19
METODE Bahan Sampel udang vaname Sampel diperoleh dari dua lokasi tambak yang berbeda yaitu di daerah Situbondo dan Lampung. Sampel udang terinfeksi IMNV diperoleh dari Balai Budidaya Air Payau (BBAP) Situbondo, berupa fiksatif organ udang yang dikoleksi dari tambak udang vaname yang terinfeksi IMNV. Sampel udang vaname terinfeksi IMNV dari Situbondo digunakan untuk deteksi fragmen gen ORF1 IMNV untuk keperluan pembuatan DNA rekombinan IMNV. Aplikasi qRT-PCR IMNV menggunakan sampel udang vaname yang berasal dari Lampung. Sampel udang vaname diambil dari tambak udang di wilayah Lampung Selatan,berukuran 16-17 gram/ekor. Kriteria sampel yang diambil adalah udang vaname yang memiliki gejala klinis dan udang vaname yang tidak menunjukkangejala klinis terinfeksi IMNV (sub klinis). Bahan dan Primer untuk nested RT-PCR dan real time RT-PCR Ekstraksi RNA diperoleh dari organ target infeksi IMNV yaitup pleopod, dan jaringan otot khususnya pada ruas abdomen ke-6 udang vaname. Organ tersebut diekstraksi menggunakan Silica extraction solutionTM(Farm Intelligence) untuk mendapatkan ekstrak RNA. Selanjutnya hasil ekstraksi disimpan pada deep freezer -70ºC saat belum digunakan. Pada pembuatan kontrol positif berupa plasmid DNA rekombinan IMNV, ekstrak RNA disintesis terlebih dahulu menjadi cDNA menggunakan primer spesifik IMNV 218F. Sintesis cDNA menggunakan kit ImProm-II RTSystem (PromegaTM). Pengujian IMNV dengan teknik nested RT-PCR menggunakan 2 pasang primer yang dibuat berdasar urutan basa nukleotida wilayah ORF1 IMNV yaitu 4587F-4914R untuk amplifikasi pertama (first step) dan primer 4725F-4863R untuk nested PCR (OIE 2010). Pengujian ini menggunakan 2 (dua) jenis bahan amplifikasi berupa access quick RT-PCR untuk one step RT-PCR dan GoTaq Green Master Mix (PromegaTM) untuk nested PCR. Salinan pada RT-PCR berupa ekstrak RNA, sedangkan salinan untuk nested PCR berupa produk PCR dari first step RT-PCR. Analisa produk PCR menggunakan gel agarose 1,5% (w/v) dengan pewarna SYBR safe (Invitrogen). Pengujian real timeRT-PCR IMNV menggunakan kit komersial IQ REALTM IMNV Quantitative System (Farming Intelligene). Kit komersial ini telah dilengkapi dengan kontrol positif IMNV yang terkuantifikasi jumlah salinan virusnya sehingga dapat langsung diaplikasikan untuk pengujian sampel secara langsung. Untuk keperluan pengembangan teknik diagnosa IMNV dengan real time PCR, metoda standar yang direkomendasikan OIE (2010) adalah qRT-PCR IMNV TaqMan probe. Menggunakan bahan QuantiTect probe qRT-PCR kit (Qiagen), desain primer qRT-PCR IMNV TaqMan probedari wilayah ORF1 IMNV sesuai rancangan Andrade et al., (2007) yaitu pada urutan nukleotida 412545 dan primer probe IMNV didesain pada urutan nukleotida 467-500 wilayah ORF1 IMNV (Andrade et al., 2007; OIE, 2010).
