A T sejtek szerepe az autoimmun 1-es típusú diabetes mellitusban Doktori értekezés
Dr. Kis János Tibor Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Treszl András, PhD. Hivatalos bírálók: Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Prof. Dr. Halmos Tamás Dr. Pánczél Pál, kandidátus Prof. Dr. Madácsy László, Dr. Hamvas József, kandidátus Dr. Vásárhelyi Barna, PhD.
Budapest 2007
Tartalomjegyzék: Rövidítések
5
1. BEVEZETÉS
7
1.1. Az 1-es típusú diabetes mellitus, mint autoimmun betegség
7
1.2. A T-sejtek, ezen belül a CD4+ T limfociták szerepe T1DM-ben
9
1.3. A natural killer (természetes ölő) T sejtek
11
1.4. Az invariant NKT sejtek alcsoportjai és felszíni markerei
13
1.5. Az iNKT sejtek 1-es típusú diabetes mellitusban
14
2. CÉLKITŰZÉSEK
15
3. BETEGEK és MÓDSZEREK
17
3.1. Betegek és egészséges kontrollok
17
3.2. Microarray vizsgálatok
20
3.3. Quantitative PCR (TaqMan)
22
3.4. Western blot analízis
22
3.5. Az adhéziós molekulák flow citometriás vizsgálata
22
3.6. A sejt DNS tartalmának mérése
23
3.7. Egyetlen sejt szortolás PBMC-ből
23
3.8. Az NKT klónok második festése
24
3.9. RNS extracio
24
3.10. RT-PCR és szekvencia analízis
25
3.11. A citokin termékek mérése ELISA-val
25
3.12. Regulátoros markerek vizsgálata
26
3.13. In vitro stimulációs kísérletek
26
3.14. Statisztikai analízis
27
4. EREDMÉNYEK
28
4.1. Az egyes betegcsoportokban különbözőképp expresszálódó gének azonosítása
28
2
4.1.1 A csoportok páronkénti összehasonlítása.
28
4.1.2. Második lépésként összehasonlítottuk az egyes párokat egymással
29
4.1.3 A legjellemzőbb, megváltozott expressziójú gének azonosítása
29
4.2. A CD4+ T-sejtek T1DM-ban érintett génjeinek funkciói
32
4.2.1. Immunszignál
32
4.2.2. A sejtciklus szabályozása
32
4.2.3. A sejtfelszíni receptorhoz kötött szignáltranszdukció
32
4.2.4. Electron transzport
32
4.2.5. Epigenetikus modifikáció
33
4.3. A microarray adatok verifikálása quantitativ PCR-ral
35
4.4. HDAC1 Western-blot analízis
36
4.5. A CD4+ T sejtek adhéziós molekuláinak, a LFA-1 és a P-szelektinnek az expressziója, illetve a sejtciklus analízise
37
4.5.1 A LFA-1 és a P-szelektin expressziója
37
4.5.2. A CD4+ T sejtek sejtciklus vizsgálata
39
4.6. Egyetlen sejt szortolás PBMC-ből
40
4.7. Az iNKT klónok azonosítása
41
4.8. Az iNKT sejtek frekvenciája
44
4.9. Az iNKT sejt klónok karakterizálása
45
4.10. A klónok citokin produkciója
48
4.11. Az iNKT sejtek regulátoros markerei
51
4.11.1. A CD25 sejtfelszíni jelenléte
51
4.11.2. A FoxP3 regulátoros marker intenzitása
52
4.11.3. A regulátoros citokinek
54
4.11.4.Az iNKT sejtek regulátoros tulajdonságainak in vitro vizsgálata
55
5. MEGBESZÉLÉS
57
5.1. A CD4+ sejtek szerepe T1DM-ban
57
5.2. Az iNKT sejtek szerepe T1DM-ban
60
3
5.2.1. Az iNKT sejtek identifikálásának technikai problémái és azok áthidalása
61
5.2.2 Az iNKT sejtek alcsoportjainak aránya a betegcsoportokban 61 5.2.3. Az iNKT klónok IL-4 és IFN-γ termelése
62
5.2.4. Az iNKT sejtek regulátoros tulajdonságai
63
6. KÖVETKEZTETÉSEK
65
7. ÖSSZEFOGLALÁS
67
8. IRODALOMJEGYZÉK
70
9. PUBLIKÁCIÓK
82
9.1. A disszertációhoz kapcsolódó közlemények
82
9.2. A disszertációtól független közlemények
83
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
85
4
Rövidítések: Ab: antibody; α-CD3: anti-CD3; bp: base pair; CDxy: cluster of differentiation; CFSE: carboxyfluoroscein succinimidyl ester; DEPC: Diethylpyrocarbonate; DMSO: Dimethyl sulfoxide; DN: double negative; DNA: Deoxyribonucleic acid; EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid; ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay; FITC: Fluorescein isothiocyanate; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAD: Glutamic Acid Decarboxylase; HPLC: High Performance Liquid Chromatography; IAA: Insulin autoantibody; IA2-Ab: Insulinoma associated Protein-tyrosine phosphatase antibody; iNKT: invariant natural killer T-cells; LFA: Lymphocyta funkció antigen; ltT1DM: long term type 1 diabetes mellitus, régóta fennálló 1-es típusú diabetes mellitus; ltT2DM: long term type 1 diabetes mellitus, régóta fennálló 1-es típusú diabetes mellitus; MFI: Mean fluorescence intensity; MHC: Major Histocompatibility Complex; ndT1DM: newly diagnosed type 1 diabetes mellitus, újonnan diagnosztizált 1-es típusú diabetes mellitus; ndT2DM: newly diagnosed type 1 diabetes mellitus, újonnan diagnosztizált 1-es típusú diabetes mellitus; NK: Natural killer;
5
NOD: non-obese diabetic mice; PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell; PBS: Phosphate Buffered Saline; PE: Phycoerythrin; PHA: Phytohaemagglutinin; RA: Rheumatoid arthritis; RIPA: RIPA puffer -RadioImmunoPrecipitation Assay puffer; RPMI: Roswell Park Memorial Institute által kifejlesztett sejt media; rtPCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction; rIL-2: Recombinant interleukin two; RNA: Ribonucleic acid; SDS: sodium dodecyl sulfate; SEM: standard error of mean; SI: stimulation index; SLE: Systemic Lupus Eythematosus; SM: Sclerosis Multiplex; SS: Systemic Sclerosis; TCR: T cell receptor; Th: T helper; T1DM: type 1 diabetes mellitus, 1-es típusú diabetes mellitus T2DM: type 2 diabetes mellitus, 2-es típusú diabetes mellitus
6
1. Bevezetés 1.1. Az 1-es típusú diabetes mellitus, mint autoimmun betegség Az 1-es típusú Diabetes Mellitus (T1DM) hozzávetőleg 10-12 millió, azaz minden 400-600-adik embert érint; a betegség incidenciája világszerte emelkedik (Silink 2002). Észak-Amerikában és Európában ez a teljes diabeteses populáció 5-10%át jelenti. Tipikusan polyuriával, polydsiával és fogyással, gyerekkorban kezdődő, relatíve gyorsan kialakuló betegség. A felnőtteket érintő lassan T1DM-ba progrediáló diabétesz alcsoport - Latent Diabetes of Adulthood (LADA)-, feltehetően szintén közel 10%-át teszi ki a 2-es típusú diabetes mellitusos (T2DM) populációnak (Panczel et al. 2001;Winter & Schatz 2003). A T1DM egy életre szóló betegséget jelent, mely számos akut és krónikus szövődményhez vezethet. Szemben a T2DM-al, melyet inzulinrezisztencia és relatív inzulinhiány jellemez, a T1DM alapvetően inzulinhiányos állapotot jelent, ami az inzulintermelő β-sejtek krónikus autoimmun pusztulása miatt alakul ki. A β-sejtek közvetlen destrukciójában citotoxikus T sejtek (CD8+) és makrofágok vesznek részt (insulitis) (In't et al. 2007;Pinkse et al. 2005;Sibley et al. 1985). Ezek a sejttípusok az inzulintermelő sejteket a sejthártyájukon való pórusok kialakításával, illetve citokinek (INF-γ, TNF-α) segítségével pusztítják el. Az inzulintermelő béta sejtek T sejt függő destrukcióját támogatják azok az inzulitist leíró szövettani vizsgálatok, melyeket újonnan diagnosztizált 1-es típusú diabeteses betegek autopsiája során találtak (Bottazzo et al. 1985). Ehhez járul még azok a bizonyítékok, mikor egypetéjű ikrek közül egy nem diabetesesből pancreas szegmentumot transzplantáltak a diabetesesbe, és a betegség kialakult (Sibley, Sutherland, Goetz, & Michael 1985), csakúgy, mint abban az esetben, mikor egy 1-es típusú diabeteses betegből csontvelőt ültettek át egy immunológiailag ledált, nem diabeteses rokonba (Lampeter et al. 1993). A β-sejtek szelektív pusztulása a glucagon szekretáló α-sejtek predominanciájához vezet, ami abszolút inzulinhiányhoz és másodlagos hyperglucagonaemiához vezet. A betegség autoimmun, krónikus, progresszív jellege felvetette az intervenció lehetőségét, mely le tudná lassítani, vagy meg tudná állítani a β-sejtek pusztulását, lehetőség szerint még prediabeteses állapotban (Winter & Schatz 2003).
7
A betegség pontos etiológiája, a primer autoantigén, és az immunreguláció egzakt mechanizmusa nem ismert. Autoimmunitás alakulhat ki minden olyan antigén ellen, amellyel az immunrendszer korábban nem vált toleránssá, azaz az autoantigén nem prezentálódott megfelelően a thymusban a T sejtek érése során, így elmaradhatott az autoreaktív T sejtek klonális pusztulása, amely normálisan bekövetkezik. Ez megvalósulhat úgy, ha a korábban a rejtett antigének válnak elérhetővé az immunrendszer számára, például fertőzés, vagy trauma következtében, továbbá az immunrendszer érzékenyítéséhez vezethet az is, ha egy patogén mikroorganizmus ellen termelődött autoantitestek keresztreakciót adnak egy autoantigénnel, az autoantigén és a mikroorganizmus közötti molekuláris mimikri révén. Ez a teória magyarázná a T1DM pathogenezisében szereplő vírusfertőződés- elméletet (Winter & Schatz 2003). A T1DM incidenciájának tavaszi és őszi halmozódása, a frissen diagnosztizált eseteknél mért emelkedett coxsackie vírus ellenes antitest titerek, sőt néhány esetben a vírus kimutatása a hasnyálmirigyből támogatja a vírusfertőződés triggerelő hatását. Felmerült a védőoltás lehetősége ezen mikroorganizmusok ellen, azonban a szóba jövő vírusok száma olyan nagy, amely ezt kivitelezhetetlenné teszi (Viskari et al. 2005). Ha az autoantigén ko-stimuláció nélkül, vagy nagyon nagy mennyiségben prezentálódik a T sejteknek, az az autoreaktív T sejtek inaktiválódásához vezethet, mely terápiás lehetőséget jelent, ezért az elsődleges autoantigén kutatása az érdeklődés középpontjában áll. Több lehetőség merült fel: az egyik egy a tejfehérjével, illetve marha szérum albuminnal molekuláris mimikrit mutató β-sejt felszíni molekula, egy hősokk protein, és a GAD fehérje (Wilson & Buckingham 2001). Azonban nemrégiben néhány olyan adat látott napvilágot, mely szerint a primer antigén maga az inzulin, vagy a proinsulin, illetve annak egy részlete lehet (Wong 2005). Sally Kent és munkatársai balesetben
elhunyt
1-es
típusú
diabeteses
kadáverek,
pancreas
környéki
nyirokcsomóiból izolált T sejteket, melyek specifikusan voltak aktiválhatók az inzulin „A” láncának első 15 aminosavából álló oligopeptiddel (Kent et al. 2005). A fent említett sejtek azonban csak korlátozott módon állnak rendelkezésre, ezért ezeket az eredményeket még nem sikerült megerősíteni. Az irodalom abban egyetért, hogy a betegség fő oka, a hibás immunológiai szabályozásban rejlik (Bach & Chatenoud 2001;Jaeckel, von Boehmer, & Manns 2005;Karlsson, Lawesson, & Ludvigsson
8
2000;Winter & Schatz 2003). A szabályozás sejt-sejt kontaktus révén, illetve citokinek révén zajlik. Régóta elfogadott, hogy a Th1 és Th2 citokinek közötti egyensúly felborulása vezethet egyes autoimmun betegségekhez (Abbas, Murphy, & Sher 1996;Foulis, McGill, & Farquharson 1991;Huang et al. 1995). Az 1-es típusú diabetes mellitus esetén a Th1 útvonalat tekintik ártalmasabbnak (Wilson et al. 1998). A jól ismert antitestestek a betegség pathogenezisében közvetlenül valószínűleg nem vesznek részt; ismert, hogy T1DM létrejöhet olyan esetben is mikor az T1DM-sal kapcsolatos antitestek nem detektálhatóak. Ezt a formát idiopathias, illetve 1B típusú diabetesnek is hívják. Az antitestek ”bystander” szerepére utal az is, hogy már agammaglobulinaemias betegnél is kialakult a T1DM (Martin et al. 2001). A T1DM kutatásában az egyik legnagyobb nehézséget az jelenti, hogy az érintett pancreas szövetminták korlátozottan állnak rendelkezésre. Következtetésképpen, a legtöbb adat a T1DM állatmodelljétől a nem kövér diabeteses egértől (NOD- nonobese diabetic mice) származik (Wong et al. 1996). A NOD egérben kifejlődő diabetes azonban több szempontból különbözik a humán T1DM-től. A diabetes például csak a nőstény egerekre korlátozódik, a primer autoantigén valószínűleg különbözik, de talán a legfontosabb az, hogy több olyan módszer ismert, mely a NOD egérben megelőzi a diabetest, de a hasonló módszert alkalmazó humán diabetes megelőzését vizsgáló tanulmányok, mind kudarcot vallottak (Bach 2002;Serreze & Chen 2005). A T1DM egy másik gyakran alkalmazott modellje a BB (BioBreeding) patkány, melynél a diabetes kialakulása CD8 sejtek hiányával társuló immundeficienciával jár, így a humán T1DM pathogenezisétől szintén jelentősen különbözik (Serreze & Chen 2005). 1.2. A T-sejtek, ezen belül a CD4+ T limfociták szerepe T1DM-ben A NOD egérben a T limfociták mindkét alosztálya (CD4+ és CD8+) részt vesz a betegség kialakulásában. A CD8+ sejtek fontos szerepet játszanak a béta sejt pusztítás korai és késői szakaszában is (Ejrnaes et al. 2005;Moore et al. 2004;Pinkse, Tysma, Bergen, Kester, Ossendorp, van Veelen, Keymeulen, Pipeleers, Drijfhout, & Roep 2005;Yamanouchi et al. 2003); azonban azok a mechanizmusok, melyek ezeknek a sejteknek az aktivációjához vezetnek, még nem ismertek. Sőt, bár a diabetes kísérletesen átvihető az NOD.SCID egerekbe akár CD4+ (Peterson & Haskins 1996)
9
akár CD8+ (Wong, Visintin, Wen, Flavell, & Janeway, Jr. 1996) sejt-klónokkal, sokkal valószínűbb, hogy e két sejt típus közötti interakció a legfontosabb (Haskins 2005;Wong, Visintin, Wen, Flavell, & Janeway, Jr. 1996). A CD4+ T sejtek szerepét támasztja alá, az a megfigyelés, mely során NOD egereket anti-CD4+ antitestekkel kezelve nem alakult ki az állatokban sem az inzulinitis, sem pedig a diabetes (Shizuru et al. 1988). Egy másik esetben azt találták, hogy T1DM esetén a CD4+ T sejtek antigén függő proliferációja csökkent (Eibl et al. 2002;Spatz et al. 2003). A CD4+ T sejteknek a T1DM pathogenezisében betöltöttt pontos szerepe lényegében még nem ismert. A CD4+ T helper sejtek a citokin termelésük alapján két csoportra oszthatók: Th1 és Th2 alcsoportok (Abbas, Murphy, & Sher 1996). A krónikus Th1 által befolyásolt gyulladásos válasz tűnik fontosnak számos autoimmun betegség pathogenezisében, így T1DM-ben is (Abbas, Murphy, & Sher 1996;Foulis, McGill, & Farquharson 1991;Huang, Yuang, Goddard, Foulis, James, Lernmark, Pujol-Borrell, Rabinovitch, Somoza, & Stewart 1995). A
leginkább
elfogadott
álláspont
szerint
azonban
autoimmun
válasz
kialakulásában és annak a sejtes immunválasz irányába való eltolódásában, jelenlegi ismeretek alapján, a regulátoros T sejtek alapvető szerepet töltenek be. A regulátoros T sejtek egyik legelsőként megfigyelt sajátsága, hogy a sejtfelszínükön nagy mennyiségben jelenik meg az interleukin-2 receptor (CD25) (Sakaguchi et al. 1995). (Ezek a regulátoros sejtek a T sejtek CD4+ T-helper (Th) csoportjához tartoznak, bár egyes feltételezések szerint CD8+, illetve egyéb T sejt alcsoportok is betölthetnek regulátoros funkciót (Joosten et al. 2007). Újabban a regulátoros funkcióval párosítanak egy transzkripciót szabályozó proteint a forkhead box p3 ( Foxp3) fehérjét (Zheng & Rudensky 2007). A regulátoros sejtek képesek lehetnek az immunválaszt sejtes (Th1) vagy humorális (Th2) irányba terelni. Bár a T1DM pathomechanizmusának egyre több részlete válik világossá, a betegség oka, vagy az autoimmun folyamatot elindító autoantigén még nem ismert. A T1DM pathomechanizmusában a szigetsejtellenes antitestek (ICA, GADA, IA2, IAA) közvetlenül nem vesznek részt, a betegség prognosztikájában, folyamatának követésében, a diagnózis megerősítésében alapvető fontosságúak (Hosszúfalusi & Pánczél 2005). A genetikai prediszponáló faktorok, mint például egyes HLA típusok régóta jól ismertek, erre rakódhat rá valamilyen triggerelő hatás (vírusfertőzés, tehéntej
10
stb.) melyek elindítják az autoimmun folyamatot. A NOD-egérrel végzett kísérletek, és az egyes humán eredmények alapján felmerült, hogy a legtöbb esetben maga az inzulin, valamelyik előalakja (preproinsulin, proinsulin), illetve annak egy részlete lehet az elsődleges autoantigén (Wong 2005). Az autoimmun folyamat előrehaladtával újabb antigének ellen alakul ki autoimmunitás (antigén spreading) (Durinovic-Bello 1998), megjelennek a szigetsejtellenes antitestek, közben a β-sejtek fokozatosan pusztulnak, először a gyors inzulinválasz károsodik, majd ha β-sejtek mennyisége a kritikus érték alá csökken, a T1DM manifesztálódik, majd eltűnésükkel abszolút inzulinhiány alakul ki. 1.3. A natural killer (természetes ölő) T sejtek A natural killer T sejtek (NKT) a thymus eredetű T sejtek azon speciális alcsoportját jelentik, melyek felszínén egyaránt megtalálhatóak az NK (természetes ölő) sejtek markerei és a T sejt receptor (TCR-T cell receptor) (Godfrey et al. 2004). Az NKT sejtek többsége invariáns TCR-t expresszál, ami azt jelenti, hogy a Vα24-JαQ (az alfa lánc 24-es variábilis régiója és az alfa lánc kapcsolódó Q régiója -Vα14-Jα18 egérben) régió között nincs nukleotid beékelődés (Godfrey, MacDonald, Kronenberg, Smyth, & Van Kaer 2004).
