ELISA-VIDITEST anti-VCA EBV IgM OD-287 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, www.vidia.cz, tel.: +420 261 090 565 1. NÁZEV SOUPRAVY ELISA-VIDITEST anti-VCA EBV IgM – ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgM proti kapsidovému antigenu (VCA) viru Epstein-Barrové (EBV). 2. POUŽITÍ Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo asociovaných s EBV jako jsou infekční mononukleóza a chronická aktivní EBV infekce. Test se používá též při diagnostice Burkittova lymfomu, nasofaryngeálního karcinomu, karcinomů Waldayerova okruhu a k charakterizaci oportunních (oligo- nebo polyklonálních) lymfomů. Najde uplatnění při komplexní charakterizaci chronického únavového syndromu a řady imunodeficientních stavů, kde bývá EBV často aktivován. 3. PRINCIP TESTU ELISA-VIDITEST anti-VCA EBV IgM je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický antigen, který reprezentuje imunodominantní epitopy VCA komplexu. Jsou-li v testovaných sérech příslušné protilátky, navážou se na imobilizované proteiny. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgM značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. Ředicí roztok plus obsahuje anti-lidské IgG protilátky určené k vysycení IgG a revmatoidního faktoru (RF). Lze jej připravit vhodným smícháním ředicího roztoku r.t.u. a RF sorbentu dle návodu. 4. OBSAH SOUPRAVY ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku, potažené specifickým antigenem STRIPS Ag 1,3 mL negativního kontrolního séra r.t.u.1) CONTROL 1,3 mL kalibrátoru r.t.u. CAL 1,3 mL pozitivního kontrolního séra r.t.u. CONTROL + 13 mL protilátek proti lidskému IgM značených peroxidázou (konjugát anti-IgM Px) r.t.u. CONJ 125 mL promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 100 mL ředicího roztoku r.t.u. DIL (pro ředění sér a přípravu DIL PLUS) 1,0 mL RF sorbentu 51x konc. RF SORB 51x 13 mL chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 13 mL stop roztoku r.t.u. STOP Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 1
1 x 12 ks 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička
5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, kontrolní séra a kalibrátor. Připravte si ředicí roztok plus (DIL PLUS) pro ředění sér následujícím způsobem: Přidejte 1 díl RF sorbentu k 50 dílům ředicího roztoku r.t.u. – ředění 51x (např. 1 mL RF sorbentu + 50 mL ředicího roztoku r.t.u.). Řeďte jen takové množství, které spotřebujete pro ředění sér v testu. Testovaná séra řeďte připraveným ředicím roztokem plus 101x (např. 5μL séra + 500 μL ředicího roztoku plus). Ředicí roztok plus obsahuje anti-lidské IgG protilátky určené k vysycení IgG a revmatoidního faktoru (RF). Pro ředění sér lze použít i ředicí roztok r.t.u.. Kontrolní séra a kalibrátor neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte si pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 mL promývacího roztoku + 900 mL H2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na +32 až +37oC a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10oC. d. Konjugát anti-IgM Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μL jednotlivými kontrolními séry, kalibrátorem a ředěnými testovanými séry podle následujícího schématu (viz Tab. 1): Naplňte první jamku samotným ředicím roztokem plus pro stanovení pozadí reakce (DIL PLUS). Další dvě jamky naplňte Kalibrátorem (CAL) a jednu jamku negativním kontrolním sérem (CONTROL -). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1, S2, S3, …). Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum (CONTROL +). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte Kalibrátor na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 30 minut (+/- 2 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 μL promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-IgM Px r.t.u. (CONJ) a napipetujte do jamek po 100 μL konjugátu. Inkubujte 60 minut (+/-5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 μL promývacího roztoku (viz bod c.). Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 μL chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (+/-30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. 2
g. Zastavte reakci přidáním 100 μL stop roztoku. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. Tab. 1: Schéma aplikace vzorků a b c d e f g h
8.
1 DIL PLUS CAL CAL CONTROL S1 S2 S3 S4
2 S5 S…
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
HODNOCENÍ TESTU
Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem plus (DIL PLUS = pozadí reakce) od hodnot kontrolních, testovaných sér a kalibrátoru. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru (CAL). Pokud aplikujete tři jamky kalibrátoru a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu tak, že průměrnou hodnotu OD Kalibrátoru vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru kalibrátoru se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní. Vzorky s OD v rozmezí 90-110% cut-off jsou hraniční (viz Pozn.). 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl.8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90 - 1,10 +/1,11 - 4,00 + 4,01 - 6,50 ++ 6,51 - 12,00 +++ > 12,00 ++++
3
Příklad:
Získaná OD kalibrátoru Průměrná hodnota OD kalibrátoru OD vzorku séra Korekční faktor kalibrátoru Cut-off hodnota Hodnota indexu
= 0,994; 1,010; 1,094 = 1,033 = 0,950 = 0,17 = 1,033 x 0,17 = 0,176 = 0,950 / 0,176 = 5,40
Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. 9. VCA IgM + + + -
INTERPRETACE VÝSLEDKŮ VCA IgG + + + + + +
VCA EA (D) EBNA-1 EBNA-1 Stadium EBV infekce IgA IgG IgG IgM EBV negativní + + Primární EBV infekce + + + (časná fáze) + + +/+ Primární EBV infekce (transientní fáze) + Primární EBV infekce + (fáze rekonvalescence) + Seropozitivní bez známek + aktivní EBV infekce + + + Reaktivovaná EBV infekce* + + + + + * Při reaktivaci EBV je protilátková odpověď ve třídě IgM slabá a nemusí být vždy v ELISA prokazatelná. Poznámka: Přítomnost revmatoidního faktoru (RF) může interferovat se stanovením IgM protilátek. RF je proto v průběhu testu vysycen RF sorbentem, který je obsažen v ředicím roztoku plus. Pro vyšetření protilátek proti dalším antigenům nabízí VIDIA tyto soupravy: ELISA-VIDITEST anti-EBNA-1 EBV IgG a IgM; ELISA-VIDITEST anti-VCA EBV IgG (CSF) a IgA; ELISA-VIDITEST anti-EA (D) EBV IgG. Pro konfirmační vyšetření lze použít IF-VIDITEST anti-VCA EBV IgG a IgM; IF-VIDITEST anti-EA EBV (D+R nebo D) IgG. 10.
