IMMUNOQUICK® Filtration EBV M Ref: 0515_K25 0515_K12
NÁVOD K POUŽITÍ
BioSynex
1
Verze 2
Použité symboly Pozor, čtěte návody
Testy v soupravě
Výrobce
Použití pouze in vitro
Datum expirace
Pouze na 1 použití
Skladujte mezi 2-30°C
Číslo šarže
Katalogové číslo
Výrobce: BioSynex
Verze 7a - Aktualizována 2010/08/26
12, RUE ETTORE BUGATTI – CS28006 67038 STRASBOURG CEDEX Tel.: 03.88.77.57.00 - Fax: 03 59 81 21 74 www.biosynex.com –
[email protected] BioSynex
2
Verze 2
IMMUNOQUICK® Filtration EBV M Rychlotest pro detekci IgM proti IEA (Immediate Early Antigen), ZEBRA a VCA p18 (Virus Capsid Antigen) proteinům Epstein-Barr viru (EBV), jako markeru aktivní infekce EBV. Ref: 0515_K25; 0515_K12 Použití pouze pro in vitro diagnostiku. 1.
POUŽITÍ
IMMUNOQUICK® Filtration EBV M je imunofiltrační test pro kvalitativní detekci IgM protilátek proti IEA, ZEBRA (BamH1 Z Epstein-Barr Replication Activator) a VCA p18 proteinům v lidském séru. 2.
ÚVOD
Epstein-Barr virus byl poprvé popsán v roce 1964 u pacientů s Burkittovým lymfomem. Je to jeden z nejrozšířenějších virů u lidí. Patří do skupiny herpesvirů, které zahrnují i jiné lidské patogenní viry (Herpes simplex 1 a 2, Varicella zoster virus (VZV), cytomegalovirus (CMV), HHV6, HHV7 a HHV8). Po primární infekci zůstává EBV životaschopný v B-lymfocytech a epiteliích nosu a krku. Když se dostane EBV do slin, vede k infekcím u dětí, které jsou však často asymptomatické nebo subklinické. U mladých lidí, ve věku mezi 15 a 25 lety, se vyskytuje druhý vrchol nákazy. Ve 2/3 případů se může rozvíjet onemocnění infekční mononukleózou. Klinické příznaky jsou ztráta chuti k jídlu, únava, horečka, vyrážka, zánět hltanu, zánět mandlí, lymphangitida, leukocytóza, bolest hlavy, revmatické bolesti a onemocnění jater. To lze přičíst infekci a lytickému životnímu cyklu viru v B-lymfocytech a následné imunitní odpovědi. Ve vzácných případech může dojít k vážným komplikacím, jako jsou hemolytické anémie, zápal plic, neurologické příhody nebo kardiologická onemocnění. Více než 90% dospělých je séropozitivních a jsou nositeli viru, protože EBV přetrvává po celý život v B-lymfocytech a některých epitelových buňkách. Stejně jako v případě jiných herpes virů, může dojít k reaktivaci u pacientů s imunitními defekty nebo po imunosupresivní léčbě, kdy může opět IgG / M / A titr protilátek proti časným antigenům EBV stoupnout. B-lymfocyty, které jsou infikovány EBV, se mohou množit neomezeně. Tato vlastnost, obvykle řízena nebo potlačována imunitním systémem, může vést k řadě maligních onemocnění: lymfoproliferativní onemocnění imunitního systému v důsledku imunodeficience způsobené nemocí (např. AIDS) nebo vlivem imunosupresivní léčby (polyklonální lymfom) nebo Burkittův lymfom spolu s chromozomálními změnami. Spolu s dalšími kofaktory, EBV způsobuje karcinom nosohltanu, který má velmi vysoký výskyt v jižních provinciích Číny. Během lytického životního cyklu viru, dochází v počáteční fázi ke kaskádovité formaci různých regulačních proteinů ("Immediate Early Antigens”, IEA; “Early Antigens", EA) a později i k formaci strukturních proteinů ("Virus Capsid Antigens"; VCA a "Membrane Proteins"; MA). V latentním stavu je vytvořeno jen několik antigenů, vč. EBNA 1-6 (Epstein-Barr Nuclear Antigens). V případě primární infekce EBV, se vyskytuje tzv. "Heterofilní" humorální odpověď, která vede k polyklonální stimulaci IgM. Tyto heterofilní IgM jsou namířeny zejména proti antigenním složkám živočišných buněk (zejména skotu). Jsou to nespecifické