1. ábra Az invariáns TCR alfa és béta lánca Az invariáns TCR alfa láncának variábilis szakaszát a Vα24, junkcionális szakaszát a JαQ alkotja, ezek a konstans régión keresztül kapcsolódnak a transzmembrán (TM), majd az intracelluláris (CYT) szakaszhoz. A variabilitás fő forrását a variábilis és a junkcionális szakasz közötti nukleotid beékelődés adja, mely azonban az invariáns TCR-nál hiányzik (nyíl). A béta lánc variábilis részét rendszerint a Vβ11 lánc adja. Itt jelen van egy diverz szakasz (D) is, mely nem azonos a nukleotid beékelődéssel.
11
Ezeket a sejteket invariáns NKT (iNKT) sejteknek hívják, de használatos még az I-es típusú vagy klasszikus NKT sejt elnevezés is (Godfrey, MacDonald, Kronenberg, Smyth, & Van Kaer 2004). Az invariáns Vα24-JαQ lánc, általában a Vβ11 lánccal párosodik. Ez a különleges, NKT sejtek által expresszált, invariáns, genetikailag kódolt TCR egy nem klasszikus MHC-szerű molekulához, a CD1d-hez tud kapcsolódni. Az NKT sejtek azon alosztályát, melynek változó, variáns TCR-ja van, vagy az csak kismértékben változatos, II-es típusú, vagy nem klasszikus NKT sejteknek hívják, melyek azonban szintén CD1d-dependensek (Hammond et al. 1999). Egyes irodalmi adatok szerint a CD1d által az NKT sejteknek prezentált antigén egy glicophospahtidilinositol (Gumperz et al. 2000;Zhou et al. 2004). Mások szerint egy lisosomális glicosphynoglipid (isoglobotrichexosyl-ceramid) lehet az endogén ligandja az NKT sejteknek (Zhou, Mattner, Cantu, III, Schrantz, Yin, Gao, Sagiv, Hudspeth, Wu, Yamashita, Teneberg, Wang, Proia, Levery, Savage, Teyton, & Bendelac 2004). Régóta ismert egy japán mélytengeri szivacsban (Agelas mauritanius) talált molekula az αgalactosyl-ceramide (α-GalCer), mely specifikusan képes aktiválni az iNKT sejteket (Gumperz et al. 2002;Gumperz, Roy, Makowska, Lum, Sugita, Podrebarac, Koezuka, Porcelli, Cardell, Brenner, & Behar 2000;Sidobre & Kronenberg 2002). Az iNKT sejtek, a TCR aktiválása után gyorsan (0,5-2 óra alatt), nagy mennyiségben, egyaránt képesek Th1 (IFN-γ) vagy Th2 (IL-4) típusú citokinek termelésére (Godfrey, MacDonald, Kronenberg, Smyth, & Van Kaer 2004). A termelődött citokinek hatással lehetnek a naiv T sejtek differenciálódására, és befolyásolhatják a gyulladásos és akár az anti-inflammatórikus válaszokat, szerepük lehet mind a veleszületett, és szerzett immunitásban (Wilson, Kent, Patton, Orban, Jackson, Exley, Porcelli, Schatz, Atkinson, Balk, Strominger, & Hafler 1998). Az iNKT sejteknek különösen fontos szerepük lehet a tumor-surveilance-ben és az adaptív immunitás szabályozásban. Az iNKT sejtek az egészségestől eltérően működnek a NOD egérben, és szintén eltérő a sejtek működése néhány humán autoimmun betegségben is, mint például a T1DM-ben, sclerosis multiplexben, systémás lupus erythematosusban és rheumatoid arthritisben (Hammond & Kronenberg 2003). Jelenleg intenzív kutatás tárgya az iNKT sejtek eredetének, fejlődésének tanulmányozása, a jelen adatok szerint a thymus ebben is szerepet játszik. Egérben az NKT sejtek eloszlása szervenként különböző, például az egér májában a T sejtek 30-40%-a, a csontvelőben 20-30%-a NKT sejt (Egawa et al. 2005). A humán
12
adatok elsősorban perifériás vérből származnak, de néhány adat szerint ez hasonló az egérből nyert adatokhoz. (Doherty et al. 1999;Durante-Mangoni et al. 2004;Exley & Koziel 2004;Norris et al. 1999). Már történtek próbálkozások az iNKT sejteket autoimmun, illetve malignus betegségekben való terápiás alkalmazására, sőt a sejtek a α-GalCer-dal történő in vivo aktiválására (Chang et al. 2006;Hammond & Godfrey 2002;Mars et al. 2004). 1.4. Az invariant NKT sejtek alcsoportjai és felszíni markerei és kimutatásuk Emberben az iNKT sejteket általában 3 alcsoportra osztják: CD4+, CD4-CD8(kettős negatív – double negative, DN) és CD8+ alcsoportok (Godfrey et al. 2000;Godfrey, MacDonald, Kronenberg, Smyth, & Van Kaer 2004). Egyes humán sejtekből származó adatok szerint a CD4+ sejtek nagyobb mennyiségben képesek IL-4et termelni, mint a DN vagy a CD8+ csoport, mely jelentősebb immunregulációs hatásra utal. A CD161 egy NK sejteken is meglévő C-típusú lektin, ennek expresszálódása, az NKT érésével van összefüggésben (Gadola et al. 2002), illetve co-stimulácós szerepe van a TCR mediált sejt aktiválódásban (Exley et al. 1998). Az NKT, vagy iNKT sejtek azonosítását és szelektálását leginkább a sejtek rendkívül alacsony száma korlátozza. Az irodalom nem egységes a technika kiválasztásában sem: a tanulmányokban különböző TCR-specifikus (Vα24, Vβ11, CD3, 6B11-az invariáns TCR régió ellenes antitest), vagy NK sejt ellenes (CD161, CD56) antitesteket, és α-galactosyl-ceramide (α-GalCer)-al töltött CD1d tetramert (a tetramer egy
MHC-szerű, mesterséges molekula, melybe oligpeptidek, és egyéb kisebb
molekulák tölthetők, továbbá fluorescens festékkel megjelölhetők, így alkalmasak egyes specifikus TCR-t hordozó T sejtek jelölésére) használtak (Kent, Chen, Clemmings, Viglietta, Kenyon, Ricordi, Hering, & Hafler 2005;Lee et al. 2002b;Porcelli et al. 1996;Wilson, Kent, Patton, Orban, Jackson, Exley, Porcelli, Schatz, Atkinson, Balk, Strominger, & Hafler 1998). Az egyes technikák nem pontosan ugyanazt a sejtcsoportot jelölik ki.
13
1.5. Az iNKT sejtek 1-es típusú diabetes mellitusban Egymásnak ellentmondó adatok lelhetők fel az NKT sejtek gyakoriságára vonatkozóan 1-es típusú diabetes mellitusban. Vannak adatok arra vonatkozóan, hogy az iNKT sejtek száma csökkent, nőt, vagy éppen változatlan maradt a perifériáról vett vérben. A különböző technikák használata megmagyarázhatja az ellentmondó adatokat, hiszen a különböző metódusok eltérő sejtpopulációkat identifikálhatnak. Wilson és munkatársai DN és Vα24 pozitív sejteket vizsgálva azok számának csökkenését találták T1DM-ben (Wilson, Kent, Patton, Orban, Jackson, Exley, Porcelli, Schatz, Atkinson, Balk, Strominger, & Hafler 1998). Lee PT és kollégái Vα24 és α-GalCer-dal töltött CD1d tetramer pozitív sejteket izoláltak, eredményeik szerint azok száma változatlan T1DM-ben (Lee, Putnam, Benlagha, Teyton, Gottlieb, & Bendelac 2002b). Oikawa és munkacsapata Vα24 és Vβ11 pozitív sejteket tanulmányozva, azok frekvenciájának növekedését találták T1DM-ben (Oikawa et al. 2002;Oikawa et al. 2003).
14
2. CÉLKITŰZÉSEK Az eddigi irodalmi adatok alapján feltételeztük, hogy a CD4+ humán T sejtek funkciója összességében megváltozik T1DM-ban. A funkcióváltozás vizsgálatára DNS microarray technikát alkalmaztuk, hogy analizáljuk a CD4+ T sejtek génexpresszióját újonnan
diagnosztizált
T1DM
(newly
diagnosed
T1DM-ndT1DM),
régóta
diagnosztizált 2-es típusú diabetes mellitus (long-term Type 2 diabetes-ltT2DM), és egészséges (healthy-H) kontroll csoportokból. Továbbá célul tűztik ki, hogy a génexpresszió-változásokat protein szinten (Western Blot, flow citometria) is megvizsgáljuk. A CD4+ T sejtek differenciálódásában az iNKT sejteknek az egyéb regulátoros sejtek mellett alapvető szerepük van. Mivel az iNKT sejtek detektálása a sejtek alacsony száma miatt technikailag nehéz, ezért először keresnünk kellett egy módszert, mely megbízhatóan és reprodukálhatóan detektálja az invariáns NKT sejteket. Ezt a technikát alkalmazva célul tűztük ki, hogy összehasonlítsuk az iNKT sejtek gyakoriságát H, ndT1DM, ltT1DM, ltT2DM csoportok között, jellemezzük az alcsoportokat, azokat összehasonlítsuk egymással, analizáljuk funkcióikat, citokin termelésüket. Az iNKT sejtek regulátoros funkciójára több közleményben hivatkoznak, azonban a citokin termelésen kívül erre egyéb bizonyíték ez idáig nem volt, célul tűztük ki ezért, hogy megvizsgáljuk a legelfogadottabb regulátoros sejtfelszíni markereket, és alkalmazzuk az iNKT sejteket in vitro kevert limfocyta antigén stimulációs vizsgálatokban. Célkitűzéseink ez alapján pontokba szedve: •
DNS microarray technika segítségével analizáljuk a CD4+ T sejtek génexpresszióját, azt hasonlítsuk össze a H, ndT1DM és a ltT1DM csoport között;
•
az egyes betegcsoportok között talált különbséget protein szinten is leellenőrizzük; •
keresünk egy módszert, mely megbízhatóan, és reprodukálhatóan detektálja az
15
invariáns NKT sejteket; •
összehasonlítjuk az iNKT sejtek gyakoriságát a H, ndT1DM, ltT1DM, ltT2DM csoportok között;
•
karakterizáljuk az alcsoportokat, illetve hasonlítjuk őket össze egymással;
•
analizáljuk a sejtfunkciókat, elsősorban a citokintermelésüket;
•
megvizsgáljuk a jelenleg legelfogadottabb regulátoros sejtfelszíni markereket;
•
alkalmazzuk az iNKT sejteket, illetve citokin termékeiket, a regulátoros hatást ellenőrző, in vitro végzett T sejt stimulációs kísérletekben.
16
3. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK
3.1. Betegek és egészséges kontrollok Különböző betegcsoportok vérmintáit alkalmaztunk az egyes vizsgálatok elvégzésére. Így a chip-adatok, a TaqMan real-time PCR, a Western blot, a sejtciklusés a sejtfelszíni markerek vizsgálatában az egyes betegcsoportokban más-más betegek vettek részt. Az egyes vizsgálatokba két ok miatt vontunk be az azonos csoportosítás ellenére más-más betegeket. Ennek egyrészt technikai okai voltak: a vizsgálatok sejt igénye nagy, ezért a szükséges vérmennyiséget egyszerre nem tudtuk volna levenni, több vérvételre lett volna szükség egy egyéntől. Másrészt viszont, ha összességében több betegben találjuk meg lényegében ugyanazokat az eredményeket, az tovább erősíti azok megbízhatóságát. Az iNKT sejtek vizsgálatára összesen 31 beteg véréből izoláltam iNKT sejteket: 6 egészséges, (healthy-H), 12 újonnan diagnosztizált 1-es típusú diabeteszes (newly diagnosed-ndT1DM; kevesebb, mint 4 hónapja), 6 régóta fennálló 1-es típusú diabeteszes (long-term-ltT1DM; több mint egy éve), és hét régóta fennálló 2-es típ. diabeteszes (long-term-ltT2DM; több mint egy éve) betegekből. A betegeket és az egészséges kontrollok a Joslin Diabetes Clinic gondozása alatt álltak, illetve ott dolgoztak. A vizsgálatban részt vevő személyek tájékozott beleegyezésüket adták a vizsgálatban való részvételhez, a vizsgálatot a Joslin Diabetes Center etikai bizottsága jóváhagyta.
1. táblázat: A betegcsoportok jellemzői A betegcsoportok közül a kor és BMI alapján nem volt különbség a H, a ndT1DM és a ltT1DM betegek között, azonban a ltT2DM csoport korban és BMI alapján is szignifikánsan eltért. #
két betegnek az IAA értéke emelkedett, nagy valószínűséggel az inzulin-kezelés miatt.
*szignifikáns különbség a csoportok, kohortok között (mean ± SEM)
17
ndT1DM
ltT2DM
H
CHIP KOHORT kor (évek)
23,8±3,9
46,4*±5,5
29,2±4,3
nem♀/♂
2 ♀/3 ♂
2 ♀/3 ♂
4 ♀/1 ♂
HbA1c (%)
8,1±0,9
6,9±0,4
BMI (kg/m2)
22,7±1,6
37,4*±2,3
24,7±1,7
IAA (<39 nU/ml)
594,5±412,6
7,6±2,7
3,8±3,8
GAD index (<0.1)
0,491*±0,201
0,012±0,005
0,014±0,005
IA2 index (<0.1)
1,522±0,916
−0,003±0,019
0,001±0,011
<4
>12
Betegség időtartama (hónap)
TAQMAN KOHORT kor (évek)
24,0 ±1,7
46,4*±5,6
26,6±1,9
nem♀/♂
5 ♀/4 ♂
2 ♀/3 ♂
2 ♀/3 ♂
HbA1c (%)
10,0*±1,1
6,9±0,4
BMI (kg/m2)
23,6 ±1,3
37,4* ±2,3
23,2 ±1,6
IAA (<39 nU/ml)
1202,3 ±466,5
7,6 ±2,7
24,4 ±12,4
GAD index (<0.1)
0,456* ±0,125
0,012±0,005
−0,007±0,017
IA2 index (<0.1)
3,72* ±1,119
−0,003±0,020
0,018±0,017
<4
>12
Betegség időtartama (hónap)
WESTERN BLOT KOHORT kor (évek)
21,7±2.6
37,7*±2,7
22,7±2,2
nem♀/♂
1 ♀/3 ♂
2 ♀/2 ♂
4♀
BMI (kg/m2)
24,5±2,2
29,6±0,7
23,7±1,5
IAA (<39 nU/ml)
678,6±619.6
3,7±1,4
12,8±0,001
GAD index (<0.1)
0,339±0,186
0,023±0,007
0,008±0,003
18
IA2 index (<0.1) Betegség időtartama (hónap)
ndT1DM
ltT2DM
H
6,780±6,535
0,017±0,008
0,003±0,005
<4
>12
SURFACE MARKERS KOHORT kor (évek)
25,3±1,9
50,0*±4,1
25,8±3,3
nem♀/♂
5 ♀/3 ♂
2 ♀/2 ♂
7 ♀/2 ♂
HbA1c (%)
9,3±1,1
6,7±0,4
BMI (kg/m2)
23,6±1,6
35,1*±3,7
21,9±0,8
IAA (<39 nU/ml)
1520,8*±455,9
307,4±294,9
10,9±5,0
GAD index (<0.1)
0,544*±0,125
0,000±0,014
0,010±0,012
IA2 index (<0.1)
2,992*±1,013
0,009±0,007
0,017±0,011
<4
>12
Betegség időtartama (hónap)
CELL CYCLE KOHORT kor (évek)
25,9±1,4
45,6*±5,4
25,9±3,8
Nem ♀/♂
5 ♀/5 ♂
3 ♀/2 ♂
6 ♀ /2 ♂
HbA1c (%)
8,8±0,9
7,2±0,5
BMI (kg/m2)
24,0±1,5
37,7*± 3
23,3±0,2
IAA (<39 nU/ml)
1441,7*±378,1
247,6±236,1
14,6±2,8
GAD index (<0.1)
0,404*±0,112
0,002±0,011
0,020±0,015
IA2 index (<0.1)
1,341±0,529
0,019±0,011
0,011±0,010
<4
>12
Betegség időtartama (hónap)
19
iNKT CELL KOHORT ndT1DM
ltT2DM
H
kor (évek)
28,7±5,7
58,7±7,7*
29,7±10
24,2±3,4
nem♀/♂
3 ♀/9 ♂
4 ♀/3 ♂
2 ♀/4 ♂
4 ♀/2 ♂
BMI (kg/m2)
22,8±3,3
36,4±5,8
23,8±1,3
23,9±3,2
IAA érték (<39nU/ml)
170±266
64±137#
0,84±17,3
1043±1342
GAD index (<0.1)
0.58±0.34
0.04±0.03
0.02±0.04
0,11±0,19
IA2 index (<0.1) Betegség időtartama
1,45±2,57
0,00±0,05
0,01±0,01
3,15±4,7
<4
>12
(hónap)
ltT1DM
>12
A vizsgálatban résztvevő betegeknél autiantitest-szűrés történt: meghatároztuk az inzulinóma asszociált proteintirozin foszfatáz (insulinoma-associated proteintyrosine phosphatase) antitest (IA2-Ab), glutamát-dekarboxiláz (GAD65)-Ab, és inzulin autoantitestek (IAA)] titerét. Az IA2- és a GAD65- antitesteket radioimmunoassay-vel mértük, mely során 35S-izotóppal jelzett GAD65 és IA2 antigéneket használtunk (Christie et al. 1993;Grubin et al. 1994). Az IAA-t kompetitív radioimmunoassay-vel határoztuk meg, itt 125I-izotóppal jelzett inzulint használtunk (Vardi et al. 1987). A betegcsoportok jellemzőit az 1.táblázat szemlélteti.
3.2. Microarray vizsgálatok A betegektől 100 ml vért vettünk le alvadásgátolt (Na-heparin) csövekbe. A vért RPMI 1640-el (BioWhittaker Cambrex, Walkersville, MD, USA) kétszeresére hígítottuk, majd 6 - 8 darab 50 ml-es tubusban ficoll-ra (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Uppsala, Sweden) rétegeztük. Ezután 2000 rpm fordulaton 18 oC-on 27 percig centrifugáltuk, úgy a centrifugán a féket kikapcsoltuk, hogy elkerüljük a rétegek
20
összekeveredését. A cső alján a vörösvérsejtek és granulocyták, felette a ficoll réteg, ennek tetején a PBMC (peripheral blood mononuclear cells - perifériás vér mononucleáris sejtek), majd felülúszó (média, szérum) helyezkedett el. A sejteket összegyűjtöttük a ficoll felszínéről, mosás után Bürker kamrában tripán-kék festés segítségével megszámoltuk. Betegenként 130-240 millió PBMC-t nyertünk. A PBMC-t hő-inaktivált (20 perc 56 oC) férfi humán AB szérumban, (Human AB serum, Omega, Tarzana CA, USA) és 10% DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) fagyasztottuk le és –80°C-on tároltuk a kísérletekig. A CD4+ T sejteket pozitív mágneses gyöngy szelekcióval izoláltuk (Magnetic beads, Dynal, Norway), a cég használati utasításainak megfelelően. Az izolált sejtek tisztaságát minden esetben FACS analízissel ellenőriztük, mely során FITC-cel konjugált anti-humán CD4 és PE konjugált anti-humán CD3 monoklonális antitesteket használtunk (Becton Dickinson). A pozitív izolálást követően a sejtek tisztasága minden esetben 95% felett volt. A CD4+ T sejtekből a teljes RNS-t Rneasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) segítségével vontuk ki. Az RNS-t (5–7 μg) ezután visszaírtuk (reverse transcription) kettős szálú standard cDNS-é (complemter DNS), HPLC-tisztított T7− (dT) 24 primereket és a Superscript Choice System (Life Technologies) kittet használva, az előírások szerint.
