A szaruhártya morfológiája diabetes mellitusban in vivo konfokális corneamikroszkópia alkalmazásával Doktori értekezés
Dr. Popper Mónika Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Süveges Ildikó egyetemi tanár, az MTA doktora Konzulensek: Dr. Jaap A. Van Best, Ph.D. (Coimbra/Leiden), Dr. José G. Cunha-Vaz egyetemi tanár, Ph.D. (Coimbra) Hivatalos bírálók: Dr. Rácz Péter tudományos tanácsadó, az MTA doktora Dr. Füst Ágnes egyetemi adjunktus, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Salacz György egyetemi tanár, kandidátus Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Halmos Tamás főorvos, az MTA doktora Dr. Holló Gábor egyetemi docens, az MTA doktora Dr. Sebestyén Anna tudományos munkatárs, Ph.D.
Budapest 2009
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
I. TARTALOMJEGYZÉK I. Tartalomjegyzék ............................................................................................................ 2 II. Rövidítések jegyzéke ................................................................................................... 5 III. Bevezetés .................................................................................................................... 7 Miért szaruhártya? ............................................................................................ 7 Miért diabetes? ................................................................................................. 7 Miért diabeteses keratopathia? ......................................................................... 8 És miért in vivo konfokális mikroszkópia? ...................................................... 9 IV. Irodalmi háttér .......................................................................................................... 10 1. A szaruhártya diabetesben: diabeteses keratopathia ............................................... 10 2. A diabeteses szaruhártya-elváltozások klinikai jelentősége ................................... 18 2.1. A cornea epithelium diabetes mellitusban ....................................................... 18 A cornea epithelium morfológiai változásai diabetesben ............................... 18 Az epithelialis basalmembrán változásai........................................................ 18 Az epithelium tapadása és a gyógyulási ráta .................................................. 19 Az epithelium barrier funkciója...................................................................... 19 A diabeteses szaruhártyahám-elváltozások klinikai manifesztációja ............. 20 2.2. Diabeteses corneális neuropathia..................................................................... 21 Morfológiai változások ................................................................................... 21 Funkcionális változások és klinikai összefüggései ......................................... 22 2.3. A szaruhártya stroma diabetesben ................................................................... 22 2.4. A Descemet-membrán diabetesben ................................................................. 22 2.5. A cornea endothelium diabetesben .................................................................. 23 Endothelsejt morfológia diabeteses corneában .............................................. 23 Endothelsejt denzitás ...................................................................................... 24 3. A szaruhártya beidegzése ....................................................................................... 25 4. Cornea idegek diabetes mellitusban, perifériás neuropathia .................................. 29 5. A szaruhártya autofluoreszcenciája (cornealis autofluoreszcencia, CAF) ............. 30 6. In vivo konfokális corneamikroszkópia .................................................................. 31 A konfokális corneamikroszkópia története, fejlődése, típusai .............................. 32 7. Az egészséges cornea konfokális képe ................................................................... 36 Epithelium ...................................................................................................... 36 Felszíni vagy superficialis epithelialis sejtek ................................................. 37 Szárnyas- vagy wing-sejtek ............................................................................ 37 Basalis epithelialis sejtek ................................................................................ 37 Bowman-membrán ......................................................................................... 37 Stroma............................................................................................................. 37 Descemet-membrán ........................................................................................ 38 Endothelium ................................................................................................... 38 Corneális beidegzés ........................................................................................ 38 8. Konfokális mikroszkópia a klinikai gyakorlatban .................................................. 40 Corneális fertőzések ....................................................................................... 40 Corneális dystrophiák ..................................................................................... 41 Keratoconus .................................................................................................... 42 Kontaktlencse-viselés ..................................................................................... 43
2