markery infekce EBV, které lze nalézt i u jiných typů infekcí (CMV, toxoplasma). Protein nazvaný ZEBRA (BamH1 Z Epstein-Barrové replikační aktivátor také nazývaný EB1 nebo ZTA) vykonává zásadní úlohu v přechodu od virové latence do lytického cyklu. Tento protein je transkripční faktor, který hraje zejména aktivační roli v přepisu některých virových genů a ve své vlastní syntéze. Test na protilátky proti ZEBRA byl hodnocen jako nepřímý marker virové reaktivace, zejména u osob HIV séropozitivních s oslabenou imunitou. Anti ZEBRA protilátky se objeví velmi brzy v průběhu primárních infekcí a detekce přítomnosti protilátek IgM proti ZEBRA antigenům umožňuje velmi časnou diagnostiku primární infekce EBV. Humorální odpověď na primární infekce EBV je rychlá. Protilátky proti EBV jsou zaměřeny na různé virové proteiny a korelují se stavem onemocnění. V případě primární infekce, se IgM a IgG objevují postupně takto: IEA (velmi časný antigen), časný difúzní antigen (EA-D), VCA (virový kapsidový antigen) a EBNA (nukleární antigen). Primární infekce je charakteristická přítomností IgM proti IEA (protein ZEBRA), EA-D a VCA, zatímco IgG proti EBNA chybí. U déle trvající infekce jsou obvykle přítomny anti VCA IgG a anti EBNA IgG. V sérologické diagnostice EBV pomocí imunofluorescenčních testů s infikovanými a EBV produkujícími buňkami, jsou protilátky převážně diferencované proti třem třídám antigenů: EA - časné antigeny, VCA kapsidové / strukturní antigeny a EBNA nukleární antigeny, které jsou exprimovány v průběhu latentní fáze. Imunofluorescence je nyní z velké části nahrazena jednodušeji proveditelnými a lépe hodnotitelnými metodami (ELISA, blot), které využívají rekombinantní proteiny nebo syntetické peptidy. Velice zajímavá specificita ZEBRA antigenu, použitého v IMMUNOQUICK ® EBV M testu, se nachází v IgM odpovědi, která je velmi časná a intenzivní a umožňuje detekci specifických protilátek ještě dříve, než umožňují ostatní markery dostupné v současně době na trhu. Tato detekce může být provedena ještě 2 týdny před testováním jednoho z prvních časných antigenů (EA), jak je uvedeno v tabulce níže. Jasnou výhodu při použití tohoto testu je možnost velmi včasného sledování infikovaných pacientů. Spojení ZEBRA proteinu a VCA P18 antigenu umožňuje detekovat všechny fáze primární infekce a umožňuje zvýšit klinickou citlivost tohoto testu.
BioSynex
3
Verze 2
Diagram: Kaskádovitá formace regulačních proteinů následující po primární infekci EBV
PRINCIP TESTU
3.
IMMUNOQUICK ® Filtration EBV M je imunofiltrační test, který využívá ZEBRA a VCA P18 antigeny pro detekci anti EBV IgM ze séra. Test se skládá z pevné fáze - membrány, která je umístěna v plastové kazetce. Membrána je pro uživatele viditelná v testovacím okně na přední straně kazetky. ZEBRA a VCA P18 antigeny jsou imobilizovány na membráně jako testovací proužek, oba antigeny jsou na úrovni zóny T1. Protein A je navázán na membráně jako kontrolní proužek na úrovni zóny C. Když se předem naředěný vzorek séra nechá projít membránou, jakékoli (IgM) anti-Zebra a anti-VCA P18 protilátky se navážou na odpovídající antigeny na úrovni T1 zóny. Po přidání vyvíjejícího činidla, které reaguje s lidskými IgM protilátkami, dojde k vytvoření modrého zbarvení. Vyvíjecí činidlo také detekuje lidské IgM protilátky navázané na kontrolní zónu C, která demonstruje, že reagencie fungují správně. Testovací zařízení je navrženo tak, aby zcela absorbovalo množství přidaných činidel. POSKYTOVANÝ MATERIÁL
4.
