Prosiding Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian Tahun 2004
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BRUCELLA ABORTUS PENYEBAB KEGUGURAN PADA SAPI SUPARTONO Balai Penelitian Veteriner, Jl R.E Martadinata 30, Bogor 16114
RINGKASAN Pengamatan kasus keluron atau keguguran yang di sebabkan oleh Brucella abortus bisa deteksi lebih awal dengan uji Rose Bengal Plate Test ( RBPT ) pada serum dan Milk Ring Test ( MRT ) pada susu . Sapi penderita Brucellosis biasanya mengalami keguguran pada usia kebuntingan muda yaitu 5 – 6 bulan . Penurunan produksi susu pada sapi perah bisa terjadi . Brucellosis dapat di tularkan lewat sekresi cairan uterus ke hewan lain sehingga menambah penyebaran kasus Brucellosis. Diagnosa awal brucellosis dengan uji RBPT dan MRT cukup sensitive untuk mengetahui kejadian infeksi pada kelompok sapi. Uji uji pengikatan komplemen atau Complement Fixation Test (CFT) , merupakan uji lanjutan, akan tetapi kelemahan dari uji tersebut adalah tidak dapat membedakan titer antibody dari sapi hasil vaksinasi atau dari infeksi alam. Oleh karena itu di lakukan pengujian lebih lanjut dengan metoda ELISA (Enzyme Lynked Immuno Sorbent Assay ) yang pada prinsipnya adalah juga mengukur titer antibody Pada serum terhadap Lypo Poly Sacharide . Selain itu uji pupukan kuman dapat dilakukan dengan mengambil contoh susu yang dicurigai dan dibiakkan pada media Trypticase broth dengan penambahan supplemen antibiotika yang selanjutnya biakan kuman yang tumbuh di pelajari berdasarkan sifat dan karakteristik kuman Brucella. Kuman B. abortus dapat disimpan dalam bentuk kering beku ( Freeze – Dried ) Kata Kunci : Keguguran ,Milk Ring Test ,RBPT, CFT, ELISA.
PENDAHULUAN Penyakit keluron atau keguguran pada sapi di sebabkan oleh kuman Brucella abortus hal ini sangat merugikan dan juga menyebabkan sterilitas atau infertilitas serta kematian dini pada pedet (Hubert et al 1970) , pada kambing terdapat Brucella melitensis pada domba Brucella ovis, pada babi Brucella suis di laporkan bahwa kejadian Brucellosis pada sapi bisa mencapai 0,17 – 11,8 % (Sudibyo dan Ronoharjo,1989) . Selain kerugian ekonomi yang tinggi juga berpengaruh buruk bagi kesehatan masarakat karena hal ini kuman Brucella dapat menular pada manusia (Zoonosis) kejadian ini banyak di temukan pada orang orang yang bekerja di rumah pemotongan hewan. Pemeriksaan lebih awal atau monitoring penyebaran Brucella menjadi amat penting selain program vaksinasi harus di laksanakan untuk menekan penyebaran Brucella (Anonymus 1981). Sumber utama penularan Brucella pada sapi di antaranya sekresi cairan uterus ,jaringan placenta , janin, kolostrum dari susu penderita atau semen beku yang tercemar Brucella , pada wilayah penyebaran ternak yang tidak terkendali terutama tidak adanya pengawasan penyakit , screening test dapat di lakukan pada daerah produksi susu sebelum susu di kirim pada industri pengolahan susu dapat di lakukan pemeriksaan Milk Ring Test (MRT ) tetapi harus di lanjutkan dengan pemeriksaan individu pada sapi mana saja yang terinfeksi dengan pengujian serologi test RBPT atau Rose Bengal Plate Test dan uji CFT Complement Fixation Test , bahkan lebih teliti lagi yaitu pengujian ELISA ( Enzyme Linked Immuno sorbent assay ).