A kapott terméket, mint mintát használtuk a biotinált cRNS
szintéziséhez, ehhez a fázishoz Bioarray RNA Transcript Labeling (Enzo) kittet használtuk. A mintákat kitisztítottuk, fragmentáltuk, majd hibridizáltuk az Affymetrix HGU133a GeneChip-re (Affymetrix, CA) a Joslin Diabetes Center Microarray Core Facility közreműködésével, a gyártó protokolljainak megfelelően. Az Affymetrix kitthez tartozó mintát használtuk belső kontrollként. A hibridizációs képet Hewlett– Packard Gene-array Scanner-rel olvastuk le. Az eredeti DAT adatokat az Affymetrix GeneChip szoftverrel írtuk át CEL kiterjesztésű adatokká. Az egyes chipek expressziós értékeit RMA technikával normalizáltuk. A további analízist a Bioconductor (t-teszt eltérő varianciák esetén) dChip (hierarchikus clusterezés), GeneCluster2 (selforganizing map), Microsoft Access, Excel és a R (hierarchikus clusterezés) szoftvereket használtuk. Az annotációkat a dChip és az ONTO EXPRESS programokkal állítottuk össze (Barash et al. 2004).
21
3.3. Quantitative PCR (TaqMan) A CD4+ T sejtek kiválaszott génjeinek kifejeződését két lépésben real-time quantitative PCR-ral (Applied Biosystems PRISM 7700) határoztuk meg. Ebbe a vizsgálatba 9 ndT1DM-es és 5 ltT2DM-os beteget, illetve 5 H jelentkezőt vontunk be. A cDNS-t a totál RNS-ből készítettük el, random hexamer primereket (Advantage, BD Biosciences, San Jose, CA) használva. A specifikus primereket és minta szekvenciákat a Primer Express (Applied Biosystems) segítségével választottuk ki. A cél gén és a belső kontroll esetében FAM és JOE jelölést alkalmaztunk. GADPH-t használtuk kontroll génként. Az adatokat a kontroll gén kifejeződésére normalizáltuk és a ciklus számoknak megfelelően fejeztük ki. 3.4. Western blot analízis PBMC-t izoláltunk 4 ndT1DM, 4 ltT2DM és 4 H betegtől. A CD4+ T sejteket a fentiek szerint pozitívan izoláltuk, majd proteináz inhibitorral kiegészített RIPA pufferben (Sigma) lizáltuk 4 °C-on. A sejt lizátum fehérje tartalmát BCA protein assay kittel (Pierce) mértük meg. Az SDS–ELFO és a nitrocellulóz membrán (Schleicher & Schluell) proteinkezelés után, a membránra egér monoclonélis anti-humán histonedeacetylase-1 (HDAC1) antitestet (Sigma–Aldrich) vagy nyúl poliklonális anti-humán HDAC1 antitestet (Cell Signaling) vittünk fel a protein detektálás céljából. A kontrollra anti-β-actin antitestet használtunk (Abcam). 3.5. Az adhéziós molekulák flow citometriás analízise Nyolc ndT1DM, 4 ltT2DM és 9 H egyén PBMC mintáját festettük meg FITC-el konjugált anti-humán CD4-el és PE-vel jelölt anti-humán LFA-1-el (lymphocyta function associated antigen 1) és PE-vel jelölt anti-humán P-szelektin monoklonális antitesttel (az összes antitestet a BD Biosciences, San Jose, CA-tól rendeltük). A mintákat EPICS XL flow citometer-rel (Beckman Coulter) mértük le, és az adatokat a FCS Express Version 3 és WinMDI 2.8 programokkal analizáltuk.
22
3.6. A sejt DNS tartalmának mérése A sejt ciklus analízist 10 ndT1DM, 5 ltT2DM és 8 H egyén véréből végeztük el. Két napig szérummentes RPMI médiumban tartottuk a sejteket, hogy a sejtciklus azonos
szakaszába
kerüljenek
(szinkronizáció).
Ezt
követően
3
μg/ml
phytohemagglutinin-P (PHA, Remel Inc., Lenexa, KS)-vel aktiváltuk a PBMC-t 2 napig. A sejteket összegyűjtöttük, megmostuk, és FITC-el konjugált anti-humán CD4 monoklonális antitesttel (10 μg/ml in 0,1% BSA/PBS, BD Biosciences, San Jose, CA) inkubáltuk 30 percig. Ezután újból mosás következett, majd a mintákat fixáltuk és egy éjszakán keresztül 75%-os alkoholban permeabilizáltuk. A következő napon a mintákat megmostuk és a jelölő médiumban 1 órán át, 4°C-on inkubáltuk; a jelölő médium PBSből, 10 μg/ml propidium iodidból és 100 μg/ml RNAse A, (Sigma)-ból állt. A CD4+ sejtek DNS tartalmát EPICS XL flow citometer (Beckman Coulter)-rel mértük meg, az adatokat FCS Express Version 3 és WinMDI 2.8 szoftverekkel analizáltuk.
3.7. Egyetlen sejt szortolás PBMC-ből A PBMC sejtek izolálása, tárolása a 3.2. pontban leírtaknak megfelelően történt. A fagyasztott PBMC-t kiolvadás után kétszer mostuk meg PBS-sel (phosphate buffered saline) és megfestettük 6B11-FITC (1:20 hígítás, BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA, USA) és Vα24-PE (1:50 hígítás, Coulter, Marseille, France) festékekkel. A toxikus azid-tartalom miatt az antitesteket steril PBS-ben dializáltuk (Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, Pierce, Rockford, IL, USA). A dialízist a cég protokolljától eltérően egy lépésben hajtottuk végre, de nagy mennyiségű dialízáló folyadékot (steril PBS-t) használtunk egy éjszakán keresztül. A dialízis sötétben történt, 300μl festéket kb. 1 liter PBS-ben dializáltunk, a festék térfogatának megváltozása elhanyagolható volt. Szűrés (1,5 ml-es baktérium-szűrő, BioWhittaker Cambrex, Walkersville, MD, USA) után sterilen 4 oC-on tároltuk. A jelölő média PBS-ből és 0,5% hőinaktivált humán AB szérumból (Omega) állt. Harminc percig, jégen inkubáltunk 10 millió sejtet a jelzett antitestekkel, 0,5 ml jelölő médiumban. A Vα24- és 6B11-pozitív sejteket szortoltunk ki (FACSVantage cell sorter, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 96-lyukú, félgömb
23
aljú, polisztirén lemezre (Corning, Corning, NY, USA). A lemezeket besugárzott (4000 rad, Boston Children Hospital), allogén feeder sejtekkel (150,000/lyuk) és sejtmédiummal [200 µl/lyuk (RPMI-1640, kiegészítve 1% 1 M HEPES, 1% sodium pyruvate, 1% glutamate, 1% penicillin/streptomycin, mind BioWhittaker Cambrex, Walkersville, MD, USA), 1% MEM (amino acid solution from Gibco, Invitrogen, Grand Island, NY, USA), és 5% hőinaktivált, humán AB szérum (Omega)] és 20 U/ml rekombináns (r)IL-2 (Tecin™ Teceleukin Bulk Ro 23-6019, National Cancer InstituteFrederick, Frederick, MD, USA) és 3 μg/mL PHA-P (Remel Inc., Lenexa, KS, USA)vel készítettem el. Minden második nap 100 μl médiumot cseréltünk ki, 40 U/ml rIL-2-t tartalmazó új médiummal. Nem használtunk semmilyen NKT sejt specifikus stimulációt. A túlélő klónok 9–11 nap tenyésztés után váltak szabad szemmel is látható sejt-pelletté. 3.8. Az NKT klónok második festése A túlélő klónokat a következő 8-10 napban továbbtenyésztettük, és új lyukakba osztottuk. Minden egyes klónból 0,5-2 x 106 sejtet kaptunk. A kultúrák nevelése során a továbbiakban sem használtunk semmilyen NKT sejt specifikus stimulálást, azért, hogy elkerüljük, hogy az esetleges PBMC szennyezésből iNKT sejtek szaporodjanak fel. A médiumot 40 U/ml rIL-2-vel egészítettük ki. A klónokat Vα24-FITC, Vβ11-PE (Coulter), CD4-FITC, CD8-PECy5, 6B11-PE, és CD161-PE (mind BD Biosciences PharMingen-től) festékekkel festettük újra, majd Beckman Coulter XL FACS (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) flow citométerrel vizsgáltuk. A FITC-el jelölt antitesteket 1:20; PE-vel jelölteket 1:50 hígításban használtuk. A FACS eredményeket a WinMDI 2.8.-as programmal analizáltuk. Az egyes klónok tisztáságát a klónokat alkotó sejtek azonos festődése alapján határoztuk meg. 3.9. RNS -kivonás A sejtek kiolvadása után az RNS-t RNAEasy Microkit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)–tel vontuk ki, a használati útmutató szerint (beleértve a DNA-áz emésztést
24
is). A mátrixhoz kötött RNS-t diethylpyrocarbonate-kezelt vízben re-szuszpendáltuk, és 260 nm-en mértük meg. A totál RNS minőségét 1% agaróz gélen ellenőriztük. 3.10. RT-PCR és szekvencia analízis A cDNS-t a totál RNS-ből írtuk át a Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kittel, random hexamereket használva, követve cég protokollját. A cDNS-t -20ºC-on tároltuk. A primereket a TCR alfa lánc újra rekombinálódó V-J-C régiójára terveztük.
A
forward
primer
(Vα24
regió-specificikus):
5-
GATATACAGCAACTCTGGATGCA-3; a reverse primer (C regió-specificikus): 5GGCAGACAGACTTGTCACTGGAT-3. A PCR reakciót a cDNS-sel végeztük el, Platinum
Taq
DNS
polimeráz-t
(Invitrogen)
használtunk.
A
primer
végső
koncentrációja 10μM volt, ezt használtuk, a DNS amplifikációhoz. Az annealing hőmérséklet 52ºC volt. A cDNS minőségét GAPDH-val (housekeeping gén), határoztuk meg. Az amplifikálódott DNS-t 2% agaróz gélen tettük láthatóvá, a gél tartalmazott 1 μg/ml ethidium bromid-ot. 230 bázispár hosszú DNS mintákat nyertünk a PCR termékből a QIAquick™ PCR purification kit (Qiagen GmbH) segítségével, és a szekvenálás előtt a DNS termék minőségét 2% agaróz gél analízissel erősítettük meg. A mintákat, valamint a forward és a reverse primerekkel ABI3100 sequencer-rel analizáltuk mindkét irányból. 3.11. A citokin termékek mérése ELISA-val Félgömb aljú polisztirén lemezek (Corning) aljához anti-CD3 (α-CD3; Exalpha Biologicals Inc., Watertown, MA, USA) antitesteket kötöttünk ki. Az anti-CD3-at 1 ng/ml töménységben készítettük el, lyukanként 50 μl PBS-ben inkubáltunk 37°C-on 2 óráig, ez idő alatt az anti-CD3 kikötődött a lemez lyukainak aljához, majd ki nem kötődött antitesteket steril PBS-es mosással (2x100 μl) eltávolítottuk. Az összes, elegendő mennyiségű sejtet eredményező klónnal elvégeztük a stimulációt. Az iNKT sejteket (50.000/lyuk) α-CD3-al és a nélkül inkubáltuk 2-2 lyukban összesen 24 óráig. Négy és 24 óra után a felülúszót eltávolítottuk, és a citokineket ELISA-val megmértük. Az antitestek és a standard IL-4 és IFN-γ citokineket a BD Biosciences PharMingen-től
25
vásároltuk, és a használati útmutató szerint alkalmaztuk. Az avidin-peroxidase konjugátumot és a 3,4,5-trimethoxybenzoic acid szubsztrátumot (mind a BD Biosciences PharMingen-től megrendelve) használtunk a méréshez.
3.12. Regulátoros markerek vizsgálata A regulátoros markerek vizsgálatára egészséges egyének iNKT sejtjeit használtuk. Az iNKT sejtek azonosítójaként is felfogható invariáns TCR jelenlétét a fentiek szerint itt is leellenőriztük. A CD25 és FoxP3 regulátoros sejtmarkereket flow citometriával, Western blottal is leellenőriztük, az alábbi antitesteket használtuk: antiCD25-PECy5, anti-CD25-PE, anti-CD4-FITC, anti-CD4-PE, anti-CD8-PE (mind BD Biosciences PharMingen-től), illetve anti-FoxP3-FITC, biotinnal konjugált anti-FoxP3 (mindkettő a eBioscience-től), anti-FoxP3, anti-beta actin (mindkettő az Abcam-tól). A FoxP3 és TGF-b1 gén transzkripcióját semiquantitatív PCR-ral vizsgáltuk a FoxP3 esetében a forward primer: 5’-GGTTCACACGCATGTTTGCCTTCT-3’, a reverse primer: 5’-AGGCAAGACAGTGGAAACCTCACT-3’ volt, quantitív PCR-ra a forward primer 5’-CTCCTCTTCCTTGAACCC-3’, illetve a reverse primer 5’AGCTGGTGCATGAAATGTGGC-3’ volt. A TGF-b1 esetében a semiquantitív PCR során a forward primer 5’-CTATTGCTTCAGCTCCACGGA-3’, illetve a reverse primer a 5’-CCCGGGTTATGCTGGTTGTAC-3’ volt. A PCR termékek tisztaságát, a kontrollokat a szekvenálást a 3.5. pontban leírtak szerint alkalmaztuk. 3.13. In vitro stimulációs kísérletek Egészségesekből származó PBMC-t osztottunk szét 96 lyukú polisztirén lemezekre, lyukanként 150.000 sejtet használtunk, komplettált médiában (c-RPMI) a fentiek szerint készítve. Egy adott kondícióra legalább 3 lyukat használtuk. A sejteket antigén nélkül, tetanusz toxoiddal (Sigma, 0,1 μU/ml koncentrációban), illetve GAD65 proteinnel (Dyamid, 20 μg/ml koncentrációban) inkubáltuk, majd az anti-CD3-al (αCD3; Exalpha Biologicals Inc., Watertown, MA, USA) aktivált iNKT sejt felülúszót adtunk a fenti szuszpenziókhoz 0-5-20-50 μl mennyiségben. A fenti médiával egyenlő
26
mennyiségre egészítettük ki a lyukak tartalmát. 5 nap inkubáció után 150 μl felülúszót eltávolítottunk. Minden egyes lyukba 50 μl összvolumenben 1 µl H3-metil-thymidin-t raktunk. 24 óra inkubáció után a sejteket desztillált vízzel lizáltuk, a visszamaradó sejttörmeléket üvegszállal megerősített itatóspapír (Printed Filtermat, 90x120mm, A Glass fibre filter, Wallac) felszínére gyűjtöttük, majd szcintillációs folyadékba mártva, oszcillométerrel (1450 MicroBeta, Wallac) mértük az aktivitást. Egy másik kísérletben responder PBMC sejteket hasonlóan aktiváltuk üres cRPMI-vel, illetve a fentivel azonos dózisú tetanus toxoiddal és GAD65 proteinnel, azonban a responder sejteket megjelöltük egy intracelluláris, az alkalmazott dózisban nem toxikus, fluorescens festékkel, CFSE-vel (carboxyfluoroscein succinimidyl ester). A festés során a CFSE-t 5 μg/ml koncentrációban 5 percig, 37 oC-n alkalmaztuk, majd a nem kötődött festéket 10 mennyiségű, jéghideg, 10% Humán AB szérumot tartalmazó cRPMI-vel távolítottuk el. Ebben az esetben nem az iNKT sejtek szupernatansát, hanem magukat a sejteket adtuk a fenti szuszpenzióhoz. További két fajta kondíciót használtunk, egyik esetben nem aktivált, másik esetben anti-CD3-mal aktivált iNKT sejteket adtunk. 5 nap inkubálás után a kísérletet FACS (Beckman Coulter XL FACS (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) analízissel értékeltük ki. A responder sejtek aktiválódását, osztódását, a CFSE aktivitásán keresztül mértük, mivel az minden egyes osztódás után a felére esett. Az aktivitás mértéket az osztódott illetve az összese CFSEvel jelölt sejt arányában fejeztük ki. Ebben az esetben is minden egyes kondíciót legalább 2 lyukban, duplikálva vizsgáltunk, melyek FACS analízise is külön történt. 3.14. Statisztikai analízis A statisztikai elemzést a StatView for Windows 5.0.1. (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) programmal végeztük. A csoport összehasonlításra, normál eloszlás esetén egy irányú ANOVA és Scheffe post hoc tesztet, ha az eloszlás nem a Gauss görbe szerinti volt, akkor Kruskal-Wallis tesztet használtuk, majd a Mann-Whitney U tesztet a post hoc Bonferroni korrekcióval. Az eredményeket átlag ± SEM formájában fejeztük ki, a P<0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak.
27
4. EREDMÉNYEK
4.1. Azon gének azonosítása, melyek különbözőképpen expresszálódtak az egyes beteg csoportokban Nagy felbontású oligonucleotide assay-t és quantitative real-time PCR-t analízist használtunk azon gének azonosítására, melyek a ndT1DM a ltT2DM és a H betegek CD4+ T sejtjeiben különbözőképpen expresszálódtak. A microarray adatok analízise során egy három lépcsős összehasonlítást alkalmazunk a ndT1DM, ltT2DM és H kontrollok között, hogy a kizárjuk a glükóz-homeosztázis hatását. 4.1.1 Első lépésként a három betegcsoportból 3 párt alakítottunk ki, és ezeket hasonlítottuk össze. ndT1DM kontra H: A ndT1DM és H csoport közötti különbséget t-teszttel (nem egyenlő varianciájú, p < 0,05) hasonlítottuk össze. Összesen 22.883 különböző szekvenciát vizsgálatunk meg, ezek közül 1122 expresszálódott statisztikailag szignifikáns mértékben, 572 gén expressziója fokozódott, és 550 gén expressziója csökkent. Az ennek megfelelő csoportosítás során ez a génlista egyértelműen különbözött a H és a ndT1DM-os csoportokban (2. ábra). ltT2DM kontra H: A ltT2DM-os és a H egyének közötti különbséget szintén t-teszttel (nem egyenlő varianciájú, p < 0,01) hasonlítottuk össze. Ezen kritériumoknak 1229 gén felelt meg, ezek közül 411 expressziója fokozódott, illetve 818-é csökkent. A korábbiakhoz hasonlóan ezek a gének itt is egyértelműen különböztek a két csoportban (2. ábra). ndT1DM kontra ltT2DM: Végül összehasonlítottuk a ndT1DM és a ltT2DM betegeket is, szintén t-teszttel (nem egyenlő varianciájú, p < 0,01). Itt e kritériumoknak 5709 gén felelt meg, azaz ennyi volt
28
különböző a csoportok között. Ezek közül 2486 gén expressziója nőtt és 3223 gén expressziója csökkent (2. ábra). 4.1.2. Második lépésként összehasonlítottuk az egyes párokat egymással Azért, hogy megtaláljuk azokat a géneket, melyek T1DM specificikusak, analizáltuk a T1DM-H és a T1DM-T2DM összehasonlítás génjeit, és csak azokat választottuk ki, melyek, mindkét listában szerepelnek. Ez a szelekció 741 gént eredményezett. Ezek közül 368 expressziója nőtt, és 373-é csökkent (2. ábra). 4.1.3 A legjellegzetetsebb génexpresszió-változások Harmadik lépésként a T1DM-ra specifikus géneket tovább szelektáltuk a „Significance Analysis of Microarrays” (SAM) szoftverrel, hogy megtaláljuk azokat, melyek
a legjellegzetesebbek. A SAM analízis során, a beviteli adatokat
logaritmizáltuk, 100 permutációt használtunk, a szorzót 2-re, a delta értéket 2,52-re állítottuk, melynél a fals pozitívok esélye csekély. Ezen beállítások után 143 gén került felismerésre, és mind a 143 aktivitása csökkent (2. ábra).
