Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie. Pavel Matějka

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie

Pavel Matějka

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie 1. Konfokální mikroskopie 1. Princip metody - konfokalita 2. Instrumentace – metody zobrazování 3. Analýza obrazu

2. Konfokální mikrospektroskopie 1. 2. 3. 4.

Luminiscenční mikrospektroskopie Ramanova mikrospektroskopie Instrumentace – mikrospektroskopické mapování Základy interpretace spektrálních map

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie Difrakce

1.22 l d= NA obj. + NA cond. Pro 20 000 cm -1, (20 000 cm-1 = 500 nm = 0.5 μm )

1.22 (0.5 µm)

d= 0.58 + 0.71

= 0.47 µm

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie Difrakce, laterální rozlišení, velikost objektu Velké vzorky (>10 μm) Nepatrná difrakce

Malé vzorky (<10 μm) Výrazný vliv difrakce

Obrazové pole Plocha vzorku

Difraktované záření

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie Difrakce, laterální rozlišení, velikost objektu  Rozlišovací schopnost mikroskopu – minimální vzdálenost dvou bodů objektu, které se zobrazí navzájem odděleně  Obrazem „bodu“ – Airyho kroužek – difrakční obrazec – ohyb záření na čočkách objektivu – překryv kroužků  Tloušťka vzorku a hloubka ostrosti  Omezení záření z mimoohniskových rovin – konfokální mikroskopie  Marvin Minsky – patent – 1957  Petráň, Hadravský - konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče - Tandem Scanning Confocal Microscope

Konfokální mikroskopie

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie  Konfokální clonka („pinhole“)  Vymezuje záření pocházející ze zaostřené plochy pod mikroskopem  Sekundární záření – odrazové, luminiscenční, rozptylové

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie  Možnost hloubkového proostřování  Sekundární záření vždy jen z ohniskové plochy  Kompromis průměru „pinhole“ - menší průměr – lepší hloubkové rozlišení, nižší signál na detektoru - větší průměr – horší hloubkové rozlišení, vyšší signál na detektoru

 V kombinaci s laterálním rozlišením (zobrazováním či mapováním) možnost konstrukce 3D obrazu

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie  Laserový rastrovací konfokální mikroskop (Laser Scanning Confocal Microscope)  Bodový osvit fokusovaným laserovým paprskem (na úrovni difrakční meze)  Stejný objektiv – sběr odraženého, rozptýleného, fluorescenčního záření  Rastrování objektu – bod po bodu

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie  Rastrování objektu – bod po bodu  Rozmítání laserového paprsku  Posouvání vzorku se softwarově ovládaným stolkem  Posouvání objektivu nad vzorkem  Z hlediska rozlišení - výhodnější krátkovlnné lasery – 488 nm, 532 nm …  Postupné snímání, obrazový šum  Fotochemické reakce a fotofyzikální jevy

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie

 Záznam sekvence 2D obrazů – tomografie vzorku  Rekonstrukce 3D obrazu – stereoskopické páry – plastické obrazy

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie  V kombinaci s laterálním rozlišením (zobrazováním či mapováním) možnost konstrukce 3D obrazu

 2D obrazy jednotlivých vrstev  Vertikální řezy

Optická konfokální mikroskopie a mikrospektroskopie  Fluorescenční obrazy při různých excitačních a emisních vlnových délkách  Využití vlastní fluorescence / fotoluminiscence materiálu či využití fluorescenčních „sond“

DAPI ‐ interkaluje do struktury DNA a RNA (modře) GFP ‐ zelený fluorescenční protein FITC ‐ fluorescein isothiokyanát (oblíbený fluorofor, snadno kovalentně modifikující např. protilátky) Fluorescein ‐ vyzařuje zelené světlo, když je osvícen modrým Cy3, Cy5 a Alexa 568 ‐ fluorofory vyvinuté specielně pro fluorescenční mikroskopii, vysoce fotostabilní a s vysokou účinností fluorescence

Image

Konfokální Ramanova mikrospektroskopie

Konfokální Ramanova mikrospektroskopie

Konfokální Ramanova mikrospektroskopie

Schéma konfokálního Ramanova mikroskopu

Konfokální Ramanova mikrospektroskopie

Konfokální Ramanova mikrospektroskopie