20 Metoda qRT-PCR IMNV TaqMan probe memerlukan kontrol positif IMNV yang terkuantifikasi. Desain primer untuk pembuatan plasmid DNA rekombinan IMNV (IMNVpl) dari wilayah ORF1 IMNV pada urutan nukleotida 218682.Keseluruhan desain primer untuk pengujian IMNV dengan nested RT-PCR maupun dengan qRT-PCR IMNVTaqMan probedisajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Primer dan probe yang digunakan untuk deteksi virus IMN dengan nested RT-PCR dan qRT-PCR TaqMan probe Primer Sekuen (5’ - 3’) Referensi 4587 F CGACGCTGCTAACCATACAA First RT-PCR 4914 R ACTCGGCTGTTCGATCAAGT OIE (2010) 4725 F CGACGCTGCTAACCATACAA Nested PCR 4863 R AGCGCTGAGTCCAGTCTTG OIE (2010) 218 F GCTGGACTGTATTGGTTGAG Andrade et al., 682 R AACCAAGTTCTTCTTCTCCAGTT (2007) 412 F GGACCTATCATACATAGCGTTTGCA RT-PCR IMNV 545 R AACCCATATCTATTGTCGCTGGAT TaqMan probe Probe -6FAMCCACCTTTACTTTCAATACTA OIE (2010) IMNVp1 CATCATCCCCGGTAMRABahan untuk Kloning dan Sekuensing Kegiatan kloning gen ini menggunakan bahan Qiagen PCR Cloningplus kit (Qiagen). Urutan nuklelotida IMNV yang akan disisipkan pada vektor kloning adalah sepanjang 464 bp, menggunakan primer 218F – 682R (Andrade et al., 2007). Proses ligasi menggunakan pDrive Cloning vector, dilanjutkan transformasi ke dalam sel kompeten QIAGEN EZ Competent Cells (F'::Tn10(Tcr) proA+B+ lacIqZΔM15 recA1 end A1 hsdR17 (rK12 – mK12 +) lac glnV44 thi-1 gyrA96 relA1).Seleksi koloni rekombinanbakteri E.coliyang telah disisipi vektor plasmidmenggunakan media tumbuh Luria Bertani (LB) agar yang mengandungAmpicilin 1000µg/ml, Xgal dan IPTG. Media LB agar tanpa penambahan Xgal dan IPTG digunakan untuk pemurnian bakteri rekombinan E.coli hasil seleksi koloni. Perbanyakan bakteri E.coli menggunakan media LB cair yang telah ditambahkan Ampicilin. Purifikasi plasmid bakteri E.coli menggunakan bahan QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen). Purifikasi hasil amplifikasi untuk keperluan sekuensing menggunakan ethanol absolut (Sambrook dan Russel, 2001). Sekuensing menggunakan bahanBig Dye Reaction MixTM(AB Applied Biosystem), hasil purifikasi produk PCR cycle sequencing ditambahkan HI-DI Formamidesebelum digunakan sebagai cetakan. Sekuensing plasmid DNA rekombinan IMNV menggunakan primer spesifik IMNV dan primer promotor vektor. Sesuai dengan vektor plasmid yang digunakan, untuk melihat ketepatan insersi gen target dalam vektor plasmid digunakan primer F-SP6 promoter (5'CATTTAGGTGACACTATAG3’) dan primer R-T7promoter (5' GTAATAC GA CTCACTATAG3’) Alat Peralatan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari peralatan plastik habis pakai (dispossible) seperti micro pastle, tabung mikro ukuran 1,5 ml dan 0,2
21 ml, serta tip mikro berbagai ukuran (0,5-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 100-1000 μl). Peralatan laboratorium yang digunakan disesuaikan dengan kegiatan yang dilaksanakan. Peralatan untuk ekstraksi RNA diantaranya adalah disecting set, pipet mikro, thermal block, micro centrifuge, vortex mixer, dan deep freezer untuk penyimpanan hasilnya. Reaksi amplifikasi berlangsung dalam mesin thermal cyler ABI GeneAmp 9700 (Applied BioSystem), deteksi produk PCR menggunakan mesin elektroforesis set dan visualisasi gel dengan UV doc (UVITEC). Real time RT-PCR menggunakan mesin real time PCR Rotor-Gene Q (Qiagen). Sekuensing menggunakan metoda Sanger dalam mesin sequencer ABI 3130 Genetic Analyser (Applied BioSystem). Isolasi dan perbanyakan bakteri E.coli memerlukan peralatan glass were khususnya cawan petri dan tabung reaksi, jarum ose, dan inkubator untuk inkubasi bakteri E.coli dalam media LB agar setelah proses transformasi. Bakteri E.coli hasil seleksi koloni ditumbuhkan pada media LB cair dan memerlukan shaking incubator untuk inkubasi, agar pertumbuhannya merata.