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Idegentest sérülés............................................................................................ 44 Száraz szem szindróma................................................................................... 44 Konfokális corneamikroszkópia szemsebészeti beavatkozások után ............. 45 Refraktív sebészet ........................................................................................... 47 V. Célkitűzések............................................................................................................... 50 1. Módszer kifejlesztése és validálása a cornea különböző rétegeiben történő sejtszámolásra in vivo scanning slit konfokális mikroszkópia alkalmazásával.......... 50 Egészséges szaruhártyák in vivo kvantitatív vizsgálata konfokális mikroszkópiával . 50 2. A diabeteses keratopathia vizsgálata in vivo konfokális mikroszkópiával: kvantitatív és kvalitatív vizsgálatok ............................................................................ 50 2.A. A cukorbetegség hatásának vizsgálata a szaruhártya különböző rétegeiben a sejtek sűrűségére ........................................................................................................ 50 2.B. A subbasalis idegrostréteg vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban ....... 51 2.C. A szaruhártya stroma vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban: stromális idegek, és egyéb magasreflektivitású képletek............................................................ 52 VI. Módszerek ................................................................................................................ 53 Helyszín ...................................................................................................................... 53 Vizsgálati személyek csoportjai, betegcsoportok ....................................................... 54 1. Mérések egészséges kontroll vizsgálati személyeken, sejtszámolási módszer kidolgozása, validálása .............................................................................................. 54 2.A. Sejtdenzitás-vizsgálatok diabeteses betegek szaruhártyáiban ............................ 54 2.B. A subbasalis idegrostréteg vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban ....... 55 2.C. A szaruhártya stroma vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban .............. 55 Etikai kérdések ........................................................................................................... 56 Eszközök..................................................................................................................... 56 A vizsgálat menete...................................................................................................... 57 A szaruhártyarétegek klasszifikációja in vivo konfokális corneamikroszkópos analízishez .................................................................................................................. 59 A sejtszámolás módszere ............................................................................................ 62 Validálás ..................................................................................................................... 64 Pontválasz-függvény (point spread function, PSF) ........................................ 64 Képméret és torzítás ....................................................................................... 65 A szaruhártyarétegek klasszifikációjának validálása ..................................... 65 A mérések megismételhetősége ..................................................................... 66 A sejtdenzitások validációja ........................................................................... 66 Statisztikai módszerek ................................................................................................ 67 VII. Eredmények ............................................................................................................ 69 1. Mérések egészséges kontroll vizsgálati személyeken, a sejtszámolási módszer kidolgozása, validálása eredményei. .......................................................................... 69 Pontválasz-függvény (point spread function, PSF), képméret és torzítás .............. 69 A szaruhártyarétegek klasszifikációjának validálása ............................................. 69 A mérések megismételhetősége: adott meneten belüli ismételhetőség (intra-session repeatability) és mérések közötti ismételhetőség (inter-session repeatability) ...... 70 A sejtdenzitások validálása..................................................................................... 70 Az egészséges vizsgálati személyek szaruhártyáiban mért sejtdenzitásértékek ..... 70 2.A. A diabeteses betegek szaruhártyáiban mért sejtdenzitásmérés eredményei ....... 75 2.B. A subbasalis idegrostréteg vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban eredményei ................................................................................................................. 80
3
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2.C. A szaruhártya stroma vizsgálatának eredményei diabeteses betegek szaruhártyáiban: stromális idegek, és egyéb magasreflektivitású képletek ................ 84 VIII. Megbeszélés........................................................................................................... 87 1. Mérések egészséges kontroll vizsgálati személyeken, in vivo sejtszámolási módszer kidolgozása, validálása ............................................................................................... 87 2. A diabeteses keratopathia vizsgálata in vivo konfokális mikroszkópiával: kvantitatív és kvalitatív vizsgálatok ........................................................................... 90 2.A. Sejtdenzitás-vizsgálatok diabeteses betegek szaruhártyáiban ............................ 90 Superficialis epithelialis sejtek rétege ............................................................ 91 Basalis epithelialis sejtek rétege ..................................................................... 91 Szaruhártya stroma: keratocyták .................................................................... 93 Endothelium ................................................................................................... 95 2.B. A subbasalis idegrostréteg vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban ........ 