Az Az ophthalmopathia ophthalmopathia autoimmun autoimmun kórfolyamatára kórfolyamatára utaló utaló tényezôk tényezôk Bizonyított: Bizonyított:
A A celluláris celluláris és és humorális humorális autoimmun autoimmun folyamatok folyamatok szerepe. szerepe. szemizom, szemizom, retrobulbaris retrobulbaris kötôszövet, kötôszövet,
könnymirigy könnymirigy elleni elleni autoantitestek autoantitestek exophthalmogen exophthalmogen immunglobulinok immunglobulinok (pl.fibroblast (pl.fibroblast stimuláló stimuláló antitestek) antitestek) thyreoglobulinnal thyreoglobulinnal és és az az acetylcholinacetylcholinesterázzal esterázzal keresztreagáló keresztreagáló antitestek antitestek citotoxikus citotoxikus reakciók reakciók (ADCC, (ADCC, direkt) direkt)
Kérdéses: Kérdéses:
A A specifikus specifikus autoantigén autoantigén kimutatása. kimutatása.
A A pajzsmirigy pajzsmirigy és és az az ophthalmopathia ophthalmopathia társulását társulását alátámasztó alátámasztó tényezôk tényezôk Kimutatott: Kimutatott:az az anatómiai anatómiai kapcsolat kapcsolat (retrograd (retrograd nyirokáramlás) nyirokáramlás) szerepe. szerepe. Kérdéses: Kérdéses: TSH, TSH, exophthalmogen exophthalmogen TSH TSH fragmentek fragmentek jelentôsége jelentôsége TSH TSH receptor receptor struktúra struktúra aa szemizom szemizom membránon membránon közös közös antigén antigén epitópok epitópok elôfordulása elôfordulása
Célkitûzések Célkitûzések
1. 1.
Az Az antitestválasz(ok) antitestválasz(ok) melyik, melyik, molekulasúly molekulasúly szerint szerint pontosabban pontosabban meghatározható meghatározható antigén antigén fehérjefehérjerész(ek) rész(ek) ellen ellen irányulnak? irányulnak? Kimutatható-e Kimutatható-e csak csak Graves-ophthalmopathiára Graves-ophthalmopathiára jellemzô jellemzô specifikus specifikus szemizom szemizom elleni elleni autoantitest? autoantitest?
2. 2.
Milyen Milyen aa kapcsolat kapcsolat aa szemizom szemizom elleni elleni autoantiautoantitestek testek elôfordulása elôfordulása és és az az ophthalmopathia ophthalmopathia fennállása, fennállása, szemtünetek szemtünetek aktivitása, aktivitása, aa protrusio protrusio elôfordulása elôfordulása és és aa terápia terápia között? között?
3. 3.
Kimutathatók-e Kimutathatók-e közös közös receptor receptor struktúrák struktúrák (pl. (pl. TSH TSH receptor receptor struktúra) struktúra) ill. ill. azonos azonos antigénrészek antigénrészek aa humán humán pajzsmirigy pajzsmirigy és és aa szemizom szemizom szövetek szövetek között? között?
