MENDELOVA ZEMĚDĚDLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2009
MARCELA KRÁLOVÁ
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Mikrobiální kontaminace vybraných druhů lahůdkový salátů Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.
Marcela Králová
Brno 2009
2
Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Mikrobiální kontaminace vybraných druhů lahůdkových salátů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne podpis diplomanta
3
Poděkování Děkuji Ing. Liboru Kalhotkovi Ph.D za cenné rady, konzultace, věcné připomínky, při vypracování této bakalářské práce. Dále chci poděkovat Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za cenné rady a odbornou pomoc při praktických zkouškách.
4
ABSTRAKT Práce se zabývá mikrobiální kontaminací vybraných druhů lahůdkových salátů se zaměřením na výrobky studené kuchyně, s majonézou i bez majonézy. Popisuje technologický postup výroby, trvanlivost výrobku a mikrobiologickou kvalitu jednotlivých složek lahůdkových salátů. Dále rozebírá nejvýznamnější mikroorganismy vyskytujících se převážně v lahůdkových salátech. Charakterizuje jejich negativní působení na lidský organismus a zaměřuje se na boj proti jejich rozkladné činnosti a prevenci jejich vzniku. Na závěr této práce je experimentálně uvedeno stanovení významných skupin mikroorganismů ve vybraných druzích lahůdkových salátů.
Klíčová slova: lahůdkářské výrobky, trvanlivost, mikrobiologie, mikroorganismy
ABSTRACT This bachelor thesis deals with the microbial contaminations of selected types of delicate salads that are products of cold meal with mayonnaise or without it. It describes the technological process of fabrication, the product durability and microbiological quality of selected ingredients of the salads. Furthermore, it studies the most important micro-organisms that grow in the delicate salads and analyzes their undesirable influence on a human organism. The thesis is also aimed at the struggle against the decomposing activity of the micro-organisms and its prevention. Finally, an experimental evaluation of significant groups of microbes presented in the selected delicate salads is given.
Key words: delicate products, durability, microbiology, microbes
5
OBSAH 1. Úvod. ……………………………………………………………………8 2. Literární přehled ……………………………………………………….10 2.1 Lahůdkové výrobky ………………………………………………………..10 2.1.1 Charakteristika lahůdkových salátů ……………………………...10 2.1.2 Rozdělení lahůdkových salátů …………………………………...10 2.1.3 Vstupní suroviny rostlinného a živočišného původu .……………12 2.1.4 Trvanlivost a údržnost lahůdkových salátů ………………………15 2.1.5 Mikroflóra hotového výrobku ……………………………………15 2.2 Mikrobiologická rizika …………………………………………………….16 2.2.1 Výskyt mikroorganismů v sýrech ………………………………..16 2.2.2 Výskyt mikroorganismů v masných výrobcích ………………….17 2.2.3 Výskyt mikroorganismů ve vejcích a vaječné hmoty ………..…18 2.2.4 Výskyt mikroorganismů v majonézách ………………………….18 2.2.5 Výskyt mikroorganismů v zelenině ……………………………...19 2.3 Manipulace s výrobkem během výrobního procesu ……………………….20 2.3.1 Výroba lahůdkových salátů ……………………………………....20 2.3.2 Hygiena během výrobního procesu ………………………………22 2.3.3 Hygiena pracovního prostředí ……………………………………24 2.3.4 Hygiena pracovníků ……………………………………………...24 2.4 Vliv vnějšího prostředí na mikroorganismy ……………………………….25 2.5 Ochrana proti rozkladné činnosti mikroorganismů ………………………..25 2.6 Mikrobiologické požadavky na potraviny v ČR …………………………..26 2.7 Charakteristika vybraných zdravotně závažných mikroorganismů a významných skupin mikroorganismů ………………………………….……27 2.7.1 Alimentární infekce …………………………………………..…..27 2.7.1.1 Salmonella sp...……………..…………………………..27 2.7.1.2 Listeria monocytogenes …………………………….…..30 2.7.1.3 Escherichia coli …………………………………….…..33 2.7.1.4 Campylobacter sp..……………………...…………........35 2.7.2 Alimentární intoxikace ……………………………………….…..37 2.7.1.2 Staphylococus aureus …………………………………..37
6
2.7.2.2 Bacilus cereus ………………………………………….39 2.7.3 Výskyt kvasinek a jejich význam v potravinářském průmyslu ………………………………………............41 2.7.4 Výskyt plísní a jejich význam v potravinářském průmyslu ………………………………….…………..42
3. Cíl práce….…..………….……………………………………….…….44 4. Materiál a metodika....…….…………………………………………....45 4.1 Analyzovaný materiál ……………………………………………...............45 4.2 Příprava laboratorních pomůcek ………………………………….………..46 4.3 Příprava kultivačních půd ………………………………………………….46 4.3.1 Typy použitých půd pro jednotlivé mikroorganismy……………..46 4.3.2 Složení půd a jejich příprava ……………………………………..46 4.4 Zpracování vzorků.…………………………………………….…………...47 4.5 Způsob vyhodnocování výsledků.………………………………………….48
5. Výsledky a diskuse….………………………………………………….49 6. Závěr……….………………………………………………….………..52 7. Seznam použité literatury.……………………………………………...53
7
1. ÚVOD Lahůdkářské výrobky nejsou ve vyhláškách k našemu Zákonu o potravinách definovány jako samostatná skupina. Německý Lexikon potravin (Frank 1990) označuje tímto souhrnným názvem výrobky, které charakterizuje speciální výběr a kombinace surovin, zvláštní hodnota chuťových a jiných vlastností, zdůraznění národních a mezinárodních stravovacích zvyklostí a skutečnost, že jde o nevšední, nikoli každodenní pokrmy a že vyhovují zvýšeným a zjemnělým nárokům spotřebitelů. Lexikon uvádí též směrné a kritické limity mikrobiologické kontaminace. Mezi lahůdky se podle téhož zdroje řadí velmi různorodé výrobky a pochoutky. Hlavní skupinou jsou saláty, zvláště majonézové a v posledních letech saláty z předzpracované čerstvé zeleniny a ovoce. Mezi lahůdkářské výrobky patří různé saláty (bramborový, vlašsky, rybí a mnoho dalších), obložené chlebíčky a další výrobky studené kuchyně. Je to různorodý sortiment, který má krátkou trvanlivost. Sortiment lahůdkářských výrobků je velmi široký. Produktem výroby lahůdek jsou převážně potraviny určené k rychlé spotřebě za studena bez dalších úprav, které vzhledem k charakteru používaných surovin vyžadují zpracování i distribuci v řízených teplotních poměrech. V poslední době se prosazují výrobky s prodlouženou údržností dosahovanou nejčastěji přísadou chemických konzervačních látek. Lahůdkářské výrobky se u nás většinou vyrábějí v menších provozech se značnou částí ruční výroby. Část materiálu není přitom tepelně opracovaná. Vlastní technologie je náročná, protože lahůdkářský výrobek patří mezi rizikové potraviny. Splnit tento požadavek znamená úzkostlivou péči o mikrobiální čistotu a sanitaci nejen výrobku, ale i celého výrobního procesu. Lahůdkářské výrobky se vyrábějí za použití celé řady surovin, postupů a balících systémů a proto je třeba očekávat, že mají jak rozdílné mikrobiologické profily po výrobě nebo skladování, tak diferencovanou dobu použitelnosti, ale přitom musí být zdravotně nezávadné v okamžiku spotřeby. Ty, které obsahují syrové přísady, mohou občas obsahovat vegetativní pathogeny jako např. listérie. Tento fakt je třeba brát v úvahu, když se určují podmínky použitelnosti ve smyslu času, teploty a pokynů pro spotřebitele. Bezpečná doba použitelnosti je stanovena na základě složení produktu a parametrů zpracování pro definované podmínky chladírenského uchování. Základem
8
pro nezávadnost a jakost většiny lahůdkářských výrobků je nepřerušený chladicí řetězec. Pro spotřebitele představují lahůdkářské výrobky možnost rizika onemocnění z potravin. Možnost výskytu nežádoucích mikroorganismů je zde vyšší než- li u jiných druhů potravin. Vlivem požadavků tržní sítě se sortiment lahůdkářských výrobků posouvá od výrobků rychlé spotřeby k výrobkům s prodlouženou údržností.
9
2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Lahůdkové výrobky Výroba lahůdek je relativně nový obor, jehož významnější rozvoj nastal až po druhé světové válce. Podobně jako výroba hotových pokrmů je i výroba lahůdek na rozhraní mezi průmyslovou výrobou pokrmů a přípravou studených pokrmů v rámci stravovacích služeb. Převládají kulinární postupy nad průmyslovými, s převažujícím podílem ruční práce. Pokud se používá mechanizace, soustřeďuje se pouze na krájení surovin, výrobu majonézy, míchání, plnění obalů a balení. Sortiment lahůdkových výrobků je velmi rozsáhlý a poměrně dynamicky se obměňuje. Charakteristické je velké množství surovin živočišného i rostlinného původu, syrových,
chlazených,
zmrazených
i
sterilovaných.
Tomu
odpovídají
různé
mikrobiologické charakteristiky, od sterility po vysokou úroveň kontaminace, případně i obsah kulturní mikroflóry (kysané jogurty, sýry, fermentované salámy). Vlivem požadavků tržní sítě se sortiment posouvá od výrobků rychlé spotřeby k výrobkům s prodlouženou údržností. (Kadlec, 2002). 2.1.1 Charakteristika lahůdkových salátů Pojem lahůdky je používán pro výrobky složené z více druhů zpravidla slaných potravin, distribuované s omezenou dobou použitelnosti ve zchlazeném stavu a určené k okamžité spotřebě ( tj. bez další úpravy) za studena. Zaujímají pozici na rozhraní mezi průmyslovou výrobou a přípravou pokrmů v rámci stravovacích
služeb.
Produktem výroby lahůdek jsou převážně potraviny určené k rychlé spotřebě, které vzhledem k charakteru používaných surovin vyžadují zpracování i distribuci řízených teplotních poměrech. V užším smyslu jsou za lahůdky označovány výrobky studené a teplé kuchyně určené k přímé spotřebě, luxusního charakteru, výjimečné chuti a vzhledu, s vysokým vkladem tvůrčí práce kuchařů, podávané zpravidla v malých porcích jako občerstvení (tedy nikoliv hlavní chod) (www.mze.cz, 2005). 2.1.2 Rozdělení lahůdkových salátů Sortiment výrobků studené kuchyně je velmi pestrý. K základním skupinám se počítají majonézy, saláty, pomazánky, kusové zboží, které zahrnuje, zejména chlebíčky a sendviče, studená masa tepelně opracovaná. (Komár, 2005)
10
Přehled skupin sortimentu
Pozitivní vymezení (mezi lahůdky patří): •
Saláty a) saláty s obsahem surovin živočišného původu (masa a uzenin, ryb, sýrů) saláty s převažujícím obsahem surovin rostlinného původu (zeleniny, ovoce, luštěnin, těstovin) b) saláty majonézové obsahující fermentované suroviny (sýry, jogurty, aj. mléčné výrobky) c) saláty bez majonézy: s olejovým dressingem, s dressingem na bázi fermentovaného mléka.
•
Pomazánky, krémy a pěny: a) tvarohové a sýrové b) s obsahem masa nebo uzenin
•
Nakládané (marinované) uzeniny
•
Nakládané (marinované) sýry
•
Výrobky z marinovaných, solených a uzených ryb, z rekonstituovaného rybího masa a z masa vodních živočichů, studené marinády s obsahem podílu rybího masa pod 60%, teplé marinády s obsahem rybího masa pod 60%, pomazánky, pěny, ochucené majonézy
•
Kusové zboží: a) obložené chlebíčky b) plněné bagety a sendviče c) aspiky (šunkové závitky v aspiku, vejce v aspiku apod.) d) ruská vejce aj. kombinované výrobky e) studené mísy na zakázku f) vaječné a masozeleninové huspeniny, mozaiky, rosoly
Negativní vymezení (do skupiny lahůdkářských výrobků nepatří): •
zelenina tepelně neopracovaná a bez přísad
•
sterilovaná zelenina
•
marinované a solené rybí výrobky s obsahem masa ryb vetší než 60%
11
•
uzené ryby
•
rybí konzervy (antipasta) (www.mze.cz, 2005)
2.1.3 Vstupní suroviny rostlinného a živočišného původu K výrobě lahůdek se používá velké množství různých, zdravotně nezávadných surovin. Veškeré suroviny musí být použity v jejich záruční lhůtě (Runštuk aj., 2001). Mezi hlavní druhy patří majonéza, vejce, uzeniny, ryby, zelenina, pečivo. (Cempírková et al., 1997) Hlavní surovinou rostlinného původu jsou brambory. Používají se uvařené a oloupané a nechají se chladit v mělkých nádobách. Zelenina se používá téměř výhradně z konzerv, tedy prakticky sterilní. Okurky, které se dávají do výrobků, musí být sterilní a z konzerv. Bílé pečivo se používá jako základ na obložené chlebíčky (Arpai a Bartl, 1997).