114
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Prosiding Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian Tahun 2004
Isolasi kuman dari susu dapat di lakukan dengan mengambil langsung dari sapi penderita dan di lanjutkan dengan pemupukan pada media selective TSA dengan penambahan supplemen antibiotik untuk menekan pencemaran dari bakteri lain. Sifat dari masing masing isolat yang berhasil di isolasi di pelajari patogenitas serta sifat sifat lain dengan uji bio kimia dan kuman yang berhasil di isolasi kemudian di simpan. Agar miring TSA atau penyimpanan untuk jangka waktu lama dilakukan dengan metoda kering beku atau Lyopilisasi .
BAHAN DAN CARA Sampel Sampel susu dari hasil survey lapang penelitian Brucella di koleksi dengan cara aseptis di sertai pendingin selama proses koleksi untuk mencegah pencemaran yang dapat mengganggu pada saat proses isolasi , sesampai di laboratorium semua susu di lakukan screening test dengan metoda MRT , semua hasil di catat dalam buku kemudian dari susu yang bereaksi positive umumnya positive + 2 dan + 3 akan besar kemungkinan bisa di dapatkan isolat Brucella yang di inginkan , untuk contoh susu sebelumnya di putar dahulu 3000 RPM selama 30 menit kemudian lemak yang terpisah pada bagian atas di koleksi bersama pada sedimen atau pellet bagian bawah tabung sentrifuge , dengan menggunakan kapas lidi atau cotton bud campuran tadi di pindahkan pada media TSY broth dan sample di biakan menggunakan anaerobic jar di inkubasi pada lemari pengeram bersuhu 370 C selama 3 hari sampai 11 hari setelah itu di pindahkan atau di sub kultur pada media agar petri. Pengamatan koloni pada agar TSA dapat di lihat berdasarkan sifat sifat kuman yaitu gram negative. Untuk pemeriksaan selanjutnya sebagai uji penegasan di lakukan koleksi darah sapi individu untuk pemeriksaan serologi . Bahan Media Pertumbuhan dan Supplement : Medium Trycticase soy broth ; Supplement antibiotik dari oxoid ; Trypticase soy agar TSA ; Bacto agar ; Tabung bejana Anaerobik ; Sentrifuge ; Antigen Rose Bengal ; Antigen milk ring tes ; Darah domba normal
Isolasi kuman pada Agar TSA dan koloni Morpologi Kuman Brucella tumbuh dengan persaratan husus seperti perlunya penambahan ciri supplement dan membutuhkan gas CO 2 setelah tumbuh baik dapat di ketahui dengan yaitu kuman muncul pada hari ketiga pada agar TSA terlihat transparan bening atau tembus cahaya , permukaan cembung ,pengecatan gram terlihat batang lembut coccoid atau antara batang dan coccus, koloni dapat di lakukan uji selanjutnya bila perlu dengan uji agglutinasi dengan serum monospesifik A (Abortus) dan serum monospesific M (Melitensis) .
Sifat morfologi Brucella abortus Kuman Brucella abortus pada sdapi di Indonesia yang berhasil di isolasi adalah B abortus biotype I ( Setiawan 1992) . Namun tidak lepas kemungkinan dengan banyaknya impor sapi dari luar bisa terdapat biotype lain seperti yang sudah di kenal terdapat 9 biotype yaitu biotype 1 sampai 9 yang dapat di bedakan berdasarkan uji bio kimia (Alton et.al 1988 ) . Secara morpologi B. abortus bersifat gram negative , tidak bergerak, tidak berspora , bentuk
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
115
Prosiding Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian Tahun 2004
kokobasillus dengan panjang 0,6 µm – 1,5 µm . Sel kuman terlihat sendiri sendiri , koloni kuman bulat transparan ,permukaan cembung, diameter koloni 1-2 mm dan bisa berlanjut sampai 5 –8 mm, Babortus termasuk genus Brucella dan di bawah familli Brucellacea ( Carter 1973 ).