98 2.C. A szaruhártya stroma vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban: stromális idegek, és egyéb magasreflektivitású képletek ......................................................... 102 IX. Az értekezés új eredményeinek összefoglalása, az új eredmények jelentősége..... 104 1. Módszer kifejlesztése és validálása a cornea különböző rétegeiben történő sejtszámolásra in vivo scanning slit konfokális mikroszkópia alkalmazásával........ 104 2. A diabeteses keratopathia vizsgálata in vivo konfokális mikroszkópiával: kvantitatív és kvalitatív vizsgálatok .......................................................................... 104 2.A. A cukorbetegség hatásának vizsgálata a szaruhártya különböző rétegeiben a sejtek sűrűségére ...................................................................................................... 105 2.B. A subbasalis idegrostréteg vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban ..... 106 2.C. A szaruhártya stroma vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban: stromális idegek, és egyéb magasreflektivitású képletek.......................................................... 106 X. Összefoglalás ........................................................................................................... 107 XI. Summary ................................................................................................................ 109 XII. Sumário ................................................................................................................. 111 XIII. Irodalomjegyzék .................................................................................................. 113 XIV. Saját publikációk jegyzéke .................................................................................. 129 XV. A disszertáció tárgyára vonatkozó független hivatkozások .................................. 137 XVI. Köszönetnyilvánítás, Acknowledgements ........................................................... 140 XVII. Az értekezéshez kapcsolódó publikációk különlenyomatai ............................... 143
4
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
II. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE IF IGT
impakt faktor károsodott glükóz tolerancia, impaired glucose tolerance IVCM in vivo konfokális mikroszkópia, in vivo confocal microscopy LASEK Laser Assisted Sub-Epithelial Keratomileusis, vagy Laser Epithelial Keratomileusis LASER lézer, Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation LASIK Laser In situ Keratomileusis, Laser-Assisted In Situ Keratomileusis LC Langerhans sejt, Langerhans cell LSCM laser scanning confocal microscopy MDD legkisebb kimutatható különbség, minimum detectable difference MNSI Michigan Neuropathy Screening Instrument NA (képletben) sejtek száma per mm2 NIDDM nem inzulin dependens diabetes mellitus NV (képletben) sejtek száma per mm3 PKP penetráló keratoplasztika, szaruhártya átütetés PMMA polimetil metakrilát PRK fotorefraktív keratektómia, photorefractive keratectomy PSF pontválaszfüggvény, point spread function RCM Rostock Cornea Modul SBN subbasalis idegek, subbasal nerves SCD felszíni sejtsűrűség, felszíni sejtdenzitás, surface cell density SD standard deviáció, szórás SSCM scanning slit (más szerzőknél slit scanning) confocal microscopy
ADA American Diabetes Association AGE késői glikációs végtermékek, advanced glycation end products ARVO Association for Research in Vision and Ophthalmology CAF a szaruhártya autofluoreszcenciája, corneal autofluorescence CDC Centers for Disease Control and Prevention CI konfidencia intervallum CM konfokális mikroszkópia, confocal microscopy DC dendritikus sejt, dendritic cell DM diabetes mellitus DP diabeteses betegek (diabetic patients) DR vagy DRP diabeteses retinopathia ECM extracelluláris mátrix ETDRS Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study Excimer excited dimer FCT Fundação para a Ciência e a Tecnologia FWHM félértékszélesség, full-width at half maximum HC egészséges kontrollszemélyek (healthy controls) HRC magasreflektivitású sejtek, highly reflective cells HRT Heidelberg Retina Tomograph IBILI Instituto Biomédico para a Investigação da Luz e Imagem, Institute of Biomedical Research in Light and Image IDDM inzulin dependens diabetes mellitus IDF International Diabetes Federation
5
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
T1 DM 1-es típusú diabetes mellitus T2 DM 2-es típusú diabetes mellitus TSCM tandem scanning confocal microscopy USAF United States Air Force
VCD térfogati sejtsűrűség, térfogati sejtdenzitás, volumetric cell density WHO Egészségügyi Világszervezet, World Health Organization
6
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
III. BEVEZETÉS Mint minden kutatásban, az enyémben is fontos szerepe volt a témaválasztásnak. Dolgozatom és eddigi kutatásaim témájával kapcsolatban is felmerülnek ezek a kérdések: Miért „szaruhártya”? Miért „diabetes”? Miért „diabeteses keratopathia”? És miért „in vivo konfokális mikroszkópia”?
Miért szaruhártya? A cornea az emberi szervezet egyik legcsodálatosabb és legfigyelemreméltóbb szövete. A szaruhártya teszi lehetővé a látást, átlátszóságánál fogva „ablak a világra”. A szaruhártyát különböző rétegek alkotják, melyek mindegyikét szigorú, szabályos sejtstruktúra jellemez. A szaruhártya épségéhez, átlátszóságának fenntartásához ezen struktúra/szerkezet kényes egyensúlya szükséges. Ha ez a szabályos struktúra valamilyen kóros állapot vagy kórfolyamatok következtében megbomlik, a cornea transzparenciája csökken, jelentősen károsítva a látást. A szaruhártya másik különlegessége, hogy az emberi szervezet legdúsabban beidegzett szövete, itt a legnagyobb az egységnyi területre eső érzőidegrostok száma [1, 2]. Becslések szerint a superficiális epithelialis rétegben kb. 7 000 [1] – 16 000 [3] érzőidegvégződés található négyzetmilliméterenként. Összehasonlításként a corneális beidegzés 20-40-szerese a fog pulpáénak és 300–600-szorosa a bőrének [4].