12
Tab. č. 1. Vlašský salát 10 kg (Runštuk aj., 2001) Druh potravin
Hmotnost v kg hrubá
čistá
Brambory loupané
3900
3510
Salát měkký výrobní
2400
2280
Okurky sterilované b.n.
1000
900
Celer sterilovaný b.n.
300
300
Mrkev sterilovaná b.n.
500
500
Hrášek sterilovaný
200
200
Majonéza základní
2000
2000
Hořčice
200
200
Ocet
120
120
Cukr
100
100
Pepř mletý
5
5
Vorčestr
50
50
Sůl
100
100
Hmotnost potravin
10 265
Výrobní ztráty celkem
- 265
Hmotnost hotového výrobku
10 000
Vlašský salát tvoří směs vařených brambor, uzeniny a zeleniny, které jsou vzájemně spojeny ochucenou majonézou. Jednotlivé suroviny jsou nakrájeny na pravidelné tvary. Uzenina na nudličky, ostatní suroviny zpravidla na kostičky v závislosti na použitých průmyslových polotovarech a použitém technologickém zařízení. Salát má svěží, kyprý vzhled, vůně a chuť je lahodná, přiměřeně slaná a příjemně sladkokyselá. Konzistence surovin je přiměřeně měkká. (Runštuk aj., 2001)
13
Tab. č. 2. Pařížský salát 10kg (Runštuk aj., 2001) Druh potravin
Hmotnost v kg hrubá
čistá
Salám měkký výrobní
4200
3900
Okurky sterilované b.n.
2000
1800
Hrášek sterilovaný b.n.
1600
1600
Majonéza základní
2000
2000
Cibule
350
280
Ocet
50
50
Cukr
100
100
Vorčestr
80
80
Pepř mletý
10
10
Sůl
50
50
Hmotnost potravin
10 160
Výrobní ztráty celkem
-160
Hmotnost hotového výrobku
10 000
Pařížský salát se skládá ze směsi salámu, sterilované zeleniny, cibule a ochucené majonézové spojky. Uzenina je nakrájená na úhledné nudličky. Konzistence salátu je přiměřeně hustá, vůně a chuť jemná, vyrovnaně sladkokyselá a přiměřeně slaná.
14
2.1.4 Trvanlivost a údržnost lahůdkových salátů Trvanlivost lahůdkových salátů závisí především od dodržování hygienických podmínek a hygienického stavu při jejich výrobě. Dále od materiálového složení a vnitřních podmínkách (stupeň kyselosti, použitá potravinářská kyselina, hodnota pH), od počátečního počtu mikroorganismů v jeho složkách jakož i od teploty jejich uchování a od druhů mikroorganismů, které v nich převládají. Dominantní skupinou mikroorganismů, která ve významné míře podmiňuje trvanlivost lahůdkových salátů jsou rody Leuconostoc, Pediococcus a také kvasinky a plísně (Görner a Valík, 2004). Bezpečná doba použitelnosti musí být stanovena na základě složení produktů a parametrů zpracování pro definované podmínky chladírenského uchování. Základem pro nezávadnost a jakost většiny lahůdkových výrobků je neporušený chladící řetězec. Výběrem kombinace faktorů může být udržován mikrobiální růst pod kontrolou a tak lze zabránit kažení výrobku a otravám po jejich použití. Výběr a kombinace těchto „překážek“ určí dobu použitelnosti. Výrobky, jako jsou saláty a pomazánky mohou být stabilizovány přídavkem chemických
konzervačních látek solí kys. sorbové a
benzoové. Pro účinnost těchto látek je důležité dostatečně nízké pH. Kromě těchto konzervovadel lze využít i účinků soli kys. octové a mléčné (Kadlec, 2002). Pro prodloužení údržnosti potravin jsou v poslední době také doporučovány tzv. bakteriociny. V příznivém případě lze dosáhnout prodloužení údržnosti řádově ve dnech, nikoliv v týdnech. Údržnost výrobku může ovlivnit také způsob balení a druh obalového matriálu (www.mze.cz, 2005).
2.1.5 Mikroflóra hotového výrobku Sortiment lahůdkových výrobků je velmi široký, proto není možno popsat mikroflóru všech druhů. Převážnou část výroby tvoří saláty bramborový, vlašský a další. Kvalitativní složení jejich mikroflóry je velmi pestré. Ve všech výrobcích se vyskytují různé druhy mikrokoků a sporulujících bakterií. Koliformní bakterie, které se vyskytují v mikroflóře, zastupují různé typy od Escherichia coli až po Enterobacter. Poměrně často jsou zastoupeny enterokoky. Plísně se nacházejí jen zřídka (Arpai a Bartl, 1997). Typickou mikroflórou chlazených výrobků jsou (psychrotrofní = rostoucí při nízké teplotě 2-8 °C) kmeny mikroorganismů: Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus a ojediněle Flavobacterium. Za 3-5 dní při 5 °C může dojít až ke trojnásobení jejich počtu. Nárust je doprovázen změnami chuti a vůně výrobku (atypická chuť, nahnilá chuť).
15
Velmi pestře jsou zastoupeny kvasinky nebo mezofilní ( = rostoucí nejrychleji při teplotě 25-45 °C) mikroorganismy, způsobující výrazné změny v chuti a vůni (nakyslá, hnilobná, nažluklá). Výskyt bakterií rodu Proteus ukazuje na závažné nedostatky v hygieně, zejména pak jejich schopnost rychle rozkládat bílkoviny způsobujíc rychlé kažení výrobků. Původci onemocnění po požití lahůdkářských výrobků mohou být zástupci rodu Proteus, Citrobacter (při přímém kultivačním nálezu) a Salmonella (ze surovin živočišného původu, při nedostatcích osobní hygieny). Závažný je také výskyt bakterie Staphylococcus aureus, která produkuje toxiny a může se vyskytovat v majonéze ze syrových vajec a na rukou pracovníků. Výběrem kombinace faktorů, jako jsou kvalita a zastoupení surovin (např. výhradní použití majonéz vyrobených z pasterovaných vajec), hygienické zpracování při nízké teplotě, aktivita vody, kyselost, pH, balení apod. může být mikrobiální růst udržován pod kontrolou (www.mze.cz, 2005).
2.2 Mikrobiologická rizika 2.2.1 Výskyt mikroorganismů v sýrech Hlavními složkami sýrů jsou bílkoviny a tuk, v menší míře pak ostatní složky mléka. Podstatnou část technologie výroby tvoří využívání čistých mlékařských kultur. Před zasyřením se tedy přidává základní čistá kultura – smetanový zákys, který se používá při výrobě všech druhů sýrů a také se přidává speciální kultura podle druhu vyrobeného sýra (Cempírková et al.,1997). Sýry se vyrábí vysrážením bílkovin z mléka kravského, ovčího nebo kozího působením syřidla nebo jiných vhodných koagulačních činidel nebo fermentací z mléčného cukru v mléku vzniklé kyseliny mléčné (Görner a Valík, 2004). Při výrobě sýrů se může vyskytnout řada vad, které mohou mít technologické, fyzikální, nebo mikrobiologické příčiny. Mikrobiologické vady sýrů lze rozdělit na vady působené plísněmi, kvasinkami, nežádoucí tvorbou plynu a nežádoucí barevné změny sýrů. Spory plísní se prostředím velmi snadno šíří. Jedná se zejména o plísně rodu Penicillium způsobující modrou plíseň nebo Cladosporium, což je černá plíseň. Dále mohou sýry kontaminovat plísně rodu Aspergillus, Fusarium, Mucor. Sýry, které jsou kontaminované kvasinkami mají kvasničnou chuť a aroma chlebového těsta. Výskyt kvasinek na povrchu sýrů bývá provázený osliznutím. Mezi kvasinky nejčastěji kontaminující
sýry patří
kvasinky rodu 16
Candida,
Yarrovia,
Kluyveromyces.
Mikroorganismy způsobujíci duření a trhaní sýrů, lze rozdělit na koliformní bakterie Enterobacter aerogenes a Escherichia coli, které způsobují časné zduření a sporogenní bakterie rodu Clostridium způsobující pozdní duření. Barevné změny vytváří Microccocu luteus a Aspergiillus flavus (Tománková et al, 2006). Závažná je také Listeria monocytogenes. Nebezpečné jsou některé druhy sýrů, jde hlavně o měkké sýry (Votava et al., 2007). 2.2.2 Výskyt mikroorganismů v masných výrobcích Masné výrobky jsou charakterizovány masem jako základní surovinou a přídavnými látkami jako jsou voda, led, koření, mouka, mléko, vejce atd. Z hlediska mikrobů v masných výrobcích jsou významné dva úseky výroby, úsek tepelného opracování výrobků a úsek po něm. U mikroorganismů nastává vzestup hlavně bakterií ze
skupiny
aerobních
sporotvorných
mikroorganismů
a
psychrotrofních
mikroorganismů (Cempírková et al., 1997). Při výskytu salmonel v mastných výrobcích se téměř vždy se jedná o sekundární kontaminaci. V uzených výrobcích bývá občas izolován Stafylococus aureus (u těch, které prošli solnými lázněmi). Nízké pH nevadí růstu stafylokoků, ale prostředí není vhodné pro rozvoj toxinů. (Hrubý, 1984) Nejčastější mikrobiální změny vyskytující se uvnitř mastných výrobků jsou kvašení, mikrobiální zelenání, hniloba a dírkovatost. Na kyselém kvašení se nejčastěji podílejí enterokoky, Leuconostoc a kvasinky. Mikrobiální zelenání, vzniká produkcí peroxidů, např. peroxidu vodíku heterofermentativními druhy mikroorganismů z rodu Lactobacillus a Leconostoc. Původcem hlubokých hnilob je Clostridium bifermentans (Cempírková et al, 1997). Největší bezpečnost z hlediska alimentárních onemocnění poskytují především dobře tepelně opracované výrobky typu různých uzenin, vařených výrobků, uzených a vařených mas, polokonzerv a další. Minimální teplota 70 °C, působící po dobu nejméně 15-20 minut ve všech částech výrobku, dává spolehlivou záruku devitalizace salmonel (Rosický, 1994). Vzhledem k tomu, že při technologickém procesu výroby mastných výrobků nejsou zničeny všechny mikroorganismy, je třeba v další etapě manipulace v expedici, při přepravě, v obchodní síti, ale i v domácnostech a společném stravování, dodržovat nízké teploty, aby nedošlo k silnému pomnožení mikroorganismů. (Cempírková et al., 1997)
17