CHARAKTERISTIKY TESTU
10.1. Platnost testu Hodnota OD Kalibrátoru (CAL) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Hodnota OD negativního kontrolního séra (CONTROL -) by měla být < 0,200. Hodnoty absorbancí kontrolních sér by měly být: CONTROL - < CAL < (CONTROL +). 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnost (interassay) a během testu -opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD.
4
10.2.1. Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ±σ CV opak. 16 1,335 0,050 3,8 % 16 0,614 0,023 3,7 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A ±σ min – max CVrepro 18 1,369 0,064 1,223-1,476 4,7% 18 0,463 0,060 0,337-0,569 12,9% 10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti bylo provedeno testováním vzorků vybraných od pacientů v akutní fázi infekční mononukleosy a od pacientů s reaktivací infekce, kde byl očekáván pozitivní výsledek na IgM proti VCA. Výsledek byl potvrzen nezávislými komerčními testy. Zjištěná diagnostická citlivost je 94,7%. Specifita testu byla stanovena na základě vyšetření vzorků od EBV séropozitivních zdravých jedinců a EBV séronegativních pacientů, kde byl očekáván VCA IgM negativní výsledek. Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 96,1%. 10.4. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/mL pro hemoglobin, 5 mg/mL pro bilirubin a 50 mg/mL pro triglyceridy. 11.
BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY
Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-HIV-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 °C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin, ...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 5
12.
UPOZORNĚNÍ
a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u., ředicí roztok
c. d. e. f. g.
r.t.u. a RF sorbent r.t.u. jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISAVIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. Kontrolní séra, kalibrátor, ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti-IgM Px jsou konzervovány ProClinem 300. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů * kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogen-substrátového roztoku TMB, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely).
13.
SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE
a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 °C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28 °C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10 °C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé.
6
14.
TESTOVACÍ SCHÉMA
Krok 1.
Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění ↓
Krok 2.
Aplikujte kalibrátor, kontrolní a testovaná séra (100 μL / jamku) ↓ Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě ↓ 4x promyjte (250 μL / jamku), vyklepněte ↓
Krok 3.
Aplikujte konjugát anti-IgM Px r.t.u. (100 μL / jamku) ↓ Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě ↓ 4x promyjte (250 μL / jamku), vyklepněte ↓
Krok 4.
Aplikujte chromogensubstrátový roztok TMB (100 μL / jamku) ↓ Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě ↓
Krok 5.
Aplikujte stop roztok (100 μL / jamku) ↓
Krok 6.
Změřte absorbanci při 450/ 620-690 nm do 20 minut
Doporučená literatura: Weber B., Brunner mM., Preiser W., et al: Evaluation of 11 enzyme imunoassays for the detection of immunoglobulin M antibodies to Epstein- Barr virus; J. Med. Virol., 1996;57, 8793 Pumannová M., Řezbová M., Švecová M., Hrbáčková H., Novotná M., Ochotná J., Roubalová K.: Porovnání záchytu IgM protilátek proti virovému kapsidovému antigenu (VCA) viru Epsteina a Barrové (EBV) u různých skupin pacientů pomocí nepřímé imunofluorescence, nepřímé ELISA a reversní ELISA. Studie diagnostické účinnosti soupravy ELISA-VIDITEST anti-VCA EBV IgM: Klin. mikrobiol.inf.lék. 2004; 10 (4);186-190 Gorgievski-Hrisoho M.,Hinderer W.,Nebel-Schickel H.,Horn J.,Vornhagen R., Sonneborn H., Wolf H., Siegl G.: Serodiagnosis of Infectious Mononucleosis by Using Recombinant EpsteinBarr Antigens and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Technology. J.of Clinical Microbiology 28: 2305-2311, 1990 Roubalová K., Horáček J., Němeček V. et al: Doporučené metody ve virologické diagnostice; Acta Hygien Epidemiol. Microbiol 2000;1, 11-12 Datum poslední verze tohoto návodu: 08/2013
7
8