Prosedur Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian berlangsung dari bulan April hingga November 2012. Sampel udang vaname (L.vannamei) yang telah diuji positif IMNV berasal dari BBAP Situbondo, dikirimkan sebagai kandidat gen target yang akan diinsersikan pada pembuatan plasmid DNA rekombinan IMNV.Sampel udang vaname yang akan diuji dengan real time RT-PCR IMNV adalah sampel udang yang berasal dari area tambak di kabupaten Pesawaran, Lampung Selatan. Sampel udang vaname dari Lampung dikoleksi pada kurun waktu antara bulan Mei hingga Oktober 2012. Identifikasi gen target dilaksanakan di laboratorium Virologi, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan Institus Pertanian Bogor (IPB). Kloning, sekuensingdan optimasi real time RT-PCR IMNV dilaksanakan di laboratorium Balai Uji Standar Karantina Ikan Jakarta. Desain dan Kerangka Konsep Penelitian Pengembangan Teknik real time RT-PCR Dan Karakterisasi Molekuler Untuk Deteksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) pada Udang vaname(Litopenaeus vannamei) didesain melalui beberapa tahapan : 1. Menentukan gen target ORF1 IMNV dengan nested RT-PCR (OIE,2010) dan karakterisasi molekuler, 2. Menentukan LOD IQ RealTMQuantitative System (FarmingIntelligene), 3. Membandingkan sensitifitas pengujian qRT-PCR IMNV dan nested RTPCR IMNV pada sampel udang vaname dengan status klinis dan sub klinis terinfeksi IMNV. 4. Pengembangan pengujian qRT-PCR IMNV non kit dengan kloning fragmen gen ORF1 IMNV sebagai kandidat kontrol positif qRT-PCR IMNV TaqMan probe, dan analisa hasil sekuensing menggunakan primer spesifik dan primer M13 (promotor vektor).
22
Gambar 11 Kerangka Konsep Penelitian
Ekstraksi RNA dan Sintesis cDNA Ekstraksi RNA menggunakan Silica extraction solutionTM(Farming Intelligence). Sampel organ 20 mg dipotong-potong halus di dalam tabung mikro 1,5 ml dan ditambahkan 900µl GT buffer untuk dihomogenkan. Tabung disentrifugasi 12.000 rpm selama 3 menit. Sebanyak 600µl supernatan ditambahkan kedalam 40µl silica, dihomogenkan dengan memvortex selama 20 detik hingga larutan menjadi keruh. Selanjutnya disentrifugasi 12.000 rpm selama 15 detik, dan supernatan dibuang sebelum ditambahkan 1000 µl ethanol 70%. Vortex selama 20 detik hingga keruh, dan sentrifugasi kembali 12.000 rpm selama 15 detik. Supernatan dibuang dan ditambahkan 500 µl DEPC ddH2O, homogenkan dengan memvortex. Inkubasikan pada suhu 55ºC selama 10 menit. Sentrifugasi 12.000 rpm selama 2 menit, supernatan dipindahkan kedalam tabung 1,5 ml baru. Ekstrak RNA dapat disimpan pada suhu -70C sebelum digunakan. Sintesis cDNA dengan primer spesifik IMNV 218F menggunakan kit ImProm-II RTSystem (PromegaTM). Tabung mikro berisi 2 µl RNA, 2 µl NFW dan Primer 218F sebanyak 1 µl (20 pmol/reaksi) diinkubasi pada suhu 70ºC selama 5 menit, dan segera didinginkan dalam air es (5ºC) selama 5 menit. RT mix dibuat dengan mencampurkan ImProm-II 5x buffer 4 µl, MgCl2 (konsentrasi final 1,5-8 mM) sebanyak 6,4 µl, dNTP Mix (konsentrasi 0.5mM tiap dNTP), Recombinant RNasin® 0,5µ (20U), ImProm-II™ reverse transcriptase 1.0 μl, dan nuclease-free water hingga vol 15μl. RNA yang telah diinkubasi dimasukkan kedalam campuran RT mix hingga total volume 20 µl. Selanjutnya diinkubasi 25°C selama 5 menit, dan proses reverse transcription (RT)