Každá souprava IMMUNOQUICK ® Filtration EBV M obsahuje potřebné množství komponentů pro provedení 25 testů:
SORB
IMMUNOQUICK ® Filtration EBV M testovací zařízení: ZEBRA a VCA P18 antigeny byly imobilizovány na membráně, jako testovací zóna T1. Protein A byl navázán na membránu na úrovni kontrolní zóny C. Poznámka: T1 zóna je žlutá a C zóna je růžová. Barvy zmizí po provedení testu.
DIL
2 lahvičky s obsahem 21 ml pufru k ředění vzorku, Reagent 1.
CONJ
2 lahvičky s obsahem 21 ml anti-IgM konjugátu navázaného na modrých polystyrenových kuličkách, Reagent 2.
WASH
2 lahvičky s obsahem 21 ml promývacího pufru, Reagent 3.
5.
1 návod k použití. POŽADOVANÝ ALE NEDODÁVANÝ MATERIÁL
1. Zkumavka na odběr krve 2. Plastová zkumavka 3. Centrifuga 4. Třepačka 5. Hodiny nebo časovač 6. Laboratorní pipeta BioSynex
4
Verze 2
6.
OMEZENÍ TESTU
1. IMMUNOQUICK ® Filtration EBV M je určen pro screening IgM protilátek proti ZEBRA a VCA P18 v séru. Test je pouze pro in vitro diagnostiku. IMMUNOQUICK ® Filtration EBV M neumožňuje kvantitativní detekci IgM protilátek proti ZEBRA nebo monitorování hladin protilátek u pacientů s prodělanou nebo současnou EBV infekcí. 2. Jedinci infikovaní Epstein-Barr virem nemusí vykazovat detekovatelné hladiny IgM v časné fázi infekce. 3. IMMUNOQUICK ® Filtration EBV M identifikuje pouze přítomnost anti ZEBRA a anti VCA P18 IgM protilátek v séru a nelze ho použít jako jediné kritérium pro diagnostiku primární infekce EBV. 4. Stejně tak, jako je tomu i u jiných diagnostických testů, je nutné interpretovat výsledek testu v souladu s dalšími dostupnými klinickými ukazateli. (hlavně VCA IgG, EBNA IgG a heterofilní protilátky). 5. Výsledky imunosuprimovaných pacientů by měly být posuzovány obezřetně. 6. Negativního výsledku může být dosaženo, pokud je vzorek pacienta vyšetřen v pozdějším stádiu akutní fáze, kdy ZEBRA IgM již nejsou přítomny. 7. Anti VCA P18 IgM mohou chybět ve velmi rané fázi primární infekce. 8. Výskyt revmatoidního faktoru ve vysoké koncentraci (> 150 IU / ml) může vést k falešně pozitivním výsledkům. 7.
SKLADOVÁNÍ A STABILITA
- Souprava by měla být skladována v chladu (při teplotě 2 – 8 °C). - Souprava je stabilní do data expirace vytištěného na obalu. - Testovací kazety musí být uloženy v ochranném obalu až do doby provedení testu. - Lahvičky se musí skladovat při teplotě 2-8 °C ihned po každém použití. - NEZMRAZUJTE 8.
UPOZORNĚNÍ
- Pouze pro diagnostické použití in vitro. Nepoužívejte po uplynutí doby použitelnosti. - Nejezte, nepijte a nekuřte při manipulaci se vzorky a při provádění testu. - Nepipetujte ústy. - Vzorky krve a séra musí být považovány za potenciálně infekční. Při provádění testu dodržujte nezbytná opatření pro manipulaci s infekčním materiálem. S jednotlivými komponenty testu a vzorky musí být nakládáno v souladu s postupem pro potenciálně infekční odpad. - Používejte příslušné laboratorní oblečení, ochranné rukavice a ochranu očí při provádění testu. - Omyjte si ruce po provedení testu. 9.
ODBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKU
- IMMUNOQUICK ® Filtration EBV M by měl být používán pouze pro sérum. - Nepoužívejte hemolyzované nebo kontaminované vzorky. Zakalené vzorky před použitím centrifugujte. - Doporučuje se provést test ihned po odběru a centrifugaci vzorku. V opačném případě může být sérum skladováno při teplotě 2-8 °C po dobu maximálně 48 hodin. Pro delší skladování se musí sérum zamrazit na -20 °C. Nespecifické reakce byly zjištěny u vzorků sér uložených více než 48 hodin při teplotě 2-8 °C. - Před provedením testu musí být zmrazené vzorky rozmraženy při pokojové teplotě a důkladně promíchány. Vzorky by se neměly rozmrazovat a znovu zmrazovat. - V případě transportu vzorku, postupuje podle nařízení o přepravě produktů lidského původu. - U lyofilizovaného přípravku pečlivě dodržujte proces rozpuštění a rekonstituované sérum vytemperujte na laboratorní teplotu před zahájením testu. BioSynex
5
Verze 2
10. KONTROLA KVALITY 1. procesní kontrola Vnitřní kontrola je součástí testu (kontrolní zóna). Taková kontrola umožňuje potvrzení, že je množství séra dostatečné a že byl postup správně proveden. Absence filtrace nebo přítomnost abnormálně pomalé filtrace (> 1 min.) některého ze 3 činidel, stejně jako přítomnost silně modrého pozadí membrány po promývacím kroku, svědčí o nestabilitě testu. V tomto případě je třeba považovat výsledek za neplatný. 2. kontrola kvality Pozitivní a negativní kontroly jsou k dispozici samostatně. Jsou určeny pro kontrolu vlastností výrobků. Doporučuje se otestovat tyto kontroly v následujících případech: - Při otevírání nové šarže - Při otevření první soupravy nové zásilky - Při použití novým pracovníkem 11. PRACOVNÍ POSTUP 1. Vytemperujte všechny potřebné komponenty na pokojovou teplotu před zahájením testu. 2. Po vyjmutí testovací kazety z hliníkové fólie ihned proveďte test. 3. Pipetujte 25 ul séra na dno plastové zkumavky. Přidejte 1,5 ml ředicího pufru DIL. Důkladně promíchejte opětovným natažením a vypuštěním pipetou. 4. Použijte laboratorní pipetu nebo přímo kápněte naředěný vzorek ze zkumavky do testovacího okna kazety. Nechte naředěný vzorek vzlínat (15 sec.). 5. Důkladně promíchejte konjugát jemným protřepáním před testováním. Odpipetuje 1,5 ml konjugátu CONJ a umístěte jej do testovacího okna. Nechte působit (15 sec.). 6. 1,5 ml promývacího pufru pipetujte do testovacího okénka. Nechte působit (15 sec.). 7. Čtěte výsledek, jakmile byl promývací pufr plně vstřebán do testovacího okénka. Nečtěte po 20 minutách. Poznámky: 1. Dbejte na to, abyste se nedotkli membrány špičkou pipety. Použijte nové špičky při každém kroku, aby nedošlo ke kontaminaci činidla 1, 2 a 3. 2. Objem 1,5 ml může být nakapán v jedné nebo dvou kapkách 750 ul (např.)
12. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ POZITIVNÍ: Anti EBV IgM pozitivní (ZEBRA a VCA p18) : Přítomnost modré linky T1 (i slabé intenzity) a modré kontrolní linky C. Přítomnost anti ZEBRA anebo anti VCA p18 IgM protilátek primární infekce EBV nebo reaktivace EBV. NEGATIVNÍ: Absence modré linky T1 a přítomnost modré kontorlní linky C. Anti ZEBRA a anti VCA p18 IgM protilátky nejsou přítomny. Absence primární infekce EBV. NEPLATNÉ: Absence modré kontrolní linky C. Nedostatečný objem vzorku nebo špatný postup jsou dvě nejčastější příčiny neplatných výsledků. Zkouška se musí provézt znovu s novým testem.
