MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie
VÝZNAM METABOLITŮ KYSELINY ARACHIDONOVÉ PRO KARCINOGENEZI
Brno 2007
Kristina Nešporová
Poděkování:
Na tomto místě bych ráda poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce prof. RNDr. Janu Šmardovi, CSc. Za pomoc a čas, který mi věnoval při řešení zadané problematiky.
2
OBSAH ÚVOD..............................................................................................................................................4 1. KYSELINA ARACHIDONOVÁ................................................................................................5 2. METABOLITY KYSELINY ARACHIDONOVÉ .....................................................................5 2.1 Prostanoidy ............................................................................................................................5 2.1.1 Prostaglandiny ................................................................................................................6 2.1.2 Prostacyklin ....................................................................................................................7 2.1.3 Tromboxany ...................................................................................................................8 2.2 Leukotrieny............................................................................................................................9 2.3 Lipoxiny a hepoxiliny..........................................................................................................11 2.4 Epoxyeikosatrienové kyseliny.............................................................................................11 3. ENZYMY METABOLIZUJÍCÍ KYSELINU ARACHIDONOVOU.......................................12 3.1 Fosfolipáza A2 .....................................................................................................................12 3.1.1 Klasifikace a vlastnosti fosfolipázy A2.........................................................................12 3.1.2 Fosfolipáza A2 a rakovina ............................................................................................13 3.2 Cyklooxygenáza ..................................................................................................................14 3.2.1 Fyziologická role cyklooxygenázy...............................................................................14 3.2.2 Regulace cyklooxygenázy ............................................................................................15 3.2.3 Cyklooxygenáza a rakovina .........................................................................................16 3.3 Inhibitory cyklooxygenáz ....................................................................................................18 3.3.1 Preklinické a klinické testy inhibitorů COX ................................................................19 3.3.2 Vliv inhibitorů COX na rezistenci k chemoterapii.......................................................20 3.4 5-lipoxygenáza.....................................................................................................................21 3.4.1 5-lipoxygenáza a rakovina............................................................................................22 3.5 Inhibitory 5-lipoxygenázy ...................................................................................................23 3.6 Cytochrom P450 ..................................................................................................................24 3.4.1 Cytochrom P450 a rakovina .........................................................................................24 ZÁVĚR..........................................................................................................................................26 LITERATURA ..............................................................................................................................27
3
ÚVOD Kyselina arachidonová a mnohé její deriváty jsou známy už od 30. let 20. století, přesto se více než 50 let nevědělo nic o jejich vlivu na karcinogenezi. Protože jejich podíl v zánětlivých procesech je podrobně popsán, v poslední době se mnohé laboratoře zaměřují na výzkum těchto látek v souvislosti s rozvojem rakoviny. Eikosanoidy a další metabolity jsou velice pestrou skupinou látek, jejichž chemická struktura je podobná, ale v zánětlivých i karcinogenních procesech působí často protichůdně. Dnešní poznatky potvrzují, že zánět je významným činitelem při vzniku a rozvoji rakoviny. Mnohé typy nádorů vznikají právě v místech infekce, chronického podráždění či zánětu. Typickými příklady jsou kolorektální rakovina způsobená zánětem tlustého střeva či rakovina jater vyvolaná chronickou hepatitidou. Je zřejmé, že určité mikroprostředí vytvářené a řízené buňkami imunitního systému je důležité pro neoplastické procesy, přežití a migraci nádorových buněk. Rakovinně transformované buňky využívají i některé signální molekuly typické pro vrozený imunitní systém, např. selektiny, chemokiny a jejich receptory, aby zvýšily vlastní invazivitu, schopnost migrace a rozvoj metastáz. Cílem této bakalářské práce je shrnout poznatky o derivátech kyseliny arachidonové a jejich úloze při karcinogenezi. V první části jsou tyto látky stručně charakterizovány a to z hlediska jejich fyziologické i patologické funkce v organismu. V druhé části práce jsem se zaměřila na nejvýznamnější enzymy, které metabolizují kyselinu arachidonovou a tak se podílí na vzniku rakoviny. V této části jsou též zmíněny inhibitory enzymů, u kterých se předpokládá protinádorový účinek. Některé enzymy a deriváty jsou do dnešní doby už dostatečně prozkoumány a dá se tedy tvrdit, že mají prokazatelně vliv na rozvoj rakoviny, u ostatních jsou ovšem známy jen dílčí informace a nelze je proto definitivně zařadit mezi látky, které mají na karcinogenezi podíl.
4
1. KYSELINA ARACHIDONOVÁ Kyselina arachidonové (AA; 5,8,11,14-eikosatetraenová kyselina) je ω-6-vícenenasycená mastná kyselina, která se do těla dostává s potravou nebo je syntetizována z esenciální kyseliny linolové. Za normálních podmínek je většina AA vázána ve fosfolipidové membráně a koncentrace volné AA je nízká. Koncentraci volné AA v buňkách však lze dočasně zvýšit vyšším příjmem kyseliny linolové v potravě nebo hydrolýzou fosfolipidové membrány fosfolipázou A2 (PLA2) (Hughes-Fulford et al., 2005). Po uvolnění AA z membrány dochází k její přeměně na biologicky aktivní molekuly lipidické povahy, které jsou souhrnně nazývané eikosanoidy. Může samozřejmě též dojít k jejímu opětovnému začlenění do fosfolipidové vrstvy nebo k difúzi mimo buňku.
2. METABOLITY KYSELINY ARACHIDONOVÉ Existuje velké množství metabolických drah, které přeměňují volnou AA na biologicky aktivní látky. První a nejdůležitější skupinou derivátů jsou „klasické“ eikosanoidy, které vznikají působením enzymů cyklooxygenázy (COX) a 5-lipoxygenázy (5-LO), a patří k nim prostanoidy a leukotrieny. Další metabolity, mezi které patří např. produkty 12-lipoxygenázy (12-LO), produkty metabolické dráhy zahrnující cytochrom P450 a případně i produkty neenzymatické peroxidace volnými radikály (izoprostany a izofurany), už nevznikají pouze z AA, ale výchozí látkou mohou být i jiné dvacetiuhlíkaté mastné kyseliny. Poslední skupiny metabolitů AA jsou tzv. endokanabinoidy.
2.1 Prostanoidy Prostanoidy byly poprvé izolovány ve 3. letech 20. století z lidských spermií a pojmenovány byly podle žlázy, o které se předpokládalo, že je jejich zdrojem - prostaty. Až v 60. letech se zjistilo, že vznikají z nenasycených mastných kyselin, přesněji z AA. Za tento objev byla v roce 1982 udělena Nobelova cena za lékařství B. Samuelssonovi, J. Fandovi a S. Bergstromovi. Prostanoidy patří mezi „klasické“ eikosanoidy a vznikají působením enzymu COX. Do této skupiny patří prostaglandiny, prostacyklin a tromboxany (obr. 1; Romano a Claria, 2003). 5
2.1.1 Prostaglandiny Prostaglandiny (PG) jsou dvacetiuhlíkaté sloučeniny, které obsahují jeden pětiuhlíkatý kruh. PG se v nízké koncentraci vyskytují ve většině tkání a k jejich zvýšené produkci je potřeba vnější podnět. Dnes známe několik forem PG, ale základní a výchozí pro syntézu dalších látek je prostaglandin H2 (PGH2). Ten vzniká oxidací AA izoformami enzymu COX, COX-1 a COX-2 (Nithipatikom et al., 2002). Při vzniku dalších forem PG jsou aktivní tzv. terminální PG syntázy, které jsou tkáňově specifické. PGE2 vzniká činností PGE2 syntázy v mozku, cévních stěnách, epitelu trávicí soustavy, ledvinách a krevních destičkách. PGD2 syntáza přítomná v průduškách, žírných buňkách a leukocytech zase vytváří PGD2 a nakonec PGF2α syntáza je aktivní v tkáni dělohy, žlutém tělísku, mozku a hladkých svalech cév (Sugino et al., 2000; Sales et al., 2005).
Obrázek 1: Syntéza prostanoidů z AA (Romano a Claria, 2003; upraveno)
PG se stejně jako ostatní prostanoidy podílí na rozvoji zánětlivé reakce, bolestivé odpovědi a horečky. Jejich další funkce často závisí na typu tkáně a typu PG. Např. PGD2 je zodpovědný za indukci spánku a nocicepci, inhibuje agregace trombocytů a projevuje se i v alergických reakcích. PGE2 působí jako bronchodilatátor, v trávicím traktu snižuje sekreci kyseliny a zvyšuje sekreci mucinu, endokrinně působí na hypofýzu, slinivku a kůru nadledvin a vyvolává vyplavení hormonů a společně s PGF2α stimuluje děložní svaly (Sugino et al., 2000; Sales et al., 2005; Rask et al., 2006). 6
Zvýšená exprese PGE2 byla pozorována u několika typů nádorů, nejvíce prostudovaná je však rakovina tlustého střeva, vaječníků a prostaty (Attiga et al., 2000; Nithipatikom et al., 2002; Rask et al., 2006). PGE2 je v dnešní době nejprozkoumanějším prostaglandinem a jeho vliv na vznik a rozvoj nádorových onemocnění byl jasně prokázán Koncentrace PGE2 je vysoká v buňkách se zvýšenou produkcí COX-2. Inaktivace PGE2 receptorů má za následek inaktivaci COX-2, zatímco eliminace receptorů jiných prostaglandinů podobné následky nemá. PGE2 podporuje vznik rakoviny, zvyšuje invazivitu a rozvoj metastáz a taky nádorovou angiogenezi (Nithipatikom et al., 2002). Důležitý je i vliv PGE2 na receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR). Ten se v posledních letech považuje za možný terapeutickým cíl při léčbě některých typů rakoviny. Metabolické dráhy PGE2 a EGFR jsou prostřednictvím COX-2 silně provázány a pracují synergisticky. Například PGE2 inhibuje apoptózu prostřednictvím PI3kináza/Akt dráhy, zatímco aktivace EGFR stimuluje stejnou metabolickou dráhu ale pomocí Ras (Rieker et al., 2006). Vyšší koncentrace PGD2, nikoliv ovšem PGE2, byla nalezena u myší, které prodělali kolitidu, onemocnění, které velmi zvyšuje pravděpodobnost vzniku rakoviny tlustého střeva. Vysoká hladina PG se u tohoto zánětlivého onemocnění vyskytuje běžně, ale přetrvávající hladina PGD2 by mohla mít za následek rozvoj rakoviny. V tomto případě se naměřily i vyšší hodnoty β-kateninu, důležitého proteinu zajišťujícího vzájemnou adhezi buněk a který je také zapojen do velkého proteinového komplexu, který zahrnuje i produkty tumor-supresorových genů. Akumulace β-kateninu v tkáni způsobuje poruchu regulace exprese několika genů, což má za následek neoplastickou transformaci. Stejné děje byly pozorovány i u lidské rakoviny tlustého střeva. Po podání specifického inhibitoru COX-2 došlo ke snížení koncentrace β-kateninu, což potvrzuje, že COX-2 nebo PGD2 nějakým způsobem regulují metabolickou dráhu β-kateninu (Zamuner et al., 2005). PGF2α se ve zvýšeném množství nachází v lidském endometriálním adenokarcinomu a předpokládá se jeho účast na vzniku tohoto typu rakoviny. Aktivuje totiž metabolickou dráhu MEK (Mitogen activated protein kinase/ERK Kinase), která zvyšuje transkripční aktivitu promotoru z genu VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) a sekreci proteinu VEGF (Sales et al., 2005). VEGF jako proangiogenní faktor způsobuje neovaskularizaci nádoru a tím jeho proliferaci. K aktivaci VEGF může dojít i jinou cestou – transaktivací EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) a následnou aktivací ERK kinázy (Ye et al., 2005).
