV IgG a IgM; IF-VIDITEST anti-EA EBV (D+R nebo D) IgG.
12. CHARAKTERISTIKY TESTU: 12.1 Platnost testu Hodnota absorbance samotného ředicího roztoku DIL (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,150. Průměrná hodnota absorbance Standardu 1 ST D/ST 1 by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Hodnoty absorbance kontrolních sér by měly být: OD ST A/CTRL- < OD ST D/ST 1 < OD ST E/ST 2 Hodnota RAI pozitivního kontrolního séra obsahujícího protilátky s vysokou aviditou CONTROL HIGH AVID by měla být > 60 %. Hodnota RAI pozitivního kontrolního séra obsahujícího protilátky s nízkou aviditou CONTROL LOW AVID by měla být < 40 %. 6
12.2 Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy – reprodukovatelnosti (interassay) a během testu – opakovatelnosti (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 12.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ±σ CV opak. 14 2,268 0,094 4,1 % 12.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A ±σ min – max CVrepro 10 0,674 0,090 0,567-0,779 13,4% 9 0,832 0,061 0,729-0,927 7,3% 7 1,116 0,069 1,048-1,221 6,2% 12.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 12.3 Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení citlivosti a specifity testu pro detekci IgG protilátek proti VCA bylo provedeno testováním vzorků vybraných z populace, kde byl očekáván pozitivní výsledek na IgG proti VCA EBV ( EBV-IgG-pozitivní krevní dárci, pacienti po infekční mononukleose). Výsledek byl potvrzen nezávislými komerčními IVD testy. Diagnostická citlivost je 98,1%. Specifita testu byla stanovena ze vzorků krevních dárců, kde byl očekáván VCA EBV IgG negativní výsledek (zdraví EBV negativní dárci krve). Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 97,1%. Diagnostická účinnost testu pro stanovení avidity byla ověřena na souborech klinicky definovaných vzorků sér: Skupina vzorků Zdraví séropozitivní jedinci Pacienti s infekční mononukleozou Pacienti se serologickým nálezem reaktivace EBV
Počet vyš.
vysoká
Stanovená avidita hraniční
nízká
Diagnostická účinnost testu
46
40
6
0
100%
41
1
2
38
97,6%
19
15
3
1
94,7%
12.4 Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/mL pro hemoglobin, 5 mg/mL pro bilirubin a 50 mg/mL pro triglyceridy.
7
13. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-HIV1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 °C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin, ...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 14. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. pro séra jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra (standardy), ředicí roztok, roztok močoviny, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti-IgG Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7 a 8. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky, konjugátem nebo roztokem močoviny * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 15. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10°C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28°C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10°C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 8
16. DOPORUČENÁ LITERATURA: Robertson, P., Beynon, S., Whybin, R., Brennan, C., Vollmer-Conna, U., Hickie, I., Lloyd, A.: Measurement of EBV-IgG Anti-VCA Avidity Aids the Early and Reliable Diagnosis of Primary EBV Infection; J. Med. Virol. 2003, 70: 617-623 Woznicová, V.: Avidita imunoglobulinů G u infekčních onemocnění ; Epidemiol. Mikrobiol. Imunol., 2004, 53, 1, s.4-11 Anderson, A., Vetter V., Kreutzer L., Bauer, G.: Avidities of IgG directed against viral capsid antigen or early antigen: useful markers for significant Epstein-Barr virus serology; J.Med. Virol., 1994, 43, s.238-244 Gray, J.J.: Avidity of EBV VCA- specific IgG antibodies: distinction between recent and primary infection, past infection and reactivation; J. Med. Virol., 1995, 52, 1-2, s.95 Votava, M., Bartošová, D., Krchňáková A., Crhová, K., et al: Diagnostic omportance of heterofile antibodies and immunoglobulins IgA, IgE, IgM and low-avidity IgG against Epstein-Barr virus capsid antigen in children. Acta Virol 1996, 40, 2, s.99-101 Weissbrich, B.: The use of semi-automated EBV IgG avidity determination for diagnosis of infectious mononukleosis; J. Med.Virol., 1998, 54, s.145-153
9
17. TESTOVACÍ SCHÉMA: Pozn.: Pokud provádíte test pouze pro stanovení pozitivity IgG protilátek a nikoliv stanovení avidity IgG protilátek, vynechejte Krok 3. Krok 1.
Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění ↓
Krok 2.
Aplikujte 100 μL/ jamku kontrolních a testovaných sér ↓ Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě ↓ 4x promyjte (250 μL/ jamku), vyklepněte ↓
Krok 3.
Aplikujte 100 μL/ jamku promývacího roztoku do sudých stripů (2, 4, 6, 8, 10 a 12) ↓ Aplikujte 100 μL/ jamku močoviny r.t.u. do lichých stripů (1, 3, 5, 7, 9 a 11) ↓ Inkubujte 10 minut (± 5 sec.) při laboratorní teplotě ↓ 4x promyjte (250 μL/ jamku), vyklepněte ↓
Krok 4.
Aplikujte 100 μL/ jamku konjugátu anti-IgG Px r.t.u. ↓ Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě ↓ 4x promyjte (250 μL/ jamku), vyklepněte ↓
Krok 5.
Aplikujte 100 μL/ jamku chromogensubstrátového roztoku TMB ↓ Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě ↓
Krok 6.
Aplikujte 100 μL/ jamku stop roztoku ↓
Krok 7.
Změřte absorbanci při 450/ 620-690 nm do 20 minut
Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu ČR. Datum poslední verze tohoto návodu: 06/2014 10
