Immunlabor vizsgálatok szerepe a szisztémás autoimmun betegségek diagnosztikájában Dr. Németh Julianna Laboratórium KFT Budapest www.laboratoriumkft.hu
Immunológiai vizsgálatok szisztémás autoimmun kórképekben • •
• • • • • • •
ANA (antinukleáris antitestek) ENA (Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, RNP) ds-DNA / chritidia ss-DNA hiszton elleni AAT nukleoszóma elleni AAT centromer elleni AAT riboszóma RNP anti-C1q
• •
ANCA MPO / PR3
• •
RF / RF izotípusok, (WR) anti-CCP, anti-MCV
•
foszfolipid antitestek
•
C3, C4,(C2), CIC, CH50
•
cryoproteinek
•
immunglobulinok, elektroforézis süllyedés, CRP
•
Autoantitest diagnosztika helye és szerepe • • •
• • • • • •
betegség diagnózisa differenciáldiagnózis: autoimmun májbetegség, glomerulonephritis, M. Basedow, myopathiák, arthropathiák betegség aktivitásának követésére – aktivitási markerek: anti-C1q, ds-DNA, ASCA – korrelál a betegséggel: ANCA, ds-DNA, nukleoszóma, EMA – nem korrelál: AMA, ANA, pajzsmirigy autoantitestek betegségcsoportokon belüli felosztás: prognosztikai és terápiás:myositis Mi2/SRP, riboszóma elleni antitest, centromer antitest terápia hatékonyságának követésére – eltűnő antitestek: cöliakia specifikus antitestek – perzisztáló antitestek: AMA2 PBC-ben, ANCA PSC-ben korai diagnosztika „tünetmentes” állapotban: RF, nukleoszóma, CCP, antiC1q (terápiás siker!) rizikó felmérés: családvizsgálat, gestációs diabetes overlap szindrómák (nem teljesen karakteres kórképek): autoimmun májbetegség, myositis, MCTD autoantitest keresés patológiai eltérés alapján
ARA kritériumok
1971 klinikai adatok
ARA kritériumok 1982
ARA kritériumok 1997
11 kritérium
11 kritérium
szerodiagnosz- immunfluoreszcens tika: Ø teszttel vagy ezzel equivalens teszttel kóros ANA titer, vizsgálat idején DIL kizárható immunológiai eltérés: LE-sejt LE-sejt vagy pozitivitás natív DNA kóros titerben vagy Sm pozitivitás vagy 6 hónapig poz. syphilis teszt, ami TPIT neg.
változatlan
immunológiai eltérés: natív DNA kóros titerben vagy Sm pozitivitás vagy kóros anticardiolipin IgG vagy IgM érték vagy kóros LA
Antinukleáris antitestek metodikái Metodikák:LE-sejt kimutatás (1948) Agglutináció (SLE-latex) antigén: DNP Immundiffuzió: polivalens ENA extractum Indirekt immunfluoreszcencia: Hep-2 sejtvonal ELISA: Hep-2 lizátum, tisztított és rekombináns antigének keveréke BLOT: tisztított és/ vagy rekombináns antigének keveréke
?