2.2.3 Výskyt mikroorganismů ve vejcích a vaječné hmoty Vejce jsou výborným živným prostředím pro mikroby, především hnilobné bakterie. Možnosti kontaminace jsou již ve vaječníku nemocných nosnic přenosem krví do žloutku (hematogenní kontaminace). Při průchodu vejcovodem mohou do vajec pronikat mikroby z kloaky, (kongentiální kontaminace) Z povrchu skořápky dochází k (extragenitální kontaminaci) Počty mikroorganismů na povrchu skořápky kolísají od několika set, do několika miliónů ( Šroubková, 1996). Jay et al. (2005) uvádí, že čerstvá snesená vejce jsou zpravidla sterilní. Avšak v relativně krátké době po snášce mohou být početné mikroorganismy nalézány na vnější straně skořápky a za vhodných podmínek mohou pronikat do vejce, množit se vněm a být pak příčinou kažení. Rychlost pronikání mikroorganismů do vajec je závislá na teplotě skladování, stáří vajec a způsobu skladování a stupni povrchové kontaminace. Mezi bakterie kontaminující vejce patří rody: Pseudomonas, Acinetobacter, Proteus, Esherichia, Salmonella. Plísně, které se nejčastěji vyskytují na skořápkách vajec, jsou Aspergilus, Mucor, Penicillium a Rhizopus (Tománková et al., 2006). Vaječnou hmotou se rozumí vaječný obsah po uvolnění skořápky. Vaječná hmota se dělí na vaječní žloutek, vaječný bílek a vaječnou směs. Kvůli devitalizaci přítomných mikroorganismů se vaječná hmota pasteruje. Za vhodných podmínek při teplotách 15 °C, se tekutá vaječná hmota rychle znehodnocuje rozmnožením přítomných mikroorganismů. Na změnách se účastní zejména bakterie, plísně, resp.kvasinky (Cempírková et al., 1997). 2.2.4 Výskyt mikroorganismů v majonézách Majonéza je hustá, tekutá, emulze oleje ve vodě, která se obyčejně vytváří pomocí vaječného žloutku. Emulze obsahuje jedlý rostlinný olej a jako emulgátor lecitin vaječného žloutku. Dále mohou být součástí kys.octová, cukr, sůl, koření, konzervační prostředky. Hlavním sortimentem výroby jsou majonézy s různým obsahem tuku (45-80% tuku, základní), majonézy ochucené, majonézové omáčky a krémy a majonézové pomazánky. Majonézy jsou vzhledem ke svému často pestrému složení vhodným prostředím pro růst a rozmnožování různých druhů mikroorganismů. Technologie, která může snížit počet nebo devitalizovat mikroorganismy, je omezená na tepelné ošetření části použitých látek, např. vaření octového nálevu. Z hlediska mikrobiální kontaminace je
18
důležitý technologický zákrok-rehydratace sušené vaječné směsi, při které může dojít ke značnému zhoršení mikrobiální kvality majonéz. Baktericidní efekt v majonézách zaručuje přítomnost octa, který ovlivňuje pH majonézy. Např. hodnoty nižší než pH 4,5 a vyšší než pH 8 v tekutém bílku a majonézách, podporují likvidaci salmonel i ostatních mikroorganismů (Cempírková et al., 1997). Na mikrobiálním kažení majonéz a majonézových salátů se pro jejich kyselost zúčastňují zejména kvasinky, plísně, méně často bakterie mléčného kvašení. (Lactobacillus spp, Pediococcus spp, Leuconostoc spp) Jejich kažení se projevuje kvašením a u kvasinek silnou tvorbou plynu (bombáže). Z kvasinek způsobující kažení přicházející do úvahy početné plynotvorné druhy a kmeny rodu Sacharomycces, Candida, Zygosaccharomyces. Zjevné kažení nebývá (plynotvorba) v souvislosti s absolutním obsahem kvasinek, ale s jejich schopností tvořit plyn (Görner a Valík, 2004). Ochrana majonéz před mikrobiálním znehodnocením musí být zaměřena na použítí tepelně opracovaných surovin, na dodržování technologických postupů, čistění a dezinfekci výrobního zařízení atd. (Cempírková et al., 1997). 2.2.5 Výskyt mikroorganismů v zelenině Pod pojmem zelenina se rozumí různé orgány nebo části rostlin odlišných čeledí, které se používají jako potraviny. U zeleniny, to mohou být plody, listy a výhonky, cibule, kořeny (Görner a Valík, 2004). Zelenina patří mezi velmi důležité složky většiny lahůdkářských výrobků. Rozsáhlé uplatnění má zejména v oblasti salátů, kde představuje základní složku salátů, doplněnou pouze majonézou a dresinkem nebo se může také kombinovat s dalšímu surovinami, jako je maso, uzeniny, ryby, vejce apod. (Míková, 2003). Mezi nejčastěji zpracované druhy zeleniny používané do směsných salátů patří z košťálové zeleniny: hlávkové zelí bíle nebo červené, z kořenové zeleniny: mrkev, celer, petržel, z cibulové zeleniny: cibule, česnek, z plodové zeleniny: okurka, paprika, rajče, z listové zeleniny: pekingské zelí, ledový salát, čekanka. Vhodným doplňkem je sterilovaná kukuřice, hrášek nebo žampióny a olivy (Hianiková, 2007). Již během vegetace se dostává na zeleninu prostřednictvím hmyzu, prachu i stykem se zemí mnoho mikroorganismů. Typičtí saprofyti se však na povrchu živých a zdravých plodin nemnoží a čekají na příhodné podmínky (přezrálost, sklizeň, poranění) Při sklizni se
19
počet mikroorganismů na zelenině zvyšuje z mnoha příčin (dotyky rukou, poranění plodu) (Ingr, 1999). Mikroflóra zeleniny je velmi rozmanitá, zahrnuje jak bakterie, tak plísně a kvasinky. Často jsou přítomny typické půdní bakterie (Pseudomonas sp., Bacillus sp.), bakterie mléčného kvašení (laktobacily, streptokoky), koliformní bakterie a další. Počet mikroorganismů závisí především na druhu a části rostliny a na prostředí, ve kterém se rostlina nachází. Pohybuje se od stovek až po několik milionů na 1cm2. (Tománková et al., 2006) Výskyt mikroorganismu v zelenině může být předpokladem odrazu hygienické kvality výrobních kroků a mikrobiologického stavu syrového produktu během výrobního procesu (Jay et al., 2005).
2.3 Manipulace s výrobkem během výrobního procesu 2.3.1 Výroba lahůdkových salátů Výrobky studené kuchyně si našly své pevné místo v našem jídelníčku. K výrobě lahůdek se používají zdravotně nezávadné suroviny odpovídající technickým normám nebo příslušným normám jakosti. Při výrobě salátů se veškeré recepturou stanovené suroviny zlehka promíchají, přičemž musí být dosaženo rovnoměrného rozložení jednotlivých složek. Suroviny pro výrobu lahůdek se skladují v suchých, větraných skladech, resp. chladírnách a mrazírnách při teplotách stanovených technickými normami pro skladování poživatin. Výroba – kompletace musí být v jednotlivých operacích plynulá a vzájemně navazující tak, aby nedošlo k narušení teplotního řetězce. Veškeré lahůdkářské výrobky se po dohotovení, případně po naplnění velkoodběratelského a malospotřebitelského balení (kelímky, misky apod.) bezprostředně přesunou do chladícího zařízení s předepsanou teplotou. (Runštuk aj., 2001) Plnění do velko- a malospotřebitelských obalů se provádí strojově nebo ručně. Méně často se produkt rozplní za vakua nebo se prostor nad produktem zaplynuje dusíkem nebo oxidem uhličitým. Při vhodné konstrukci kombinovaného zařízení se saláty mohou i pasterizovat nebo sterilizovat (Görner a Valík, 2004). Hotové výrobky se expedují vychlazené v předepsané teplotě v čistých, zdravotně nezávadných přepravních obalech a musí být také řádně označeny. Přeprava lahůdkářských výrobků se provádí výhradně vyčleněnými vozidly, určenými pouze pro tento účel (Runštuk aj., 2001).
20
Tab.č. 3. Základní technologické operace při výrobě lahůdek (http://www.vscht.cz/ktk/www_324/studium/HP/HP.pdf) Příjem surovin Navažování nebo odměřování přísad Skladování surovin
Míchání
Přípravné operace - mytí, čištění, loupání Porcování Rozmražování ryb, mražené zeleniny
Kompletace kusových výrobků
Dělení, krájení, mechanické zpracování
Balení
Marinování, solení ryb
Skladování
Předvaření, vaření zeleniny a brambor
Expedice
Chlazení
Rozvoz
Nezávadnost lahůdkářských výrobků musí být zajišťována uplatněním principů systému kritických bodů (HACCP), přičemž ovládací opatření lze shrnout do těchto bodů :
1. Dobře navržená receptura (zejména s ohledem na možné překážky bránící mikrobům v rozmnožování) a kvalifikovaně navržené podmínky údržnosti (teplota, doba spotřeby). 2. Výběr surovin (s ohledem na obsah cizorodých látek a na mikrobiální kontaminaci – mikrobiologicky riziková mohou být vejce, uzeniny, sýry, koření, cibule apod.). 3. Chlazení od surovin až k výrobku a od expedice až k zákazníkovi (dostatečná chladicí kapacita, dostatečné vychlazení, dobrá organizace práce při míchání, kompletaci apod. pro co nejmenší oteplení surovin a výrobků). 4. Spolehlivé
dávkování
citlivých
přísad
(sůl,
ocet,
konzervační
látky,
stabilizátory) 5. Prevence vniknutí mechanických nečistot (vyloučení nebo evidence a ochrana skleněných a dalších rizikových materiálů, poučení pracovníků). 6. Spolehlivý systém hygieny (osobní hygiena zaměstnanců) a sanitace (přesně vymezená osobní odpovědnost, kontrola účinnosti, princip „čisti, kudy chodíš“, podlahy a pracovní plochy co nejsušší, dezinfekce běžných úklidových pomůcek).
21
7. Dodržování zásad správné výrobní praxe (zvláště prevence křížení cest syrových a opracovaných surovin, oddělení výroby jednotlivých partií výrobků čištěním zařízení apod. ( http://www.vscht.cz/ktk/www_324/studium/HP/HP.pdf)
Zavedení správné hygienické a výrobní praxe může přinést výrobcům potravin ještě další výhodu, kterou je možnost zjednodušit systém kritických bodů. Zejména menší výrobci mohou využít snížení počtu kritických bodů až na jeden, zaměřený na kontrolu dodržování správné výrobní a hygienické praxe. (vyhl. 147/1998 Sb. ve znění vyhl. 196/2002 Sb.) 2.3.2
Hygiena během výrobního procesu Příprava všech salátů je z hygienického hlediska poměrně náročná lahůdkářská
práce, kde platí přísná hygienická pravidla, týkající se suroviny, přísad, ale především tzv. správné technologické praxe (GMP). Nedílnou součástí je i jejich správná úchova (po dobu nezbytně nutnou do jejich konzumace). Základním a limitujícím požadavkem je uchování při chladírenské teplotě do 5° C. (Matyáš et al., 2002). Schéma technologického procesu výroby lahůdkářských salátů je znázorněno na Obr.1.
22
Obr.1. Diagram výrobního procesu : (www.mze.cz attachments/Příručka_ 11 – 02_ lahůdky.doc) 1. Příjem
např.brambory pasterované, sterilované okurky, syrová rajčata, vakuově balená šunka, syrová vejce, balená majonéza.
↓ 2. Skladování
Suchý čistý sklad (sterilované okurky), sklad vajec, sklad zeleniny (rajčata), chladírna (balené suroviny – brambory, šunka, majonéza).
↓ 3. Výdej
↓ 4. Přípravné operace
Např. vybalování a krájení šunky, brambor a okurek/oplachování a spaření, zchlazení, loupání, odstranění semen a krájení rajčat/vaření, chlazení, loupání a krájení vajec/příprava nebo
.
otvírání obalů majonézy.
↓ 5. Příprava a
Míchání surovin.
kompletace
↓ 6. Skladování a expedice
↓ 7. Doprava
→
8. Uvedení do prodeje
23
Tato výroba neobsahuje etapy dekontaminace (tepelné opracování, atd.). Je proto třeba zvlášť dbát na kvalitu použitých surovin a osobní hygienu pracovníků v průběhu výroby a skladování.(www.mze.cz/attachments/Příručka 11_ – 02_ lahůdky.doc) Preventivní opatření, která by zabránila kontaminaci jak surovin, tak i finálních potravinářských výrobků, musí být zajišťována již v průběhu výroby. Jsou to nejen všeobecně známá preventivní hygienická opatření při zavádění správné hygienické praxe a zabezpečování kontrolního systému HACCP ve výrobě a distribuci poživatin, ale i nutná znalost požadavků jednotlivých patogenních mikrobů (Konečný, 2008).