Přítomnost tmavě modrého pozadí. Silně modré pozadí se může na membráně objevit, jestliže jeden z filtračních kroků trvá déle než 1 minutu. V takovém případě je test neplatný. Proveďte jiný test s druhou sadou lahviček dodávaných v soupravě.
BioSynex
6
Verze 2
13. OČEKÁVANÉ HODNOTY 50% západní populace je očkováno proti EBV před dosažením věku pěti let a 90% dospělých má EBV protilátky, které svědčí o v minulosti prodělané infekci. V souboru 166 dárců krve ze Štrasburku, byla míra pozitivity s IMMUNOQUICK Filtration ® EBV M testem 1,8%. 14. CHARAKTERISTIKA TESTU 1.
Testování souboru ambulantních pacientů a dárců krve
Séra byla testována ELISA metodou VCA a/nebo EA IgM ( DiaSorin) nebo imunoblotem (EBVCHECK IgM ALLDIAG S.A.) nebo EBV IgM (Enzygnost Anti EBV / IgM II Dade Behring). EBV IgM + SERA
EBV IgM - SERA
IMMUNOQUICK®
POZITIVNÍ
74
1
EBV M+
NEGATIVNÍ
5
75
Senzitivita = 93,70%
Specificita = 98,70%
2. Studie zkřížených reaktivit potenciálně interferujících sér Séra
NEGATIVNÍ
POZITIVNÍ
CMV IgM+
4
1
Borrelia burgdorferi IgM+
2
2
Borrelia burgdorferi IgG+
3
0
Anti thyroglobulin nebo anti thyroperoxydáza+
6
0
Revmatoidní faktor
7
3
Tuberkulóza (anti A60 protilátky)
4
0
Poznámky
EBV reaktivace byla konfirmována v 1 ze 2 pozitivních vzorků
Pozitivní > 150 UI/ml
3. Inter a intra studie testu IMMUNOQUICK ® Filtration EBV M test byl hodnocen v triplikátu na dvou různých šaržích v souboru negativních, slabě pozitivních a vysoce pozitivních sér. Výsledky poskytovaly reprodukovatelnost 100%, jak při testování mezi šaržemi, tak při testování v rámci jedné šarže.
BioSynex
7
Verze 2
15. LITERATURA 1. Brousset, P. et al. “Epstein-Barr virus (EBV) replicative gene expression in tumour cells of AIDS-related non Hodgkins’lymphoma in relation to CD4 cell number and antibody titres to EBV”, AIDS, vol. 8, 1994, pp. 583-590. 2. Chan, K.H. et al. “Development and evaluation of an Epstein-Barr Virus (EBV) Immunoglobulin M enzyme-linked immunosorbent assay based on the 18-kilodalton matrix protein for diagnosis of primary EBV infection”, Journal of clinical microbiology, vol 36, 1998, pp. 3359-3360 3. Cheng, Hwez-ming et al. “ Epstein-Barr Virus Nuclear antigen 1 linear epitopes that are reactive with immunoglobulin A (IgA) or IgG in sera from nasopharyngeal carcinoma patients or from healthy donors.” Journal of clinical microbiology, vol. 29, N°10, Oct. 1991, pp. 2180-2186. 4. Cheng, Hwee-Ming. “Linear epitopes of the replication-activator protein of Epstein-Barr virus recongised by specific serum IgG innasopharyngeal carcinoma.” Cancer immunol immunother, vol. 40, 1995, pp. 251-256. 5. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr. 1964. Virus particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt’s Lymphoma. In: Lancet 1:702-703. 6. Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G. Achong. 1965. Studies with Burkitt’s Lymphoma. In: Wistar Inst. Sympos. Monogr. 4:69-82. 7. Gorgievski-Hrisoho, M., et al.. Serodiagnosis of Infectious Mononucleosis by using recombinant Epstein-Barr Virus Antigens and Enzymelinked immunosorbent assay technology. J. Clin. Microbiol. 28, 2305-2311 (1990) 8. Hinderer, W et al. “Serodiagnosis of Epstein-Barr virus infection by using recombinant viral capsid antigen fragments and autologous gene fusion” Journal of clinical microbiology, vol. 37, 1999, pp. 3239-3244 9. Ho, D. W., P. R. Field, and A. L. Cunningham. 1989. Rapid diagnosis of acute Epstein-Barr virus infection by an indirect enzymelinked immunosorbent assay for specific immunoglobulin M (IgM) antibody without rheumatoid factor and specific IgG interference. J. Clin. Microbiol. 27(5): 952-958. 10. Jilg, W. et al., Diagnostic significance of antibodies to the Epstein-Barr virus-specific membrane antigen gp 250. J. Infect. Dis. 152, 222-225 (1985) 11. Joab, I. et al. “Detection of anti Epstein-Barr virus trans-activator (ZEBRA) antibodies in sera from patients with human immunodeficiency virus. JID, vol. 163, Jan. 1991, pp. 53-56. 12. Joab, I. et al. “Detection of anti Epstein-Barr virus trans-activator (ZEBRA) antibodies in sera from patients with nasopharyngeal carcinoma”. J. Cancer, vol. 48, 1991, pp. 647-649. 13. Lee, C.L. and Davidson, L. 1967. Spot test for infectious mononucleosis. Annual Meeting ASCP and CAP. 14. Marechal, V. et al. “enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to ZEBRA, an Epstein-Barr trans-activator”. Research in virology, vol. 144, N°5, 1993, pp.397-404. 15. Matheson, B. A., S. M. Chisholm, and D. O. Ho-Yen. 1990. Assessment of rapid ELISA test for detection of Epstein-Barr virus infection. J. Clin. Pathol. 43:691- 693. 16. Mathew, A et al., “A high incidence of serum IgG antibodies to the Epstein-Barr virus replication activator in nasopharyngea carcinoma”, Cancer Immunology Immunotherapy, vol. 38, 1994, pp. 68-70. 17. Mikaelian, I et al. “The DNA-binding domain of the two BZIP transcription factors, the Epstein-Barr virus switch gene product EBI and Jun, is a bipartite nuclear targeting sequence”. Journal of virology, Feb. 1993, pp. 734-742. 18. Miller, G., “The switch between latency and replication of Epstein-Barr virus”, The Journal of infectious diseases, vol. 161, 1990, pp. 833844. 19. Niedobitek, G., et. al. 1997. Epstein-Barr virus (EBV) infection in infectious mononucleosis: virus latency, replication and phenotype of EBV-infected cells. J. Pathol. 182: 151-159. 20. Tedeschi, R. et al. “the disease associations of the antibody response against the Epstein-Barr virus transactivator protein ZEBRA can be separated into different epitopes.” Journal of General Virology, vol. 76, 1995, pp1393-1400. 21. Thorley-Lawson, D.A.. 1988. Immunological responses to Epstein-Barr virus infection and the pathogenesis of EBV-induced diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 948: 263-286. 22. Van Grunsven, Wout M.J., et al. “Gene mapping and expression of two immunodominant Epstein-Barr virus capsid proteins”,
BioSynex
8
Verze 2
16. PROTOKOL
Obr. 1. Pipetujte 25 µL séra na dno plastové zkumavky a přidejte 1.5 mL ředícího pufru DIL. Důkladně promíchejte pipetováním tam a zpět.
Obr. 2. Použijte laboratorní pipetu nebo přímo kápněte naředěné sérum ze zkumavky do testovacího okna (15 sek.).
Obr. 3. Pipetujte 1.5mL konjugátu CONJ do testovacího okna (15 sek.)
BioSynex
Obr. 4. Pipetujte 1.5 mL promývacího roztoku do testovacího okna (15 sek.) Nechte vzlínat činidla do vyhodnocovacího okna zařízení (15 sek.) Čtěte výsledek jakmile je všechen promývací roztok převedený do vyhodnocovacího okna. Nevyhodnocujte výsledek po 20. minutách.
9
Verze 2