Diagnosis Brucella dengan uji Serologi Untuk mengetahui apakah ternak yang di pelihara petani bebas dari Brucella sangatlah penting , diagnosis terhadap Brucella dapat di gunakan uji konvensional (RBPT dan CFT ) maupun uji ikatan primer seperti ELISA, prinsipnya sama yaitu mengukur antibody terhadap Lipopoly Sacharide LPS ( Dohoo et al, 1986 ).
Diagnosis Brucella dengan RBPT (Rose Bengal Plate Test) Dibutuhkan beberapa ml darah yang di ambil lewat vena jugolaris atau bisa juga vena di bawah tulang ekor di antara ruas ekor , darah yang di koleksi di proses hingga di peroleh serum dengan menggunakan mikropippet darah di ambil sebanyak 1 tetes atau 0,25 µl di sertakan pula serum kontrol positive lalu di simpan pada tempat cawan hemagglutinasi , kemudian tambahkan juga antigen berwarna Rose Bengal sebanyak 1 tetes l lihat terjadinya agglutinasi setelah campuran tadi di aduk dengan alat agglutinator selama 4 menit.
Diagnosis Brucella pada susu dengan MRT (Milk Ring Test) Produksi susu pada area peternakan dalam skala kecil atau pada area besar dapat di periksa dengan mudah , namun pemeriksaan ini hanya untuk screening dimana saja lokasi yang terinfeksi Brucella yang selanjutnya di ikuti dengan uji penegasan yaitu serologi.Untuk pemeriksaan di butuhkan sebanyak 1 ml susu segar atau susu koleksi yang tidak lebih dari 72 jam , langkah pemeriksaan ini adalah sebagai berikut: - Dengan menggunakan pipet ambil 1 ml susu lalu tempatkan pada tabung reaksi kecil - Ditambahkan sebanyak 1 tetes antigen berwarna (biru) pada susu tersebut lalu aduk menggunakan pengaduk vortex , Inkubasi susu tersebut pada suhu 370 C selama 1 jam , Baca reaksi perubahan warna yang terbentuk pada lapisan krim susu di bagian atas dengan kriteria sbb; 1+ Masih terdapat warna kebiruan pada campuran susu dan sedikit ring yang terbentuk.; 2+ Sedikit sekali warna birunya ( antigen ) pada campuran susu dan ring terlihat agak jelas ; 3+ Campuran susu dan antigen menjadi tidak berwarna menjadi putih bersih terbentuk ring / cincin warna biru terlihat jelas.
Uji Pengikatan Komplemen / Complement Fixation Test Pengujian dengan serologi Pengikatan komplemen banyak di gunakan untuk mendiagnosa penyakit Brucellosis pada sapi,kambing dan domba, pada prinsipnya di perlukan enam komponen utama sebagai penunjang, yang mana satu sama lain saling terkait, artinya bila salah satu komponen tidak tepat/ salah mengakibatkan tidak bereaksi dengan sempurna, keenam komponen tersebut adalah Antigen ;yang terbuat dari suspensi sel kuman Brucella abortus yang di larutkan dalam phenol 0,5 % , Larutan BBS ( Barbital Buffered saline ) ,
116
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
Prosiding Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian Tahun 2004
Larutan Alsever; Campuran glukosa ,nacl,sodium sitrat, sitric acid , Komplemen marmot , Eritrosit domba dan Hemolisin serum kelinci. Untuk melakukan pengujian di gunakan cawan mikro yang berdasar cembung,contoh serum dan campuran komponen tersebut di reaksikan pada kondisi tertentu pada suhu berfariasi sehingga terjadi reaksi, yaitu terjadinya hemolysis atau gumpalan yang mengendapdengan reaksi yang berbeda beda dari hemolysis sempurna dan tidak terjadinya hemolysis.
