19
Metode ekstraksi tergantung pada polaritas senyawa yang diekstrak. Suatu senyawa menunjukkan kelarutan yang berbeda-beda dalam pelarut yang berbeda. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pemilihan pelarut adalah selektivitas, toksisitas, kemampuan untuk mengekstrak, kemudahan untuk diuapkan, dan harga pelarut. Metode ekstraksi dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu ekstraksi sederhana dan khusus. Ekstraksi sederhana terdiri atas maserasi, perkolasi, reperkolasi, evakolasi, dan dialokasi. Ekstraksi khusus terdiri atas sokletasi, arus balik, dan ultrasonik (Harborne 1987). Maserasi digunakan untuk mengekstrak sampel yang relatif tidak tahan panas. Metode ini dilakukan hanya dengan merendam sampel dalam suatu pelarut dengan waktu tertentu, biasanya dilakukan selama sehari semalam (24 jam) tanpa menggunakan pemanas. Kelebihan metode ini adalah sederhana, tidak memerlukan alat-alat yang rumit, relatif murah, kerusakan komponen dapat dihindari karena tidak menggunakan panas sehingga baik untuk sampel yang tidak tahan panas. Kelemahannya antara lain, dari segi waktu dan penggunaan pelarut yang tidak efektif dan efisien karena jumlah pelarut yang digunakan relatif banyak dan membutuhkan waktu yang lebih lama (Meloan 1999 dalam Wulandari 2005).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun kedondong bangkok, bakteri Gram positif (S. aureus dan B. subtilis), bakteri Gram negatif (E. coli dan P. aeruginosa), yeast extract, bacto peptone, bacto agar, nutrient broth, nutrient agar, glukosa, heksana, aseton, metanol, akuades, pereaksi-pereaksi uji fitokimia (kloroform, H2SO4, ammonia, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorf, pereaksi Wagner, metanol, pereaksi Lieberman Burchard, dan FeCl 1%). Alat-alat yang digunakan adalah laminar air flow hood, spektrofotometer, inkubator bergoyang, oven, eksikator, hot plate stirrer, lemari es, cawan petri, jarum ose, neraca analitik, autopipet, peralatan gelas, dan evaporator vakum.
20
Metode Pembuatan Filtrat Daun kedondong bangkok segar dicuci bersih dan dipisahkan menjadi daun muda dan daun tua. Masing-masing daun dipotong-potong dan dihaluskan dengan mortar. Filtrat yang diperoleh digunakan untuk uji pendahuluan bakteri. Hasil uji pendahuluan ini (daun muda atau daun tua) akan digunakan untuk metode selanjutnya.
Pembuatan Ekstrak Tahap ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi menggunakan tiga pelarut, yaitu heksana, aseton, dan metanol. Daun kedondong bangkok segar dikeringkan dalam oven ± 50 °C lalu diblender. Serbuk daun kedondong yang telah diketahui bobotnya direndam dengan masing-masing pelarut dengan perbandingan 1:10 selama 24 jam pada suhu ruang. Tahap maserasi ini dilakukan triplo. Setelah 24 jam, sampel disaring untuk memisahkan filtrat dengan ampas. Masing-masing filtrat dievaporasi menggunakan evaporator vakum untuk menguapkan pelarut. Ekstrak yang diperoleh digunakan untuk uji antibakteri, uji fitokimia, dan penentuan KHTM.
Penentuan Kadar Air Kadar air ditentukan dengan mengeringkan daun dalam oven bersuhu 105°C selama 3 jam selanjutnya didinginkan dalam eksikator. Daun yang sudah dingin ditimbang. Hal ini dilakukan berulang-ulang sampai diperoleh bobot yang konstan. Pinggan porselin yang digunakan harus dikeringkan terlebih dahulu dalam oven 105 °C selama 30 menit dan didinginkan dalam eksikator. Pinggan ini kemudian ditimbang. Kadar air dihitung dengan persamaan : Kadar air = w1 – w2 × 100% w w1: bobot pinggan porselin ditambah bobot daun sebelum dikeringkan w2: bobot pinggan porselin ditambah bobot daun setelah dikeringkan w : bobot daun
21
Uji Fitokimia (Harborne 1987) Uji Alkaloid. Sebanyak 0.1 gram sampel ditambahkan 5 mL kloroform dan 3 tetes ammonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 2 tetes H2SO4. Fraksi asam dibagi menjadi tiga tabung kemudian masing-masing ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner. Uji Saponin. Sebanyak 0.1 gram sampel ditambahkan 5 mL akuades dan dipanaskan selama lima menit. Setelah itu ekstrak disaring dan filtratnya dikocok. Adanya saponin ditunjukan dengan timbulnya busa selama ± 10 menit. Uji Flavonoid. Sebanyak 0.1 gram sampel ditambahkan metanol sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditambahkan H2SO4, terbentuknya warna merah karena penambahan H2SO4 menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 gram sampel ditambahkan 5 ml etanol lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan eter. Lapisan eter ditambahkan pereaksi Lieberman Burchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid. Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram sampel ditambahkan 5 mL akuades kemudian dididihkan selama beberapa menit. Kemudian disaring dan filtratnya ditambahkan dengan FeCl 1%. Warna biru tua atau hitam kehijauan yang terbentuk menandakan adanya tanin.
Pembuatan Media Pembuatan Media Nutrient Agar (NA). Media ini merupakan media agar miring. Sebanyak 23 g NA dilarutkan dalam 1 L akuades lalu dipanaskan dan diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer sampai homogen. Larutan tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, kemudian ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Media disterilkan dengan otoklaf pada tekanan 1.5 atm, dengan suhu 121 °C selama 15 menit. Tabung-tabung tersebut dimiringkan sebelum mengeras dan dibiarkan selama 24 jam. Media ini digunakan untuk
22
pertumbuhan bakteri. Formulasi perliter NA DIFCO adalah beef extract 3 g, bacto peptone 5 g, dan bacto agar 15 g. Pembuatan Media Cair Nutrient Broth (NB). Sebanyak 13 g media NB dilarukan dalam 1 L akuades, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan magnetic stirrer sampai homogen. Sebanyak 10 mL larutan tersebut dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Media disterilkan dengan otoklaf pada tekanan 1.5 atm, suhu 121 °C selama 15 menit. Pembuatan Media Peptone Yeast Glucose (PYG) (Bintang 1993). Sebanyak 10 g pepton, 10 g yeast extract, 20 g glukosa, dan 20 g agar dilarutkan dalam 1 L akuades lalu dipanaskan dan diaduk sampai larut. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 20 mL dan media disterilkan dengan otoklaf pada tekanan 1.5 atm, 121 °C selama 15 menit. Media PYG digunakan untuk pembuatan agar cawan petri.
Regenerasi Bakteri Bakteri dibiakkan pada agar miring steril lalu diinkubasi pada 37 °C selama 24 jam. Biakan tersebut diambil satu ose dan diinokulasikan ke labu Erlenmeyer yang berisi 10 mL media cair NB steril. Biakan diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 24 jam dengan suhu 37 °C. Setelah diinkubasi, kerapatan optik (optical density, OD) 25% T bakteri ini diukur pada panjang gelombang 600 nm.
Uji Aktivitas Antibakteri (Bintang 1993) Biakan bakteri yang telah diregenerasi dengan nilai OD ± 1.0 diambil sebanyak 50 μL dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Biakan tersebut dicampurkan dengan media PYG cair (± 45 °C) lalu didinginkan pada suhu kamar sampai menjadi padat. Media dilubangi dengan menggunakan pangkal pipet tetes steril (diameter ± 5.5 mm). Ekstrak daun kedondong bangkok dimasukkan ke dalam lubang tersebut sebanyak 50 μL dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. Aktivitas antibakteri diperoleh dengan mengukur zona bening yang menunjukkan bakteri tidak tumbuh disekitar lubang yang berisi ekstrak sampel. Kontrol positif yang digunakan adalah antibiotik ampisilin dengan konsentrasi 0.4 mg/mL.
23
Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) Penentuan KHTM dilakukan setelah diketahui ekstrak daun kedondong bangkok memiliki aktivitas antibakteri. Biakan bakteri uji sebanyak satu ose dimasukkan ke dalam 10 mL media cair NB lalu diinkubasi dalam inkubator bergoyang selama 24 jam pada suhu 37 °C. Sebanyak 50 μL biakan bakteri dengan nilai OD ± 1.0 dicampurkan ke dalam 20 mL media agar PYG bersuhu ± 45 °C lalu dibiarkan sampai memadat. Media agar yang telah padat dilubangi dengan pangkal pipet tetes (diameter ± 5.5 mm). Variasi konsentrasi yang digunakan untuk menentukan KHTM adalah 250, 100, 75, 50, 25, 10, 5, 4, 3, 2, dan 1 mg/mL. Sebanyak 50 μL sampel dimasukkan pada lubang media PYG yang telah diinkubasi dengan bakteri uji, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. Aktivitas antibakteri diperoleh dengan mengukur zona bening dengan menggunakan jangka sorong, minimal empat kali pengukuran diagonal dan nilainya dirata-ratakan.
Analisis Statistik Analisis statistik yang digunakan adalah rancangan percobaan dua faktor dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL). Model rancangannya: Yij = μ + τi + εij Yij = diameter zona bening pada dosis ke-i ulangan ke-j μ = pengaruh rataan umum τ = pengaruh dosis ke-i ε = pengaruh acak pada dosis ke-i ulangan ke-j dengan i: 1 = 250 mg/mL 2 = 100 mg/mL 3 = 75 mg/mL 4 = 50 mg/mL 5 = 25 mg/mL 6 = 10 mg/mL 7 = 5 mg/mL 8 = 4 mg/mL 9 = 3mg/mL 10= 2 mg/mL 11= 1 mg/mL j: 1, 2