2.3.3 Hygiena pracovního prostředí Vyrábět pokrmy lze jen v provozovně, která splňuje hygienické požadavky na prostorové a dispoziční uspořádání,
zásobení vodou, odstraňování odpadních vod,
mikroklima pracovišť, včetně požadavku na sníženou teplotu výrobního prostředí do 15°C, a na vybavení (Runštuk aj., 2001). Při udržování mikrobiologické čistoty provozu se používají mechanické, fyzikální i chemické prostředky a jejich kombinace. K mechanickým prostředkům náleží odstraňování prachu, nečistot a zbytků organického materiálu z provozoven, tj. ze strojů a ostatního zařízení, stěn i podlah. Důležitým mechanickým prostředkem je ventilace, odstraňující zvířený prach a páru, jež by jinak kondenzovala na stěnách a stropu a umožňovala rozvoj plísní. Z fyzikálních prostředků se nejčastěji uplatňuje vlhké teplo, především tlaková pára pro propařování potrubí, a jiného technologického zařízení (Šilhánková, 1997). Dále musí být zabezpečena spolehlivá hygiena nářadí a zařízení používaného při výrobě. Pokud se používají syrové složky, musí se u nich zabezpečit snížení obsahu mikroorganismů tepelným ošetřením. Před a po ukončení výroby se použité nářadí a zařízení musí důkladně očistit a dekontaminovat. (Görner a Valík, 2004). Runštuk aj. (2001) uvádí, že z provozního hlediska musí být funkci strojů a technického zařízení věnována trvalá pozornost. Před započetím práce musí být všechny části strojů, přicházející do styku s potravinami, opláchnuty čistou vodou. Stroje a zařízení musí odpovídat hygienickým předpisům. Při čištění je třeba věnovat největší pozornost těm částem strojů a zařízení, které jsou v přímém styku se surovinami.
24
2.3.4 Hygiena pracovníků Všechny osoby pracující v potravinářském průmyslu musí po celou dobu zaměstnání zachovávat úzkostlivou osobní čistotu. V souladu s charakterem vykonané práce musí zaměstnanci nosit vhodný oblek, včetně pokrývky hlavy. Ruce by si měli umývat tak často, jak to vyžaduje charakter výroby a požadavky na hygienu. (Matyáš et al., 1999) Při výrobě lahůdek musí zaměstnanci plně dodržovat hygienické zásady a předpisy, jedná se především o zákon č. 258/2000 Sb. O ochraně veřejného zdraví a o změně některých souvisejících zákonů a prováděcí vyhlášku k tomuto zákonu č.107/2001 Sb. o hygienických požadavcích na stravovací služby a o zásadách osobní a provozní hygieny při činnostech epidemiologicky závažných. Tyto předpisy podstatně ovlivňují podmínky při výrobě lahůdkářských výrobků. (Runštuk aj., 2001)
2.4 Vliv vnějšího prostředí na mikroorganismy Životní činnost mikroorganismů i jejich vývoj jsou závislé na vnějším prostředí. Aby se mohly mikroorganismy rozmnožovat, musí být v prostředí
jak dostatečné
množství surovin pro syntézu buněčné hmoty a dostatečné množství zdroje využitelné energie, tak i vhodné fyzikální , chemické a biologické podmínky. Mikroorganismy jsou ovšem schopny se přizpůsobit vnějším podmínkám nejen změnou enzymového vybavení svých buněk, ale mohou do určité míry změnit i složení a tvar buněk, aby byly vůči existujícím nepříznivým podmínkám odolnější. Mají také schopnost měnit do určité míry vnější podmínky ve svém nejbližším okolí, např změnou pH. Všechny tyto schopnosti mikroorganismů jsou ovšem určitým limitem, za nímž dochází k zastavení růstu nebo usmrcení buňky. Nepříznivé vlivy prostředí se uplatňují v přírodní selekci odolnějších rodů nebo druhů. V praxi se nepříznivé vlivy používají v boji proti nežádoucím mikroorganismům (Šilhánková, 2002).
2.5 Ochrana proti rozkladné činnosti mikroorganismů Intenzita rozkladných procesů (R) v určitém prostředí je přímo závislá na virulenci a počtu mikrobů a nepřímo závisí na odolnosti prostředí. Tyto okolnosti jsou vyjádřeny poměrem počtu mikrobů k odolnosti prostředí. Je – li hodnota počtu mikrobů nepoměrně vyšší, může být rozklad velmi pomalý, neznatelný nebo k němu vůbec nedojde. Musíme vzít v úvahu i to, že ne všechny mikroby, které kontaminují potraviny mají možnost se zde rozmnožovat a způsobit rozklad. Praktické konzervační metody pracují tak, že zmenšují nebo úplně potlačují činitele v čitateli, nebo naopak posilují
25
čitatele ve jmenovateli (Šroubková, 1996; Ingr, 1999). Kyzlink (1998) vypracoval systém konzervačních metod (biotických a anabiotických), který byl všeobecně přijat a který v redukované podobě vypadá následovně: •
vylučování mikroorganismů z prostředí
•
přímá inaktivace mikroorganismů
•
nepříma inaktivace mikroorganismů
Vylučování mikroorganismů z prostředí •
Zahrnuje omezování kontaminace potravin mikroorganismy, ochuzování potravin o mikroorganismy
během
pracovního
procesu,
případně
úplné
vyloučení
mikroorganismů z potravin. •
Omezování kontaminace potravin mikroorganismy znamená dbát na čistotu místnosti,
nářadí, strojů, vzduchu, vody, pomocných látek a přísad, čistotu
pracovníků. Ochuzování potravin o mikroorganismy během pracovního procesu se v praxi provádí při mechanickém odstraňování nečistot, kalů a pevných částic ze suroviny. Samy o sobě to nejsou konzervačními zásahy, ale přispívají k úspěchu konzervace. •
Úplné vyloučení mikroorganismů z potravin se uplatňuje jen u kapalin jako mikrobiální filtrace tzv. baktofugace
Přímá inkativace mikroorganismů •
fyzikální zákroky (sterilace zvýšenou teplotou přívodem tepla, konzervace krátkovlnným a elektronovým zářením)
•
chemické zákroky – chemosterilace (sterilace kyslíkem, chemikáliemi, fumiganty)
Nepřímá inaktivace mikroorganismů •
U potravin lze využít fyzikální ( případně fyzikálně chemické ) úpravy, chemickou konzervaci (chemoanabiózu) a konzervaci pomocí biologických zásahů.
•
Z fyzikálních metod se při výrobě zeleninových salátů uplatňuje jen konzervace.
•
Princip chemoanabiózy je že, nepatrným přídavkem uměle vyrobených chemických látek potlačíme v potravině rozvoj mikroorganismů. (Šroubková, 1996; Ingr, 1999)
26
2.6 Mikrobiologické požadavky na potraviny v ČR Mikrobiologické požadavky na potraviny jsou upraveny nařízením ES 2073/2005 a 1441/2007. V ČR také platí ČSN:569609, která charakterizuje mikrobiologická kritéria pro potraviny. Potraviny se z mikrobiologického hlediska hodnotí jako nevhodné k danému účelu, se sníženou hodnotou nebo omezenou trvanlivostí, jestliže byly překročeny tolerované hodnoty stanovené pro jednotlivé druhy, skupiny nebo podskupiny potravin, avšak nebyly překročeny nejvyšší mezní hodnoty. Potraviny se z mikrobiologického hlediska hodnotí jako zdravotně nezávadné, jestliže : •
byly překročeny nejvyšší stanovené mezní hodnoty pro bakteriální toxiny a mykotoxiny
•
byly překročeny stanovené nejvyšší mezní hodnoty počtu mikroorganismů
•
byly zjištěny mikroorganismy a mikrobiální metabolity, působící onemocnění z potravin
•
nebyly splněny podmínky obchodní sterility (kterou se zde rozumí nepřítomnost života schopných mikroorganismů, které by se mohly za podmínek oběhu potravin množit a dále nepřítomnost mikroorganismů vyvolávající onemocnění z potravin
•
byly zjištěny nežádoucí změny způsobené mikrobiální
činností, popřípadě
nežádoucí růst mikroorganismů (Ingr, 1999).
2.7 Charakteristika vybraných zdravotně závažných mikroorganismů a významných skupin mikroorganismů 2.7.1 Alimentární infekce Alimentární infekce je důsledkem konzumace potraviny obsahující danou patogenní bakterii v množství překračující minimální infekční dávku. Tato bakterie v trávicím traktu v průběhu množení vytváří toxiny, které poškozují strukturu nebo funkci tkání hostitele (Komprda, 2007). Mezi významné alimentární bakteriální infekce patří: Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Campylobacter sp. 2.7.1.1 Salmonella sp. Rod Salmonella je pojmenován po D.E. Salmonovi, americkém veterinárním lékaři, který objevil S.choleraesuis v roce 1884. Do roku 1914 bylo popsáno jen 12 serotypů. Až po roce 1930 se začíná počet objevovaných salmonel nesmírně rozrůstat. (Rosický, 1994) 27
Rod Salmonella je významným zástupcem čeledi Enterobacteriaceae. Jedná se o gramnegativní, fakultativně anaerobní nesporulující krátké tyčinky. Většina příslušníků rodu Salmonella je peritrichinózní (opatřena bičíky po celém povrchu těla), což jim zajišťuje pohyblivost. Komprda (2007) uvádí, že je možno, z pohledu šíření alimentárních onemocnění, různé druhy salmonel rozdělit do tří skupin : 1. Druhy primárně patogenní pro člověka :
2.
-
Salmonella typhi
-
S. paratyphi
Salmonely adaptované primárně na zvířecí druhy : - S.choleraesuis - S. gallinarum-pullorum
3.
Druhy patogenní pro člověka, tak pro zvíře : - S.typhimurium - S.enteritidis
Nejzávažnější onemocnění člověka způsobují S.typhi a S.paratyphi, avšak kvantitativně největší význam mají S.typhimurium a S.enteritidis (Komprda, 2007). Salmonely patří k poměrně odolným bakteriím, v zevním prostředí přežívají po několik týdnů. Do značné míry odolávají nízkému pH v žaludku a ve fagocytární vakuole (Votava et al, 2007). Nejvýznamnějšími faktory, které ovlivňují jejich činnost jsou teplota (optimum 30 - 40 °C ), pH (kyselost prostředí, rozmezí 7,2 – 6,5) a podíl volné, využitelné vody aw (rozmezí 0,97 – 1,00) (Rosický, 1994). Salmonely jsou značně rezistentní na chlad, za normálních podmínek se rychle rozmnožují, varem se rychle ničí. (Ambrož, 1986) Jsou to termolabilní bakterie, ale ve vnějším prostředí přežívají dlouho. Na rostlinách, hnoji, v čistírenských kalech a v potravinách přežívají někdy měsíce až rok, přičemž si zachovají svoji virulenci. (Görner a Valík, 2004) Zdrojem salmonel jsou především drůbež a jatečný dobytek. Vzácně se zdrojem může stát i nemocný člověk zaměstnaný v potravinářském průmyslu. Vektorem nákazy jsou tedy potraviny živočišného původu, hlavně maso a vejce, ať původně infikované nebo nebezpečné potraviny. Z hlediska přenosu jsou nebezpečné potraviny zvláště z mletého masa a vajec, které nejsou dostatečně tepelně zpracované - různé prejty, sekaná, tlačenka, paštiky, měkké salámy, majonézy. (Votava et al., 2007)
28
Rosický (1994), uvádí, že cesty vstupu salmonel do potravního řetězce, platné pro všechny suroviny a potraviny živočišného původu jsou v podstatě: •
intravitální infekce jatečných a jiných potravních zvířat,
•
křížová kontaminace surovin a potravin v průběhu zpracování,
•
sekundární kontaminace hotových výrobků,
•
pomnožení salmonel v průběhu těžení, zpracování, manipulace a
uchování potravin pro (vznik salmonelóz speciálně u lidí). Onemocnění vyvolaná primárně zoopatogenními salmonelami jsou velmi častá. Označují se jako salmonelózy
a často patří
mezi otravy z potravin. U nás patří
k nejčastějším střevním onemocněním. Po krátké, několikahodinové inkubační době se vyvinou v několik dní trvající gastroenteritidu se zvracením, bolestmi břicha a průjmem, zvýšenou teplotou (Votava et al, 2007). Bakterie salmonely se ze zažívacího traktu transportují do lymfatického systému a odsuď do krve. Krví mohou dále putovat kamkoliv a usadit se na různých orgánech, kde mohou způsobit i těžké komplikace. Závisí to nejenom na bakteriích samotných, ale i na vnímavosti a odolnosti organismu. I když mají po požití infikovaného jídla všichni stejnou pravděpodobnost nákazy, nebezpečenství hrozí zejména malým
dětem,
starým lidem a
osobám
s
oslabenou
imunitou
(http://www.ordinace.cz/clanek/salmoneloza/#sireni) Salmonelózy mají typicky sezónní výskyt, a to v letních měsících, kdy je vyšší pravděpodobnost, že se salmonely v nedostatečně chlazených potravinách pomnoží do vysokých dávek (salmonely se dobře množí už od 8 °C). Epidemiologický význam salmonel v potravinách a potřeba získávat rychle výsledky rozborů vedla k vypracování četných zkrácených metod a rychlých testů průkazu, z nichž některé existují i v komerčním provedení. (Jičínská a Havlová, 1996) Prevence salmonelóz,
jak uvádí Komprda (2007),
spočívá v následujících
opatření : •
vyloučení bacilonosičů z veškeré manipulace s potravinami,
•
dokonalé provedení
veterinární prohlídky všech potravin a surovin
živočišného původu, včetně mikrobiologického vyšetření, •
vysoká úroveň hygieny v potravinářských provozech, včetně obchodů,
•
ochrana potravin před hmyzem a hlodavci,
•
oddělení čistých provozů od rizikových,
29
•
vyčlenění pomůcek a nástrojů pro práci se syrovými potravinami (surovinami),
•
odděleni potravin a surovin živočišného původu od ostatních při jejich uložení v chladničkách,
•
správná tepelná úprava potravin,
•
použití pouze nezávadných zdrojů pitné a užitkové vody,
•
provádění bakteriologického vyšetření dovážených surovin, především masa,
•
vyloučení rizikových potravin ze stravy v letních měsících,
•
dodržování pravidel osobní hygieny,
Obr.2. Salmonella typhimurium, snímek z elektronového mikroskopu (http://cs.wikipedia.org/wiki/Salmonella)
2.7.1.2 Listeria monocytogenes Listeriózu je možno stručně charakterizovat jako v současné době vysoce aktuální závažné alimentární onemocnění postihující převážně obyvatele hospodářsky vyspělých zemí. (Komprda, 2007) Nejvýznamnějším patogenem rodu je Listeria monocytogenes. Rod je pojmenován po zakladateli antisepse, lordu Listerovi. Představují jej krátké grampozitivní tyčinky, které se nacházejí na sliznicích lidí i zvířat a na rostlinách (Votava et al., 2007). Listeria monocytogenes není jediným druhem rodu Listeria. Patří sem i Listeria innocua, L. grayi, L .seeligeri a také L. welshimeri. Pouze však Listeria monocytogenes je považována za patogenní pro člověka. (Konečný, 2007)
30
Při svém růstu listerie tolerují velké rozdíly pH a teplot. (Votava et al, 2007) Bakterie může přežít a dokonce růst v ledničkových teplotách (4 °C) a je tolerantní k nízkému pH a vysokým koncentracím soli (10%). ( Fratamico et al., 2005) Studie naznačují, že Listeria monocytogenes žije v trávicím traktu až 10% lidí, aniž by u nich vyvolala příznaky nemoci. Vyskytuje se také volně ve vnějším prostředí, půdě, ve vodě, na rostlinách, přežije i v silážích. (http://cs.wikipedia.org/wiki/Listeria_monocytogene) V epidemiologii listeriózy se významně uplatňuje bacilonosičství. Tomuto způsobu přenosu je připisováno asi 12% všech diagnostikovaných případů listeriózy. Nezanedbatelná je též možnost transplacentárního přenosu. Při výrobě a zpracování potravin hraje velkou roli křížová kontaminace. Přenos se ale ovšem děje hlavně potravinami. Velice významným faktorem při vzniku onemocnění je i citlivost hostitele. (Komprda, 2007) Listeria monocytogenes je fakultativní intracelulární parazit, je schopná proniknout do hostitelské buňky a množit se v ní. Faktory virulence jsou proteiny, které umožňují bakterii žít a množit se v hostitelském organismu.K pomnožení Listerie monocytogenes v potravinách může dojít při primární kontaminaci syrových potravin, jako je nedostatečně pasterizované mléko, měkké sýry, paštika, krůtí maso, drůbeží párky, nebo zelenina a dále při sekundární kontaminaci v průběhu vlastního vaření a uchování hotových pokrmů při pokojové teplotě, zkřížené kontaminaci při přípravě potravy a při nedostatečné osobní hygieně zaměstnanců manipulujících s potravinami. Při dostatečné funkci imunitního systému k onemocnění buďto vůbec nedojde, nebo proběhne bezpříznakově, eventuálně s mírnými příznaky, jako je nevolnost, zvraceni, průjem, nebo chřipce podobné symptomy. Listérie se mohou množit v buňkách střevní sliznice, ale dále do organismu nepronikají. (http://cs.wikipedia.org/wiki/Listeria_monocytogene) U zdravých osob proběhne listerióza většinou bez příznaků nebo jako chřipce podobné onemocnění. Je-li napaden plod, vyvíjí se u něj celková infekce, s tvorbou granulomů v orgánech a infikovaný plod se potrácí. U novorozenců a starých osob probíhá listerióza většinou jako bakteriémie a meningitida. (Votava et al., 2007) Listerie patří k rezistentním mikrobům, což dokazuje i jejich schopnost pomnožovat se v přítomnosti řady látek pro jiné mikroby toxických ( Votava, 2000). V rámci nejdůležitějších preventivních opatření je možno jmenovat : •
zavedení systému HACCP, 31
•
důsledné provádění hygienického dozoru ze strany kontrolních orgánů, včetně testovaní produktů na přítomnost listerií,
•
důsledná sanitace ( čištění a dezinfekce) povrchu strojů a zařízení,
•
dodržování zásad obecné a osobní hygieny (Komprda, 2007)
Tab. č. 4. Nejvýznamnější alimentární patogeny (Konečný, 2008) Původce onemocnění
Přirozený výskyt
Výskyt v potravinách
Infekční dávka (g)
Inkubační doba
Příznaky onemocnění
Salmonella spec.
Drůbež, domácí zvířata, lidé , ptáci
Vejce, syrové mléko či maso, aj.
105 děti 102
12 -72 hodin
Listeria monocytogenes
Půda, vegetace, zvířata, lidé
Syrové mléko, vepř.maso, zelenina
> 106
8 dnů až 3 měsíce
E .coli 0157 H7
Skot, ovce, výkaly, kontamin.
Syrové mléko, maso, hamburgry
nestanovena
3-9 dnů
Zvracení, průjem, teolota, křece, dehydratace Chřipkové až meningokok ové příznaky, potraty těhot.žen. Krvavé a vodnaté průjmy, křeče, selhání ledvin, končí smrtí Profůzní průjmy, křeče, nevolnost, teplota Nevolnost, zvracení, a průjem trvající 1-2 dny Nevolnost a zvracení již za 1 hod. průjem po 6 hod. Intoxikacezažívací nebo nervové příznaky, dlouhodobé působenívznik rakoviny
voda
Campylobacter jejuni
Půda, voda, výkaly, drůbež
Syrové mléko, maso,hl.drůbež
<5x102
48 hod.až týden
Staphylococcus aureus
Kůže, sliznice nosu, hrtanu, poranění
Těstoviny, ryby, mléko, maso, sýry
105-106 1mg toxnu
2-6 hod
Bacillus cereus
Půda, rostliny
Rýže, syrové mléko, maso, zelenina, koření.
>103
1-15 hod
Plísně
Půda, prach, zelenina, výkaly
Chléb, sýry, ovoce, zavařeniny.
variabilní
variabilní
32
2.7.1.3 Escherichia coli Patogenní kmeny Escherichia coli jsou v současnosti považovány za jeden z největších mikrobiologických problémů výroby potravin. (Komprda, 2007) Escherichia coli (velmi často jen zkráceně E. coli) je fakultativně anaerobní gramnegativní bičíkatá tyčinkovitá bakterie žijící v tlustém střevě teplokrevných živočichů. Byla objevena německo-rakouským pediatrem a bakteriologem Theodorem Escherichem v roce 1885. (http://cs.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli) Kromě Escherichia coli lze u člověka vzácně prokázat druhy Escherichia hermannii, Escherichia vulneris a Escherichia fergusonii (ve střevě). (Votava et al., 2007) Escherichia coli je nejprozkoumanějším mikrobiálním druhem, neboť slouží jako modelový organismus pro biochemické, genetické, fyziologické studie. Je prvním bakteriálním druhem, u něhož byla pozorována a prostudována konjugace (tj.spájení) buněk a výměna genetického materiálu, jeho chromozom byl podrobně zmapován a také bakteriofágy, které jej napadají, patří k nejprostudovanějším. (Šilhánková, 2002) Střevní infekce se projevují průjmem. Jejich původci se dají rozčlenit na nejméně čtyři skupiny kmenů : •
enterotoxigenní (ETEC)
•
enteropatogenní (EPEC)
•
enterohemoragické (EHEC)
•
enteroinvazivní E. coli (EIEC). (Votava et al., 2007)
První dvě skupiny představují převážně potravinové nákazy a druhé dvě skupiny převážně potravinové toxikoinfekce (Görner a Valík, 2004). Patogenní kmeny E. coli mohou růst v rozmezí teplot 7 – 46 °C, pH 4,4 – 9,0 a aw nad 0,96. Rychle se množí při koncentraci NaCl 2,5%, inhibuje je až koncentrace NaCl 8,5%. V chladírenských podmínkách přežívají až několik týdnů při pouze malé redukci počtu buněk. Naopak však nejsou nijak výjimečně odolné vůči vyšší teplotě (Komprda, 2007). Escherichia coli zkvašuje cukry (např. glukósu, laktosu, některé pentosy a alkoholické cukry) za intenzivní tvorby kyselin a plynu. Tvoří z těchto cukrů hlavně kys.mléčnou, pyrohroznovou, octovou a mravenčí, přičemž část kys.mravenčí rozkládá na oxid uhličitý a kyslík. Gramnegativní povahy Escherichie coli a její schopnosti
33
zkvašovat laktosu za vzniku kyselin se využívá pro její zjištění v potravinách nebo ve vodě. (Šroubková, 1996) Její přítomnost ve vodě indikuje čerstvé fekální znečištění a vede k vyloučení vody pro použití jakožto pitné vody. (http://cs.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli) E .coli je příslušníkem normální střevní flóry, v níž zaujímá nanejvýš 1 % (zbytek jsou hlavně anaerobní mikroby). Mimo střevo je však téměř vždy patogenní a některé kmeny jsou vybaveny takovými faktory virulence, že jsou patogenní i ve střevě a vyvolávají průjem. Mezi faktory virulence patří hlavně adhesiny a toxiny. Jako adhesiny slouží především fimbrie (Votava et al., 2007). Rezervoárem pro kontaminaci potravin jsou pracovníci, přicházející do styku s potravinami. E. coli se nachází v sýrech, různých salátech (bramborový), v hamburgerech a uzeninách. Potraviny jsou kontaminovány při nedodržení hygieny výroby, balení a skladování potravin a při nedostatečné osobní hygieně pracovníků (Cempírková et al.,1997). Dalším
zdrojem
onemocnění
jsou
potravinářské
suroviny
pocházející
z nemocných zvířat. Častou příčinou, je konzumace hotových jídel, která byla infikována po jejich kulinárním zpracování a ponechána delší
dobu při pokojové
teplotě (Komprda, 2007). Nejčastějšími mimostřevními infekcemi vyvolanými E.coli jsou infekce močového traktu. V komunitě odpovídá E.coli za 80% močových infekcí. Původci jsou uropatogenní kmeny, většinou hemolytické a vybavené adhesiny. E.coli se dále pravidelně objevuje v ústní dutině těžce nemocných osob, zejména starších a hospitalizovaných. (Votava et al., 2007) Správné zacházení s potravinami a vhodná hygiena zamezí jejímu rozšíření (Medigan et al., 2009). V současnosti se do popředí pozornosti medicínských mikrobiologů a epidemiologů dostávají enterohemoragické (EHEC) kmeny E.coli 0157:H7, která způsobují vážná průjmová onemocnění u lidí. (Marth a Steele, 2001) Toxikoinfekce způsobené E.coli 0157 : H7 se vyskytují ve spojitosti s konzumací kontaminovaného a nedostatečně kulinárně technologicky upraveného masa, ovocných šťáv, zeleniny, mléka, mléčných produktů (Görner a Valík, 2004).
K nejdůležitějším preventivním opatřením patří : •
důkladné tepelné ošetření potravin: (70 °C ve všech částech tedy i v jádře potraviny) po dobu minimálně 2 minut, 34
•
správná zootechnická praxe,
•
správná pasterace mléka,
•
zabránění křížové kontaminaci: důsledné oddělení manipulace s tepelně opracovanými a sýrovými produkty ( Komprda, 2007).
S ohledem na možnost hygienického rizika se v posledních letech metodám průkazu a stanovení E.coli věnuje v mezinárodním měřítku zvýšená pozornost a samotný ukazatel „Eschericha coli“ se postupně zavádí do mikrobiologických hodnotících kritérií potravinářských výrobků v průmyslově vyspělých státech.(E. Jíčínská, J. Havlová, 1996)
Obr.3. Escherichia coli při 1000 násobném zvětšení (růžová barva je pozůstatek Gramova barvení).( http://cs.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli)
2.7.1.4 Campylobacter sp. Kampylobaktery jsou mikroaerofilní a kapnofilní (vyžadují sníženou koncentraci kyslíku a zvýšenou tenzi oxidu uhličitého v atmosféře). Tyto mikroorganismy nedovedou fermentovat cukry, jako zdroj energie jim slouží aminokyseliny (Votava, 2000). Původcem
kampylobakteriózy
jsou
termotolerantní
patogenní
druhy
Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis (Komprda, 2007). Nejvýznamnějším humánním patogenem je Campylobacter jejuni. Procento onemocnění zapříčiněných tímto mikrobem kolísá ve světové populaci mezi 4 až 35 % pacientů s klinicky manifestními průjmy (Votava, 2000).
35
Campylobacter jejuni je od sedmdesátých let považován za nebezpečný potravinářský patogen a patrně je původcem přibližně dvojnásobného množství případů střevních
onemocnění
ve
srovnání
se
známější
Salmonellou.
Původně
byl
Campylobacter považován za neškodný mikroorganismus žijící v zažívacím traktu některých živočichů a dosud není objasněna skutečnost, že je často přítomen v zažívacím traktu ptáků, aniž by působil jakékoliv potíže, zatímco je vážným patogenem u lidí. Zdravé osoby nejsou nositely tohoto patogenu a nedochází k přenosu z infikovaných osob na osoby zdravé. Hlavním symptomem infekce je průjem, ale mohou se vyskytovat i další příznaky; horečka, zvracení, bolesti hlavy a břicha. Projevují se obvykle za 2 až 5 dnů po požití infikované potraviny a velmi oslabují organismus, obvykle trvají až 10 dnů (http://www.eufic.org/article/cs/food-safety-quality/foodcontaminants/artid/campylobacter-jejuni-bakterie). Kampylobakter je termofil, teplotní optimum pro růst je 42 – 43 °C, teplota 46°C již růst zcela inhibuje. Při pH pod 7,7, již není kampylobakter schopen růst, při pH 5,0 a 4 °C však zůstává života schopný. Kamylobakter je inaktivován i relativně nízkou koncentraci soli: 1,5 %. V případě kamylobakteriózy se jedná o onemocnění zootechnického charakteru (přenos ze zvířat na člověka). Rezervoárovými živočichy jsou především různé druhy drůbeže, menší význam mají skot. Ke kolonizaci drůbeže dochází vodou, krmivem, prostřednictvím divokých ptáků, a hlodavců, přes drůbeží výkaly. K přenosu patogena dochází v průběhu porážení drůbeže. Infekční dávka je relativně nízká, 102 buněk/gram potraviny. Onemocnění probíhá pod obrazem typické enteritídy (zánět střeva). Inkubační doba je několik (2-7 dní), onemocnění se projevuje horečkou, křečemi, bolestmi břicha, průjmem (Komprda, 2007). V současné době se používá k průkazu a stanovení Campylobacter sp. v klinickém materiálu a v potravinách několik selektivních pomnožovacích médií a selektivně diagnostických agarových půd a kultivačních postupů (Jičínská a Havlová, 1996)
36
2.7.2 Alimentární intoxikace Cempírková et al, (1997) uvádí, že se jedná o onemocnění vzniklá působením toxinů, které se tvoří působením činností bakterií v potravinách nebo jsou to toxiny produkovány až ve střevě.
2.7.2.1 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus byl objeven v Aberdeen ve Skotsku v roce 1880 chirurgem sirem Alexandrem Ogstonem. (http://wikipedia.infostar.cz/s/st/staphylococcus_aureus.html) S. aureus (často zvaný zlatý stafylokok) je druh grampozitivních bakterií. Způsobuje velmi často různé choroby, jejichž patogenita je výsledkem produkce toxinů či přímého ničení tkáně nemocného. S.aureus vstupuje do potraviny z povrchu při zacházení s potravinami (Ronald, 1995) . Příkladem onemocnění způsobeného touto bakterií je otrava infikovaným jídlem. S.aureus může být přítomen v salámech, mase, ale i v pečivu plněném pudinkem, dále v bramborovém salátu či v zmrzlině. (http://cs.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus) S. aureus způsobuje hnisavé onemocnění na kůži (trudovitost), hnisání ran a hnisavé onemocnění poraněných kostí. Dostane-li se do potraviny, produkuje tam toxiny bílkovinné povahy, které mohou způsobit vážné smrtelné otravy. Tyto toxiny se inaktivují varem (jsou termolabilní) a proto je nebezpečí otrav hlavně u potravin, jež se dále tepelně neopracovávají. Vedle metabolismu aerobního má rod Stapylococcus i metabolismus anaerobní, takže je schopen zkvašovat cukry za tvorbu kyselin (Šroubková, 1996).
37
Obr.4. St.aureus (http://cs.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus)
Stafylokoky patří mezi poměrně odolné mikroby. Nevadí jim např. vyschnutí ani přítomnost 10 % NaCl v prostředí. Z dezinfekčních prostředků odolávají poměrně dobře fenolu a sloučeninám těžkých kovů (Votava et al, 2007). U člověka a zvířat jsou stafylokoky přirozenou součástí mikroflóry dutiny nosní a ústní a mikroflóry kůže a srsti. Obvykle se zjišťují u 30 - 50 % zdravých lidí v dutině nosní, na kůži bývá výskyt nižší (5 - 30 %). Dále se vyskytují v prachu, ve vzduchu, ve vodě, v odpadních vodách (Cempírková et al., 1997). Asi 20 - 50 % koaguláza pozitivních kmenů S.aureus izolovaných ze člověka má schopnost tvořit stafylokokové enterotoxiny, které mohou zapříčinit otravy potravinami – enterotoxikózy ( Görner a Valík, 2004). Na přenosu onemocnění se významně podílí člověk, u kterého se vyskytují hnisavé procesy na kůži nebo záněty horních cest dýchacích. Takovýto člověk, přicházející do styku s potravinami, může způsobit jejich sekundární kontaminaci, a to buď přímo, nebo nepřímo přes nástroje nebo pomůcky používané při manipulaci s těmito potravinami. V kontaminované potravině, která není uchována při teplotě vyšší než 60 °C nebo nižší než 7 °C následně dochází k pomnožení stafylokoka a tvorbě toxinu. Častou příčinou otrav stafylokokovým enterotoxinem je potravina vyžadující rozsáhlejší opracování v průběhu více technologických kroků, po přípravě uchována při mírně zvýšené teplotě. Pro stafylokokovou enterotoxikózu je typická velice krátká inkubační doba. Příznaky se objevují již za 2 – 3 hodiny (Komprda, 2007). Dávka enterotoxinu potřebná k vyvolání onemocnění je 1µ (Cempírková et al., 1997).
38
Stafylokokové enterotoxikázy působí na sliznici střeva, což vede k prudkému zvracení spojeným s průjmem bez zvýšení tělesné teploty, v těžkých případech až s kolapsovým stavem (děti). Příznaky vymizí obyčejně za jeden až dva dny (Görner a Valík, 2004). Prevence onemocnění spočívá v eliminaci pramenů nákazy, tj. dobré osobní hygieně zaměstnanců v potravinářských a kulinárních závodech a prostorách (Komprda, 2007). Stafylokoky dobře rostou na běžných půdách. K jejich izolaci se nejlépe hodí krevní agar s 5 % ovčích erytrocytů a dále běžný thioglykolátový bujón (Votava, 2000). 2.7.2.2 Bacillus cereus Rod Bacillus je velmi rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený. Jeho druhy tvoří většinou grampozitivní peritrichni tyčinky, které mají bohaté enzymové vybavení, takže mohou rozkládat nejrůznější organické sloučeniny. Většina druhů má velmi aktivní amylolytické enzymy, které štěpí škrob, řada druhů má pektolytické enzymy, které štěpí rostlinné pektiny. Většina druhů má také velmi aktivní proteolytické enzymy, takže se uplatňuje při aerobním a anaerobním rozkladu bílkovin ( Šroubková, 1996). Příslušníci rodu Bacillus jsou nejčastějšími kontaminanty ve fermentačních procesech, neboť jsou v přírodě a na nejrůznějším materiálu velmi početně zastoupeny. Díky fakultativně anaerobní povaze a bohatému enzymovému vybavení se rozmnožují na nejrůznějším materiálu. Mimořádná odolnost spor tohoto rodu ke zvýšeným teplotám vede k tomu, že při nedostatečné tepelné sterilaci media nebo technologického zařízení mohou tyto spory přežít a v nekyselém prostředí vyklíčit (Šilhánková, 1997). Bacillus cereus se vyskytuje ubikvitárně v prostředí, bývá izolován z půdy, vegetace, vody, srsti živočichů. V potravinách se vyskytuje běžně, ovšem v množství <102 KTJ/gram, což je považováno za hodnotu přijatelnou z hlediska zdravotní nezávadnosti. V případě chybné manipulace s potravinou, především poněkud se jedná o nedodržení správného teplotního režimu, může dojít k pomnožení patogena na hodnoty >105 KTJ/gram, což stačí k intoxikaci. Vegetativní formy B. cereus se v tepelně neopracovaných surovinách množí jen velmi sporadicky. Jeho růst je zde potlačován ostatními přítomnými mikroorganismy, zvláště se projevuje antagonismus gramnegativnich tyčinek. Po tepelném opracování potravin je doprovázející nespirálující mikroflóra zničena, čímž po vyklíčení spor nastávají příznivé podmínky pro množení a růst. Spory B. cereus snesou pasterační teploty i běžné převaření.
39
Podmínkou vzniku intoxikace je tedy přítomnost spor v potravině, která byla tepelně ošetřena a poté ponechána delší dobu při teplotě vhodné pro růst a množení vegetativních forem B. cereus, které vyklíčily z přítomných spor. B. cereus intenzivně produkuje při svých metabolických projevech enzym fosfolipázu C, pomocí níž rozkládá v potravině přítomný lecitin na vlastní toxický produkt – lyzolecitin. Vzniklý lyzolecitin způsobuje hemolýzu erytrocytů (Komprda, 2007). Patogenita B. cereus je dvojí. Vyvolává jednak otravy z potravin, které mají dvojí formu, emetickou a průjmovou, jednak se chová jako oportunní patogen, dostanou – li se jeho spory do organismu. Nebezpečná je rychle probíhající endoftalmitida po penetrujícím poranění oka, vedoucí k oslepnutí. Značně vnímavý jsou i novorozenci nedonošenci (Votava, 2000). Na vyvolané onemocnění z potravin je třeba velké koncentrace buněk B. cereus v 1gramu, a to asi 1 až 10 miliónů. Inkubační čas je krátký 3 - 20 hodin, podle množství buněk přítomných v potravině. Onemocnění se projevuje vodnatými průjmy a křečemi ve střevech. Potraviny se před rozmnožováním B. cereus ochraňují udržováním a uschováváním v takových tepelných podmínkách, které zabraňují rozmnožení spor a nebo buněk. Jsou to teploty nižší než 10 °C, tedy chladničkové (Arpai a Bartl, 1997). Pro stanovení Bacillus cereus se používá selektivní agar s masovým extraktem, peptonem, žloutkovou emulzí, fenolovou červení a sulfátem polymyxinu B jako inhibitorem doprovodné mikroflóry (Šilhánková, 1997). 2.7.3 Výskyt kvasinek a jejich význam v potravinářském průmyslu Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy patřící mezi houby. Svůj český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně trisacharidy na ethanol a CO2 (Šroubková, 1996). Jsou to jednobuněčné organismy, které patří do tříd Ascomytes, Basidiomycetes nebo Deuteromycetes. Kvasinky vyžadují kyselé prostředí a alespoň minimum kyslíku. Jsou náročné na zdroj energie, potřebují i amoniakální dusík aminokyselin, některé vitamíny a minerální látky (Ingr, 1999). Při mikrobiologickém zkoumání lahůdkových výrobků z hlediska jejich stability, má stanovení obsahu kvasinek v nich významnou výpovědní hodnotu. Stanoveni není z hlediska materiálu a pracnosti náročné. S přibývající kyselostí vyšetřovaného produktu jejich počet neklesá a kromě jejich indikátorového významu se i přímo
40
zúčastňují při kažení produktu (tvorby plynu, změny senzorických vlastností) (Görner a Valík, 2004) Kvasinky postrádají pohybové orgány, nejsou schopny aktivního pohybu. Dobře vyživované, pěstované za optimálních podmínek se množí pouze vegetativně. Jsou velmi rozšířeny v přírodě, setkáváme se s nimi na povrchu sladkých plodů, v nektaru květů, v půdě, vodě, potravinách, trávícím traktu lidí a zvířat i na povrchu těl. (Ambrož, 1999) Výskyt kvasinek ovlivňuje také jejich nízká tepelná odolnost. Většina kvasinek je usmrcena již při 2-5 minutovém zahřívání na 56 °C, spory kvasinek mají tepelnou odolnost jen nepatrně vyšší. Rozmnožováni kvasinek je úplně potlačeno při teplotě 38 °C (Šilhánková, 2002). Hrubý (1984) uvádí, že v lahůdkářských výrobcích jsou nacházena značná množství kvasinek nejrůznějších druhů. Zvlášť významná z hlediska kvasinek je zelenina, proto se nejčastěji, kromě cibule, zpracovává konzervovaná. Pokud se ale velké balení konzervované zeleniny a brambor nespotřebuje naráz a uchovává se načaté, může dojít k pomnožení kvasinek, které se do nich dostaly sekundární kontaminací. Za mimořádně rizikové z tohoto hlediska jsou kyselé okurky, které se někdy používají místo sterilizovaných. Poměrně málo nebezpečné jsou z hlediska obsahu kvasinek ve výrobě používané uzeniny a vejce. Mohou být ale příčinou obsahu salmonel v produktech (Görner a Valík, 2004). Kvasinky jsou sice obecně využívány v řadě odvětví potravinářského průmyslu, nicméně současně představují mikrobiální agens, která mohou způsobovat právě tomuto průmyslovém
odvětví
významné
hospodářské
škody,
především
v důsledku
znehodnocování poživatin např. kompotů, moštů, slazených limonád (Dobiáš, 1999). Zejména při masivní kontaminaci mohou kvasinky způsobit lehčí onemocnění trávicího ústrojí. Kromě toho se mohou vyskytovat v potravinách také patogenní kvasinky způsobující především kožní onemocnění nebo onemocnění trávicího a dýchacího ústrojí (Hrubý, 1984). Při technologickém zpracování lahůdkových salátů převládá manuální činnost. Kritickými body, kromě kvality surovin, jsou proto osobní čistota, a dodržování zásad hygieny. Význam má také čistota (sanitace) strojů a zařízení. Suroviny, polotovary i hotové výrobky musí být uchovány při nízkých teplotách. Záleží nejen na uschování výrobků v obchodní síti, ale i doma u konzumentů. Vyžadují skladování do 8 °C (Hrubý, 1984). 41
2.7.4 Výskyt plísní a jejich význam v potravinářském průmyslu Jako plísně (vláknité mikromycety) se označují mikroskopické vláknité vícebuněčné eukaryotické mikroorganismy patřící mezi houby (Fungi). Mikromycety jsou parazitické nebo saprofytické mikroorganismy, některé jsou rozšířeny po celém světě. Mikroskopické vláknité houby jsou součástí přírody miliony let a plní nezastupitelnou
roli
destruentů
při
rozkladu
organické hmoty.
Plísně patří
k nejrozšířenějším životním formám na naší planetě. Jejich spory mají schopnost přežívat i v těch nejméně příznivých podmínkách za vysokých teplot a tlaků (Buňková a Janalíková, 2007). Potravinářsky významné jsou plísně náležející do tříd Zygomycetes, Ascomycetes a Denteromycetes. Plísně vystačí často se zcela nepatrným množstvím živin. Podle povahy prostředí mohou podle potřeby vytvářet indukované (adaptivní) enzymy. Plísně vytvářejí makroskopické viditelné porosty, některé plísně vytvářejí velmi toxické zplodiny (mykotoxiny), některé jsou typické specifickým pachem (Ingr, 1999). Hlavním rezervoárem plísní je půda, z níž se dostávají do vzduchu, na organický materiál převážně rostlinného původu, na exkrementy zvířat a průmyslové předměty uložené ve vlhku. Různá barviva konídií i endospor plísní chrání tyto buňky před nepříznivými účinky ultrafialové složky slunečního světla, a proto se plísně vyskytují jako velmi častá vzdušná kontaminace Význam plísní je dán jejich fyziologickými vlastnostmi. Vzhledem k přísně aerobní povaze se mohou rozmnožovat většinou pouze na povrchu napadeného matriálu..Plísně mají schopnost využívat vzdušnou vlhkost, proto napadají materiály, jsou-li uložené ve vlhkém prostředí. Jsou ale schopny se také rozmnožovat za poměrně nízké vlhkosti prostředí. Oproti bakteriím a kvasinkám mohou plísně napadat i neporušená rostlinná pletiva (zeleniny, ovoce). Protože některé plísně rostou i za velmi nízké teploty (i při 10 °C), způsobují ztráty při dlouhodobém skladování (Šroubková, 1996). Na rozdíl od bakterií se plísně rozmnožují mnohem pomaleji, a proto mohou s bakteriemi konkurovat pouze při extrémních podmínkách. Mimořádně vysoký negativní význam mají plísně z hlediska tvorby mykotoxinů. Mykotoxiny jsou metabolické produkty toxigenních druhů hub. Nejvýznamnější mykotoxiny jsou produkovány rody Aspergilus, Penicillium, Fusarium, Alternaria. Dnes známe více než 300 mykotoxinů, které produkuje asi 350 druhů hub. Mykotoxiny jsou přesně definované sloučeniny nízké molekulární hmotnosti. Jsou většinou termostabilní, proto ochrana před nimi je založena na prevenci rozvoje
42
plísní. Mykotoxiny způsobují více čí méně těžké fyziologické změny u lidí a zvířat nebo přímo intoxikace – mykotoxikózy. Poškozují vnitřní orgány, způsobují krvácení, nervové poruchy (Šroubková, 1996). Některé druhy plísní jsou významnými producenty biofaktorů nebo se uplatňují jako průmyslové kmeny v biotechnologických procesech (Dobiáš, 1999).
43
3. CÍL PRÁCE •
zpracovat literární rešerši v níž budou shrnuty poznatky o lahůdkových salátech
•
zaměřit se na kontaminující mikroorganismy a produkty jejich metabolismu negativně ovlivňující lidské zdraví
•
experimentálně stanovit významné skupiny mikroorganismů ve vybraných výrobcích
44
4. MATERIÁL A METODIKA 4.1 Analyzovaný materiál K mikrobiologickému rozboru byly použity 2 druhy lahůdkových salátů Feferonkový a Pochoutkový zakoupené ve dvou obchodech – Brněnka, Interspar.
a) vzorek č.1 - Feferonkový salát – pultový prodej, výrobek byl zakoupen 23.3.2009 v obchodě Brněnka, vzorek byl téhož dne zpracován, složení výrobku: sýr EIDAM, okurek, cibule, hrášek, kapie, olej, feferony, koření
b) vzorek č.2 - Pochoutkový salát – pultový prodej, výrobek byl zakoupen 23.3.2009 v obchodě Brněnka, vzorek byl téhož dne zpracován, složení výrobku: majonéza, jemný salám, okurek, cibule, hrášek, koření
c) vzorek č.3 - Feferonkový salát – pultový prodej, výrobek byl zakoupen 23.3.2009 v supermarketu Interspar, vzorek byl téhož dne zpracován, složení výrobku: sterilovaná zelenina (paprika 30%, hrášek 12 %, kapie 10%, feferony 8 %, cibule 20 %), voda, ocet, cukr, sůl, kořenící přísady, náhradní sladidla, sacharin, sýr EIDAM 9 % (pasterované kravské mléko, mlékařské kultury, syřidlo, sůl, chlorid vápenatý)
d) vzorek č.4 - Pochoutkový salát – pultový prodej, výrobek byl zakoupen 23.3.2009 v supermarketu Interspar, vzorek byl téhož dne zpracován, složení výrobku: salám výrobní 32%, majonéza 30 % (rostlinný olej, pitná voda, kvasný ocet lihový, vaječné žloutky, pšeničný modifikovaný škrob, jedlá sůl), hrášek sterilovaný 11 %, jogurt býlí, hořčice plnotučná, cukr, Worchester, sůl, pepř černý mletý
V analyzovaném materiálu byl stanoven celkový počet mikroorganismů (CPM), koliformní bakterie (koli), a počty kvasinek a plísní (K/P).
45
4.2 Příprava laboratorních pomůcek Laboratorní sklo (pipety) použité při mikrobiologickém rozboru bylo sterilizováno v horkovzdušném sterilizátoru při 165 °C po dobu 1 hodiny. Zkumavky s destilovanou vodou a Erlenmayerovy buňky s živnými půdami byly sterilizovány v parním sterilizátoru 20 minut při 121 °C. Při rozboru byly použity sterilní jednorázové Petriho misky.
4.3 Příprava kultivačních půd 4.3.1 Typy použitých půd pro jednotlivé mikroorganismy •
agar Endo pro stanovení koliformních bakterií (kultivace 24 hod/37 °C )
•
PCA agar pro stanovení CPM (kultivace 3 dny/30 °C)
•
agar s chloramfenikolem na stanovení kvasinek a plísní (kultivace 5 dní/25 °C)
4.3.2 Složení půd a jejich příprava •
Agar Endo (MERCK, Něměcko) složení : masový extrakt
8,55 g/l
pepton z hovězího masa
10,0 g/l
laktóza
10,0 g/l
chlorid sodný
5,00 g/l
siřičitan sodný bezvodý
1,20 g/l
fuchsin bazický
0,25 g/l
agar
12,0 g/l
Příprava: Do jednoho litru demineralizované vody se přidá 47 g sušené živné půdy, rozpustí se zahříváním ve vodní lázni nebo proudící páře. Po dokonalé rozpuštění se živná půda sterilizuje v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Konečné pH při 25 °C je 7,4+/- 0,2. •
PCA agar (Biokar Diagnostics, Francie) složení: trypton
5,00 g/l
kvasničný extrakt sušený
2,50 g/l
glukóza
1,00 g/l
agar
12,0 g/l
46
Příprava: Navážka 20,5 g sušené půdy se rozpustí v 1 litru destilované vody a zahřívá se do úplného rozpuštění. Sterilizuje se v autoklávu 15 minut při 121 °C. Konečné pH při 25 °C je 7,0 +/- 0,2 g/l. •
Agar s chloramfenikolem (Himedia, Indie) složení: kvasničný extrakt
5,00 g/l
dextrosa
20,0 g/l
chloramfenikol
0,10 g/l
agar
14,9 g/l
Příprava: Navážka 40,0 g přípravku se rozpustí v 1 litru destilované vody a zahřívá se do úplného rozpuštění. Sterilizuje se v autoklávu 15 minut při 121°C. Konečného pH při 25 °C je 6,6+/-0,2.
4.4 Zpracování vzorků U všech čtyř vzorků byla provedena metoda desetinného ředění. Z lahůdkových salátů se na digitálních vahách odváží vzorky o hmotnosti 10 g. Navážka se přesype do sterilního plastikového sáčku a přidá se 90 ml destilované vody. Sáček se uzavře svorkou a vloží se na 1 minutu do homogenizátoru typu STOMACHER, čímž se obsah sáčku důkladně promíchá. Takto získáme ředění 10-1. Po homogenizaci se ze sáčku se vzorkem odebere pipetou 1 ml a převede se do zkumavky s 9 ml destilované vody, čímž se získá ředění 10-2. Z toho ředění se pipetou odebere opět 1 ml do další zkumavky s 9 ml destilované vody a takto se pokračuje až do ředění 10-7. Pro stanovení koliformních bakterií bylo použito ředění 10-1, pro kvasinky a plísně 10-1 a 10-2 a pro stanovení CPM 10-5, 10-6, 10-7. Z každé takto připravené zkumavky se po důkladném promíchání jejího obsahu odebral pipetou 1 ml na předem připravenou Petriho misku. Pro každé jednotlivé ředění byly nachystány 2 Petriho misky. Misky s napipetovaným inokulem
se zalijí
odpovídající půdou (zchlazenou na 45 °C) a krouživými pohyby dojde k promíchání inakula s agarem. Po ztuhnutí agaru se misky obrátí dnem vzhůru a vloží se do termostatu při dané době a teplotě pro určitou skupinu mikroorganismů. Během celého
47
průběhu zpracování vzorků musí být kladen důraz na maximální sterilitu, aby nedošlo ke kontaminaci mikroflórou z vnějším prostředí.
4.5 Způsob vyhodnocování výsledků Po ukončení inkubace byly jednotlivé kolonie mikroorganismů na miskách spočítány. Výsledné počty mikroorganismů byly poté uvedeny v KTJ na gram výchozího materiálu dle rovnice :
∑ (a + b + c + d ) (n1 + 0.1 ⋅ n2 ) ⋅ d
48
5. VÝSLEDKY A DISKUSE Cílem, experimentálního rozboru v bakalářské práci, bylo stanovit mikrobiální osídlení vybraných druhů lahůdkových salátů. Byly zvoleny dva druhy salátů s odlišným složením. Nálezy mikrobiálního osídlení byly rovněž odlišné. Výsledky mikrobiologických analýz jsou uvedeny v Tab. č.5.
Tab. č. 5. Počty mikroorganismů v lahůdkových salátech Skupina 1. 2. 3. 4. mikroorganismů Feferonkový Pochoutkový Pochoutkový Feferonkový salát salát salát salát (KTJ/g)
(KTJ/g)
(KTJ/g)
Brněnka
(KTJ/g)
Interspar
COLI
ND
ND
ND
ND
CPM
2,7.106
1,8.106
1,0.105
4,5.106
Plísně
25
15
5
90
1,8.104
4,7.104
ND
9,0.103
Kvasinky
Vysvětlivky : COLI - koliformní bakterie, CPM – celkový počet mikroorganismů, ND - nedetekováno
Celkový počet mikroorganismů se u vzorků salátů pohyboval řádově v rozmezí 105 – 106 KTJ/g. Nejnižší počty byly zjištěny u vzorku Pochoutkového salátu ze supermarketu Interspar (1,0.105 KTJ/g) Celkově vyšší počty byly zjištěny u vzorků Feferonkového salátu. Koliformní bakterie, které jsou důležité z hygienického hlediska, kde jejich přítomnost v potravinách je ukazatelem, že zde došlo k znečištění (Šilhánková, 2002) ve vzorcích detekovány nebyly. Počty plísní byly v analyzovaných vzorcích velmi nízké. Kvasinky se ve vzorcích salátů, s výjimkou vzorku 3.Pochoutkový salát, vyskytovaly v rozmezí řádově 103 – 104 KTJ/g. (viz.tab č.5) Kvasinky jsou podle (Görner a Valík, 2004) na podmínky prostředí (pH, teplota) nenáročné a proto mohou být významným kontaminantem podílejícím se na kažení tohoto typu potravin.
49
(a) Brněnka 10000000
1000000
[KTJ/g]
100000
10000 Feferonkový salát Pochoutkový salát
1000
100
10
1 COLI
CPM
Plísně
Kvasinky
Skupina Mikroorganismů
(b) Interspar 10000000
1000000
[KTJ/g]
100000
10000 Feferonkový salát Pochoutkový salát
1000
100
10
1 COLI
CPM
Plísně
Kvasinky
Skupina Mikroorganismů
Graf. č. 1. Srovnání obchodních řetězců : (a} Brněnka, (b) Interspar. V grafu (a) a (b) jsou porovnány skupiny daných mikroorganismů u dvou testovaných salátu : Feferonkového a Pochoutkového. Z důvodu velkého rozsahu naměřených hodnot je osa y uváděna v logaritmickém měřítku.
50
Ve vyhlášce č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení jsou stanoveny limity pro lahůdkářské výrobky s majonézou i bez majonézy (tato vyhláška byla zrušena a nahrazena č. 2073/2005 a 1441/2007, přesto mohou údaje z vyhl.132 posloužit výrobcům lahůdkových salátů jako kritéria pro hodnocení nezávadnosti výrobků, mají-li tato kriteria zapracována v systému HACCP) K tomuto účelu dnes slouží ČSN:569609, která charakterizuje Mikrobiologická kritéria pro potraviny.
51
6. ZÁVĚR Sortiment lahůdkářských výrobků je velmi rozsáhlý a poměrně dynamicky se obměňuje. Charakteristické je velké množství surovin živočišného a rostlinného původu, syrových, chlazených, zmrazených i sterilovaných. Tomu odpovídají různé mikrobiologické charakteristiky – od sterility po vysokou úroveň kontaminace, případně i obsah kulturní mikroflóry (kysané zelí, jogurty, sýry, fermentované salámy). Vlivem požadavků tržní sítě se sortiment posouvá od výrobků rychlé spotřeby k výrobkům s prodlouženou údržností. V užším smyslu jsou za lahůdky označovány výrobky studené a teplé kuchyně určené k přímé spotřebě, luxusního charakteru, výjimečné chuti a vzhledu, s vysokým vkladem tvůrčí práce kuchařů, podávané zpravidla v malých porcích jako občerstvení (tedy nikoliv hlavní chod) Analyzované byly dva druhy lahůdkových salátů zakoupených při pultovém prodeji, u obou byl analyzován celkový počet mikroorganismů, koliformní bakterie a počty kvasinek a plísní. Výsledné hodnoty celkových počtů mikroorganismů (CPM), počtu plísní a kvasinek (P/k) a koliformních mikroorganismů (koli) se liší navzájem mezi jednotlivými saláty a také v rámci použitého konzervantu. Tato variabilita je dána jednak charakterem jednotlivých druhů použitých surovin, jednak různým stupněm kontaminace použitých surovin, odlišnou účinností dekontaminace povrchů surovin při zpracování, důkladností promíchání surovin salátu a vhodným skladováním výrobků. Z celkového hlediska lze kladněji hodnotit Pochoutkový salát s majonézou, než salát Feferonkový. Rozdíl mohl být způsoben nedostatečnou hygienou při výrobě nebo nedostatečným použitím potravinářským kyselin, címž by nebylo zajištěno optimální kyselé pH, při kterém by se mikroorganismy nemnožily.
52
7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Arpai, J., Bartl, V. Potravinárska mikrobiologia. ALFA, Bratislava, 1997, 280s.
Ambrož, Z. Mikrobiologie. MZLU Brno, 1986, 100s.
Buňková, L., Hanzlíková, M. Obecná mikrobiologie. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně. 2007, 190s.
Cempírková, R., Lukášková, J., Hejlová, Š. Mikrobiologie potravin. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 1997, 165s.
ČSN 569609 Pravidla správné hygienické a výrobní praxe- Mikrobiologická kriteria pro potraviny. Principy stanovení a aplikace.
Dobiáš, L. Vybrané kapitoly z mikrobiologie. Ostravská univerzita. Ostrava, 1999, 297s.
Fratamico, P., M., Bhunia, A., K., Smith, J., L. Foodborne Pathogenes (Microbiology and Molecular Biology). British Library Cataloguing-Publication Data, Great Britain, 2005, 348s.
Görner, F., Valík, L. Aplikovaná mikrobilógia požívatín. MALÉ CENTRUM, Bratislava, 2004, 528s.
Hrubý, S. Mikrobiologie v hygieně výživy, Avicentrum, zdravotnické nakladatelství, n.p., Praha, 1984, 208s.
Hianiková, M., Mikrobiologické hodnocení zeleninových výrobků, MZLU Brno, 2007.
Ingr, I. Základy konzervace potravin. MZLU Brno, 1999, 137s.
Jay, J., M., Loessner, M., J., Golden, D., A. Modern Food Microbiology. Springer Science Business Media, USA, 2005, 790s.
53
Jičínská, E., Havlová, J. Metody detekce patogenních mikroorganismů v potravinách. Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 1996, 115s.
Kadlec, P. a kolektiv. Technologie potravin I. Vysoká škola chemicko - technologická v Praze, 2002, 300s.
Komár, A. Technologie, zbožíznalství a hygiena potravin. IV. část, Technologie, zbožíznalství a hygiena potravin minerálního původu, nápojů a pochutin. Univerzita obrany, Brno, 2005, 142s.
Konečný, S. Mikrobiální nemoci z potravin – souhrn problematiky. Maso, 1/2008, s.66.
Konečný, S. Nemoc z potravin, o které se mluví – listerióza. Maso – Hygiena, 1/2007, s.37-38. Kyzlink, V. Teoretické základy konzervace potravin. SNTL, Praha, 1988, 353s.
Komprda, T. Hygiena potravin. MZLU Brno, 1997, 171s.
Matyáš, Z., Pavlíček, J., Sovjak, R., Kopřiva, V., Pazour, V., Hejlová, Š., Vojtěch, J., Horký, J., Hlaváček, J. Podklady pro zavedení HACCP do oboru zpracování surovin a potravin živočišného původu: ryby, měkkýši, korýši, zvěřina, drůbež, vejce, med, lahůdky. Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, 2002, 141s.
Matyáš, Z., Vítovec, J. Hygiena výroby a distribuce potravin. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 1999, 191s.
Míková, K. Zelenina ve výrobě lahůdek. Maso – Lahůdka, 2/2003, s.1.
Medigan, M., T., Martinho, J., M., Dunlop, P., V., Clark, D.,P. Brock Biology of Microorganisms: International Edition. Pearson Education, Inc., USA, 2009, 1168s.
Marth, E., H., Steele, J., L. Applied Dairy Mikrobiology. 2. vyd. Marcel Dekker, New York, 2001, 744s.
54
Nařízení komise komise (ES) č. 1441/2007 ze dne 5.12. 2007, kterým se mění nařízení (ES) č. 2073/2005 o Mikrobiologických kritériích pro potraviny.
Runštuk, J. aj. Receptury studených pokrmů. R plus Hradec Králové, 2001, 828s.
Rosický, B., Sil, W. Salmonelózy. SCIENTIA MEDICA, spol. s.r.o., Praha, 1994, 208s.
Ronald M. Atlas, Microorganisms in our world. McGraw-Hill College, USA, 1995, 762s.
Šilhánková, L. Hygiena mikrobiálních výrob.Vysoká škola chemicko-technologická, Praha, 1997, 57s.
Šilhánková, L. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, Praha, 2002, 363s.
Šroubková, E. Technická mikrobiologie. MZLU Brno, 1996, 150s.
Tománková, V., Rada, V., Killer, J. Potravinářská mikrobiologie. Česká zemědělská univerzita v Praze, 2006, 168s.
Votava, M., Broukal, Z., Vaněk, J. Lékařská mikrobiologie pro zubní lékaře. Neptun, Brno, 2007, 567s.
Votava, M. Lékařská mikrobiologie II:
přehled vyšetřovacích metod v lékařské
mikrobiologii. Masarykova univerzita, Brno, 2000, 309s.
Vyhláška ministerstva zemědělství Ministerstva zemědělství
č. 196/2002
č. 147/1998
Sb., kterou se mění vyhláška
Sb., o způsobu stanovení kritických bodů
v technologii výroby.
55
Vyhláška ministerstva zdravotnictví č. 107/2001 Sb. o hygienických požadavcích na stravovací služby a o zásadách osobní a provozní hygieny při činnostech epidemiologicky závažných.
Zákon č. 258/2000 Sb. o ochraně veřejného zdraví a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů.
Internetové zdroje (http://www.vscht.cz/ktk/www_324/studium/HP/HP.pdf) (www.mze.cz attachments/Příručka_ 11 – 02_ lahůdky.doc) (http://www.ordinace.cz/clanek/salmoneloza/#sireni) (http://cs.wikipedia.org/wiki/Salmonella) (http://cs.wikipedia.org/wiki/Listeria_monocytogene) (http://cs.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli) http://www.eufic.org/article/cs/food-safety-quality/foodcontaminants/artid/campylobacter-jejuni-bakterie) (http://wikipedia.infostar.cz/s/st/staphylococcus_aureus.html)
56