Alkalmazott Alkalmazott módszerek módszerek Antitestek Antitestek kimutatására kimutatására Indirekt Indirekt ELISA ELISA meghatározás meghatározás 125 125 I-Staphylococcus I-Staphylococcus Protein Protein A A immunimmunadszorpció adszorpció SDS-PAGE SDS-PAGE gélelektroforézis gélelektroforézis és és western western blotting blotting vizsgálatok vizsgálatok TSH TSH receptor receptor struktúrák struktúrák vizsgálatára vizsgálatára 125 I-hTSH Autoradiographia Autoradiographia 125 I-hTSH izotóppal izotóppal Scatchard Scatchard analizis analizis
Antigénfrakciók Antigénfrakciók elôállítása elôállítása
Humán pajzsmirigy szemizom
homogenizálása homogenizálása szétválasztó szétválasztó centrifugálások centrifugálások
vázizom
3000 3000 gg II Frakció Frakció == üledék üledék 10 10 000 000 gg IIII Frakció Frakció == üledék üledék 100 100 000 000 gg III III Frakció Frakció == üledék üledék
IV IV Frakció= Frakció= szupernatans szupernatans (citoszol) (citoszol)
A A 87 87 Graves-kóros Graves-kóros beteg beteg fôbb fôbb klinikai klinikai paraméterei paraméterei Klinikai Esetszám Klinikai paraméterek paraméterek Esetszám Nemek 70 Nemek megoszlása megoszlása nô nô 70 férfi 17 férfi 17 Átlagéletkor 44 Átlagéletkor 44 ±± 14 14 év év Ophthalmopathia 60 Ophthalmopathia társulása társulása 60 fennállási 4.5 fennállási ideje ideje 4.5 ±± 3.8 3.8 év év aktív aktív gyulladásos gyulladásos szemtünetek szemtünetek 27 27 osztályozása osztályozása (NOSPECS) (NOSPECS) II. 77 II. stádium stádium III.stádium 29 III.stádium 29 IV. 21 IV. stádium stádium 21 V. 22 V. stádium stádium VI. 11 VI. stádium stádium Pajzsmirigy Pajzsmirigy funkció funkció hyperthyreoid 47 hyperthyreoid 47 euthyreoid 35 euthyreoid 35 hypothyreoid 55 hypothyreoid TSH 46 TSH receptor receptor elleni elleni antitest antitest 46 elôfordulása elôfordulása (TRAK (TRAK >> 14 14 IU/ml) IU/ml)
Szemizom Szemizom citoszol citoszol elleni elleni antitestek antitestek és és aa terápia terápia kapcsolata kapcsolata aa 60 60 Graves-ophthalmopathiás Graves-ophthalmopathiás betegnél betegnél antitestpozitív betegszám
Terápia Terápia 25
Corticosteroid, Imuran,Cyclosporin-A
Radiojód
20
Antitestek IgM 1 Series IgA 2 Series IgG 3 Series
15 10 5 0
N=15
nem
N=45
N=35
N=25
igen nem terápiát kapott
igen
antitestpozitív beteszám
Szemizom Szemizom citoszol citoszol frakció frakció elleni elleni IgG, IgG, IgA IgA és és IgM IgM típusú típusú antitestek antitestek elôfordulása elôfordulása aa 87 87 Graves-kóros Graves-kóros betegnél betegnél 35
* P<0.001 ** P<0.02 *,**
28 21 14 7
*
Betegcsoportok Kontroll (IgG N=25, Kontroll IgA N=17,IgM N=20) Graves-kór(-) ophGraves-kór (-ophth.path) thalmopathia N=27 Graves-ophthalmoGraves-ophthalmopathia pathia N=60
**
* * 0 IgG IgA IgM antitestek
antitestpozitív betegszám
Pajzsmirigy, Pajzsmirigy, szemizom szemizom és és vázizom vázizom citoszol citoszol elleni elleni IgA IgA típusú típusú antitestek antitestek 87 87 Graves-kóros Graves-kóros betegnél betegnél 35 Betegcsoportok Kontroll Series 1 N=17 Graves-kór(-)ophSeries 2 thalmopathia N=27 Graves-ophthalmoSeries 3
28 21 14
pathia N=60
7 0 pajzsmirigy szemizom antigének
vázizom
antitestpozitív betegszám
Triton Triton X X 100-al 100-al szolubilizált szolubilizált szemizom szemizom citoszol citoszol elleni elleni antitestek antitestek kimutathatósága kimutathatósága Graves-ophthalmopathiában Graves-ophthalmopathiában
6 Betegcsoportok Kontroll1N=21 Series Graves-ophthalSeries 2 mopathia N=25
4 2 0
IgG
IgA antitestek
antitestpozitív betegszám
Szemizom Szemizom IIII és és IV IV frakciók frakciók elleni elleni IgG IgG típusú típusú autoantitestek autoantitestek Graves-ophthalmopathiában Graves-ophthalmopathiában és és progresszív progresszív szisztémás szisztémás sclerosisban sclerosisban 20 15
Betegcsoportok Progresszív sziszté- más Series sclerosis1N=43 Graves-ophthalmoSeries 2
10
pathia N=50
5 0
II IV szemizom frakciók
antitestpozitív betegszám
Szemizom Szemizom IIII és és IV IV frakciók frakciók elleni elleni IgG IgG típusú típusú autoantitestek autoantitestek Graves-kórban Graves-kórban 20 Betegcsoportok Kontroll N=25 Kontroll Graves-kór(-)ophGraves-kór thalmopathia (-ophth.path) N=25 Graves-ophthalmo-pat Graves-ophthalmopathia
15 10
hia N=50
5 0
II IV szemizom frakciók
antitestpozitív betegszám
Szemizom Szemizom citoszol citoszol elleni elleni antitestek antitestek és és aa TSH TSH receptor receptor elleni elleni antitestek antitestek kapcsolata kapcsolata 60 60 Graves-ophthalmopathiás Graves-ophthalmopathiás betegnél betegnél 20
N=32
N=28 * P<0.05 *
Antitestek IgM 1 Series IgM IgA 2 Series Series IgG 3
15 10 5 0
* TRAK + TRAK TSH receptor elleni antitestek
antitestpozitív betegszám
Szemizom Szemizom citoszol citoszol elleni elleni antitestek antitestek és és aa pajzsmirigy pajzsmirigy funkció funkció kapcsolata kapcsolata 60 60 Graves-ophthalmopathiás Graves-ophthalmopathiás betegnél betegnél 16 12 8
N=22
N=33
N=5 Antitestek IgM 1 Series IgA 2 Series IgG 3 Series
4 0 Hyperthyreosis Euthyreosis Hypothyreosis pajzsmirigy funkció
antitestpozitív betegszám
Szemizom Szemizom citoszol citoszol elleni elleni antitestek antitestek és és az az ophthalmopathia ophthalmopathia fennállási fennállási idejének idejének kapcsolata kapcsolata 12
N=13
N=18
N=18 Antitestek IgM 1 Series IgA 2 Series Series IgG 3
8 4 0
0-1
1.3 3.8 fennállási idô (év)
antitestpozitív betegszám
A A protrusio protrusio és és aa szemizom szemizom citoszol citoszol elleni elleni antitestek antitestek kapcsolata kapcsolata aa 60 60 Graves-ophthalmopathiás Graves-ophthalmopathiás betegnél betegnél 25 20
*N=29 *
N=21 * P<0.02
15 10 5 0
III.stádium IV.stádium az ophthalmopathia osztályozása
Antitestek IgM 1 Series IgA 2 Series Series IgG 3
Új tudományos eredmények 1. 1. AA humán humán szemizom szemizom elleni elleni IgG, IgG, IgA IgA és és IgM IgM
típusú típusú antitestek antitestek elôfordulása elôfordulása nem nem specispecifikus fikus aa Graves-ophthalmopathiára. Graves-ophthalmopathiára. Kimutathatósága Kimutathatósága függ függ az az antigén antigén elôállíelôállítási tási módjától módjától és és különbség különbség észlelhetô észlelhetô aa vázizom vázizom elleni elleni antitestekhez antitestekhez képest. képest.
Új tudományos eredmények 2.
Az Az IgG, IgG, IgA IgA és és IgM IgM típusú típusú szemizom szemizom citoszol citoszol elleni elleni antitestek antitestek megjelenése megjelenése eltérô eltérô diagnosztikai diagnosztikai jelentôséggel jelentôséggel bír: bír: a. IgG :: aa gyulladásos gyulladásos szemtünetekkel szemtünetekkel adott adott a. IgG szoros szoros összefüggést összefüggést (P<0.001). (P<0.001). b. IgA :: kulcsszerepe kulcsszerepe lehet lehet aa Graves-kórban Graves-kórban aa b. IgA pajzsmirigy pajzsmirigy betegség betegség és és az az ophthalmopathia ophthalmopathia társulásában társulásában (P<0.001, (P<0.001, azonos azonos molekulasúly molekulasúly tartományokban tartományokban kb.80, kb.80, 58-55 58-55 kDa). kDa). c. IgM :: elôfordulása elôfordulása megelôzheti megelôzheti az az ophthalmoophthalmoc. IgM pathia pathia megjelenését. megjelenését.
Új tudományos eredmények 3.
TSH TSH receptor receptor struktúra struktúra mutatható mutatható ki ki aa szemizom szemizom membrán membrán és és citoszol citoszol frakciókban frakciókban (( 66 66 kDA-nál, kDA-nál, aa TSH TSH receptor receptor alfa-alegységének alfa-alegységének megmegfelelôen 125I-hTSH felelôen 125 I-hTSH kötôdés kötôdés gátlása gátlása ).).
A A 87 87 Graves-kóros Graves-kóros beteg beteg esetében esetében alkalmazott alkalmazott terápia terápia
Gyógyszeres Gyógyszeres Methothyrin 61 Methothyrin 61 Corticosteroidok 59 Corticosteroidok 59 Lithium 36 Lithium carbonat carbonat 36 Imuran 88 Imuran Cyclosporin-A 22 Cyclosporin-A Parlodel 66 Parlodel Thyranon Thyranon szubsztitució szubsztitució 13 13
Pajzsmirigy Pajzsmirigy mûtét mûtét Radiojód Radiojód kezelés kezelés
66 42 42
SMEA index*
Szemizom Szemizom membrán membrán (( frakció frakció II )) elleni elleni antitestek antitestek kimutatása kimutatása 125-I-Staphylococcus 125-I-Staphylococcus Protein Protein A A módszerrel módszerrel és és aa szemtünetek szemtünetek aktivitása aktivitása Graves-ophthalmopathiában Graves-ophthalmopathiában Aktivitással Aktivitás Aktivitással Aktivitás nélkül nélkül 6 o P<0.001 5 4
o 3 o o oo 2 oo o ooo o o 1 oo oo o 0
o N=21 Series 3o N=19 o oo o o oo ooo o o o o oooooo betegcsoportok
* SMEA index:(c.p.m. beteg-vak)/(c.p.m.kontroll-vak), antitestpozitivítás,ha értéke > 1.17 (kontroll (kontroll x+2SD) x+2SD)
-
pajzsmirigy citoszol elleni antitestek
Humán Humán szemizom szemizom és és pajzsmirigy pajzsmirigy citoszol citoszol elleni elleni IgA IgA típusú típusú antitestek antitestek közötti közötti korreláció korreláció aa 60 60 Graves-ophthalmopathiás Graves-ophthalmopathiás betegnél betegnél 3
Y=0.63+0.58*X Y=0.63+0.58*X r=0.7333 r=0.7333 P<0.001 P<0.001
2 1 0 0,6
1
1,4
1,8
2,2
Szemizom citoszol elleni antitestek
2,6
TSH TSH receptor receptor struktúra struktúra Scatchard Scatchard analizise analizise humán humán szemizom szemizom citoszol citoszol frakció frakció esetében esetében
kötött / szabad 125 I aktivitás
1
Szemizom Szemizom citoszol citoszol
0,8 0,6 0,4 Pajzsmirigy Pajzsmirigy citoszol citoszol
0,2 0
0
20
40
Jelzett TSH kötött
60
125
80 I aktivitása
TSH TSH -3 100 x 10 pmol
TSH TSH receptor receptor struktúra struktúra Scatchard Scatchard analizis analizis eredményei eredményei humán humán szemizom szemizom és és pajzsmirigy pajzsmirigy citoszol citoszol frakciók frakciók esetében esetében Humán Humán szemizom szemizom citoszol citoszol frakció frakció
-- 33
A A kötôdés kötôdés szenzitivítása szenzitivítása :: 2.717 2.717 xx 10 10 pmol pmol TSH TSH (( 2.28 2.28 mIU mIU // ml ml )) 99 -- 11 Affinitási konstans : 146 x 10 Affinitási konstans : 146 x 10 M M
Humán Humán pajzsmirigy pajzsmirigy citoszol citoszol frakció frakció
-- 33
A A kötôdés kötôdés szenzitivítása szenzitivítása :: 1.073 1.073 xx 10 10 pmol pmol TSH TSH (( 0.9 0.9 mIU mIU // ml ml )) 99 -- 11 Affinitási Affinitási konstans konstans :: 11 11 xx 10 10 M M