29
2. ábra. A gén chip adatok 3 lépcsős analízise. A folyamatábra mutatja az összehasonlítás lépcsőit. A világos téglalapok jelentik az aktiválódott, a sötétek a deprimált géneket, a számok a gének mennyiségét mutatják.
A génontológia vizsgálatakor a T1DM specifikus rövid génlistán, (143 gén), megfigyeltük, hogy a leginkább értintett gének az immunológiai válaszban (p = 0,00172), a sejt ciklus szabályozásában (p = 0,00102), a sejtfelszíni receptorokhoz kötött szignál transzdukcióban (p = 0,00217), és az elektron transzportban (p = 0,01869) vesznek részt. Hasonlóan a fentiekhez, a T2DM specifikus géneket is megvizsgáltuk. A T2DM-H és a T2DM-T1DM összehasonlításból kiemeltük azokat, melyek mindkét
30
listában szerepelnek, 915 T2DM specifikus gént találtunk. Ezek közül 339 aktivitása nőtt, 576-é csökkent. Mikor a T2DM specifikus géneket futattuk a SAM szoftverrel (beviteli adatok logaritmikus formában, 100 permutáció, a szorzó 2-re, a delta érték 3,461-ra volt beállítva [a fals pozitív detektálás esélye itt is csekély]), az analízis 146 gént eredményezett, ezt neveztük el T2DM specifikus rövid gén listának. A rövid gén listából 145 gén aktivitása nőtt, 1-é csökkent. A T1DM és a T2DM specifikus gének rövid listái között csupán 6,2% volt az átfedés, ráadásul ezeknél a géneknél a változás iránya ellentétes volt. Azért, hogy megerősítsük eredményeinket, az összes gén chip adatot (22.883 gén) újra futtattuk a SAM szoftverrel, (a beviteli adatok logaritmikus formában voltak, 100 permutáció, 2- es szorzót és 1,469-es delta [a fals pozitív detektálás esélye itt is csekély] értéket
állítottunk be, de előtte az adatokon semmilyen szelektálást nem
hajtottunk végre. Az analízis során azt találtuk, hogy a T1DM, a T2DM és H összehasonlításból a 143 leginkább változott gén szintén mind deprimált volt. Ráadásul az így nyert adatok és a T1DM specifikus rövid gén lista közötti átfedés 78% volt. A fentiekhez hasonlóan, ezen adatok között szereplő gének az immunológiai válaszokban (p = 0,0012), a sejtciklus szabályozásában (p = 0,00098), a sejtfelszíni receptorokhoz kötött szignál trandukcióban
(p = 0,00075) és az elektron transzportban (p = 0,02)
vesznek részt. Ezen T1DM specifikus géneknek molekuláris mintájának felfedéséhez, egy önszervező térképet (self-organizing map, SOM) készítettünk. Ezen analízis során kiderült, hogy az immunológiai ontológiai csoportban levő gének nagy része (11 a 19ből) egy ágon helyezkedett el. Ezen gének expressziója ndT1DM-ben 35%-ra csökkent a ltT2DM és a H esetekhez képest.
31
4.2. A CD4+ T-sejtek T1DM-ban érintett génjeinek funkciói 4.2.1. Immunszignál A ndT1DM specifikus rövid listában 17 olyan gén van, melynek szerepe van az immunológiai szignálátvitelben. Ezen gének aktivitása csökkent ndT1DM-ban, összehasonlítva a ltT2DM és a H esetekhez. Az immunszignál számos komponense érintett, nem csak az intracelluláris rész, hanem a TCR alfa és béta láncának expressziója, a CD3 delta, mely a TCR komplex része és számos adhéziós molekula (LFA-1, limfocita funkció-asszociált antigén 1; L-szelektin, P-szelektin). Emellett az interferon indukálta transzmembrán protein 1, 2, 3, a natural killer transzkript 4, a cathepsin C, a CD2 antigén, az interleukin-2 receptor gamma lánc expressziója stb. szintén deprimált. 4.2.2. A sejtciklus szabályozása Számos olyan gén aktivitása is csökkent, melyek szerepet játszanak a sejtciklus szabályozásában, úgymint: sejt osztódás 25B, ubiquitinnal konjugált E2 enzim 1-es variánsa, chaperont tartalmazó TCP1, limfocita specifikus protein tirozin kináz, anafázist indító komplex 5-ös alegysége, interferon indukált transzmembrán protein 1. 4.2.3. A sejtfelszíni receptorhoz kötött szignáltranszdukció Megfigyeltük, hogy a CD2 antigén p50, Enah/Vasp like, CD3D antigén, és az interferon indukált transzmembrán protein 1 expressziója szintén szignifikánsan csökkent a ndT1DM betegek CD4+ T sejtjeiben a ltT2DM és a H betegekéhez képest. 4.2.4. Elektron transzport Szintén számos olyan gén expressziója szignifikánsan csökkent ndT1DM-ban, melyek az elektron transzport folyamatokban vesznek részt. A mitokondriális légzési lánc számos komponense deprimált, mint például az acetil-CoA dehidrogenáz, proteindiszulfid izomeráz protein, ubiquinol-citokróm c reduktáz mag protein 1, és a neutrofil sejtplazma faktor 1.
32
4.2.5. Epigenetikus modifikáció Ezek az adatok alátámasztják, hogy számos olyan gén működése deprimált, melyek nélkülözhetetlenek a CD4+ T sejtek működésében. Ezek után kerestünk egy olyan regulátoros faktort, mely potenciálisan kontrollálja az említett géneket. A HDAC1 egy olyan epigenetikus modifikációra képes enzim, mely számos gén működését szabályozza. A mi ndT1DM mintáinkban ennek aktivitása lecsökkent a H és a ltT2DM mintákhoz képest. Felvetődött a HDA1C központi szerepe, ezért leellenőriztük, hogy a rövid ndT1DM gén listából hány gén transzkripcióját szabályozza a HDA1C, és azt találtuk, hogy 15 génre van hatása (3. ábra).
33
3. ábra. A T1DM specifikus rövid gén lista, a gének, melyeket a HDA1C szabályoz, ki vannak emelve.
34
4.3. A microarray adatok megerősítése quantitativ PCR-ral A SAM analízis és a biológiai fontosság alapján 10 gént választottunk ki a T1DM specifikus rövid listáról, és quantitatív PCR-ral is megmértük a gének expresszióját. Az adatok megbízhatóságának fokozása végett ehhez a vizsgálathoz újabb egyéneket vontunk be, de a korábbiakhoz hasonlóan itt is H és ltT2DM, illetve ndT1DM betegektől nyertünk sejteket (1. táblázat). A quantitatív PCR megerősítette a chip adatokat, mind a 10 gén aktivitása csökkent, átlagosan a felére (1/1, 92 ± 0, 62), 7 gén esetében a csökkenés szignifikáns volt. A HDAC1 mennyisége szintén csökkent (1/1,48-ad részére), az array adatoknak megfelelően (2. táblázat). 2. táblázat A 10 gén expressziója a quantitativ real-time PCR mérés alapján A T1DM rövid gén chip listából kiválasztott 10 gén expressziója, kvantitatív real time PCR-ral mérve. A kiválasztott 10 gén szerepet játszik a sejtciklus szabályozásában, az immunológiai válaszokban, a sejt adhézióban. GAPDH-t használtuk kontroll génként. Az adatokat a kontroll gén expressziójára normalizáltuk. Az adatok a átlag ± SEM formájában vannak kifejezve. *A gének szignifikáns csökkenése, p érték alapján (Student t-teszt).
A csökp érték kenés (PCR) mértéke
A gén neve
Ontológiai csoportja
Expresszió, ltT2DM és H
Expresszió, ndT1DM
Histone deacetylase 1 (HDAC1)
Transzkripció szabályozása
0,095 ± 0,003
0,064 ± 0,03
1,48
0,061
CD3D antigén, delta polypeptide (TiT3 complex)
immunológiai
1,246 ± 0,047
0,612 ± 0,027
2,04
0,003*
Interleukin-2 receptor, gamma
immunológiai
0,960 ± 0,041
0,515 ± 0,023
1,86
0,025*
Szelektin L
Sejt adhézió
1,423 ± 0,066
0,853 ± 0,043
1,67
0,024*
35
A csökp érték kenés (PCR) mértéke
Ontológiai csoportja
Expresszió, ltT2DM és H
Expresszió, ndT1DM
Cathepsin C
immunológiai
0,527 ± 0,022
0,304 ± 0,013
1,73
0,010*
CD2 antigén (p50)
immunológiai
1,204 ± 0,066
0,354 ± 0,013
3,40
0,0000 3*
Szignál transducers és aktivátor immunológiai transcription 6 (STAT6)
0,454 ± 0,013
0,346 ± 0,017
1,31
0,140
Limfocita specifikus protein tyrozin kináz
sejtciklus
0,555 ± 0,019
0,251 ± 0,010
2,21
0,001*
Integrin beta 2 (antigén CD18 (p95)
Sejt adhézió
4,610 ± 0,218
3,430 ± 0,153
1,34
0,209
T-sejt receptor alfa locus
immunológiai
2,700 ± 0,33
1,157 ± 0,050
2,33
0,005*
A gén neve (limfocita adhéziós molekula 1)
4.4. HDAC1 Western blot analízis A HDAC1 protein mennyiségének vizsgálatát szintén ndT1DM, ltT2DM és H egyének CD4+ T sejtjeiből végeztük, HDAC1 specifikus antitesteket használva. A chip és a rtPCR adatoknak megfelelően a HDAC1 protein mennyisége ndT1DM esetén csökkent, a H és a ltT2DM mintákéhoz képest (4. ábra).
36
4. ábra. A HDAC1 protein Western blot analízise (egy reprezentatív ábra). A HDAC1 és a β-akctin protein szinteket mértük meg CD4+ limfociták sejtszuszpenziójából. A minták jelen esetben is ndT1DM, ltT2DM és H egyénekből származnak. A denzitometriás vizsgálat elvégzése után mutatjuk a normalizált HDAC1 protein szintjét. Az értékek négy egyén átlagát ± SEM-et mutatják.
4.5. A CD4+ T sejtek adhéziós molekuláinak, a LFA-1 és a P-szelektinnek az expressziója, illetve a sejtciklus analízise 4.5.1 A LFA-1 és a P-szelektin az expressziója Megvizsgáltuk két kulcsfontosságú adhéziós molekula (LFA-1 és P-szelektin) sejtfelszíni expresszióját és a CD4+ T sejtek sejtciklusát. Az CD4+ T sejtek átlagos
37
fluoreszcencia intenzitását (Mean fluorescence intensity - MFI) hasonlítottuk össze a csoportok között (3. táblázat). Mindkét adhéziós molekula esetén szignifikáns különbség volt látható. A post hoc analízis során azt találtuk, hogy a ndT1DM esetekben a P-szelektin MFI értéke szignifikánsan alacsonyabb, mint a H csoporté (p = 0,026), a ltT2DM és H, illetve a ltT2DM és ndT1DM betegek között nem volt szignifikáns különbség. A T1DM esetek LFA-1 MFI értéke szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a ltT2DM csoport (p = 0,002) vagy a H (p = 0,039) csoporté (5. ábra).
5. ábra A P-szelektin és a LFA-1 expresszójának flow citometriás analízise. Az ábrán reprezentatív példák láthatók. Az analízis során a P-szelektin MFI értékének középértékét, illetve a LFA-1 MFI értékének geometriai középértékét használtuk a statisztikai elemzésre.
38
3. táblázat A CD4+ T sejtek P-szelektin és LFA-1 expressziójának MFI értékei (mean fluorescence intensity, mean ± SEM
ndT1DM (n = 8) P-szelektin MFI (középérték) LFA-1
MFI
(geometriai
középérték)
H (n = 9)
ltT2DM (n = 4)
11,86 ± 2,03*
26,63 ± 7,91
29,73 ± 7,32
213,77 ± 5,23#
313,21 ± 35,04
265,05 ± 11,43
*A T1DM csoportban a P-szelektin MFI értéke szignifikánsan alacsonyabb, mint a H betegek között (p = 0,026). # A T1DM csoportban a LFA-1 MFI értéke szignifikánsan alacsonyabb, mint a T2DM (p = 0,002), vagy mint a H (p = 0,039) csoport.
4.5.2. A CD4+ T sejtek sejtciklus analízise A sejtciklus vizsgálata során megszámoltuk, hogy hány sejt volt az egyes fázisokban. A G1 és a G2-M fázis aránya, ((G1)/(G2-M)) mutatja a nyugvó / mitózisba lépő sejtek arányát. Azt találtuk, hogy több sejt lépett be a mitózisba a H esetekben (arány: 2,06 ± 0,16), mint a ndT1DM sejtek esetében (ráció: 2.64 ± 0.19; one-way ANOVA p = 0,043, post hoc analízis H-ndT1DM p = 0,046). A ltT2DM betegek esetén voltak a sejtek a legaktívabbak (1,91 ± 0,28). A ltT2DM és a ndT1DM közötti különbség szintén szignifikáns (post hoc analysis T2DM-T1DM p = 0,033). A ltT2DM és a H sejtek sejtciklusa között nem volt szignifikáns különbség (6. ábra).
39
6. ábra Sejt ciklus analízis A ndT1DM, ltT2DM és H egyének CD4+ T limfocitáinak vizsgáltuk a sejtciklusát, propidium jodid (PI) festéssel. Az ábrán egy-egy reprezentatív példát mutatunk. Szinkronizált PBMC-t stimuláltunk PHA-vel, majd PI-al festettük meg a sejtek DNS tartalmát. A sejtciklusokat flow citometriával analizáltuk, majd a G1 és a G2-M fázisban lévő sejtek arányát ((G1)/(G2-M)) számoltuk ki, és alkalmaztuk a statisztikai vizsgálatokban.
4.6. Egyetlen sejt szortolás PBMC-ből A 6B11-FITC és Vα24-PE festés után, a mindkét jelölésre pozitív sejteket egyenként szortoltuk ki a 96-lyukú lemezekre. Mivel az iNKT sejtek száma nagyon alacsony, emiatt legalább 10 millió sejtet, (PBMC-t) használtunk a frekvencia analízisre és a szortolásra. A módszerünk reprodukálhatóságnak leellenőrzése végett, néhány mintát kétszer festettünk meg és két különböző FACS gépen analizáltuk. A két gépen nyert iNKT sejt frekvenciák között a korreláció r= 0,97 volt (7. ábra). Átlagosan 20 napos inkubálás után, minden egyes túlélő klón tartalmazott 0,5–2 millió sejtet. A teljes túlélés 5-25% volt.
40
Vα24-PE
A
6B11-FITC 0,001
0,01
0,1
1 1
B
BD FACS Vantage
Y=-0.004+1.286X r: 0.971
0,1
0,01
0,001
Beckmann Coulter XL
7. ábra Az
iNKT
sejtek
FACS
analízise
perifériás
vérből
és
a
módszer
reprodukálhatósága. A Vα24 és 6B11antitestek jelölik az iNKT sejteket. Az A ábrán egy reprezentatív példát láthatunk a Vα24/6B11 pozitív sejtek festődésére, ebben a mintában az iNKT sejtek frekvenciája 0,18 (R régió/lymphocyták*100). Az iNKT sejteket az R régióból szortoltuk ki egyetlen sejt szortolás (single cell sorting) technikájával. A B ábrán a Vα24/6B11 pozitív sejtek frekvenciáját mértük két különböző készülékkel, más-más időpontban. A korrelációs koefficiens r=0,971 volt. 4.7. Az iNKT klónok azonosítása
41
A klónok sejtjeinek invariáns TCR-ának meglétét bizonyítottuk egy második festéssel, RT-PCR-ral és szekvencia analízissel. Minden klónt megfestettünk Vα24FITC-el, mely az invariáns TCR alfa lánca, a klónjaink 80% (285/354) volt Vα24 pozitív. Ezek közül az összes random kiválasztott Vα24-pozitív klón szintén pozitív volt 6B11-re (67/67), azaz minden egyes klón TCR-ja tartalmazta azt az alfa lánc régiót mely a lánc invariabilitását jelzi (8./A ábra). A Vα24-negatív klónokat kizártuk a további vizsgálatból, vagy negatív kontrollként használtuk őket. RNS-t izoláltunk 52 Vα24-pozitív és 5 Vα24-negatív klónból. A nyert cDNS minőségét minden esetben megerősítettük GAPDH-val. A Vα24 specifikus forward primert és C régió specificikus reverse primert használva 230 bázispár hosszú DNS mintát nyertünk minden Vα24 klónból (52/52), de nem volt értékelhető PCR termék egyik Vα24 negatív klónból sem. A DNS minta szekvenciája minden egyes esetben (52/52)
megegyezett,
a
már
említett,
invariáns
TCR
szekvenciával:
TGTGTGGTGAGCGACAGAGGCTCAACC, Cys-Val-Val-Ser-Asp-Arg-Gly-Ser-Thr.
42
B
C
Vα 24
Vβ11
A
6B11
Vα24
E
F
CD161
D
CD4 8. ábra Az iNKT klónok karakterizálása A 8. ábra A-F részein reprezentatív példákat láthatunk különböző klónok festődéséről, melyeket a Vα24/6B11 kettős festéssel izoláltunk. Minden Vα24 pozitív iNKT klón szintén pozitív volt 6B11-re (mely antitest a genetikailag kódolt, invariáns TCR szakasz, a CDR3 régió ellen termelt, 8/A). A Vα24 alfa lánc leggyakrabban a Vβ11 béta lánccal párosodott (8/B). Néhány klón Vβ11 negatív volt (8/C). A klónokat a CD4 és CD161 megjelenése szerint is klasszifikáltuk, találtunk kettős pozitív (8/D) és az egyes antitestekre csak egyszeresen pozitív klónokat (8/E-F) is.
43
4.8. Az iNKT sejtek frekvenciája A klónozást felhasználtuk arra, hogy bebizonyítsuk, hogy a Vα24 és 6B11 jelölés technikája reprodukálható és magas pozitív prediktív értékkel identifikálja az iNKT sejteket. Ezt, a Vα24 és 6B11 jelölés módszerét használtuk arra, hogy megmérjük az iNKT sejtek frekvenciáját a PBMC-ben. Az eredmények széles skálán mozogtak a Vα24 és 6B11-pozitív sejtek aránya 0,002 – 0,4%-ban volt a limfociták között, azonban nem találtunk különbséget az egyes beteg csoportok között (9. ábra).
9. ábra A Vα24/6B11 sejtek frekvenciája a különböző betegcsoportokban. A Vα24/6B11 sejtek frekvenciája (Vα24/6B11 sejtek/limfocyták*100) széles skálán mozgott, ahogy azt a logaritmikus skálán láthatjuk (Y-tengely) 9. ábra. A középérték 0,054 és 0,064 % között volt, nem találtunk különbséget az egyes csoportok között.
44
4.9. Az iNKT sejt klónok karakterizálása Az összes Vα24 pozitív klónt karakterizáltuk a Vβ11, CD4, CD8 és a CD161 expressziója alapján (8. ábra). Ahogy vártuk, az iNKT sejtek többségén jelen volt a legáltalánosabb béta lánc a Vβ11-lánc, és nem volt különbség a betegcsoportok között. A CD161 expressziója nagyon különböző volt, de nem találtunk szignifikáns különbséget a vizsgált csoportok között. A CD4 expressziója hasonló volt a H, ltT2DM és ndT1DM betegek között, de szignifikánsan alacsonyabb volt (one-way ANOVA, P=0,0032; Scheffe post hoc test, H–ltT1DM, P=0,0181; ndT1DM– ltT1DM, P=0,0376; ltT1DM–ltT2DM, P=0,0082) a ltT1DM betegeknél. Az egyes felszíni marker pozitív klónok arányainak kiszámolása viszonylag kis számú klónokból történt, ami matematikai hibalehetőséget is rejthet, ezért az eredményeinket direkt PBMC festéssel is megerősítettük. Betegcsoportonként három olyan mintát használtunk, melyeknél az iNKT sejtek aránya magas volt, mivel technikailag bonyolult olyan mintából kiszámolni az iNKT sejtek alcsoportjainak arányát, ahol maguknak az iNKT sejteknek is alacsony a száma. Megjelöltük a sejteket ugyanazokkal a festékekkel, amit a szortolásra használtunk (Vα24, 6B11) majd CD4-PECy5-t használtunk, ezután a szortolási kaput a Vα24/6B11 sejtekre állítottuk, és megmértük a CD4 pozitív sejtek arányát. Az eredmény hasonló volt (one-way ANOVA, P=0,0007; Scheffe post hoc test,
H–ltT1DM,
P=0,0017;
ndT1DM–ltT1DM,
P=0,0023;
ltT2DM–ltT1DM,
P=0,0091). A CD8+ iNKT klónok aránya mindegyik betegcsoportban alacsony volt: 60-ból 4 klón volt H iNKT klónok között, 102-ből 3 a ndT1DM iNKT klónok között, 69-ből 8 a ltT1DM iNKT klónok között és 54-ből 2 a ltT2DM iNKT sejt klónok között (4. táblázat és 9. ábra).
45
4. táblázat Az iNKT klónok karakterizálása Az egyes sorok az egy egyéntől származó sejteket jelölik. A ferde számok mutatják, hogy egy betegtől hány klónt nyertünk. A továbbiakban az egyes markerekre pozitív klónok arányát mutatjuk százalékban. Minden csoportban a Vβ11 lánc volt a leggyakoribb béta lánc (71-88%). A CD161 megjelenése nagyban variáns volt, azonban nem volt különbség a csoportok között. A CD4+ arány gyakori volt H (87%), ltT2DM (91%), és a ndT1DM (76%) betegek között, de alacsony a ltT1DM betegeknél (45%). A CD4 adatok elemzése a 4/A ábrán látható.
H n 6 19 10 6 11 8 60
ndT1DM
Vβ11 CD161 CD4 n Vβ11 CD161 67 100 100 12 92 33 79 0 100 5 60 40 100 0 80 4 50 50 83 0 83 5 20 20 100 0 82 3 100 0 100 0 75 21 100 76 3 100 0 14 100 43 9 100 33 13 100 15 7 86 100 6 100 0 AV: 88% 17% 87% 102 84% 35%
ltT1DM CD4 67 20 75 80 100 67 100 64 78 92 71 100 76%
46
ltT2DM
n Vβ11 CD161 CD4 n Vβ11 CD161 CD4 9 78 0 33 11 100 18 82 10 100 10 60 10 70 0 100 10 100 10 40 5 0 0 100 10 100 10 10 3 100 0 100 21 86 5 90 3 67 0 100 9 56 11 33 7 71 0 71 69 15 87 0 87 54
87%
8%
45%
71%
3% 91%
10. ábra A CD4 + iNKT sejtek aránya A CD4+ sejtek aránya szignifikánsan csökkent a ltT1DM-es betegeknél. (Mean+SEM, *P<0,05; #P<0,01) 10/A: A CD4+ arány az iNKT klónok festődése alapján. 10/B: Az iNKT sejtek CD4+ arányát direkt festéssel, PBMC-ből meghatároztuk. A Vα24/6B11 kettős festés mellett CD4 antitestekkel is jelöltünk, majd a Vα24/6B11 kettős pozitív sejtekre helyeztük a kaput, így mérve a CD4+ sejtek arányát.
47
10/C: Reprezentatív ábrák a CD4+ /(Vα24+/6B11+) arányának méréséről PBMC-ből. Az x tengely mutatja a CD4-PECy5 jelölés intenzitását logaritmikus skálán. Az y tengely mutatja az események számát. A ltT1DM-es esetekben az események többsége negatív volt CD4-PECy5-ra. Az M marker beállítása az összes limfocita CD4 festésén alapult. 4.10. A klónok citokin produkciója Az iNKT sejteket (50.000/lyuk) lemezhez kötött anti-CD3-al stimuláltuk. A TCR stimulációt követően az IL-4 és az IFN-γ termelést mértük ELISA technikával a felülúszóból. A citokin termelés és a stimulációs index (H3-methylthymidine beépülésével mérve) között nem volt korreláció. A citokin adatok között azonnal szembeötlő volt az, hogy a H és a ltT2DM csoportban a kevesebb IFN-γ-t termeltek az iNKT sejtek. Vagyis csak a T1DM csoport (a ndT1DM és a ltT1DM csoport) termelt több IFN-γ-t, mint a H iNKT klónok IFN-γ termelődésének átlaga és a SD háromszorosa (átlag+3SD), mely arra utal, hogy a T1DM klónok potensebb IFN-γ termelők. Kevés adatunk van a nagyon ritkán előforduló CD8+ iNKT sejtek statisztikai analíziséhez, ezért csak CD4+ és a DN klónokat elemeztük. Nem volt szignifikáns különbség az IL-4 termelésben az egyes betegcsoportok között. A ndT1DM csoport iNKT sejtjei több IFN-γ-t termeltek, mint a H és ltT2DM-es iNKT sejtek. (H–ndT1DM, P=0,0054; ndT1DM–ltT2DM, P=0,0006). A ndT1DM iNKT klónok között a CD4+ sejtek több IFN-γ-t termeltek, mint a ltT1DM és a ltT2DM csoport (P=0,0024 illetve P=0,0126), ehhez hasonlóan a ndT1DM-es CD4–CD8– (DN) klónok szintén többet, mint a H csoport (P=0,036). A ltT1DM-es csoportban a CD4+ klónok szignifikánsan kevesebb IFN-γ-t termeltek, mint a DN iNKT sejtek (P=0,0399). Habár a CD8+ iNKT klónok száma alacsony a statisztikai elemzéshez, azonban az ábrából az egyértelműen látható, hogy ezek sejtek mindkét vizsgált citokint csak kis mennyiségben termelték (11. ábra).
48
11. ábra Az aktivált iNKT klónok citokin termelése Az ábrán stimulált iNKT klónok (50.000 sejt/lyuk) IL-4 (x tengely) és IFN-γ (y tengely) termelése látható. Az ábrán a klónokat CD4 és CD8 felszíni markerek alapján külön ábrázoltuk: CD4+:■, CD4-CD8- (DN):▲, CD8+: ●. A szaggatott vonal az egészséges iNKT klónok IFN-γ termelésének átlagát és a háromszoros standard deviációt mutatja. (átlag+3SD). Csak a ndT1DM-es és a ltT1DM-es csoport klónjai termeltek ennél nagyobb mennyiségű IFN-γ-t.
49
12. ábra. A betegcsoportok iNKT klónjainak IFN-γ termelése. A 12/A ábrán az összes klón (CD4+, CD8+ és DN) adatai láthatók, a ndT1DM csoport termelt több IFN-γ, a H és a ltT2DM csoporthoz hasonlítva. (mean+SEM, #: P<0,01, **: P<0,001). A 12/B ábrán izoláltan látható a CD4+ és a CD4-CD8- (DN) klónok IFN-γ termelése. A ndT1DM csoportban CD4+ klónok több IFN-γ-t termeltek, mint a ltT1DM és a ltT2DM csoport CD4+ klónjai. A ndT1DM csoport DN klónjai szintén több IFN-γ-t termeltek a H csoport DN klónjaihoz képest. A ltT1DM–es csoportban szignifikáns különbség volt a CD4+ és a DN klónok között. (átlag+SEM, *: P<0,05; #: P<0,01)
50
4.11. Az iNKT sejtek regulátoros markerei 4.11.1. A CD25 sejtfelszíni jelenléte Egészségesekből származó iNKT klónokat jelöltünk CD25-tel, az összes vizsgált CD4+ (29/29) és az összes CD4-CD8- (5/5) iNKT klón nagy mértékben expresszálta a CD25-t, de a CD8+ klónok közül 4/6 volt teljesen negatív a CD25-re, 2/6 pedig alacsony szinten expresszálta a CD25-t. Mivel a CD25 aktiválódási marker is lehet, mely akkor is jelen lehet, ha a sejteket aktiváltuk. Ezért pihentettük – inkubáltuk mindenfajta aktiválás nélkül - az iNKT klónokat 5 napig a festés előtt, de mivel klónokról van szó, melyeket előzetesen aktiváló ágensekkel (IL-2, PHA) sejtosztódásra kellett bírni, hiszen egyetlen sejtből akár 2 millió sejtet is neveltünk. Az ebből eredő hibalehetőséget úgy küszöböltük ki, hogy korábban nem manipulált PBMC-t festettünk meg az iNKT sejteket azonosító anti-Vα24 és anti-6B11, illetve anti-CD25-tel. A nem aktivált iNKT sejtek is 70-90%-ban magas intenzitással jelölődtek anti-CD25-tel (13 ábra).
51
13. ábra Az iNKT sejtek CD25 festődése 13/A: Reprezentatív példák az egyes iNKT alcsoportok CD25 festődéséről. A CD4+ és DN alcsoportok magasan, a CD8+-ak nem, vagy csak alig festődtek. 13/B: A korábban nem aktivált PBMC iNKT sejt festését anti-CD25-el egészítettük ki, az iNKT sejtekre kapuzva azok nagy része CD25 magasan pozitív volt. 4.11.2. A FoxP3 regulátoros marker intenzitása A regulátoros markerek közül jelenleg a FoxP3-at tartják legfontosabbnak. Ez egy intracelluláris protein, melynek jelenlétét intracelluláris festéssel, Western blottal és PCR szekvencia analízissel is kimutattuk. A CD25 eredményekhez hasonlóan CD4+ és a DN iNKT klónok tartalmaztak nagyobb mennyiségben FoxP3 molekulát. A Western blot és a PCR-t a CD8+ sejtek nehezebb hozzáférhetősége miatt csak a CD4+ és a DN klónokkal végeztük el. Ezek közül mindegyik sejtben, mindkét vizsgálattal, a Western blot esetében pedig több antitestet is kipróbálva egyértelműen bizonyította a FoxP3 molekula jelenlétét. Természetesen itt is felmerülhet, hogy a klónok aktiválódása okozta
52
a FoxP3 megjelenését, ezért néhány mintából sikerült több ezer iNKT sejtet kiszortolni. Minden minta esetében megtalálható volt a FoxP3 molekula (14. ábra).
14. ábra A FoxP3 jelenléte semiquantitatív PCR-ral a kiszortolt, korábban nem aktivált iNKT sejtekből. Az 1-es és a 2-es minta két beteget jelöl, az első 3 oszlopban béta-2-microglobulint használtunk, mint pozitív kontroll. A második oszlopban az invariáns TCR, a harmadikban a FoxP3 látható. A FoxP3 jelen volt az aktivált klónokban, az aktiválatlan, korábban nem manipulált PBMC-ben, ezért kíváncsiak voltunk, az aktiválódás kinetikájára. A fent leírt módon lemezhez kötöttünk anti-CD3 antitesteket, majd erre iNKT klónokat helyeztünk. A sejtek inkubálását azonnal, 1, 4, 18, 24 és 48 óra múlva fejeztük be. A FoxP3 aktiválódását mRNS szinten quantitatív PCR-ral és Western blottal is megmértük. A FoxP3 transzkripciója 1 és 4 óra között kezdődött a maximumot 24 óránál érte el. A transzláció ehhez képest nem mutatott lényeges különbséget. Ugyanezt a kísérletet elvégeztük PMA-ionomycin aktivációval is. A PMA-ionomycin közvetlenül aktiválja a limfocitákat, itt a csúcs már egy óra múlva jelentkezett (15. ábra).
53
15. ábra A FoxP3 kinetikája a TCR aktivációja után 15/A A TATA binding protein mRNS-ére normalizált FoxP3 mRNS mennyisége quantitatív PCR-ral, anti-CD3-mal történt aktiválás után 0, 1, 4, 18, 24 illetve 48 órával. 15/B A fenti mRNS adatoknak megfelelő Western blot, itt a kontroll a β-actin volt. 4.11.3. A regulátoros citokinek Regulátoros citokinek között elsőként említik a TGF-β és az IL-10-et. Mindkét citokin kis mennyiségben képes regulátoros hatást kifejteni. Mindkét citokint sikerült kimutatnunk az anti-CD3-al aktivált iNKT sejtek felülúszójából, ELISA technikával; a TGF-β1-et pedig PCR-val is (az adatokat nem mutatjuk). 4.11.4. Az iNKT sejtek regulátoros tulajdonságainak vizsgálata in vitro kísérletekkel. Aktiválatlan, tetanusz toxoiddal és GAD65 proteinnel aktivált PBMC sejtekhez adtunk biztosan sejtmentes anti-CD3-al aktivált iNKT sejtek felülúszóját, illetve magukat az aktivált, illetve aktiválatlan sejteket. Az első kísérletből csupán a felülúszó
54
hatását tudtuk lemérni, a másodikból a sejt-sejt kontaktus és a felülúszó hatását együtt, hiszen a jelenlévő sejtek citokin termelését a kevert sejtkultúrában sem zárhattuk ki. Meglepetésünkre mindkét esetben az iNKT sejtek aktiváltak a PBMC a sejtek szaporodását, mely aktiváló hatás független volt a tetanus toxoid, illetve a GAD25 jelenlététől (16. ábra).
A
B
16. ábra Az iNKT sejtek regulátoros hatása, in vitro vizsgálva. 16/A: Egészségesekből származó PBMC-t aktiváltunk tetanusz toxoiddal TT és GAD65 proteinnel. A sejtkultúrákhoz 0-5-20-50 μl mennyiségben adtunk egyik anti-CD3-al aktivált iNKT sejt klón szupernatansából. A sejtek aktiválódását, H3-metil-thymidin beépülésének meghatározásával mértük le. Az eredményeket cpm+SEM-ben (count per
55
minutes) fejeztük ki, a számok a szignifikanciát jelzik, összehasonlítva azzal, mikor nem adtunk hozzá felülúszót. 16/B: A fentihez hasonló kísérlet, de itt a responder sejteket (PBMC) előzőleg CFSEvel jelöltük, majd tetanusz toxoiddal és GAD65 proteinnel aktiváltuk őket. Ezt követően ugyanettől a betegtől származó egyik iNKT klón (jelen esetben G3-al jelölt) felülúszóját (SG3) és sejtjeit (G3) adtuk hozzá. Itt alkalmaztunk aktiválatlan (csillag nélkül) és antiCD3-al aktivált (csillaggal - * jelölt) sejteket és azok felülúszóját.
56
5. MEGBESZÉLÉS 5.1. A CD4+ sejtek szerepe T1DM-ban A T1DM egy autoimmun betegség, valószínűleg, mind a CD4+, és mind a CD8+ T limfociták részt vesznek a hasnyálmirigy Langerhans-szigetek béta sejtjeinek immunológiai destrukciójában (Kukreja & Maclaren 1999). A CD4+ T sejtek azonban valószínűleg centrális szerepet játszanak az immunológiai folyamatok irányításában. A totál T sejtek, vagy a CD4+ T-sejt szuszpenziók képesek voltak a diabetes átvitelére a NOD.NON-Thy-1a egérből a NOD-scid/scid egérbe, azonban a CD8+ T sejt szuszpenziók önmagukban erre képtelenek voltak (Christianson, Shultz, & Leiter 1993). Kimutatták, hogy a T1DM CD4+ T sejtek aktiválhatósága, proliferációval mérve, csökkent. Ezekben a vizsgálatokban nem diabetes specifikus antigéneket használtak a proliferációra, ami arra utalhat, hogy elsősorban a naiv T sejtek az érintettek (Eibl, Spatz, Fischer, Mayr, Samstag, Wolf, Schernthaner, & Eibl 2002). Feltételeztük, hogy a T1DM autoimmunitás magyarázható az abnormális, vagy defektív CD4+ T sejt funkcióval. Tanulmányoztuk a perifériás vérből származó CD4+ T sejtek gén expresszióját, hogy megvizsgálhassuk a sejtek funkcióit. A microarray-vel történő génexpressziós vizsgálatok széles körben alkalmazható olyan technológia, melyet sikeresen használtak már tumorok (Ballestar et al. 2003), fertőző- (An et al. 2003;Ren et al. 2003), és egyéb autoimmun betegségek klasszifikációjára (Carroll et al. 2002;Firneisz et al. 2003). Oly módon elemeztük ezen CD4+ T sejtektől származó microarray adatokat, hogy ndT1DM-H és a ltT1DM-ndT2DM összehasonlításból csak azokat emeltük ki, melyek mindkét listában szerepeltek. Hasonlóan jártunk el a ltT2DM specifikus génlista esetén is, itt a ltT2DM-H és a ndT1DM-ltT2DM összehasonlításból azokat a géneket tekintettük T2DM specifikusnak melyek mindkét összehasonlításban szerepelnek. A következő lépésben csökkentettük a vizsgálni kívánt gének számát azzal, hogy a legjellegzetesebbeket SAM analízis segítségével kiválasztottuk. Ennek a többlépcsős megközelítésnek a használatával ki tudtuk zárni az emelkedett szérum glükóz hatását mind a T1DM és mind a T2DM rövid, specifikus génlista esetén. Az, hogy a T1DM és a T2DM specifikus rövid gén lista között csak 6,2% az átfedés, mutatja, hogy a két
57
betegség pathogenezise alapvetően különbözik, illetve támogatja szelekciós technikánk helyességét. Az immunológiai jelátviteli mechanizmusok egyes komponensei, úgy, mint az adhéziós molekulák, citokinek, chemokinek, azok receptorai és immun transzkripciós faktorok alapvető szerepet játszanak a T1DM pathogenezisében (Alegre et al. 1998;Bach & Chatenoud 2001;Coyle & Gutierrez-Ramos 2001). Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a CD4+ T sejtek működése a T1DM betegekben összességében sérült. A leginkább érintett géneknek az immunológiai válaszban, a sejt ciklus szabályozásában és a sejtfelszíni receptorokhoz kötött szignál transzdukcióban van szerepük. Az immunológiai válaszban részt vevő gének közül nem csak azok aktivitása csökkent, melyek az intracelluláris jelátvitelben (pl.: src családdal kapcsolatos foszfoprotein 1, Rho GDP disszociáció gátló beta-) vesznek részt, hanem azok is, melyek a sejtfelszínen (pl.: T-sejt receptor alfa- és béta lánc, sőt a CD3D) expresszálódnak, mint a T sejt receptor. A gamma lánc csökkent kifejeződése a ndT1DM CD4+ T sejteken különösen érdekes. A gamma lánc nélkül az IL-2 receptor nem képes működni, annak ez elhagyhatatlan része. Az IL-2 receptor gamma-lánc hiányos sejtek nem képes szignálokat továbbítani. Ez a gamma lánc nem csupán az IL-2 receptor alkotója, de szintén szerepet játszik az IL-4 és az IL-7 receptor felépítésében (Kondo et al. 1997;Sugamura et al. 1996). Az IL-7 szükséges a limfociták kifejlődéséhez, az IL-2 és IL-4 pedig nélkülözhetetlen a limfociták proliferációjához. A thymociták fejlődése során a T sejt receptor (TCR) intracelluláris szignálja alapján a T sejtek fejlődése kétfelé válhat: pozitív szelekció (ennek eredményeképpen megmenekül az apoptózistól, és tovább érik, vagy differenciálódik), illetve a negatív szelekció (mely apoptózist indukál). Nakajima és kollégái írták le, hogy a túléléshez szükséges szignál alapvetően függ, a citokin receptor közös gamma láncától, ami kiemeli a citokinek szerepét ebben a folyamatban (Nakajima, Noguchi, & Leonard 2000;Noguchi et al. 1997). A közös citokin receptor gamma lánc tehát esszenciális szerepet tölt be a lymphoid homeosztázisban (Nakajima et al. 1997). A sejtciklust reguláló gének a leginkább megváltozott expressziójú gének között vannak. A CD4+ T sejtek sejtciklus analízise azt mutatta, hogy a ndT1DM CD4+ sejtek
58
lassabban, ritkábban lépnek be a mitózis fázisába, mint H, vagy a ltT2DM CD4+ sejtek. Ez a sejtek általános „funkcióromlására” utal. Szintén szignifikáns aktivitáscsökkenés volt látható az adhéziós molekulák expressziójában (pl.:, natural killer sejt transcript 4, prolin-szerin-threonin foszfatáz hatású protein 1, LFA-1, calsyntenin 1, P-szelektin ligand). Ezeket az adatokat támogatja a sejtfelszíni markerek (LFA-1, P-szelektin) flow citometriás analízise. A sejt-sejt interakciónak alapvető szerepe van a kezdeti T sejt aktivációban, ami jelentős hatással lehet az effektor funkcióra.
Az LFA-1 és az ICAM-1 közötti interakció
minőségi és mennyiségi változásokat eredményez a T sejt effektor funkciójában, ami potenciálisan autodestruktív választ eredményezhet (Camacho et al. 2001). Kísérletesen létrehozott 1-es típusú diabetesben az adhéziós molekulák expressziója alacsonyabb volt, mint a H kontrolloké (Ludwig et al. 1999). Ezen eredmények összhangban állnak Spatz és munkatársai eredményeivel, akik szerint T1DM-ban az antigén prezentáló sejtek alacsonyabb szinten fejezik ki az ICAM –ot (Spatz, Eibl, Hink, Wolf, Fischer, Mayr, Schernthaner, & Eibl 2003). Az ICAM-1 és a LFA-1 közötti interakció szükséges, az antigén prezentáló sejt és a naiv T sejt első találkozásához. A naiv T sejteknek a memória sejtektől eltérően sokkal nagyobb az aktiválódáshoz szükséges küszöbértékük. Ezek alapján nagyobb mennyiségű ICAM-1-re van szükségük, a velük kapcsolatba kerülő antigén prezentáló sejtek felszínén. Ez a deprimált antigén prezentáló sejt – T sejt interakció szintén megmagyarázhatja a károsodott T sejt funkciót T1DM-ban. Az, hogy nem találtunk nagyobb mennyiségű IFN-gamma, illetve kisebb mennyiségű IL-4 expressziót, nem mond ellen a korábbi Th1/Th2 elméletnek T1DMban, melyet antigén specifikus T sejtekben (Kallan et al. 1997) és a természetes ölő T sejtekben már leírtak (Wilson, Kent, Patton, Orban, Jackson, Exley, Porcelli, Schatz, Atkinson, Balk, Strominger, & Hafler 1998). A Th1 dominanciát az antigén specifikus, perifériáról származó limfocitákon, T1DM-os betegek első fokú rokonain már leírták de T1DM-os betegeken még nem (Karlsson, Lawesson, & Ludvigsson 2000;Wilson, Kent, Patton, Orban, Jackson, Exley, Porcelli, Schatz, Atkinson, Balk, Strominger, & Hafler 1998). Ezzel ellentétben, vannak adatok arra vonatkozóan, hogy PHA által stimulált limfociták interferon gamma produkciója lecsökkent az egészséges kontrollokéhoz
59
képest (Ciampolillo et al. 1993). Egy jelen tanulmányban nem találtak megnövekedett citokin szekréciót, mikor T1DM-os betegek PBMC-jét a proinzulin overlapping peptidjeivel aktiváltak (Durinovic-Bello, Boehm, & Ziegler 2002). A jelen vizsgálatban mi nem tanulmányoztuk az antigén specifikus T sejteket, hanem a teljes nem stimulált CD4+ T sejt populációt analizáltuk. Az antigén specifikus T sejtek aránya a perifériás vérben nagyon alacsony, feltételezett számok szerint kevesebb, mint 1 a 20.000 T sejt között, ezért nem meglepő, hogy nem sikerült megerősíteni a Th1/Th2 elméletet. Eredményeink feltételezik, hogy van egy, vagy néhány kulcs regulátoros elem. Az egyik regulátoros elem lehetséges, hogy a HDAC (Bernstein et al. 2005;Huebert & Bernstein 2005). Genetikai (mRNS) és fehérje szinten is (Western blot) sikerült kimutatni, hogy a HDAC-1 aktivitása csökkent. A hiszton módosítása hozzájárul a kromatin módosításához, ami alapja a szövet-specifikus epigenetikus modifikációs mintázatnak (Roh, Cuddapah, & Zhao 2005;Wang et al. 2005). Hasonlóan a mi eredményeinkhez, Moreira és munkatársai (Moreira, Scheipers, & Sorensen 2003) kimutatták, hogy Trichostatin-A (HDAC inhibitor) kezelt CD4+ T sejtek csökkent aktivitású génjei között megtalálhatóak a mitokondriális légzési lánc enzimjei, a TCR és egyes sejtfelszíni markerek. Bár a globális hiszton hiperacetiláció nem vezet szükségszerűen a transzkripció csökkenéséhez, mutatva azt, hogy a kromatin modifikáció egy gén-specifikus esemény, változó transzkripciós eredménnyel. A CD4+ T sejtek csökkent HDAC expressziója ndT1DM-ban hatással van az epigenetikus modifikációra, mely elképzelhető, hogy fontos szerepet játszik ezen sejtek hibás működésében.
5.2. Az iNKT sejtek szerepe T1DM-ban Az iNKT sejteknek valószínűleg fontos szerepük van az immunfolyamatok kontrollálásában, elsősorban az autoimmunitás területén és a tumor surveillance-ben (Kukreja et al. 2002). A humán iNKT sejtek tanulmányozását nagyban nehezíti az a tény, perifériás vérben nagyon kis mennyiségben fordulnak elő. Az egyéb szövetekből nyert iNKT sejtekről csak kevés adat áll rendelkezésre. Hovatovább, egymásnak
60
ellentmondó adatok láttak napvilágot az iNKT sejtek szerepéről T1DM-ban. Egyes tanulmányok szerint az iNKT sejteknek védő szerepe lenne T1DM-ban (Wilson, Kent, Patton, Orban, Jackson, Exley, Porcelli, Schatz, Atkinson, Balk, Strominger, & Hafler 1998), mások eredményei szerint azonban nincs összefüggés a betegség kialakulása és az iNKT sejtek száma, funkciója között (Lee, Putnam, Benlagha, Teyton, Gottlieb, & Bendelac 2002b). 5.2.1. Az iNKT sejtek identifikálásának technikai problémái és azok áthidalása Az iNKT sejtek identifikálására különböző technikákat használtak, melynek szerepe lehet az egymásnak ellentmondó adatok létrejöttében. Az α-GalCer -dal töltött CD1d tetramerről úgy gondolták, hogy egy specifikus és szenzitív módszer az iNKT sejtek jelölésére. Lee és társai ezt a tetramert használták a Vα24 festéssel együtt, és a technika magas specificitásáról számoltak be (Lee et al. 2002a;Lee, Putnam, Benlagha, Teyton, Gottlieb, & Bendelac 2002b). Mások szerint azonban nem csak az iNKT sejtek, de más akár Vα24-negatív T sejtek, diverzáns TCR lánccal is képesek kapcsolódni az αGalCer-dal töltött tetramerrel (Chatenoud 2002;Gadola, Dulphy, Salio, & Cerundolo 2002;Kent, Chen, Clemmings, Viglietta, Kenyon, Ricordi, Hering, & Hafler 2005). Mi két különböző módszerrel megerősítettük, hogy a Vα24/6B11 jelölés egy megbízható módszer az iNKT sejtek detektálására. Az ezzel a technikával nyert klónok 80%-a bizonyult biztosan iNKT sejtnek. A maradék 20% reprezentálja a non-specifikus kötődést, illetve minden egyéb metodikai hibát (a sejtválogatás/szortolás hibáját, a lehetséges kontaminációkat stb.) Nem találtunk korrelációt a PBMC-ben lévő Vα24/6B11 sejtek száma és a szortolás hatékonysága között. Ennek módszernek a reprodukálhatósága kiváló volt (r=0,97). Két különböző technikával (második festés, illetve az invariant TCR RT-PCR-ja és szekvenálása) ellenőriztük le ennek a módszernek a specificitását. Ez a két független megerősítés erősen támogatja, hogyVα24 és 6B11 kettős festés megbízhatóan identifikálja az iNKT sejteket; ezért alkalmas ezen sejtek tanulmányozására.
61
5.2.2 Az iNKT sejtek alcsoportjainak aránya a betegcsoportokban Nem találtunk különbséget Vα24/6B11 sejtek számában a különböző betegcsoportok (H, ndT1DM, ltT1DM és ltT2DM) között. Mivel kontrollként nem csak a H sejteket használtuk, hanem a ltT2DM-es csoportot is, ezzel ki tudtuk zárni a megváltozott glükóz homeosztázis hatását. Szintén ellentmondó adatok vannak az iNKT sejtek subpopulációinak arányáról, a korábbi vizsgálatok széles sávokban határozták ezt meg: DN, 17–71%; CD4, 25–90%; CD8, 1–55%. (Mittag et al. 2005;Takahashi et al. 2002) Azonban különböző metodikákat használtak az iNKT sejtek detektálására illetve felszaporításukra (Gadola, Dulphy, Salio, & Cerundolo 2002;Gumperz, Miyake, Yamamura, & Brenner 2002;Szatmari et al. 2004). Hasonlóan a korábbi eredményekhez a CD8+ sejtek aránya nagyon alacsony volt, nem volt különbség az egyes betegcsoportok között. A CD4+ iNKT sejt klónok aránya azonban szignifikánsan csökkent a ltT1DM-es csoportban. Ezt az eredményt direkt festéssel is megerősítettük a korábban nem manipulált PBMC mintákból. A ndT1DM csoportban is látható volt CD4+ sejtek arányának csökkenése, összehasonlítva a H vagy a ltT2DM-es mintákkal. Ennek az eredménynek a magyarázata tisztázatlan, úgy gondoljuk, hogy a technika nem elég érzékeny, hogy szignifikáns eredményt adjon, illetve lehetséges, hogy a CD4+ sejtek aránya a T1DM betegség előrehaladtával folyamatosan, lassan csökken. Az eredmény valószínűleg független a glükóz anyagcserétől, hiszen a ltT2DM-os csoportban ezt nem észleltük. Természetesen mind a direkt festésnek, mind a klónozásnak vannak limitációi. Például, amikor a CD4 arányt a klónokból számoltuk, a klónok aránylag kis száma befolyásolhatja az arányt, ehhez hasonlóan, a direkt számolás PBMC-ből technikailag szintén nehéz az iNKT sejtek alacsony száma miatt. Ennek ellenére az alkalmazott módszerek mellett nem volt korreláció az eredeti Vα24/6B11 sejtszám, és a nyert klónok mennyisége között. Mivel akár a klónozás, akár a sejtek felszaporítása befolyásolhatja az eredményt, mi a CD4+ iNKT sejtek arányának csökkenését direkt PBMC festéssel is megerősítettük.
62
5.2.3. Az iNKT klónok IL-4 és IFN-γ termelése A T1DM-os csoportokban, különösen a ndT1DM-os betegekben az iNKT klónok több IFN-γ-t termeltek, mint a H vagy a ltT2DM betegekből származó iNKT sejtek. Ugyanezt az eredményt találtuk akkor is, amikor az alcsoportokat (CD4 és DN) külön-külön hasonlítottuk össze. Egészségesekben és T1DM-os betegekben korábban azt találták, hogy a CD4+ iNKT sejtek relatíve több IL-4-t termeltek, mint a DN sejtek (Lee, Putnam, Benlagha, Teyton, Gottlieb, & Bendelac 2002b). A domináns IL-4 termelés egy lehetséges regulátoros hatást sugall a CD4+ alcsoport számára. A mi adataink szerint nincs szignifikáns különbség az IL-4 termelés tekintetében a CD4+ és a DN iNKT klónok között egyik beteg csoportban sem. Ellenkezőleg, a T1DM-os iNKT sejteknél a DN klónok több IFN-γ-t produkáltak, mint a CD4+ klónok. A mi vizsgálatainkban vizsgált klónok a klónozás folyamata során előstimulált állapotban voltak, mely hatással lehet a citokin termelésre, azonban a CD4+ és a DN klónok egyformán stimulálva voltak. Az eredményeink így is összhangban vannak a korábbi publikációkkal abban, hogy a DN iNKT sejtek inkább Th1 citokint termelnek (Wilson, Kent, Patton, Orban, Jackson, Exley, Porcelli, Schatz, Atkinson, Balk, Strominger, & Hafler 1998). Nagyon kevés adat áll rendelkezésre a CD8+ iNKT sejtek funkciójáról. Mi 14 CD8+ iNKT sejt klónt vizsgáltunk, és azt találtuk, hogy ezek a sejtek egyaránt alacsony IL-4 és IFN-γ termelők. Bár összesen sok iNKT sejt klónt tanulmányoztunk (285), a CD8+ klónok száma az egyes betegcsoportokban túl alacsony volt a statisztikai analízishez. 5.2.4. Az iNKT sejtek regulátoros tulajdonságai A FoxP3 a regulátoros T sejtek karakterizálásának egy kulcsmolekulája, azok egyik specifikus markere (Ziegler 2006). Maga a molekula az evolúció során nagymértékű konzervativizmust mutat (Ziegler 2006). A thymus eredetű, természetesen kifejlődött regulátoros T sejtek expresszálják a FoxP3-t, azonban ismert a regulátoros T sejtek azon csoportja is, melyek csak aktiválás után fejezik ki a FoxP3-at, ezeket a T sejteket, adaptálódó, vagy indukálható regulátoros T sejteknek is hívják. A humán és az
63
egér FoxP3 közötti különbséget nemrégiben írták le (Ziegler 2006). Amíg az egér FoxP3 nem aktiválható, addig a humán a regulátoros T sejtekben anti-CD3-al, illetve anti-CD28-al kifejeződésük fokozható. A FoxP3 transzkripciót szabályozó enzimek lehetnek aktiváló és gátló hatásúak is. A FoxP3 azonban transzkripciót gátló protein, célgénjei nagy valószínűséggel egyes citokin gének (Zheng & Rudensky 2007). A kísérleteink során képesek voltunk detektálni a FoxP3 jelenlétét az iNKT sejtekben. Adataink azt mutatják, hogy a FoxP3 indukálható (Q-PCR, flow citometria, Western-blot) humán iNKT sejtekben. Az antigén stimulált T sejt kísérletekben az iNKT sejtek és azok felülúszója dózisfüggően aktiváló hatású volt. Ez az eredmény ellentmond azoknak a publikációknak, melyek szerint az iNKT sejtek elsősorban gátló hatásúak. A különbség adódhat abból, hogy a klónozás során történt gyakran ismétlődő aktiváció megváltoztathatta a sejtek citokin termelését. Összegzésül az adataink alátámasztják, hogy az iNKT sejtek fontos regulátoros T sejtek, melyek hatása elsősorban a Th1 és Th2 citokinektől függ, de a még az aktiválatlan sejtek felszínén is nagy számban jelen van CD25, illetve intracellulárisan a FoxP3. Ezek a sejtek képesek a TGF-β1 és IL-10 citokinek termelésére.
64
6. KÖVETKEZTETÉSEK Az itt leírt három lépcsős chip adatelemzési módszer véleményünk szerint hasznos lehet olyan humán betegségek analízisében, ahol valamilyen patológiai folyamat mindkét esetben (jelenleg szénhidrát háztartás zavara) jelen van. Adataink szerint a T1DM-eredetű autoimmunitás hátterében csökkent válaszkészségű CD4+ T helper sejtfunkció áll. Ez a diszfunkció úgy tűnik nem T1DM antigén specifikus, hanem minden CD4+ T sejt funkcióját érinti. Ezen sejtek nagy része ráadásul nem is autoreaktív T sejt. Feltételezésünk szerint ezért a CD4+ T sejtek globális funkcióromlása lehet az egyik kulcsfolyamat a T1DM pathogenezisében. A génexpresszió mintája legalábbis részben magyarázható a HDAC1 csökkent aktivitásával és a hibás epigenetikus modifikációval. Az iNKT sejteket tekintve a 6B11/Vα24 kettős jelölés technikája vizsgálataink szerint megbízható, és hatásos módszer. Ezt az eljárást két független módszerrel is leellenőriztük (második festés és RT-PCR/szekvenálás). Alkalmazva ezt a módszert összehasonlítottuk a Vα24/6B11 sejtek számát PBMC-ben, és nem találtunk különbséget a ndT1DM, ltT1DM, ltT2DM és a H csoport között. Nagy számú (285) iNKT sejt klónt karakterizáltunk, meghatároztuk az egyes alcsoportok arányát. A szignifikánsan csökkent CD4+ iNKT sejt arány, mely önmagában is kedvez a Th1 iránynak, és a megnövekedett IFN-γ termelés, mely független az alcsoportok arányaitól, együttesen egy erős Th1 egyensúly-eltolódásra utal. Eredményeink alátámasztják a Th1/Th2 teória fontosságát, és megerősítik azt az elméletet, miszerint Th1 egyensúlyeltolódásnak és az iNKT sejteknek fontos jelentősége van T1DM-ban. A vizsgálataink során mindig törekedtünk arra, hogy eredményeinket több oldalról, minél több beteg bevonásával, különböző technikai módszerekkel is megerősítsük. A CD4+ T sejtek és az iNKT sejtek vizsgálata több helyen kapcsolódik egymással. Az iNKT sejtek a nagykapacitású citokin termelő képességük lehetővé teszik, hogy karmester módjára befolyásolják az immunológiai folyamatokat, így lehetséges, hogy a CD4+ T sejteknél észlelt eltérések ennek következményei. A CD4+ T sejtek vizsgálata során hiányoltuk a Th1/Th2 elmélet megnyilvánulását, azonban ez az iNKT sejteknél ez világosan jelentkezett. Nem vizsgáltuk a két sejtcsoport közötti
65
interakció mikéntjét. A jelen vizsgálatok nem terjedtek ki az antigén-specifikus T sejtek vizsgálatára, ezért meglepő, hogy a teljes a CD4+ T sejt populáció szintjén ilyen markáns különbségeket találtunk. Az iNKT sejteket, azok alcsoportjait részletesebben és több ellenőrző mechanizmust beépítve analizáltuk, mint a korábbi hasonló publikációk, és találtunk új, korábban nem publikált eredményeket.
66
7. ÖSSZEFOGLALÁS Az 1-es típusú diabetes mellitus (T1DM) minden 400-600-adik embert érint, a betegség incidenciája világszerte emelkedik. A betegséget az inzulintermelő β-sejtek krónikus autoimmun pusztulása okozza. A betegség pontos etiológiája, illetve az autoimmun folyamatot elindító autoantigén, a pontos szabályozó mechanizmusok azonban még nem ismertek. A betegség autoimmun, krónikus, progresszív jellege joggal veti fel az intervenció lehetőségét, azaz hogy kezdeti, lehetőleg prediabeteses állapotban lassítsák, vagy blokkolják a β-sejtek destrukcióját. Egyre több bizonyíték gyűlik össze arról, hogy az autoimmun folyamatok szabályozásban, a T sejteknek, azon belül a regulátoros T sejteknek és a természetes ölő T (natural killer T - NKT) sejteknek alapvető szerepük van. Humán CD4+ T sejteket izoláltunk egészséges (healthy-H), újonnan diagnosztizált (kevesebb, mint 4 hónap, newly diagnosed type 1 diabetes mellitus ndT1DM) 1-es típusú diabeteses és régóta, azaz több mint 1 éve fennálló 2-es típusú diabeteszes (long term type 2 diabetes mellitus - ltT2DM) betegektől. A CD4+ sejteket gén chip technológia segítségével hasonlítottuk össze, az eredményeket további genetikai vizsgálatokkal (PCR), illetve fehérje szinten (Western blott és FACS analízis) és funkcionális vizsgálatokkal is megerősítettük. A teljes CD4+ sejtpopulációt potenciálisan szabályozni képes sejtcsoportot, azaz az invariáns NKT sejteket számoltunk, izoláltunk, klónoztunk H, ndT1DM, ltT1DM és ltT2DM betegekből. Továbbá megvizsgáltuk a különböző iNKT sejtcsoportok tulajdonságait, funkcióját. A teljes CD4+ T sejtpopulációban markáns különbségeket találtunk azon gének működésében melyek az immunológiai folyamatokban és a sejtciklus szabályozásában vesznek részt. Az iNKT sejteken belül a CD4+ iNKT sejtek aránya szignifikánsan csökkent ltT1DM betegeknél, összehasonlítva a H és a ltT2DM betegcsoportokhoz képest. Az iNKT sejtek citokin termelése a ndT1DM és a ltT1DM csoportokban az immunológiailag ártalmasabb irányba tolódott el. A teljes CD4+ sejtpopulációban leírt különbségek, a potensebb regulátoros tulajdonságokkal rendelkező CD4+ iNKT alosztály arányának csökkenése, illetve a megváltozott citokin termelés természete segít megérteni az 1-es típusú diabetes mellitus pathogenezisében lezajló immunológiai folyamatokat. A T sejtek, és ezen belül
67
az iNKT sejtek befolyásolásán alapuló klinikai vizsgálatok megkezdődtek, reméljük, hogy vizsgálati eredményeink ezen intervenciós vizsgálatoknak segítséget nyújtanak.
68
SUMMARY Type 1 diabetes mellitus (T1DM) affects 1 in 400-600 people; the incidence of the disease is rising worldwide. The T1DM is caused by the chronic autoimmune destruction of the insulin producing β-cells. The exact etiology and the primary autoantigen is not known. The autoimmune, chronic and progressive nature of the disease raised the possibility of intervention, which can slow down or stop the destruction of the β-cells preferably as early as possible in prediabetic stage. A lot of proofs were gathered about, that the T cells, mainly the regulatory T cells and the natural killer cells have fundamental role in regulating the autoimmune process. We isolated human CD4+ T cells from healthy (H), from newly diagnosed T1DM (less than 4 months-ndT1DM), from long term T2DM (more than one yearltT2DM) patients. We studied the gene expression of the CD4+ T cells with affymetrix gene chip, then we confirmed the results wilt other genetic studies (PCR) and with checking it in protein level (Western blot and FACS analysis), and with functional assay. The iNKT cells can potentially regulate the all CD4+ T cell population. Thus we measured the frequency of these cells, we isolated (from H, ndT1DM, ltT1DM and ltT2DM patients) and cloned them. We furthermore characterized the different subgroups and their function. The all CD4+ T cell population gene expression pattern showed significant differences, mainly in the regulatory genes of the immune signal and cell cycle. The ratio of the CD4+ iNKT cells significantly decreased among the ltT1DM patients comparing to the H and ltT2DM patient groups. The cytokine production of the iNKT cells shifted to the harmful direction in ndT1DM and in ltT1DM groups. The differences in the all CD4+ T cell population and the CD4+ iNKT cell subgroup, which has more potent regulatory function and the changed cytokine production can be helpful to understand the immuno-pathogenesis of type 1 diabetes mellitus. The clinical studies, modulating the T cells as well as the iNKT cells, have already started. We hope that our results can help to these intervention trials.
69
8. IRODALOMJEGYZÉK
Abbas, A. K., Murphy, K. M., & Sher, A. 1996, "Functional diversity of helper T lymphocytes", Nature, vol. 383, no. 6603, pp. 787-793. Alegre, M. L., Shiels, H., Thompson, C. B., & Gajewski, T. F. 1998, "Expression and function of CTLA-4 in Th1 and Th2 cells", J.Immunol., vol. 161, no. 7, pp. 3347-3356. An, H. J., Cho, N. H., Lee, S. Y., Kim, I. H., Lee, C., Kim, S. J., Mun, M. S., Kim, S. H., & Jeong, J. K. 2003, "Correlation of cervical carcinoma and precancerous lesions with human papillomavirus (HPV) genotypes detected with the HPV DNA chip microarray method", Cancer, vol. 97, no. 7, pp. 1672-1680. Bach, J. F. 2002, "Immunotherapy of type 1 diabetes: lessons for other autoimmune diseases", Arthritis Res., vol. 4 Suppl 3, pp. S3-15. Bach, J. F. & Chatenoud, L. 2001, "Tolerance to islet autoantigens in type 1 diabetes", Annu.Rev.Immunol., vol. 19, pp. 131-161. Ballestar, E., Paz, M. F., Valle, L., Wei, S., Fraga, M. F., Espada, J., Cigudosa, J. C., Huang, T. H., & Esteller, M. 2003, "Methyl-CpG binding proteins identify novel sites of epigenetic inactivation in human cancer", EMBO J., vol. 22, no. 23, pp. 6335-6345. Barash, Y., Dehan, E., Krupsky, M., Franklin, W., Geraci, M., Friedman, N., & Kaminski, N. 2004, "Comparative analysis of algorithms for signal quantitation from oligonucleotide microarrays", Bioinformatics., vol. 20, no. 6, pp. 839-846. Bernstein, B. E., Kamal, M., Lindblad-Toh, K., Bekiranov, S., Bailey, D. K., Huebert, D. J., McMahon, S., Karlsson, E. K., Kulbokas, E. J., III, Gingeras, T. R., Schreiber, S. L., & Lander, E. S. 2005, "Genomic maps and comparative analysis of histone modifications in human and mouse", Cell, vol. 120, no. 2, pp. 169-181. Bottazzo, G. F., Dean, B. M., McNally, J. M., Mackay, E. H., Swift, P. G. F., & Gamble, D. R. 1985, "In situ characterization of autoimmune phenomena and
70
expression of HLA molecules in the pancreas in diabetic insulitis", New Eng J Med, vol. 313, pp. 353-360. Camacho, S. A., Heath, W. R., Carbone, F. R., Sarvetnick, N., LeBon, A., Karlsson, L., Peterson, P. A., & Webb, S. R. 2001, "A key role for ICAM-1 in generating effector cells mediating inflammatory responses", Nat.Immunol., vol. 2, no. 6, pp. 523-529. Carroll, J. M., McElwee, K. J., King, E., Byrne, M. C., & Sundberg, J. P. 2002, "Gene array profiling and immunomodulation studies define a cell-mediated immune response underlying the pathogenesis of alopecia areata in a mouse model and humans", J.Invest Dermatol., vol. 119, no. 2, pp. 392-402. Chang, D. H., Liu, N., Klimek, V., Hassoun, H., Mazumder, A., Nimer, S. D., Jagannath, S., & Dhodapkar, M. V. 2006, "Enhancement of ligand dependent activation of human Natural Killer T cells by Lenalidomide: Therapeutic Implications", Blood. Chatenoud, L. 2002, "Do NKT cells control autoimmunity?", J Clin Invest, vol. 110, no. 6, pp. 747-748. Christianson, S. W., Shultz, L. D., & Leiter, E. H. 1993, "Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors", Diabetes, vol. 42, no. 1, pp. 44-55. Christie, M. R., Hollands, J. A., Brown, T. J., Michelsen, B. K., & Delovitch, T. L. 1993, "Detection of pancreatic islet 64,000 M(r) autoantigens in insulin-dependent diabetes distinct from glutamate decarboxylase", J.Clin.Invest., vol. 92, no. 1, pp. 240-248. Ciampolillo, A., Guastamacchia, E., Caragiulo, L., Lollino, G., De Robertis, O., Lattanzi, V., & Giorgino, R. 1993, "In vitro secretion of interleukin-1 beta and interferon-gamma by peripheral blood lymphomononuclear cells in diabetic patients", Diabetes Res.Clin.Pract., vol. 21, no. 2-3, pp. 87-93.
71
Coyle, A. J. & Gutierrez-Ramos, J. C. 2001, "The expanding B7 superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulating T cell function", Nat.Immunol., vol. 2, no. 3, pp. 203-209. Doherty, D. G., Norris, S., Madrigal-Estebas, L., McEntee, G., Traynor, O., Hegarty, J. E., & O'Farrelly, C. 1999, "The human liver contains multiple populations of NK cells, T cells, and CD3+CD56+ natural T cells with distinct cytotoxic activities and Th1, Th2, and Th0 cytokine secretion patterns", J Immunol, vol. 163, no. 4, pp. 2314-2321. Durante-Mangoni, E., Wang, R., Shaulov, A., He, Q., Nasser, I., Afdhal, N., Koziel, M. J., & Exley, M. A. 2004, "Hepatic CD1d expression in hepatitis C virus infection and recognition by resident proinflammatory CD1d-reactive T cells", J Immunol, vol. 173, no. 3, pp. 2159-2166. Durinovic-Bello, I. 1998, "Autoimmune diabetes: the role of T cells, MHC molecules and autoantigens", Autoimmunity, vol. 27, no. 3, pp. 159-177. Durinovic-Bello, I., Boehm, B. O., & Ziegler, A. G. 2002, "Predominantly recognized proinsulin T helper cell epitopes in individuals with and without islet cell autoimmunity", J.Autoimmun., vol. 18, no. 1, pp. 55-66. Egawa, T., Eberl, G., Taniuchi, I., Benlagha, K., Geissmann, F., Hennighausen, L., Bendelac, A., & Littman, D. R. 2005, "Genetic evidence supporting selection of the Valpha14i NKT cell lineage from double-positive thymocyte precursors", Immunity, vol. 22, no. 6, pp. 705-716. Eibl, N., Spatz, M., Fischer, G. F., Mayr, W. R., Samstag, A., Wolf, H. M., Schernthaner, G., & Eibl, M. M. 2002, "Impaired primary immune response in type-1 diabetes: results from a controlled vaccination study", Clin.Immunol., vol. 103, no. 3 Pt 1, pp. 249-259. Ejrnaes, M., Videbaek, N., Christen, U., Cooke, A., Michelsen, B. K., & von Herrath, M. 2005, "Different diabetogenic potential of autoaggressive CD8+ clones associated with IFN-gamma-inducible protein 10 (CXC chemokine ligand 10) production but not
72
cytokine expression, cytolytic activity, or homing characteristics", J Immunol, vol. 174, no. 5, pp. 2746-2755. Exley, M., Porcelli, S., Furman, M., Garcia, J., & Balk, S. 1998, "CD161 (NKR-P1A) costimulation of CD1d-dependent activation of human T cells expressing invariant V alpha 24 J alpha Q T cell receptor alpha chains", J Exp Med, vol. 188, no. 5, pp. 867-876. Exley, M. A. & Koziel, M. J. 2004, "To be or not to be NKT: natural killer T cells in the liver", Hepatology, vol. 40, no. 5, pp. 1033-1040. Firneisz, G., Zehavi, I., Vermes, C., Hanyecz, A., Frieman, J. A., & Glant, T. T. 2003, "Identification and quantification of disease-related gene clusters", Bioinformatics., vol. 19, no. 14, pp. 1781-1786. Foulis, A. K., McGill, M., & Farquharson, M. A. 1991, "Insulitis in type 1 (insulindependent) diabetes mellitus in man--macrophages, lymphocytes, and interferon-gamma containing cells", J.Pathol., vol. 165, no. 2, pp. 97-103. Gadola, S. D., Dulphy, N., Salio, M., & Cerundolo, V. 2002, "Valpha24-JalphaQindependent, CD1d-restricted recognition of alpha-galactosylceramide by human CD4(+) and CD8alphabeta(+) T lymphocytes", J Immunol, vol. 168, no. 11, pp. 5514-5520. Godfrey, D. I., Hammond, K. J., Poulton, L. D., Smyth, M. J., & Baxter, A. G. 2000, "NKT cells: facts, functions and fallacies", Immunol Today., vol. 21, no. 11, pp. 573-583. Godfrey, D. I., MacDonald, H. R., Kronenberg, M., Smyth, M. J., & Van Kaer, L. 2004, "NKT cells: what's in a name?", Nat.Rev.Immunol, vol. 4, no. 3, pp. 231-237. Grubin, C. E., Daniels, T., Toivola, B., Landin-Olsson, M., Hagopian, W. A., Li, L., Karlsen, A. E., Boel, E., Michelsen, B., & Lernmark, A. 1994, "A novel radioligand binding assay to determine diagnostic accuracy of isoform-specific glutamic acid
73
decarboxylase antibodies in childhood IDDM", Diabetologia, vol. 37, no. 4, pp. 344-350. Gumperz, J. E., Miyake, S., Yamamura, T., & Brenner, M. B. 2002, "Functionally distinct subsets of CD1d-restricted natural killer T cells revealed by CD1d tetramer staining", J Exp Med, vol. 195, no. 5, pp. 625-636. Gumperz, J. E., Roy, C., Makowska, A., Lum, D., Sugita, M., Podrebarac, T., Koezuka, Y., Porcelli, S. A., Cardell, S., Brenner, M. B., & Behar, S. M. 2000, "Murine CD1drestricted T cell recognition of cellular lipids", Immunity, vol. 12, no. 2, pp. 211-221. Hammond, K. J. & Godfrey, D. I. 2002, "NKT cells: potential targets for autoimmune disease therapy?", Tissue Antigens., vol. 59, no. 5, pp. 353-363. Hammond, K. J. & Kronenberg, M. 2003, "Natural killer T cells: natural or unnatural regulators of autoimmunity?", Curr Opin Immunol, vol. 15, no. 6, pp. 683-689. Hammond, K. J., Pelikan, S. B., Crowe, N. Y., Randle-Barrett, E., Nakayama, T., Taniguchi, M., Smyth, M. J., van Driel, I. R., Scollay, R., Baxter, A. G., & Godfrey, D. I. 1999, "NKT cells are phenotypically and functionally diverse", Eur.J Immunol, vol. 29, no. 11, pp. 3768-3781. Haskins, K. 2005, "Pathogenic T-cell clones in autoimmune diabetes: more lessons from the NOD mouse", Adv.Immunol., vol. 87, pp. 123-162. Huang, X., Yuang, J., Goddard, A., Foulis, A., James, R. F., Lernmark, A., PujolBorrell, R., Rabinovitch, A., Somoza, N., & Stewart, T. A. 1995, "Interferon expression in the pancreases of patients with type I diabetes", Diabetes, vol. 44, no. 6, pp. 658-664. Huebert, D. J. & Bernstein, B. E. 2005, "Genomic views of chromatin", Curr Opin Genet.Dev, vol. 15, no. 5, pp. 476-481. In't, V. P., Lievens, D., De, G. J., Ling, Z., Van der, A. B., Pipeleers-Marichal, M., Gorus, F., & Pipeleers, D. 2007, "Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors", Diabetes.
74
Jaeckel, E., von Boehmer, H., & Manns, M. P. 2005, "Antigen-specific FoxP3transduced T-cells can control established type 1 diabetes", Diabetes, vol. 54, no. 2, pp. 306-310. Joosten, S. A., van Meijgaarden, K. E., Savage, N. D., de, B. T., Triebel, F., van der, W. A., de, H. E., Klein, M. R., Geluk, A., & Ottenhoff, T. H. 2007, "Identification of a human CD8+ regulatory T cell subset that mediates suppression through the chemokine CC chemokine ligand 4", Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, vol. 104, no. 19, pp. 8029-8034. Kallan, A. A., Duinkerken, G., de Jong, R., van den, E. P., Hutton, J. C., Martin, S., Roep, B. O., & De Vries, R. R. 1997, "Th1-like cytokine production profile and individual specific alterations in TCRBV-gene usage of T cells from newly diagnosed type 1 diabetes patients after stimulation with beta-cell antigens", J.Autoimmun., vol. 10, no. 6, pp. 589-598. Karlsson, M. G., Lawesson, S. S., & Ludvigsson, J. 2000, "Th1-like dominance in highrisk first-degree relatives of type I diabetic patients", Diabetologia, vol. 43, no. 6, pp. 742-749. Kent, S. C., Chen, Y., Clemmings, S. M., Viglietta, V., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Hering, B., & Hafler, D. A. 2005, "Loss of IL-4 secretion from human type 1a diabetic pancreatic draining lymph node NKT cells", J Immunol, vol. 175, no. 7, pp. 4458-4464. Kondo, M., Akashi, K., Domen, J., Sugamura, K., & Weissman, I. L. 1997, "Bcl-2 rescues T lymphopoiesis, but not B or NK cell development, in common gamma chaindeficient mice", Immunity., vol. 7, no. 1, pp. 155-162. Kukreja, A., Costi, G., Marker, J., Zhang, C. H., Sinha, S., Sun, Z., & Maclaren, N. 2002, "NKT cell defects in NOD mice suggest therapeutic opportunities", J Autoimmun., vol. 19, no. 3, pp. 117-128. Kukreja, A. & Maclaren, N. K. 1999, "Autoimmunity and diabetes", J Clin Endocrinol Metab, vol. 84, no. 12, pp. 4371-4378.
