BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di kebun percobaan Babakan Sawah pada bulan Juni September 2009. Untuk analisis kandungan flavonoid dan pigmen dilakukan di laboratorium RGCI, Institut Pertanian Bogor. Untuk analisis stomata dan trikoma dilakukan pada Laboratorium Ekofisiologi, Institut Pertanian Bogor.
Bahan Bahan yang digunakan adalah tanaman sambung nyawa berumur 1.5 bulan yang berasal dari stek batang, pupuk urea, KCl, dan SP-18 dengan media yang digunakan campuran tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1. Alat yang digunakan antara lain peralatan budidaya, polybag, bambu, lampu UV-B 100 W, polycarbonat, spektrofotometer, dan keperluan untuk analisis flavonoid dan klorofil
Metode Penelitian akan dilakukan dengan rancangan acak lengkap 1 faktor dengan tiga ulangan. Perlakuan yang diberikan radiasi UV dengan 3 taraf yaitu UV-B (P1), Non-UV (P2), dan UV-Ambient (P3). Analisis statistika yang digunakan adalah sidik ragam dengan model rancangan sebagai berikut : Yij = µ + αi + εij dimana : Yij
: respon pengamatan perlakuan
µ
: rataan umum
αi
: pengaruh dari penyinaran UV-B taraf ke-i
ε(ij)k : galat percobaan i
: 1.2, dan 3 Setiap percobaan diulang sebanyak 3 kali sehingga terdapat 9 satuan
percobaan yang masing – masing satuan percobaan terdiri dari 3 polybag tanaman sambung nyawa, maka total polybag yang digunakan sebanyak 27 polybag.
10
Apabila hasil sidik ragam menunjukkan pengaruh yang nyata pada taraf 5%, maka uji statistik dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan.
Pelaksanaan Penyemaian sambung nyawa dilakukan di dalam polybag dengan ukuran 35 cm x 35 cm sebanyak 200 polybag dengan tanah yang telah dicampur pupuk kandang sebagai media tanam. Penanaman dilakukan dengan menggunakan stek batang sepanjang 2 ruas (Gambar 4). Untuk menunjang pertumbuhan ditambahan pupuk urea dengan dosis 2 g/liter yang diberikan dengan disiram.
Gambar 4. Bibit Tanaman Kamar untuk perlakuan terbuat dari bambu berukuran 2 m x 1 m x 3 m yang beratap polykarbonat (Gambar 5). Kemudian dipasang lampu di dalamnya pada ketinggian 2.7 m sehingga diperoleh luas paparan 80.78 m2. Lalu dengan lama penyinaran 3 jam dan lampu dengan kekuatan 100 watt, maka intensitas yang diberikan sebesar
di mana : W
= kekuatan lampu (Watt)
t
= lama penyinaran (detik)
A
= luas paparan (m2)
Dengan demikian intensitas sinar UV-B sebesar 13.37 kj.m-2 atau setara dengan 124 µW.cm-2. Pemberian perlakuan UV-B dilaksanakan selama 24 hari setelah tanaman berumur 1.5 bulan. Penyinaran dilakukan selama 3 jam mulai dari 08.00 – 11.00. Perlakuan Non-UV diberikan dengan memberikan naungan dengan polykarbonat
11
untuk menahan pancaran UV. Perlakuan UV-Ambient, tanaman diletakkan pada lapangan terbuka untuk mendapatkan cahaya matahari alami.
Gambar 5. Bangunan Penelitian Perlakuan UV Pengambilan contoh daun dilakukan satu minggu sekali. Daun yang diambil adalah daun ke-3 – 5 dari pucuk. Penentuan kadar flavonoid dan klorofil menggunakan spektroskopi serapan UV.
Pengamatan 1. Luas daun Luas daun dihitung pada akhir perlakuan dengan menggunakan metode gravimetrik dengan rumus : LD =
B
J
D B
L
K
K
2. Kadar flavonoid Daun yang diambil adalah daun ke 3 – 4. Daun kemudian ditimbang dan digerus, lalu tambahkan 10 ml campuran methanol dan HCl dengan perbandingan 99 : 1 (v/v). Selanjutnya hasil gerusan tersebut disaring dan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 300 nm. (Markham, 1988) 3. Kandungan klorofil dan antosianin Satu disk daun segar ditambah dengan ACETRIS 2 ml, lalu digerus dan dimasukkan dalam mikrotube 2 ml, kemudian larutan disentrifuse 14.000 rpm selama 10 menit. Larutan yang sudah disentrifuse tersebut diambil 1 ml dan ditambahkan 3 ml ACETRIS, lalu dibaca dengan spektrofotometer
12
pada panjang gelombang 647 nm, 663 nm, dan 537 nm. (Lichtenthaler, 1987) Kandungan klorofil dapat dihitung dengan rumus : Klorofil a : (0.01373 x λ663) – (0.000897 x λ537) – (0.003046 x λ647) Klorofil b : (0.02405 x λ647) – (0.004305 x λ537) – (0.005507 x λ663) Antosianin : (0.08173 x λ537) – (0.00697 x λ647) – (0.002228 x λ663) 4. Pengamatan stomata dan trikoma Pengamatan stomata dan trikoma dilakukan di Laboratorium Ekofisiologi, Institut Pertanian Bogor. Pengamatan ini dilakukan dengan mengambil sampel stomata dan trikoma dengan menggunakan cat kuku (kuteks) bening. Stomata diamati dengan perbesaran 400 x sedangkan trikoma diamati dengan menggunakan perbesaran 100 x. Pengamatan dilakukan bersamaan dengan pengambilan sampel daun dengan masing – masing diamati sebanyak 2 bidang pandang. 5. Ketebalan daun Untuk pengamatan ketebalan daun dilakukan dengan mengiris daun segar setipis mungkin sehingga dapat diperoleh penampang melintang daun. Kemudian sampel diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 400 x yang menggunakan okuler mikrometer untuk menghitung tebal daun. 6. Analisis aktivitas Phenylalanine ammonia lyase (PAL) menurut Zucker (1965) 4 lembar daun + 4 ml buffer A(0.1M Borate buffer pH 8.8) Masukan dalam mikrotube 2ml Sentrifuge 14.000 rpm 15’ FILTRAT Ambil 2 µL enzyme ekstrak + 1800 µL Buffer B Inkubasi pada suhu 30°C selama 15 menit +0.1 ml 5M HCl Spektrofotometer pada panjang gelombang 290 nm
13
7. Analisis kandungan protein Untuk analisis kandungan protein digunakan metode lowry. 1 ml filtrate + 2 ml pereaksi C Inkubasi 10 menit pada suhu ruang + 0.2 ml pereaksi D Inkubasi 30 menit pada suhu ruang Spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm Ket : Larutan A : 50 ml natrium karbonat 2% + 50 ml NaOH 0.1M Larutan B : 10 ml CuSO4 .5 H2O 1.56 % + 10 ml garam rochele 2.37 % Larutan C : Campuran larutan A dan larutan B yang dibuat segar dengan perbandingan 50:1 Larutan D : Pereaksi folin ciocalteu, larutkan dalam air dengan perbandingan 1:1