2.1.2 Prostacyklin Prostacyklin (PGI2) je hlavní produkt metabolismu AA v cévách. Vzniká z PGH2 působením enzymu prostacyklin syntázy v endoteliálních buňkách cév, v krevních destičkách a 7
makrofázích. Jeho účinky spočívají zejména v indukci vazodilatace v plicním i systémovém oběhu a inhibici agregace a adheze trombocytů cestou stimulace adenylátcyklázy, která vede ke zvýšení cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP) v krevních destičkách. Je pravděpodobné, že prostacyklin působí antiproliferačně a brání remodelaci cév (Pradono et al., 2002; Kajita et al., 2005; Poole et al., 2006). V léčbě plicní arteriální hypertenze a Raynaudova syndromu se už 20 let úspěšně používá syntetický analog PGI2 zvaný epoprostenol. PGI2 vykazuje určité vlastnosti, které by ho mohly řadit mezi látky bránicí vzniku rakoviny. Mezi jeho účinky patří suprese zánětu a buněčné proliferace, podpora vzniku apoptózy, prevence rozvoje metastáz a potlačení růstu už vytvořených metastáz. Na modelu transgenní myši bylo prokázáno, že při zvýšené expresi PGI2 je po vystavení tabákovým karcinogenům nižší incidence vzniku rakoviny plic. V dnešní době se proto zkoumá možnost využití PGI2 při chemoprevenci (Keith et al., 2004).
2.1.3 Tromboxany Tromboxan A2 (TXA2) je syntetizován z PGH2 v aktivovaných krevních destičkách, endotelu, ledvinách a mozku za přítomnosti tromboxan syntázy. Zprostředkovává lokální vasokonstrikci, aktivaci dalších destiček a jejich agregaci, což vede k zástavě krvácení (Pradono et al., 2002). Je tedy antagonistou prostacyklinu. Tromboxan B2 (TXB2) je produktem neenzymatické přeměny TXA2, který je za fyziologických podmínek vysoce nestabilní (Castelli et al., 1989). V dnešní době je TXB2 používán jako biochemický model různých fyziologických dějů a taky jako vhodný prekurzor TXA2. Z pokusů s transfekcí genů pro TXA2 a PGI2 vyplývá, že tyto prostanoidy mají antagonistické účinky i v oblasti karcinogeneze a tedy, že TXA2 působí proangiogenně a proliferačně a tím napomáhá vzniku rakoviny (Pradono et al., 2002). Koncentrace TXA2 se ukázala jako vhodný prognostický ukazatel u pacientů s invazivní rakovinou močového měchýře - se zvyšující se koncentrací TXA2 klesá pravděpodobnost přežití (Moussa et al., 2005). Studie zabývající se tímto typem karcinomu také potvrdily pozitivní vliv TXA2 na migraci a přežívání rakovinných buněk. V případě gliomů je hlavním eikosanoidem podporujícím migraci a proliferaci nádorových buněk a inhibici apoptózy TXB2, který se v tomto typů nádoru nachází ve vyšší koncentraci než ve zdravých astrocytech a fibroblastech (Zhao et al., 1998).
8
2.2 Leukotrieny Leukotrieny (LT) jsou stejně jako prostanoidy významné eikosanoidy s autokrinním a parakrinním účinkem. Na rozdíl od prostanoidů však vznikají přeměnou AA katalyzovanou enzymem 5-LO (obr. 2; Romano a Claria, 2003). Název leukotrieny vznikl spojením slov leukocyty, ve kterých se LT nejčastěji tvoří, a trieny, protože ve své struktuře obsahují tři konjugované dvojné vazby.
Obrázek 2: Syntéza leukotrienů a lipoxinů z AA (Romano a Claria, 2003; upraveno)
Kromě nestabilního leukotrienu A4 (LTA4), který je významný hlavně jako prekurzor dalších LT, známe LTB4 a tzv. cysteinylové LT, do kterých se zařazují LTC4, LTD4, LTE4 (Brocklehurst, 1960). Tyto LT obsahují ve svých molekulách navázanou aminokyselinu cystein, kterou na LTA4 přenáší enzym glutathion transferáza. Cysteinylové LT se uplatňují zejména v alergickém zánětu a jejich zdrojem jsou hlavně žírné buňky a eozinofilní granulocyty . Tyto LT byly dříve označeny jako SRS-A (Slow Reacting Substance of Anafylaxis). LTC4, LTD4 a LTE4 působí vazbou na receptory Cys LT1 a Cys LT2. Cys LT receptory nesou především buňky hladkých svalů a eozinofily a některé další buňky (Heise et al., 2000; Figueroa et al., 2001). Působením leukotrienů dochází proto k bronchokonstrikci (leukotrieny mají velmi významný bronchokonstrikční efekt, více než 1000krát větší než histamin) a dalším 9
účinkům, jako je edém tkáně a zvýšená sekrece hlenu. Vysoká hladina cysteinylových LT může způsobit anafylaktický šok. Leukotrieny hrají významnou úlohu v patogenezi alergického zánětu i svou chemotaktickou aktivitou vůči eozinofilům. LTB4 je naproti tomu produkován především neutrofily, monocyty a makrofágy. Je významným chemoatraktantem neutrofilů a podílí se na vasokonstrikci a bronchokonstrikci. Další studie potvrzují, že také ovlivňuje agregaci leukocytů, stimuluje tok iontů (především Ca2+), podporuje exkreci lysozomálních enzymů a stimuluje tvorbu superoxidových aniontů. V poslední době několik studií prokázalo, že inhibice vzniku nebo působení LT potlačuje proliferaci nádorových buněk v případě rakoviny slinivky, prostaty a močového měchýře. Společné použití inhibitorů COX-2 a 5-LO snižuje výrazněji vznik metastáz u rakoviny jater než použití samotného inhibitoru COX-2 (Gregor et al., 2005). V roce 2007 byly tyto výsledky potvrzeny studií, ve které se použitím inhibitorů 5-LO, specifických antagonistů receptorů LTB4 (BLT1) a také inhibicí exprese BLT1 docílilo zastavení proliferace nádorových buněk rakoviny tlustého střeva a také indukce apoptózy u těchto buněk. Z této studie též vyplývá, že LTB4 MAPK/ERK, řídící růst mnohých buněčných typů (Ihara et al., 2007). Poměrně překvapivé bylo zjištění, že LTD4 je schopen potlačit apoptózu u nádorových buněk tlustého střeva. Mechanismem účinku LTD4 je stimulace exprese anti-apoptického proteinu Bcl-2, který se hromadí v mitochondriální membráně a brání uvolnění cytochromu c, jež spouští proces apoptózy (Wikström et al., 2003). A protože se LTD4 v tkáních vyskytuje především během zánětlivé reakce, tyto poznatky jen potvrzují myšlenku, že zánětlivé onemocnění nebo jiné poškození tkáně mohou vyvolat neoplastickou transformaci buněk. K podobnému závěru došla i Mezhybovska et al. (2006), když zkoumali spojení mezi LTD4 a βkateninem. Zvýšená hladina LTD4 způsobuje vyšší expresi β-kateninu, který pokud se vyskytuje v buňce ve větším množství může cestovat do jádra a tam aktivovat transkripci potenciálních onkogenů jako např. c-myb a genu pro cyklin D1. V tomto pokusu byl zvýšený obsah β-kateninu pozorován i v mitochondriích, společně s proteinem Bcl-2, je tedy možné, že mezi těmito proteiny dochází k interakci, která může dál snižovat pravděpodobnost apoptózy. Bylo také potvrzeno, že LTD4 v nádorových buňkách tlustého střeva spouští aktivaci cPLA2 a translokaci tohoto enzymu do jádra (Parhamifar et al., 2005). Do tohoto procesu jsou zapojeny metabolické dráhy ERK1/2 a p38 MAP kinázy. Zajímavý je i fakt, že přídavek LTD4 k buňkám vyvolává aktivaci transkripce genu cPLA2 a to zvýšením transkripční aktivity promotoru tohoto genu. Tato aktivace je v mnoha buňkách závislá na NF-κB.
10
2.3 Lipoxiny a hepoxiliny Lipoxiny (LX), neboli produkty interakcí lipoxygenáz, byly poprvé popsány v roce 1984 Serhanem et al. (1984). LX vznikají v červených krvinkách z LTA4, který byl do krvinek transportován z buněk myeloidní linie. Červené krvinky mění LTA4 na LXA4 oxygenázovou aktivitou 12-LO, která je v tomto případě nazývána LXA4 syntáza. LX mohou vznikat také působením 15-LO (přítomné v monocytech a epiteliálních buňkách) a následně epoxidhydrolázy v leukocytech. V leukocytech vzniká jak LXA4 tak i LXB4. Na rozdíl od jiných derivátů AA, které jsou obecně prozánětlivé, působí LX jako faktory zastavující prozánětlivý signál a zahajující opravu zánětem poškozené tkáně. LX, především jejich analogy ATL (aspirin-triggered lipoxin), vykazují kromě protizánětlivých vlastností i schopnost negativně regulovat migraci buněk a také zastavují vznik nových cév. Působí tedy antikarcinogenně (Fierro et al., 2002). Hepoxiliny vznikají také oxidací AA 12-lipoxygenázou. Jejím substrátem jsou i další dvacetiuhlíkaté mastné kyseliny. Narozdíl od leukotrienů a lipoxinů neobsahují ve své molekule žádné konjugované dvojné vazby. Do dnešní doby byly identifikovány dva hepoxiliny, hepoxilin A3 a B3. Hepoxiliny vykazují prozánětlivé účinky v kůži, zatímco v neutrofilech působí protizánětlivě. Také otvírají buněčné kanály pro Ca2+ a K+ ionty (Dho et al., 1990; Reynaud et al., 1996).
2.4 Epoxyeikosatrienové kyseliny
Epoxyeikosatrienové kyseliny (EET) jsou signální molekuly syntetizované cytochrom P450 epoxygenázou (P450, CYP) z dvacetiuhlíkatých mastných kyselin, tedy i z AA. Slouží jako autokrinní a parakrinní mediátory a účinkují vasodilatačně a profibrinolyticky. CYP produkuje čtyři regioisomery EET: 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET a 14,15-EET) (Oliw et al., 1982; Karara et al., 1993). K jejich produkci dochází hlavně v srdci, plicích, játrech, ledvinách, tlustém střevě, žaludku, slinivce a hypofýze (Enayetallah et al., 2004). Všechny formy EET jsou spojovány s řadou fyziologických procesů. EET mohou aktivovat Ca2+-závislé K+ kanály a hyperpolarizovat endoteliální buňky a buňky hladkých svalů. Jsou to tedy potenciální od endotelu odvozené hyperpolarizační faktory. To znamená, že regulují nejen cévní tonus, ale jsou vlastně transdukčními molekulami, které ovládají cévní homeostázi. Díky své schopnosti transdukce vnitrobuněčných signálů se EET zapojují i do regulace tyrosin 11
kinázy a fosfatázy, MAP kináz (ERK1/2, p38 MAPK, c-Jun N.terminální kináza), fosfatidylinositol-3 kinázy, protein kinázy B/Akt, ADP ribosylázy G-proteinů, IκB kinázy a adenylcyklázy (Zhang et al., 2006). EET také vykazují protizánětlivé účinky, díky schopnosti inhibovat NF-κB a snižovat expresi cévní buněčné adhezivní molekuly 1 indukovanou cytokiny. EET také stimuluje proliferaci cévních endoteliálních buněk, což je základ pro angiogenezi (Potente et al., 2002; Michaelis et al., 2003).
3. ENZYMY METABOLIZUJÍCÍ KYSELINU ARACHIDONOVOU
3.1 Fosfolipáza A2 Fosfolipázy A2 (PLA2) tvoří vekou rodinu enzymů, které katalyzují hydrolýzu esterové sn-2 vazby fosfolipidů, a tím uvolňují mastné kyseliny a lyzofosfolipidy (Parker et al.,1979). PLA2 je prvním enzymem, který se podílí na vzniku eikosanoidů a to vytvářením volné AA. Reakcí PLA2 vzniká také prekurzor faktoru aktivujícího destičky (PAF), jenž se společně s eikosanoidy podílí na zánětlivých reakcích, ale i na jiných patologických změnách v organismu (Meyer et al., 2004). Inhibice PLA2 by tedy mohla být potenciálně výhodným postupem, jak zastavit všechny hlavní metabolické dráhy syntézy prozánětlivých molekul (Barbour a Dennis, 1993). Cílená inhibice PLA2 se ovšem jeví jako docela problematická, především kvůli velkému počtu různých enzymů typu PLA2. U člověka bylo identifikováno 19 proteinů s aktivitou PLA2.