HASIL DAN PEMBAHASAN Brucella abortus dapat di ketahui dengan ada atau terjadinya keguguran atau keluron pada usia kebuntingan muda yaitu sekitar +/-5- 6 bl , untuk penegasan keguguran diperlukan pemeriksaan penyaringan dan dapat dilakukan pada susu yang di uji dengan metoda Milk Ring Test selanjutnya dari pemeriksaan screening tersebut dapat dilakukan uji pupukan kuman untuk isolasi dan identifikasi dengan media TSA + supplemen antibiotika , isolat yang di dapat di pelajari sifat dan karakteristiknya sampai biotyping . pada Tabel 1 di uraikan media yang di uji mulai dari karbohidrat sampai bio kimia dan bio typing , beberapa isolat dihasilkan dari pupukan asal susu segar . Untuk uji penegasan yang lebih teliti lagi dapat dilakukan dengan pengambilan darah individu dilanjutkan dengan uji serologi secara RBPT , CFT , dan ELISA. Tabel 1. Identifikasi dan Perbedaan Biovar dari genus dan species Brucella yang berhasil di isolasi survei lapang dan menurut ( Alton )1988 No. Samp
Gram Stain
Catalase
Oxidase
urease
Nitrate
Citrate
B .fuchsin
Agglu A
Con trol
Neg – batang
+
+
+
+
-
404
neg
+
+
+
+
-
+
+
407
Neg
+
+
+
+
-
-
A
409
Neg
+
+
-
+
+
+
+
414
Neg
+
+
-
+
+
+
-
473
Neg
-
+
-
-
+
+
+
459
Neg
+
-
+
-
+
-
+
+
501
Neg
+
-
-
+
-
-
+
2
Motilitas
H2S
Thionin
+
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
CO
Keterangan : no 404 Termasuk Biotype 1; 407 Termasuk Biotype 2; 409 Termasuk Biotype 3; 414 Termasuk Biotype 5; 473 Termasuk Biotype 6
KESIMPULAN Dari pengambilan susu yang di teliti dapat di isolasi dan identifikasi Brucella abortus kemudian di pelajari sifat dan karakteristik dengan uji bio kimia dan biotyping. Serologi test
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
117
Prosiding Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Pertanian Tahun 2004
mulai dari RBPT,CFT dan ELISA sebagai uji penentu / penegasan isolat kuman di isolasi lalu di simpan dalam bentuk kering beku/ Lyopilisasi.
UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih banyak di sampaikan pada peneliti di lab Bakteriologi unit Brucella yaitu Drh. Susan Maphilindawati Noor Mvsc , Dr. Suripto Mvsc dan juga tidak lupa pada almarhum Drh Agus Sudibyo sebagai peneliti di Brucella untuk di kenang pada saat penulis membantu pada pelaksanaan penelitian Brucella sehingga dapat selesai studynya . Dan penulis juga tidak lupa berterima kasih pada team penilai atau pembahas pada penulisan makalah ini hingga dapat di presentasikan pada saatnya nanti.
DAFTAR PUSTAKA Alton,G,G.L.M, Jones,R.D . Angus and J.M..Verger 1988 Technique for the Brucellosis Laboratory. Institute National De La Recherche Agronomique , Paris Bulletin Epidemiologi Veteriner , Bina Direktorat Kesehatan Hewan 1991 Dirjen Peternakan Jakarta Carter , G.R 1973. Outline of Veterinary Bacteriology annd Mycology .Los Angeles 177p Dohoo.I,R ,P.f. Wright ,G. M Ruckerbaner ,B,S, Samaghi, F,J. Robertson ,and L. B. Forbes, 1986 . A Comparison of Five serological test for Bovine brucellosis Hubbert , W. T ,G.D. Booth, W, D . Bolton ,H.W . Dunne,K.Mc.Entee, R.E. Smith and M.E. Tourelotte. 1970. Bovine abortion in five north – eastern states, 1960 – 1970 Evaluation of diagnostic laboratory data, cornell .Vet . 63;291 – 316 Setiawan ,E. D 1992 study tentang beberapa sifat biologis brucella abortus isolat lapang. Disertasi Doktor . Program pasca sarjana . Institut Pertanian Bogor . Sudibyo. A. P. Ronoharjo ,B,B. Patten dan Y, Mukmin .1991. Status brucellosis pada sapi potong di Indonesia . Penyakit Hewan xxiii (41); 18-22
118
Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan
