HŐSOKKFEHÉRJÉK ELLENI ANTITESTEK SZEREPE KÜLÖNBÖZŐ AUTOIMMUN BETEGSÉGEKBEN
Doktori értekezés Dr. Horváth Laura Témavezető: Prof. Dr. Füst György Semmelweis Egyetem, Budapest Tudományági Doktori Iskola: Molekuláris Orvostudományok 2002
1
TARTALOMJEGYZÉK
2.
1. ÖSSZEFOGLALÁS
4.
2. SUMMARY
5.
3. BEVEZETÉS
6.
4. IRODALMI HÁTTÉR
7.
4.1. A hősokkfehérjék általános jellemzői
7.
4.2 Autoimmunitás
9.
4.2.1. Természetes autoimmunitás
9.
4.2.2. Pathogén autoimmunitás, autoimmun betegségek kialakulása
9.
4.3. Hősokkfehérjék elleni immunitás
11.
4.3.1. A hősokkfehérjék elleni immunitás fiziológiás szerepe
11.
4.3.2. A hősokkfehérjék elleni immunitás pathogén szerepe
12.
4.3.3. Hősokkfehérjék elleni immunreakcióra vonatkozó irodalmi adatok szisztémás autoimmun betegségekben
15.
4.3.4. Hősokkfehérjék elleni immunreakcióra vonatkozó irodalmi adatok 1-es típusú diabetes mellitusban
16.
4.4. C1q elleni antitestek autoimmun kórképekben
17.
4.5. C1q- és 60- illetve 65kD-s hősokkfehérjék elleni antitestek keresztreakciója
20.
4.6. Az 1-es típusú diabetes mellitus etiopathogenezise
21.
4.7. P277 60 kD-os hősokkfehérje peptid szerepe diabetes mellitusban
22.
5. CÉLKITŰZÉSEK
29.
6. MÓDSZEREK
30.
6.1. Betegek és kontrollok
30.
6.2. Felhasznált anyagok
31.
6.3. Vizsgálati módszerek
32.
6.4. Statisztikai analízis
34.
7. EREDMÉNYEK
36.
7.1. Hsp60-, hsp65- illetve C1q elleni antitestek előfordulása autoimmun kórképekben, korreláció a vizsgált antitestek szintje között
36.
7.2. Keresztreakció anti-C1q és anti-hsp60 antitestek között
41.
7.3. C1q ellenes antitestek kapcsolata egyéb vizsgált paraméterekkel szisztémás lupus erythematosusban
44.
7.4. Hősokkfehérjék elleni antitestek 1-es típusú diabetes mellitusban
49.
2
7.5. P277 elleni antitestek 1-es típusú diabetes mellitusban
49.
7.6. A hsp60 elleni antitestek epitópspecificitásának vizsgálata 1-es típusú diabetes mellitusban
54.
7.7. Egyéb diabetesre jellemző antitestek (ICA, GADA, IA-2At) vizsgálata
54.
8. MEGBESZÉLÉS
57.
8.1. A hősokkfehérjék és a C1q elleni antitestek vizsgálata autoimmun kórképekben 57. 8.2. A C1q antitestek és az SLE klinikai és laboratóriumi paraméterei közötti összefüggések vizsgálata
59.
8.3. A hősokkfehérjék és egyes epitópjai elleni antitestek vizsgálata frissen diagnosztizált 1-es típusú diabeteses gyermekekben
64.
8.4. Az értekezésben leírt legfontosabb eredmények összefoglalása
68.
9. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
70.
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
71.
11. IRODALOMJEGYZÉK
73.
12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
85.
3
1. ÖSSZEFOGLALÁS A hősokkfehérjék elleni antitestek szerepe különböző autoimmun betegségekben Dr. Horváth Laura Témavezető: Prof. Dr. Füst György Semmelweis Egyetem, Budapest, 2002 A doktori értekezésemben a hősokkfehérjék elleni humoralis immunválasz szerepének vizsgálata során kapott eredményeimet foglalom össze. Irodalmi adatok alapján feltételezhető, hogy bizonyos autoimmun betegségek pathogenezisében a hősokkfehérjék elleni immunreakciónak is szerepe lehet. Különböző autoimmun kórképekben (szisztémás lupus erythematosus, SLE; polymyositis/dermatoymositis, PM/DM; rheumatoid arthritis, RA; Raynaud szindróma, RS; nem differenciált kollagén betegség, NDC; szisztémás sclerosis, SSC; diabetes mellitus, DM) mértük meg a hsp elleni antitestek titerét, valamint egyéb jellegzetes, az egyes kórképekre specifikus autoantitesteket is meghatároztunk, és vizsgáltuk ezek kapcsolatát, korrelációját, esetleges keresztreakcióját a hsp elleni antitestekkel. A hsp60 és hsp65 elleni antitestek titere egyedül nem differenciált kollagén betegségben volt magasabb, és csak ebben a kórképben észleltünk korrelációt a C1q elleni antitest titerrel is, mindezek megerősítik ennek a betegcsoportnak külön klinikai entitásként való elfogadását, illetve utalnak a C1q elleni antitestek heterogenitására is. A C1q elleni antitestek, melyek SLE-ben jelentősebben gyakrabban voltak detektálhatóak mint egészségesekben, szorosan korreláltak a betegség aktivitásával, bizonyos akut fázis fehérjékkel, valamint a veseérintettséggel (nephritissel). 1-es típusú diabetesben a hsp elleni antitestek epitópspecificitását vizsgálva két olyan peptidszakaszt azonosítottunk hsp60 AA394-413 (p277) és AA435-454 illetve hsp65 AA366-385 és AA408-427 , amelyek ellen a diabeteses gyermekek magasabb antitest reaktivitást mutattak, mint az egészséges kontrollok. Mivel a p277 peptid terápiás és protektív hatása állatkísérleti modellekben már igazolódott, van remény arra, hogy megfelelő alkalmazásával a humán diabetesben zajló immunfolyamatokat is modulálni lehet majd. Eredményeink megerősítik, hogy a hősokkfehérjék egyes epitópjai elleni immunreakció szerepet játszhat bizonyos autoimmun betegségek pathogenezisében. Ezen immunfolyamatok pontosabb megismerése akár egészen új terápiás és prevenciós lehetőségek felé irányíthatja figyelmünket.
4
2. SUMMARY The role of antibodies against heat shock proteins in different autoimmun disesases Dr. Laura Horváth Programleader: Prof. Dr. George Füst Semmelweis University, Budapest, 2002
Experiments summarised in this work are focused on the role of humoral autoimmunity against heat shock proteins (hsps). There are a lot of evidence supporting that the immune reaction against heat shock proteins may have a role in the pathogenesis of certain autoimmune diseases. We measured the titer of hsp antibodies in patients suffering from SLE, PM/DM, SSc, RA, RS, NDC and DM. Some other characteristic, disese-specific antibodies were also examined, and we studied the correlation and possible cross reaction with the hsp antibodies. Antibodies against hsp60 and hsp65 were significantly higher in patients with non differenciated connective tissue diseases, and correlation between C1q and hsp antibodies could also be proved in this group of patients. These results support the acceptance of NDC as a separate disease entity, and indicate the heterogenity of C1q antibodies as well. The C1q antibodies, detected more often in SLE patients than in healthy controls, correlated strongly with the activity of the disease, with some acut phase proteins and renal involvement (nephritis). Studying the epitope specificity of hsp antibodies in type 1 diabetes mellitus we discovered two peptid region hsp60 AA394413 (p277) and AA435-454; hsp65 AA366-385 and AA408-427 , against which the sera from diabetic children showed much stronger antibody-reactivity than did the controls. Since the protective and beneficial therapeutic effect of the p277 peptide was proved in animal experiments, there is a hope, that giving the peptide to human we can modulate the immune processes of human diabetes, too. Our results support that immune reaction agains certain epitopes of heat shock proteins may have a role in the pathogenesis of some autoimmune diseses. The clear understanding of these immune processes can turn our attention to very new therapeutic and preventive possibilities.
5
3. BEVEZETÉS Az autoimmun betegségek etiológiája, pontos pathogenezise ma sem tisztázott egyértelműen, és az oki kezelés hiányában igen korlátozottak a terápiás lehetőségek is. Számos kórképben ismertek olyan autoantigének, amelyek ellen a szervezet ismeretlen okból autoantitesteket és autoreaktív T sejteket termel, ugyanakkor általában egy-egy betegségben több feltételezett target antigén is szóba kerül. Nem ismert, hogy ezek közül melyik az az antigén, amelyik felelős a destruktiv immunfolyamat elindításáért, melyek azok, amelyek a folyamat fenntartásában vesznek részt, és melyek azok, amelyek esetleg csak szekunder módon, mintegy mellékleletként detektálhatóak, funkciójuk nem jelentős, és csak a célszerv pusztulásának fokát jelzik. Nem ismert az sem, hogy mennyiben vesz részt az immunrendszer celluláris illetve humorális ága a sejtek illetve szövetek károsításában. Az utóbbi években kerültek a figyelem középpontjába a hősokkfehérjék (hsp), mint minden sejtben kimutatható, immundomináns, konzervatív sejtalkotórészek. Az úgynevezett természetes autoimmunitás részeként mind humoralis, mind celluláris immunreakció kimutatható a hősokkfehérjék ellen egészséges egyénekben is, és úgy tűnik, hogy a hsp elleni antitestek és autoreaktív T sejtek egy bizonyos alacsony reaktivitású szintje szükséges lenne az immunhomeosztázis fenntartásához. A hősokkfehérjék elleni immunválasz tehát fiziológiás a normál immunhomeosztázisban, mindemellett számos kórképben feltételezhető a normálisnál fokozottabb, vagy éppen gyengébb hősokkfehérjék elleni immunreakció pathogenetikai szerepe, melynek oka a szabályozási mechanizmusok zavarában kereshető. Doktori munkám során a hősokkfehérjék elleni humorális immunválaszt vizsgáltam különböző autoimmun betegségekben, remélve, hogy ezáltal közelebb kerülhetünk az immun-mediált kórképek természetének megismeréséhez, a természetes autoimmunitás pontosabb megértéséhez, esetleg új, az eddiginél hatékonyabb terápiás lehetőségek felfedezéséhez.
6
4. IRODALMI HÁTTÉR 4.1. A hősokkfehérjék általános jellemzői A hősokkfehérjéket, mint hőmérsékletemelkedés hatására indukálódó sejtkomponenseket először Drosophilában írták le (1). Filogenetikailag, funkcionális és immunológiai szempontból rendkívül konzervált molekulák, melyek esszenciálisak a sejtek életműködéséhez. Megtalálhatóak a baktériumoktól a növényi és állati sejteken át az emberig minden élőlényben, funkciójuk igen hasonló, és egyes tagjai jelentős (több mint 50%-os) aminosav szekvencia homológiát mutatnak a különböző fajok között. Legfontosabb szerepük a fehérjeszintézisben van, a fehérjéket végigkísérik a nascens láncok szintetizálódásától multimer komplexek összeállásáig, ezért molekuláris chaperonoknak is nevezik őket (2). Konstitutív és indukált formájuk ismert, az előbbiek fiziológiás körülmények között vesznek részt a fehérjeszintézisben és –transzportban, az utóbbiak pedig a sejteket érő stresszhatások (hyperthermia, anoxia-reoxigeizáció, reaktív oxigén gyökök akkumulációja, gyógyszerek, nehézfémek, etanol, vírus- és baktériumfertőzések) idején segítik a sejtek túlélését (3, 4). Fiziológiás körülmények között a hősokkfehérjék hozzákapcsolódnak a transzlokációra váró fehérjékhez, elősegítik az ehhez szükséges szerkezetváltozásokat (folding-unfolding), majd elkísérik a fehérjéket a rendeltetési helyükre és itt leválnak róluk. Stresszhatás esetén megkötik a denaturálódott saját fehérjéket ezzel megelőzve a cascade denaturatiót, illetve olyan morfológiai és anyagcsere változásokat idéznek elő, amelyek eredményeképpen a sejt a további stresszhatásokra rezisztenssé válik. Különböző vírus-, bakterialis- és parazita fertőzések során proteázként működnek, és ATP-áz aktivitásuk révén az idegen fehérjék denaturációjában is részt vesznek (2). A hősokkfehérjék expresszálódását fokozó különböző ágensek hatásának mechanizmusa hasonló: a sejtlégzés megzavarásával, következményes szabadgyök felhalmozódással oxidatív stressz útján okoznak hsp indukciót. A szabadgyökök nukleinsavakkal, lipidekkel és egyéb sejtkomponensekkel reakcióba lépve olyan denaturált vagy aberráns molekulák képződéséhez vezetnek, melyeknek felszaporodása a hsp gének aktiválódásához vezet (4). Molekulatömegük alapján alcsaládokra oszthatóak, ezek közül a legfontosabbak és legismertebbek a hsp60, hsp70 és hsp90 alcsaládok. További vizsgálatok folynak még a 20kD körüli, illetve a magas, 100kD körüli molekulatömegű hsp családok szerepe és jelentősége vonatkozásában. Az egyes családok fő tulajdonságait az 1. táblázat foglalja össze. 7
Hsp60 család Lokalizáció
mitokondrium, citoplazma, szekretoros granulumok, növényi kloroplaszt
Fő funkciók
sejtkomponensek összeszerelése, fehérjék konformációjának kialakítása, oligomerek összeszerelése, a fehérjék membránba illesztése és proteolízishez való előkészítése
Működés
homo-oligomerként aktívak ATP-áz aktivitással rendelkeznek, egy belső üregben kötik meg a fehérjéket, ahol lehetőséget adnak a megfelelő szerkezetváltozások kialakulásához, és a kész fehérje távozik, melyet ATP hidrolízis kísér Hsp70 család
Lokalizáció
mitokondrium, citoplazma, endoplazmás retikulum
Fő funkciók
nascens fehérjék fogadása, riboszomális összeszerelése, fehérje transzport, klatrin szétszerelés, fehérjék lizoszomába terelése, topoizomeráz védelme a sejtmagban, a sejt szerkezeti elemeihez kötődve (tubulin, kalmodulin, vimentin) a sejtfelépítésben való részvétel
Működés
monomerként aktívak Nem ölelik körül az egész fehérjét, csak kis peptid szakaszt (3-4AS) képesek megkötni, gyakran két ponton is kötik a fehérjéket, így húzva szét őket a megfelelő állapotba. Főleg hidrofób felszíneket ismernek fel, ezekkel komplexet képezve védelmet nyújtanak az aggregáció ellen. Hsp90 család
Lokalizáció
citoplazma
Fő funkciók
fehérjékhez (pl. tirozin kinázok, szteroid hormon receptorok) kötődve azok konformációjának stabilizálása, aktiválása
Működés
dimer formában asszociálva bizonyos proteinekkel aktívak
1. táblázat: A legismertebb hősokkfehéreje alcsaládok legfontosabb jellemzői A hsp molekulák gyakran egymással interakcióban, egymást kiegészítve vesznek részt fiziológiás körülmények között a fehérjék szintézisének, transzportjának bonyolult és többlépcsős folyamatában, valamint stressz szituációban a sejtek homeosztázisának fenntartásában (2, 3).
8
4.2 Autoimmunitás 4.2.1. Természetes autoimmunitás Az immunrendszer fő funkciója a szervezet védelme a káros környezeti faktorokkal, fertőzésekkel és toxikus anyagokkal szemben. Elméletileg tehát potenciálisan elegendő lenne antitesteket és T sejteket termelnie a környezeti, exogén, idegen antigének ellen. Ennek ellenére, meglepő módon az immunrendszer saját antigénekkel reagáló immunsejteket és antitesteket is produkál, fiziológiás körülmények között is. Ezek az antitestek felismernek nemcsak keringő és sejtfelszíni antigéneket, de a sejtek belsejében lévő organellumok antigénjeit is. Az elsődleges immunválasz antitestjeihez hasonlítanak, IgM izotípusba tartoznak, kicsi az affinitásuk a saját antigénekhez, az auto- és idegen antigéneknek széles skálájához kötődnek, még csekély strukturális homológia esetén is. Megfigyelték, hogy leggyakrabban konzervatív, jelentős biológiai funkciójú antigénekkel reagálnak (hősokkfehérjék, enzimek, sejmembrán komponensek, citoplazmatikus fehérjék, sejtmag alkotóelemek, plazmafehérjék, citokinek, hormonok). A természetes autoimmunitás útján a szervezet immunrendszere az alapvetően fontos, nélkülözhetetlen biológiai rendszereket és molekulákat védi. Feltételezhetően ezeknek az autoantitesteknek a sejtek metabolikus folyamatai során keletkező degradációs termékek eltávolításában van szerepük, így hozzájárulnak az általános homeosztázis fenntartásához. A természetes autoimmun reakciónak védő szerepe lehet autoimmun betegségek kialakulásával szemben is, mivel azelőtt biztosítja a felszabadult autoantigének eltakarítását, illetve lefedését, mielőtt még valódi autoimmun betegség kialakulhatna (5). 4.2.2. Pathogén autoimmunitás, autoimmun betegségek kialakulása Az autoantitestek egy másik típusának szerepe lehet bizonyos betegségek pathogenezisében. Ezek az autoantitestek IgG típusúak és magas affinitással kötődnek az antigénekhez. Nem szükségszerűen monospecifikusak, keresztreagálhatnak struktúrálisan homológ molekulákkal (5). Direkt pathogén szerepük többféleképpen bizonyítható, például a betegség indukálhatóságával az autoantitesteket egészséges egyéneknek adva vagy kísérleti állatokat immunizálva a kérdéses autoantigénekkel illetve annak részeivel. Szintén a pathogén szerep mellett szól, ha az antitesteket sikerül izolálni az érintett szervekből, vagy ha azok keringő formája korrelál betegség klinikai manifesztációival.
9
Arra vonatkozóan, hogy mikor, és miért fordul az immunrendszer a saját szervezet ellen olyan formában, hogy az autoimmun betegség kialakulásához vezet, számos hipotézis létezik. A legelfogadottabb teóriákat példákkal illusztrálva a 2. táblázat foglalja össze (6). Az autoimmunitásért felelős mechanizmus
Autoimmun betegség
Az immunrendszertől elzártan fejlődő szervek Szimpátiás ophtalmia sérülés vagy gyulladás következtében
Autoimmun encephalitis
kapcsolatba kerülnek az immunrendszer sejtjeivel Molekuláris mimikri teória: Fertőzések során
Diabetes mellitus
a bakteriális illetve virális antigének ellen
Rheumatoid arthritis
képződött ellenanyagok keresztreagálnak a
Graves-Basedow kór
hasonló saját antigénekkel A saját antigén szerkezetének megváltozása
Gyógyszer indukálta autoimmun
mutáció vagy haptén kötődése révén
betegségek (SLE)
2. táblázat: Az autoimmun betegségek kialakulásának feltételezett fő mechanizmusai A különböző autoimmun betegségek pathogenezisének egy lehetséges magyarázata a molekuláris mimikri teória. A hipotézis alapja az az epidemiológiai, klinikai és experimentális megfigyelés, hogy külünböző fertőzések és autoimmun betegségek gyakran egyszerre fordulnak elő, és hogy keresztreaktivitást észleltek saját antigének és bizonyos mikrobiális antigén determinánsok között. Ezen determináns ellen irányuló immunválasz szövetspecifikus immunreakciót indíthat be, mely sejt- és szöveti destrukciót jelenthet, feltételezetten citotoxikus keresztreagáló effektor lymphocyták és antitestek útján, melyek felismerik a kritikus epitópokat a target sejteken. A keresztreakció indukciójának nem feltétele a kiváltó ágens jelenléte, az immunmodulált károsodás bekövetkezhet a kórokozó eliminálódása után is, ezt nevezik hit-and-run teóriának. Más szóval, a vírus vagy mikróba, mely eredetileg kiváltotta az autoimmun választ, nem biztos, hogy jelen van a betegség kialakulásakor is. Az is elképzelhető, hogy a fertőzés hatására létrejövő sejtkárosodás során olyan saját antigének szabadulnak fel, melyek autoimmun választ váltanak ki, és az így aktiválódó antitestek és T sejtek keresztreagálnak egyéb, hasonló antigénekkel is (7). 10
A pathogenetikai jelentőséggel bíró autoantitestek és a természetes antitestek tulajdonságaiban és természetében lévő nyilvánvaló különbségek ellenére számos adat szól amellett, hogy ezek szoros kapcsolatban állnak és keresztreagálnak egymással, sokszor a határvonal az antitestek e két populációja között egyáltalán nem éles. 4.3. Hősokkfehérjék elleni immunitás 4.3.1. A hősokkfehérjék elleni immunitás fiziológiás szerepe A természetes autoimmunitás részjelenségeként mind humoralis, mind celluláris immunreakció kimutatható a hősokkfehérjék, mint konzervatív és immundomináns fehérjék ellen egészséges egyénekben is, és úgy tűnik, hogy a hsp elleni antitestek és autoreaktív T sejtek egy bizonyos alacsony szintje szükséges és protektív lenne. A hősokkfehérjék elleni immunválasz tehát fiziológiás a normál immunhomeosztázisban. Fontos szerepe van különböző infekciók során a szervezet védelmében. A szervezetet érő különböző fertőzések hatására a kórokozók eliminálása céljából aktiválódó immunválaszt vizsgálva kiderült, hogy annak fontos része a mikrobialis hősokkfehérjék elleni reakció, és a hsp-k erősen immundomináns antigénként viselkednek a fertőzések során. Először Mycobacterium tuberculosis és M. leprae fertőzések esetén bizonyították, hogy a fertőzött egyénekben a kórokozó hatására indukálódó T sejtek/antitestek egy része hősokkfehérjék ellen irányul (8, 9). Később számos egyéb fertőzésben sikerült kimutatni a kórokozó hősokkfehérjéi elleni antitesteket és T sejteket, pl. Onchocerca (10), Plasmodium (11), Trypanososma (12), Schistosoma (13) fertőzésekben. Jelentős keresztreaktivitást észleltek a különböző pathogénekből származó hősokkfehérjék között és az aminosav analízis kiterjedt szekvencia-homológiát igazolt (14). Ugyanakkor mycobacterialis hsp65-tel reagáló proliferációra képes és citotoxikus T sejt klónokat egészséges kontrollokból is sikerült izolálni (15). Valószínűleg a hősokkfehérjék immundominánsak mind egészséges, mind fertőzött egyénekben, mivel széles körben jelen vannak és expresszálódnak nemcsak a pathogén, de az ártalmatlan mikroorganizmusokban is. Különösen kedvezőtlen körülmények között, melyek egy gazdaszervezetben adottak a kórokozó számára (16). A hősokkfehérjék elleni immunválasz szerepe infekciók esetén kettős lehet. Egyrészt része lehet a pathogén microorganizmus eliminálásában. A reakció gyorsasága miatt ez a védekezés első vonalát jelentené, megelőzve a lassúbb kórokozó-specifikus immunválasz kifejlődését. (16) Nemrég fedezték fel, hogy a T sejtek egy része úgynevezett
T sejt, melyek a hsp-ket MHC nélkül is képesek felismerni. Feltételezik, 11
hogy ezek a sejtek felismerik mind a gazdaszervezet „stresszelt” sejtjeinek, mind a fertőző ágensnek fokozottan expresszált hősokkfehérjéit. Elképzelhető, hogy ezek a T sejtek egy ún. „protektív ablak” periódust jelentenének a gazdaszervezet számára a microorganizmusokkal szemben mindaddig, ameddig beindulnak az MHC prezentálást igénylő
T sejtek aktiválódását jelentő pathogén-specifikus immunreakciók (17). A
különböző élőlények hősokkfehérjéi között fennálló magas szekvenciahomológia lehetővé teszi, hogy a
T sejtek a fertőző microorganizmusok és károsodott sejtek
széles skáláját felismerjék és eliminálják. Ezen elmélet mellett szól a a
T sejtek
lokalizációja is, az immunvédekezés első vonalában, a bőr- és a gastrointestinalis nyálkahártya felszíni rétegeiben helyezkednek el. Ebben a tekintetben tehát a hősokkfehérjék elleni immunválasz jól működő immunrendszer esetén kifejezetten hasznos lenne, és eddig ismeretlen tényezők hatására fordul a szervezet saját sejtjei ellen (17). A saját hsp epitópok ellen irányuló immunválasznak ugyanakkor szerepe lehet az infekció illetve egyéb stresszhatások közben transzformált, stressznek kitett saját sejtek eliminálásában is, mivel ezek a sejtek feltételezés szerint a normál sejteknél több felszíni hsp molekulát expresszálnak (16). 4.3.2. A hősokkfehérjék elleni immunitás pathogén szerepe Számos kórképben feltételezik a hősokkfehérjék elleni immunreakció pathogenetikai szerepét, melynek oka a szabályozási mechanizmusok zavarában kereshető. Néhány bizonyíték, mely a hősokkfehérjék autoimmun betegségek kialakulásában való részvétele mellett szól: 1. Állatkísérleti modellekben hősokkfehérjék vagy peptidjeik kívülről történő adagolásával befolyásolni lehet bizonyos autoimmun betegséget, az adagolás módjától és időpontjától függően betegséget indukálva vagy éppen ellenkezőleg, szupresszálva. Erre legismertebb példák a patkányok adjuváns arthritise illetve a NOD egerek diabetese. Ezekben a modellekben beteg állatokból vett hsp60 reaktív T sejtekkel átoltható volt a betegség (18, 19) 2. Hsp reaktív T sejteket sikerült izolálni bizonyos autoimmun betegségben: rheumatoid arthritisben synovialis folyadékból (20), nyulak atheroscleroticus lézióiból (21).
12
3. Perifériás, keringésben lévő hsp reaktív T sejteket mutattak ki rheumatoid arthritisben (22) 4. Számos autoimmun betegségben írtak le hősokkfehérje elleni antitesteket (pl. SLE, diabetes mellitus, sclerosis multiplex, szisztémás sclerosis). 5. Emelkedett hsp expressziót írtak le több autoimmun betegség gyulladásos léziójában (arthritisek, SM, SLE, 1-es típusú diabetes mellitus, atherosclerosis, Grave’s betegség, krónikus gastritis, psoriasis) (23) Ezeket az adatokat azonban kellő óvatossággal kell értékelni, mivel hsp specifikus antitestek és T sejtek egészséges emberekben is kimutathatóak, puszta jelenlétük tehát nem magyarázza az autoimmun betegség kialakulását. Gyulladásos laesiókban illetve az érintett és károsított szervekben való fokozott expressziójuk sem bizonyít feltétlenül oki kapcsolatot a betegség kialakulásával, részben mert csak egyes esetekben (SM – oligodendrocyták, krónikus gastritis – gyomor epithelium) sikerült a hsp-k felszíni expresszióját is kimutatni, másrészt pedig a fokozott expresszió magyarázható lehet a sejteket érő stresszhatással is, így inkább következmény, mint ok lehet (23). A fentebb elmített, infekciók során kialakult hősokkfehérjék elleni immunreakció is fordulhat kóros irányba akkor, ha a szabályozási mechanizmusokban valami hiba történik (16). A bakteriális és humán hsp-k közötti magas szekvencia-homológia a fertőzések hatására indukálódó és stimulálódó T lymphocyták keresztreagálnak a saját hsp molekulákkal (melyek a stresszhatás miatt egyébként fokozottan expresszállt állapotban vannak). A közös epitópok infekció alatti kiterjedt prezentációja miatt a saját molekulák irányában fennálló tolerancia csökkenhet, így autoimmun betegség alakulhat ki (23). A normál autoimmunitásnak pathogén irányba történő progressziójáért a fertőzést követő gyulladás során termelődő különböző cytokinek egyensúlyában bekövetkezett zavart tartják fontosnak, számos autoimmun betegségben jellegzetesen proinflammatorikus cytokinek termelődését mutatták ki (IFN-gamma, IL-1). Az infekciók során termelődő citokinek profiljának tanulmányozása segítheti a postinfekciós autoimmun rekciók káros következményeinek megelőzését (24). Mindemellett a hsp molekulák széles elterjedtségét ismerve (minden sejtben megtalálhatóak) nehezen magyarázható az egyes autoimmun betegségekben észlelhető szerv- illetve szövetspecificitás. Egyes magyarázatok szerint molekuláris mimikri állna fenn különböző hsp molekulák és bizonyos szerv- illetve szövet-specifikus antigének között. Jones és munkatársai a humán hsp60 molekula szekvenciájában számos olyan peptid szakaszt írtak le, amelyek magas homológiát mutatnak bizonyos 13
autoantigénekkel. Ezen szövetspecifikus proteinek illetve hsp60 epitópok közötti keresztreaktivitás az autoimmun reakció magyarázatául szolgálhatna. Néhány gyakoribb autoimmun betegséget és a feltételezett autoantigént, illetve a hsp60-nal homológ aminosavszakaszokat a 3. táblázatban foglalom össze. Ismert autoantigén
AA
Autoimmun betegség
Hsp60 aminosav régió
glutaminsav dekarboxiláz 520-534
1-es típusú diabetes
391-405
mellitus thyreoglobulin
393-403
Hashimoto thyreoiditis
65-75
myeloperoxidáz
594-610
glomerulonephritis
1-17
KU autoimmun antigén
81-93
scleroderma
37-49
bullosus pemphigoid Ag
308-323
pemphigoid
152-167
citokeratin
83-105
rheumatoid arthritis
101-123
myelin-asszociált protein 286-297
sclerosis multiplex
328-339
citokróm p450
359-372
krónikus aktív hepatitis
7-21
piruvát dehidrogenáz
45-63
primer biliaris cirrhosis
38-53
21 hidroxiláz
61-71
Addison kór
290-300
3. táblázat: Autoimmun betegségek, melyekben a feltételezett autoantigének egy-egy peptidszakasza magas szekvenciahomológiát mutat a hsp60 egy-egy epitópjának aminosavszekvenciájával. A molekuláris mimikri teória szerint a hsp elleni antitestek keresztreagálnak a hasonló szekvenciájú szövetspecifikus antigénekkel, és ez a reakció szerepet játszhat különböző szervspecifikus autoimmun betegségek pathogenezisében. Az egyes egyének MHC II. molekuláiban megjelenő individuális különbözőségből eredően egy-egy infekció során más-más hsp epitóp kerülhet prezentálásra, ennek megfelelően más-más target antigén és autoimmun betegség manifesztálódhat (25). Ugyanakkor az is elképzelhető, hogy a hsp reaktív T sejtek és antitestek nem a primer immunfolyamat elindítói, hanem csak a már folyamatban lévő és előrehaladó autoimmun destrukció fokozói lennének. A gyulladás helyén lévő sejtek ugyanis a stresszhatások miatt fokozottan expresszálnak hősokkfehérjéket, azok pedig az immunrendszer targetjeivé válnak (23).
14
4.3.3. Hősokkfehérjék elleni immunreakcióra vonatkozó irodalmi adatok szisztémás autoimmun betegségekben Számos állatkísérleti eredmény és humán vizsgálat utal arra, hogy a hősokkfehérjék elleni immunreakciónak szerepe lehet bizonyos autoimmun betegségek pathogenezisében. Ezek közül a szisztémás autoimmun kórképekre koncentrálva emelek ki néhányat: M. bovis hsp65 reaktív T sejtekkel sikerült irradiált, naív patkányokban adjuváns arthritist indukálni (26). Krónikus arthritisben szenvedő betegek synovialis folyadékából származó lymphocyták között kimutattak hsp65 reaktívakat is (27). A hsp65 kulcs epitópjaként egy 9 aminosavból álló peptid szakaszt sikerült izolálni (180188) a M. bovis hsp65 szekvenciájában (28). Meglepő módon ez a szakasz a molekulának nem konzervált része, nem találtak szekvencia hasonlóságot a mycobacterialis és emlős változatok között (29). Megfelelően a mycobacteriális peptid és a humán porc elleni T sejtek között észlelt keresztreaktivitásnak homológia volt viszont a 180-188 peptidszakasz és porcszöveti proteoglikán egy szakasza között (30). Danieli és mtsai immunreaktivitást mutattak ki a mycobacterialis hsp65 és 180-188 peptidje ellen juvenilis rheumatoid arthritisben szenvedő betegekben, ugyanezen betegségben szenvedő felnőttekben viszont nem. Ez a juvenilis és felnőttkori variáns különböző etiológiáját bizonyíthatja (31). Krónikus arthritisben szenvedő betegekben megfigyeltek magas anti-hsp65 antitest szintet is (32). Szintén emelkedett anti-hsp65 titert írtak le rheumatoid arthritisben illetve emelkedett anti-hsp70 és 90 szérumszinteket spondylosis ankylopoeticában és SLE-ben (33, 34). Tsoulfa és mtai is hasonló eredményeket kaptak: szignifikánsan magasabb IgG és IgA anti-M. bovis hsp65 szinteket detektálatak rheumatoid arthritises betegek szérumában összehasonlítva egészségesekben, SLE-ben, tuberculosisban, spondylosis ankylopoeticában és Crohn betegségben szenvedő betegekkel (35). Vannak viszont olyan tanulmányok is, melyekben ellenkező eredményeket kaptak: nem észleltek szignifikáns különbséget az anti-hsp65 és70 szintekben rheumatoid arthritises, SLE-s és egészséges egyének között (36, 37). Experimentális arthritis modellekeben (kollagén II. arthritis, adjuváns arthritis, olaj indukálta arthritis) írták le, hogy a hsp65 elleni humorális immunválasz kialakulásához a normál bakterialis bélflóra épsége szükséges. Ugyanezen modellekben „germ free” állatokban is észleltek súlyos arthritises választ humoralis immunreakció nélkül, ebből arra következtethetünk, hogy a hsp65 elleni humoralis immunitásnak nincs szerepe a betegség kialakulásában (38). Panchapakesan és mtsai rheumatoid 15
arthritises betegekben emelkedett anti-hsp65 IgM és anti-hsp70 IgG szintet, SLE-s betegekben pedig emelkedett anti-hsp65 IgM szintet írtak le (39). Az Escherichia coli hsp60 elleni antitest titert is magasabbnak írták le rheumatoid arthritisben és néhány egyéb kötőszöveti betegségben, és feltételezték hogy ez a betegek bélmicroorganizmusokkal való fertőzöttségének köszönhető (40). Gruber és mtsai szignifikánsan magasabb M. bovis hsp65 elleni antitest szintet mértek vasculititses és arteriosclerosisos betegekben egészséges kontrollokénál. SLE-ben szintén magasabb volt az antitest titer, de a különbség nem volt szignifikáns (41). Latchman és mtsai quantitatív ELISA módszerrel SLE-s betegek 26%-ában írtak le emelkedett hsp90 elleni IgM antitest szintet és 35%-ban IgG típusút. Ezeket az antitesteket nem tudták detektálni egészséges kontrollokban, rheumatoid arthritisben és sclerodermában szenvedő betegekben. A hsp70 elleni antitest szintben nem észleltek különbséget a vizsgált csoportokban, ezt kapcsolatba hozták azzal a megfigyeléssel, hogy SLE-s betegekből származó lymphocytákon és monocytákon a hsp90 molekula fokozott felszíni expresszióját észlelték, ugyanez nem volt megfigyelhető a hsp70 és 60molekulákra vonatkozóan (42). Arora és mtsai rekombináns Leishmania donovani hsp70 elleni antitestek előfordulásának gyakoriságát mérték SLE-s betegekben és nem találtak lényegi eltérést a kontroll és beteg egyének között, így feltételezik, hogy ennek az antitestnek nincs szerepe a betegség pathogenezisében (43). Emelkedett IgG antitest szintet észleltek a konstitutív bovin 73kD-os hősokkfehérje ellen rheumatoid arthritises, sclerodermás és kevert kötőszöveti betegségben (MCTD) szenvedő betegek szérumában. Az antitestek felismerték a humán konstitutív hsp73-t is, de az indukálható hsp72-t nem. Kiemelkedően magas antitestszinteket észleltek MCTD-ben, és felvetették, hogy ebben a kórképben az anti-hsp73 antitest akár új diagnosztikus markerként is használható lenne (44). 4.3.4. Hősokkfehérjék elleni immunreakcióra vonatkozó irodalmi adatok 1-es típusú diabetes mellitusban A hősokkfehérjék elleni humorális immunválaszt diabetes mellitusban eddig kevesen vizsgálták, az eredmények ellentmondásosak. Tun és mtsai emelkedett M. bovis hsp65 elleni antitest szintet mértek néhány pre-diabeteses ikerben illetve frissen diagnosztizált 1-es típusú diabeteses betegben, de az antitest szintek medián értéke nem különbözött szignifikánsan a kontroll egészségesekétől (45). Atkinson és mtsai nem találtak arra utaló jelet, hogy a hősokkfehérjék (hsp65, 70 és 90) elleni humorális immunreakciónak 16
szerepe lenne diabetes mellitusban (46). Ozawa és mtsai írták le, hogy japán populációban 1-es típusú diabetes mellitusban a hsp60 elleni atitestek előfordulása és átlag értéke szignifikánsan magasabb volt az egészséges kontrollokban mértnél (47). Child és mtasi viszont alacsonyabb hsp65 szintet mértek 1-es típusú diabetes betegekben mint egészségesekben, az esetszámuk azonban elég alacsony volt (48). Figuerdo és mtsai írták le, hogy diabetesesekben az IgG és IgM típusú anti-hsp70 szintek nem különböztek a kontrollokétól, viszont az IgA típusúak szignifikánsan magasabbak voltak 1-es és 2-es típusú diabetesesekben is (49). Számos kórképben írták tehát le a hősokkfehérjék elleni humorális illetve celluláris immunreakció jelenlétét, mindezen viszgálatok azonban inkább csak leíró-megfigyelő jellegűek. Arra vonatkozóan, hogy lézió helyén vagy a keringésben lévő hsp reaktív T sejtek vagy antitestek pathogének, protektívek vagy éppen hatás nélküliek-e, csak elméletek illetve spekulációk léteznek. Egyértelmű az is, hogy egészséges emberekben is megfigyelhetőek mind autoreaktív T sejtek mind hsp elleni antitestek. Csak találgatni lehet, hogy a normál immunválasz mikor, milyen tényezők hatására fordul át kóros autoimmunitásba, de bizonyára az MHC haplotípusnak, a potenciális autoantigén jelenlétének és környezeti faktoroknak szerepe lehet ebben (50). 4.4. C1q elleni antitestek autoimmun kórképekben A C1q a komplement rendszer klasszikus reakcióútjának első komponense. Erősen kationos 460kD molekulatömegű glikoprotein, egy N terminális kollagénszerű farokból és egy karboxil végen elhelyezkedő nyitott „virágcsokor” szerű fejből áll, ez utóbbi az antitest-kötőhely. Kötődik az immunkomplexekhez, megakadályozza aggregációjukat és solubilis formában tartja őket. A C1q receptor a kollagénszerű faroknál köti meg a C1q molekulát. C1q elleni antitestek jelenlétét először 1984-ben írták le (51) SLE-s betegek szérumában. Az antitest csak a szilárd fázishoz kötött C1q-val reagál, így jön ugyanis létre az a konformációváltozás, melynek eredményeképpen a kötő epitóp megjelenik. Felmerült a kérdés, hogy mi lehet az oka a C1q elleni antitestek keletkezésének. A legelfogadottabb elképzelés szerint a perzisztens vagy rekurráló komplement aktiváció eredménye lenne. A komplementrendszer aktiválódása során C1q kötődik az immunkomplexekhez, melyet C1r2C1s2 kötődés követ, ez utóbbi lépés C1 inhibitor által kontrollált folyamat. A C1r2C1s2 disszociációja után a C1q továbbra is kötve marad, a 17
molekula kollagénszerű farka konformációváltozás miatt szabaddá válik. Fogékony egyénekben secunder humoralis immunválasz lép működésbe és antitestek termelődése indul meg a molekula ellen (52). A C1q antitestek első leírása óta az SLE mellett számos kórképben igazolták emelkedett szintjét, sőt egészséges egyének egy részében is jelen van. Azokat a kórképeket, amelyekben emelkedett C1q antitest szintet írtak le, a 4. táblázatban foglalom össze (5254). Ezek közé elsősorban olyan szisztémás betegségek tartoznak, ahol keringő immunkomplexek nagy mennyiségben vannak jelen a keringésben, és ezeknek a betegségek pathogenezisében is jelentőséget tulajdonítanak. Az immunkomplexek lerakódásának leggyakoribb helyei a bőr és a glomerulusok mikrovaszkulatúrája, így ezekeben a kórképekben bőr- és veseérintettséggel gyakran találkozunk. A C1q elleni antitestek pathogenetikai szerepére vonatkozóan több elmélet létezik. Mind a keringésben mind lokálisan amplifikálják az immunkomplexek kialakulását, megnövelik méretüket, és a fokozott komplementaktiváció gyulladáshoz vezet. Az antitestek befolyásolhatják a teljes C1 komplex működését, vannak adatok mind a komplex aktivitásának csökkenése, mind növekedése mellett. Egyes szerzők nem észleltek változást a komplex működésében az antitestek jelenlétével összefüggésben. Az antitestek jelenléte befolyásolhatja a C1q-C1q receptor kötődést is, befolyásolva ezzel a C1q hatásait. Egyes elképzelések szerint nem vethető el a kollagén II molekulával adott keresztreakció lehetősége sem, bár ezt kevés adat támasztja alá (53, 54).
18
Betegcsoportok
anti-C1q IgG (%)
anti-C1q IgA (%)
Hypocomplementaemiás urticariás vasculitis szindróma
100
-
54-88
12
MCTD
94
64
Felty szindróma
76
28
28-59
0
Rheumatoid vasculitis
32
68
Polyarteritis nodosa
27
27
Sjögren szindróma
13
-
8
20
Rheumatoid arthritis
3-5
1
Szisztémás sclerosis
0-13
0
IgA nephropathia
0
0
Membranosus glomerulopathia
0
0
Wegener granulomatosis
0
0
Egészséges kontrollok
4
3
Membranoproliferativ glomerulonephritis
Szisztémás lupus erythematosus
Spondylosis ankylopoetica
4. táblázat: C1q vesebetegségekben
elleni
antiestek
előfordulása
19
különböző
autoimmun-
és
SLE-s betegekben a C1q elleni antitesteknek számos különböző klinikai és laboratóriumi paraméterrel vizsgálták a kapcsolatát. Pozitív korrelációt észleltek a nephritissel, dermatitissel, hypocomplementaemiával, anti-dsDNA antitest szinttel, a keringő immunkomplexek mennyiségével és a vörösvértest süllyedéssel. Negatív korrelációt írnak le a C1q szinttel, C3 és C4 szintekkel és a központi idegrendszeri tünetekkel. Nem észleltek korrelációt a hemoglobin szinttel, fehérvérsejt számmal, thrombocyta számmal, bőr-, ízületi- és serosa érintettséggel. Ellentmondásosak az eredmények a szérum kreatinin szintet illetően, egyesek negatív korrelációt írtak le, mások nem észleltek összefüggést (55, 56). A veseérintettség és a C1q ellenes antitestek szintjének kapcsolatára vonatkozóan szintén ellentmondásos eredményeket közöltek. Magas C1q antitest titert írtak le aktív lupus nephritisben (55), és a magas antitest szint előrejelezte a lupus nephritis relapsusát (56, 57). Trendelenburg és mtsai eredményei szerint a C1q antitest pozitivitás SLE-ben 100%-os negatív prediktív értékű, C1q negatív SLE-s betegekben nem fordult elő nephritis (58). Ugyanakkor két különböző munkacsoport is beszámolt arról, hogy nem találtak korrelációt sem a C1q antitestek jelenléte, sem titere és az SLE szervi manifesztációi között, beleértve a nephritist is. Vizsgálták az IgG típusú C1q elleni antitestek alosztályspecificitását is, az eredmények ellentmondásosak. Egyes eredmények szerint különböző kórképekben az eloszlás megegyezett a normál szérumban észlelttel, míg mások SLE-ben az IgG2, membranoproliferatív glomerulonephritisben IgG3 alosztályú antitestek dominanciáját írták le. 4.5. C1q- és 60- illetve 65kD-s hősokkfehérjék elleni antitestek keresztreakciója Korábban Prohászka Z. és mtsai szoros pozitív korrelációt mutattak ki HIV fertőzött betegek szérumában található C1q– és hsp60- (p<0.0001) illetve C1q- és hsp65 elleni antitestek (p=0.0023) szintje között (59). Összehasonlítva ugyanezen betegekben a C1q antitest pozitív –illetve negatív csoportokat, a C1qAt pozitívakban szignifikánsan magasabb volt mindkét hősokkfehérje elleni antitest titere. Megvizsgálták, hogy a poliklonális anti-C1q antitestek mutatnak-e keresztreakciót 60kD-s hősokkfehérjékkel. ELISA kísérleti rendszerben szilárd fázishoz kötött hsp60 és hsp65 molekulákhoz dózisfüggően kötődött a kecskében termelt anti-humán C1q antitest, míg a kontrollként használt egyéb komplementfehérjék (C4b, C1-inhibitor) ellen termelt antitestek nem mutattak kötődést. Ezután epitóp-analízist végeztek: a M. bovis hsp65 molekula 9 feltételezetten epitópként funkcionáló szakaszát választották ki és polietilén tűk hegyén 20
szilárd fázisú peptidszintézissel 5 aminosavanként átfedő peptidsorozatokat hoztak létre. Pin ELISA módszerrel a kilenc lefedett hsp65 szakasz közül három esetében találtak C1q antitestekkel reakciót mutató peptideket. A kötődés specifikus volt, mivel tisztított C1q molekulával gátolni tudták. A keresztreakció jelentősége még nem teljesen egyértelmű, magyarázatára további kísérletek vannak folyamatban (59). 4.6. Az 1-es típusú diabetes mellitus etiopathogenezise Az autoimmun eredetű 1-es típusú diabetes mellitus kialakulásának négy stádiumát különböztetjük meg. Az első stádium a genetikai fogékonyság állapota. A második stádium a triggertényezők behatása, mely többnyire ismeretlen, mai ismereteint szerint lehet valamely vírusfertőzés (coxsackie, mumps, rubeola), vagy a korai tehéntejtáplálás bevezetése. Ezt követi a harmadik stádium, az immunológiai abnormalitások időszaka, melynek során a béta sejtek tömege az autoimmun destrukció miatt fokozatosan csökken. Erre a stádiumra jellemző a szigetsejt–specifikus citotoxicus T sejtes reakció, az insulitis. Ebben az időszakban számos szigetsejt ellenes antitest is kimutatható (ICAislet cell antibody, GADA-glutamic acid decarboxylase antibody, IA-2 azaz 2-es számú szigetantigén- tirozin foszfatáz ellenes antitest, insulin ellenes antitestek, glikolipidek elleni antitestek, carboxypeptidase H elleni antitest), a feltételezett autoantigének száma egyre növekszik, ezek közé sorolhatóak a hősokkfehérjék is. A szigetsejtek direkt pusztításáért valószínűleg inkább a celluláris immunreakció tehető felelőssé. Az antitestek szerepe mindezidáig nem tisztázott, prediktív értékük viszont bizonyított. Az antitest pozitív, de még egészséges személyekben bizonyítottan gyakrabban alakul ki diabetes, mint az antitest negatívakban. Ebben az időszakban már kimutatható a szigetsejtek
inzulintermelő
kapacitásának
csökkenése,
az
első
fázisú
inzulinfelszabadulás kiesése, különböző fokú szénhidrát-anyagcsere-zavar kialakulása. Ha a béta-sejtek kb. 80-90%-a elpusztul, akkor beszélhetünk a negyedik stádiumról, a manifeszt 1-es típusú cukorbetegség kialakulásáról. Az 1-es típusú diabetes mellitus pathogenezisét az 1. ábra foglalja össze.
21
1. stádium: genetikai fogékonyság (HLA DR3, DR4, DQ2, DQ8) 2. stádium: trigger tényező (vírus, korai tehéntej táplálás) 3. stádium: immunológiai abnormalitások (szigetsejt elleni antitestek és citotoxikus T sejtek, insulitis) 4. stádium: diabetes manifesztálódása
100%
10-20%
0%
Működő szigetsejtek mennyisége 1. ábra: Az 1-es típusú diabetes mellitus kialakulásának stádiumai
4.7. P277 60 kD-os hősokkfehérje peptid szerepe diabetes mellitusban A p277 nevű 60 kD-os hsp peptidet Cohen és mtsai írták le 1991–ben (60). Állatkísérleti adatok alapján úgy tűnik, hogy az 1-es típusú, autoimmun pathomechanizmusú diabetes kialakulásában e peptidnek pathogenetikai jelentősége van. A p277 egy 24 aminosavból álló peptid, a hsp60 molekulának 437-460 aminosavig tartó peptidszakasza. A peptid maga biológiailag instabil, oxidációra, aggregációra illetve egyéb kémiai folyamatokra érzékeny illetve hajlamos, oldatban 1-2 hónap alatt elveszíti biológiai aktivitását még -20 C-n tartva is. A 6. és 11. pozícióban lévő cysteinek valinnal történő helyettesítése az immunogenitást nem befolyásolva jelentősen növeli a stabilitást, így a kísérleti modellekben ezt használják. Az egér és a humán variáns 1 aminosavban különbözik, de immunológiailag teljes keresztreaktivitás áll fenn, állatkísérletekben is általában a humán peptiddel dolgoznak (61). A p277 peptidnek a diabetes mellitus pathogenezisében játszott szerepét illetve esetleges preventív és terápiás használhatóságát ezidáig főleg állatkísérleti modellekben vizsgálták. Az egyik modell állat az ún. NOD (non obes diabetic) egér, mely a humán 22
diabetessel kapcsolatos kísérletek leggyakrabban használt állatkísérleti modellje. Ezekben az állatokban spontán diabetes alakul ki. 4 hetes korban már kimutatható a kezdődő, enyhe insulitis, mely nőnemű egerekben progresszív folyamat, a szigeteket egyre több gyulladásos sejt infiltrálja, és 13-15 hetes korban kialakul a manifeszt diabetes. 32 hetes korban nőnemű egerekben a diabetes incidenciája több mint 80%-os, hímneműekben valamivel kevesebb. A folyamat inzulin kezelés nélkül az egerek halálához vezet (62). A modellben számos saját antigén ellen mutattak ki mind humoralis, mind celluláris immunreaktivitást, a direkt károsodásért inkább a T sejteket tartják felelősnek, az antitesteknek a predikció szempontjából tulajdonítanak jelentőséget, pontos szerepük nem ismert. A legtöbb adat az insulin, GAD, hsp60 elleni autoimmun reakció pathogenetikai szerepét támasztja alá, mindhárom molekuláról leírták, hogy korai, prediabeteses stádiumban adagolva képes az autoimmun folyamatot pozitív irányba befolyásolni, azaz a betegséget megelőzni, vagy legalább enyhíteni, előfordulási arányát csökkenteni, vagy a manifesztáció időpontját késleltetni. A hsp60 és annak p277 peptidjének kulcsfontosságú szerepét a diabeteshez vezető autoimmun folyamatokban több tanulmány bebizonyította. Prediabeteses egerekben spontán T sejt válasz mutatható ki a hsp 60 molekula és a humán illetve egér p277 ellen, p277 elleni antitestek viszont spontán nem termelődtek (61). P277 elleni T sejtekkel a diabetest sikerült átvinni olyan egértörzsből származó állatokra, amely egyébként nem hajlamosak a betegségre (63). Ez arra utalna, hogy a peptidnek közvetlen szerepe lenne a primer immunfolyamatban, és az immunválasz nemcsak a szigetsejtek pusztulása utáni károsodásnak köszönhető fokozott autoantigén felszabadulás következmény lenne. Örök kérdés ugyanis a diabetesben felmerülő autoantigénekkel és ellenük irányuló immunfolyamatokkal kapcsolatban, hogy mi a primer kiváltó ok, és melyek a szekunder következmények, melyek azonban kétségtelenül a folyamat súlyosbodásához vezetnek. Amellett azonban, hogy a p277 (és hsp60) elleni immunreakciónak bizonyítottan szerepe van a betegség kialakulásában, megfigyelték azt is, hogy a peptid kívülről történő adagolásával befolyásolható a szigetsejtek elleni immunreakció. Az adagolás módjának, dózisának és időpontjának függvényében különböző eredményeket értek el. Prediabeteses stádiumban szubkután adagolással a NOD egerekben megelőzhető volt a diabetes (64). 12-17 hetes korban adva az előrehaladott insulitist megállította, a humán és az egér variáns is effektívnek bizonyult (60, 65, 66). Kovalensen immunogén karrier molekulához kötve (ovalbumin, BSA) átmeneti enyhe diabetest indukált, mely később 23
megszűnt és az egér nem lett többé diabeteses (67). Nem konjugálva, karrier molekula nélkül adva megállította az autoimmun folyamatot anélkül, hogy hiperglikémiát indukált volna (67). Az effektív dózis 7 hetes korban 50-100ug volt, egyszeri szubkután adagolással. Ennél nagyobb dózissal nem értek el jobb hatást, és az egész molekula szükséges volt a megfelelő hatás eléréséhez, sem a molekula C, sem N terminálisa nem volt hatékony. Egy másik erősen immunogén peptiddel, a p278-al sem lehetett megelőzni a betegséget, pedig ez ellen is kimutatható spontán immunreakció NOD egerekben (68). A kezelés időpontjától függött a hatás. Ha 7 illetve 12 hetes korban adták, akkor egy egér sem pusztult el és az egerek több mint fele egészséges maradt. 15 hetes korban adva, amikor az egereknek már 50%-a diabeteses, sikerült a mortalitást szinte nullára csökkenteni és az egerek fele teljesen meggyógyult. Még 17 hetes korban is hatékony volt, amikor az egereknek már 80% diabeteses volt: 40. hétre 30% egészséges volt, 10% halt meg, szemben a BSA-val kezelt kontroll csoporttal, ahol 80%-os volt a halálozás (68). Vizsgálták a peptid kezelés hatását az insulitisre a szigetek szövettani analízisével: a peptiddel kezelt állatokban jelentősen enyhébb volt vagy egyáltalán nem alakult ki insulitis. A kezelés a T sejt rekativitást is befolyásolta, a kezelés hatására a 14. hét körül egy tranziens reaktivitás növekedés volt megfigyelhető, majd az aktivitás teljesen megszűnt (68). Egy másik kísérletben p277 kezelt egerekből 8 hónapos korban lépsejteket izoláltak és adoptálták 2 hetes NOD egerekbe, ezután a diabetes incidenciájának jelentős csökkenését észlelték a kontroll egerekhez képest. A kezelt állatokban nem voltak olyan T sejtek, melyekkel át lehetett adni a betegséget, míg a nem kezelt egerek T sejtjei képesek voltak diabetest indukálni. Kezelt és nem kezelt állatok T sejtjeit együtt adva megfigyelték, hogy a p277 terápián átesett egerek T sejtjei még szuppresszálták is a potens T sejtek diabetogén hatását: az így T sejteket kapott állatokban csökkent a diabetes incidenciája a pozitív kontrollokhoz képest (68). Felvetették a kérdést, hogy a p277-e az egyetlen olyan peptid, amelyet a diabetes terápiájára fel lehet használni, vagy minden olyan peptid effektív-e amely ellen spotnán T sejt válasz kimutatható. A hsp60 molekula átfedő peptidjeit szintetizálták meg (38db 20-20 aminosavból álló, 5 aminosavval átfedő peptidet), és ezek között találtak még egy immunogén peptidet, ezt p12-nek nevezték el (166-185), de ez ellen a peptid ellen nem észleltek spontán T sejt választ a prediabeteses stádiumban. 10 hetes NOD egereket kezeltek p277-el, p12-vel, a GAD65 molekula p35 nevű peptidjével és M. tuberculosis p278-al. Ezen peptidek mindegyike NOD egerekben immunogénnek bizonyult, ami azt jelenti, hogy adagolásuk után ellenük immun-válasz indukálódott. Spontán válasz 24
egyedül a p277 ellen és a M. tuberculosis p278 ellen volt észlelhető. A diabetes kialakulását csak a p277 és a p12 volt képes gátolni, és ezek a peptidek IgG1 és IgG2b típusú antitestek termelődését indukálták. A 7. hónapban a p277-tel kezelt egereknek 60%-a, a p12-vel kezelt egerek 50%-a nem volt hiperglikémiás. Ezzel szemben a p278al és GAD35-el kezelt állatok 90%-a diabeteses volt ugyanebben az életkorban. A p277 és p12 peptidek elleni antitestek szintje 7 hónapos korban jelentősen emelkedett volt, izotípust tekintve az IgG1 és 2b domináltak. Minél magasabb volt ezeknek az antitesteknek a szintje, annál alacsonyabb vércukorértékek voltak megfigyelhetőek (69). NOD egerekben a p277 peptid Th2 típusú citokinek szintjének emelkedését idézte elő és down regulálta az egyéb béta-sejt antigének elleni autoimmunitást (69). Állatkísérletekben kimutatták, hogy mind a CD4+ helper, mind a CD8+ citotoxikus T sejtek felelőssé tehetőek az autoimmun destrukcióért. Az egér CD4+ T sejteknek funkcionális szempontból két csoportját írták le: Th1 típusú T sejteket, melyek főleg IL2-t (T sejt proliferációt indukál) és proinflammatorikus citokineket (IFN gamma) termelnek, szöveti gyulladást indukálnak és a B sejteket IgG2a típusú antitestek képzésére serkentik. Ezzel szemben a Th2 sejtek IL4-t (B sejtek IgG1 termelését növeli, Th1 proinflammatorikus citokinek termelését szuppresszálja) és IL10-t (indirekt módon gátolja a Th1 aktivációt, antigén prezentációt befolyásolja, proinflammatorikus citokinek termelődését csökkenti, Th1 sejteket down regulálja) (61). Ismert tény, hogy a diabetest csak a Th1 típusú T sejtek képesek átadni, Th2 típusúak nem pathogének, sőt inkább hasznosnak tűnnek. A p277 adagolás tehát hatással van a citokin profil alakulására, és az egyéb béta sejt antigének elleni immunválaszt is módosítja, ennek vizsgálatára a következő kísérletet végezték: NOD egereket a 12 hetes korban 1 alkalommal kezeltek 100ug p277-el, kontrollként M. tbc p278-al és PBS-sel. 5 héttel később a lépből T sejteket izoláltak és a vérből antitesteket mértek GAD, hsp60, insulin és p277 ellen, valamint figyelték a diabetes kialakulását is. A p277-tel kezelt állatok 47%-a volt diabeteses, ezzel szemben a M. tbc p278-al kezelt állatok 83%-a, a PBS-sel kezeltek 90-97%-a. Az antitestek profiljára is hatással volt a kezelés: a kontroll csoportokban (kezelt és nem kezelt is) 80%-os GADA, 90%-os hsp60 At, 50%-os insulin At pozitivitást észleltek és nem volt mérhető p277 elleni antitest. A p277 kezelt állatokban ezzel szemben 80%-os volt a p277 elleni antitest pozitivitás (p<0.0001), és csökkent a GAD, hsp60 és insulin elleni antitestek előfordulása. Ezen kívül izotípus váltást is megfigyeltek: IgG2a helyett komplementet kevésbé aktiváló IgG1 és 2b típusú
25
antitestek termelődtek. A kezelés hatására csökkent a p277 és GAD peptidekre adott T sejt proliferatív válasz, ugyanez nem volt jellemző a p278-ra (61). A p277 terápia megváltoztatta a citokin profilt is, a proinfalmmatikus Th1 válasz helyett az anti-inflammatorikus Th2 válasz lépett előtérbe. Ez csak a p277 peptid hatására volt megfigyelhető, a szintén erősen immunogén p278 és GAD35 nem befolyásolták a citokin profilt (61). Az INF gamma gátolja az insulin szekréciót, in vitro szigetsejt citotoxikus, reguláló hatása van az MHC I és II expresszióra és pozitív feed-back hatása a Th1 T sejtek effektor funkcióira. A terápia hatására az insulitis is csökkent, 2-6 héttel a kezelés után a szigeteken belüli leukocyták száma csökkent, az ép szigetek száma emelkedett (61, 68). Az 1-es típusú diabetes mellitus másik kísérletes modellje a hímnemű egerekben streptozotocin (STZ) által indukált diabetes. A toxin hatása dózisfüggő, egyszeri nagy adagban (200mg/tskg) adva direkt béta sejt toxikus hatással rendelkezik és 2-4 napon belül kialakul a klinikai diabetes. Genetikailag fogékony egerekben ennél kisebb dózisban adva (30-40mg/tskg, 4 napig) viszont autoimmun folyamat indul be, mely immunológiailag nagyon hasonlít a NOD egerekben spontán kialakuló diabetesben észlelthez, és kb. 3 hét alatt alakul ki a cukorbetegség. A toxikus hatás és az immunfolyamatok együtt vezetnek a betegség kialakulásához. Ha még alacsonyabb dózisban adjuk, akkor a prodromális szakasz hossza nő, közelít a spontán diabetes kialakulásának prodromális időszakához, amikor is a diabetes manifesztációja 2-4 hónappal később követi az insulitist. Itt az autoimmunitás dominál a pathogenezisben, a toxikus hatás háttérben van (70). Kipróbálták a toxin különböző dózisait: 40 mg/tskg-t adva 5 napig 2-3 héttel később alakult ki diabetes. Kisebb dózisok esetén később alakul ki a betegség. 30 mg/tskg-t 5 napig adva a 20. nap körül észleltek enyhe hiperglikémiát, mely után a vércukor szint visszatért a normál szintre, majd 2-3 hónap múlva alakult ki a diabetes. A hiperglikémiás időszakban a hsp60 és inzulin elleni antitestek szintjének növekedése volt detektálható. Hsp60 és p277 elleni T sejt válasz 25 nappal a STZ adása után volt kimutatható. Ebben a dózisban tehát a STZ adása és a betegség kialakulása között elég hosszú idő telik el ahhoz, hogy a preklinikai stádium immunológiai változásait jól követni tudjuk. 10 mg/tskg heti egyszeri adásával 10 hétig enyhe perzisztáló hiperglikémiát lehetett indukálni, mely azonban nem progrediált diabetesbe (70). A STZ alacsony dózisa a következő mechanizmussal idéz elő diabetest: mint béta sejt toxin növeli a hsp60 expresszióját a béta sejteken és ezzel fogékonnyá teszi ezeket a sejteket az autoimmun folyamatokra. Az alacsony dózisú STZ által triggerelt 26
autoimmun diabetes immunológiailag hasonló a NOD egerek spontán diabeteséhez: prodromális szakasz van, valamint insulin elleni autoantitestek, hsp60 elleni anitestek és T sejtek és p277 elleni T sejtek megjelenése jellemzi (70). A diabetes mellitus pathogenezisének folyamatát úgy képzelik el, hogy a természetes autoimmunitás diszregulációja következik be genetikailag fogékony egyedekben STZ vagy egyéb nem ismert környezeti faktorok hatására, és egy progresszív autoimmun folyamat indul be, mely a béta sejtek destrukciójához és klinikai diabeteshez vezet. A p277 peptid nemcsak a NOD egerek diabetesét tudja megállítani, hanem a STZ által indukált diabetest is. Az effektív dózisnak 100ug peptid kétszeri adása bizonyult, az első dózist 1 héttel a toxin adása után, a másodikat 85 nappal később adták. Ennek hatására változásokat észleltek a p277 elleni immunitásban: T sejtek helyett IgG1 és IgG2b izotípusú anti-p277 antitestek jelentek meg. A p277 effektívnek bizonyult akkor is amikor még nem volt jelentős az insulitis, és akkor is amikor már kialakult a diabetes. Az előbb említett protokol mellett (7. és 85. napon adva) csak átmeneti hyperglikémiát észleltek a 80. nap körül, később a vércukor szint normalizálódott, ezzel párhuzamosan pedig megfigyelték, hogy a p277-re és hsp60-ra adott T sejt válasz csökkent. GAD34-et és PBS-t használtak kontrollként, egyik sem volt effektív. A p277 terápia itt Th2 típusú (IgG1 és 2b) antitestek termelődését indukálta. A GAD34 lehet, hogy azért nem volt effektív, mert az általa keltett immunitás Th1 típusú (IgG2a). Úgy tűnik tehát, hogy a diabetesre való védelem nem a hsp60 és p277 elleni immunitás inaktiválásával vagy deléciójával magyarázható, hanem inkább az aktiváció Th1-Th2 irányú „átkapcsolásával” (71). A p277 terápiás hatásának pontos mechanizmusa nem ismert. Lehet, hogy anti-idiotípus T sejtek képződését segítik elő, melyek szuppresszálják a p277 elleni diabetogén T sejteket. Az immunrendszer modulációjáról és nem gátlásáról van tehát szó (71). A peptid szerepe human diabetesben még nem tisztázott egyértelműen. Emelkedett p277 elleni T sejt választ találtak 1-es típusú diabeteses betegekben a 2-es típusú diabetesesekhez és az egészséges kontrollokhoz képest (72). Egy randomizált, fázis II stádiumú, kettős vak klinikai vizsgálatban a p277 peptid adagolása diabeteses betegeknél kedvező hatású volt. Ebben a vizsgálatban olyan frissen diagnosztizált 1-es típusú diabeteseseket kezeltek a peptiddel, akiknek a bazális szérum C-peptid szintjük 0.1 nmol/l feletti volt, ami feltételezi, hogy van még saját inzulin teremlésük, azaz működő szigetsejtjeik. A peptidet 1mg-os dózisban szubkután kapták meg a betegek a 0., 1. és 6. hónapban. A 10 hónapos követési idő alatt elsődleges végpontként a glukagon stimulált C-peptid termelést határozták meg, mint a béta sejtek funkciójának 27
jelzőjét. Másodlagos végpontok voltak az exogén inzulin igény, a HgbA1c koncentráció (metabolikus kontroll), illetve a hsp60 és p277 elleni citokin profil változásának vizsgálata. A kezelés kezdetétől számított 10. hónapban szignifikánsan magasabb volt a kezelt betegek glukagonnal stimulált C-peptid termelése, és alacsonyabb az exogén inzulin igénye. Ugyanakkor a HgbA1c koncentráció nem különbözött a két csoportban, ami arra utal, hogy két csoport között észlelt bármilyen különbség nem a metabolikus kontrollal, hanem a peptid kezeléssel függ össze. A p277 peptiddel kezelt betegek hsp60 ra adott interferon gamma termelése alacsonyabb, IL 10 és IL 13 teremlése magasabb volt, mint a placeboval kezelt betegekben. Mivel a kezelés előtt is több betegben ki tudtak mutatni p277 elleni antitesteket, ezért nem vizsgálták a p277 kezelés hatását a peptid elleni antitestek szintjére, indukciójára. Eredményeikből arra következtettek, hogy 1-es típusú diabetesben p277 kezeléssel megőrízhető az endogén inzulintermelés. Mindez valószínűleg a Th1-Th2 citokintermelés átkapcsolása útján valósul meg (73). Felvetődött a kérdés, hogy ha a hsp60 molekula a szervezet minden sejtjében előfordul, hogyan tudnak a hsp elleni T sejtek és antitestek szervspecifikus autoimmun betegséget okozni. Erre vonatkozóan több elméletet is kidolgoztak. Elképzelhető, hogy a különböző szövetekben szövetspecifikus hsp60 epitópok kerülnek prezentálásra a T sejtek felé. A hsp molekulák intracelluláris lokalizációja is mutathat szöveti különbségeket: míg a hsp60 a legtöbb sejtben döntően a mitokondriumokban helyezkedik el, addig a pancreasban a szekretoros granulumokban is megtalálható. Amikor a granulumok fuzionálnak a sejtmembránnal, a hsp60 molekula a sejtek felszínére illetve szekretálódásra kerül, még akkor is, ha nem éri stressz a sejtet. Egyesek sejt- illetve szövet specifikus poszt-transzlációs processinget feltételeznek. Kimutatták, hogy a béta sejtek maguk képesek a hsp60 molekulát prezentálni, nem igényelnek antigén prezentáló sejteket. Mindemellett a béta sejtek különösen érzékenyek oxidánsokra és egyéb toxikus ágensekre. A T sejtek károsító hatására szövetei antigének szabadulnak fel, melyek szövetspecifikus destructióhoz vezető kaszkád reakciót indítanak el. Lehetséges, hogy a folyamatot elindító trigger a szövetspecifikus: a vírus, kémiai anyag vagy táplálékalkotó lokálisan hsp60 expresszió fokozódáshoz vezet (interferon gamma vagy más intermedier útján), így a saját szövet targetjévé válik az egyébként normálisan is jelen lévő saját ellen irányuló hsp60 reaktív T sejteknek.
28
5. CÉLKITŰZÉSEK Doktori munkám célja a hősokkfehérjék elleni humorális immunreakció vizsgálata volt különböző autoimmun kórképekben. Az irodalomban számos, egymásnak ellentmondó közlemény jelent meg a témában, és a hősokkfehérjék elleni immunitás pathogenetikai szerepe még mindig nem tisztázott egyértelműen. Vizsgálataink fő célkitűzései a következőek voltak: 1. Hősokkfehérjék (humán hsp60, Mycobacterium bovis hsp65) elleni antitestek megatározása autoimmun kórképekben (szisztémás lupus erythematosus, SLE; polymyositis/ dermatoymositis, PM/DM; rheumatoid arthritis, RA; Raynaud szindróma, RS; nem differenciált kollagén betegség, NDC; szisztémás sclerosis, SSC; diabetes mellitus, DM) 2. C1q elleni antitestek meghatározása szisztémás autoimmun betegcsoportokban és ezen antitestek kapcsolatának vizsgálata különböző klinikai és laboratóriumi paraméterekkel SLE-ben 3. A C1q és hsp elleni antitestek korrelációjának, keresztreakciójának vizsgálata ugyanezen kórképekben. Ennek célja az volt, hogy igazoljuk vagy megcáfoljuk a korábban HIV fertőzöttekben észlelt szoros korrelációt és keresztreakciót más betegcsoportokban is. Autoimmun kórképek vizsgálatát az indokolta, hogy mind a hősokkfehérjék ellen, mind C1q ellen már leírtak az irodalomban emelkedett antitest szintet. 4. A hsp elleni antitestek epitópspecificitásának vizsgálata és a p277 elleni antitestek szintjének mérése 1-es típusú diabetes mellitusban. A hsp és p277 elleni antitestek kapcsolatának vizsgálata egyéb diabetesre jellemző autoantitestekkel (szigetsejt elleni antitest, glutaminsav dekarboxiláz elleni antitest, IA-2- vagy tirozin foszfatáz elleni antitest). A humán hsp60 molekulának korábban leírt erősen immunogén peptidje (p277) ugyanis állatkísérleti modellekben protektívnek és terápiás hatásúnak bizonyult, és mivel humán vizsgálatok ebben a témában alig történtek ezidáig, érdekesnek tűnt a peptid elleni antitestek szintjének meghatározása diabeteses gyermekekben, egészséges kontrollokhoz hasonlítva. A leírt vizsgálatok eredményeit elemezve közelebb kerülhetünk számos, eddig részleteiben nem tisztázott, összetett etiológiájú és pathomechanizmusú immun-mediált kórkép természetének megismeréséhez és a természetes autoimmunitás pontosabb megértéséhez. 29
6. MÓDSZEREK 6.1. Betegek és kontrollok A 60- és 65kD-os hősokkfehérjék elleni- illetve a C1q elleni antitestek szintjét 122 szisztémás lupus erythematosusban szenvedő betegben vizsgáltuk. Közülük 73 beteg állt a Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinikáján gondozás alatt 1988 és 1997 között (átlag életkor: 39 év, 66 nő, 7 férfi), 49 beteget a Pécsi Orvostudományi Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikáján kezeltek 1997-98-ban (átlag életkor: 41 év, 39 nő, 10 férfi). Ugyanezen antitestek szintjét egyéb autoimmun betegcsoportokban is vizsgáltuk: 14 gyulladásos myopathiában (polymyositis/dermatomyositis) (áé: 48 év, 12 nő, 2 férfi), 21 rheumatoid arthritisben (áé: 46 év, 15 nő, 6 férfi), 27 Raynaud syndromában (áé: 46 év, 21 nő, 6 férfi), 33 nem differenciált kötőszöveti betegségben (áé: 42 év, 33nő), 55 szisztémás sclerosisban (áé: 50 év, 49 nő, 6 férfi) szenvedő betegben, akik mindannyian a Pécsi Orvostudományi Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikáján álltak gondozás alatt. Kontrollként 192 felnőtt egészséges véradót vizsgáltunk (áé: 47 év, 111 férfi, 81 nő). A C1q ellenes antitestek titerének összefüggését az SLE különböző klinikai és laboratóriumi paramétereivel 137 betegben vizsgáltuk (a korábbi vizsgálati csoport kiegészült új 15 beteggel, akiket szintén a Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinikáján kezeltek 2000-ben, kiegészült csoport átlagéletkora: 39 év, 119 nő, 18 férfi). Az autoimmun betegek esetében a diagnózis felállításához a nemzetközileg elfogadott általános betegség-kritériumokat alkalmaztuk (74, 75). Az SLE aktivitásának meghatározása különböző klinikai és laboratóriumi paraméterek alapján történt a betegek kezelőorvosainak közvetlen segítségével. Figyelembe vettük a vizsgálat (vérvétel) idején meglévő szervi manifesztációkat (arthritis, bőrtünetek, serositis, központi idegrendszeri tünetek, általános tünetek – láz, szubfebrilitás, testsúlycsökkenés) és jellegzetes laboratóriumi eltéréseket (gyorsult vörösvértest süllyedés, anti-dsDNA, csökkent C3 szint, proteinuria-haematuria). Meghatároztuk a SLEDAI indexet is (szintén nemzetközi kritériumoknak megfelelően – 90). A nephritist perzisztens proteinuria (>0.5g/24 óra) és/vagy haematuria (> 5 vvt/látótér) jelentette, miután infectiót, kövességet és egyéb lehetséges okokat kizártunk. A humán hsp60 és M. bovis 65 elleni antitestek szintjét, a humán– és Mycobacterium bovis p277 peptid elleni antitestek titerét, az ICA-t, GADA-t és IA-2 At szinteket 83 30
frissen diagnosztizált 1-es típusú diabetes mellitusos gyermekben (áé:10 év, 1-16, 36 lány, 47 fiú) határoztuk meg. A gyermekeket a Semmelweis Egyetem I. sz. Gyermekgyógyászati Klinikáján gondozták. A diagnózis és a vérvétel időpontja között eltelt idő kevesebb volt, mint 1 hónap. A diagnózis napja az a nap volt, amelyen a hiperglikémiát észlelték. A diagnózis felállítása a jellegzetes klinikai tünetegyüttes – hiperglikémia, ketonuria, polyuria, polydipsia – alapján történt, a WHO kritériumoknak megfelelően. Minden beteg azonnal inzulin kezelésre szorult. Kontrollként 81 egészséges gyermeket vizsgáltunk (áé: 11 év, 1-19, 34 lány, 47 fiú), akiknek első fokú rokonai között nem volt diabeteses. 6.2. Felhasznált anyagok Antigének A C1q elleni antitestek méréséhez BioRex 70 és BioGelA5 oszlopokon szekvenciális chromatographia eljárással humán plazmából izolált C1q-val fedtük a lemezeket (76). A humán rekombináns hsp60 (SPP-740, batch: 712403) antigén a StressGen Biotechnologies cégtől (Victoria, Canada) származott, a rekombináns Mycobaterium bovis hsp65-t (batch: MA14) az UNDP/World Bank /WHO Program támogatásával Németországból kaptuk (GBF, Braunschweig, Germany). A humán és Mycobacterium bovis p277 peptideket az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban szintetizálták Boc/Bzl stratégiával szilárd fázisú peptidszintézis módszerével, 4-metil-benzhidrilamin gyantán. A peptidek tisztítása gradiens elúcióval fordított fázisú HPLC-vel történt (eluens: 0.1%TFA/víz-acetonitril). A peptideket tömegspektrometriás módszerrel azonosították. A human p277 szekvenciája: VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED, a M.bovis p277 szekvenciája: VAGGVTLLQAAPTLDELKLEGDE. A humán p277 peptid 2 cystein helyén valint tartalmaz, mivel az eredeti molekula oxidációra érzékeny és rendkívül instabil, ez az aminosav csere az immunológiai tulajdonságok, antigenitás változtatása nélkül növeli a molekula stabilitását (61). A vizsgálatokhoz használt antitestek (anti-hsp60, különböző anti-human IgG-k, anti DIG-HRP) származási helyének leírása a vizsgálati módszerek között szerepel.
31
6.3. Vizsgálati módszerek Hősokkfehérjék elleni antitestek titerének mérése A hősokkfehérjék elleni antitestek szintjének meghatározására szilárd fázisú ELISA módszert vezettünk be. A lemezeket (Enzy-Plate, Propilen Ltd., Pécs, Hungary) human rekombináns hsp60 és Mycobacterium bovis hsp65 antigénekkel fedtük 0.1ug/well koncentrációban bikarbonát pufferben (pH 9.6, 100ul/well, 4 C-n egy éjszakán át). Egyszeri mosás után (PBS-Tween20 0.05%) 1 órán át blokkoltuk a lemezeket szobahőmérsékeleten PBS-zselatin (0.5%)-Tween (0.05%)-nel. Ismételt mosás után mértük be a szérum mintákat (100-100ul/well PBS-zselatin-Tween-ben, 1:200 higítás, 1 óra inkubálás szobahőmérsékleten). Ezután a lemezeket 5x mostuk, majd nyúlban termelt peroxidázzal konjugált anti-humán IgG-t (DAKO, Dánia) adtunk hozzá (1 óra, szobahőm.). A szubsztrát reakció (5x-i mosás után) ortophenilene diamine (OPD, Sigma, USA)-vel történt citrát pufferben H2O2 jelenlétében. A reakciót kénsavval állítottuk le, az optikai denzitásokat (OD) 490 nm-n (referencia: 620nm) olvastuk le microplate ELISA leolvasó segítségével. Az OD értékeket fedetlen lemezen mért OD-k kivonásával korrigáltuk, az egyes savókat duplikátként mértük. Az antitest koncentrációt önkényes egység/ml-ben (Arbitrary Unit – AU/ml) adtuk meg, melyet nyúlban termelt polyclonalis anti hsp60-al (mely keresztreagál a hsp65-el is) készített standard görbe alapján számoltunk ki. C1q elleni antitestek szintjének mérése A C1q kollagén-szerű farka ellen termelt antitestek szintjének mérése szintén szilárd fázisú ELISA módszerrel történt, melyet Siegert és munkatársai írtak le (77). A lemezek (Maxisorp, Dánia) fedése bikarbonát pufferben oldott C1q-val történt (3ug/well, pH 9.6), majd 2 órán át inkubáltuk 37 C-n. Ezután 3x mostuk PBS Tween20 (0.05%)-nel, majd a savókat 1:30 és 1:60-s higításban 100ul-s térfogatban alkalmaztuk PBSTween20 (0.05%)- delta-FCS (1%) oldatban, melyhez 1M NaCl-t is adtunk. 1 óra 37 Cn történő inkubáció, majd 3x mosás után monoclonalis anti-human IgG-t adtunk hozzá (HB43DIG, 1:2500) PBS-Tween20 delta-FCS oldatban 100ul/well mennyiségben. Ismét 1 óra 37 C-n történő inkubációt és 3x mosást követően második antitestkentként anti-DIG HRP-t alkalmaztunk (1:5000 PBS-Tween20-delte-FCS-ben, 100ul/well), 1 óra 37 C. A szubsztárt-reakciót ABTS és H2O2 jelenlétében végeztük, az optikai denzitást
32
415nm-n olvastuk le. Az egyes savók anti C1q titerét önkényes egység/ml-ben (AU/ml) adtuk meg, magas antitest-titerű human szérumot használva standardként. 192 egészséges véradóban kapott értékek átlaga+2 S.D.-t tartottuk felső normál határértéknek, ez esetünkben 66 AU/ml volt, amely közel áll az irodalomban korábban leírtakhoz. Kompetitív ELISA C1q és hősokkfehérjék elleni antitestek keresztreakciójának vizsgálatára Anti-C1q és anti-hsp60 és anti-hsp65 At-ek közötti keresztreakció bizonyítására kompetitív ELISA módszert alkalmaztunk. A lemezeket (Enzy-Plate, Propilen Ltd., Pécs, Hungary) 5 ug/ml C1q-val fedtük. Ezután humán rekombináns hsp60-t illetve M. bovis hsp65-t, rekombináns CD4-et, tisztított C1q-t, valamint kontrollként PBS puffer oldatot kevertünk össze NDC-s beteg magas anti-hsp60 tartalmú szérumából tisztított IgG higítási sorozatával (végső koncentráció: 20 ug/ml – 10ng/ml) és ezt adtuk a lemezekhez. A kötődött IgG-t peroxidázzal jelzett kecske-anti-human IgG (Dako, Dánia) és OPD (Sigma, St. Louis, USA) segítségével detektáltuk. IgG tisztítás 200ul magas anti-C1q (124 U/ml), anti-hsp60 (257 U/ml), és anti-hsp65 (40 U/ml) tartalmú, nem differenciált kollagénbetegségben szenvedő betegtől származó savót futtattunk „Protein-G Sepharose 4 Fast Flow” oszlopon (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Az IgG-t 50 mM citrát-foszfát pufferben mostuk ki (pH 3.0), a preaparátum tisztaságát és koncentrációját Lowry fehérje meghatározási módszerrel és IgG specifikus ELISA-val ellenőriztük. Összesen 800ug IgG-t tisztítottunk.
P277 peptid elleni antitestek titerének mérése Az anti-human és anti-M. bovis p277 peptidek elleni antitestek mérésére a laboratóriumunkban működő anti-hsp ELISA módosított változatát alakítottuk ki. A fedés human- illetve M. bovis p277 peptiddel történt (Enzy-Plate, Propilen Ltd., Pécs, Hungary) 1ug/well koncentrációban 50ul/well desztillált vízben oldva, 1 éjszakán át szárítva. Ezután a hsp-ELISA-nál leírt protokollt használtuk, azonos oldószereket, anyagokat, higítási arányokat, inkubációs időket és detektálási rendszert használva. Standardként egy igen magas antitest titerű human savó higítási sorát használtuk.
33
Epitóp-analízis Az epitóp analízis első lépéseként Chou-Fasman analízis segítségével megbecsültük a hsp60 és 65 molelulákon a valószínűleg antigénként szereplő béta-kanyarulatokat. Ezután 92 dekamer, 5 aminosavval átfedő peptidszakaszt szintetizáltunk polyethylen tűk hegyén, a várható epitóp-régióknak megfelelően. Módosított ELISA módszerrel mértük meg a tűk hegyéhez kötött peptidekhez kötődő antitestek szintjét (59). Szigetsejt elleni antitestek (ICA) mérése A szigetsejt elleni antitesteket indirekt immunfluorescenciás módszerrel mértük humán pancreas cryostatos metszeteit használva antigénként, standardizált protokoll szerint (78). Laboratóriumunk validitása 73%-os volt a 12. ICA IDW Proficiency program szerint, 100%-os specificitással és konzisztenzitással. A detektálási határ 10 JDFU volt. Glutaminsav dekarboxiláz elleni antitestek mérése A GAD elleni antitestek szintjének mérése radio-immuno assay módszerrel, kereskedelmi anti-GAD kittel (B.R.A.H.M.S., Germany) történt. A normál értéktartomány felső határa 0.9 U/ml volt. IA-2 antitestek meghatározása Radio-immuno assay módszerrel törént az IA-2 antitestek meghatározása is (Cent-A.K. IA-2 antibody kit, Medipan, Germany). A felső normál határérték 0.75 U/ml volt. Egyéb laboratóriumi módszerek A C3 koncentrációt radio-immundiffúziós módszerrel, az anti-DNA antitesteket indirekt immunfluorescenciával
(Biosystems,
Barcelona,
Spain),
a
serum
alpha-2-HS
glikoprotein szintet rakéta-immunelektroforézissel határoztuk meg (részletesebben: 79, 80). 6.4. Statisztikai analízis A statisztikai analízist a GraphPad Prism3 (San Diego, CA, USA) computer program segítségével végeztük el. Mivel a mért változók nem mutattak normál eloszlást, nem paraméteres teszteket használtunk. Az egyes csoportok összehasonlítását MannWhitney U teszttel és többszörös logisztikus regressziós analízissel végeztük. A 34
különböző változók közötti korreláció vizsgálatára a Spearman féle korrelációs tesztet használtuk. Nem folyamatos adatok esetében a Fischer féle exact tesztet alkalmaztuk. P<0.05 értéket fogadtuk el statisztikailag szignifikánsnak.
35
7. EREDMÉNYEK 7.1. Hsp60, hsp65- illetve C1q elleni antitestek előfordulása autoimmun kórképekben, korreláció a vizsgált antitestek szintje között C1q és human hsp60- illetve M.bovis hsp65 elleni antitestek szintjét mértük meg különböző autoimmun betegcsoportokban illetve kontrollként egészséges felnőtt véradókban. Szignifikánsan (p<0.0001) magasabb anti-C1q titert találtunk az SLE-s betegekben (133.3 25.57 AU/ml, átlag SEM) a kontroll csoporthoz viszonyítva (7.52 2.14 AU/ml). Nem volt szignifikáns különbség a többi autoimmun betegcsoport és a kontroll csoport között (2. ábra).
200
AU/ml
p<0.0001
100
0 kontroll SLE PM/DM
RA
RS
NDC
SSC
2. ábra: Anti-C1q antitestek szintje autoimmun betegcsoportokban és egészséges kontrollokban (átlag+SEM). Az SLE-s betegcsoportban szignifikánsan magasabb C1q antitest szint észlelhető, mint a kontroll csoportban (p<0.0001). A többi betegcsoport esetében nincs szignifikáns különbség.
Magas antitest titert észleltünk (pozitív anti-C1q: egészséges kontrollokban mért átlag+2 S.D. – ami ebben a vizsgálatban 66 AU/ml volt) az SLE-s betegek 28,7%-ában (35/122), a Raynaud szindrómás betegek 3,7%-ában (1/27), az NDC-ben szenvedő
36
betegek 9.1%-ában (3/33), a szisztémás sclerosisos betegek 5.5%-ában (3/55) és az egészséges kontrollok 2.1%-ában (4/192). Nem találtunk pozitív beteget a gyulladásos myopathiában és rheumatoid arthritisben szenvedők között. A különbség a C1q antitest pozitív SLE-s betegek és az egészségesek között erősen szignifikáns volt (p<0.0001), az anti-C1q pozitív betegek relatív kockázata arra, hogy SLE-sek legyenek 14 (CI: 5-38) volt az anti-C1q negatív betegekhez viszonyítva. A C1q antitestekkel ellentétben sem az anti-hsp60, sem az anti-hsp65 antitestek szintje nem tért el a kontrollokétól SLE-s betegekben. Az NDC csoportban a kontrollokhoz képest szignifikánsan magasabb anti-hsp60 (217 34 AU/ml vs. 139.6 10 AU/ml, p=0.0061) és anti-hsp65 (31 6.3 AU/ml vs. 18.9 2.1 AU/ml, p=0.036) szinteket észleltünk. A többi csoportban nem volt különbség a hősokkfehérjék elleni antitestek szintjében, ugyanakkor meg kell említeni, hogy a hsp65 antitestek vonatkozásában a szignifikancia határán (p=0.051) lévő különbséget észleltünk a szisztémás sclerosisos és a kontroll csoport között (3. ábra A, B). Magas anti-hsp65 antitest szintet (átlag+2 S.D. – azaz 77U/ml – feletti értéket) találtunk az NDC-s betegek 15.2%-ában (5/33), (p=0.0094, relativ risk: 3.2, CI: 1.2-9.0) szemben a kontroll csoporttal, ahol 4.7%-os volt a magas hsp65 antitest titerűek aránya (9/192). Magas anti-hsp60 antitest szintet (átlag+2 S.D. – azaz 416U/ml – feletti értéket) szintén az NDC csoportban észleltünk, ugyancsak a betegek 15.2%-a volt magas antitest titerű (5/33), míg a kontroll csoportban 6/192 egyén (3.1%), (p=0.01, relativ risk: 4.85, CI: 1.57-15.0). Megnéztük a korrelációt a vizsgált antitestek szintje között. Szignifikáns pozitív korreláció volt az anti-hsp60 és anti-hsp65 antitestek titere között minden vizsgált csoportban. A C1q antitest és az anti-hsp60At szintek között nem észleltünk korrelációt egyetlen csoportban sem, míg a C1q antiestek titere az anti-hsp65At szinttel gyenge, de szignifikáns pozitív korrelációt mutatott az NDC csoportban. Az SLE, NDC és kontroll csoportokban kapott korrelációs eredményeket az 5. táblázat mutatja. Összehasonlítva a hsp60 és hsp65 elleni antitestek szintjét egy-egy csoporton belül attól függően hogy volt-e mérhető C1q ellenes antitest szintjük vagy nem, szignifikáns különbséget egyedül az NDC csoportban észleltünk: azokban a betegekben, akikben voltak C1q ellenes antitestek, magasabb volt a hsp65 antitestek szintje (6. táblázat).
37
A 300
p=0.0061 p=0.77 p=0.34 p=0.68
200
AU/ml
p=0.28
p=0.06 100
0 kontroll
SLE
PM/DM
RA
RS
NDC
SSC
B
50
p=0.61
p=0.036
AU/ml
40
p=0.051 p=0.16
30
p=0.2 p=0.88
20
10
0 kontroll
SLE
PM/DM
RA
RS
NDC
SSC
3. ábra: Anti-hsp60 (A) és anti-hsp65 (B) antitest szintek az egyes csoportokban (átlag+SEM). Az NDC csoportban a kontrollokhoz képest szignifikánsan magasabb anti-hsp60 (p=0.0061) és anti-hsp65 (p=0.036) szinteket észleltünk. A többi csoportban nem volt különbség a hősokkfehérjék elleni antitestek szintjében.
38
Vizsgálati
C1qAt és anti-
C1qAt és anti-
Anti-hsp60 and
csoportok
hsp60 antitest
hsp65 antitest
anti-hsp65 antitestek
Spearman R (p érték) Egészséges
0.024 (n.s.*)
0.108 (n.s.)
0.216 (0.0026)
SLE (n=122)
- 0.041 (n.s.)
- 0.019 (n.s.)
0.549 ( 0.0001)
NDC (n=33)
0.211 (n.s.)
0.416 (0.016)
0.437 (0.0109)
kontrollok (n=192)
*n.s.: nem szignifikáns 5. táblázat: C1q-, hsp60 és hsp65 elleni antitestek közötti korreláció
39
Vizsgálati
C1q At nem C1q At
csoportok
mérhető
P érték*
mérhető
C1q At nem C1q At mérhető
mérhető
Anti-hsp60, medián (25-
Anti-hsp65, medián (25-
75% percentilis)
75% percentilis)
Egészséges 100.8 (64.4- 99.7 (65.5- n.s.
10.2 (4.83-
14.79
kontrollok 167.1)
179.5)
20.67)
(5.79-
(n=192)
(n=26)
(n=166)
28.90)
(n=166)
P érték*
n.s.
(n=26) SLE
115.1 (75.3- 105.2
n.s.
11.35 (5.93- 9.85 (3.39- n.s.
(n=122)
167.9)
(64.4-
19.58)
23.84)
(n=65)
175.2)
(n=65)
(n=57)
(n=57) NDC
116.7 (75.0- 191.0
n.s.
14.25 (9.65- 43.01
(n=33)
190.4)
(131.1-
17.14)
(22.4-
(n=25)
288.7)
(n=25)
71.76)
(n=8)
0.0125
(n=8)
* Mann-Whitney teszt, n.s.: nem szignifikáns 6. táblázat: Hősokkfehérjék elleni antitestek szérumszintje egészséges, SLE-s és NDC-s betegekben a C1q ellenes antitestek jelenlétének függvényében
40
7.2. Anti-C1q és anti-hsp65 antitestek közötti keresztreakció Annak eldöntésére, hogy a C1q illetve hsp65 elleni antitestek között az NDC-s betegcsoportban észlelt korreláció a megfelelő B sejt klónok szimultán aktivációja-e, vagy pedig az antitestek keresztreakciójának köszönhető, kompetitív ELISA rendszert állítottunk be. Magas anti-C1q, anti-hsp60 és anti-hsp65 antitestekkel rendelkező nem differenciált kötőszöveti betegségben szenvedő beteg szérumából tisztított IgG higítási sorozatát kevertük össze humán rekombináns hsp60-nal, M. bovis hsp65-tel, negatív kontrollként egy másik rekombináns, irreleváns fehérjével (CD4), tisztított C1q-val, illetve kontrollként „üres” PBS oldattal, és adtuk hozzá C1q-val fedett lemezhez. A hsp60 erősen, a hsp65 gyengébben (az irreleváns peptidhez hasonló mértékben) gyengítette az NDC-IgG kötődését a C1q-val fedett lemezhez. A C1q jelenléte nem befolyásolta a kötődést (4. ábra). A humán hsp60 által okozott gátlás dózisfüggő volt (5. ábra), míg a hsp65 és CD4 hatása nem változott a fehérjék dózisának változtatásával.
41
Control C1q hsp60 hsp65 CD4
4. ábra: Rekombináns hősokkfehérjék, CD4 és C1q hatása az NDC-s betegből tisztított IgG kötődésére C1q-val fedett lemezhez. Az ELISA lemezek fedése 5ug/ml C1q-val történt. Magas anti-C1q, anti-hsp60 és anti-hsp65 antitestekkel rendelkező nem differenciált kötőszöveti betegségben szenvedő beteg szérumából tisztított IgG higítási sorozatát kevertük össze humán recombináns hsp60-nal, M. bovis hsp65-tel, negatív kontrollként egy másik rekombináns, irreleváns fehérjével (CD4), tisztított C1q-val, illetve kontrollként „üres” PBS oldattal, és adtuk hozzá C1q-val fedett lemezhez. Az ábrán feltüntetett értékek háromszor megismételt kísérletek eredményeit összesítik.
42
5. ábra: A humán hsp60 molekula dózisfüggő gátló hatása az NDC-s beteg szérumából tisztított IgG és lemezhez kötött C1q kötődésére.
43
7.3. C1q ellenes antitestek kapcsolata egyéb vizsgált paraméterekkel szisztémás lupus erythematosusban Mivel csak az SLE-s betegekben észleltünk a kontrollokénál szignifikánsan magasabb C1q antitest szintet, ebben a kórképben vizsgáltuk tovább a C1q antitestek tulajdonságait, életkorral és néhány SLE-re jellemző klinikai adattal való összefüggését. C1q-antitestek változása az életkor függvényében Szoros negatív korrelációt észleltünk az SLE-s betegek életkora és a C1q antitestek titere között (Spearman korrelációs koefficiens –0.4, p<0.0001). A C1q antitestek tehát gyakrabban voltak jelen a fiatalabb életkorú betegekben. Ha összehasonlítottuk az életkor alapján alacsony-, közepes- és magas tercilisbe tartozó betegeket, szignifikáns különbség adódott az egyes csoportok között (C1q antitest medián (25-75% percentilis): alacsony: 43.08 (0-355.6), közepes: 30.46 (0-142), magas: 0 (0-22.5) U/ml; KruskalWallis teszt p<0.0001). Magas C1q antitest titer (>66 U/ml) volt észlelhető a betegek 45(22/49), 32(13/41) illetve 11(5/47) százalékában, az egyes tercilisekben. Korreláció a C1qAt-ek és különböző laboratóriumi paraméterek között Összehasonlítottuk a C1q antitestek szintjét néhány SLE-re jellemző laboratóriumi paraméterrel. Összehasonlítva magas (>66 AU/ml) és alacsony (<66 AU/ml) C1q antitest titerű betegeket, magas antitest szint esetén szignifikánsan alacsonyabb C3 szintet (p<0.0001, 6. ábra A), magasabb anti-dsDNA szintet (p<0.0001, 6. ábra B) és alacsonyabb alfa2-HSGP szintet észleltünk (p=0.018, 6. ábra C). Korrelációkat vizsgálva: Pozitív korrelációt találtunk a teljes szérum IgG koncentrációval (r=0.33, p=0.0085), az antinukleári faktor (ANF) pozitivitással (r=0.54, p<0.0001) és a dupla szálú DNS (dsDNA) elleni antitest szinttel (r=0.45, p<0.0001). Negatív volt a korreláció a C3 komplement komponens szintjével (r=-0.4, p<0.0001) és az alfa-2HSGP negatív akut fázis fehérje szérumszintjével (r=-0.29, p=0.06). Nem találtunk korrelációt a szérum IgA-, IgM-, alfa-2 makroglobulin-, transzferrin-, alfa-2 haptoglobin-, orozomukoid és immunkomplex szintjével, sem a rheuma faktor pozitivitással.
44
A
mg/dl
200
p < 0.0001
100
0 alacsony C1qAt
magas C1qAt
B
IU/ml
1000
p < 0.0001
100
10
1 alacsony C1qAt
magas C1qAt
C 1000
p = 0.018
g/ml
750
500
250
0 alacsony C1qAt
magas C1qAt
6 ábra: C3-, anti-dsDNA- és alfa2-HSGP szintek alacsony (<66 AU/ml) és magas (>66 AU/ml) C1q antitest titer esetén SLE-s betegekben (vízszintes vonal= medián).
45
Korreláció a C1qAt-ek és az SLE klinikai aktivitása között A klinikai aktivitás és a C1q antitestek kapcsolatát vizsgálva azt találtuk, hogy míg a remisszióban lévő betegeknek csak 15%-ában, az aktív stádiumban lévőknek viszont 41%-ában volt magas C1q antitest titere. A különbség erősen szignifikáns (p<0.0001, Fisher’s exact teszt, odds ratio: 3.96 (95% CI: 1.73-9.03) (7. ábra, 7. táblázat). A C1qAt szintek medián (interquartilis) értéke 0 (0-35), illetve 36.0 (0-262.5) U/ml a remisszióban illetve az aktív stádiumban lévő betegekben (p<0.0001). Figyelembe véve C1q antitestek előforulásának változását az életkorral, multiplex logisztikus regressziós analízis segítségével kiszámoltuk az aktivitás és a C1qAt szint korra igazított kapcsolatát is, a különbség így is szignifikáns maradt (p=0.002). Meghatároztuk a betegek SLEDAI indexét is, az aktivitás illetve súlyosság ezen jelzője is szignifikánsan korrelált a C1q antitestek szintjével (r=0.24, p=0.006).
Betegek száma
100
inaktív aktív
75
50
25
0 C1q At alacsony
C1q At magas
7. ábra: Az inaktív és aktív stádiumban lévő betegek aránya a C1q antitestek szintjének függvényében (alacsony anti-C1q<66 AU/ml, magas anti-C1q>66 AU/ml). P<0.0001
46
Összesen
C1qAt
C1qAt
< 66 U/ml
> 66 U/ml
56
10
66
Aktív SLE-s betegek
41
29
70
Összesen
97
39
136
Inaktív SLE-s betegek
7. táblázat: Aktív és inaktív stádiumban lévő betegek megoszlása szisztémás lupus erythematosusban a C1q antitest titerének függvényében. 21 SLE-s betegtől relapszusban és remisszióban vett szérumminta is rendelkezésünkre állt, így lehetőségünk volt a C1q antitesteknek a klinikai aktivitással való változását nyomon követni. Aktív stádiumban jelentősen (p=0.0017, Wilcoxon teszt) magasabb C1q antitest titert (219.2 87.5 AU/ml) mértünk, mint remissziós fázisban (24.56 12.14 AU/ml. Korreláció a C1qAt-k és különböző szervi manifesztációk között Megvizsgáltuk az összefüggést a C1q antitestek titere és a vérvétel időpontjában fennálló különböző SLE-re jellemző szervi manifesztációk között (8. táblázat). Vese érintettség (nephritis) volt jelen 3/66 (4.5%) inaktív és 19/70 (27%) aktív betegben (p=0.0003, Fischer’s exact teszt), és 11/93 (12%) C1qAt – illetve 11/36 (31%) C1qAt + betegben (p=0.017, Fischer’s exact teszt). Egyetlen kivételtől eltekintve minden C1q pozitív és veseérintettséggel rendelkező beteg klinikailag aktív stádiumban volt. Vese biopszia történt 23 betegben. A C1q antitest titere és a hisztológia (diffúz-proliferatív-, membranosus-, focalis-szegmentális glomerulonephritis) között nem volt összefüggés. Diffúz proliferatív glomerulonephritis volt a szövettana a magas C1q antitest szintű 6 beteg közül 3-nak, az alacsony antitest szintű 17 beteg közül 6-nak, de a különbség nem volt szignifikáns. Mint a táblázatban látható, lymphadenopathia és pleuritis/pericarditis is gyakrabban volt jelen C1q antitest pozitivitás esetén, de a különbségek nem érték el a szignifikancia szintjét. A C1qAt-ek titere nem mutatott összefüggést más szervek érintettségével. A hősokkfehérje elleni antitestek szintje és a klinikai aktivitás illetve különböző szervi manifesztációk között egyáltalán nem találtunk összefüggést.
47
Betegek alacsony ( 66 U/ml)
Betegek magas ( 66 U/ml) C1qAt
P érték
C1qAt szinttel
szinttel
Fisher’s
Klinikai tünetek
Klinikai tünetek
Klinikai tünetek
Klinikai tünetek
exact
-igen
-nem
-igen
-nem
teszt
Nephritis
11 (12%)
82 (88%)
11 (31%)
25 (69%)
0.017*
KIR érintettség
10 (11%)
83 (89%)
5 (14%)
31 (86%)
n.s.
Tüdő érintettség
5 (5%)
88 (95%)
2 (6%)
34 (94%)
n.s.
Lymphadeno-
7 (8%)
86 (92%)
7 (19%)
29 (81%)
n.s.
pathia
(0.06)
Szív érintettség
4 (4%)
89 (96%)
2 (6%)
34 (94%)
n.s.
Pericarditis
2 (2%)
91 (98%)
4 (11%)
32 (89%)
n.s.
és/vagy pleuritis
(0.051)
Polyarthritis
28 (30%)
65 (70%)
14 (39%)
22 (61%)
n.s.
Bőrtünetek
13 (14%)
80 (86%)
9 (25%)
27 (75%)
n.s.
Subfebrilités
5 (5%)
88 (95%)
5 (14%)
31 (86%)
n.s.
3 (3%)
90 (97%)
2 (6%)
34 (94%)
n.s.
21 (23%)
72 (77%)
13 (36%)
23 (64%)
n.s.
6 (6%)
87 (94%)
4 (11%)
32 (89%)
n.s.
vagy láz** Testsúly csökkenés Süllyedés
25
mm/óra Leukocytopenia***
*Fischer’s exact teszt, **
38oC, *** 4000 sejt/µl, n.s.: nem szignifikáns
8. táblázat: Klinikai tünetek és a C1q antitest szint közötti összefüggés
48
7.4. Hősokkfehérjék elleni antitestek 1-es típusú diabetes mellitusban A humán hsp60- és Mycobacterium bovis hsp65 elleni antitestek szintjét frissen diagnosztizált diabeteses gyermekekben és negatív családi anamnézisű egészséges gyermekekben hasonlítottuk össze. Nem találtunk különbséget a két csoport között egyik antitest szintjében sem (9. táblázat). A hsp60 és hsp65 elleni antitestek szintje egymással szoros korrelációt mutatott mindkét csoportban (diabeteses csoport: Spearman r=0.27, p=0.01; kontroll csoport r=0.4, p=(0.0002).
1. típusú diabeteses
Egészséges gyermekek
gyermekek
n=81
MannWhitney
n=83
teszt
AU/ml, medián (25-75 percentilis)
P érték
Anti-hsp 60 At
183.8 (113.2-270)
189 (98.81-273.7)
n.s.
Anti-hsp 65 At
53.63 (35.06-92.24)
57.92 (35.99-105.7)
n.s.
9. táblázat: Hősokkfehérje elleni antitestek diabeteses és egészséges gyermekekben
7.5. P277 elleni antitestek 1-es típusú diabetes mellitusban Mind az anti-humán, mind az anti-M. bovis p277 antitestek szintje (medián, 25-75 percentilis) szignifikánsan (humán: p=0.0002, M. bovis: p=0.0044) magasabb volt diabeteses gyermekekben (humán: 20.75 (13.07-27.27) AU/ml; M. bovis: 16.71 (13.0222.68) AU/ml) mint egészséges kontrollokban (humán: 12.48 (9-20.39) AU/ml, M. bovis: 12.88 (9.31-20.37) AU/ml) (8. ábra A, B). Többszörös logisztikus regressziós analízissel számolva a magas anti-p277 ellenes (akár humán akár M. bovis) antitest szintű gyermekek 2-3 szor nagyobb eséllyel tartoznak a diabeteses csoportba, mint az alacsony antitest titerű gyermekek (Odd’s ratio (95%CI) humán p277: 3.44 (1.93-6.15), M. bovis p277: 2.28 (1.33-3.89), 10. táblázat), életkorra és nemre való illesztés után is.
49
Antitest
P érték
Odd’s ratio (valószínűségi arány (95%CI)
Anti-hu-p277At
0.0003
3.44 (1.93-6.15)
Anti-Mb-p277At
0.0019
2.28 (1.33-3.89)
Anti-hu-hsp60At
0.3443
1.23 (0.8-1.9)
Anti-Mb-hsp65
0.2122
0.65 (0.402-1.04)
Életkor
0.1825
-
Nem
0.6922
-
10. táblázat: P277-, hsp60/65 ellenes antitestetek és az 1-es típusú diabetes mellitus kapcsolatának elemzése többszörös logisztikus regressziós analízissel, korra és nemre igazítva
Erős pozitív korelációt észleltünk a humán és M. bovis p277 elleni antitestek szintje között mindkét csoportban (diabeteses gyermekek: r=0.6563, p<0.0001, egészséges gyermekek: r=0.7981, p<0.0001, Spearman teszt). Az antitestek szintjét 80 egészséges felnőtt véradóban is megmértük. Az anti-humán p277 antitest szint magasabb volt egészséges gyermekekben (12.48 (8.03-18.45) AU/ml) mint felnőttekben (9.8 (6.36-15.8) AU/ml), de a különbség nem volt szignifikáns. Ellenkező eredményt kaptunk az anti-M. bovis antitestek vonatkozásában: felnőttekben (16.5 (7.97-33.8) AU/ml) szignifikánsan (p=0.0438, Mann Whitney teszt) magasabb titert mértünk, mint gyermekekben (12.88 (6.26-24.12) AU/ml)(9. ábra, A, B).
50
A p=0.0002
AU/ml
100
10
1
diabeteses
egészséges
B p=0.0044
AU/ml
100
10
1
diabeteses
egészséges
8. ábra: Anti-humán (A) és anti-M. bovis (B) p277 elleni antitestek szintje diabeteses (dm, n=83)- és egészséges (eg, n=81) gyermekekben. Az ábrákon jelölt vízszintes vonal a mediánokat jelzi. Mind az anti-humán, mind az anti-M. bovis p277 antitestek szintje (medián, 25-75 percentilis) szignifikánsan (humán: p=0.0002, M. bovis: p=0.0044) magasabb volt diabeteses gyermekekben, mint egészséges kontrollokban.
51
A p=0.06
AU/ml
100
10
1
gyermek
felnõtt
B p=0.0438
AU/ml
1000
100
10
1
gyermek
felnõtt
9. ábra: Anti-humán (A) és anti-M.bovis (B) p277 elleni antitestek szintje egészséges gyermekekben (n=81) és egészséges felnőttekben (n=80). Az ábrákon jelölt vízszintes vonal a mediánokat jelzi. Az anti-humán p277 antitest szint magasabb volt egészséges gyermekekben mint felnőttekben, de a különbség nem volt szignifikáns (p=0.06). Ellenkező eredményt kaptunk az anti-M.bovis antitestek vonatkozásában: felnőttekben szignifikánsan (p=0.0438, Mann Whitney teszt) magasabb titert mértünk, mint gyermekekben.
52
A p277 elleni antitestek specificitásának bizonyítása A p277 elleni antitestek specificitásának bizonyítására egy magas p277At szintű gyermek savójából IgG-t tisztítottunk. Az így tisztított IgG-nek p277-hez való kötődését sikerült specifikusan gátolnunk a teljes hsp60 molekulával, míg kontrollként használt BSA nem gátolta az IgG/p277 kötődést (10. ábra).
10. ábra: A hsp60 molekula gátolja a p277 és a magas p277 antitest titerű diabeteses gyermek savójából tisztított IgG kötődését. Az ábra 1 és 5 mikrogramm/ml IgG esetén a mutatja a hsp60 blokkoló hatását. A kontrollként használt BSA-nak nem volt gátló hatása.
53
7.6. A hsp60 elleni antitestek epitópspecificitásának vizsgálata 1-es típusú diabetes mellitusban Megvizsgáltuk, hogy melyek lehetnek azok a specifikus linearis epitópok, amelyek ellen az anti-hsp60 antitestek irányulnak. Átfedő peptidsorozatot szintetizáltunk polietilén tűk hegyén a feltételezett hsp60 és hsp65 epitóp régióknak megfelelően. 8 diabetes mellitusos és 11 egészséges gyermek szérumának reaktivitását vizsgáltuk a peptidek ellen (11. ábra). Olyan szérumokat válogattunk mindkét csoportból, amelyekben magas anti-hsp60At szintet mértünk. Szignifikáns különbséget (p<0.0001) a diabeteses és az egészséges csoport között a vizsgált epitóp régiók közül kettőben találtunk. Ezek a hsp60 AA394-413 és AA435-454 illetve hsp65 AA366-385 és AA408-427 régióknak felelnek meg, a diabeteses gyermekek jelentősen magasabb reaktivitást mutattak ezen két peptid ellen mint az egészségesek (12. ábra). Az említett hsp60 és 65 peptidek homológok, aminosav szekvenciájuk nagyon hasonló. 7.7. Egyéb diabetesre jellemző antitestek (ICA, GADA, IA-2At) vizsgálata Néhány egyéb, autoimmun diabetesre jellemző antitestet (ICA, GADA, IA-2) is meghatároztunk a diabeteses gyermekekben, illetve részben az egészségesekben (ICA) is. A diabeteses csoportban a gyermekek 48%-a (40/83) volt ICA pozitív, 56%-a (47/83) GADA pozitív és 55%-a (46/83) IA-2 pozitív. A kontroll csoportban nem észleltünk ICA pozitivitást. Vizsgáltuk az összefüggést a különböző antitestek előfordulása illetve szintje között. Nem volt korreláció az ICA és az anti-hsp- vagy antip277 szintek között. Nem korrelált sem a GADA, sem az IA-2 szint a hősokkfehérje és a peptid elleni antitest titerrel. Az irodalmi adatoknak megfelelően az ICA és GADA pozitivitás között pozitív korrelációt észleltünk (r=0.3, p=0.0045). Gyenge összefüggést találtunk az IA-2 antitest szint és az ICA pozitivitás között (r=0.2372, p=0.0308), nem volt viszont korreláció az IA-2- és a GADA szintek között.
54
0
kvtlgpkgrn 26-55 91-120 136-160
gyermek (fekete) antitestjeinek átlag
55 176-235 276-290 341-360 366-385 408-427
epitóprégiót, ahol szignifikáns különbség volt a beteg és a kontroll csoport között.
val határoztuk meg. Az egyes oszlopok 11 egészséges (fehér) illetve 8 diabeteses
SEM értékeit jelzik. A nyilak jelzik azt a két 441-480
11. ábra: Diabeteses gyermekek anti-hsp60 és anti-hsp65 antitestjeinek
epitópspecificitása. Az átfedő peptidekkel reagáló antitestek szintjét módosított ELISA502-521
aglfltteav tteavvadkp
469-508
naasiaglfl
ghglnaqtgv
rnlpaghgln
vaekvrnlpa
lepgvvaekv
435-454
afnsglepgv
plkqiafnsg
valeaplkqi
qaaptldelk
gvtllqaapt
394-413
ivagggvtll
ikagaateve
ggvavikaga
368-387
laklaggvav
ensdsdydre
irqeiensds
303-317
grvaqirqei
rrkamlqdma
203-262
pgfgdrrkam
tvkdllplle
sskvstvkdl
yillvsskvs
vledpyillv
erqeavledp
fvtdperqea
162-186
yisgyfvtdp
rfdkgyisgy
ltegmrfdkg
glqleltegm
esntfglqle
gdqsigdlia
aaisagdqsi
117-146
qiaataaisa
vetkeqiaat
plglkrgiek
aaganplglk
glnrvaagan
52-81
alvreglrnv
tvlaqalvre
titndgvsia
kwgaptitnd
vvlekkwgap
taevvvteip
asllttaevv
daagvasllt
evgydamagd
mqsssevgyd
ivekimqsss
vegsliveki
aknagvegsl
pamtiaknag
rtlkipamti
rcipaldslt
gcallrcipa
ivlgggcall
lkvggtsdve
dgvavlkvgg
laklsdgvav
ldvttseyek
eiieqldvtt
ekriqeiieq
nrknqlkdma
pgfgdnrknq
siqsivpale
ekkissiqsi
yvllsekkis
efqdayvlls
kgqkcefqda
fintskgqkc
yispyfints
kfdrgyispy
iiegmkfdrg
dneleiiegm
dgktlndele
ngdkeignii
atisangdke
eiaqvatisa
vttpeeiaqv
pveirrgvml
skganpveir
gfekiskgan
siakegfeki
tvlarsiake
kvtkdgvtva
swgspkvtkd
viieqswgsp
pkgrtviieq
avtmgpkgrt
0
pkgrnvvlek
OD/ODbackground
OD/OD background
human hsp60
5
4
3
2
1
M.bovis hsp65
530-549
10
8
6
4
2
A
B 10
OD/ODbackground
OD/ODbackground
7.5
5.0
2.5
0.0
8 6 4 2 0
LAKLSDGVAV DGVAVLKVGG LKVGGTSDVE
LAKLAGGVAV GGVAVIKAGA IKAGAATEVE
D
C 10.0
OD/ODbackground
OD/ODbackground
7.5
5.0
2.5
7.5
5.0
2.5
0.0
0.0 IVAGGGVTLL GVTLLQAAPT QAAPTLDELK
IVLGGGVALL GVALLRVIPA RVIPALDSLT
12. ábra: 8 diabeteses és 11 egészséges gyermek szérumának reaktivitása a humán hsp60 (A) és M.bovis hsp65 (B) molekula GAD szerű epitópja (hsp60: AA394-403, 399-408, 404-413, A; hsp65: AA366-375, 371-380, 346-385, B) valamint p277 epitópja (hsp60 –C, hsp65 –D) ellen (hsp60: AA346-445, 441-450, 446-455, C; hsp65: AA408417, 413-422, 418-427, D). A polietilén tűk hegyén szintetizált peptid epitópok elleni antitest reaktivitást módosított ELISA módszerrel mértük meg. A két csoport közötti különbség erősen szignifikáns mindegyik ábrázolt rövid peptidszakasz esetében (p<0.0001).
56
8. MEGBESZÉLÉS 8.1. A hősokkfehérjék és a C1q elleni antitestek vizsgálata autoimmun kórképekben A hősokkfehérje ellenes antitestek szerepét, viselkedését különböző szisztémás illetve szervspecifikus autoimmun betegségekben vizsgáltuk. Célunk az volt, hogy minél több betegcsoportban meghatározuk a hsp60 illetve 65 elleni antitestek szintjét, meghatározzuk viszonyukat az egyes betegségekre jellemző egyéb (auto)antitestekkel, jellegzetes klinikai és laboratóriumi paraméterekkel, vizsgáljuk az antitestek epitópspecificitását, mindezzel közelebb kerülve a hősokkfehérjék és az ellenük irányuló immunválasz szerepének pontosabb megértéséhez. Hősokkfehérje ellenes antitesteket korábban több kutatócsoport is vizsgált autoimmun betegségekben, az eredmények azonban igen ellentmondásosak. Néhány szerző emelkedett hősokkfehérje ellenes antitest szintet észlelt szisztémás lupus erythematosusban és rheumatoid arthritisben szenvedő betegekben (39), más szerzők viszont nem találtak különbséget SLE-s betegek és egészséges kontrollok hsp65 antitest szintje között (41). A hsp60, hsp70 és hsp90 elleni antitestek szerepe felmerült emellett spondylosis ankylopoeticában, gyulladásos bélbetegségekben, autoimmun thyreoiditisben, szisztémás sclerosisban és diabetes mellitusban is (81). Az eredményeket azonban kellő kritikával kell értékelnünk, nincs ugyanis általánosan elfogadott standardizált módszer a hősokkfehérje ellenes antitestek mérésére, így a különböző munkacsoportok által publikált eredmények nehezen vethetőek össze. A hsp ellenes antitestek előfordulásának gyakoriságában, eloszlásában, egyes betegcsoportokban mért szérumszintjében észlelt különbségek, illetve az ellentmondásos eredmények részben a mérési módszerek különbözőségéből adódhatnak. A kutatólaboratóriumunkban beállított szilárd fázisú ELISA módszer évek óta megbízhatóan működik, protokollunk hasonló a legtöbb munkacsoport által használt vizsgálati protokollhoz. A vizsgált szisztémás autoimmun kórképek (SLE, NDC, RA, SSc, RS, PM/DM) közül egyedül nem differenciált kollagén betegségben találtunk magasabb hősokkfehérje ellenes antitest titert. A kontroll csoporthoz viszonyítva mind a hsp60, mind a hsp65 elleni antitestek titere magasabb volt. Ez a kórkép egy olyan átmeneti betegcsoportot jelöl, melyben autoimmun betegségekre jellemző klinikai tünetek, laboratóriumi értékek figyelhetőek meg, ugyanakkor ezek nem felelnek meg egyetlen jól differenciált 57
autoimmun kórkép kritérium rendszerének sem. Megfigyelések szerint a betegek egy részében valamelyik differenciált kórkép felé progrediál a klinikai kép, leggyakrabban SSc, SLE, RA vagy Sjögren syndroma alakul ki (82-84). Ugyanakkor az esetek többségében nem alakulnak ki új tünetek és a beteg stabilan megmarad úgynevezett nem differenciált kollagénbetegnek. Az általunk észlelt különbségek ezen betegcsoport és a többi autoimmun csoport között (emelkedett hsp antitest szintek, korreláció C1q antitest titerrel egyedül NDC-ben) szintén megerősítik az NDC mint külön klinikai entitás létjogosultságát. A fentebb említett szisztémás autoimmun betegekben a hsp antitestek mellett megvizsgáltunk még egy autoimmun betegekségekben jellegzetesen előforduló antitestet: a C1q antitestet. Az irodalmi adatokkal megegyezően SLE-s betegekben jelentősen gyakoribb volt a C1qAt pozitív betegek előfordulása, mint az egészségesekben. A mi vizsgálatunkban 29%-os (35/122) volt a pozitivitás (szemben a kontroll csoportban észlelt 2.1%-kal). Hasonló eredményekről számolnak be más munkacsoportok is: Siegert és mtsai 34%-ban (57/169) (85), Fremeaux-Bacchi és mtsai (86) 34%-ban (38/113) írtak le C1qAt pozitivitás SLE-s betegcsoportban. Néhány más munkacsoport ennél magasabb arányú pozitivitásról is beszámol, az esetszámok azonban kisebbek voltak. Vener és mtsai (87) 47%-os (35/74), Ravelli és mtsai (88) 59%-os (17/29), Wiesnieski és Jones (52) 35%-os (12/35), Trendelenburg és mtsai (58) 44%-os (21/48) pozitivitást észlelt SLE-ben. Kevesebb irodalmi adat van a C1q antitestek előfordulásáról egyéb autoimmun kórképekben. Gyulladásos myopathiában (polymyositis/dermatomyositis) Wiesnieski és Jones (52) nem talált C1qAt pozitív beteget 21 eset közül (hasonló eredményeket kaptunk mi is: 0/14). Siegert és mtsai (85) valamint Vener és mtsai (87) 4/80 (5%) illetve 1/36 (3%) esetben találtak pozitivitást Rheumatoid arthritisben, ez szintén összevethető a mi eredményünkkel (0/21). Az 55 SSc-s beteg közül 3 volt C1qAt pozitív, szemben ezzel Siegert és mtsai (85) nem találtak pozitívat 10 betegben. Nem találtunk gyakoribb pozitivitást Raynaud syndromában a kontrollokhoz viszonyítva, ezzel kapcsolatban irodalmi adatok nincsenek. Nem differenciált kollagénbetegségben 9.1%-os (3/33) volt a C1qAt pozitívak aránya, elképzelhető, hogy ezek a betegek fognak később SLE felé differenciálódni (89). Érdemes lehet tehát longitudinális vizsgálatot végezni ezen At pozitív betegekkel. Az autoimmun betegekben elvégzett autoantitest vizsgálatainknak másik célja az volt, hogy megvizsgáljuk fennáll-e a C1q antitestek és hsp60/65 elleni antitestek közötti 58
keresztreakció, melyet korábban HIV fertőzött betegekben írtak le. HIV fertőzöttekben szignifikáns pozitív korreláció volt a hsp60 illetve hsp65 és a C1q elleni antitestek titere között, és rekombináns hsp65-el, illetve kisebb mértékben hsp60-al gátolható volt az antitestek kötődése a szilárd fázisú C1q-hoz (59). Autoimmun betegekben a C1q elleni antitestek szintje csak SLE-ben volt szignifikánsan, illetve NDC-ben tendenciózusan magasabb a kontrollokhoz képest. A hősokkfehérje elleni antitestek szintje csak NDCben volt magasabb. Nem meglepően korrelációt is csak NDC-ben észleltünk, de csak a C1q- és a hsp65At-ek között. Ezzel szemben az NDC-s szérumból tisztított IgG kötődését a szilárd fázisú C1q-hoz csak a hsp60 tudta dózisfüggően gátolni. Ugyan a hsp65 is mutatott gátló hatást, de ez hasonló volt az irreleváns kontroll fehérjeként használt CD4-hez, és nem volt dózisfüggő. Lehetséges, hogy a hsp65 és CD4 molekulák gátló hatása ebben az esetben nem specifikus fehérje-fehérje interakciónak köszönhető, viszont a humán hsp60 specifikusan gátolna, a C1q és a hsp60 molekulák közös epitópjai közötti keresztreakció miatt. Ezen közös epitópokat már sikerült azonosítani (59). Először meglepőnek tűnik, hogy a tisztított C1q egyáltalán nem gátolta az NDC-s szérumból nyert IgG kötődését a szilárd fázishoz kötött C1q-hoz. Azonban figyelembe véve azt a tényt, hogy a keverékben kialakult C1q-antiC1q immunkomplexek a szabad C1qAt-ekhez hasonlóan kötődnek a szilárd fázishoz kötött C1q-hoz, érthetővé válik a várt gátlás elmaradása. Eredményeinkből arra következtethetünk, hogy a C1q ellenes antitestek epitópspecificitása különböző kórképekben (illetve egészségesekben) különbözhet, és az antitestek C1q molekula más-más részei ellen irányulhatnak. Más lehet ezen antitestek pathogenetikai szerepe, komplement aktiváló képessége, klinikai jelentősége. Az epitópok pontos meghatározása szükséges ahhoz, hogy a C1q antitestek különböző kórképekben betöltött szerepét jobban megismerjük. 8.2. A C1q antitestek és az SLE klinikai és laboratóriumi paraméterei közötti összefüggések vizsgálata Szisztémás lupus erythematosusban szenvedő betegekről értékes adatbázist sikerült összegyűjtenünk, így lehetőségünk volt az általunk mért antitestek (C1q, hsp60/65) szintjének összefüggését vizsgálni számos SLE-re karakterisztikus klinikai és laboratóriumi adattal. Eredményeink az irodalmi adatokkal egyezően szoros pozitív korrelációt mutattak az SLE klinikai aktivitása és a C1qAt-ek titere között (55, 86, 88). A betegek aktivitása és a C1q antitestek szintje közötti összefüggést több szempontból 59
is elemeztük: a betegeket gondozó klinikus kollégák által megadott aktivitás, az általunk (nemzetközi kritériumrendszer alapján) meghatározott SLEDAI indexek, illetve ugyanazon betegtől különböző időpontokban (és különböző aktivitási stádiumban) vett szérumminták segítségével. Az antitestek aktivitással való összefüggése minden esetben igazolódott. A klinikai aktivitáshoz hasonlóan az úgynevezett laboratóriumi aktivitási értékekkel is összefüggött a C1q antitestek szintje: alacsony C3 és magas anti-dsDNA szintet találtunk a C1q pozitív betegkben. A C1qAt pozitivitás összefüggését az alacsony C3 szinttel, mint a komplement aktiváció jelzőjével, más szerzők is leírták (55, 86, 88, 90), akárcsak a szoros pozitív korrelációt a ds-DNA antitestek szintjével (55, 88, 90). Elsőként vizsgáltuk viszont a C1q antitestek kapcsolatát egy negatív akut fázis fehérjével, az alfa2-HSGP-vel. Negatív korrelációt találtunk közöttük. Egy korábbi tanulmányban alacsony alfa2-HSGP szintet írtak le 63 SLE-s betegben egészséges kontrollcsoporthoz képest, és az alfa2-HSGP antitestek alacsony szintje együtt járt bizonyos aktivitási paraméterekkel, például alacsony C3 szinttel (80). Először Siegert és mtsai (85) közöltek adatokat arról, hogy a C1q antitestek gyakrabban fordulnak elő fiatalabb életkorú SLE-s betegekben. Nagy számú SLE-s betegben ezt nekünk is sikerült megerősítenünk. 15-30 év közötti betegekben négyszer gyakoribb volt a C1q pozitivitás mint 45 év felett. Lupus nephritises betegekben gyakrabban találtunk C1q antitesteket azokhoz képest, akikben a vese nem volt érintett. Más szervi manifesztáció nem volt kapcsolatban a C1q antitestekkel. A veseérintettségre és a C1q antitestek közötti összefüggésre vonatkozó megfigyelést korábban mások is közölték, és egy prospektív tanulmányban az IgG típusú C1q antitestestek előrejelezték a nephritis megjelenését (53, 91). Trendelenburg és mtsai C1qAt negatív betegekben egyáltalán nem észleltek súlyos lupus nephritist, így az antitesteknek 100%-os negatív prediktív értéket tulajdonítanak a lupus nephritis kialakulása szempontjából (56). A veseérintettség tekintetében vannak azonban ellentmondó közlések is. Vannak munkacsoportok, melyek nem találtak összefüggést a C1q antitestek előfordulása és a nephritis között, ezekben a tanulmányokban olasz illetve indiai SLE-s betegpopulációt vizsgáltak (88, 90). Összevetve eredményeinket az irodalmi adatokkal elmondhatjuk, hogy a nephritis megjelenhet C1q negatív betegekben is, de jóval ritkábban, mint a pozitívakban. Az ellentmondó eredmények magyarázata valószínűleg a vizsgált populációk genetikai 60
különbözőségében illetve az SLE megjelenési idejének eltérésében lehet. Megbízható, egyetlen aktivitási marker, amely előrejelezné a nephritist és szintje annak aktivitásával párhuzamosan változna, még mindig nem áll rendelkezésünkre. A C1q At hasznos marker a folyamatosan aktív nephritis fennállása esetén, de nincs vagy kevés az adat arról, hogy hogyan változik az antitestek szintje terápia hatására, a vese állapotának javulása alatt, illetve milyen az egyes szövettani típusok megoszlása a nephritisen belül. A további vizsgálatoknak ilyen irányba is kell tehát haladniuk. A hősokkfehérje ellenes antitestek (hsp60/65At), melyeknek szinjét nem találtuk magasabbnak SLE-ben, nem meglepő módon nem voltak kapcsolatban az SLE-re jellemző laboratóriumi és klinikai paraméterekkel. A mi adataink tehát nem valószínűsítenek szerepet ezen antitesteknek a szisztémás lupus erythematosus pathogenezisében. Az, hogy SLE-ben nem észleltünk emelkedett hsp60 ellenes antitest szintet, alátámasztja munkacsoportunk azon elméletét, hogy a magas anti-hsp60 szint (melyet bizonyos autoimmun betegségekben illetve súlyos coronariasclerosisban írtak le) nem szekunder jelenség, nem magyarázható egyszerűen poliklonális B sejt aktivációval, hanem primer, genetikai okokra vezethető vissza. SLE-ben ugyanis jól ismert a poliklonális B sejt aktiváció, de ez nem jár együtt a hősokkfehérje elleni antitestek fokozott termelésével. Immunológiai tényezők szerepét többen vizsgálták az atherogenezis pathomechanizmusában is. Az utóbbi néhány évben egyre több olyan közlemény jelent meg, amely autoimmun mechanizmust bizonyít az atherosclerosis és így az atheroscleroticus eredetű érbetegségek keletkezésében (92-96). A folyamatban kulcsfontosságú antigénként a lipid-associált antigének mellett fontos szerepe lehet a hősokkfehérjéknek is. Egy epidemiológiai tanulmányban szignifikánsan magasabb hsp65 elleni antitestszintet írtak le olyan egészségesekben, akikben az ultrahang vizsgálat jelentős carotis atherosclerosist igazolt (97). Feltételezik, hogy ezeknek az antitesteknek pathogenetikai szerepük is van, mivel képesek voltak endothelsejteket károsítani komplement mediált lízis vagy antitest-dependens celluláris citotoxicitás révén. Wick és munkatársai felállítottak fel egy hipotézist az atherogenezis pathomechanismusára vonatkozóan, mely szerint a magas hősokkfehérje ellenes antitestek és az atherosclerotikus érbetegségek közötti összefüggést az az autoimmun reakció jelenti, amely során a hősokkfehérje ellenes antitestek kötődnek az artériák 61
endothelsejtjein különböző stresszhatásokra (haemodinamikai, toxikus, virálisbakteriális fertőzések, stb.) expresszálódó hősokkfehérjékhez. Az antitestek kötődését komplement aktiváció követi, melynek fontos szerepe van az atherosclerosis kialakulásában. A hősokkfehérjék emelkedett szintje magyarázható lehet korábbi bakteriális infekciókkal, az így keletkezett antitestek keresztreagálhatnak a saját molekulákkal (molekuláris mimikri teória). Ugyanakkor lehetséges az is, hogy a saját hsp molekulák válnak immunogénné oxidáció illetve egyéb metabolikus változások révén (96, 98). A folyamatot vázlatosan a 13. ábra mutatja. Néhány megfigyelés azonban az emelkedett hsp elleni antitestszint előbb említett szekunder eredete ellen szól. Munkacsoportunk nem talált emelkedett anti-hsp60 antitest szintet H. pylori fertőzöttekben szeronegatív egyénekhez képest. Szintén nem volt összefüggés a Chlamydia pneumoniae fertőzöttség és a hsp60, hsp65 illetve GroEL antitestek szintje között. Longitudinális vizsgálat során konstans anti-hsp60 szint volt észlelhető hat hónapos utánkövetés során, valószínűtlen hogy bármilyen stimulus képes lenne ilyen hosszan magas antitest szintet fenntartani. Nem detektáltunk magas antihsp60 és hsp65 szintet olyan jellegzetesen poliklonális B sejt aktivációval járó kórképekben, mint az SLE vagy a HIV betegség. Mindezek primer, genetikai eredetet sejtetnek az emelkedett anti-hsp szint hátterében.
62
Sejtkárosító hatások
Antigének
OxLDL, toxinok (LPS)
A.
Szabad gyökök
Hsp homológokat expresszáló infectiv ágensek
Hypertonia (nyíró erők)
B.
Hősokk (láz), fertőzések
Szöveti károsodás pl. myocardialis infarctus
Endothelsejtek fehérjéinek károsodása Immunválasz a hsp-k ellen Fokozott hsp produkció
Komplement mediált endothelsejt károsodás
OxLDL, Citokinek, Növekedési faktorok
Komplikált atheroscleroticus léziók
13. ábra: Vázlat a hsp60 elleni immunválasz atherogenetikus hatásának bemutatására. Különböző stresszhatások (oxidált LDL, szabad gyökök, toxinok, hősokk, hemodinamikai stressz) hősokkfehérjék termelődését indukálják az artériák falában. A korábban fertőzések vagy szövetkárosodás hatására indukált hősokkfehérje elleni antitestek vagy T sejtek reagálnak a hsp-t expresszáló endothelsejtekkel és károsítják azokat. Mindebben fontos szerepe van a komplementrendszer aktiválódásának.
63
8.3. A hősokkfehérjék és egyes epitópjai elleni antitestek vizsgálata frissen diagnosztizált 1-es típusú diabeteses gyermekekben A következő autoimmun betegség, melyben a hősokkfehérjék elleni antitestek előfordulását és szerepét vizsgáltuk, az 1-es típusú diabetes mellitus volt. Különböző hsp ellenes antitestek szintjének mérésére vonatkozóan több szerző is közölt (ellentmondásos) adatokat. Nincs azonban irodalmi adat a p277 (hsp60 peptid) elleni antitestek humán vonatkozásáról. Elsőként vizsgáltuk ezen antitestek szintjét nagy számú beteganyagon 1-es típusú diabetes mellitusban. Sikerült kimutatnunk p277 ellenes antitesteket mind egészséges, mind frissen diagnosztizált diabeteses gyermekekben. Szintetikus p277 molekulát használva a humán és M. bovis p277 elleni antitestek szintjét szignifikánsan magasabbnak találtuk a diabeteses gyermekekben az egészségesekhez képest, laboratóriumunkban kifejlesztett ELISA módszerrel mérve az antitesteket. A teljes rekombináns hsp60 molekula erősen és dózisfüggő módon gátolta az IgG típusú antitestek kötődését a szilárd fázisú p277-hez, míg albuminnal nem volt elérhető a gátlás. Ebből arra következtethetünk, hogy a szilárd fázishoz kötött p277 peptid konformációja hasonló ahhoz, amely konformációban a teljes hsp molekulán belül helyezkedik el. Mindezen eredményeket alátámasztotta a hősokkfehérje elleni antitestek epitópspecificitásának vizsgálata is. A hsp60 molekulának két olyan lineáris epitópját sikerült azonosítani, amelyek ellen magasabb titerben tartalmaztak antitesteket a diabeteses gyermekek savói, mint az egészségesek (8 diabeteses és 11 egészséges gyermek savóját vizsgáltuk). Az egyik epitóp (AA435-454 a hsp60-ban és AA408-427 a hsp65-ben) szinte teljesen megfelel a p277 peptidszakasznak (AA437-460 a hsp60 molekulában, AA409-432 a hsp65 molekulában). A másik epitóp régió, amely ellen a diabetesesekből származó savók magasabb reaktivitás mutattak az AA394-413 (hsp60) illeltve AA366-385 (hsp65). Ez az aminosav szakasz teljesen homológ a GAD molekula AA520-534 szakaszának megfelelő doménjével (14. ábra), (25). Mindemellett nem találtunk azonban különbséget a teljes hsp molekulák elleni antitestek szintjében a diabeteses és az egészséges gyermekek között. Az epitópspecificitás vizsgálata megmagyarázza ezt az eredményt, hiszen a vizsgált epitóprégiók többségének esetében nem volt különbség az ellenük irányuló antitestek titerében a két csoport között.
64
Glutaminsav dekarboxiláz
EERMSRLSKVAPV IK
(GAD 65) (AA 520-534)
_* * _ _ _**
Hsp60
NERLAKLSDGVAVLK
(AA 391-405)
_ * _*
14. ábra: A glutaminsav dekarboxiláz és a hsp60 molekula homológ aminosavszakaszai. A csillaggal (*) jelölt aminosavak azonosak, a kötőjellel (_) jelöltek aminosavak pedig konzerváltak. A p277 peptid lehetséges pathogenetikai szerepe először NOD egérben végzett kísérletek alapján merült fel (99). Az egereket humán peptiddel kezelve (melyben egy cystein molekula valinnal van helyettesítve – saját kísérleteinkben szintén a humán változatot használtuk) megelőzhető volt a diabetes kialakulása, sőt a már kialakult cukorbetegség is sikeresen kezelhető illetve gyógyítható volt (60, 66, 68). A peptid adásának hatására bizonyos immunológiai változásokat figyeltek meg, elsősorban a p277 elleni immunreakció vonatkozásában. A p277 elleni T sejt reaktivitás magas volt a prediabeteses fázisban, majd jelentősen csökkent a betegség megjelenésekor. A káros Th1 típusú válasz helyett Th2 típusú immunválaszt figyeltek meg, Th2 típusú IgG1 és IgG2b anti-p277 ellenes antitestek jelentek meg (61). Egyes irodalmi megfigyelések utaltak arra is, hogy a teljes hsp65 molekula elleni antitestek emelkedett szintjét észlelték a prediabeteses időszakban, az antitest szint azonban gyorsan csökkent és a betegség kialakulásakor már nem volt magas (64). A p277 elleni antitestek szintjének alakulását a diabetes kialakulásának folyamatában azonban részletesebben nem vizsgálák sem emberben, sem állatkísérletes modellekben. Számos meggyőző irodalmi adat támogatja tehát a hsp60-nak illetve annak immunogén p277 peptidjének szerepét az 1-es típusú, autoimmun diabetes pathogenezisében, megelőzésében és gyógyításában - állatkísérleti modellekben. Ennek ellenére még mindig nem tisztázott, hogy mi lehet a hsp60 molekula szerepe a humán diabetes kialakulásában. Elképzelhető, hogy a hsp60 elleni antitesteknek szerepük van a béta sejtek ellen irányuló immunfolyamatokban, ugyanakkor az is lehetséges, hogy jelenlétük csak a béta sejtek destrukciójának, pusztulásának következménye illetve tükrözője. Kevés, ellentmondásos eredményt közöltek a hsp60 elleni antitestek szintjének alakulásáról diabeseses betegekben (45-48). Még kevesebb az adat a p277 elleni immunreakciót illetően. A kevés humán vonatkozású publikációk egyikében emelkedett p277 elleni T sejt reaktivitást közöl 1-es típusú diabetesesekben 2-es 65
típusúakhoz és egészséges kontrollokhoz képest (72). Egy másik, fázis II stádiumú klinikai vizsgálat eredményeiről beszámoló közleményben 1-es típusú diabeteses betegekben p277-tel való kezelés után kedvező metabolikus (magasabb stimulált Cpeptid szint, csökkent exogén inzulin igény) és immunológiai (citokin profil Th1-ről Th2 irányba történő eltolódása) változásokat észleltek a placeboval kezelt kontrollokhoz képest (73). A p277 elleni antitestek alakulását azonban ebben a vizsgálatban sem vizsgálták részletesebben. A rendelkezésre álló adatok alapján biztos következtetéseket nem vonhatunk le a hsp60 elleni immunreakció diabetesben betöltött szerepével kapcsolatban. Elképzelhető, hogy a NOD egér modellben észlelthez hasonlóan magas a hsp65 elleni antitestek titere a prediabeteses időszakban majd az össz-hsp-antitest titer lecsökken a betegség klinikai manifesztációjának idejére, és ezután már csak a potenciálisan pathogén, csak bizonyos epitópok ellen irányuló antitestek detektálhatóak magasabb titerben. Bizonyított, hogy a GAD elleni antitesteknek prediktív értékük van az 1-es típusú diabetes kialakulására vonatkozóan (100). A hsp65 illetve p277 általi immunizációval egerekben kiváltott antitestek szintén szerepet játszhatnak az autoimmun diabetesben (64, 67). A mi vizsgálatainkban talált hsp60 epitópok (p277, GAD szerű epitóp) elleni immunreakció szintén játszhat valamiféle szerepet a diabetes kialakulásához vezető béta sejt destrukcióban. Hogy ezt a feltételezést igazoljuk, olyan longitudinális vizsgálatokra lenne szükség, melyekben a prediabeteses stádiumtól kezdve, a diabetes manifesztálódásán túl a betegség lefolyását követve ismételten vett szérummintákból végzett antitestvizsgálatok történnek, így követve az antitest szintek alakulását a betegség kialakulásában, lefolyásában. Mindehhez a diabetesre hajlamos gyermekek kiszűrése (család-, genetikai- immunológiai és anyagcsere vizsgálatok alapján) és szoros követése szükséges; diabetológiai munkacsoportunk már megkezdett egy vizsgálatot, mely első lépésként a szükséges szérum-sorozatok gyűjtésével indul. Szintén folyamatban van egy izraeli munkacsoport által koordinált nagy nemzetközi klinikai vizsgálat, mely a p277 peptid kedvező hatását célozza vizsgálni olyan már diabeteses gyermekekben és felnőttekben, akikben még detektálható bizonyos C-peptid szint, tehát feltételezhető hogy vannak még működésre, insulin termelésre képes béta sejtjeik. A peptid ismételt szubkután adagolását követően vizsgálják a p277 által indukált humorális és celluláris immunológiai-, illetve anyagcsere változásokat, részeredményeik kedvezőek (részletesebben ismertettem a 27. oldalon) és a Lancetben kerültek publikálásra (73). 66
A diabetes mellitus kialakulásához vezető autoimmun béta sejt destrukció folyamatának és a hsp60-nak, valamint epitópjainak ebben játszott szerepének pontosabb megértéséhez azonban még számos klinikai vizsgálat szükséges. Munkacsoportunk vizsgálta a hősokkfehérjék elleni immunitás atherosclerosisban betöltött szerepét is. Különböző hősokkfehérjék (hsp60, hsp65, E. coli GroEL) elleni antitestek szintjét mértük meg súlyos coronariabetegségben szenvedő betegekben egészséges kontrollcsoporthoz viszonyítva. Mindhárom vizsgált 60kD családba tartozó fehérje ellen szignifikánsan magasabb antitest titert találtunk súlyos coronariasclerosisos betegekben, mint a korban illesztett egészséges kontroll csoportban. Érdekesnek tűnt ugyanezen vizsgálatot megismételni cerebrovascularis megbetegedésben szenvedőkön is, figyelembe véve a tényt, hogy az arteriosclerosis a szervezet egész érrendszerét érintő szisztémás megbetegedés, általában parallel jelentkezik az érrendszer különböző szakaszain. Ismert mindemellett hogy a különböző lokalizációjú érelmeszesedésben bizonyos rizikófaktorok különböző súllyal esnek latba. Nagy számú cerebrovascularis eseményen (stroke vagy TIA) átesett betegben mértük meg a hs60 elleni antitestek szintjét, és nem találtunk különbséget az egészséges kontroll csoporthoz viszonyítva. Mindez utalhat arra, hogy az érrendszer különböző szakaszait érintő érelmeszesedében szerepet játszó immunológiai faktorok nem teljesen egyezőek. Következtethetünk tehát arra, hogy a hősokkfehérjék elleni antitesteknek szerepe lehet bizonyos autoimmun illetve egyéb immun-mechanizmusú betegségek pathogenezisében (NDC, 1-es típusú diabetes mellitus, atherosclerosis). Az antitesteknek feltétlenül érdemes megvizsgálni az epitópspecificitását is, mivel olyan esetekben is, ahol a teljes hősokkfehérje elleni antitest szintek nem különböznek, jelentős különbségek derülhetnek ki az antitestek epitópspecificitását illetően (diabetes – p277, GAD-szerű epitóp), és ennek fontos klinikai relevanciája lehet. Igen bíztatóak a p277 peptiddel állatkísérletekben kapott eredmények, ha mindez igazolódik humán vonatkozásban is, új távlatok nyílhatnak meg az 1-es típusú diabetes megelőzésében és kezelésében. A p277 peptid szubkután adagolásával az immunrendszer kedvező irányú modulálása lenne a cél, azáltal, hogy a károsító Th1 típusú immunreakciót Th2 irányba tereli el. A mi eredményeink (friss diabeteses gyermekekben talált magasabb p277 elleni antitest szint, 67
illetve fokozott reaktivitás a hsp60 molekula p277 epitópja ellen) beleilleszthetőek ebbe a hipotézisbe, ha feltételezzük, hogy a magasabb p277 elleni antitest szint a szervezet részéről egy protektív, de nem elég erős próbálkozás arra, hogy a diabetes kilalakulását megelőzze. A peptid adagolásával ez a vonal talán felerősíthető, gyengítve ezzel párhuzamosan a káros Th1 irányú vonalat. Persze mindez csak abban az esetben igaz, ha bebizonyosodik, hogy az állatkísérleti modellben leírt immunológiai folyamatok hasonlóan alakulnak emberben is, éppen ezért szükséges minél több humán vizsgálat. A fázis II. stádiumban lévő klinikai vizsgálatok eddigi eredményei mindenesetre kedvezőek, bár még korai lenne végső következtetéseket levonni. További terveink között szerepel olyan longitudinális vizsgálat kivitelezése, amelyben a várhatóan diabetesben megbetegedő betegeket a már prediabeteses fázisban kiszűrve elkezdjük vizsgálni az immunrendszert, követjük az antitest szintben bekövetkezett változásokat a diabetes kialakulásával és a betegség előrehaladásával párhuzamosan, így talán teljesebb képet kaphatunk majd az antitestek viselkedéséről és komolyabb következtetéseket vonhatunk le a pathogenetikai szerepet illetően is. Mindezek segítségével talán közelebb kerülhetünk olyan új terápiás eljárások kidolgozásához, amelyek egészen új utat jelentenek a diabetes kezelésében, és talán elérhető közelségbe kerül a megelőzés is. 8.4. Az értekezésben leírt legfontosabb eredmények összefoglalása, következtetések Összefoglalva tehát, az értekezésben ismertetett kísérletek eredményeiből az alábbi fontosabb következtetéseket vonhatjuk le: 1. A nem differenciált kötőszöveti betegség, mint önálló klinikai entitás létezését a mi eredményeink is megerősítik, mivel egyedül ebben a betegcsoportban találtunk az egészségesekétől eltérő, magasabb anti-hsp60 és anti-hsp65 antitestszinteket, és szintén egyedül ebben a betegcsoportban észleltünk korrelációt a hősokkfehérje és a C1q elleni antitestek szintje között. 2. A C1q elleni antitesteknek az általunk vizsgált betegcsoportok közül csak SLEben volt emelkedett a szintje. Bizonyos akut fázis fehérjékkel, a klinikai aktivitással és a veseérintettséggel észlelt korreláció utalhat ezen antitestek pathogenetikai szerepére. A C1q pozitív nem differenciált kollagénbetegeket érdemes szorosan követni, mivel elképzelhető hogy később SLE felé differenciálódik tovább a betegségük.
68
3. A hsp és C1q elleni antitestek keresztreakciójának vizsgálata során kapott eredményeinkből arra következtethetünk, hogy a C1q ellenes antitestek epitópspecificitása különböző kórképekben (illetve egészségesekben) különbözhet, és az antitestek C1q molekula más-más részei ellen irányulhatnak. 4. 1-es típusú diabetes mellitusban azonosítottunk két olyan epitóprégiót a hsp60 molekulán belül, amelyek ellen a diabeteses gyermekek fokozott antitestreaktivitást mutattak. Állatkísérleti és az eddigi humán vizsgálatok adatait figyelembe véve ezen peptidek ellen irányuló immunreakciónak fontos szerepe lehet az 1-es típusú diabetes mellitus pathogenezisében.
69
9. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Ag: antigén ANF: antinukleáris faktor At: antitest BSA: bovin serumalbumin DM: diaebetes mellitus DsDNA: dupla szálú dezoxiribonukleinsav ELISA: enzim linked immunosorbent assay GADA: glutamic acid decarboxylase antibody (glutaminsav dekarboxiláz elleni antitest) Hsp: hősokkfehérje ICA: islet cell antibody (szigetsejt ellenes antitest) IFN: interferon Ig: immunglobulin IL: interleukin KIR: központi idegrendszer LSP: lipopoliszacharid MCTD: mixed connective tissue disease (kevert kötőszöveti betegség) NDC: non differenciated collagen disease (nem differenciált kötőszöveti betegség) NOD (egér): non obes diabetic (mouse) OxLDL: oxidált alacsony denzitású lipoprotein PM/DM: polymyositis/dermatomyositis RA: Rheumatoid arthritis RS: Raynaud szindróma SLE: szisztémás lupus erythematosus SLEDAI: Systemic lupus erythematosus activity index (SLE aktivitási index) SSC: szisztémás sclerosis
70
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Elsősorban szeretnék köszönetet mondani Füst György professzor úrnak, aki nemcsak témavezetőm volt, de kutatómunkám minden lépését segítette. Az ő támogatása, bíztatása és segítsége nélkülözhetetelen volt a doktori munka létrehozásához, és köszönöm a lehetőséget, hogy az általa vezetett kutatólaboratóriumban dolgozhattam. Szintén nagyon sokat köszönhetek Prohászka Zoltánnak, aki megismertette velem a kutatómunka alapjait, a manuális kísérleti tevékenységtől kezdve az adatok értékelésén, számítógépes feldolgozásán, statisztikai elemzésén keresztül a publikálásig, előadások elkészítéséig. Köszönöm Pánczél Pálnak bíztató támogatását és hogy felhívta figyelelmemet arra, milyen fontos a kutatómunka egy klinikus számára is. Köszönöm Gergely Péter professzor úrnak hogy helyet biztosított számomra az Elméleti és Klinikai Immunológia PhD programban. Romics László és Karádi István professzor uraknak köszönettel tartozom azért, hogy az általuk vezetett III. sz. Belgyógyászati Klinika munkatársaként lehetőséget adtak a teljes munkaidőben végzett kutatómunkára. Szintén köszönettel tartozom a Klinika minden munkatársának megértéséért és a tudományos munkát támogató légkörért. Sokat köszönhetek Mohamed R. Daha professzor úrnak, aki lehetővé tette, hogy az általa irányított leideni kutatólaboratóriumban 3 hónapos kutatómunkát végezzek és új metodikákat tanuljak meg. Az itt elvégzett kísérletekből számos értékes, publikálható eredmény született. Szintén sokat tanultam insbrucki tanulmányútjaim alatt is, köszönet ezért Hans Dieplingernek, aki kétszer is fogadott nagyszerű hangulatú és eredményes kutatólaboratóriumában. Köszönet minden társszerzőnek, hogy munkájukkal, kísérleteikkel, javaslataikkal hozzájárultak az eredmények publikálásához. Külön köszönöm Hudecz Ferencnek és Uray Katalinnak, hogy elkészítették a peptidkísérletekhez és az epitópanalízishez szükséges anyagokat. Köszönet azon kollégáimnak, akik bevettek kollaborációs munkáikba, és egy-egy kísérletsorozattal hozzájárulva társszerzőként szerepelhettem cikkeikben. Hálával tartozom a III. Belklinika Kutatólaboratóriumának minden dolgozójának, PhD hallgatóknak és asszisztenseknek (Kovács Margit, Szigeti Antalné, Nagyné Vers Marika) egyaránt, hogy munkára ösztönző, motiváló légkörben dolgozhattam.
71
Nem utolsósorban köszönettel tartozom családomnak, amiért végig mellettem álltak, bíztattak és kitartásra ösztönöztek.
72
11. IRODALOMJEGYZÉK
1. Lindquist S (1986) The heat-shock response. Ann. Rev. Biochem. 55, 151-1191
2. Craig EA, Gambill BD, Nelson RJ (1993) Heat-Shock Proteins: Molecular Chaperones of Protein Biogenesis. Microbiol. Rev. 57, 402-414
3. Dubois P (1989) Heat shock proteins and immunity. Res. Immunol. 140, 653-659
4. Omar R (1994) Heat Shock Proteins in Autoimmun Disease. J Clin Immunoassay. 17, 129-132 5. Falus A (1996) Az immunológia élettani és molekuláris alapjai 6. Szollár L (1993) Kórélettan tankönyv
7. Oldstone MB (1998) Molecular mimicry and immune-mediated diseases. Faseb J, 12(13), 1255-1265
8. Gillis TP, Miller RA, Young DB, Khanolkar SR, Buchanan TM (1985) Immunochemical characterization of a protein associated with Mycobacterium leprae cell walls. Infect Immun. 49, 371-377
9. Lamb FI, Kingston AE, Estrada GI, Colston MJ (1988) Heterologous expression of the 65-kilodaltons antigen of Mycobacterium leprae and murine T-cell response to the gene product. Infect Immun. 56, 1237-1241
10. Rothstein NM, Higashi G, Yates J, Rajan TV (1989) Onchocerca volvulus heat shock protein is a major immunogen in amicrofilameric individuals from a filariasis endemic area. Mol Bioch Parasit 33, 229-236
11. Mattei D, Osaki LS, Pereira SL (1988) A Plasmodium falciparum gene encoding a heat-shock-like antigen related to the rat 78 kD glucose related protein. Nucl Acid Res 16, 5204 73
12. Engman DK, Kirchoff LV, Henke K, Donelson JE (1988) A novel hsp 70 cognate in trypanosomes. J Cell Biochem 12D (Suppl), 290-295
13. Hedstrom RJ, Culpepper RA, Harrison RA, Agabain N, Newport G (1987) A major immunogen in Schistosoma mansoni infections in homologous to the heat shock protein hsp-70. J Exp Med 165, 1430-1435
14. Garsia RJ, Hellquist L, Both RJ, Radford AJ, Britton WJ, Astbury L, Trent RJ, Basten A (1989) Homology of the 70-kilodalton antigens of Mycobacterium leprae and Mycobacterium bovis with the Mycobacterium tuberculosis 71-kilodalton antigen and with the conserved heat shock protein 70 of eucaryotes. Infect Immun. 57, 204-212
15. Lamb JR, Bal V, Rothbard JB, Mehlert A, Mendez Samperio P, Young DB (1989) The mycobacterial GroEl stress protein: a common target of T-cell recognition in infection and autoimmunity. J Autoimmunol 2 (Suppl) 93
16. Res P, Thole J, Vries R (1991) Heat Shock proteins and autoimmunity in humans. Springer Semin Immunpathol. 13, 81-98
17. Omar R. (1994) Heat Shock Proteins in Autoimmune Disease. J Clin Immunoassay 17, 129-132.
18. Van Eden V, Thole JE, Van der Zee R, Noordzij A, van Embden JD, Hensen EH, Cohe IR (1988) Cloning of the mycobacterial epitope recognised by T lymphocytes in adjuvant arthritis. Nature 311, 171-173
19. Elias D, Markovits D, Reshef T, van der Zee R, Cohen IR (1990) Induction and therapy os autoimmun diabetes of a non-obese diabetic (NOD/Lt) mouse by a 60kDA heat shock protein. Proc Nat Acad Sci USA. 87, 1576-1580
74
20. De Graeff-Medder ER, Van der Zee R, Rijkers GT, Shuurman HJ, Kuis W, Bijslma JWJ, Zegers BJM, van Eden W (1991) Recognition of human 60 kD heat shock protein by mononuclear cells from patients with juvenile chronic arthritis. Lancet 337, 13681372
21. Xu Q, Kleindienst R, Waitz W, Dietrich H, Wick G (1993) Increased expression of heat shock protein 65 coincides with a population of infiltrating T lymphocytes in atherosclerotic lesions of rabbits specially responding to heta shock protein 65. J Clin Invest. 91, 2693-2702
22. Danieli MG, Markovits D, Gabrielli A, Corvetta A, Giorgi PL, Van der Zee R, Van Embden DJ, Danieli G, Cohen IR (1992) Juvenile rheumatoid arthritis patients manifest immune reactivity to the mycobacterial 65-kDa heat shock protein, to its 180-188 peptide, and to a partially homologous peptide of the proteoglycan link protein. Clin Immunol Immunpathol. 64, 121-128
23. Kaufman SHE (1994) Heat Shock Proteins and Autoimmunity: A Critical Appraisal. Int Arch Allergy Immunol. 103, 317-322
24. Rose NR (1998) The role of infection in the pathogenesis of autoimmune disease. Semin Immunol. Feb; 10(1), 5-13 Review
25. Jones DB, Coulson FWC, Duff GW (1993) Sequence homologies between hsp60 and autoantigens. Immunology Today 14, 115-118
26. Van Eden W, Holoshitz J, Nevo Z et al. (1985) Arthritis induced by a T lymphocyte clone that responds to Mycobacterium tuberculosis and to cartilage proteoglycans. Proc Nat Acad Sci USA 82, 5117
27. Res PC, Schaar CS, Breedveld FC (1988) Synovial fluid T cell reactivity against 65 kD heat shock protein of Mycobacteris in early chronic arthritis. Lancet ii, 1988; 478
28. Van Eden W, Thole J, van der zee R et al. (1988) Cloning of the mycobacterial epitope recognized by T lymphocytes in adjuvant arthritis. Nature 331, 171-173 75
29. Jindal S, Dudani AK, Harley CB et al. (1989) Primary structure of human mitochondrial protein homologuos to bacterial and plant chaperonins and to hsp65 kD mycobacterial antigen. Mol Cell Biol 9, 2279
30. Cohen IR. (1988) The self, the world and autoimmunity. Sci Am 258, 52
31. Danilei MG, Markovits D, Gabrielli A et al. (1992) Juvenile rheumatoid arthritis patients manifest immune reactivity to the mycobacterial 65kD heat shock protein, to its 180-188 peptode and to a partially homologous peptiode of the proteoglycan link protein. Clin Immunol Immunopathol. Aug; 64(2), 121-8
32. Bahr GM, Rook GAW, Al-Saffar et al. (1988) Antibody levels to mycobacteria in relation to HLA type: Evidence for non-HLA- linked high levels of antibody to the 65 kD heat shock proteins of M. bovis in rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 74, 211218
33. Young RA (1990) Stress proteins and immunology. Annu Rev Immunol 8, 401-420
34. Brand SR, Worthington J, Mintosh DP et al. (1992) Antibody to a 63 kilodalton insect protein in ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis. 51, 334-339
35. Tsoulfa G, Rook GA, Bahr GM, Sattar MA, Behbehani K, Young DB, Mehlert A, van Embden JD, Hay FC, Isenberg DA, Lydyard PM. (1989) Elevated IgG antibody levels to the mycobacterial 65-kDa heat shock protein are characteristic of patients with rheumatoid arthritis. Scand J Immunol. 30, 519
36. Wothington J, Rigby A, McGregor A et al. (1993) Lack of association of increased antibody levels to mycobacterial hsp65 with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 52, 542-544
37. Kindas-Mugge I, Steiner G, Smolen J (1993) Similar frequency of autoantibodies against 70-kD class HSps in healthy subjects and systemic lupus erythematosus patients. Clin Exp Immunol 92, 46-50
76
38. Bjork J, Kleinau S, Midtvedt T, Klarenskog L, Smedegard G (1994) Role of the bowel flora for developmnent of immmunity to hsp65 and arthritis in three experimental models. Scand J Immunol 40(6), 648-652
39. Panachapakesan J, Daglis M, Gatenby P (1992) Antibodies to 65 kDa and 70 kDa heat shock proteins in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Immunol Cell Biol 70 (Pt 5), 295-300
40. Hirata D, Hirai I, Iwamoto M, Yoshio T, Takeda A, Masuyama JI, mimoro A, Kano S, Minota S (1997) Preferential binding with Escherichia coli hsp60 of antibodies prevalent in sera from patients with rheumatoid arthritis. Clin Immunol Immunpathol. 82(2), 141-148
41. Gruber R, Lederer S, Bechtel U, Lob S, Riethmuller G, Feucht HE (1996) Increased antibody titers against mycobacterial heat-shock protein 65 in patients with vasculitis and arteriosclerosis. Int Arch Allergy Immunol. 110(1), 95-98
42. Latchman DS, Isenberg DA (1994) The role of hsp90 in SLE. Autoimmunity 19, 211-218
43. Arora SK, Singh G, Sehgal S (1995) Comparative evaluation of anti-heat shock protein antibodies in SLE and healthy controls. Scand J Rheumatol 24(3), 160-163
44. Mairesse N, Kahn MF, Appelboom T (1993) Antibodies to the constitutive 73 kd heat shock protein: a new marker of mixed connective tissue disease? Am J Med 95(6), 595-600
45. Tun RYM, Smith MD, Lo SSS, Rook GAW, Lydyard P, Leslie RDG (1994) Antibodies to heat shock protein 65 kD in type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine 11, 66-70
46. Atkinson MA, Holmes LA, Scharp DW, Lacy PE, Maclaren NK (1992) No evidence for serological autoimmunity to islet cell heat shock proteins in insulin dependent diabetes. J Clin Invest 87, 721-724 77
47. Ozawa Y, Kasuga A, Nomaguchi et al. Detection of autoantibodies to the pancreatic islet cell heat shock protein 60 in insulin-dependent diabetes mellitus. (1996) J Autoimmunity 9, 517-524
48. Child DF, Williams CP, Jones RP, Hudson PR, Jones M, Smith CJ (1995) Heat shock protein studies in type 1 and type 2 diabetes and human islet cell culture. Diabetic Medicine 12, 595-599
49. Figueredo A, Ibarra JL, Rodriguez A et al. (1996) Increased serum levels of IgA antibodies to hsp70 protein in patients with diabetes mellitus: their relationship with vascular complications. Clin Immunol and Immunpathol 79, 252-255
50. Yang XD, Feige U (1992) Heta shock proteins is autoimun disease. From causative antigen to specific therapy? Experientia 48, 650-656
51. Uwatoko S, Aotsuka S, Okawa M, Egusa Y, Yokohari F, Aizawa C, Suzuki K (1984) Characterization of C1q-binding IgG complexes in systemic lupus erythematosus Clin ImmunolImmunpathol. 30, 104-116
52. Wisnieski JJ, Jones SM (1992) IgG autoantibody to the collagen-like region of C1q in Hypocomplementemic Urticarial Vasculitits Syndrome, Systemic Lupus Erythematosus, and 6 other Musculoskeletal or Rheumatic Diseases. J Rheumatology 19, 884-888
53. Siegert CEH, Daha MR, Halma C, Van der Voort, Breedveld, FC (1992) IgG and IgA antibodies to C1q in systemic and renal diseases. Clinical and Experimental Rheumatology 10, 19-23
54. Siegert CEH, Daha MR (1998) C1q as antigen in humoral autoimmun responses. Immunbiol. 199, 295-302
55. Siegert C, Daha MR, Westedt ML, Van der Voort E, Breedveld F (1991) IgG antibodies against C1q are correlated with nephritis, hypocomplementemia and dsDNA antibodies in systemic lupus erythematosus. J Rheumatology 18, 230-234 78
56. Siegert CEH, Daha MR, Tseng CMES, Coremans IEM, Leendert A van ES, Breedveld F (1993) Predictive value if IgG autoantibodies against C1q in systemic lupus erythematosus. Annals of the rheumatic diseases 52, 851-856
57. Coremans IE, Spronk PE, Bootsma H, Daha MR, van der Voort EAM, Kater L, Breedveld FC, Kallengerg CGM (1995) Changes in antibodies to C1q predict renal relapses in sytemic lupus erythematosus. Am J Kidney Dis. 26, 595-601
58. Trendelenburg M, Marfurt J, Gerger I, Tyndall A, Schifferli JA (1999) Lack of occurrence of severe lupus nephritis among anti-C1q autoantibody-negative patients Arthritis Rheum 42, 187-8 59. Prohászka Z, Daha MR, Süsal C, Daniel V, Szlávik J, Bánhegyi D, Nagy K, Várkonyi V, Horváth A, Ujhelyi E, Tóth FD, Uray K, Hudecz F, Füst G (1999) C1q Antibodies in HIV Infection: Correlation to Elevated Levels of Antibodies against 60kDa Heat-Shock Proteins. Clin Immunol 90, 247-255
60. Elias D, Reshef T, Birk OS, van der Zee R, Walker MD, Cohen IR (1991) Vaccination against autoimmune mouse diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein. Proc Natl Acad Sci USA 88, 3088-3091 61. Elias D, Meilin A, Ablamuntis V, Birk OS, Carmi P, Könen Waisman S, Cohen IR (1997) Hsp 60 peptide therapy of NOD mouse diabetes induces a Th2 cytokine burst and downregulates autoimmunity to various beta-cell antigens. Diabetes 46, 758-764
62. Castano L, Eisenbarth GS (1990) Type 1 diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouse and rat. Annu Rev Immunol 8:647-679
63. Miller BJ, Appel MC, O'Neill JJ, Wicker LS (1988) Both teh Lit-2+ and L3T4+ T cell subsets are required for the transfer of diabetes in nonobes diabetic mice. J Immunol 140, 152-158
79
64. Elias D, Markovits D, Reshef T, van der Zee R, Cohen IR (1990) Induction and therapy of autoimmune diabetes in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouse by a 65kDa heat shock protein. Proc Natl Acad Sci USA 87, 1576-1580
65. Birk OS, Elias D, Weiss AS, Rosen A, van der Zee R, Walker MD, Cohen IR (1996) NOD mouse diabetes: The ubiquitous mouse hsp60 is a beta-cell antigen of autoimmune T cells. J Autoimmunity 9, 159-166
66. Elias D, Cohen IR (1994) Peptide therapy for diabetes in NOD mice. Lancet 343, 704-706
67. Elias D, Marcus H, Reshef T, Ablamunits V, Cohen IR (1995) Induction of diabetes in standard mice by immunization with the p277 peptide of a 60-kDa heat shock protein. Eur J Immunol 25, 2851-2857
68. Elias D, Cohen IR (1995) Treatment of autoimmun diabetes and insulitis in NOD mice with heat shock protein 60 peptide p277. Diabetes 44, 1132-1138
69. Bockova J, Elias D, Cohen R (1997) Treatment of NOD diabetes with a novel peptide of the hsp60 molecule induces Th2-type antibodies. J Autoimmunity 10, 323329
70. Elias D, Prigozin H, Polak N, Rapaport M, Lohse A, Cohen R (1994) Autoimmune diabetes induced by the beta-cell toxin STZ. Diabetes 43, 992-998
71. Elias D, Cohen R (1994) The hsp peptide p277 arrests the autoimmune diabetes induced by the toxin streptozotocin. Diabetes 45, 1168-1172
72. Abulafia-Lapid R, Elias D, Raz I, Keren-Zur Y, Atlan H, Cohen IR (1999) T cell proliferative responses of Type 1 diabetes patients and healthy individuals to human hsp60 and its peptides. J Autoimmunity 12, 121-129
80
73. Raz I, Elias D, Avron A, Tamir M, Metzger M, Cohen IR (2001) Beta-cell funktion in new-onset type 1 diabetes and immunomodulation with a heat-shock protein peptide (DiaPep277): a randomised, double-blind, phase II trial. Lancet 358: 1749-53
74. Tan EM, Cohen AS, Fries JF, Masi AT, McShane DJ, Rothfield NF, Schaller JG, Talal N, Winchester RJ (1982) The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 25, 1271-77
75. Bombardier C, Gadman DD, Urowitz MB, Caron D, Chang CH (1992) Derivation of the SLEDAI:a disease activity index for lupus patients. Committee on prognosis studies in SLE. Arthritis Rheum 35, 630-40
76. Tenner AJ, Lesavre PH, Cooper NR (1981) Purification and radiolabeling of human C1q. J. Immunol. 127, 648-653
77. Siegert CEH, Daha MR, Van der Voort EAM, Breedvelt FC (1990) IgG and IgA antibodies to the collagen-like region of C1q in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 33, 1646-1654
78. Bottazzo GF, Florin-Christensen A, Doniach D (1974) Islet cell antibodies in diabetes mellitus with autoimmune polyendocrine deficiencies. Lancet II. 1279-1283
79. Kalabay L, Cseh K, Benedek Sz, Fekete S, Masszi T, Herjeczky K, Pozsonyi T, Jakab L, Jakab L (1991) Serum 2-HS-glycoprotein concentration in patients with hematological malignancies: a follow up study. Ann. Hematol. 63, 264-69
80. Kalabay L, Jakab L, Cseh K, Pozsonyi T, Jakab LA (1990) Correlation between serum
2-HS-glycoprotein
concentration and conventional laboratory parameters in
systemic lupus erythematosus. Acta Medica Hung. 47, 53-64
81. Tischler, M. and Schoenfeld, Y (1996) Semin. Arthritis. Rheum 26, 558-563
82. Mosca M, Tavoni A, Neri R, Bencivelli W, Bombardieri S (1998) Lupus 7, 95-100
81
83. Williams HJ, Alarcon GS, Neuner R, Steen VD, Bulpitt K, Clegg DO, Ziminski CM, Luggen ME, Polisson RP, Willkens RF, Yarboro C, Morgan J, Egger MJ, Ward JR (1998) J Rheumatol 25, 261-268
84. Williams HJ, Alarcon GS, Joks R, Steen VD, Bulpitt K, Clegg DO, Ziminski CM, Luggen ME, Polisson RP, Willkens RF, Yarboro C, Morgan J, Egger MJ, Ward JR (1999) J Rheumatol 26, 816-825
85. Siegert CEH, Daha MR, Swaak AJG, van der Voort EAM, Breedvelt FC (1993) The relationship between serum titers of autantibodies to C1q and age in the general population and in patients with systemic lupus erythematosus. Clin. Immunol. Immunopathol 67, 204-9
86. Fremeaux-Bacchi V, Weiss L, Demouchy C, Blouinm J, Kazatchkine MM (1996) Autonatibodies to the collagen-like region of C1q are strongly associated with classical pathway-mediated hypocomplementaemia in systemic lupus erythematosus. Lupus 5, 216-20
87. Wener MH, Uwatoko S, Mannik M (1989) Antibodies to the collagen-like region of C1q in sera of patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthr Rheumat 32, 544-51
88. Ravelli A, Wisnieski JJ, Ramenghi B, Ballardini G, Zonta L, Martini A (1997) IgG autoantibodies to complement C1q in pediatric-onset systemic lupus erythematosus. Clin Exp Rheumatol 15, 215-219
89. Calvo AJ, Alarcon GS, Burgard SL, Burst N, Bartolucci AA, Williams HJ (1996) Systemic lupus erythematosus: predictors of its occurrence among a cohort of patients with early undifferentiated connective tissue disease: multivariate analyses and identification of risk factors. J Rheumatol 23, 469-475
90. Kumar A, Gupta R, Varghese T, Pande RM, Singal VK, Garg OP (1999) Anti-C1q antibody as a marker of disease activity in sytemic lupus erythematosus. Indian J Med Res 110, 90-3
82
91. Haseley LA, Wisniewski JJ, Denburg MR, Michael-Grossman AR, Ginzler EM, Gourley MF, Hoffmann JH, Kimberly RP, Salmon JE (1997) Antibodies to C1q in systemic lupus erythematosus: characteristics and relation to Gc gamma RIIA alleles. Kidney Int 52, 1375-80
92. Kleindienst R, Schett G, Amberger A, Seitz CS, Michaelis D, Metzler B, Dietrich H, Xu Q, Wick G (1995) Atherosclerosis as an autoimmun condition . Isr J Med Sci. 31, 596-599
93. Metzler B, Xu Q, Wick G (1998) The role of (auto-) immunity in atherobenesis. Wien Klin Wochenschr 110/10, 350-355 94. Ross R (1999) Atherosclerosis – An Inflammatory Disease. New England J of Med. 340, 115-126
95. Stemme S, Hanson GK (1994) Immune Mechanisms in Atherogenesis. Annals of Medicine 26, 141-146
96. Wick G, Kleindienst R, Schett G, Amberger A, Xu Q (1995) Role of Heat Shock Protein 65/60 in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Int Arch Allergy Immunol 170, 130-131
97. Xu Q, Willeit J, Marosi M, Kleindienst R, Oberhollenzer F, Kiechl S, Stulning T, Luef G, Wick G (1993) Association of serum antibodies to heat-shock protein 65 with carotid atherosclerosis. Lancet 341, 255-259
98. Xu Q, Dietrich H, Steiner HJ, Gown AM, Mikuz G, kaufmann SHE, Wick G (1992) Induction af atherosclerosis in normocholesterolemic rabbits by immunization with heat shock protein 65. Atheroscler Thromb 12, 789-799
99. Ablamunits V, Elias D, Reshef T, Cohen IR (1998) Islet T cells secreting IFNgamma in NOD mouse diabetes: arrest by p277 peptide treatment. J Autoimmunity 11(1), 73-81
83
100. Verge CF, Howard NJ, Rowley MJ (1994) Anti-glutamate decarboxylase and other antibodies at the onset of childhood IDDM: a population-based study. Diabetologia 37(11), 1113-1120
84
12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE A doktori értekezésben összefoglalt saját közlemények: 1. Laura Horváth, László Czirják, Béla Fekete, Lajos Jakab, Zoltán Prohászka, László Cervenák, László Romics, Mahavir Singh, Mohamed R Daha, George Füst: Levels of antibodies against C1q and 60 kD familiy of heat-shock proteins in the sera of patients with various autoimmune diseases. Immunology Letters. 2001; 75: 103-109 IF: 1.546 2. Z. Prohászka, J. Duba, L. Horváth, A. Császár, I. Karádi, A. Szebeni, M. Singh, B. Fekete, L. Romics, G. Füst: Comparative study on antibodies to human and bacterial 60 kD Heat shock proteins in a large cohort of patients with coronary hart disease and healthy subjects. Eur J Clin Invest. 2001; 31(4): 285-292 IF: 2.071 3. L. Horváth, L.Czirják, B. Fekete, L. Jakab, T. Pozsonyi, L. Kalabay, L.Romics, K. Miklós, L.Varga, Z. Prohászka, A. Szakács, E. Nagy, MR Daha and G. Füst High levels of antibodies against C1q are associated with the disease activity and nephritis but not with other organ manifestations in SLE patients. Clin Exp Rheum 2001 Nov-Dec; 19(6): 667-72 IF: 1.638 4. L. Horváth, L. Cervenak, M. Oroszlán, Z. Prohászka, K. Uray, F. Hudecz, É. Baranyi, L. Madácsy, M. Singh, L. Romics, G. Füst and P. Pánczél: Antibodies against different epitopes of heat-shock protein 60 in children with type 1 diabetes mellitus. Immunology Letters 2002 Mar 1; 80(3): 155-62 IF: 1.546 Az értekezés témájában megjelent társszerzős közlemények: 1. Kramer, P. Harcos, Z. Prohászka, L. Horváth, I. Karádi, M. Singh, A. Császár, L. Romics, G. Füst: Studies on the frequencies of some complement protein alleles and serum levels of anti-heat-shock protein antibodies in cerebrovascular diseases. Stroke. 2000; 31: 2648-2652 IF: 6.008
85
2. Burian K, Kis Z, Virok D, Endresz V, Prohaszka Z, Duba J, Berencsi K, Boda K, Horvath L, Romics L, Fust G, Gonczol E: Independent and Joint Effects of Antibodies to Human Heat-Shock Protein 60 and Chlamydia pneumoniae Infection in the Development of Coronary Atherosclerosis. Circulation. 2001 Mar 20;103(11):1503-1508 IF: 10.893 3. L. Kalabay, B. Fekete, L. Czirják, L. Horváth, M.R.Daha, A. Veres, G. Fónyad, A. Horváth, Á. Viczián, M. Singh, I. Hoffer, G. Füst, L. Romics, Z. Prohászka: Helicobacter pylori infection in connective tissue disorders is associated with high levels of antibodies to mycobacterial hsp65 but not to human hsp60. Helicobacter 2002 accepted IF: 2.639 Más témában megjelent társszerzős közlemények:
1. Sorensen IJ, Holm Nielsen E, Schroder L, Voss A, Horvath L, Svehag SE: Complexes of serum amyloid P component and DNA in serum from healthy individuals and systemic lupus erythematosus patients. J Clin Immunol. 2000 Nov;20(6):408-15 IF: 3.383 2. J. Szabó, L. Cervenák, F.D. Tóth, Z. Prohászka, L. Horváth, K. Kerekes, Z. Beck, A. Bácsi, A. Erdei, E.I.B. Peerschke, G. Füst, B. Gebrehiwet: Soluble gC1q-R/p33, a Cell Protein That Binds to the Globular „Heads” of C1q Effectively Inhibits the Growth of HIV-1 Strains In Cell Cultures. J Clin Immunol. 2001 May; 99(2): 222-31 IF: 3.383 3. Cs. Szalai, J.Duba, Z. Prohászka, Á. Kalina, T. Szabó, B. Nagy, L.Horváth, A.Császár: Involvement of polymorphisms in the chemokine system in the susceptibility for coronary artery disease (CAD). Coincidence of elevated Lp(a) and MCP-1-2518 G/G genotype in CAD patients. Atherosclerosis 2001 Sep; 158(1): 233-9 IF: 3.386
86
4. Á. Kalina, A. Császár, G. Füst, B. Nagy, Cs. Szalai, I. Karádi, J. Duba, Z. Prohászka, L. Horváth, H. Dieplinger: The association of serum lipoprotein(a) levels, apolipoprotein(a) size and (TTTTA0n polymorphism with coronary heart disease. Clinica Chimica Acta 2001 309; 45-51 IF: 1.041 5. A. Horváth, D. Bánhegyi, A. Bíró, E. Újhelyi, A. Veres, L. Horváth, Z. Prohászka, A. Bácsi, V. Tarján, L. Romics, I. Horváth, FD. Tóth, G. Füst, I. Karádi: High level of anticholesterol antibodies (ACHA) in HIV patients. Normalization of serum ACHA concentration after introduction of HAART. Immunobiology 2001 Aug;203(5):756-68 IF: 2.416 Hazai közlemények: 1. Pánczél, P, Külkey O, Luczay A, Bornemissza B, Illyés Gy, Halmos T, Baranyi É, Blatniczky L, Mészáros J, Kerényi Zs, Gerő L, Tamás Gy, Hosszúfalusi N, Horváth, L., Madácsy L, Romics L: Hasnyálmirigy szigetsejt elleni antitestek vizsgálata a klinikai gyakorlatban. Orv. Hetil., 1999, 140, 2695-2701. 2. Füst György, Harcos P, Duba J, Kramer J, Prohászka Z, Horváth L, Horváth A, Karádi I, Mahavir Singh, Császár A, Romics L: Hasonlóságok és különbségek a cardiovascularis és a cerebrovascularis megbetegedések genetikai hátterében és immunológiai mechanizmusaiban. Magyar Belorv. Arch. 1999; 52: 387-393 3. Fekete Béla, Prohászka Z, Horváth L, Krivanek L, Kovács L, Paál M, Tamássy K, Pozsonyi T, Jakab L, Czirják L, Füst Gy:: Hősokkfehérje (hsp) 90, hsp70 és M. bovis hsp65elleni, valamint a Helicobacter pylori elleni antitestek előfordulása szisztémás sclerosisban és primer Raynaud-szindrómában. Magyar Belorv. Arch. 1999; 52: 394-399 4. Jánoskuti Lívia, Horváth L, Szebeni A, Császár A, Karádi I, fenyvesi T, Romics L, Füst Gy, Prohászka Z: A 60 kD-os hősokkfehérjék elleni antitestek szintjének változása akut coronaria-szindrómában szenvedő betegekben. Magyar Belorv. Arch. 1999; 52: 400-405
87
5. Hosszúfalusi Nóra, Pánczél P, Jánoskuti L, Prohászka Z, Kovács L, Horváth L, Ábel T, Karádi I, Romics L: Magas-normális vércukorszint és csökkent inzulin szekréció normáli glukóz toleranciájú szívbetegekben: „régi-új” rizikófaktorok? Magyar Belorv. Arch. 1999; 52: 406-412 6. Pánczél P, Hosszúfalusi N, Bornemissza B, Horváth L, Jánoskuti L, Füst G, Rajczi K, Vatay A, Prohászka Z, Madácsy L, Luczay A, Blatniczky L, Halmos T, Korner A, Szilvasi A, Romics L: A lassan kialakuló felnőttkori autoimmun diabetes (LADA): az autoimmun eredetű 1-es típusú cukorbetegség klinikai spektrumának része. Orv. Hetil 2001 Nov 18;142(46):2571-8 Előadások jegyzéke:
Hazai kongresszusok: Pánczél Pál dr., Külkey Orsoly dr., Horváth Anna oh., Horváth Laura oh., Gerő László dr., Romics László dr., Madácsy László dr.: Szigetsejt elleni antitest (ICA) kimutathatóságának összehasonlítása Bouin oldatban fixált, illetve cryostatos pancreas metszeteken gyermekkori, illetve felnőttkorban manifesztálódó IDDM-ben. Magyar Diabetes Társaság XIII. Kongresszusa, Keszthely, 1996, Diabetologica Hungarica, 1996, 4(suppl.1.), 40 Horváth Laura: Szigetsejt elleni antitest (ICA) kimutathatóságának összehasonlítása Bouin oldatban fixált, illetve cryostatos pancreas metszeteken. TDK Konferencia, Budapest, 1997. Pánczél Pál dr., Külkey Orsoly dr., Luczay Andrea dr., Bornemissza Beryll, Illyés György dr., Halmos Tamás dr., Blatnitzky László dr., Baranyi Éva dr., Mészáros József dr., Kerényi Zsuzsa dr., Gerő László dr., Tamás Gyula dr., Ábel Tatjána dr., Hosszúfalusi Nóra dr., Horváth Laura dr., Madácsy László dr., Romics László dr: Szigetsejt elleni cytoplazmatikus antitest (ICA) meghatározás a klinikai gyakorlatban. Magyar Diabetes Társaság XIV. Kongresszusa, Eger, 1998, Diabetologica Hungarica, 1998, suppl.1., 56
88
Horváth Laura dr., Prohászka Zoltán dr., Pánczél Pál dr., Baranyi Éva dr., Luczay Andrea dr., Madácsy László dr., Romics László dr: Hő-shock fehérjék elleni autoantitestek vizsgálata insulin dependens diabetes mellitusos gyermekekben. (poszter) Magyar Diabetes Társaság XIV. Kongresszusa, Eger, 1998, Diabetologica Hungarica, 1998, suppl.1., 28 Horváth L., Czirják L., Fekete B., Jakab L., Prohászka Z., Kalabay L., Romics L., MR Daha, Füst G.: C1q- és hősokkfehérjék (hsp60, hsp65) elleni antitestek szerepe különböző autoimmun betegségekben. Magyar Immunológiai Társaság XXIX. Kongresszusa, Bük, 1999. Horváth L., Prohászka Z., Vajna R, Hosszúfalusi N., Uray K., Hudecz F., Baranyai É, Madácsy L., Romics L., Füst G., Pánczél P: Hősokkfehérjék (hsp) és p277 60kD-os hsp peptid elleni antitestek 1. típusú diabetes mellitusban. SOTE PhD 2000. Tudományos napok, Budapest, 2000. Horváth L., Prohászka Z., Vajna R, Hosszúfalusi N., Uray K., Hudecz F., Baranyai É, Madácsy L., Romics L., Füst G., Pánczél P: Hősokkfehérjék (hsp) és p277 60kD-os hsp peptid elleni antitestek gyermekkorban manifesztálódó 1. típusú diabetes mellitusban. Magyar Diabetes Társaság XV. Kongresszusa, Tihany, 2000. Diabetologia Hungarica, 2000, suppl.1., 32. Hosszúfalusi N, Pánczél P, Jánoskuti L, Prohászka Z, Kovács L, Horváth L, Karádi I, Romics L: A „magas-normális” éhomi és postprandiális vércukorszint mint lehetséges cardiovascularis rizikófaktor. Magyar Diabetes Társaság XV. Kongresszusa, Tihany, 2000. Diabetologia Hungarica, 2000, suppl.1., 33. Pánczél P, Hosszúfalusi N, Luczai A, Bornemissza B, Horváth L, Kovács L, Kerényi Zs, Madácsy L, Romics L: Az inzulinkezelés szükségességének előrejelzése felnőttkorban kialakuló cukorbetegségben. Magyar Diabetes Társaság XV. Kongresszusa, Tihany, 2000. Diabetologia Hungarica, 2000, suppl.1., 66.
89
Horváth L, Pánczél P, Uray K, Szigeti A-né, Füst Gy, Hudecz F, Prohászka Z: A 60kD hősokkfehérjék (hsp60) elleni antitestek epitópspecificitásának különbségei insulindependens diabeteses és egészséges gyermekekben. Magyar Immunológiai Társaság XXX. Kongresszusa, Budapest, 2000. Horváth Laura, Fekete Béla, Czirják László, Kalabay László, Veres Amarilla, Fónyad Gábor, Horváth Anna, Viczián Ágnes, Hoffer Izabella, Füst György, Romics László, Prohászka Zoltán: Helicobacter pylori fertőzöttség és 60kD-os hősokkfehérjék elleni antitestek kapcsolata különböző autoimmun betegségekben. Magyar Immunológiai Társaság XXXI. Kongresszusa, Eger, 2001. Külföldi kongresszusok: B. Fekete, L. Czirják, G. Füst, L. Kovács, M. Paál, Z. Prohászka, L. Horváth, Á. Viczián, L. Krivanek, L. Berczi: Seroprevalence of Helicobacter pylori (H. pylori) infection and HSP65, HSP90 in systemic sclerosis (SS), mixed connective tissue disease (MCTD) and primary Raynaud syndrome (PR) II. International Workshop on Helicobacter pylori and extragastric pathologies associated with Helicobacter infection, Róma 1998. L. Horváth, L. Czirják, B. Fekete, L. Jakab, Z. Prohászka, L. Kalabay, L. Romics, G. Füst, MR Daha: Antibodies against C1q and heat-shock protein 60/65 in different autoimmune diseases. (poszter) 7th European Meeting on Complement in Human Disease, Helsinki 1999, Molecular Immunology, 1999, 36, abstract 103. L. Horváth, Z. Prohászka, R. Vajna, K. Uray, F. Hudecz, É. Baranyai, L. Madácsy, L. Romics., G. Füst, P. Pánczél: Antibodies against heat-shock proteins (hsp) and p277 hsp peptide in childhood-onset Type 1 diabetes mellitus. (poszter) 4th Immunology of Diabetes Society Congress, Fiuggi, 1999. Abstract book: page 89. N. Hosszúfalusi, P. Pánczél, L. Jánoskuti, Z. Prohászka, L. Horváth, I. Karádi, L. Romics: Hogh-normal plasma glucose and impaired insulin secretion: are they cardiac risk factors? Atherosclerosis, 1999, 147 (suppl.2.), S14
90
Horváth L, Prohászka Z, Vajna R, Uray K, Hudecz F, Baranyi É, Madácsy L, Romics L, Füst G, Pánczél P: Antibodies against heat-shock proteins (hsp) and p277 60kD hsp peptide in childhood-onset type 1 diabetes mellitus. 14th European Immunology Meeting EFIS 2000, Poznan, Immunology Letters, 2000 (2,3), 263. Fekete B, Horváth L, Czirják L, Jakab L, Prohászka Z, Cervenak L, Kalabay L, Romics L, Miklós K, Varga L, Singh M, Daha MR, Füst G: Antibodies to C1q and 60 kD family of hsp in autoimmune disorders. 14th European Immunology Meeting EFIS 2000, Poznan, Immunology Letters, 2000 (2,3), 268. Cervenak L, Szabó J, Tóth FD, Prohászka Z, Horváth L, Kerekes K, Beck Z, Erdei A, Peerschke EIB, Füst G, GebrehiwetB: Soluble receptor for the globular „heads” of C1q (gC1q-R/p33) effectively inhibits the growth of HIV-1 strains in cell cultures. 14th European Immunology Meeting EFIS 2000, Poznan, Immunology Letters, 2000 (2,3), 429.
91