3.1.1 Klasifikace a vlastnosti fosfolipázy A2 PLA2 jsou systematicky klasifikovány na základě sekvence nukleotidů a aminokyselin. Poslední oficiální aktualizace této klasifikace se odehrála v roce 2000, ale od té doby byly objeveny další skupiny PLA2, takže nyní obsahuje 14 skupin enzymů (Gelb et al., 2000; Ho et al., 2001; Girod et al., 2002; Abe et al., 2006). Původní širší klasifikace PLA2 se řídila enzymatickou aktivitou a enzymy rozdělovala do tří skupin: sekretované (sPLA2), cytosolové závislé na Ca2+ (cPLA2) a cytosolové nezávislé na Ca2+ (iPLA2). Savčí sPLA2 (skupiny IB, IIA,C-F, III, V, X, XII) mají nízkou molekulovou hmotnost (13-19 kDa) a nejsou specifické k AA. cPLA2 (skupina IV) mají vyšší molekulovou hmotnost (>60 kDa) a preferenčně hydrolyzují fosfolipidy obsahující AA. iPLA2 mají nejvyšší hmotnost 12
(85 kDa), ale nejsou selektivní vůči AA (Killermann Lucas et al., 2005). Mnoho PLA2 vyžaduje jako katalytický kofaktor atom Ca2+, ale jeho potřeba se mění i v rámci jednotlivých skupin, případně v koncentraci a ve způsobu jeho použití. Například, skupiny IVA a IVB potřebují Ca2+ k translokaci do membrány a ne pro vlastní aktivitu, zatímco IVC je na Ca2+ zcela nezávislá (Stahelin et al., 2003). V metabolismu AA se nejvíc uplatňují PLA2 skupiny IV, tedy cPLA2. Tyto proteiny jsou kódovány geny na chromozomu 1 (PLA2 IVA), 15 (PLA2 IVB,D-F) a 19 (PLA2 IVC). Z této skupiny se na rozvoji zánětu a s ním spojené produkci eikosanoidů největší měrou podílí PLA2 IVA, také známá jako PLA2α. Tato PLA2 závislá na Ca2+ je přepisována ve většině tkání a preferenčně hydrolyzuje sn-2 vazbu fosfolipidů. Hraje zásadní roli v cytokiny indukovaném uvolňování AA. V buňkách stimulovaných TNF-α dochází k aktivaci PLA2α. MAPK fosforyluje PLA2α a Ca2+ ionty umožní její transport z cytoplasmy do endoplazmatického retikula a jaderné membrány. Tam dochází k hydrolýze fosfolipidů a uvolnění AA, které je dál zpracována dalšími enzymy (Dong et al., 2005). Aktivity cPLA2 je regulována i mnoha dalšími podněty, včetně hormonů, neurotransmiterů, antigenů a mitogenů.
3.1.2 Fosfolipáza A2 a rakovina Poněkud překvapivé bylo zjištění, že v mnoha nádorech je snížená koncentrace cPLA2 a zvýšená koncentrace COX-2 ve srovnání se zdravou tkání. Dřív se předpokládalo, že díky zásadní roli PLA2 v metabolismu eikosanoidů bude koncentrace obou enzymů v rakovinné tkáni zvýšená. Přímá korelace mezi hladinami PLA2 a COX-2 však nebyla zjištěna. Existují však důkazy, že významnou roli v regulaci apoptózy hraje buněčná rovnováha AA. Například, snížení koncentrace AA, ať už zablokováním cPLA2 nebo zvýšenou utilizací AA enzymy COX, vede k vyčerpání jejích buněčných zásob a tím k utlumení proapoptických signálů a tumorigenezi (Dong et al., 2005). Dong et al. (2003) zjistil, že působením inhibitoru cPLA2 na myší střevní buňky dochází k poklesu apoptózy indukované TNF-α. A Dong et al. (2005) také jako první prokázal, že cPLA2 je důležitým mediátorem v TNF-α indukované apoptóze v lidských buňkách rakoviny tlustého střeva. Tyto výsledky ovšem nejsou definitivní, protože jiné studie poukazují na opačný efekt cPLA2. Na myším modelu rakoviny plic došlo po vyřazení funkce genů pro cPLA2 k potlačení vzniku nádorů. Incidence rakoviny poklesla o 43 %. Je pravděpodobné, že na tomto účinku se podílela jak atenuace syntézy PG, tak i nemožnost vzniku PAF. PAF totiž funguje jako parakrinní regulátor VEGF, který podporuje angiogenezi a tím i proliferaci a růst nádorů (Meyer et al., 2004). 13
Díky rozmanitosti izoenzymů PLA2 je velice obtížné syntetizovat účinné inhibitory. V dnešní době je známo jen pár sloučenin s možným inhibičním účinkem, jednou z nich je quinacrine, antimalarikum a antibiotikum, který se pravděpodobně nespecificky váže na katalytické místo PLA2 (Nuttle et al., 1999). Podobné účinky mají i bromfenacyl bromid a 7,7dimethyleikosadienová kyselina (DEDA) (Wright a Malik, 1996; Tariq et al., 2006). Ale kvůli nedostatečným znalostem o mechanismu inhibice se ve výzkumu protirakovinných účinků inhibice PLA2 prozatím nejčastěji využívají myší modely s inaktivovanými geny PLA2.
3.2 Cyklooxygenáza COX, nebo také prostaglandin endoperoxidáza syntáza, je integrální membránový bifunkční enzym, který metabolizuje AA na biologicky aktivní produkty, eikosanoidy. Prvotní cyklooxygenázová aktivita přeměňuje volnou AA na hydroperoxyendoperoxid (PGG2) a následná peroxidázová aktivita přeměňuje PGG2 na hydroxylperoxid PGH2. PGH2 je výchozí látkou pro syntézu prostanoidů. COX zahrnuje tři isoformy, COX-1, COX-2 a COX-3. COX byla poprvé získána v čisté podobě v roce 1976 a poprvé byla klonována v roce 1988. V roce 1991 se několika laboratořím podařilo identifikovat produkt jiného genu s cyklooxygenázovou aktivitou, který byl označen COX-2 (Hla a Neilson, 1992). COX-3 byla objevena teprve v roce 2002 (Chandrasekharan et al., 2002). Jedná se však pouze o posttranslačně modifikovanou formu COX-1. COX-2 je kódována genem o velikosti 8,3 kb lokalizovaném na chromozómu 1, který obsahuje 10 exonů (Hla a Neilson, 1992). COX-1 vzniká expresí mnohem většího genu (22 kb) na chromozomu 9, který má 11 exonů (Funk et al., 1991). Bílkovinné řetězce o stejné molekulové hmotnosti 72 kDa vykazují vysokou homologii v sekvenci aminokyselin. Obě izoformy COX mají podobnou i terciální strukturu. Tvoří úzký a dlouhý hydrofobní kanál, do kterého vstupuje AA uvolněná z membrány.
3.2.1 Fyziologická role cyklooxygenázy Zásadní rozdíl mezi oběma hlavními izoformami COX spočívá v rozdílné funkci a lokalizaci v organismu. Zatímco COX-1 je jako konstitutivní forma přítomna v mnoha buněčných typech v konstantním množství, aktivita inducibilní COX-2 je za fyziologických podmínek téměř nezjistitelná a její syntéza je omezena na místo zánětu. V normálních podmínkách je COX-2 přepisována pouze v malém množství v CNS, ledvinách, semenných 14
váčcích a megakaryocytech a nově vytvořených krevních destičkách (Rocca et al., 2002). Intracelulární lokalizace obou izoforem je však stejná, nachází se na vnitřní straně endoplazmatického retikula a na jaderné membráně (Spencer et al., 1998). COX-1 je zodpovědná za syntézu cytoprotektivních prostaglandinů ve sliznici trávicího traktu, především sliznici žaludku, hraje významnou roli v hemodynamické regulaci ledvin a syntéze TXA2 v krevních destičkách (Yu et al., 2005; Kawada et al., 2005). Podstatou ochranné funkce v žaludeční sliznici jsou vazodilatační účinky vznikajících prostaglandinů (např. PGI2) podporující slizniční cirkulaci. Vazodilatační účinky se uplatňují rovněž při udržení dostatečného renálního průtoku v případě některých patologických stavů (srdeční selhání, jaterní cirhóza, renální insuficience). V trombocytech je COX-1 klíčovým enzymem při syntéze proagregačního TXA2. V neposlední řadě hraje COX-1, ale v tomto případě i COX-2, významnou úlohu během indukce děložních kontrakcí při porodu (Sawdy et al., 1998). Izoenzymy COX jsou přítomny v mnoha strukturách CNS. COX-1 je zastoupena v předním mozku, zatímco COX-2 je exprimována hlavně v kůře, hippokampu, hypothalamu a míše. V předním hypothalamu dochází působením PGE2 k nastavení termoregulačního centra. Tento PGE2 je produkován především buňkami endotelu cév zásobujících hypothalamus (Guay et al., 2004). V průběhu dráhy bolesti je COX-2 přítomna na míšní úrovni, kde se podílí na modulaci nocicepčního impulsu a její cestou syntetizované prostaglandiny působí hyperalgesii. Pro výzkumné účely byly vytvořeny myší modely s knokautovaným genem COX-2. U myší bez funkční kopie COX-2 se vyvinula srdeční fibróza, nefropatie a perotonitida (Norwood et al., 2000). Myši hynuli do tří týdnů po narození a hlavní příčinou byla právě perotinitida a porucha funkce ledvin. Samci COX-2-/- byly fertilní, zatímco samičky nikoliv.
3.2.2 Regulace cyklooxygenázy COX-2 je produkována především v místě zánětu imunitními buňkami a buňkami cévního endotelu. Produkci COX-2 zvyšují mnohé mitogenní a prozánětlivé stimuly včetně bakteriálního lipopolysacharidu, žlučových kyselin, prozánětlivých cytokinů (IL-1, IL-2), TNFα, růstových faktorů (VEGF, EGF, PDGF) a záření UVB. Naopak protizánětlivé cytokiny (IL-4, IL-10, IL-13) a kortikosteroidy produkci COX-2 snižují (Zhang et al., 1999). Přestože mechanismus pozitivní regulace COX-2 není zcela objasněn, několik studií prokázalo, že by ji mohla vyvolávat aktivace metabolické dráhy Ras a MAPK (mitogen-activated protein kinase) (Chen et al., 2000). Bylo potvrzeno, že aktivita Akt/PKB (Protein Kináza B) ovlivňuje expresi COX-2 vyvolanou K-Ras a že stabilizace mRNA COX-2 částečně závisí na aktivaci Akt/PKB. Tyto dráhy aktivují regulační faktory, jež se váží na promotor genu COX-2. 15
Tato oblast obsahuje několik transkripčních a responzivních elementů, včetně NF-κB a AP-1 míst. Regulace přepisu COX-2 je také zajištěna přítomností mnohočetných opakujících se sekvencí v mRNA COX-2, které jsou zodpovědné za její časnou degradaci. Promotor genu COX-2 může být aktivován proteinem c-Myb. COX-2 i c-myb jsou exprimovány ve většině buněčných linií odvozených z kolorektálních nádorů. Na promotoru COX-2 bylo objeveno 13 potenciálních vazebných míst pro c-Myb. Naopak žádná podobná vazebná místa nebyla objevena na genu COX-1. Osm z těchto míst vykazují vysokou afinitu k cMyb. c-Myb je také důležitým regulačním faktorem aktivity Bcl-2 a ovlivňuje tedy i rozvoj apoptózy v nádorových buňkách (Ramsay et al., 2000). S COX-2 interaguje také oxid dusnatý (NO) (Rao et al., 2002). NO aktivuje COX oxidací hemu nebo nepřímo přes produkci peroxynitrilu a hydroxylového radikálu, což vede ke zvýšené peroxidaci lipidů. Zvýšená produkce peroxidového aniontu syntázou NO by mohla být zodpovědná za aktivaci COX. U nádorů tlustého střeva je zvýšená exprese indukovatelné syntázy NO a prostanoidů spojena s nadměrnou expresí COX-2, a to jak v nádorových buňkách, tak i ve stromatu. Tato zjištění ukazují na těsnou spojitost mezi těmito dvěma faktory.
3.2.3 Cyklooxygenáza a rakovina Přestože mnohé detaily zůstávají neobjasněny, dle dosavadních poznatků je zřejmé, že obě izoformy COX se významně podílejí na vzniku a rozvoji a nádorových onemocnění.
Aktivace karcinogenů. Peroxidázová aktivita COX přeměňuje prokarcinogeny na karcinogeny a tak podporuje vznik neoplastických lézí (Wiese et al., 2001). V játrech, kde se metabolizuje velké množství xenobiotik, nedochází ke vzniku velkého množství mutagenů, protože tyto oxidativní reakce jsou nejčastěji katalyzovány cytochromem P450. Naopak v tlustém střevě, kde je nízká koncentrace P450 a ostatních monooxygenáz, dochází k oxidaci různých substrátů a peroxidázovou aktivitou COX vzniká nezanedbatelné množství mutagenů. Ke vzniku většího množství mutagenů dochází i v jiných tkáních, především těch, které jsou také vystaveny karcinogenním látkám. Typickým příkladem jsou látky obsažené v cigaretovém kouři, které poškozují plíce, ústní dutinu a močový měchýř. Podobně nebezpečné jsou estrogeny, které po oxidaci na diethylstilbestrol, vykazují transformující genotoxické účinky. Navíc i samotný metabolismus AA produkuje mutageny. PGH2 izomerizuje na malondialdehyd, který indukuje posuny a substituce párů bází (Plastaras et al., 2000).
16
Vliv COX na časná stádia karcinogeneze. Role COX-2 v propagaci tumorů byla asi nejvíce studována u nádorů kolorekta. Oshima et al. (1996) poprvé popsali redukci počtu a velikosti střevních polypů u myší, které disponovaly jedinou funkční kopií genu COX-2. Velké polypy se u těchto myší téměř nevyskytovaly. U homozygotních myší byl tento efekt ještě výraznější. COX-2 v této fázi nádoru působí prostřednictvím svého produktu PGE2. Tento prostaglandin aktivací EGFR spouští expresi VEGF (Seno et al., 2002). Zásadní je i vzájemná regulace COX-2 a EGFR (Zhang et al. 2005). PGE2 aktivuje EGFR tím, že uvolňuje ligand EGFR z plasmatické membrány nebo indukuje transaktivaci EGFR stimulací dráhy Src. Transaktivace EGFR stimuluje AP1-místo na promotoru genu COX-2 a tím zvyšuje koncentraci PGE2. V buňkách lidské rakoviny prsu byla potvrzena silná korelace mezi expresí COX-2 a aromatázou cytochromu P450 (CYP 19) (Díaz-Cruz et al., 2005). V tomto případě by mohl COX-2 podporovat rozvoj rakoviny buď přímou stimulací proliferace nádorových buněk nebo nepřímo indukcí aromatázy.
Potlačení apoptózy. Při růstu nádoru dochází k posunu rovnováhy mezi proliferací a apoptózou. Hlavně u premaligních a maligních lézí je apoptóza silně potlačena. Pokles frekvence apoptózy je často doprovázen zvýšenou koncentrací COX-2. COX-2 zvyšuje množství antiapoptického faktoru Bcl-2 a také způsobuje rezistenci vůči apoptóze vyvolané butyrátem (Saha et al., 1999).
Angiogeneze. Růst solidních nádorů a vznik metastáz je závislý na vzniku nových krevních cév. Nádorové buňky produkují velké množství různých faktorů, které podporují růst cév. Nejznámějšími faktory jsou VEGF, bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) a PDGF (Platelet Derived Growth Factor). Průběh angiogeneze však ovlivňuje hlavně COX-2: (1) vysoká koncentrace COX-2 zvyšuje tvorbu cévních růstových faktorů a to hlavně díky migraci endoteliálních buněk přes kolagenovou matrix a zakládání nových cévních sítí, (2) hustota kapilární sítě prokazatelně závisí na koncentraci PGE2 v tkáni (Uefuji et al., 2000). Rozvoj metastáz. Aby mohly nádorové buňky vycestovat z místa primárního nádoru a vytvářet metastázy, musí dojít k narušení matrix a zvýšení buněčné motility. Matrix metalloproteinázy (MMP) představují rodinu enzymů degradujících matrix. Jejich syntéza je spojená s invazivitou nádorových buněk, narušením cévní stěny a rozvojem metastáz. Rovněž do těchto procesů zasahuje COX-2: COX-2 indukuje expresi MMP v lidských buňkách rakoviny tlustého střeva 17
(Tsujii et al., 1997), naopak inhibice COX-2 v karcinomu dlaždicových buněk vede ke snížení sekrece MMP (Kinugasa et al., 2004). COX také ovlivňuje míru adheze rakovinných buněk. Zvyšuje například jejich adherenci k extracelulární matrix a to tak, že snižuje expresi E-kadherinu, který v normálním případě zajišťuje vzájemnou adhezi buněk (Kakiuchi et al., 2002).
Vliv na imunitu. Růst nádorů je spojen s potlačením imunitního systému. Aktivované makrofágy produkují PGE2, který zastavuje syntézu regulačních cytokinů, proliferaci T a B lymfocytů a snižuje cytotoxickou aktivitu NK buněk. Na myším modelu rakoviny plic došlo po podávání inhibitorů COX-2 k infiltraci lymfocytů do nádoru a k pozastavení jeho růstu, také došlo
k znovunastolení
rovnováhy
mezi
produkovanými
interleukiny,
které
spustily
protinádorovou reakci imunitního systému (Stolina et al., 2000).
3.3 Inhibitory cyklooxygenáz Výše uvedené poznatky ukazují, že COX-2 podporuje procesy spojené s tvorbou nádorů. Proto je pochopitelné, že se vynakládá velké úsilí po nalezení inhibitorů COX-2. Existují dvě třídy nesteroidních protizánětlivých léčiv (NSAID, Non-Steroidal AntiInflammatory Drugs): klasické neselektivní NSAID (aspirin, ibuprofen, sulindac a mnoho dalších) a selektivní inhibitory COX-2 (např. colecoxib, rofecoxib). Všechny klasické NSAID jsou schopny inhibovat COX-1 i COX-2, ale vyššího stupně inhibice dosahují proti COX-1 a tím se liší od skupiny selektivních inhibitorů COX-2. Tento rozdíl spočívá v rozdílně struktuře obou izoforem COX. Bílkovinné řetězce o stejné molekulové hmotnosti 72 kDa vykazují 63% homologii v sekvenci aminokyselin. Vazebným místem pro klasické NSAID je u obou forem arginin v pozici 120, na který se léčivo váže prostřednictvím vodíkové vazby. Selektivní inhibice COX-2 je dána záměnou jedné aminokyseliny (v molekule COX-2 je na pozici 523 valin místo izoleucinu) (García-Nieto et al., 1999). Menší valinový zbytek otevírá přístup do postranní kapsy, která je považována za vazebné místo pro selektivní inhibitory COX-2. V molekule COX-1 je toto místo blokováno větším zbytkem izoleucinu. Obě izoformy se liší i kinetikou inhibice. Zatímco inhibice COX-1 je na základě tvorby vodíkové vazby kompetitivně reverzibilní a nastává okamžitě, v případě COX-2 se jedná o kovalentní ireverzibilní vazbu a inhibice dostavuje během 15 až 30 minut. Výjimkou
18
v klasických NSAID je kyselina acetylsalicylová, která acetylací cyklooxygenázového místa blokuje aktivitu COX nevratně. Při dlouhodobém užívání neselektivních NSAID se u některých pacientů projevují jejich vedlejší příznaky, žaludeční vředy a jiné zažívací obtíže, které jsou pravděpodobně způsobené inhibicí COX-1, protože při užívání selektivních inhibitorů COX-2 se tyto problémy nevyskytují.
3.3.1 Preklinické a klinické testy inhibitorů COX Do dnešní doby byla provedena řada výzkumů, které měli potvrdit vhodnost využití NSAID při prevenci vzniku rakoviny. Pozitivním výsledky byly zaznamenány v případě rakoviny žaludku, prsu, jícnu, prostaty a močového měchýře. Většina těchto studií byla prováděna s použitím nespecifických NSAID, ale podle posledních studií se selektivními inhibitory COX-2 se zdá, že i s jejich použitím se docílí podobných výsledků (a bez vedlejších účinků klasických NSAID). V roce 1994 proběhla klinická studie, ve které bylo skupině onkologických pacientů s výhledem na přežití více jak 6 měsíců podáváno buď placebo, prednisol (steroidní protizánětlivé léčivo) nebo indometacin (neselektivní NSAID) až do jejich úmrtí (Lundholm et al., 1994). Podle očekávání se stav pacientů, kterým bylo podáváno placebo, horšil, zatímco pacienti dostávající prednisol a indometacin si udržovali svůj výchozí stav. Pacienti s indometacinem také lépe snášeli bolest a společně s pacienty dostávajícími prednisol se u nich prodloužila doba přežití. Preklinické testy využívající NSAID společně s běžně používanými chemoterapeutiky (cisplatina, cyklofosfamid, doxorubicin) při léčbě rakoviny ukázaly, že obě látky působí synergisticky a snižují rychlost růstu nádoru a také omezují vznik metastáz (Soriano et al., 1999; Awara et al., 2004). Většina těchto testů se prováděla na modelech různých typů rakoviny plic. Podobné výsledky poskytly i studie, které zkoumaly společný vliv radioterapie a NSAID. I v nich se na modelech karcinomu plic a také na myších modelech prokázalo, že NSAID zvyšují účinek radioterapie, aniž by přispívaly k poškození okolní zdravé tkáně radiofarmaky (Kishi et al., 2000; Ishikawa et al., 2006). V preklinických studiích se testoval i vliv společně podávaných inhibitorů EGFR a specifických inhibitorů COX-2. Pozitivních výsledků bylo dosaženo na modelech rakoviny SCCHN (Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck). U myší se po kůře obsahující oba inhibitory výrazně zpomalil rozvoj rakoviny (Zhang et al., 2005). Díky těmto nadějným signálům z preklinických testů došlo v posledních pěti letech k řadě klinických výzkumů, ve kterých se k léčbě různých typů rakoviny použily vedle standardních postupů (radioterapie, chemoterapie, hormonální léčba) také selektivní inhibitory 19
COX-2. U mnoha pacientů došlo k výraznému zlepšení. Nejlepší výsledky byly pozorovány v případě rakoviny prsu a prostaty citlivými na hormonální léčbu (Goss a Strasser-Weippl, 2004).
3.3.2 Vliv inhibitorů COX na rezistenci k chemoterapii Rodina proapoptických a antiapoptických proteinů Bcl-2 spouští nebo naopak zastavuje apoptózu na úrovni mitochondrií. Proteiny Bcl-2 způsobují klinicky významnou rezistenci k chemoterapii v řadě hematologických onemocnění a také při léčbě solidních nádorů – akutní a chronické myeloidní leukémie, akutní a chronické lymfoblastické leukémie, rakoviny prostaty a prsu, zhoubných nádorů mozku a při neuroblastomech (Campos et al., 1993). Snížení aktivity Bcl-2 zvyšuje toxicitu různých chemoterapeutik u mnoha nádorových buněčných linií. Selektivní inhibitory COX-2 jsou schopny inhibicí Bcl-2 navodit apoptózu v transformovaných buňkách tlustého střeva a prostaty (Liu et al., 1998). Na druhou stranu, posílení funkce proapoptického proteinu Bax a současné snížení aktivity Bcl-XL také spouští proces apoptózy. Celecoxib, aspirin a indometacin apoptózu navozují stimulací proteinů Bak a Bax, které snižují membránový potenciál na mitochondriální membráně a tak aktivují kaspázu-3 (Zhang et al., 2000; Zhou et al., 2001). Antiapoptické proteiny z rodiny Bcl-2 mohou být ovlivněny i nepřímo – inhibicí signální dráhy Akt. Akt/PKB je serin/threonin protein kináza, která slouží jako regulátor buněčného přežití a proliferace. V posledních letech bylo prokázáno, že dráha Akt/PKB je často v nádorových buňkách modifikována. Nejčastěji v těchto buňkách dochází ke zvýšené expresi růstových faktorů a nitrobuněčných signálních molekul, např. Ras. Dráhu Akt je také možno ovlivňovat pomocí různých regulačních proteinů. Fosforylace Akt je spojena s fosforylací a tedy inaktivací proapoptických proteinů Bad a kaspázy-9 (Hsu et al., 2000; Wu et al., 2004). Fosforylovaný Bad se nemůže vázat na Bcl-2 a fosforylovaná kaspáza-9 nemůže být aktivována a snižuje se tedy aktivity mitochondriální apoptózy. Celecoxib, selektivní inhibitor COX-2, brání fosforylaci Akt a umožňuje tedy průběh apoptózy v lidských nádorových buňkách. V některých případech pomáhají NSAID překonat rezistenci inhibicí exprese IAP (Inhibitors of Apoptosis). Mezi IAP patří např. survivin, c-IAP1, c-IAP2, XIAP, NIAP, livin, ILP-2 a Bruce. Tyti látky obecně regulují aktivitu kaspáz, ať už iniciátorových (kaspáza-9) nebo efektorových (kaspáza-3 a -7). IAP také způsobují rezistenci k běžně používaným chemoterapeutikům v případě rakoviny vaječníků, myeloidní leukémie a nemalobuněčném plicním karcinomu. V těchto tkáních se při zvýšeném přepisu COX-2 molekuly IAP stabilizují a
20
zvyšují tak rezistenci k apoptóze (Krysan et al., 2003). Po vystavení těchto buněk působení inhibitorů COX dochází ke snížení koncentrace IAP a k indukci apoptózy. Dalším významným faktorem v rezistenci nádorů k léčbě je NF-κB. NF-κB je člen rodiny transkripčních faktorů Rel, jež se vyskytují v cytoplazmě v podobě heterodimerů či homodimerů. NF-κB aktivuje transkripci různých genů, může tedy působit proapopticky i antiapopticky. Podmínkou jeho transaktivačnáí funkce je transport z cytoplazmy do jádra. K tomu však dojde až po degradaci inhibitorových molekul IκBα či IκBβ enzymem IκB kinázou. Tato aktivace NF-κB je ve vyšší míře sledována u buněk maligních nádorů. NF-κB pak často spouští expresi nejrůznějších antiapoptických molekul, např. z rodiny Bcl-2 či IAP. Aspirin a sulindac inhibují IκB kinázu a tím i možnost transportu NF-κB do jádra (Yamamoto et al., 1999). Celecoxib zase přímo inhibuje činnost NF-κB, případně jeho aktivaci nejrůznějšími látkami (TNF, lipopolysacharidy aj.) (Shishodia et al., 2004). Objevily se ovšem i případy, kdy inhibitory COX-2 snižovaly účinnost chemoterapie. Například nimesulid inhibuje cytotoxický efekt cisplatiny v buněčných liniích SCCHN. V roce Ratnasinghe et al. (2001) zmínili možnost korelace mezi COX-2 a rezistencí k léčbě chemoterapeutiky, když imunohistochemická analýza tkáně nádoru prsu vykázala souvislost mezi expresí COX-2 a expresí MDR1/Pgp (P-glykoproteiny typu mdr1). MDR1/Pgp je spojován právě s primární rezistencí k chemoterapii. Podobná zjištění přinesl i výzkum rakoviny děložního čípku a vaječníků.
3.4 5-lipoxygenáza Činnost 5-lipoxygenázy (5-LO) byla poprvé popsána Borgeatem et al. (1976). Je to protein s hmotností 78 kDa, který se podílí na syntéze leukotrienů z AA (Dixon et al., 1988).Gen 5-LO je dlouhý asi 82 kb a skládá se z 14 exonů a 13 intronů. U lidí se nachází na chromozomu 10. Promotor obsahuje několik oblastí pro vazbu transkripčních faktorů, např. NF-κB, GATA, Myb a AP1-místo (Hoshiko et al., 1990). Lidská 5-LO se přepisuje především v buňkách myeloidní linie, ale také v B-lymfocytech a endoteliálních buňkách plicní artérie. Mechanismus, který řídí stupeň exprese genu pro 5-LO, zůstává zatím neznámý. Je pravděpodobné, že transkripci genu 5-LO spouští jeho demetylace (Uhl et al., 2002). 5-LO je, stejně jako ostatní lipoxygenázy, dioxygenáza. Odstraňuje atom vodíku ze sedmého uhlíku v molekule AA a zároveň na pátý uhlík váže molekulární kyslík. Vzniká tak
21
5(S)-HPETE, neboli 5(S)-hydroperoxy-6E,8Z,11Z,14Z-eikosatetraenová kyselina. Ta může být dál redukována na 5-HETE. Ovšem 5(S)-HPETE může být také odtržením dalšího vodíku přeměněna na nestabilní epoxid, leukotrien A4 (LTA4). LTA4 je výchozí látkou pro další biologicky aktivní sloučeniny: může být převeden LTA4-hydrolázou na LTB4 nebo jej lze metabolizovat na LTC4 LTC4syntázou. Z LTC4 lze dál syntetizovat LTD4 a LTE4, které společně s LTC4 patří do skupiny tzv. cysteinylových leukotrienů. Kromě toho může být LTA4 přeměněn na lipoxiny A4 a B4 prostřednictvím 12- nebo 15-LO. Pro plnou aktivitu vyžaduje 5-LO některé kofaktory, jako například vápník, ATP a FLAP (5-LO-Activating Protein). FLAP je protein o velikosti 18 kDa, který zajišťuje správné navázání AA na 5-LO (Reid et al., 1990).
3.4.1 5-lipoxygenáza a rakovina Kromě buněk, ve kterých je 5-LO přepisována za normálních podmínek, se zvýšená hladina tohoto enzymu objevila v buňkách rakoviny tlustého střeva, plic, prsu, prostaty, slinivky, kostí, mozku a mezotelu. Především u rakoviny slinivky a mezotelu bylo jasně prokázáno, že v odpovídající zdravé tkáni je koncentrace 5-LO prakticky nedetekovatelná, zatímco v nádorových buňkách je koncentrace i aktivita výrazně větší (Romano et al., 2001; Hennig et al., 2002). Z toho vyplývá, že exprese 5-LO se může dočasně zvýšit během neoplastické transformace, pravděpodobné je také zvýšení exprese receptorů 5-LO. V případě kolorektální rakoviny dochází k vysoké expresi cysteinylových leukotrienů a navíc jejich koncentrace negativně koreluje s přežitím pacientů. Myši s inaktivovaným genem pro 5-LO nevykazují žádné podstatné fyziologické změny, jsou odolnější vůči zánětlivému poškození a naopak citlivější k bakterémii (Cuzzocrea et al., 2003). LTA4 a 5(S)-HETE, ne však LTB4, pozitivně regulují transkripci VEGF v modelových buňkách lidské rakoviny mezotelu (Romano et al., 2001). VEGF působí na mezoteliání buňky jako autokrinní růstový faktor. Působí také jako proangiogenní faktor a je tedy možné, že 5-LO podporuje růst a rozvoj tumoru dvojím způsobem – přímým stimulem proliferace nádorových buněk a zároveň proangiogenní odpovědí pacientových stromálních buněk. Nádorové mezoteliální buňky, které ve vysoké míře exprimují 5-LO, mají výrazně nižší schopnost vytvářet nukleozóm a defragmentovat svou DNA. Apoptóza se tedy u těchto buněk vyskytuje v nižší míře než ve zdravých mezoteliálních buňkách. Použitím specifických či nespecifických inhibitorů 5-LO nebo inhibicí 5-LO na genové úrovni lze normální míru apoptózy znovu navodit. 22
V buněčných liniích lidské rakoviny prsu se také prokázalo, že 5-LO způsobuje zrychlení růstu těchto buněk, snížení apoptózy, aktivaci Bcl-2 a inhibici Bax (Avis et al., 2001). Při použití inhibitorů 5-LO nebo FLAP došlo v u těchto buněk k zastavení buněčného cyklu ve fázi G1. Inhibitory COX-2 v tomto případě obdobný účinek neměly.
3.5 Inhibitory 5-lipoxygenázy Při výzkumu možností inhibice 5-LO byly vyzkoušeny inhibitory zaměřené na různé cíle v metabolismu leukotrienů – PLA2, 5-LO, FLAP, LTA4 hydroláza a LTC4 syntáza. Ovšem 5-LO se ukázal jako nejvhodnější, protože jeho blokováním lze zastavit syntézu LTB4, Cys-LT i 5HPETE. Podle některých studií se dokonce inhibitory 5-LO, popřípadě i FLAP, jeví jako účinnější chemopreventivní látky než inhibitory COX (Rioux a Castonguay, 1998). Podle mechanismu působení specifických inhibitorů 5-LO rozlišujeme čtyři typy: inhibitory 5-LO s redoxní aktivitou, inhibitory vážící se na atom železa v molekule 5-LO, neredoxní inhibitory 5-LO a poslední skupinou jsou inhibitory, u kterých není mechanismus účinku ještě dostatečně znám. Redoxní inhibitory zahrnují lipofilní redukující látky, např. kyselinu kávovou, flavonoidy, kumariny a fenidon (Shimpo et al., 2000). Tyto inhibitory redukují atom železa v aktivním místě 5-LO, čímž poruší katalytický cyklus enzymu. Jsou vysoce účinné, ale málo specifické a napadají i jiné biologické redoxní systémy. Inhibitory typu ligandů atomu železa v molekule 5-LO jsou zastoupeny hydroxamovými kyselinami a deriváty N-hydroxymočoviny, jež chelatují atom železa v aktivním místě, zároveň ovšem vykazují slabé redukční vlastnosti (Chamulitrat et al., 1992). Z této skupiny vzešel zatím jediný komerčně vyráběný lék založený na selektivní inhibici 5-LO – zileuton. Neredoxní inhibitory pracují na principu kompetice s AA o vazbu na 5-LO (Fischer et al., 2003). Do této skupiny patří řada strukturně odlišných molekul, které se jeví jako účinné a vysoce selektivní inhibitory 5-LO. Nejčastěji to jsou látky odvozené od methoxyalkylthiazolů a methoxytetrahydropyranů. Z přírodních látek sem patří kyselina boswellová a její deriváty (Safayhi et al., 1992). V poslední době se pracuje i na vývoji léků, které by obsahovaly hybridní farmakofory, ovlivňující více metabolických drah současně. Asi největší uplatnění by měly inhibitory COX-2 a 5-LO (Ishii et al., 1994), protože při společném působení vykazují oba inhibitory lepší výsledky v boji proti zánětlivým onemocněním a transformaci buněk.
23
3.6 Cytochrom P450
Cytochrom P450 (CYP, P450) je rodina rozmanitých hemoproteinů nacházejících se ve všech hlavních skupinách organismů. CYP se podílí na metabolismu mnoha endogenních i exogenních látek, především svou monooxygenázovou aktivitou (Karara et al., 1993). Nejčastěji tvoří součást mnohočlenného sytému přenašečů elektronů. K říjnu 2006 bylo známo a oficiálně pojmenováno přes 6400 různých sekvencí CYP. Mnoho CYP je schopno metabolizovat AA na biologicky aktivní látky a jsou vedle COX a LO často popisovány jako hlavní enzymy metabolismu AA. V lidských endoteliálních buňkách jsou nejvíc exprimovány CYP podtříd 2B, 2C a 2J, které přeměňují AA do všech čtyř regioizomerů EET (Enayetallah et al., 2004). Zatímco exprese CYP 2J je konstitutivní, CYP 2C se začíná ve větší míře přepisovat až po přijetí nějakého podnětu, jímž jsou například antagonisté Ca2+ iontů. Podrobnější informace o regulaci CYP 2C nejsou známy, byly pouze zjištěno, že po izolaci buněk dochází k rapidnímu poklesu hladiny mRNA i proteinu CYP 2C a kultivace buněk je pro účely zkoumání aktivity CYP 2C velmi problematická (Michaelis et al., 2005).
