ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Salmonella sp. PADA REPTIL
ERFIANDINI EKA PUSPITA
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Identifikasi Salmonella sp. pada Reptil adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Juni 2015 Erfiandini Eka Puspita NIM B04110050
ABSTRAK ERFIANDINI EKA PUSPITA. Isolasi dan Identifikasi Salmonella sp. pada Reptil. Dibimbing oleh I WAYAN TEGUH WIBAWAN Salmonella sp. merupakan agen patogen bagi manusia yang bersifat zoonosis. Kejadian salmonellosis pada manusia dapat disebarkan oleh hewan peliharaan eksotik (exotic pet animals). Infeksi mikroorganisme ini pada manusia akan meningkat didukung oleh popularitas dan varietas reptil sebagai hewan peliharaan eksotik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan Salmonella sp. pada reptil sebagai faktor penyebaran melalui kontak langsung dengan manusia yang memelihara reptil. Sampel yang digunakan adalah swab kulit disekitar kloaka setiap reptil yang berasal dari salah satu petshop di Dramaga Bogor. Penelitian ini dilakukan melalui tahapan isolasi, uji presumtif, dan uji konfirmasi. Hasil penelitian menunjukan bahwa prevalensi keberadaan Salmonella sp. pada hewan eksotik khususnya reptil di petshop tersebut sebanyak 7.5%. Hasil positif didapatkan pada sampel yang berasal dari ular. Kata kunci : isolasi, identifikasi, Salmonella sp., reptil, swab kulit.
ABSTRACT ERFIANDINI EKA PUSPITA. Isolation dan Identification Salmonella sp. in Reptile. Supervised by I WAYAN TEGUH WIBAWAN Salmonella sp. is a zoonotic pathogenic agent. The incidence of salmonellosis can be spread by exotic pets. Microorganism infection in humans correlates with the popularity of exotic pets. This research aims to determine the presence of Salmonella on reptiles as a spreading factor through direct contact with humans. Cloacal skin swab of reptiles in one of petshops in Dramaga, Bogor were used as samples. This research was conducted through steps: isolation, presumptive test, and confirmation test. The result of this research showed that the prevalence of Salmonella on exotic animals especially reptiles in the mentioned pet shop is 7.5%. The positive results are mostly acquired from samples derived from snakes. Keyword : isolation, identification, reptile, Salmonella sp., skin swab.
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Salmonella sp. PADA REPTIL
ERFIANDINI EKA PUSPITA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PRAKATA Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul penelitian yang telah dilaksanakan sejak bulan Januari sampai Mei 2015 ini ialah Isolasi dan Identifikasi Salmonella sp. pada Reptil. Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Prof Dr Drh I Wayan Teguh Wibawan, MS sebagai dosen pembimbing atas segala bimbingannya, masukan, dukungan, nasihat, serta kesabarannya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini. 2. Drh Wyanda Arnafia dan Drh Siti Gusti Ningrum yang telah banyak memberi saran, bimbingan dan menyempurnakan skripsi ini. 3. Drh Purnomo yang telah menyediakan tempat dan waktunya dalam pengambilan sampel penelitian. 4. Bapak Agus Soemantri, Bapak Nur, Bapak Didik, Mas Adji dan beserta seluruh staf Laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medis, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesmavet (IPHK), Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan staf Laboratorium Bakteriologi Balai Besar Veteriner Bogor yang telah membantu selama pengumpulan data. 5. Keluarga tercinta, Ayahanda A Kohar Lutfi, Ibunda Erna Hastuti, Adinda M. Ridho Andwi Putra dan Adinda Rahmadian Tri Noval atas doa dan dukungannya kepada penulis. 6. Sylvia Oscarina dan Andi Aulia Ariesty sebagai teman penelitian. Ibu Masniari, Oktavia, Nia, Meilany, Rianti, para Yasminers dan seluruh angkatan FKH 48 yang telah memberikan warna dan cerita. Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih belum sempurna, sehingga kritik, saran, dan masukan yang membangun sangat diharapkan dalam penulisan karya ilmiah ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2015
Erfiandini Eka Puspita
DAFTAR ISI PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Manfaat Penelitian TINJAUAN PUSTAKA Klasifikasi dan Karakteristik Reptil Klasifikasi dan Karakteristik Bakteri Salmonella sp. Patogenesis Salmonellosis Salmonellosis pada Reptil METODE Tempat dan Waktu Penelitian Desain Penelitian Pengambilan dan Jumlah Sampel Alat dan Bahan Metode Penelitian Tahap Pre-Enrichment (Pra-Pengayaan) Tahap Enrichment (Pengayaan) Tahap Isolasi dan Identifikasi Uji Konfirmasi Biokimia Uji Konfirmasi Isolat Salmonella Menggunakan Metode PCR Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji Konfirmasi Biokimiawi Uji Konfirmasi Isolat Salmonella Menggunakan Metode PCR SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA RIWAYAT HIDUP
1 1 1 1 2 2 2 3 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 7 8 8 9 9 10 11 13 13 13 14 16
DAFTAR GAMBAR 1 Mekanisme invasi Salmonella sp. (Revolledo 2010). 2 Diagram alur pengujian Salmonella sp. 3 Koloni Salmonella sp. pada media BSA 4 Hasil Uji Biokimia 5 Hasil elektroforesis sampel yang diduga Salmonella sp.
4 7 10 11 12
DAFTAR TABEL 1 Reaksi biokimia Salmoella sp. (BSN 2008) 2 Sampel yang diduga positif Salmonella sp. pada BSA 3 Sampel yang diduga positif Salmonella sp. pada TSIA 4 Persentase prevalensi Salmonella sp. pada reptil
7 9 10 12
2
PENDAHULUAN Latar Belakang Reptil merupakan hewan melata, berdarah dingin, dan memiliki masa hidup yang relatif panjang dari mamalia. Sifat dan karakteristik unik tersebut membuat akhir-akhir ini popularitas reptil sebagai hewan peliharaan yang eksotik, semakin meningkat. Saat ini diperkirakan 1% dari rumah tangga di Amerika Serikat dan Eropa memelihara jenis hewan ini, dan jenis yang paling banyak dipelihara adalah jenis kura-kura (Harris et al. 2010). Selama popularitas dan varietas hewan ini meningkat, maka semakin tinggi infeksi yang terjadi pada manusia akibat terinfeksi mikroorganisme pada reptil, khususnya Salmonella sp.. Banyak studi telah membuktikan bahwa kejadian salmonellosis pada manusia dapat disebarkan oleh hewan peliharaan eksotik (exotic pet animals). Salmonelosis merupakan penyakit yang disebabkan oleh infeksi dari Salmonella sp., dan salah satu penyakit zoonotik yang penting menyerang manusia dan hewan. Gray (2011) dalam sebuah penelitian menyatakan sekitar 40% isolat Salmonella sp. ditemukan pada saluran pencernaan reptil. Salmonella sp. juga ditemukan pada tanah tempat reptil dipelihara dan di feses. Salmonella sp. merupakan agen patogen bagi manusia yang dapat menyebabkan penyakit serius, namun tidak menimbulkan gejala klinis pada reptil. Kemampuan penyebaran bakteri ini sangat mudah, baik secara langsung maupun tidak langsung. Secara langsung bakteri ini dapat menginfeksi melalui kontak langsung saat menangani hewan, sedangkan secara tidak langsung dapat terinfeksi dari kontaminasi kandang dan alat pakan hewan. Menurut Geue dan Löschner (2002), reptil liar memiliki prevalensi Salmonella sp. lebih rendah dibandingkan reptil yang dipelihara dalam penangkaran. Sebanyak 88.9% isolat Salmonella sp. ditemukan pada sampel reptil yang dipelihara di pet shop dan sebanyak 58.8% ditemukan pada sampel reptil yang ditangkap dari alam liar. Salmonella sp. pada hewan reptil dapat terdeteksi di kloaka dan ulas kulit (skin swab). Penyebaran Salmonella sp. dari reptil melalui kulit ke lingkungan lebih mudah karena reptil bergerak dengan merayap. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan Salmonella sp. pada reptil khususnya pada kulit sebagai faktor penyebaran melalui kontak langsung dengan manusia yang memelihara reptil.
Perumusan Masalah Diperlukan penelitian untuk memecahkan pertanyaan mengenai keberadaan Salmonella sp. pada sampel swab kulit di sekitar kloaka reptil khususnya pada reptil sebagai hewan peliharaan.
Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai keberadaan Salmonella sp. pada reptil yang digunakan sebagai hewan peliharaan.
2
TINJAUAN PUSTAKA Klasifikasi dan Karakteristik Reptil Reptil adalah hewan bertulang belakang yang merayap, bersisik dan bernapas dengan paru-paru. Indonesia memiliki tiga ordo yaitu: Testudines, Squamata dan Crocodylia. Tuatara (Ordo Rhynchocephalia) merupakan reptil primitif yang terdiri dari 1 jenis dan hanya terdapat di SelandiaBaru (O’Shea dan Halliday 2001). Berikut adalah klasifikasi umum reptil: Kingdom : Animalia Filum : Chordata Sub-filum : Vertebrata Kelas : Reptilia Sub Kelas : Eureptilia Super Ordo : Lepidosauria, Testudines, Archosauria Ordo : Testudines (kura-kura) Squamata (kadal, ular, dan amphisbaenia) Rhynchocephalia (tuatara) Crocodylia (buaya) Ciri utama reptil adalah tubuhnya yang ditutupi dengan sisik-sisik rata atau berduri yang berfungsi untuk mengatur sirkulasi air melalui kulitnya. Hewan ini tidak memiliki rambut atau bulu. Warna kulit beragam, dari warna yang menyerupai lingkungannya sampai warna yang membuat reptil mudah terlihat. Semua reptil tidak memiliki telinga eksternal. Sebagian besar reptil terdapat perbedaan antara jantan dan betina pada ukuran dan bentuk, maupun warna tubuh dewasa (Halliday dan Adler 2000). Hampir semua reptil adalah ovipar atau bertelur, dan sebagian lagi ovovivipar. Reptil dapat bersifat ovipar maupun ovovivipar walaupun termasuk dalam genus yang sama.
Klasifikasi dan Karakteristik Bakteri Salmonella sp. Salmonella sp. berhabitat secara alami pada saluran pencernaan hewan. Saat ini lebih dari 2500 jenis serovar Salmonella sp. yang telah ditemukan. Salmonella sp. memiliki 2 spesies, yakni Salmonella enterica dan S. bongori, dan 6 subspesies S. Enterica (subspesies I), S. Salamae (subspesies II), S. Arizonae (subspesies III), S. Diarizonae (subspesies IIIb), S. Houtenae (subspesies IV) dan S. Indica (subspesies V). Subspecies I secara rutin ditemukan pada manusia, sedangkan subspesies lain sering ditemukan dari hewan poikitoterm dan lingkungan. Berikut adalah klasifikasi umum bakteri Salmonella sp. Kingdom : Bacteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gammaproteobacteria Ordo : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Salmonella sp.
3 Salmonella sp. termasuk dalam famili Enterobacteriaceae, merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang, serta tidak membentuk spora. Ratarata berukuran 1-3 µm x 0.5 µm. Bakteri ini bersifat motil dengan flagela peritrichous. Semua spesies Salmonella sp. adalah patogen bagi manusia. Bakteri yang ditemukan pertama kali oleh Daniel Elmer Salmon (ahli patologi veteriner dari Amerika) ini hidup pada kisaran temperatur 5 °C sampai 47 °C (optimum 37 °C), sensitif terhadap temperatur tinggi, tidak tahan pada temperatur lebih dari 70 °C. Bakteri ini dapat mati pada suhu pasteurisasi dan sensitif terhadap pH rendah (4.5 atau kurang) dan tidak dapat berkembang biak pada aW 0.94 terutama dengan kombinasi pH rendah. Bakteri ini dapat bertahan pada kondisi beku dan kering. Salmonella sp. dapat memfermentasi sukrosa tetapi jarang adonitol, urea negatif, indol negatif, tidak menghidrolisis urea atau deaminate phenylalamine, membentuk dekarboksilase lisin dan ornithine, negatif uji Voges-Proskauer, dan positif uji methyl red. Salmonella sp. membentuk gas ketika ditumbuhkan di media yang mengandung glukosa. Secara umum, Salmonella sp. memfermentasi non laktosa seperti dulcitol, kecuali Salmonella Arizonae. Umumnya bakteri ini menggunakan sitrat sebagai sumber karbon, kecuali Salmonella Arizonae yang menggunakan malonate sebagai sumber karbon utama (Ray dan Bhunia 2008).
Patogenesis Salmonellosis Habitat bakteri Salmonella sp. adalah di dalam alat pencernaan manusia, dan hewan. Rute penularan terjadi melalui fekal dan oral, akibat mengonsumsi makanan atau minuman tercemar. Salmonella sp. yang berkembang biak di dalam saluran pencernaan akan mengakibatkan radang usus (enteritis). Radang usus terjadi karena proliferasi Salmonella sp. sehingga terjadi kerusakan lamina propria dan menimbulkan diare. Salmonella sp. yang menginfeksi memiliki kemampuan menghasilkan racun cytotoxin dan enterotoxin (Poeloengan et al. 2006). Infeksi Salmonella sp. pada hewan dan manusia dapat menyebabkan penyakit serius atau terjadinya carier. Sejumlah faktor virulensi Salmonella sp. telah diidentifikasi untuk menyerang dan menginfeksi hospes. Mayoritas Salmonella sp. yang motil menggunakan flagela untuk kontak dengan sel inang. Flagela terdapat di salah satu kutub, menyebabkan bakteri dapat melakukan aktivitas bergerak. Faktor virulensi seperti flagela ini banyak digunakan sebagai antigen dalam uji-iji diagnostik seperti enzym linked imunnosorbent assay (ELISA). Patogenesis Salmonella sp. sangat tergantung dari faktor virulensi bakteri yaitu: (1) kemampuan invasi sel, (2) lapisan lipopolisakarida, (3) kemampuan replikasi intrasel, dan (4) kemungkinan perbanyakan toksin. Setelah bakteri masuk dalam saluran pencernaan, organisme tersebut berkoloni di ileum dan kolon, memasuki epitel usus dan terjadi proliferasi epitel dan folikel limfoid. Tahap selanjutnya yaitu menginduksi membran enterosit dan menstimulasi pinositosis organisme (Khoiriyah et al. 2013). Infeksi oral Salmonella sp. pada mamalia ditandai dengan interaksi awal bakteri dalam saluran pencernaan, terutama melalui sel M dan sel epitel. Setelah organisme masuk ke hospes, Salmonella sp. memulai siklus infeksinya dengan menginvasi jaringan limfoid. Kapasitasnya untuk menyerang sel epitel usus non
4 fagosit memberikan perlindungan seluler sehingga mikrob bereplikasi dan bertahan dalam hospes. Salmonella sp. menghasilkan efek cicotoxic yang mengakibatkan rusaknya sel-sel M dan invasi bakteri dalam enterosit akan dilanjutkan ke hati dan limpa (Revolledo 2010).
Gambar 1 Mekanisme invasi Salmonella sp. (Revolledo 2010). Salmonella sp. memiliki kemampuan untuk menghasilkan 3 tipe substansi toxic. Thermolabile enterotoxin mengikat ganglion dan meningkatkan cyclic adenosine monophospate (cAMP) dan sekresi cairan. Cytotoxin merupakan komponen non-lipopolysaccharida pada membran luar yang menghambat sintesa protein sel eukariotik. Endotoxin (lipid A) merupakan komponen lipopolisacharida dinding sel berfungsi mengaktifkan makrofag dan limfosit sehingga memicu serangkaian reaksi biologis seperti demam, leukositosis dan hipotensi (Selimovic et al. 2010).
Salmonellosis pada Reptil Salmonella sp. pertama kali di isolasi dari kadal (Heloderma suspectum) pada tahun 1994. Sebelumnya Salmonella sp. pernah terisolasi dari ular gopher (Pituophis catenifer deseticola) di peternakan kalkun pada tahun 1939. Namun laporan belum dikonfirmasi oleh Organisai Biokimia Salmonella. Hasil laporan menyatakan terdapat 3 serotypes yaitu: Salmonella Panama, S. Meleagridis dan tipe paracolon yang belum teridentifikasi. Kemudian ular dianggap sebagai reservoar utama dari Salmonella sp. dan penyebab terjadinya wabah salmonelosis pada peternakan kalkun (Mitchell dan Shane 2001). Salmonella sp. pada reptil tidak menimbulkan gejala klinis, namun dapat menimbulkan penyakit serius pada manusia. Selama popularitas dan varietas reptil meningkat, maka semakin tinggi salmonellosis terjadi pada manusia. Infeksi bersumber dari hewan eksotik seperti ular, kadal, kura-kura, iguana, katak dan lain sebagainya. Gray (2011) dalam sebuah penelitiannya menyatakan sekitar 40% isolat Salmonella sp. ditemukan pada saluran pencernaan Iguana. Salmonella sp. juga ditemukan pada tanah tempat iguana dipelihara dan juga ditemukan di feses. Reptil liar memiliki prevalensi Salmonella sp. lebih rendah dibandingkan reptil yang dipelihara dalam penangkaran. Sebanyak 88.9% isolat Salmonella sp.
5 ditemukan pada sampel reptil yang dipelihara di pet shop dan sebanyak 58.8% ditemukan pada sampel reptil yang ditangkap dari alam liar (Geue dan Lo¨schner 2002). Salmonella sp. pada hewan reptil dapat terdeteksi di kloaka dan ulas kulit (skin swab) (Pees et al. 2013).
METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian telah dilakukan pada bulan Januari 2015, bertempat di Laboratorium Bakteriologi Bagian Mirobiologi Medis, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesmavet (IPHK), Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (IPB) dan dan bulan Mei 2015 di Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor.
Desain Penelitian Penelitian dibagi menjadi tiga tahap, yaitu (1) pengambilan sampel swab kloaka reptil dari salah satu pet shop di Dramaga dan (2) pengujian sampel swab kloaka reptil di laboratorium terhadap keberadaan Salmonella sp. (3) pengujian menggunakan metode PCR di Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor.
Pengambilan dan Jumlah Sampel Jumlah sampel swab kloaka reptil diambil sebanyak 40 berasal dari 22 spesies reptil. Sampel diambil pada semua reptil yang ada di pet shop tersebut dengan melakukan swab pada kulit daerah kloaka reptil. Setiap sampel dimasukkan ke dalam buffer peptone water (BPW) sebanyak 5 mL sebagai pre-erichment, kemudian diberi label, dan disimpan dalam cool box selama proses transportasi.
Alat dan Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah sampel swab kulit daerah kloaka reptil, BPW, tetrathionate broth/TTB (DifcoTM Tetrathionate Broth Base), bismuth sulfite agar/BSA (OXOID CM 0201), triple sugar iron agar/TSIA (DifcoTM Triple Sugar Iron Agar), tripsin soy agar/TSA, methyl red-Voges Proskauer/MR-VP (OXOID CM 0043), urea broth (OXOID CM 0071), SIM (BBLTM SIM Medium), simmons citrate agar (OXOID CM 0155) phenol red lactose broth (DifcoTM Lactose), phenol red sucrose broth (Fluka Biochemica), dulcitol broth (Merck 1.05990.0050), iodin solution, indikator methyl red, larutan α-naphtol, KOH 40%, larutan herlich, aquades steril, air, sabun, Dettol®, dan alkohol 70%. PureLink® Genomic Digestion buffer, proteinase K, PureLink® Genomic lysis/binding buffer, etanol 96%, PureLink® Genomic washing buffer, PureLink® Genomic elutian buffer, primers (IDT®, 10 pmol/µl), DNA template,
6 master mix (Maxima® Hot Start Green), aquadest (DNAse, RNAse free), agarose (Promega®), ethidium bromide (Applichem®), dan DNA ladder (Vivantis®). Alat yang digunakan ialah jas lab, sarung tangan, masker, plastik steril tahan panas, cotton swab, cawan Petri (diameter 10 cm), tabung reaksi (volume 15 mL), sumbat dan rak tabung reaksi, labu Erlenmeyer (volume 250 mL), gelas ukur (volume 250 mL dan 1000 mL), pipet volumetrik (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, dan 20 mL), syringe 5 mL, botol media (volume 500 mL dan 1000 mL), gunting, pinset, jarum inokulasi (ose), pembakar Bunsen, pH meter, timbangan, pengocok tabung (vortex), inkubator, penangas air, autoklaf, lemari steril, lemari pendingin, kotak pendingin, kolom spin, PCR tube, mikropipet, UV illuminator, dan freezer.