75
Lampeter, E. F., Homberg, M., Quabeck, K., Schaefer, U. W., Wernet, P., Bertrams, J., Grosse-Wilde, H., Gries, F. A., & Kolb, H. 1993, "Transfer of insulin-dependent diabetes between HLA-identical siblings by bone marrow transplantation", Lancet, vol. 341, no. 8855, pp. 1243-1244. Lee, P. T., Benlagha, K., Teyton, L., & Bendelac, A. 2002a, "Distinct functional lineages of human V(alpha)24 natural killer T cells", J Exp Med, vol. 195, no. 5, pp. 637-641. Lee, P. T., Putnam, A., Benlagha, K., Teyton, L., Gottlieb, P. A., & Bendelac, A. 2002b, "Testing the NKT cell hypothesis of human IDDM pathogenesis", J Clin Invest, vol. 110, no. 6, pp. 793-800. Ludwig, R., Kretschmer, M., Caspar, G., Bojunga, J., Oldenburg, A., Schumm-Draeger, P., Stegmuller, M., von Minckwitz, G., Usadel, K. H., & Kusterer, K. 1999, "In vivo microscopy of murine islets of Langerhans: increased adhesion of transferred lymphocytes to islets depends on macrophage-derived cytokines in a model of organspecific insulitis", Immunology, vol. 98, no. 1, pp. 111-115. Mars, L. T., Novak, J., Liblau, R. S., & Lehuen, A. 2004, "Therapeutic manipulation of iNKT cells in autoimmunity: modes of action and potential risks", Trends Immunol, vol. 25, no. 9, pp. 471-476. Martin, S., Wolf-Eichbaum, D., Duinkerken, G., Scherbaum, W. A., Kolb, H., Noordzij, J. G., & Roep, B. O. 2001, "Development of type 1 diabetes despite severe hereditary B-lymphocyte deficiency", N Engl J Med, vol. 345, no. 14, pp. 1036-1040. Mittag, A., Lenz, D., Gerstner, A. O., Sack, U., Steinbrecher, M., Koksch, M., Raffael, A., Bocsi, J., & Tarnok, A. 2005, "Polychromatic (eight-color) slide-based cytometry for the phenotyping of leukocyte, NK, and NKT subsets", Cytometry.A., vol. 65, no. 2, pp. 103-115. Moore, A., Grimm, J., Han, B., & Santamaria, P. 2004, "Tracking the recruitment of diabetogenic CD8+ T-cells to the pancreas in real time", Diabetes, vol. 53, no. 6, pp. 1459-1466.
76
Moreira, J. M., Scheipers, P., & Sorensen, P. 2003, "The histone deacetylase inhibitor Trichostatin A modulates CD4+ T cell responses", BMC.Cancer, vol. 3, no. 1, p. 30. Nakajima, H., Noguchi, M., & Leonard, W. J. 2000, "Role of the common cytokine receptor gamma chain (gammac) in thymocyte selection", Immunol.Today, vol. 21, no. 2, pp. 88-94. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., & Leonard, W. J. 1997, "The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis", J.Exp.Med., vol. 185, no. 2, pp. 189-195. Noguchi, M., Sarin, A., Aman, M. J., Nakajima, H., Shores, E. W., Henkart, P. A., & Leonard, W. J. 1997, "Functional cleavage of the common cytokine receptor gamma chain (gammac) by calpain", Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, vol. 94, no. 21, pp. 11534-11539. Norris, S., Doherty, D. G., Collins, C., McEntee, G., Traynor, O., Hegarty, J. E., & O'Farrelly, C. 1999, "Natural T cells in the human liver: cytotoxic lymphocytes with dual T cell and natural killer cell phenotype and function are phenotypically heterogenous and include Valpha24-JalphaQ and gammadelta T cell receptor bearing cells", Hum.Immunol, vol. 60, no. 1, pp. 20-31. Oikawa, Y., Shimada, A., Yamada, S., Motohashi, Y., Nakagawa, Y., Irie, J., Maruyama, T., & Saruta, T. 2002, "High frequency of valpha24(+) vbeta11(+) T-cells observed in type 1 diabetes", Diabetes Care, vol. 25, no. 10, pp. 1818-1823. Oikawa, Y., Shimada, A., Yamada, S., Motohashi, Y., Nakagawa, Y., Irie, J., Maruyama, T., & Saruta, T. 2003, "NKT cell frequency in Japanese type 1 diabetes", Ann.N Y Acad Sci, vol. 1005, pp. 230-232. Panczel, P., Hosszufalusi, N., Bornemisza, B., Horvath, L., Janoskuti, L., Fust, G., Rajczy, K., Vatay, A., Prohaszka, Z., Madacsy, L., Luczay, A., Blatniczky, L., Halmos, T., Korner, A., Szilvasi, I., & Romics, L. 2001, "[Latent autoimmune diabetes in adults(LADA): part of the clinical spectrum of type-1 diabetes mellitus of autoimmune origin]", Orv.Hetil., vol. 142, no. 46, pp. 2571-2578.
77
Peterson, J. D. & Haskins, K. 1996, "Transfer of diabetes in the NOD-scid mouse by CD4 T-cell clones. Differential requirement for CD8 T-cells", Diabetes, vol. 45, no. 3, pp. 328-336. Pinkse, G. G., Tysma, O. H., Bergen, C. A., Kester, M. G., Ossendorp, F., van Veelen, P. A., Keymeulen, B., Pipeleers, D., Drijfhout, J. W., & Roep, B. O. 2005, "Autoreactive CD8 T cells associated with beta cell destruction in type 1 diabetes", Proc Natl.Acad Sci U S.A., vol. 102, no. 51, pp. 18425-18430. Porcelli, S., Gerdes, D., Fertig, A. M., & Balk, S. P. 1996, "Human T cells expressing an invariant V alpha 24-J alpha Q TCR alpha are CD4- and heterogeneous with respect to TCR beta expression", Hum.Immunol, vol. 48, no. 1-2, pp. 63-67. Ren, Q., Robertson, S. J., Howe, D., Barrows, L. F., & Heinzen, R. A. 2003, "Comparative DNA microarray analysis of host cell transcriptional responses to infection by Coxiella burnetii or Chlamydia trachomatis", Ann.N.Y.Acad.Sci., vol. 990, pp. 701-713. Roh, T. Y., Cuddapah, S., & Zhao, K. 2005, "Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping", Genes.Dev, vol. 19, no. 5, pp. 542-552. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., & Toda, M. 1995, "Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases", J Immunol., vol. 155, no. 3, pp. 1151-1164. Serreze, D. V. & Chen, Y. G. 2005, "Of mice and men: use of animal models to identify possible interventions for the prevention of autoimmune type 1 diabetes in humans", Trends Immunol. Shizuru, J. A., Taylor-Edwards, C., Banks, B. A., Gregory, A. K., & Fathman, C. G. 1988, "Immunotherapy of the nonobese diabetic mouse: treatment with an antibody to T-helper lymphocytes", Science, vol. 240, no. 4852, pp. 659-662.
78
Sibley, R. K., Sutherland, D. E., Goetz, F., & Michael, A. F. 1985, "Recurrent diabetes mellitus in the pancreas iso- and allograft. A light and electron microscopic and immunohistochemical analysis of four cases", Lab Invest, vol. 53, no. 2, pp. 132-144. Sidobre, S. & Kronenberg, M. 2002, "CD1 tetramers: a powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells", J Immunol Methods, vol. 268, no. 1, pp. 107-121. Silink, M. 2002, "Childhood diabetes: a global perspective", Horm.Res., vol. 57 Suppl 1, pp. 1-5. Spatz, M., Eibl, N., Hink, S., Wolf, H. M., Fischer, G. F., Mayr, W. R., Schernthaner, G., & Eibl, M. M. 2003, "Impaired primary immune response in type-1 diabetes. Functional impairment at the level of APCs and T-cells", Cell Immunol., vol. 221, no. 1, pp. 15-26. Sugamura, K., Asao, H., Kondo, M., Tanaka, N., Ishii, N., Ohbo, K., Nakamura, M., & Takeshita, T. 1996, "The interleukin-2 receptor gamma chain: its role in the multiple cytokine receptor complexes and T cell development in XSCID", Annu.Rev.Immunol., vol. 14, pp. 179-205. Szatmari, I., Gogolak, P., Im, J. S., Dezso, B., Rajnavolgyi, E., & Nagy, L. 2004, "Activation of PPARgamma specifies a dendritic cell subtype capable of enhanced induction of iNKT cell expansion", Immunity, vol. 21, no. 1, pp. 95-106. Takahashi, T., Chiba, S., Nieda, M., Azuma, T., Ishihara, S., Shibata, Y., Juji, T., & Hirai, H. 2002, "Cutting edge: analysis of human V alpha 24+CD8+ NK T cells activated by alpha-galactosylceramide-pulsed monocyte-derived dendritic cells", J Immunol, vol. 168, no. 7, pp. 3140-3144. Vardi, P., Dib, S. A., Tuttleman, M., Connelly, J. E., Grinbergs, M., Rabizadeh, A., Riley, W. J., Maclaren, N. K., Eisenbarth, G. S., & Soeldner, J. S. 1987, "Competitive insulin autoantibody RIA: Prospective evaluation of subjects at high risk for development of Type I diabetes mellitus", Diabetes, vol. 36, pp. 1286-1291.
79
Viskari, H., Ludvigsson, J., Uibo, R., Salur, L., Marciulionyte, D., Hermann, R., Soltesz, G., Fuchtenbusch, M., Ziegler, A. G., Kondrashova, A., Romanov, A., Kaplan, B., Laron, Z., Koskela, P., Vesikari, T., Huhtala, H., Knip, M., & Hyoty, H. 2005, "Relationship between the incidence of type 1 diabetes and maternal enterovirus antibodies: time trends and geographical variation", Diabetologia, vol. 48, no. 7, pp. 1280-1287. Wang, A. G., Kim, S. U., Lee, S. H., Kim, S. K., Seo, S. B., Yu, D. Y., & Lee, D. S. 2005, "Histone deacetylase 1 contributes to cell cycle and apoptosis", Biol Pharm.Bull, vol. 28, no. 10, pp. 1966-1970. Wilson, D. M. & Buckingham, B. 2001, "Prevention of type 1a diabetes mellitus*", Pediatr Diabetes, vol. 2, no. 1, pp. 17-24. Wilson, S. B., Kent, S. C., Patton, K. T., Orban, T., Jackson, R. A., Exley, M., Porcelli, S., Schatz, D. A., Atkinson, M. A., Balk, S. P., Strominger, J. L., & Hafler, D. A. 1998, "Extreme Th1 bias of invariant Valpha24JalphaQ T cells in type 1 diabetes", Nature, vol. 391, no. 6663, pp. 177-181. Winter, W. E. & Schatz, D. 2003, "Prevention strategies for type 1 diabetes mellitus: current status and future directions", BioDrugs., vol. 17, no. 1, pp. 39-64. Wong, F. S. 2005, "Insulin - a primary autoantigen in type 1 diabetes?", Trends Mol Med, vol. 11, no. 10, pp. 445-448. Wong, F. S., Visintin, I., Wen, L., Flavell, R. A., & Janeway, C. A., Jr. 1996, "CD8 T cell clones from young nonobese diabetic (NOD) islets can transfer rapid onset of diabetes in NOD mice in the absence of CD4 cells", J.Exp.Med., vol. 183, no. 1, pp. 67-76. Yamanouchi, J., Verdaguer, J., Han, B., Amrani, A., Serra, P., & Santamaria, P. 2003, "Cross-priming of diabetogenic T cells dissociated from CTL-induced shedding of beta cell autoantigens", J Immunol, vol. 171, no. 12, pp. 6900-6909.
80
Zheng, Y. & Rudensky, A. Y. 2007, "Foxp3 in control of the regulatory T cell lineage", Nat.Immunol., vol. 8, no. 5, pp. 457-462. Zhou, D., Mattner, J., Cantu, C., III, Schrantz, N., Yin, N., Gao, Y., Sagiv, Y., Hudspeth, K., Wu, Y. P., Yamashita, T., Teneberg, S., Wang, D., Proia, R. L., Levery, S. B., Savage, P. B., Teyton, L., & Bendelac, A. 2004, "Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells", Science, vol. 306, no. 5702, pp. 1786-1789. Ziegler, S. F. 2006, "FOXP3: of mice and men", Annu.Rev.Immunol., vol. 24, pp. 209-226.
81
9. PUBLIKÁCIÓK 9.1. A disszertációhoz kapcsolodó közlemények Cikkek: Kis J, Engelmann P, Farkas K, Richman G, Eck S, Lolley J, Jalahej H, Borowiec M, Kent SC, Treszl A, Orban T. (2006) Reduced CD4+ subset and Th1 bias of the human iNKT cells in Type 1 diabetes mellitus. J Leukoc Biol. Mar;81(3):654-62. impact factor: 4,57 Kis János, Engelmann Péter, Heyam Jalahej, Orbán Tihamér (2006) Az immunológiai prevenció lehetősége 1-es típusú diabetes mellitusban. LAM. 16(8-9): 771–773. Orban T, Kis J, Szereday L, Engelmann P, Farkas K, Jalahej H, Treszl A. (2007) Reduced CD4+ T-cell-specific gene expression in human type 1 diabetes mellitus. J Autoimmun. Jun;28(4):177-87. impact factor: 2,15 Előadások: Kis J. Characterization of natural killer T cells. Joslin Diabetes Center, Immunology data club. Boston, USA 2005.12.12. Kis J. Natural killer T cells in type 1 diabetes. Joslin Diabetes Center, Harvard, Boston, USA, 2006.02.14. Poszterek/ Abstraktok :. Janos Kis, Peter Engelmann, James Lolley, Geoff Richman, Heyam Jalahej, Tihamer Orban, (2005) Characterization of Human NKT Cell Clones Identified by Vα24 and 6B11 Double Staining in Type 1 Diabetes. poszter: ADA San Diego, 65th Scientific Sessions, 43-LB
82
Peter Engelmann, Janos Kis, Geoffrey Richman, Shawn Eck, Heyam Jalahey, Tihamer Orban (2006) The Regulatory Function of the Invariant Natural Killer T Cells, poszter: ADA Washington, DC 66th Scientific Sessions, 1179-P, absztrakt: Diabetes. Jun;55(Suppl.:1):A278 Janos Kis, Peter Engelmann, Geoffrey Richman, Shawn Eck, Heyam Jalahey, Tihamer Orban. (2006) Human Invariant Natural Killer T Cells in Type 1 Diabetes Mellitus, poszter: ADA Washington, DC 66th Scientific Sessions, 1187-P, absztrakt: Diabetes. Jun;55(Suppl.:1):A279 Tihamer Orban, Janos Kis, Peter Engelmann, Laszlo Szereday, Geoffrey Richman, Shawn Eck, Andras Treszl. (2006) Impaired Function of the CD4+ T Cells in Human Type 1 Diabetes Mellitus, poszter: ADA Washington, DC 66th Scientific Sessions, 1195-P, absztrakt: Diabetes. Jun;55(Suppl.:1):A281 9.2. A disszertációtól független közlemények Cikkek: Kis János Tibor, Nemesánszky Elemér (2002) A gastrooesophagealis reflux betegség atípusos formái. LAM;12(8):455-60 Dr. Kis János, Dr. Pálhegyi Erika (2003) Szokatlan lokalizációjú, ritkán előforduló hasi daganat felismerése és eredményes kezelése. LAM;13(7):555-8. Előadások / absztraktok: Kis J, Pálhegyi E, Lambert M, Gelley A, Székely Gy, Nemesánszky E (2003) The maze of abdominal ultrasound and computer tomography in the diagnosis of clinically silent abdominal space occupying lesions előadás: 45th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 3-7, 101., absztrakt: Z Gastroenterol;41(5):442 Poszterek/absztraktok:
83
Kis J, Rédei Cs, Nemesánszky E. (2002) Az oesophagus pH monitorozás szerepe a gastrooesophagealis reflux betegség atípusos formáinak diagnosztikájában, poszter: A Magyar Belgyógyász Társaság XXXIX. Nagygyűlése, nov. 21-23., absztrakt: MBA;LV(Suppl.:3):82 Kis J, Székely Gy, Nemesánszky E. (2002) The importance of the ultrasonography to reveal a rare case of portal hypertension, poszter: 44th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 4-8, absztrakt: Z Gastroenterol;40(5):341 Janos Kis, Antal Csepregi, C. P. Strassburg, P. Obermayer-Straub, S. Kneip, A. Kayser, E. Nemesanszky and M. Manns (2002) Antimitochondrial antibodies against
dihydrolipoamide
acyltransferases
(PDC-E2
and
BCKADCE2)
in
immunofluorescent AMA-negative rheumatoid arthritis sera, poszter: 37th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver Madrid, Spain, 17-21 April, 610, absztrakt: J. Hepatol;36(Suppl:1):153-154
84
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom Dr. Orbán Tihamérnak, aki lehetőséget adott, hogy az ő általa irányított laborban dolgozhassam, hogy részt vehettem az általa felügyelt vizsgálatokban. Köszönetet szeretnék mondani témavezetőimnek, PhD. Dr. Treszl Andrásnak, aki tanácsaival
irányította
munkámat,
segített
a
kísérletek
megtervezésében,
végrehajtásában és az eredmények publikálásában. Prof. Dr. Tulassay Tivadarnak és Prof. Dr. Madácsy Lászlónak köszönhetem, hogy PhD. munkámat az I. Sz. Gyermekklinikán írhatom. Hálával tartozom Dr. Grosz Andreának, aki munkámat mindvégig figyelemmel kísérte és észrevételeivel, tanácsaival segítette. Köszönetemet fejezem ki Prof. Dr. Nemesánszky Elemérnek, hogy pályám elején utamat egyengette. Köszönöm Prof. Dr. Balázs Csabának, Prof. Dr. Naszlady Attilának és Dr. Bene Krisztiánnak, hogy tanulmányutamhoz hozzájárultak. Köszönettel tartozom a Joslin Diabetes Center (Harvard, Boston, USA) Immonológiai és Immunogenetikai laborjában dolgozóknak, úgy, mint Dr. Heyam Jalahejnek, PhD. Engelmann Péternek, Geoffrey Richmannak, Shawn Ecknek, James Lolleynak, Dr. PhD. Farkas Klárának, illetve Dr. Sally C. Kentnek (Brigham & Women’s Hospital (Harvard Medical School, Boston, USA)) és a Joslin Diabetes Center ambulanciáján dolgozó asszisztenseknek, nővéreknek, akik mindig készen álltak, hogy munkámat segítsék. Hálás vagyok feleségemnek, aki biztosította a nyugodt családi hátteret, és elviselte távollétemet, illetve családomnak, akik mindig is támogattak.
85