3.4.1 Cytochrom P450 a rakovina V endoteliálních buňkách, které po infekci speciálně upraveným adenovirem, přepisovaly ve větší míře CYP 2C9 se o 50 % zvýšila proliferace ve srovnání s kontrolními buňkami, které CYP neexprimovaly (Potente et al., 2002). Aby se tyto výsledky potvrdily, použili výzkumníci sulfafenazol, specifický inhibitor CYP 2C9, který u upravených buněk snížil míru proliferace, zatímco u kontrolních buněk neměl žádné účinky. Tento vzrůst proliferace je spojen s aktivací transmembránového receptoru EGFR (Michaelis et al., 2003). K aktivaci dochází díky vyšší expresi EGF/HB-EGF v endoteliálních buňkách a to jak v virově transformovaných buňkách tak i v buňkách, ke kterým byla přidána 11,12-EET. V těchto buňkách došlo také k fosforylaci Akt. Akt/protein kináza B je cílovou molekulou EGFR. Pro proliferaci jsou významné i další signální molekuly, mezi nimi hlavně cyklin D. Cyklin D1 byl ve větší míře exprimován v transformovaných buňkách a jeho exprese byla inhibována sulfafenazolem (Potente et al., 2002). U transformovaných buněk došlo také k aktivaci p38 MAP kinázy a naopak k inhibici c-Jun N-terminální kinázy (JNK). Po dalších pokusech byl vyvrácen vliv p38 MAP kinázy na tvorbu cyklinu D1 indukovanou CYP 2C9. Tento vliv byl však potvrzen u JNK, kdy společná transfekce genů pro CYP 2C9 a dominantně negativní alely JNK způsobila zvýšení exprese cyklinu D1. 24
Inaktivace či atenuace signální dráhy JNK je spojena s defosforylací JNK specifickou fosfatázou MPK-1. Po prozkoumání vlivu CYP 2C9 na MPK-1 bylo zjištěno, že CYP 2C9 zvyšuje expresi MPK-1, která naopak deaktivuje JNK, což v důsledku vede k tvorbě cyklinu D1 a proliferaci endoteliálních buněk. Stejné výsledky dostaneme i po kultivaci normálních buněk s 11,12-EET. Naopak ke snížení tvorby MPK-1 dochází po kultivaci s H2O2. Peroxid v tomto případě nahrazuje reaktivní kyslíkaté molekuly, jež jsou také jedním z produktů metabolismu CYP. Podle dalších výsledků podporuje zvýšená exprese CYP 2C9 nebo samotná 11,12-EET angiogenezi (Michaelis et al., 2003). Míra takto vyvolané angiogeneze byla srovnatelná s výsledky získanými po aplikaci EGF nebo VEGF. Naopak žádný proangiogenní efekt nebyl pozorován po aplikaci 14,15-EET. CYP a EET též chrání lidské rakovinné buňky před apoptózou vyvolanou TNF-α (Jiang et al., 2005). Buňky přepisující CYP 2J2, stejně jako buňky inkubované s 8,9-EET, 11,12-EET a 14,15-EET vykazovaly sníženou apoptózu na rozdíl od buněk inkubovaných s inhibitorem CYP 2J2. Buňky, u kterých byla omezena TNF-α indukovaná apoptóza též více exprimovaly NF-κB a antiapoptické proteiny Bcl-2 a Bcl-XL. To znamená, že CYP a EET inhibují apoptózu vyvolanou TNF-α prostřednictvím narušení rovnováhy mezi proapoptickými a antiapoptickými proteiny.
25
ZÁVĚR U jednoho ze tří lidí se během života objeví rakovina. Nejúčinnější ochranou proti jejímu vzniku je nepopiratelně prevence. Ta nezahrnuje jen zdravý životní styl, ale i nepodceňování běžných a zdánlivě banálních onemocnění. Záněty, především pokud nejsou rychle vyléčeny a stávají se chronickými, výrazně podporují rozvoj rakoviny. U mnoha faktorů produkovaných imunitními buňkami v místě zánětu byl prokázán vliv na karcinogenezi. To platí i u látek syntetizovaných z kyseliny arachidonové. Postupně se začíná odhalovat složitý systém regulace syntézy těchto látek, které následně spouští metabolické dráhy, jež se v maligní transformaci buněk uplatňují. Většina metabolitů kyseliny arachidonové má prokarcinogenní účinky, i mezi jsou však výjimky - prostacyklin a lipoxiny. Využití těchto látek v boji s rakovinou je ale málo pravděpodobné. Významnějším způsobem, jak bránit rozvoji rakoviny, je inhibice syntézy prokarcinogenních metabolitů. Tuto hypotézu podporují i výzkumy, ve kterých se zkoumal zdravotní stav lidí, kteří dlouhodobě užívali protizánětlivé léky typu aspirin a ibuprofen – tedy klasické NSAID. U těchto lidí byla pozorována výrazně nižší incidence vzniku rakoviny. Tyto tradiční léky ovšem mají řadu vedlejších účinků, mimo jiné způsobují gastrointestinální krvácení. Do budoucna připadá v úvahu i predikce určitých typů rakoviny podle genetického vyšetření genu COX-2. V případě nádoru prostaty, prsu a jícnu byly objeveny jednonukleotidové polymorfismy, které zvyšují incidenci vzniku rakoviny. Podobné výsledky byly vysledovány i v případě polymorfismu genu pro CYP a rakoviny prsu a plic. V poslední době se proto intenzivně pracuje na vývoji nových léčiv. Od těchto látek si farmakologové, lékaři a samozřejmě i pacienti slibují lepší výsledky v prevenci i léčbě rakoviny bez vedlejších příznaků klasických NSAID. Také nadále probíhá řada výzkumů, které se pomocí histochemických a biochemických rozborů snaží určit, které typy nádorů jsou na derivátech kyseliny arachidonové závislé. Problémem je ovšem fakt, že maligní transformace je velice složitý proces, jež zahrnuje širokou škálu metabolických procesů a imunitních reakcí. To znesnadňuje výzkum onkologických onemocnění a také vysvětluje, proč si někdy výsledky pokusů s nejrůznějšími inhibitory v různých typech nádorů protiřečí.
26
LITERATURA Abe, A., Hiraoka, M. and Shayman, J.A. 2006. Positional specificity of lysosomal phospholipase A2. J Lipid Res. 47: 2268-2279 Attiga, F.A., Fernandez, P.M., Weeraratna, A.T., Manyak, M.J. and Patierno, S.R. 2000. Inhibitors of Prostaglandin Synthesis Inhibit Human Prostate Tumor Cell Invasiveness and Reduce the Release of Matrix Metalloproteinases. Cancer Res. 60: 4629-4637 Avis, I., Hong, S.H., Martínez, A., Moody, T., Choi, Y.H., Trepel, J., Das, R., Jett, M. and Mulshine, J.L. 2001. Five-lipoxygenas inhibitors can mediate apoptosis in human breast cancer cell lines through complex eicosanoid interactions. FASEB J 15 (11): 2007-2009 Awara, W.M., El-Sisi, A.E., El-Sayad, M.E. and Goda, A.E. 2004. The potential role of cyclooxygenase-2 inhibitors in the treatment of experimantally-induced mammary tumour: does celecoxib enhance the anti-tumour activity of doxorubicin? Pharmacol Res 50 (5): 487-498 Barbourt, S.E. and Dennis, E.A. 1993. Antisense Inhibition of Group IIPhospholipase A2 Expression Blocks the Production of Prostaglandin E2 by P388D1 Cells. J Biol Chem. 268 (29): 21875-21882 Borgeat, P., Hamberg, M. and Samuelsson, B. 1976. Transformation of Arachidonic Acid and Homo-γ-linoleic Acid by Rabbit Polymorphonuclear Leukocytes. J Biol Chem 251 (24): 7816-7820 Brocklehurst, W.E. 1960. The Release Of Histamine And Formation Of A SlowReacting Substance (SRS-A) During Anaphylactic Shock. J Physiol. 151: 416-4635 Campos, L., Rouault, J., Sabido, O., Oriol, P., Roubi, N., Vasselon, C., Archimbaud, E., Magaud, J. and Guyotat, D. 1993. High Expression of bcl-2 Protein in Acute Myeloid Leukemia Cells Is Associated With Poor Response to Chemotherapy. Blood 81 (11): 3091-3096 Castelli, M.G., Chiabrando, C., Fanelli, R., Martelli, L., Butti, G., Geatani, P. and Paoletti, P. 1989. Prostaglandin and Thromboxane Synthesis by Human Intracranial Tumors. Cancer Res. 49: 1505-1508 Cuzzocrea, S., Rossi, A., Serraino, I., Di Paola, R., Dugo, L., Genovese, T., Britti, D., Sciarra, G., De Sarro, A., Caputi, A.P. and Sautebin, L. 2001. 5-lipoxygenase knockout mice exhibit a resistance to acute pancreatitis induced by cerulein. Immunology 110 (1): 120-130 Dho, S., Grinstein, S., Corey, E.J., Su, W. and Pace-Asciak, C.R. 1990. Hepoxilin A3 induces changes in cytosolic calcium, intracellular pH and membrane potential in human neutrophils. Biochem J. 266: 63-68
27
Díaz-Cruz, E.S., Shapiro, C.L. and Brueggemeier, R.W. 2005. Cyclooxygenase Inhibitors Suppress Aromatase Expression and Activity in Breast Cancer Cells. J Clin Endocrinol Metab 90 (5): 2563-2570 Dixon, R.A.F., Jones, R.E., Diehl, R.E., Bennett, C.D., Kargman, S. and Rouzer, C.A. 1988. Cloning of the cDNA for human 5-lipoxygenase. Proc Natl Acad Sci USA 85: 416420 Dong, M., Guda, K., Nambiar, P.R., Rezaie, A., Belinsky, G.S., Lambeau, G., Giardina, C. and Rosenberg, D.W. 2003. Inverse association between phospholipase A2 and COX-2 expresiion during mouse colon tumorigenesis. Carcinogenesis 24 (2): 307-315 Dong, M., Johnson, M., Rezaie, A., Ilsley, J.N.M., Nakanishi, M., Sanders, M.M., Forouhar, F., Levine, J., Montrose, D.C., Giardina, C. and Rosenberg, D.W. 2005. Cytoplasmic Phospholipase A2 Levels Correlate with Apoptosis in Human Colon Tumorigenesis. Clin Cancer Res. 11: 2265-2271 Enayetallah, A.E., French, R.A., Thibodeau, M.S. and Grant, D.F. 2004. Distribution of Soluble Epoxide Hydrolase and of Cytochrome P450 2C8, 2C9, and 2J2 in Human Tissues. J Histochem Cytochem 52 (4): 447-454 Fierro, I.M., Kutok, J.L. and Serhan, C.N. 2002. Novel Lipid Mediator Regulators of Endothelial Cell Proliferation and Migration: Aspirin-Triggered-15R-Lipoxin A4 and Lipoxin A4. J Pharmacol Exp Ther. 300: 385-392 Figueroa, D.J., Breyer, R.M., Defoe, S.K., Kargman, S., Daugherty, B.L., Waldburger, K., Liu, Q., Clements, M., Zeng, Z., O’Neill, G.P., Jones, T.R., Lynch, K.R., Austin, C.P. and Evans, J.F. 2001. Expression of the Cysteinyl Leukotriene 1 Receptor in Normal Human Lung and Peripheral Blood Leukocytes. Am J Respir Crit Care Med. 163: 226233 Fischer L., Szellas, D., Rädmark, O., Steinhilber, D. and Werz, O. 2003. Phosphorylation- nad stimulus-dependent inhibition of cellular 5-lioxygenase activity by nonredox-type inhibitors. FASEB J 17 (8): 949-965 Funk, C.D., Funk, L.B., Kennedy, M.E., Ponh, A.S. and Fitzgerald, G.A. 1991. Human platelet/erythroleukemia cell prostglandin G/H synthase: cDNA cloning, expression, and gene chromosomal assignment. FASEB J 5: 2304-2312 García-Nieto, R., Pérez, C., Checa, A. and Gago, F. 1999. Molecular model of the interaction between nimesulide and human cyclooxygenase-2. Rheumatology (Oxford) 38 (1): 14-18
28
Gelb, M.H., Valentin, E., Ghomashchi, F., Lazdunski, M. and Lambeau, G. 2000. Cloning and Recombinant Expression of a Structurally Novel Human Secreted Phospholipase A2. J Biol Chem. 275 (51): 39823-39826 Girod, A., Wobus, C.E., Zádori, Z., Ried, M., Leike, K., Tijsen, P., Kleinschmidt, J.A. and Hallek, M. 2002. The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2 is cyrrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity. J Gen Virol. 83: 973-978 Goss, P.E. and Strasser-Weippl, K. 2004. Prevention strategies with aromatase inhibitors. Clin Cancer Res 10: 372-379 Gregor, J.I., Klian, M., Heukamp, I., Kiewert, C., Kristiansen, G., Schimke, I., Walz, M.K., Jacobi, C.A. and Wenger, F.A. 2005. Effects of selective COX-2 and 5-LO inhibition on prostaglandin and leukotriene synthesis in ductal pancreatic cancer in Syrian hamster. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 73 (2): 89-97 Guay, J., Bateman, K., Gordon, R., Mancini, J. and Riendeau, D. 2004. Carrageenaninduced Paw Edema in Rat Elicits a Predominant Prostaglandin E2 (PGE2) Response in the Central Nervous System Associated with the Induction of Microsomal PGE2 Synthase-1. J Biol Chem 279 (23): 24866-24872 Heise, C.E., O’Dowd, B.F., Figueroa, D.J., Sawyer, N., Nguyen, T., Im, D., Stocco, R., Bellefeuille, J.N., Abrahamovitz, M., Cheng, R., Williams Jr., D.L., Zeng, Z., Liu, Q., Ma, L., Clements, M.K., Coulombe, N., Liu, Y., Austin, C.P., George, S.R., O’Neill, G.P., Metters, K.M., Lynch, K.R. and Evans, J.F. 2000. Characterization of the Human Cysteinyl Leukotiene 2 Receptor. J Biol Chem. 275 (39): 30531-30536 Hennig, R., Ding, X.Z., Tonh, W.G., Schneider, M.B., Standop, J., Friess, H., Büchler, M.W., Pour, P.M. and Adrian, T.E. 2002. 5-Lipoxygenase and Leukotriene B4 Receptor Are Expressed in Human Pancreatic Cancer But Not in Pancreatic Ducts in Normal Tissue. Am J Pathol 161: 421-428 Hla, T. and Neilson, K. 1992. Human cyclooxygenase-2 cDNA. Proc Natl Acad Sci USA 89: 7384-7388 Ho, I., Arms, J.P., Bingham, C.O., Choi, A., Austen, F. and Glimcher, L.H. 2001. A Novel Group of Phospholipase A2s Preferentially Expressed in Type 2 Helper T Cells. J Biol Chem. 276 (21): 18321-18326 Hoshiko, S., Rådmark, O. and Samuelsson, B. 1990. Characterization of the human 5lipoxygenase gene promotor. Proc Natl Acad Sci USA 87: 9073-9077
29
Hsu, A.L., Ching, T.T., Wang, D.S., Song, X., Rangnekar, V.M. and Chen, C.S. 2000. The Cyclooxygenase-2 Inhibitor Celecoxib Induces Apoptosis by Blocking Akt Activation in Human Prostate Cencer Cells Independently of Bcl-2. J Biol Chem 275 (15): 11397-11403 Hughes-Fulford, M., Tjandrawinata, R., Li, C. and Sayyah, S. 2005. Arachidonic acid, an omega-6 fatty acid, induces cytoplasmic phospholipase A2 in prostate carcinoma cell. Carcinogenesis. 26 (9): 1520-1526 Chamulitrat, W., Mason, R.P. and Riendeau, D. 1992. Nitroxide Metabolites from Alkylhydroxylamines and N-Hydroxyurea Derivatives Resulting from Reductive Inhibition of Soybean Lipoxygenase. J Biol Chem 267 (14): 9574-9579 Chandrasekharan, N.V., Dai, H., Roos, K.L., Evanson, N.K., Tomsik, J., Elton, T.S. and Simmons, D.L. 2002. COX-3, a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: Cloning, structure, and expression. Proc Natl Acad Sci USA 99 (21): 13926-13931 Chen, C., Sun, Y., Chen, J. and Chiu, K. 2000. TNF-α-Induced Cyclooxygenase-2 Expression in Human Lung Epithelial Cells: Involvement of the Phospholipase C-γ2, Protein Kinase C-α, Tyrosine Kinase, NF-κB-Inducing Kinase, and I-κB Kinase 1/2 Pathway. J Immunol 165 (5): 2719-2728 Ihara, A., Wada, K., Yoneda, M., Fujisawa, N., Takahashi, H. and Nakajima, A. 2007. Blockade of Leukotriene B4 Signaling Pathway Induce Apoptosis and Suppresses Cell Proliferation in Colon Cancer. J Pharmacol Sci. 103: 24-32 Ishii, K., Motoyoshi, S., Kawata, J., Nakagawa, H. and Takeyama, K. 1994. A Useful Method for Differential Evaluation of Anti-Inflammatory Effects Due to Cyclooxygenase and 5Lipoxygenase Inhibitions in Mice. Jpn J Pharmacol 65: 297-303 Ishikawa, H., Ohno, T., Kato, S., Wakatsuki, M., Iwakawa, M., Ohta, T., Imai, T., Mitsuhashi, N., Noda, S., Nakano, T. and Tsujii, H. 2006. Cyclooxygenase-2 impairs treatment effects of radiotherapy for cervical cancer by inhibition of radiation-induced apoptosis. Int J Radiation Oncoogy Biol Phys. 66 (5): 1347-1355 Jiang, J., Chen, C., Card, J.W., Yang, S., Chen, J., Fu, X., Ning, Y., Xiao, X., Zeldin, D.C. and Wang, D.W. 2005. Cytochrome P450 2J2 Promotes the Neoplastic Phenotype of Carcinoma Cells and Is Up-regulated in Human Tumors. Cancer Res 65 (11): 4707-4715 Kajita, S., Ruebel, K.H., Casey, M.B., Nakamura, N. and Lloyd, R.V. 2005. Role of COX-2, thromboxane A2 synthase, and prostaglandin I2 synthase in papillary thyroid carcinoma growth. Mod Pathol. 18: 221-227
30
Kakiuchi, Y., Tsuji, S., Tsujii, M., Murata, H., Kawai, N., Yasumaru, M., Kimura, A., Komori, M., Irie, T., Miyoshi, E., Sasaki, Y., Haashi, N., Kawano, S. and Hori, M. 2002. Cyclooxygenase-2 Activity Altered the Cell-Surface Carbohydrate Antigens on Colon Cancer Cells and Enhanced Liver Metastasis. Cancer Res 62: 1567-1572 Karara, A., Makita, K., Jacobson, H.R., Falck, J.R., Guengerich, F.P., DuBoist, R.N. and Capdevila, J.H. 1993. Molecular Cloning, Expression, and Enzymatic Characterization of the Rat Kidney Cytochrome P-450 Arachidonic Acid Epoxygenase. J Biol Chem 268 (18): 13565-13570 Kawada, N., Solis, G., Ivey, N., Connors, S., Dennehy, K., Modlinger, P., Hamel, R., Kawada, J.T., Imai, E., Langenbach, R., Welch, W. and Wilcox, C.S. 2005. Cyclooxygenase1-Deficient Mice Have High Sleep-to Wake Blood Pressure Ratio and Renal Vasoconstriction. Hypertension 45: 1131-1138 Keith, R.L., Miller, Y.E., Hudish, T.M., Girod, C.E., Sotto-Santiago, S., Franklin, W.A., Nemenoff, R.A., March, T.H., Nana-Sinkam, S.P. and Geraci, M.W. 2004. Pulmonary Prostacyclin Synthase Overexpression Chemoprevents Tobacco Smoke Lung Carcinogenesis in Mice. Cancer Res. 64: 5897-5904 Killermann Lucas, K., Svensson, C.I., Hua, X., Yaksh, T.L. and Dennis, E.A. 2005. Spinal phospholipase A2 in inflammatory hyperalgesia: role of Group IVA cPLA2. Br J Pharmacol. 144: 940-952 Kinugasa, Y., Hatori, M., Ito, H., Kurihara, Y., Ito, D. and Nagumo, M. 2004. Inhibition od¨f cyclooxygenase-2 suppresses invasiveness of oral squamous cell carcinoma lines via down-regulation of matrix metalloproteinase-2 and CD44. Clin Exp Metastasis 21: 737-745 Kishi, K., Petersen, S., Petersen, C., Hunter, N., Mason, K., Masferrer, J.L., Tofilon, P.J. and Milas, L. 2000. Preferential Enhancement of Tumor Radioresponse by a Cyclooxygenase-2 Inhibitor. Cancer Res 60 (5): 1326-1331 Krysan, K., Merchant, F.H., Zhu, L., Dohadwala, M., Luo, J., Lin, Y., HeuzeVourc’h, N., Põld, M., Seligson, D., Chia, D., Goodglick, L., Wang, H., Strieter, R., Sharma, S. and Dubinett, S. 2003. COX-2-dependent stabilization of survivin in non-small cell lung cancer. FASEB J 18 (1): 206-225 Liu, X., Yao, S., Kirschenbaum, A. and Levine, A.C. 1998. NS398, a Selective Cyclooxygenase-2 Inhibitor, Induces Apoptosis and Down-Regulates bcl-2 Expression in LNCap Cells. Cancer Res 58: 4245-4249 Lundholm, K., Gelin, J., Hyltander, A., Lönnroth, C., Sandström, R., Svaninger, G., Körner, U., Gülich, M., Kärrefors, I., Norli, B., Hafström, L.O., Kewenter, J., Olbe, L. and 31
Lundell, L. 1994. Anti-inflammatory Treatment May Prolong Survival in Undernourished Patients with Metastatic Solid Tumors. Cancer Res 54: 5602-5606 Meyer, A.M., Dwyer-Nield, L.D., Hurtesu, G.J., Keith, P.L., O’Leary, E., You, M., Bonventre, J.V., Nemenoff, R.A. and Malkinson, A.M. 2004. Decreased lung tumorigenesis in mice genetically deficient in cytosolic phospholipase A2. Carcinogenesis. 5 (8): 1517-1524 Mezhybovska, M., Wikström, K., Öhd, J.F. and Sjölander, A. 2006. The Inflammatory Mediator Leukotriene D4 Induces β-Catenin Signaling and Its Association with Antiapoptotic Bcl-2 in Intestinal Epithelial Cells. J Biol Chem. 281 (10): 6776-6784. Michaelis, U.R., Fisslthaler, B., Medhora, M., Harder, D., Fleming, I. and Busse, R. 2003. Cytochrome P450 2C9-derived epoxyeicosatrienois acids induce angiogenesis via crosstalk with the epidermal growth factor receptor. FASEB J 7 (6):770-788 Michaelis, U.R., Fisslthaler, B., Barbosa-Sicard, E., Falck, J.R., Fleming, I. and Busse, R. 2005. Cytochrome P450 epoxygenases 2C8 and 2C9 are implicated in hypoxiainduced endothelial cell migration and angiogenesis. J Cell Sci 118: 5489-5498 Moussa, O., Yordy, J.S., Abol-Enein, H., Sinha, D., Bissada, N.K., Halushka, P.V., Ghoneim, M.A. and Watson, D.K. 2005. Prognostic and Functional Significance of Thromboxane Synthase Gene Oveexpression in Invasive Bladder Cancer. Cancer Res. 65 (24): 11581-11587 Nithipatikom, K., Isbell, M.A., Lindholm, P.F., Kajdacsy-Balla, A., Kaul, S. and Campell, W.B. 2002. Requirement of cyclooxygenase-2 expression and prostaglandins for human prostate cancer cell invasion. Clin Exp Metastasis. 19: 593-601 Norwood, V.F., Morham, SG. and Smithies, O. 2000. Postnatal development and progression of renal dysplasia in cyclooxygenase-2 null mice. Kidney Int 58: 2291-2300 Nuttle, L.C., Ligon, A.L., Farrell, K.R. and Hester, R.L. 1999. Inhibition of phospholipase A2 attenuates functional hyperemia in the hamster cremaster muscle. Am J Physiol. 279: 1289-1294 Oliw, E.H., Guengerich, F.P. and Oates, J.A. 1982. Oxygenation of Arachidonic Acid by Hepatic Monooxygenases. J Biol Chem 257 (7): 3771-3781 Oshima, M., Dinchuk, J.E., Kargman, S.L., Oshima, H., Hancock, B., Kwong, E., Trzaskos, J.M., Evans, J.F. and Taketo, M.M. 1996. Suppression of Intestinal Polyposis in Apc∆716 Knockout Mice by Inhibition of Cyclooxygenase 2 (COX-2). Cell 87: 803-809 Parhamifar,. L., Jeppsson, B. and Sjöander, A. 2005. Activation of cPLA2 is required for leukotriene D4-induced proliferation in colon cancer cells. Carcinogenesis 26 (11): 19881998 32
Parker, C.W., Kelly, J.P., Falkenhein, S.F. and Huber, M.G. 1979. Release of Arachidonic Acid from Human Lymphocytes in Response to Mitogenic Lectins. J Exp Med. 149: 1487-1503 Plastaras, J.P., Guengerich, F.P., Nebert, D.W. and Marnett, L.J. 2000. Xenobioticmetabolizing
Cytochromes
P450
Convert
Prostaglandin
Endoperoxide
to