23 berlangsung pada suhu 42°C selama 1 jam. Inaktivasi proses reverse transcriptionpada suhu 70°C selama 15 menit. Menentukan Fragmen Gen ORF 1 IMNV Seleksi awal (screening) untuk menentukan sampel positif IMNV menggunakan nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested RTPCR) dengan dua pasang primer 4587F-4914R untuk first step, dan primer 4725F-4863R untuk nested PCR (OIE, 2010). Amplifikasi RT-PCR IMNV ini merupakan one step RT-PCR dimana sampel berupa ekstrak RNA udang vaname ditranskripsi balik (reverse transcription) dengan primer spesifik bersamaan dengan proses amplifikasi. Selanjutnya produk PCR yang dihasilkan digunakan sebagai salinan untuk nested PCR IMNV dengan primer 4725F-4863R. Visualisasi produk PCR dengan gel elektroforesis 1,5% (w/v) agarose pada target pita 328 bp (first step) dan 139 bp (nested PCR). Sampel yang terdeteksi positif IMNV dipisahkan untuk seleksi fragmen gen ORF1 IMNV. Amplifikasi fragmen gen ORF1 IMNV pada urutan nukleotida 218-682 digunakan kombinasi 2 pasang primer yaitu primer 218F-545R dan 412F-682R sesuai rancangan Andrade et al., (2007). Sampel yang menjadi salinan pada amplifikasi fragmen gen ORF1 IMNV ini berupa cDNA, sehingga sampel berupa ekstraksi RNA harus ditranskripsi balik menjadi cDNA dengan primer spesifik 218F. Formulasi dan profil amplifikasi nested RT-PCR IMNV disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Formulasi bahan amplifikasi nested RT-PCR IMNV dan ampifikasi fragmen gen ORF1 IMNV (218-682) RT-PCR IMNV Nested PCR IMNV ORF1 218-682 (OIE, 2010) (OIE, 2010) (Andrade et al., 2007) 12,5 µl Access quick TM (Promega) AMV 0,2 U μl–1 Primer F-R @0,4 µM 1-50 ng total RNA (±7 µl) NFW hingga volume 25µl
12,5 µl Go taq Green Mastermix (Promega) -
o
-
Primer F-R @0,4 Primer F-R @ 5 pmol µM 2 µl produk PCR 2 µl cDNA sampel first step NFW hingga volume NFW hingga volume 25µl 25 µl,
Profil Amplifikasi RT suhu 60 C 30’; 95 C 2’ Pre 95oC 2’ (39 siklus) 95oC 45”; 60oC (39 siklus) 95oC 45”; Final 60o C 7 menit 30”; 65oC 30”; 72oC 30”; F inal 72oC 2’ o
12,5 µl Go Taq Green Mastermix (Promega)
Pre 95oC 2’ (39 siklus) 94oC 45”; 60oC 45”, 72ºC 45”; Final 72ºC 10 menit
Purifikasi produk PCR positif IMNV menggunakan purifikasi ethanol absolut. Ditambahkan ethanol sebanyak 5x volume produk PCR untuk mengendapkan DNA target. Inkubasi ethanol dan produk PCR pada suhu -20ºC
24 semalaman. Selanjutnya produk PCR disentrifugasi 12.000 rpm pada suhu 4 ºC selama 15 menit, ethanol dibuang hingga menyisakan pelet DNA. Pencucian dengan menambahkan ethanol 70% sebanyak 60 µl dan sentrifugasi kembali selama 3 menit. Untuk melarutkan pelet digunakan Nuclease Free Water sebanyak 20-30 µl. Konsentrasi purifikasi diukur menggunakan GenQuant spectrofotometer. Hasil purifikasi ini digunakan untuk sekuensing dan ligasi pada kloning gen. Karakterisasi Molekuler (Sekuensing) Penentuan urutan basa DNA (sekuensing) memerlukan produk PCR berupa fragmen DNA yang telah dipurifikasi. Sekuensing menggunakan metode dideoksi pada empat reaksi terpisah. Setiap produk PCR yang disekuensing memerlukan primer tunggal untuk setiap reaksinya. Tahapan sekuensing dimulai dengan amplifikasi hasil purifikasi. Bahan yang digunakan untuk setiap reaksi amplifikasi adalah Big Dye Reaction Mix TM (2,5x) 4 µl, sequen buffer (5x) 2µl, sekuen primer tunggal (F218; R545; F412; R682) 3,2 pmol (~1µl), salinan hasil purifikasi produk PCRproduk PCR 10 ng/100 bp (~1-2 µl), nuclease free water hingga volume akhir 20µl. Keseluruhan bahan dimasukkan dalam tabung 0,2 ml untuk proses amplifikasi (cycle sequencing). Profil amplifikasi cycle sequencing dimulai dengan denaturasi awal pada suhu 96ºC selama 1 menit, 25 siklus 96ºC 10 detik, 50ºC 5 detik, 60ºC selama 4 menit. Setelah proses amplifikasi dilanjutkan dengan purifikasi produk PCR menggunakan ethanol absolut. Ethanol absolut ditambahkan 3 kali volume produk PCR setiap reaksi, dihomogenkan dengan membolak-balik tabung sebelum diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Campuran disentrifugasi 2500xg (4000-5000 rpm) untuk mengendapkan DNA. . Supernatan sellanjutnya dibuang dan pelet DNA dicuci dengan menambahkan ethanol 70% sebanyak 3 kali volume produk PCR per-reaksi dan disentrifugasi pada 4000 rpm suhu 4ºC selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet DNA dikeringkan untuk menguapkan sisa-sisa ethanol selama 10-15 menit. Denaturasi sampel diawali dengan menambahkan Hi-Di Formamide kedalam tabung sampel hasil purifikasi cycle sequencing. Volume Hi-Di Formamide yang ditambahkan sama banyak dengan volume produk cycle sequencing. Vortex dan spin larutan dilakukan selama 1 menit, selanjutnya sampel dipanaskan pada suhu 95ºC selama 2-5 menit dan segera pindahkan ke dalam es (suhu 4ºC) sebelum dimasukkan kedalam mesin sequencer. Sebanyak 10-13 µl sampel dimasukkan dalam 96 well microplate, dan tutup dengan septa sebelum dimasukkan dalam tray mesin sequencer. Hasil sekuensing tersebut disimpan dalam bentuk ABI file. Hasil sekuen kedua produk PCR 327 bp dan 270 bp digabungkan membentuk urutan nukleotida sepanjang 464 bp.Urutan nukleotida hasil sekuensing diedit secara manual berdasar kromatogram, menggunakan program BioEdit. Homologi dari urutan nukleotida sejenis yang tersimpan dalam database GenBankdianalisis menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Limit deteksi nested RT-PCR dan real time RT-PCR IMNV. Limit deteksi (LOD) real time RT-PCR IMNV dengan kit IQ Real IMNV Quantitative System (Farming Intelligene) ditentukan dengan membuat serial pengenceran kontrol positif IMNV yang telah terkuantifikasi. Konsentrasi kontrol
25 positif IMNV kit IQ-Real adalah 106 salinan virus IMNV, selanjutnya diencerkan hingga 101untuk pembuatan standar kurva pengujian. Standar kurva ini akan digunakan untuk kuantifikasi jumlah salinan virus IMN pada sampel yang diuji dengan kit IQ-Real qRT-PCR IMNV. Limit deteksi qRT-PCR IMNV dengan TaqMan probe belum dapat dibuat standar kurva uji untuk kuantifikasi salinan virus karena kontrol positif IMNV belum terkuantifikasi jumlah salinannya. Limit analitik pengujian IMNV dengan nested RT-PCR dan qRT-PCR IMNV TaqMan probe diperoleh melalui pembuatan seri pengenceran RNA sampel positif IMNV hingga pengenceran 10-3 sebagai template pada pengujian dengan nested RT-PCR dan qRT-PCR IMNV Taqman probe. Pengenceran ini bertujuan untuk memperoleh limit deteksi kedua metoda tersebut. Formulasi bahan amplifikasai sesuai dengan Tabel 3. Tabel 3 Formulasi bahan dan profil amplifikasi qRT-PCR TaqMan probe (OIE,2010) dan kit IQ-Real REALTM IMNV Quantitative System (Farming Intelligene) qRT-PCR TaqMan Probe IMNV (OIE,2010)
