BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah daun salam, daun jati belanda, daun jambu biji yang diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka (PSB) LPPM-IPB Bogor. Bahan yang digunakan untuk uji fitokimia adalah: kloroform, H2SO4 2M, pereaksi Dagendorf, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, pereaksi Lieberman Burchard, NaOH 10% (b/v), metanol 30%, etanol 30%, FeCl3 1% (b/v). Bahan untuk uji apoptosis adalah: khamir (Saccharomyces cerevisiae), bubuk ekstrak khamir, bakto peptone, glukosa, bakto agar, etanol 70%. Bahan yang digunakan untuk uji antioksidan adalah: Larutan standar 1,1,3,3-tetrametoksi-propana (TMP) 6M, asam trikloroasetat (TCA) 20% , 2 mL Thiobarbituric acid (TBA) 1% (b/v) dalam asam asetat 50%, buffer fosfat 0.1 M pH 7, asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%, α-tokoferol, aquades. Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, kertas saring Whatman No. 40, neraca analitik, pipet tip, tabung Eppendorf, laminar air flow cabinet, shaker, autoklaf, penangas air, vorteks, spektrofotometer, sentrifuse Beckman J 21.
Metode Penelitian Pembuatan Ekstrak Tanaman. Serbuk kering daun salam, daun jati belanda dan daun jambu biji diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka (PSB) LPPM-IPB Bogor. Serbuk kering daun masing-masing diekstraksi dengan metode refluks. Serbuk kering daun sebanyak 20 gram diekstraksi dengan 200 mL pelarut etanol 70% selama 2 jam pada suhu 70oC menggunakan refluks. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No. 40. Ekstrak yang telah disaring diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 50oC dan dioven pada suhu 400C sehingga diperoleh ekstrak kasar dengan persen rendemen masing-masing adalah ekstrak daun salam 20,55 %, ekstrak daun jambu biji 21,1 % dan ekstrak daun jati belanda 18,30 %. Ekstrak selanjutnya dianalisis fitokimia.
Analisis Fitokimia Sampel (Harbone 1987) Uji Alkaloid. Ke dalam 10 mL kloroform ditambahkan ekstrak sampel sebanyak 0.1 g dan beberapa tetes amonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dagendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih oleh pereaksi Meyer, endapan merah oleh pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat oleh pereaksi Wegner. Sebagai sampel pembanding digunakan daun tapak dara Uji Saponin. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah air secukupnya dan dipanaskan selama lima menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok. Timbulnya busa selama ± 10 menit menunjukkan adanya saponin. Sebagai sampel pembanding digunakan buah klerak. Uji Flavonoid dan Fenolik Hidrokuinon. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah metanol 30% sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditambah NaOH 10% (b/v) atau H2SO4. Terbentuknya warna merah karena penambahan NaOH menunjukkan adanya senyawa fenolik hidrokuinon sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan adanya flavonoid. Sebagai sampel pembanding digunakan buah pinang. Uji Triterpenoid dan Steroid. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah 25 mL etanol 30% lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambah eter. Lapisan eter ditambah pereaksi Lieberman Burchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid. Sebagai sampel pembanding digunakan daun som jawa. Uji Tanin. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambahkan air kemudian dididihkan selama beberapa menit. Lalu disaring dan filtratnya ditambah FeCl3 1% (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin. Sebagai sampel pembanding digunakan daun teh. Analisis Hidroperoksida dari Oksidasi Asam Linoleat dengan Metode Diena Terkonjugasi (Kikuzaki dan Nakatani 1993). Sebanyak 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%, dan 1 mL air bebas ion dimasukkan ke dalam botol gelap yang berulir, kemudian campuran
diinkubasi pada suhu 40 oC selama 8 hari. Campuran sampel tersebut diambil 50 µL ke dalam 6 mL etanol 75%, kemudian Absorbansi diena terkonjugasi sampel diukur langsung menggunakan spektrofotometer sinar UV pada panjang gelombang 234 nm. Analisis hidroperoksida diukur setiap hari. Analisis Konsentrasi Malonadialdehida (MDA) dengan metode TBA (Kikuzaki dan Nakatani 1993). Campuran sampel yang dibuat terdiri atas 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%, dan 1 mL larutan sampel. Sebagai kontrol negatif dibuat campuran yang sama tetapi 1 mL larutan sampel diganti dengan 1 mL air bebas ion. Sebagai pembanding atau kontrol positif dibuat campuran yang terdiri atas 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8% yang mengandung α-tokoferol (vitamin E) 200 ppm total campuran, dan 1 mL air bebas ion. Semua campuran diletakkan pada botol gelap berulir, kemudian campuran diinkubasi dalam penangas air yang bersuhu 40°C dengan lama inkubasi 6 hari (2 hari setelah tercapainya puncak serapan pada hari ke-4). berdasarkan hasil pengukuran diena terkonjugasi dari asam linoleat. Campuran reaksi kemudian diuji potensi antioksidasinya. Masing-masing campuran diambil 1 mL kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20% (b/v) dan 2 mL larutan TBA 1% (b/v) dalam pelarut asam asetat 50% (v/v). Lalu campuran reaksi tersebut diinkubasi dalam penangas air bersuhu 100 °C selama 10 menit. Setelah dingin dilakukan sentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit, selanjutnya diukur serapannya pada λ 532 nm. Sebagai kurva standar, larutan stok pereaksi TMP konsentrasi 6 M dibuat menjadi 1.5, 3.0, 6.0, 9.0, 12.0, 15.0, dan 18.0 µM. Masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 1 mL, selanjutnya ditambahkan 2 mL TCA 20% (b/v) dan 2 mL larutan TBA 1% (b/v) dalam pelarut asam asetat 50% (v/v). Lalu campuran reaksi tersebut diinkubasi dalam penangas air bersuhu 100 °C selama 10 menit. Setelah dingin dilakukan sentrifugasi pada 3000 rpm (960 kali gravitasi) selama 15 menit, selanjutnya diukur serapannya pada λ 532 nm. Uji Apoptosis (Granot et al. 2003). Untuk uji apoptosis ada beberapa tahap yang diperlukan yaitu penyiapan dan perlakuan kultur khamir dengan ekstrak, uji viabilitas dan uji frekuensi petit.
Penyiapan Kultur Saccharomyces cerevisiae. Pada peremajaan sel khamir, sel ditumbuhkan pada media padat (YEPD) yang komposisinya adalah 1% yeast extract, 2% pepton, dan 2% glukosa, 1,8% agar serta aquades 200 mL. Sel diinkubasi 280C selama 2 hari. Sel khamir yang telah diremajakan sebanyak dua ose dipindahkan ke dalam 200 mL medium cair YEPD suhu 280C sampai fase stasioner selama 4 hari. Komposisi medium cair penumbuh khamir (YEPD) adalah 1% yeast extract, 2% pepton, dan 0.1% glukosa serta aquades 200 mL.
Setelah 4 hari khamir
0
disentrifus 4000 rpm, 4 C, selama 10 menit. Pelet yang didapat dicuci 2 kali dengan 40 mL aquades. Perlakuan Saccharomyces cerevisiae dengan Ekstrak. Sel khamir yang telah diremajakan sebanyak dua ose dipindahkan kedalam 200 mL medium cair YEPD suhu 280C sampai fase stasioner selama 4 hari. Komposisi medium cair penumbuh khamir (YEPD) adalah 1% yeast extract, 2% pepton, dan 0.1% glukosa serta aquades 200 mL. Setelah 4 hari khamir disentrifus 4000 rpm, 40C, selama 10 menit. Pelet yang didapat dicuci 2 kali dengan 40 mL aquades. Pelet sebanyak 600 L ditambahkan ekstrak 100 ppm dan 200 ppm kemudian diinkubasi pada 370C selama 24 jam. Untuk kontrol negatif, ekstrak diganti dengan aquades dan untuk kontrol positif, ekstrak diganti dengan glukosa 4% (berasal dari glukosa 10%) (dilakukan 3 kali pengulangan). Uji Viabilitas. Setiap 24 jam sebanyak 50 L sel dari biakan yang telah diberi perlakuan
diencerkan 10-8
dan disebarkan ke media padat YEPD
kemudian diinkubasi pada 280C selama 3 hari. Koloni yang muncul dihitung dan dibandingkan dengan kontrol (dilakukan 3 kali pengulangan). Uji Frekuensi Petit. Sebanyak 50 L larutan hasil inkubasi perlakuan pada 370C selama 24 jam, disebarkan ke media petit dan YEPD dan diinkubasi pada 280C. Komposisi media petit adalah 1% yeast exstract, 2% pepton, dan 0.1% glukosa, 1.8% agar, 4 mL etanol 70% serta aquades. Setelah 24 jam koloni yang muncul dihitung. Sel-sel khamir yang mengalami petit, koloninya akan tampak berukuran lebih kecil dibandingkan dengan sel-sel khamir normal. Sel-sel khamir yang mengalami petit dihitung frekuensi petitnya berdasarkan jumlah koloni petit dengan rumus :
koloni petit koloni petit koloni normal
x 100%