Hydroxyheptadecatrienoic Acid and the Mutagen, Malondialdehyde. J Biol Chem 275 (16): 11784-11790 Poole, E.M., Bigler, J., Whitton, J., Sibert, J.G., Potter, J.D. and Ulrich, C.M. 2006. Prostacyclin Synthase and Arachidonate 5-Lipoxygenase Polymorphisms and Risk of Colorectal Polyps. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15 (3): 502-508 Potente, M., Michaelis, U.R., Fisslthaler, B., Busse, R. and Fleming, I. 2002. Cytochrome P450 2C9-induced Endothelial Cell Proliferation Involves Induction of Mitogenactivated Protein (MAP) Kinase Phosphatase-1, Inhibition of the c-Jun N-terminal Kinase, and Up-regulation of Cyclin D1. J Biol Chem 277 (18): 15671-15676 Pradono, P., Tazawa, R., Maemondo, M., Tanaka, M., Usui, K., Saijo, Y., Hagiwara, K. and Nukiwa, T. 2002. Gene Transfer of Thromboxane A2 Synthase and Prostaglandin I2 Synthase Antithetically Alered Tumor Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Res. 62: 63-66 Ramsay, R.G., Friend, A., Vizantios, Y., Freeman, R., Sicurella, C., Hammett, F., Armes, J. and Venter, D. 2000. Cyclooxygenase-2, a Colorectal Cancer Nonsteroidal Antiinflammatory Drug Target, Is Regulated by c-MYB. Cancer Res 60: 1805-1809 Rao, C.V., Indranie, C., Simi, B., Manning, P.T., Connor, J.R. and Reddy, B.S. 2002. Chemopreventive properties of a selective inducible nitric oxide synthase inhibitor in colon carcinogenesis,
administered
alone
or
in
combination
with
celecoxib,
a
selective
cyclooxygenase-2 inhibitor. Cancer Res 62 (1): 165-170 Rask, K., Zhu, Y., Wang, W., Hedin, L. and Sundfeldt, K. 2006. Ovarian epithelial cancer: a role for PGE2-synthesis and signaling in malignant transformation and progression. Molecular Cancer. 5 Ratnasinghe, D., Daschner, P.J., Ancer, M.R., Kasprzak, B.H., Taylor, P.R., Yeh, G.C. and Tangrea, J.A. 2001. Cyclooxygenase-2, P-glycoprotein-170 and drug resistance: is chemoprevention against multidrug resistance possible? Anticancer Res 21 (3C): 2141-2147 Reid G.K., Kargman, S., Vickers, P.J., Mancini, J.A., Léveillé, C., Ethier, D., Miller, D.K., Gillard, J.W., Dixon, R.A.F. and Evans, J.F. 1990. Correlation between Expression of 5-Lipoxygenase-activating Protein, 5-Lipoxygenase, and Cellular Leukotriene Synthesis. J Biol Chem 265 (32): 19818-19823 33
Reynaud, D., Demin, P. and Pace-Asciak, C.R. 1996. Hepoxilin A3-specific binding in human neutrophils. Biochem J. 313: 537-541 Rieker, R.J., Joos, S., Mechtersheimer, G., Blacker, H., Schnabel, P.A., MoresiHauf, A., Hecker, E., Thomas, M., Dienemann, H., Schirmacher, P. and Kern, M.A. 2006. COX-2 upregulation in thymomas ans thymic carcinomas. Int J Cancer. 119: 2063 – 2070 Rioux, N. and Castonguay, A. 1998. Inhibitors of lipoxygenase: a new class of cancer chemopreventive agents. Carcinogenesis 19 (8): 1393-1400 Rocca, B., Secchiero, P., Ciabattoni, G., Ranelletti, F.O., Catani, L., Guidotti, L., Melloni, E., Maggiano, N., Zauli, G. and Patrono, C. 2002. Cyclooxygenase-2 expression is induced during human megakaryopoiesis and characterizes newly formed platelets. Proc Natl Acad Sci USA 99 (11): 7634-7639 Romano, M., Catalano, A., Nutini, M., D’Urbano, E., Crescenzi, C., Claria, J., Libner, R., Davi, G. and Peocopio, A. 2001. 5-Lipoxygenase regulates malignant mesothelial cell survival: involvement of vascular endothtelial growth factor. FASEB J 15 (13): 2326-2336 Romano, M. and Claria, J. 2003. Cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase converging functions on cell proliferation and tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. FASEB J 17: 1986-1995 Safayhi, H., Mack, T., Sabieraj, J., Anazodo, M.I., Subramanian, L.R. and Ammon, H.P.T. 1992. Boswellic Acids: Novel, Specific, Nonredox Inhibitors of 5-Lipoxygenase. J Pharmacol Exp Ther 261 (3): 1143-1146 Saha, D., Datta, P.K., Sheng, H., Morow, J.D., Wada, M., Moses, H.L. and Beauchamp, R.D. 1999. Synergistic Induction of Cyclooxygenase-2 by Transforming Growth Factor-β1 and Epidermal Growth Factor Inhibits Apoptosis in Epithelial Cells. Neoplasia 1 (6): 508-517 Sales, K.J., List, T., Boddy, S.C., Williams, A.R.W., Anderson, R.A., Naor, Z. and Jabbour, H.N. 2005. A Novel Angiogenic Role for Prostaglandin F2α-FP Receptor Interaction in Human Endometrial Adenocarcinomas. Cancer Res. 65 (17): 7707-7716 Sawdy, R., Knock, G.A., Bennett, P.R., Poston, L. and Aaronson, P.I. 1998. Effect of nimesulide and indomethacin on contractility and the Ca2+ channel current in myometrial smooth muscle from pregnant women. Br J Pharmacol 125: 1212-1217 Seno, H., Oshima, M., Ishikawa, T., Oshima, H., Takaku, K., Chiba, T., Narumiya, S. and Taketo, M.M. 2002. Cyclooxygenase 2- nad Prostaglandin E2 Receptor EP2-dependent Angiogenesis in Apc∆716 Mouse Intestinal Polyps. Cancer Res 62: 506-511
34
Serhan, C.N., Hamberg, M. and Samuelsson, B. 1984. Lipoxins: Novel series of biologically active compounds formed from arachidonic acid in human leukocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 81: 5335-5339 Shimpo, M., Ikeda, U., Maeda, Y., Ohya, K., Murakami, Y. and Shimada, K. 2000. Effects of Aspirin-Like Drugs on Nitric Oxide Synthesis in Rat Vascular Smooth Muscle Cells. Hypertension 35: 1085-1091 Shishodia, S., Koul, D. and Aggarwal, B.B. 2004. Cyclooxygenase (COX)-2 Inhibitor Celecoxib Abrogates TNF-Induced NF-κB Activation through Inhibition of Activation of IκBα Kinase and Akt in Human Non-Small Cell Lung Carcinoma: Correlation with Suppression of COX-2 Synthesis. J Immunol 173: 2011-2022 Soriano, A.F., Helfrich, B., Chan, D.C., Heasley, L.E., Bunn, P.A. and Chou, T.C. 1999. Synergistic Effects of New Chemopreventive Agents and Conventional Cytotoxic Agents against Human Lung Cancer Cell Lines. Cancer Res 59 (24): 6178-6184 Spencer, A.G., Woods, J.W., Arakawa, T., Singer, I.I. and Smith, W.L. 1998. Subcellular Localization of Prostaglandin Endoperoxide H Synthases-1 and -2 by Immunoelectron Microscopy. J Biol Chem 273 (16): 9886-9893 Stahelin, R.V., Rafter, J.D., Das, S. and Cho, W. 2003. The Molecular Basis of Differential Subcellular Localization of C2 Domains of Protein Kinase C-α and Group IVa Cytosolic Phospholipase A2. J Biol Chem. 278 (14): 12452-12460 Stolina, M., Sharma, S., Lin, Y., Dohadwala, M., Gardner, B., Luo, J., Zhu, L., Kronenberg, M., Miller, P.W., Portanova, J., Lee, J.C. and Dubinett, S.M. 2000. Specific Inhibition of Cyclooxygenase 2 Restores Antitumor Reactivity by Altering the Balance of IL-10 and IL-12 Synthesis. J Immunol 164 (1): 361-370 Sugino, N., Nakata, M., Kashida, S., Karube, A., Takiguchi, S. and Kato, H. 2000. Decreased superoxide dismutase expression and increased concentrations of lipid peroxide and prostaglandin F2α in the decidua of failed pregnancy. Mol Hum Reprod. 6 (7): 642-647 Tariq, M., Elfaki, I., Khan, H.A., Arshaduddin, M., Sobki, S. and Moutaery, M.A. 2006. Bromophenacyl bromide, a phospholipase A2 inhibitor attenuates chemically induced gastroduodenal ulcers in rats. World J Gastroenterol. 12 (36): 5798-5804 Tsujii, M., Kawano, S. and DuBois, R.N. 1997. Cyclooxygenase-2 expression in human colon cancer cells increases metastatic potential. Proc Natl Acad Sci USA 94: 3336-3340 Uefuji, K., Ichikura, T. and Mochizuki, H. 2000. Cyclooxygenase-2 Expression Is Related to Protaglandin Biosynthesis and Angiogenesis in Human Gastric Cancer. Clin Cancer Res 6: 135-138 35
Uhl, J., Klan, N., Rose, M., Entian, K., Werz, O. and Steinhilber, D. 2002. The 5Lipoxygenase Promoter Is Regulated by DNA Methylation. J Biol Chem 277 (6): 4374-4379 Wiese, F.W., Thompson, P.A. and Kadlubar, F.F. 2001. Carcinogen substrate specifity of human COX-1 and COX-2. Carcinogenesis 21 (1): 5-10 Wikström, K., Juhas, M. and Sjölander, A. 2003. The anti-apoptotic effect of leukotriene D4 involves the prevention of caspaza 8 activation and Bid cleavage. Biochem J. 371: 115-124 Wright, H.M. and Malik, K.U. 1996. Prostacyclin formation elicited by endothelin-1 in rat aorta is mediated via phospholipase D activation and not phospholipase C or A2. Circ Res. 79 (2): 271-276 Wu, T., Leng, J., Han, C. and Demetris, A.J. 2004. The cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib blocks phosphorylation of Akt and induces apoptosis in human cholangiocarcinoma cells. Mol Cancer Ther 3 (3): 299-307 Yamamoto, Y., Yin, M.J., Lin, K.M. and Gaynor, R.B. 1999. Sulindac Inhibits Activation of the NF-κB Pathway. J Biol Chem 274 (38): 27307-37314 Ye, Y.N., Wu, W.K.K., Shin, V.Y., Bruce, I.C., Wong, B.C.Y. and Cho, C.H. 2005. Dual inhibition of 5-LOX and COX-2 sypresses colon cancer formation promoted by cigarette smoke. Carcinogenesis. 26 (4): 827-834 Yu, Y., Cheng, Y., Fan, J., Chen, X., Klein-Szanto, A., FitzGerald, G.A. and Funk, C.D. 2005. Differential impact of prostaglandin H synthase 1 knockdown on platelets and parturition. J Clin Invest 115 (4): 986-995 Zamuner, S.R., Bak, A.W., Devchand, P.R. and Wallace, J.L. 2005. Predisposition to Colorectal Cancer in Rats with Resolved Colitis: Role of Cyclooxygenase-2-Derived Prostaglandin D2. Am J Pathol. 167 (5): 1293-1300 Zhang, M., Harris, R.C. and McKanna, J.A. 1999. Regulation of caclooxygenase-2 (COX-2) in rat renal cortex by adrenal glucocorticoids and mineralocorticoids. Proc Natl Acad Sci USA 96 (26): 15280-15285 Zhang, L., Yu, J., Park, B.H., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B. 2000. Role of BAX in the apoptotic response to anticancer agents. Science 290 (5493): 989-992 Zhang, X.,Chen, Z., Choe, M.S., Lin, Y., Sun, S., Wieand, H.S., Shin, H.J.C., Chen, A., Khuri, F.R. and Shin, D.M. 2005. Tumor Growth Inhibition by Simultaneously Blocking Epidermal Growth Factor Receptor and Cyclooxygenase-2 in a Xenograft Model. Clin Cancer Res 11 (17): 6261-6269
36
Zhang, B., Cao, H. and Rao, G.N. 2006. Fibroblast Growth Factor-2 Is a Downstream Mediator of Phosphatidylinositol 3-Kinase-Akt Signaling in 14,15-Epoxyeicosatrienoic Acidinduced Angiogenesis. J Biol Chem 281 (2): 905-914 Zhao, S., Jiang, X., Xue, D. and Chen, D. 1998. Glioma prostaglandin levels correlate with brain edema. J Tomgji Med Univ. 18 (2): 115-118 Zhou, X.M., Wong, B.C.Y., Fan, X.M., Zhang, H.B., Lin, M.C.M., Kung, H.F., Fan, D.M. and Lam, S.K. 2001. Non-steroidal anti-inflammatory drugs induce apoptosis in gastric cancer cells through up-regulation of bax and bak. Carcinogenesis 22 (9): 1393-1397
37