ANA gyűjtőfogalom= minden autoantitest, amelyik konzervált (bármely sejtben előforduló) sejtmag antigénnel reagál, lehet IgG / A/ M ANA = minden olyan autoantitest, amelyik indirekt immunfluoreszcens módszerrel szövetmetszeten (rágcsáló máj / vese) vagy tenyésztett humán tumorsejt-lemezen (pl. Hep-2) nukleáris fluoreszcenciát mutat ANA= minden olyan antitest, amelyik a sejtmag oldható ill. struktúra fehérjéivel reagál LE-sejt, SLE-latex teszt, ANF, ANA, antinukleáris antitestek, ANA screen, ANA detect, ANA-6, -8, -10, -12, ANA-panel, ANA subset, FANA, CTD ANA ANA lelet: negatív / pozitív, titer / koncentráció, ++, <>
mag, magburok, ms apparátus, nukleoplazma, citoplazma
ANA, mint laboratórumi teszt • • • • • •
IIF ELISA szenzitivitás: 64-90% 72-90% – SLE: 98% specificitás: 48-56 % 50-62% – SLE:49% - prediktív érték: 93-95% 94-96% + prediktív érték : 29-35 % 33-36% ANA vizsgálat jó a szisztémás autoimmun betegség kizárására, kevésbé jó a betegség igazolására ANA pozitivitás sokkal gyakoribb, mint a szisztémás autoimmun betegség
homogén
gyűrűs
szemcsés
ds-DNA
PCNA 5-10%
ss-DNA
riboszóma P <10%
hiszton
Anti-kromatin antitestek • • •
•
LE sejt faktor, SLE-latex, anti-nukleoszóma, anti-DNP, H2A-H2B-DNA kromatin: hisztonok natív komplexe DNS-sel tartalma: – 40% DNS – 40% hiszton – 20% non-hiszton fehérje – más makromolekula antikromatin antitestek: – anti-nukleoszóma (4) – anti-ds-DNA (6) – anti-ss-DNA – anti-hiszton (5)
Anti-ds-DNA metodikák METODIKA
ELŐNY
HÁTRÁNY
Farr assay
magas specificitás, mindhárom izotípus
alacsony szenzitivitás radioaktív módszer
CLIFT assay
magas specificitás csak intakt duplaszálú DNS-t mutat ki
alacsony szenzitivitás IF mintázat értékelése szemikvantitatív
immunoblot
egyszerű kivitel antigén megválasztása
nem kvantitatív
ELISA
magas szenzitivitás nagy széria izotípus specificitás
alacsony specificitás alacsony és magas aviditású antitestet is méri
ds-DNA metodikai problémái • • • •
heterogén autoantitest család, nem SLE specifikus SLE-ben:22-94% pozitivitás irodalom és metodika függő nem korrelál mindig a betegség aktivitásával ds-DNA pozitivitás ANA pozitivitás nélkül
•
laboratóriumi tesztek és az antitest probléma köre: – antigén tisztaság – antigén specificitás (borjú thymus, lazac spermium plazmid DNA, humán rekombináns DNA ) – kitapasztott antigén (megváltozó struktúra, más kötési viszonyok, antigén intaktsága) – antigén keresztreakcó készség (ss-DNA) – antitest alosztály (protektív IgM antitest) – aviditás (ELISA) – affinitás – RF és CIC pozitivitás
ANA diagnosztika algoritmusa IIF-val ANA szűrés Hep-2 IIF mag fluoreszcencia
granuláris és homogén magfluoreszcencia
ENA screen
ENA azonosítás
citoplazma fluoreszcencia
kromoszóma pozitív
ds-DNA, hiszton, nukloeszóma
SS-A, Jo-1!
finom szemcsés
durva szemcsés vagy szálas
Rib. Jo-1
AMA, simaizom
ANA diagnosztika algoritmusa ELISA-val ANA screening ELISA
pozitív
határérték
negatív
Hep-2 IIF?
ENA screen, ENA azonosító: U-RNP, Sm, SS-A, SS-B, Scl, Jo-1 ds-DNA, hiszton, nukleoszóma
ritka antigén valóban negatív
Foszfolipid antitestek
APS nemzetközi konszenzus kritériumai Miyakis és mtsai 2006
Laboratóriumi kritériumok 12 héten belül legalább 2 alkalommal pozitívnak talált plazma lupus antikoagulans (az LA mérést az International Society on Thrombosis and Hemostasis előírásai szerint kell végezni) 12 héten belül legalább 2 alkalommal mért pozitív kardiolipin IgG és / vagy IgM koncentráció közepes vagy magas titerben, (>40 GPL, / >40 MPL) standardizált ELISA-val mérve 12 héten belül legalább 2 alkalommal pozitívnek talált β2-GPI IgG és / vagy β2-GPI IgM standardizált ELISA-val mérve APS valószínű, ha legalább egy laboratóriumi és egy klinikai kritérium egyidejűleg fennáll
APS diagnosztikai problémái • 12 héten belül megismételt vizsgálat – kardiolipin IgG infekciókban álpozitiv lehet: • TBC, mycoplasma, HIV, malaria, borrelia, lepra, streptococcus, coli, chlamydia, salmonella – malignus betegségek • mikor történjen az antitest vizsgálat • foszfolipid antitestek értékeinek ingadozása • LA és / vagy antifoszfolipid pozitivitás • primer – szekunder APS • 2 lépcsős diagnosztika – 1. kardiolipin / β2-glikoprotein I komplex – 2. ritka autoantitestek
Laboratóriumi eltérések APS-ban •
Autoantitest pozitivitás: – Anti-prothrombin – Anti-foszfatidil-szerin – Annexin V – Anti-foszfatidil-kolin – Anti-foszfatidil-inozitol – Anti foszfatidil-etanolamin
• • • •
Kóros APTI Thrombocytopenia Coombs pozitivitás VDRL, TPHA pozitivitás
RA laboratóriumi diagnosztika Metodika
Szenzitivitás (%)
Specificitás (%)
RF (IgM) (1937)
~ 75 %
< 65 %
WR (1948)
~ 50 %
~ 87 %
APF (1964)
49-60 %
73-90 %
AKA (1979) Filaggrin (filament aggregating protein)
35-55 %
88-98 %
Anti-CCP1 (1998)
55-70 %
91-95 %
Anti-CCP2-CCP3
68-85 %
91-99 %
CCP IgG/IgA Egyéb citrunillált fehérjék (MCV)
ANCA diagnosztika Diagnosztikai ajánlás
ANCA antigén (major)
IIF mintázat
Proteináz-3
cANCA, ritkán pANCA
Myeloperoxidáz
pANCA, ritkán cANCA
Elasztáz
pANCA
Katepszin G
pANCA
Laktoferrin
pANCA
Lizozim
pANCA
BPI
atípusos cANCA vagy pANCA
„új beteg” laboratóriumi vizsgálatánál csak mindkét metodika kombinált eredménye alapján szabad(na) leletet adni (IIF, ELISA) a kétféle vizsgálat (IIF és ELISA) sorrendje is fontos: az IIF történjen előbb IIF mintázat nem elég specifikus a diagnózis felállításához, ezért terápiás döntéshez az ANCA ELISA leletre is szükség van minden nem c mintázat esetén ANA vizsgálata is ajánlott mindkét teszt forma quantitatív végzése ajánlott
Cutan vasculitis esete 50 éves férfi beteg 1984. térdizületi arthrosis 1990. súlyos tüdőgyulladás ( klíma berendezéstől) 1995. RF: 266.9 IU/ml, minden egyéb laboratóriumi paraméter normális 1998. kullancs csípés után Borrelia infekció lábán petechiaszerű bőrelváltozások, melyek összefolynak, havonta 1x megjelennek, majd eltűnnek, barna bőrelszíneződéssel gyógyulnak Kb.1999-től visszatérő boka-, térdizületi fájdalmas duzzanat, mozgáskorlátozottság 2000. Salmonella, Chlamydia, Yersinia negatív szerológia 2000-2006 ellentmondó Borrelia szerológiai leletek 2003 enyhén emelkedett transzamináz érték A bőrjelenség miatt többszörös átvizsgálás, gócot nem találnak: 2 bőrgyógyász, 2 belgyógyász, angiológus, rheumatológus, infektológus Diagnózisok: purpura vasculitis Schönlein-Henoch purpura
IgG: 14.9 g/l, IgA:1.0 g/l, IgM: 1.94 g/l, IgE:217 IU/ml C4:0.1 g/l, C3:1.29g/l, CH50: 59 E/ml, RF: 891 IU/ml, RF-IgM és IgA emelkedett, Waaler-Rose:1:128, CCP:neg, ANA, ENA, ds-DNA: neg Borrelia szerológia: IgG negatív, IgM kissé emelkedett, BLOT: Flagellin IgG és IgM gyengén poz IFE: negativ, szérum kappa: 3.77g/l, lambda:1.05 g/l kappa / lambda: 3.59 II. típusu kryoglobulinaemia, IgM kappa monoklonális és IgG poliklonális gammopathia anti-HCV pozitivitás
Autoantitestek, mint diagnosztikai kritériumok
• SLE: ANA, ds-DNA, Sm, foszfolipid antitestek • Neonatalis lupus: ANA / SS-A, SS-B • MCTD: ANA / U1-RNP • CREST szindróma: ANA/ centromer • Sjögren szindróma: ANA/SS-A, SS/B • PM/DM: ANA /Jo-1, Mi-2, Ku, SRP, OJ, EJ, PM/Scl • RA: RF, citrunillált peptid • M. Wegener: cANCA/PR-3
SLE MCTD SjS PM/DM Í
ds-DNS, hisztonÎSLE
Scl-70, PM-sclÎSS
SS-A, SS-B, Sm, RNP
PCNAÎSLE
centromerÎCREST
Jo-1ÎPM/DM
