Moderní světelná a elektronová mikroskopie

Moderní světelná a elektronová mikroskopie Doc. RNDr. Roman Kubínek, CSc. Katedra experimentální fyziky Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky v rámci projektu Vzdělávání výzkumných pracovníků v Regionálním centru pokročilých technologií a materiálů (CZ.1.07/2.3.00/09.0042)

Mikroskopické techniky ●

Světelná mikroskopie ●

●

●

●

●

●

●

●

●

Nomarského interferenční kontrast (DIC) Hofmannův modulační kontrast (HMC) Fluorescenční mikroskopie (FLM) UV a IR mikroskopie, ultramikroskopie Laserová konfokální mikroskopie (LSCM) Digitální holografická mikroskopie (DHM) Optická mikroskopie v blízkém poli (NSOM)

Elektronová mikroskopie ●

●

●

Metoda fázového kontrastu (PC)

Transmisní elektronová mikroskopie (TEM, HRTEM) Skenovací elektronová mikroskopie (SEM, eSEM)

Mikroskopie skenující sondou – „Hrotové mikroskopy“ (speciální přednáška)

Zdroje informací: ●

●

●

●

http://apfyz.upol.cz/ucebnice/elmikro.html http://apfyz.upol.cz/ucebnice/optmikro.html http://atmilab.upol.cz/brozura.html http://micro.magnet.fsu.edu/primer/

Vývoj „světelných“ mikroskopů 1670 1850

1930

1998

SM – zvětšení

Zvětšení mikroskopu Z=

0, 25 Δ 0, 25 =− . ¿ =Z obj . Z ok ¿ ¿ f f1 f2

SM – rozlišení Rozlišovací mez SM λ0 0, 61 λ 0 D=1, 22. ⇒ d min= A0 n .sin α 0 Hloubka ostrosti SM T = Tg + Tv + Ta

1 1 Tg = [mm] 7 A.Z

T v=

n. λ [ mm ] 2 2A

250 Ta = 2 [mm] Z

SM – objektivy suché a imerzní

SM – metoda fázového kontrastu Potřeba zvýraznit detaily průsvitných preparátů s indexem lomu nepatrně odlišným od okolí - (Fritz Zernike 1930) Vlnová teorie zobrazení ve SM

Fázové destičky

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/phasecontrast/phasemicroscope/index.html

Nomarského diferenční interferenční kontrast (DIC) Snaha o odstranění „halo“ efektu kolem detailů předmětu (Georges Nomarski 1950)

Nomarského diferenční interferenční kontrast (DIC) Rozdíl oproti klasickému SM: • vložení páru Wollastonových hranolů a páru zkřížených polarizátorů. Přednosti: • Kolem detailů předmětu není v obraze rušivá „aura“ jako u FK Při malých hloubkách ostrosti lze rozlišit stupňovité vrstvy ∼ nm Chod paprsků: • Lineární polarizace světla polarizátorem • Chod paprsků dvojlomým děličem Wollastonova typu (směr polarizace svírá s optickými osami hranolu 450) • Druhý Wollastonův hranol, shodně orientovaný s prvním je umístěn v zadní ohniskové rovině objektivu

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/dic/light/index.html

Hoffmanův modulační kontrast (HMC) Výhody oproti Nomarskému DIC – Robert Hoffman 1975 • podobné zobrazení při nižší ceně doplňkových komponent • možnost pozorovat objekty i na dvojlomných podložkách (např. buněčné kultury v plastových kultivačních kyvetách)

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/hoffman/pathways/index.html

Fluorescenční mikroskopie – základy Fluorescence – emise světla probíhající během absorpce energie excitačního světla (interval mezi absorpcí a emisí vyzářeného kvanta  10-6 s.

Zdroj světla: nejčastěji vysokotlaké rtuťové (50–200 W) nebo xenonové výbojky (75–150 W)

Fluorescenční mikroskopie – realizace

Fluorescence v prošlém a odraženém světle excitační filtr (propouští jen požadovanou λ přes preparát) bariérový filtr (potlačení nebo absorpce excitační λ, propouští jen emisní λ na detektor) dichroické zrcadlo (filtr odrážející excitační λ a propouštějící emisní λ)

Laserová konfokální mikroskopie LSCM (základní idea z r. 1957 - Marvin Minski)

Laserová konfokální mikroskopie Odlišnosti konfokálního způsobu od klasického SM

• osvětlen je jen jeden bod, signály od okolních bodů (vedle, pod a nad) jsou omezeny otvorem • režim: epi (reflexní) nebo fluo – (fluorescenční) • konfokální: kondenzor = objektiv (méně odrazů) • skenování: rozmítání laserového svazku, příčné posouvání vzorku před objektivem, případně posouvání objektivu nad vzorkem • konfokální obrazy jsou vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem (pro λ = 488 nm tloušťka = 0,4 µm)

Počítačová rekonstrukce obrazu: • zvýšení hloubky ostrosti skládáním obrazů, • skládání obrazů (otáčení obrazů), pronikání do hloubky vzorku, • stereoskopické obrázky, korekce pozadí atd. http://www.olympusconfocal.tcom/java/confocalsimulator/index.html

Digitální holografická mikroskopie (DHM) DHM vychází z principu holografického zobrazení, objeveného v roce 1948 Denisem Gáborem.

Metoda DHM vytváří v reálném čase 3D digitální obrazy preparátů užitím holografického principu. Hologramy jsou vytvářeny skládáním koherentní referenční vlny s vlnou odraženou od předmětu (je možné i nekoherentní osvětlení s vyloučením jevu koherenční zrnitosti)

Digitální holografická mikroskopie – realizace

DHM - reflexní režim

DHM - transmisní režim

Digitální holografická mikroskopie – realizace V DHM je interference vlny odražené od předmětu a referenční vlny zaznamenána CCD kamerou a přenesena do počítače, který provádí numerickou rekonstrukci v reálném čase. Software DHM metody umožňuje výpočet obrazu jednotlivých hologramů (během několika mikrosekund) ze souboru vlnoploch vycházejících z objektu

Digitální holografická mikroskopie – aplikace DHM poskytuje následující informace:

• Intenzitní obrazy poskytují stejný kontrast jako klasické optické mikroskopy, • Fázové obrazy poskytují kvantitativní data definovaná v sub-vlnové škále použitá pro přesná a stabilní měření, • V reflexním režimu fázové obrazy přímo odhalují topografii povrchu se subnanometrovým vertikálním rozlišením, • V transmisním (procházejícím) režimu odhaluje fázový obraz fázový posun vyvolaný průsvitným objektem (preparátem). Ten je závislý na jeho tloušťce a indexu lomu

Optická mikroskopie v blízkém poli (NSOM - Near–Field Scanning Optical Microscopy)

1972 E. A. Ash and G. Nicholls, University College - London Oblast blízkého pole je definovaná jako oblast v okolí vzorku menším než je vlnová délka dopadajícího světla. V NSOM je tato vzdálenost v řádu několika nanometrů. Detekce světla z blízké oblasti se provádí za účelem dosažení optického rozlišení lepšího než je difrakční limit (cca 250 nm)

Optická mikroskopie v blízkém poli (NSOM - Near–Field Scanning Optical Microscopy)

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/nearfield/nsomscan/index.htmlt

Elektronová mikroskopie ●

●

Transmisní elektronová mikroskopie (TEM a HRTEM) Skenovací elektronová mikroskopie (SEM a eSEM-“environmentální“ s volitelným vakuem)

Transmisní elektronový mikroskop

Urychlené elektrony jako vlna ve vakuu Pohybující se elektron o energii E a hybnosti p má podle Lui de Broglieho teorie vlnovou povahu; tedy chová se jako vlna o: frekvenci

f =

E h

h a vlnové délce λ= me v je Planckova konstanta

Pro vlnovou délku elektronu odvodíme vztah λ=

h

 

2m 0 eU 1

V praxi pro výpočet λ při známé hodnotě U [V]

Příklad:

1,226 λ= [ nm ] U

, kde h

U= 10 kV → λ = 0,01226 nm U= 100 kV → λ = 0,0037 nm

eU 2m 0 c 2



≃

h  2m 0 eU

Elektrony procházející preparátem

Atomy stejného druhu v různě orientované krystalické mříži (v případě levého obrázku, prochází elektrony snadněji) Kontrast v obraze závisí mimo jiné na: • orientaci krystalů v látce, • na průměrném protonovém čísle atomů preparátu, • na hustotě látky (počtu atomů v krystalické mříži). Pro transmitované elektrony: v případě obrázku vlevo bude obraz světlejší než v případě obrázku vpravo

Zviditelnění obrazu vytvořeného elektrony v TEM  přeměnou kinetické energie elektronů na světlo – pozorování, záznam  dopadem elektronů na fotografickou emulzi – záznam Přeměna energie elektronů na světlo Podobně jako v klasické TV obrazovce, elektrony bombardují stínítko opatřené luminoforem (fosfor, ZnS atd.) V komoře TEM, v  její spodní části je oválné luminiscenční stínítko (fosfor – zelená fosforescence), na němž vzniká celkový obraz Snímání obrazu speciální CCD kamerou - registrujeme změny intenzity jako ČB (šedotónový) obraz.

Digitální kamery pro elektronovou mikroskopii instalace na 35mm port Parametry:

• Rozlišení obrazu - 11 megapixelů

Morada (11 MPixelů)

• • • • • •

Velikost pixelu - 9.0 x 9.0 µm² Kmitočet pixelu - až 25 MHz Dynamický rozsah - 14 bitů Instalace kamery - příruba na širokoúhlém portu Připojení PC - technologie FireWireTM (IEEE 1394) Spřažení kamery - s optickými čočkami

Vnitřní přenosový čip s elektronickým přerušovačem umožňuje extrémně krátké i extrémně dlouhé expoziční časy - 1 ms až 60 s. Morada dosahuje až 10 snímků za sekundu a frekvenci pixelu 24 MHz. CCD čip je chlazený Peltierovým způsobem a vzduchem a je stabilizovaný při 15°C, poskytuje velmi vysoký poměr signál/šum. Morada používá nové speciálně vyvinuté scintilátory, optimalizované pro 100 a 200 keV. ●

MegaView III (6 MPixelů)

Kamera má video výstup 640×408 pixelů (50 Hz PAL, 60 Hz NTSC).

●

Digitální kamery pro elektronovou mikroskopii instalace pod projekční komoru Černobílá CCD kamera s vysokým rozlišením instalovaná ve spodní části projekční komory mikroskopu v otse elektronového svazku. • Uspořádání CCD čipu a účinného fosforového scintilátoru na principu optického vlákna. CCD typ: rychlost: 10 nebo 20 MegaPixel/s, dynamická plocha: 4096 odstínů šedi (12 bit), rozlišení: 1280×1024), • Expoziční čas: 100 µs - 160 s. Chlazení kamery Peltierem na teplotu 10 oC, chlazení je součástí dodávky. • Obrazová data jsou odesílána přes FireWireTM (IEEE1394), což eliminuje použití přídavného framegrabberu. • Použití pro biologické aplikace a pro materiálový výzkum s požadavkem na vysoké rozlišení. • Instalace: běžné transmisní mikroskopy FEI (Philips), LEO, Jeol

Konstrukce TEM Čtyři základní stavební a funkční prvky elektronového mikroskopu:  zdroj elektronů (elektronové dělo),  elektromagnetické čočky, Elektronové dělo  preparátový stolek (držák, goniometr),  vakuový systém.

Systém elektromagnetických čoček a clon

Luminiscenční stínítko

Preparátová komůrka

Konstrukce TEM – elektronové dělo zdroj elektronů: termoemisní zdroj přímo (nepřímo) žhavená katoda (2700 oC – Wolframové vlákno – vydrží měsíc)

katoda LaB6 (2100 oC – hexaborid lanthanu – vydrží rok) autoemisní (studený) zdroj (FEG) – vydrží několik let

 Wehneltův válec (obklopuje katodu) – potenciál -100 V  Křižiště (zdroj elektronů, podobně jako vlákno žárovky) s průměrem cca 50 µm  Urychlovací napětí 100 až 300 kV (obvyklá hodnota TEM)

Konstrukce TEM – elektromagnetické čočky

elektromagnetická čočka (solenoid)

průběh magnetického pole (aberace)

Pro ohniskovou vzdálenost elektromagnetické čočky přibližně platí:

1 e = f 8.m.U

z2

2 B ∫ zo ( z ).dz z1

Bz0 – magnetická indukce v místě z na ose

Výhoda: možnost měnit ohniskovou vzdálenost elmag. čočky změnou proudu ve vinutí cívky (solenoidu). Nevýhoda: Magnetické pole v dutině cívky (čočky) se mění (podle obrázku) a to vede k vadám zobrazení (sférická vada, chromatická vada)

Konstrukce TEM – tubus kondenzor • fokusuje elektronové paprsky na preparát • promítá křižiště elektronové trysky na preparát • zajišťuje jeho homogenní a intenzivní ozáření) objektiv • je určen k tvorbě obrazu (faktor zvětšení 50–100×) projektiv • je tvořen dalšími čočkami, které určují výsledné zvětšení TEM a „promítají“ obraz na stínítko

Součástí elektronoptického systému v tubusu jsou clony: • Clona kondenzoru odcloní mimoosové elektronové svazky • Aperturní clona (součást objektivu) určuje aperturu elektronového svazku „paprsků“

Konstrukce TEM – preparátová komůrka Držák vzorku

1. Přesný a jemný posun (krok nm) 2. Posun v osách x, y, z, 3. Rychlá výměna preparátu

Konstrukce TEM – vakuový systém EM potřebuje vakuum: • ve vzduchu je elektron absorbován, (dosah elektronového svazku EM ve vzduchu je max. 1 m) • elektronové dělo musí být izolováno vakuem (vzduch není dobrý izolant), • vzduch obsahuje molekuly O2, N2, CO2 a hydrokarbonáty, které způsobují kontaminaci tubusu a vzorku. Běžné hodnoty tlaku atmosférický tlak ≈ 0,1 MPa (105 Pa) tlak v kosmickém prostoru ≈ 10-7 Pa Vakuum v preparátové komůrce ≈ 10-5 Pa  Vakuum v prostoru katody ≈ 10-5 Pa (pro LaB6), 10-7 Pa (FEG)  Vakuum v prostoru stínítka ≈ 10-3 Pa (je zde film pro záznam obrazu) Vakuový systém EM je tvořen řadou ventilů spojených s vývěvami

Konstrukce TEM – vakuový systém

Schema vakuového systému moderního TEM

3 oddělené vakuované komory 1. prostor katody 2. prostor preparátu 3. projekční komora Typy vývěv: • rotační vývěva (předvakuum) • difúzní olejová vývěva • iontová (Ti – sublimační, 100 litrů/s) • turbomolekulární Měření vakua: měrkami Piraniho typu Cyklus vzduchem uzavíratelných ventilů (čerpání rotačními vývěvami cca 30 s.) Čerpání preparátové komory s výměnou vzorku trvá několik minut. Pro kryoaplikace (biologické vzorky) je nutné odstranit usazování ledu na povrchu vzorku (kryostat s LN2)

Základní pracovní režimy TEM Světlé a temné pole Difrakce TEM vysokého rozlišení TEM Tomografie Rentgenová mikroanalýza

Metoda světlého a tmavého pole Světlé pole - standardní režim zobrazení

rovina preparátu Na tvorbě obrazu se podílí paprsky přímo procházející preparátem, boční difrakční maxima jsou zachycena aperturní clonou. aperturní clona (v obrazové ohniskové rovině objektivu) (obvykle 4 – 8 průměrů AC) Obraz světlého pole krystalu MnO (krystaly leží na tenké C vrstvě na měděné síťce)

Temné pole

vysunutím AC excentricky mimo osu, necháme procházet preparátem pouze paprsky 1. difrakčního maxima. Použití pro zvýšení kontrastu krystalických materiálů

TEM jako difraktograf 1. pro identifikaci krystalů, 2. pro stanovení orientace krystalu. Difrakční obrazec vzniká v obrazové ohniskové rovině objektivu (podobnost se SM) projektiv je pro sledování obrazu zaostřen na rovinu obrazu vytvořeného objektivem. Pro studium difraktogramů je nutné přeostřit Pr na OOR. Příklad:

dva typy elementárních buněk

dvě roviny (vzdálenost rovin 1/2 délky elementární buňky)

čtyři roviny (1/4 el. buňky)

Pro horizontální směr: Pro dvě roviny – reciproká vzdálenost = 2 (dva body ve dvojnásobné vzdálenosti od středu), Pro čtyři roviny – reciproká vzdálenost = 4 (čtyřnásobná vzdálenost od středu) Při započítání ostatních směrů dostaneme 3D síť mřížových bodů

Difraktogram Si

difraktogram Si3 (hexagonální symetrie)

Elektronová mikroskopie s vysokým rozlišením – HRTEM Splnění několika podmínek:

1. náklon vzorku tak, aby umožnil průchod elektronového svazku podél uspořádaných atomů (viz. obrázek atomů v mřížce), 2. použití apertury s velmi malým průměrem pro dosažení úzkého elektronového paprsku, 3. zpravidla se používá vyšší urychlovací napětí (nad 300 kV). TEM obraz atomů Si s vysokým rozlišením vzdálenost mezi atomy (bližšími) 0,14 nm skutečná struktura (vlevo nahoře)

Azbestová vlákna na síťce

struktura azbestu s vysokýtm rozlišením

HRTEM (High Resolution Transmission Electron Microscopy)

TEM tomografie Co je třeba k získání 3D informace? Každý obrázek je 2D projekcí z 3D objektu

Jak získat 3D informaci v TEM? ●

●

Stereo zobrazování (TEM) ●

Dva stejné obrázky získané při různých náklonech dávají stereo obraz

●

Nevýhoda je omezená hloubka ostrosti

Série řezů (TEM) ●

●

●

Sestavení 3D obrazu ze série řezů jejich složením Nevýhoda: značná doba pořízení dílčích řezů a jejich analýza. Dochází ke ztrátě obrazových dat

Tomografie (TEM) ●

●

Získání série obrazových dat z náklonu vzorku a jejich 3D softwarová rekonstrukce Výhoda:

+ rychlost (limitovaná rychlostí zpracování dat v PC + obraz s vysokým rozlišením (5 nm)

TEM tomografie – princip

Objemová rekonstrukce obrazu Automatizovaný sběr dat

Vizualizace

‘3D

TEM tomografie – princip 

Pořízení obrazů při náklonu



Seřazení projekcí



Rekonstrukce



Vizualizace a analýza

TEM tomografie – princip 

Pořízení obrazů při náklonu



Seřazení projekcí



Rekonstrukce



Vizualizace a analýza obrazu

TEM tomografie – princip 

Pořízení obrazů při náklonu



Seřazení projekcí



Rekonstrukce



Vizualizace a analýza obrazu

TEM tomografie – princip ●

Plně automatizovaný sběr dat

30–60 min. ●

Rekonstrukce 10 min.

●

Objemové rozpoznání

90 min.

Bakterie Courtesy: Dr. Kobayashi, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Osaka, Japan

(Movie 9 sec.)

Příprava preparátů pro TEM Hlavní cíl: Získat morfologickou informaci (reprodukovatelným způsobem) se snahou potlačit jakékoliv artefakty preparátu. Tenká transparentní fólie – pro zachycení ultratenkých řezů tkání nebo suspenze částic uhlíková fólie – 20 až 50 nm, plastická fólie (Formvar ředěný v etylendichloridu <0,5%) – 20 nm Podmínka: stabilita při prozařování elektrony, nízká zrnitost, kontrast porovnatelný se vzorkem. Příprava plastické fólie je snadnější než čisté C vrstvy (pro HRTEM je vhodnější C fólie) Síťka pro TEM – pevná podpora pro fólie (řezy) vyrobená z Cu (antiferomagnetikum) Mesh 100 (100 čar/palec)

Označení MESH

Mesh 400

Příprava preparátů pro TEM Postup nanesení fólie na síťku a – sklíčko ponořit do roztoku s Formvarem b – vysušení v bezprašném prostředí c – fólie splavená na hladinu vody d – síťka na proužku papíru pod fólii

Příprava uhlíkové fólie

Příprava preparátů pro TEM Ultratenké řezy

Vrstvou o tloušťce 100 nm (biologický preparát o  = 1 g.cm-3) prochází 50 % elektronů při UN = 50 kV  není možné pozorovat celé buňky. Obvyklá tloušťka tenkého řezu 50 nm. Pro řezání musí být tkáň speciálně připravena:  odběr tkáně (krájení v kapce fixáže na polyetylénu) nebo buněk (přímo do fixativa)  fixace  odvodnění  kontrastování  zalití do bločků  krájení

Zalévání vzorku do bločku Ultratenké řezy

Vlastnosti ideální zalévací hmoty (Durcupan, Vestopal, …):  rozpustnost v etanolu nebo acetonu před polymerizací,  neovlivňuje chemicky vzorek,  nezpůsobuje pnutí ve vzorku,  homogenně tuhá, ale dostatečně plastická,  stabilní při ozařování elektronovým paprskem. Bloček tkáně je párátkem přenesen na dno želatinové kapsle a zalit zalévací hmotou. Ořezání bločku do tvaru komolého jehlanu Ploška by měla mít velikost 0,5 mm

Ultramikrotomie

Stínování těžkými kovy Zvýraznění povrchové topografie odpařováním kovu ze strany latexové kuličky (0,3 µm) stínované a) Au b) Au–Pd Kovy používané na stínování:  vysoká hustota,  inertnost vzhledem k chemickým vlivům a teplotě,  Au, Pd, Cr, Ni, Ge, Pt, U.  Cr pod 5 nm vykazuje granularitu.  Slitina Pt-Pd (3:1) je vhodnější než čistá platina. Slitina dává tloušťku 0,3–1,5 nm.

Repliky Vzorky silnější než 0,1 µm nemohou být studovány v TEM (rozptyl, absorpce). Metoda povrchových replik spočívá v otisku povrchu do tenkého filmu transparentního pro elektrony (C, Formvar atd.). Tloušťka repliky je cca 20 nm. Z důvodu malého kontrastu je dodatečně stínována. Způsob vytváření replik: a - rozpuštěním vzorku b - odtržením z povrchu a odstraněním pásky Negativní replika Nanesení plastického (nebo C) filmu, sloupnutí (obtížné), stínování Pozitivní replika postup přípravy pozitivní repliky

Metody mrazového sušení, lomu a odpařování (Freeze Drying/ Fracturing/ Etching) Freeze drying zmražení v LN2 sublimace ledu ve vakuu porovnání sušení na vzduchu a metodou Freeze–Drying (zabrání se agregaci částic)

Při mrazovém sušení buněk může být jako mezistupeň zařazeno nanesení uhlíkového filmu pro dosažení lepšího kontrastu

Freeze fracturing (etching) Metody umožňují zkoumání objektů ve zmraženém stavu. Odpadá fixace chemickými činidly (a tedy možných chemických reakcí se vzorkem). Rozlišení je dáno zrnitostí nanášeného kovu, z něhož je vyrobena replika. Freezing Kousek tkáně (buněčné suspenze) je rychle zmražen (LN2) a přenesen do vakuovaného

prostoru s nízkou teplotou. Fracturing Zmrzlá tkáň je zchlazeným nožem obnažena (zlomena) a dochází k sublimaci ledu z povrchu (-90 oC) do hloubky 10 – 30 nm.Vytvoří se reliéf povrchu. Povrchová topografie kopíruje buněčné membrány a organely. Povrch se bezprostředně stínuje kovem a nanáší se C film pro vytvoření repliky.

Postup: a. b. c. d. e. f.

izolace tkáně zmražení mrazový lom sublimace ledu stínování a příprava repliky čištění repliky

Trasnmisní elektronový mikroskop JEM 2010 (JEOL)

Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) je zobrazovací technikou využívající průchodu urychlených elektronů vzorkem a jeho zobrazení na fluorescenčním stínítku nebo záznamu na film nebo speciální CCD kameru. Podle zvoleného urychlovacího napětí je možné měřit velikosti nanočástic do 0,1 nm. Aplikace: stanovení velikosti a distribuce částic, morfologie nanočástic, chemického složení, krystalické struktury. Rozlišovací mez 0.194 nm Urychlovací napětí: 80–200 kV Zvětšení: 50–1,500 000×

Závěr

http://atmilab.upol.cz http://nanocentrum.upol.cz