Moleculaire diagnostiek van infectieziekten
Arjan de Jong 8 december 2015
Moleculaire diagnostiek • Diagnostiek op basis van moleculair biologische (DNA/RNA) technieken
Moleculaire diagnostiek van infecties • Diagnostiek op basis van moleculair biologische (DNA/RNA) technieken • Het aantonen van de aan- of afwezigheid van DNA of RNA van microorganismen • RNA: veelal RNA-virussen, dus virussen met RNA als genoom • DNA: alle andere micro-organismen, inclusief virussen met DNA als genoom • RNA: wanneer we geïnteresseerd zijn in expressie
Moleculair biologische technieken • PCR • Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) voor RNA targets • Conventionele PCR • PCR waarbij de detectie van een PCR product post-PCR plaatsvindt • PCR waarbij post-PCR handelingen noodzakelijk zijn • Real-time PCR • PCR waarbij de detectie van een PCR product tijdens de reactie plaatsvindt • ‘gesloten’ reacties, dus geen post-PCR handelingen
Moleculair biologische technieken • LiPA • Line Probe Assay, meestal gebruikt voor geno- of resistentiebepaling • Sequening • Bepalen van de sequentie van een specifiek stukje genoom • Next generation sequencing (NGS) / Whole genome sequencing (WGS) • Bepalen van de sequentie van (een groot deel van) een heel (micro)organisme
PCR | polymerase kettingreactie • Nabootsen van natuurlijke proces van DNA replicatie/vermenigvuldiging • Basis: twee specifieke primers • Passen op ‘target’ DNA als sleutel in slot • 40-50 cycli van: • Uitsmelten DNA strengen • Binden primers • Verlengen van de primers • Na 30 cycli 109 moleculen
Monster → PCR uitslag • Nucleïnezuur isolatie (voorbehandeling) • PCR mixenberekening, PCR set up • PCR reactie (post PCR handelingen) • Analyse • Invoer en confirmatie in GLIMS • Autorisatie, beschikbaarheid in EPIC
Kwaliteitsinstrumenten bij MolDiag • Fout negativiteit • Door remmende stoffen in monster • Door niet optimaal verlopen van het proces • Controles: isolatiecontroles EAV/PhHV • Fout positiviteit • Door contaminatie • Controles: negatieve isolatiecontrole negatieve PCR controle • Ruimtescheiding: pre- en post-PCR handelingen in verschillende ruimtes met eenrichtingsverkeer
Verdere verbetering kwaliteit en/of snelheid
• Automatisering van home-brew diagnostiek • Aurora FLOW • Verminderen van: werklast manuele handelingen overschrijfmomenten en resultaatinvoer momenten • Implementatie moleculaire sneltesten (GeneXpert) • Influenza/RSV • MRSA • HCV • HIV (cito) • Clostridium difficile
(semi)Kwantitatieve PCR • Kwantitatief: PCR met ijklijn van bekende standaarden • Semi-kwantitatief: PCR zonder ijklijn, mate van positiviteit geschat op basis van Ct/Cp/Cq waarde t.o.v. historie of vaste positieve controle • Kwantitatief: • CE/IVD: • HIV, HCV, HBV • Home-brew: • CMV, EBV, BKV • Semi-kwantitatief: • HSV, PCP
Multiplexing en panels • Multiplexing: meerder reacties (targets/pathogenen) in dezelfde reactie • Door gebruik van verschillende labels (kleurstoffen)
Multiplexing en panels • Multiplexing: meerder reacties (targets/pathogenen) in dezelfde reactie • Door gebruik van verschillende labels (kleurstoffen) • Panels: ‘syndroom diagnostiek’ • Meerdere (multiplex) reacties om de aanwezigheid van een aantal potentiële verwekkers tegelijk aan te tonen • Respiratoire diagnostiek • Virale, bacteriële en parasitaire faecesdiagnostiek • Kosten: panels goedkoper dan losse, individuele targets • Kosten voor verwerking, isolatie, PCR plaatje etc. al gemaakt • Hands-on-time neemt minimaal toe bij meer targets op bestaand monster
Workflow • Huidige workflow • Beperkt pakket niet op FLOW: Start om 12:30 | PCR O/N | uitslag volgende ochtend • ‘bulk routine’ op FLOW Start om 9:00 | FLOW run overdag | uitslag 2e helft middag • Respiratoire diagnostiek + virale faecesdiagnostiek: Start om 9:00 | handmatig overdag | uitslag einde van de dag • Bacteriële en parasitaire feacesdiagnostiek: Start om 12:00 | FLOW run overdag | uitslag einde van de dag
Workflow | CITO diagnostiek • CITO diagnostiek mogelijk, maar niet wenselijk • Drukke bezetting van apparaten met huidige workflow • Analisten ingepland binnen huidige workflow • In behandeling nemen van CITO leidt altijd tot een verstoring van de rest van workflow • Indien noodzakelijk altijd in overleg met arts-microbioloog
16S PCR • Identificatie van stammen of detectie/identificatie in directe materialen • 16S rRNA is de bouwsteen van ribosomen, in alle bacteriën aanwezig • Geconserveerde en variabele delen
16S PCR • Identificatie van stammen of detectie/identificatie in directe materialen • Geconserveerde en variabele delen
• PCR + sequentie analyse • Database vergelijking
• Contaminatie gevoelig
Sequencing: Sanger sequencing • ‘old-school’ sequencing, fragmenten tot ± 800 basen • Sequence by synthesis, inbouw van gelabelde nucleotiden = stop reactie
Sequencing: Sanger sequencing • ‘old-school’ sequencing, fragmenten tot ± 800 basen • Sequence by synthesis, inbouw van gelabelde nucleotiden = stop reactie
Lee SH, et.al., Am J Clin Pathol. 2010 Apr;133(4):569-76.
Next generation sequencing • Nieuwe technische ontwikkelingen • Sequencing zonder voorkennis van wat er aanwezig is • Verschillende approach van verschillende fabrikanten • Korte stukjes sequencen • Langer stukjes stukjes sequencen • Alignment aan referentiegenoom • De novo assembly
Next generation sequencing • Technische ontwikkelingen gaan door • Kosten gaan omlaag • Workflow nog niet geautomatiseerd • Met name analyse tijd lang • Interpretatie? • Het kan al wel….