IQ REALTM IMNV Quantitative System (Farming Intelligene)
QuantiTect probe RT-PCR Master Mix 12,5 µl
20 µl Real-Time PreMix
QuantiTect RT Mix 0,25 µl Primer F412/R545 @ 0,5 µl (20 pmol)
RTzyme Mix 1 µl 2 µl IQzyme DNA Polymerase 2U/µl
IMNV probe 0,25 µl (10 pmol)
-
Template RNA 2 µl (1 ng) NFW hingga volume 25µl RT suhu 42ºC 30’; (40 siklus) suhu 93ºC 15”, suhu 60ºC 1’
Templalte RNA sebanyak 2 µl Total volume/ reaksi : 25µl RT suhu 50°C 30’; 95°C 10’; (40 siklus) suhu 95°C 15”, suhu 60°C 1’
Sensitifitas diagnostik nested RT-PCR dan qRT-PCR IMNV pada sampel udang vaname (klinis dan sub klinis) Sampel udang vaname dari Lampung yang memiliki gejala klinis dan sub klinis terinfeksi IMNV diperiksa dengan nested RT-PCR dan qRT-PCR IMNV. Sensitifitas uji nested RT-PCR dan qRT-PCR IMNV diperoleh dengan membandingkan hasil pengujian kedua metoda tersebut. Pengujian real time RTPCR menggunakan kit IQ Real IMNV Quantitative System (Farming Intelligene) yang telah dilengkapi dengan kontrol positif yang terkuantifikasi, sedangkan nested RT-PCR menggunakan 2 pasang primer untuk first step dan nested (OIE, 2010). Deteksi produk PCR dengan gel elektroforesis (1,5% agarose), sampel positif IMNV ditandai dengan munculnya pita DNA 328 bp (first step) dan atau 139 bp (nested) (OIE, 2010). Kloning fragmen gen ORF1 IMNV Berdasar hasil analisis sekuensing antar isolat lapang IMNV dapat ditentukan fragmen gen yang akan digunakan dalam tahapan kloning. Hasil
26 purifikasi produk PCR kembali dielektroforesis untuk memastikan keberadaan gen target. Kegiatan kloning gen ini menggunakan bahan Qiagen PCR Cloning plus kit (QiagenTM). Keseluruhan reagen dicairkan diatas es. Ligasi memerlukan komposisi bahan berupa 2x Ligation Master Mix 5 µl, pDrive Cloning vector 1µl,hasil purifikasi produk PCR 3 µl, dan ddH2O hingga volume 10 µl. Ligasi berlangsung pada suhu 100 C selama 2 jam, selanjutnya hasil ligasi disimpan pada suhu -200C hingga saat akan digunakan. Proses transformasi menggunakan sel kompeten QIAGEN EZ Competent Cells sebanyak 50 µl yang dicairkan diatas es. Hasil ligasi sebanyak 2 µl dimasukkan dengan hati-hati dan dihomogenkan dengan membolak balik tabung 4-5 kali. Suspensi diinkubasi didalam pecahan es selama 2 menit, selanjutnya dilakukan heat shock pada suhu 42ºC selama 30 detik dan diinkubasi kembali kedalam pecahan es selama 2 menit. Media SOC broth sebagai media tumbuh rekombinan bakteri ditambahkan sebanyak 200 µl kedalam suspensi tersebut, dan diinkubasi pada suhu 37º C pada shaker incubator (100 rpm) selama 1 jam. Secara hati-hati suspensi dicampur dengan membolak-balikkan tabung untuk selanjutnya disentrifugasi 12.000 rpm 1 menit untuk membuang ± 100 µl media SOC (supernatan) sebelum platting pada media Luria Bertani agar. Seleksi koloni, kultur dan isolasi plasmid DNA rekombinan IMNV Media Luria Bertani (LB) agar untuk menumbuhkan rekombinan bakteri E.coli mengandung ampicilin, Xgal dan IPTG. Suspensi bakteri yang telah diinkubasi pada shaker incubator ditanam pada media LB agar dengan teknik spriding, dan diinkubasi semalaman pada suhu 37ºC. Seleksi koloni dilakukan setelah inkubasi untuk membedakan bakteri yang tertransformasi. Terdapat 2 (dua) jenis koloni yaitu putih dan biru (Gambar 12a), koloni yang dimurnikan dan ditanam kembali pada media LB agar adalah koloni yang berwana putih. Menggunakan tusuk gigi steril (kayu), koloni diambil dan ditanam pada media LB agar(Gambar 12b), dan dimasukkan dalam tabung LB cair yang telah ditambahkan ampicilin 1000 µg/ ml (Gambar 12c). Media LB agar diinkubasi pada suhu 35ºC, dan media LB cair diinkubasi pada shaking incubator pada suhu 37ºC selama ±16 jam (Gambar 12d). Isolasi plasmid DNA rekombinan IMNV (pIMNV) terbagi menjadi 3 tahap yaitu melisiskan sel, pencucian dan elusi (pelepasan DNA). Bakteri yang telah tumbuh pada media LB broth dipindahkan ke tabung baru dan disentrifugasi pada 8000 rpm selama 3 menit untuk mendapatkan pelet bakteri. Isolasi pIMNV dari bakteri menggunakan QIAprep® Spin Miniprep Kit dengan melarutkan pelet bakteri dalam 250µl buffer, setelah itu ditambahkan 250 µl buffer P2 dan dihomogenkan dengan memipet 4-6 kali (, dari 5 menit) hingga larutan berwarna biru. Selanjutnya ditambahkan 350 µl buffer hingga tercampur sempurna (larutan berwarna bening) dan sentrifugasi selama 10 menit pada 13.000 rpm. Masukkan larutan pada spin coloumn dan sentrifugasi selama 60 detik, buang cairan pada collection tube dan tambahkan 500 µl buffer PB sentrifugasi kembali untuk membuang cairan. Buffer PE ditambahkan 750µl, sentrifugasi kembali selama 60 detik untuk menghilangkan wash buffer tersebut. Collection tube dipindahkan ketabung mikro 1,5 ml baru, dan ditambahkan 20-50µl EB buffer untuk melarutkan DNA dari filter spin coloumn.Sentrifugasi setelah didiamkan selama 1
27 menit. Plasmid DNA rekombinan IMNV 218 dan 412 diukur konsentrasinya menggunakan GenQuant.
Gambar 12 Seleksi dan pembiakan bakteri E.coli . (a) Seleksi koloni; (b) Pemurnian koloni; (c) biakan koloni pada LB cair; (d) inkubasi 37ºC dalam shaking incubator
Sekuensing plasmid DNA rekombinan IMNV Sekuensing plasmid DNA rekombinan IMNV untuk meHasil purifikasi plasmid diamplifikasi menggunakan primer spesifik IMNV sesuai dengan produk PCR yang disisipkan (insersi) dan primer vektor plasmid F-SP6 promoter (5' CATTTAGGTGACACTATAG3’); R-T7 promoter (5'GTAATACGACTCAC TATAG3’). Elektroforesis dilakukan untuk memastikan panjang basa telah sesuai target. Produk PCR selanjutnya dipurifikasi menggunakan ethanol abosolut sebelum dijadikan salinan pada cycle sequencing.
Analisis Data Analisa hasil untuk mengetahui kemiripan (similiarity) fragmen gen ORF1 IMNV isolat Situbondo dan isolat Lampung dengan mensejajarkan (alignment) sekuen kedua isolat IMNV tersebut dengan sekuen isolat IMNV dari Brazil dan Indonesia yang ada di GenBank menggunakan program BioEdit BLAST nukleotida (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Analisis sensitifitas uji qRT-PCR IQ RealTM IMNV dengan nested RT-PCR IMNV terhadap seluruh sampel klinis dan sub klinis IMNV mengikuti rumus (Tabel 4) Tabel 4 Analisis sensitifitas diagnostik qRT-PCR dengan nested RT-PCR IMNV Nested RT-PCR IMNV Positif Negatif JUMLAH qRT-PCR Positif A B A+B IMNV Negatif C D C+D JUMLAH A+C B+D A+B+C+D a Menghitung sensitifitas diagnostik berdasar OIE (2012) : Sensitifitas
= A/(A+C) x 100%
Spesifisitas
= D/(B+D) x 100%
Data hasil analisis disajikan secara deksriptif.