Metode Penelitian Prinsip pengujian Salmonella sp. di laboratorium meliputi tahap pertumbuhan Salmonella sp. pada media selektif dengan pre-enrichment (pra-pengayaan) dan enrichment (pengayaan), dilanjutkan dengan isolasi dan identifikasi, meliputi uji konfirmasi menggunakan metode uji biokimia dan metode polimerase chain reaction (PCR). Setiap proses pengujian selalu disertai dengan menggunakan kontrol positif S. Typhimurium ATCC 14028.
Tahap Pre-Enrichment (Pra-Pengayaan) Sampel diambil dengan melakukan swab pada kulit daerah kloaka reptil, kemudian hasil swab dimasukkan ke dalam tabung berisi 5 mL BPW kemudian diinkubasipada temperatur 37 °C selama 24 jam.
Tahap Enrichment (Pengayaan) Biakan pra-pengayaan dihomogenkan menggunakan vortex kemudian dipindahkan 1 mL ke dalam 10 mL media TTB kemudian diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 48 jam.
Tahap Isolasi dan Identifikasi Sebanyak satu ose TTB diinokulasi pada BSA kemudian diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam. Inkubasi BSA dapat diperlama 1 x 24 jam untuk memperjelas hasil yang didapat. Koloni Salmonella sp. pada BSA terlihat berwarna hitam dan kadang metalik, media di sekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam. Identifikasi dilakukan pada koloni yang diduga kemudian diinokulasikan ke TSIA. Inokulasi dilakukan dengan cara menusuk ke dasar media agar, selanjutnya digores pada agar miring. Kemudian media diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam.
7 1. Homogenisasi dan prapengayaan
2. Seleksi pengayaan
3. Plating pada media selektif
4. Identifikasi
5. Konfirmasi • Biokimiawi • PCR
Gambar 2 Diagram alur pengujian Salmonella sp. menurut International Organization for Standardization 6579: 2002 dengan modifikasi minor
Uji Konfirmasi Biokimia Konfirmasi Salmonella sp. dengan uji biokimia dilakukan dengan menginokulasi koloni positif media TSIA pada masing–masing media uji biokimia yaitu SIM, citrate, urease, mannitol broth, glucose broth, sucrose broth, lactose broth, dulcitol broth, dan MR-VP kemudian diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 24 jam. Intepretasi hasil uji biokimia Salmonella sp.dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Reaksi biokimia Salmonella sp. (BSN 2008) Uji substrat Urease Phenol red dulcitol broth Uji indol
Simmons sitrat
Phenol red lactose broth Phenol red sucrose broth
Uji Voges-Proskauer
Uji methyl red
Hasil reaksi Positif Negatif Merah muda sampai Tetap kuning Merah Warna kuning Tidak berubah warna dengan/tanpa gas dan tidak terbentuk gas Permukaan warna Permukaan warna Merah setelah Kuning setelah penambahan reagen penambahan reagen Pertumbuhan warna Tidak ada biru pertumbuhan dan tidak ada perubahan Warna kuning Tidak berubah warna dengan/tanpa gas dan tidak terbentuk gas Warna kuning Tidak berubah warna dengan/tanpa gas dan tidak terbentuk setelah penambahan gas setelah reagen penambahan reagen Merah muda sampai Tidak berubah warna Merah setelah setelah penambahan penambahan reagen reagen Merah menyebar Warna kuning Menyebar
Salmonella -
-
bervariasi
-
-
-
+
8
Uji Konfirmasi Isolat Salmonella Menggunakan Metode PCR Prosedur PCR digunakan untuk mengonfirmasi isolat yang diduga Salmonella dari uji-uji biokimiawi. Metode ini mendeteksi keberadaan agen berbasiskan materi genetik berupa DNA sehingga memiliki spesifitas uji yang tinggi. Nilai spesifitas yang tinggi mengakibatkan teknik PCR dapat digunakan sebagai uji konfirmasi. Semua isolat yang diduga Salmonella pada uji biokimiawi dilanjutkan dengan pengujian menggunakan teknik PCR. Teknik PCR diawali dengan ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA yang dilakukan mengikuti protokol pada prosedur PureLink® genomic DNA Kits. Isolat yang diduga Salmonella pada uji biokimiawi dikultur pada 5 mL BHI selama 24 jam pada suhu 37 °C. Sebanyak 1 mL kultur disentrifugasi 10000 rpm selama 5 menit. Pelet diresuspensikan dengan menambahkan 180 µl PureLink® genomic digestion buffer dan 20 µl proteinase K, kemudian diinkubasi 55 °C selama 30 menit. Setelah itu ditambahkan 20 µl RNAase A dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Suspensi ditambahkan dengan 200 µl PureLink® genomic lysis/binding buffer dan 200 µl etanol 96% kemudian disentrifugasi 10000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 600 µl suspensi dimasukkan ke dalam kolom spin dan disentrifugasi 10000 rpm selama 1 menit kemudian dicuci sebanyak 2 kali menggunakan 500 µl PureLink® genomic washing buffer. DNA yang terdapat pada kolom spin kemudian dilarutkan menggunakan 200 µl PureLink® genomic elutian buffer. Hasil ekstraksi DNA digunakan sebagai DNA template untuk proses PCR. Prosedur amplifikasi PCR fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan primers ompC, forward (OMPCF) 5′-ATC GCT GAC TTA TGC AAT CG-3′ dan reverse (OMPCR) 5′-CGG GTT GCG TTA TAG GTC TG-3′). Primers yang dipakai mengamplifikasi protein C pada bagian outer membrane dari Salmonella sp. PCR dilakukan dengan total volume 20 µl larutan reaksi yang terdiri dari 7.2 µl aquadest (DNAse, RNAse free), 10 µl 2× PCR master mix (Maxima® Hot Start Green), 0.8 µl primers (IDT®, 10 pmol/µl), dan 2 µl DNA template. PCR dilakukan dengan 1 siklus pada suhu 95 °C selama 3 menit (initial denaturasi), 35 siklus pada suhu 95 °C selama 30 detik (denaturasi), 50 °C selama 30 detik (annealing) dan pada suhu 72 °C selama m1 menit (extention), dan dilanjutkan dengan 1 siklus pada suhu 72 °C selama 5 menit (final extention). Produk PCR (amplikon dengan panjang 204 bp) diseparasi menggunakan 1.5 % agarose (Promega®) yang telah ditambahkan ethidium bromide (Applichem®) 0.5 µg/mL pada tegangan 120 V selama 50 menit dengan menggunakan marker 100 bp DNA ladder (Vivantis®). Hasil elektroforesis selanjutnya dilihat dengan menggunakan UV illuminator.
Analisis Data Hasil pengujian laboratorium terhadap Salmonella sp. dianalisis secara deskriptif.
9
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Identifikasi Bakteri Tabel 2 menunjukan sebanyak 22 sampel dari 40 sampel yang diuji memberikan hasil positif pada inokulasi di media bismuth sulfite agar (BSA). Koloni yang diduga Salmonella sp. memiliki warna keabu-abuan atau kehitaman (BSN 2008). Menurut BAM (2007), Salmonella sp. dapat menghasilkan koloni yang besar dengan inti bewarna gelap mengkilap atau koloni terlihat hitam keseluruhan (Gambar 3). Bakteri Salmonella sp. dapat memproduksi hidrogen sulfida yang dapat menyebabkan media menghitam karena produksi ferrous sulphides. Ferrous sulphides menyebabkan dekarboksilasi lisin dan menghasilkan reaksi alkali (warna ungu) atau reaksi netral di dasar medium. Bakteri S. Typhimurium ATCC 14028 digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian ini. Tabel 2 Sampel yang diduga positif Salmonella sp. pada BSA No
Kode
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1 2 3 4 5 7 8 10 12 14 19 24 25 27 28 29 31 32 33 35 36
Nama Ilmiah Gonyosoma oxycephala Ptyas mucosa Ptyas mucosa Ptyas mucosa Ptyas mucosa Varanus salvator Varanus salvator Pyton curtus Pyton reticulatus Pyton reticulatus Eublepharis macularius Ahaetulla prasina Ahaetulla prasina Ptyas coros Eublepharis macularius Pyton curtus Boiga dendrophila Morelia trancyae Morelia trancyae Boa contrictor Varanus salvadorii
Sampel Nama populer Ular Hijau Bakau Ular Jali Kembang Ular Jali Kembang Ular Jali Kembang Ular Jali Kembang Biawak Biawak Ular Bipong Karamel Ular Retik Ular Retik Kadal Gurun Ular Pucuk Ular Pucuk Ular Coros Kadal Gurun Ular Bipong Ular Cincin Emas Ular Halmahera Ular Halmahera Ular Boa Biawak Papua
Jenis Hewan Ular Ular Ular Ular Ular Biawak Biawak Ular Ular Ular Kadal Ular Ular Ular Kadal Ular Ular Ular Ular Ular Biawak
10
Gambar 3 Koloni Salmonella sp. pada media BSA Hasil penelitian Waltman (1999) menunjukan bahwa persentase positif cemaran Salmonella sp. pada media BSA dinilai rendah. Hal ini disebabkan karena mikrob selain Salmonella sp. dapat tumbuh pada media ini. Koloni yang diduga Salmonella sp. pada media BSA selanjutnya dikultur pada media TSIA. Kultur pada media TSIA bertujuan sebagai uji presumtif dalam mengidentifikasi Salmonella sp. Hasil positif pada media TSIA sebanyak 5 sampel dari 21 sampel yang diuji (Tabel 3). Sampel positif Salmonella sp. pada media TSIA menurut BAM (2007) ditandai dengan bagian permukaan miring (slant) berwarna merah/alkalin (reaksi basa), bagian butt berwarna kuning (reaksi basa), dan memproduksi H2S (kehitaman pada agar hingga menutupi warna dasar agar). Warna hitam yang muncul pada media TSIA disebabkan oleh media TSIA mengandung Fe, bakteri Salmonella sp. menghasilkan H2S sulfur yang dihasilkan dari gas H2S bereaksi dengan Fe pada media TSIA menjadi FeS yang berwarna hitam (BSN 2008). Tabel 3 Sampel yang diduga positif Salmonella sp. pada TSIA No 1 2 3 4 5
Kode Sampel 4 19 25 31 35
Nama Ilmiah Ptyas mucosa Eublepharis macularius Ahaetulla prasina Boiga dendrophila Boa contrictor
Asal Sampel Nama populer Ular Jali Kembang Leopard Gecko Ular Pucuk Ular Cincin Emas Ular Boa
Jenis Hewan Ular Kadal Gurun Ular Ular Ular
Uji Konfirmasi Biokimiawi Uji konfirmasi biokimiawi dilakukan untuk menguatkan dugaan bahwa bakteri yang diisolasi merupakan bakteri Salmonella sp. Berdasarkan hasil uji biokimia dari lima isolat yang telah diisolasi didapatkan sebanyak tiga isolat yang memiliki karakteristik sebagai Salmonella sp. Menurut SNI 2897:2008, Salmonella sp. tidak mampu memfermentasi sukrosa dan laktosa tetapi mampu
11 memfermentasi manitol dan glukosa. Hasil fermentasi positif ditandai dengan perubahan warna dasar merah menjadi kuning akibat produksi asam hasil metabolisme bakteri. Fermentasi dulcitol menunjukan hasil yang bervariasi, karena secara umum Salmonella sp. memfermentasi non lactose seperti dulcitol, kecuali Salmonella Arizonae yang secara rutin memfermentasi gula ini. Hasil uji citrate pada Salmonella sp. menunjukan hasil negatif. Hal tersebut juga terjadi pada uji Voges-Proskauer dan uji urease dengan ditandai tidak adanya perubahan warna. Hasil uji positif didapat pada uji methyl red yang ditandai dengan adanya penyebaran warna merah pada larutan. Gambar 4 menyajikan hasil pengamatan uji biokimia.
Gambar 4 Hasil Uji Biokimia dari kiri ke kanan hasil uji Indol, uji citrate, uji urease, uji phenol red manitol broth, uji phenol red glukose broth, uji phenol red sucrose broth, uji phenol red lactose broth, uji phenol red dulcitol broth, uji Voges-Proskauer, dan uji methyl red
Uji Konfirmasi Isolat Salmonella Menggunakan Metode PCR Analisis hasil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa yang berperan sebagai sirkuit elektrik untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan jumlah nukleotida penyusunnya. Semakin kecil ukuran pasang basa nukleotidanya, akan semakin mudah bermigrasi dan berada di bagian gel yang dekat dengan anoda. Pita-pita DNA yang terbentuk diamati dengan alat UV transilluminator. Visualisasi DNA pada elektroforesis dilakukan menggunakan pewarna yang dapat berfluoresensi yaitu etidium bromida yang merupakan molekul planar yang dapat menyisip di antara ikatan basa DNA. Etidium bromida yang terkonsentrasi dalam fragmen DNA dan berfluoresensi pada cahaya UV. Sampel yang menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran sekitar 204 pasang basa menandakan bahwa sampel tersebut positif mengandung Salmonella sp. (Radji et al 2010). Hasil elektroforesis terhadap produk yang dihasilkan melalui amplifikasi PCR ditunjukkan pada Gambar 5.
12
Gambar 5 Hasil elektroforesis sampel yang diduga Salmonella sp. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode PCR menggunakan primers ompC, forward (OMPCF) 5′-ATC GCT GAC TTA TGC AAT CG-3′ dan reverse (OMPCR) 5′-CGG GTT GCG TTA TAG GTC TG-3′) dapat mendeteksi Salmonella sp. yang ditunjukkan dengan hasil amplifikasi fragmen DNA berukuran sekitar 204 pasang basa. Sebanyak lima sampel yang diperiksa, terdeteksi Salmonella sp. sebanyak tiga sampel yaitu sampel 4, 19, dan 35. Hasil positif yang diuji pada metode PCR menunjukan hal yang sama pada hasil uji biokimiawi. Penelitian ini menunjukan bahwa uji biokimiawi memerlukan waktu yang cukup lama dibandingkan menggunakan metode PCR. Tabel 4 Persentase prevalensi Salmonella sp. pada reptil Asal Sampel Ular Kadal Biawak Labi Labi Total
Total Sampel 24 11 4 1 40
Sampel Positif 3 0 0 0 3
Persentase Prevalensi 12.5% 0% 0% 0% 7.5%
Prevalensi keberadaan Salmonella sp. pada 40 sampel reptil yang diuji pada penelitian ini didapatkan 7.5% mengandung bakteri Salmonella sp. Berdasarkan hasil penelitian, sampel positif Salmonella sp. yang didapatkan pada penelitian ini, berasal dari reptil jenis ular (Ptyas mucosa, Ahaetulla prasina, dan Boa contrictor). Menurut Schröter (2004), prevalensi kejadian Salmonella sp. pada ular sangat tinggi terutama pada sampel fecal. Penelitian lainya telah dilaporkan Scheelings et al. (2011) bahwa prevalensi Salmonella sp. pada ular di dunia mencapai 92.5% dan 69.2% di Australia. Persentase kontaminasi Salmonella sp. pada sampel swab disekitar kulit kloaka reptil cukup rendah. Hal ini dapat disebabkan lingkungan kandang yang bersih. Rendahnya persentase paparan juga dapat disebabkan oleh ketidakmampuan Salmonella sp. berkompetisi secara baik dengan mikrob-mikrob umum oleh karena itu pertumbuhannya terhambat dengan adanya bakteri-bakteri
13 lain (Saptarini 2009). Potensi kompetisi antar bakteri sering terjadi terutama dalam mendapatkan nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan perkembangan.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan hasil penelitian, prevalensi keberadaan Salmonella sp. pada sampel swab kulit di sekitar kloaka reptil khususnya pada reptil yang berada di pet shop sebanyak 7.5%. Hasil positif didapatkan pada sampel yang berasal dari ular.
Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi serotype bahkan sub serotipe Salmonella sp. yang ditemukan pada reptil menggunakan teknik labolatorium yang lebih mutakhir seperti sekuensing.
14
DAFTAR PUSTAKA [BAM] Bacteriological Analytical Manual. 2007. Salmonella. [diunduh 2015 Mei 06]. Tersedia pada : http://www.fda.gov/downloads/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/ Bacteriological%20AnalyticalManualBAM/UCM244774.pdf [BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2008. Metode pengujian cemaran mikroba dalam daging, telur, dan susu, serta hasil olahannya. SNI 2897:2008. Jakarta (ID): Badan Standardisasi Nasional. Geue L, Löschner U. 2002. Salmonella enterica in reptiles of German and Austrian origin. Veterinary Microbiology. 84(1-2):79–91. Gray TZ. 2011. Update: Reptile and Salmonella. Journal of Exotic Pet Medicine. 20(1):14–17. Halliday T, Adler K. 2000. The Encyclopedia of Reptiles and Amphibians. New York (USA): Facts on File Inc. Harris JR, Neil KP, Behravesh CB, Sotir MJ, Angulo FJ. 2010. Recent multistate outbreaks of human Salmonella infections acquired from turtles: a continuing public health challenge. Clinic Infection Diseases. 50:554–559. Khoiriyah A, Triyana, Ngatini. 2013. Bahaya Salmonella bagi kesehatan. Buletin Laboratorium Veteriner (Velabo). 30(2):1-44. Mitchell MA, Shane SM. 2001. Salmenella in reptiles. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 10(1):25-35. O’Shea M, Halliday T. 2001. Reptiles and Amphibians. London (UK): Dorling Kindersley. Pees M, Rabsch W, Plenz B, Fruth A, Prager R, Simon S, Schmidt V, Münch S, Braun PG. 2013. Evidence for the transmission of Salmonella from reptiles to children in Germany, July 2010 to October 2011. Euro Surveill. 18(46):110. [diunduh 2015 Jan 12]. Tersedia pada : hhttp://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20634. Poeloengan M, Komala I, Noor SM. 2006. Bahaya Salmonella Terhadap Kesehatan. Lokakarya Nasional Penyakit Zoonosis. Radji M, Puspaningrum A, Sumiati A. 2010. Deteksi cepat bakteri Escherichia coli dalam sampel air dengan metode polymerase chain reaction menggunakan primer 16e1 dan 16e2. Makara Sains. 14(1):9-43 Ray B, Bhunia A. 2008. Fundamental Food Microbiology 4th Edition. Florida (USA): CRC Press Tylor & Franciss Group. Revolledo L. 2010. Salmonella, Colonization of gastrointestinal tract. Veterinary Portal [Internet]. Veterinay digital [diunduh 2015 Jan 12]. Tersedia pada: http://www.veterinariadigital.com/uk/noticia.php?id=14. Saptarini K. 2009. Isolasi Salmonella spp. pada sampel daging sapi di wilayah bogor serta uji ketahanannya terhadap proses pendinginan dan pembekuan [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Selimovic BM, Babic T, Stojanovic P. 2010. Salmonella Enteritidis-Actualities and Importance. Journal of Acta Medica Medianae. 49(3):71-75. Scheelings TF, Lightfoot D, Holz P. (2011). Prevalence of Salmonella in australian reptiles. Journal of Wildlife Diseases 47(1):1-11.
15 Schröter M. 2004. Pet snakes as a reservoir for Salmonella enterica subsp. Diarizonae (serogroup IIIb). Applied and Environmental Microbiology. 70(1):613-615 Waltman WD. 1999. Methods for isolating Salmonella from poultry and the poultry environment. dalam: A.M. Saeed edt. Salmonella enteric serovar Enteritidis in Humans and animals. Iowa State University Press. Ames. US pp. 419-432.
16
RIWAYAT HIDUP Penulis bernama Erfiandini Eka Puspita dilahirkan di Baturaja Sumatera Selatan tanggal 28 April 1993 dari ayah A Kohar Lutfi dan ibu Erna Hastuti. Penulis adalah putri pertama dari tiga bersaudara. Penulis menempuh pendidikan mulai jenjang TK Sandy Putra Telkom (1997-1999), Sekolah Dasar Negeri 08 OKU (1999-2005), Sekolah Menengah Pertama Negeri 01 OKU (2005-2008), dan Sekolah Menengah Atas Negeri 04 OKU (2008-2011). Tahun 2011 penulis melanjutkan pendidikan S1 di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN undangan. Semasa perkuliahan, penulis aktif di beberapa organisasi diantaranya Himpunan Minat dan Profesi Hewan Kesayangan dan Satwa Akuatik (2013-2014), dan Ikatan Mahasiswa Kedokteran Hewan Indonesia (2013-2014). Penulis pernah menjadi asisten praktikum Histologi Veteriner II pada tahun ajaran 2014/2015. Penulis juga pernah meraih sebagai 10 besar mahasiswa berprestasi Fakultas Kedokteran Hewan. Bulan Januari–Mei penulis melaksanakan Penelitian di Laboratorium Bakteriologi Bagian Mirobiologi Medis, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesmavet (IPHK), Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (IPB) dan di Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor dengan judul Isolasi dan Identifikasi Salmonella sp. pada Reptil.