Miért diabetes? A diabetes, különösen annak leggyakoribb típusa, a 2-es típusú diabetes mellitus a feljett, nyugati világ, de egyre inkább a fejlődő világ népbetegsége is. A 2-es típusú diabetes a cukorbetegség leggyakoribb típusa, az összes diabeteses eset 90-95%-át jelenti. Jelenleg a Föld felnőtt népességének mintegy 5-6%-át érinti [5]. Jelentősége erősen növekszik, a betegség nemcsak időskorban jelentkezik, hanem egyre gyakoribb a középkorúaknál vagy fiatal felnőttkorban kezdődő betegség. Incidenciájának és prevalenciájának növekedése mellett az egyre javuló egészségügyi gondozás miatt a betegek várhatóan egyre hosszabb ideig élnek együtt a betegséggel, a kialakuló szövődményekkel.
7
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Miért diabeteses keratopathia? A diabetes mellitus a szem minden szövetét érinti, károsítja. Legismertebb, széleskörben vizsgált és publikált szemészeti szövődménye a diabeteses retinopathia. Napjainkban azonban egyre nagyobb szakmai figyelem fordul a korábban elhanyagolt diabeteses keratopathia ill. keratoepitheliopathia felé. A cukorbetegek szaruhártyáiban jellemző elváltozások feltehetőleg összefüggést mutatnak a perifériás neuropathiával, valamint elhúzódó, rosszabb sebgyógyuláshoz vezetnek. A 2-es típusú diabetes mellitus népbetegség volta, gyakoriságának további növekedése, valamint az egyre javuló egészségügyi gondozás miatt a cukorbetegek a betegséggel való egyre hosszabb ideig tartó együttélése miatt a diabetes mellitus fontossága tovább nő. Korunkban ezzel egyidejűleg jellemző társadalmi-egészségügyi jelentőségű folyamat a népesség egyre igényesebbé válása, egészségi állapotát és életminőségét tekintve ezek iránt egyre magasabb elvárásokat, igényeket támaszt. Napjainkban – a nem-diabeteses és a diabeteses népesség körében is – egyre több olyan szemészeti – műtéti vagy optikai – beavatkozást végzünk, melyek a szaruhártyát érintik: így a kontaktlencseviselés, szürkehályogműtét során a cornealis sebkészítés, refraktív műtétek, szaruhártyaátültetés. Régebben
a
cukorbetegség
a
legtöbb
szemészeti
beavatkozás
relatív
kontraindikációját képezte. A diabeteses betegeknek a cukorbetegséggel való hosszabb együttélése, és az egészségügyben alkalmazott technológia, pl. műtéti technikák gyors fejlődése
következtében
egyre
gyakrabban
végzünk
cukorbetegeken
műtéti
beavatkozásokat. Napjainkban a fejlett világban a szemészeti műtétek két legnagyobb csoportját a szürkehályogműtétek és a refraktív műtétek jelentik. Mindkét műtétcsoportnak közös jellemzője, hogy a sebkészítés a szaruhártyán történik. A szürkehályogműtétek esetében a modern műtéti technológia a corneális sebkészítés (clear cornea) elterjedéséhez vezetett. Jellemző továbbá a korábbi évtizedekhez képest a fiatalabb életkorban, a cataracta korábbi stádiumában elvégzett műtét. A modern refraktív célú excimer lézeres szaruhártyaműtétek pedig természetszerűleg szintén a corneán végzett beavatkozások. A cukorbetegek diabeteses keratopathiában is szenvednek, melyet csökkent cornea érzékenység, elhúzódóbb corneális sebgyógyulás, gyakoribb perzisztáló és recidiváló
8
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
szaruhártya erosiók, ulcusok jellemeznek. Ezek módosíthatják az amúgy sikeres cataracta és refraktív beavatkozások gyógyulását a diabeteses betegcsoportban. A hosszabb vitrektómiás műtétek során a diabeteses keratopathia következtében egyrészt romlik a beavatkozás alatti átláthatóság, a vitrektómiás vizualizáció, másrészt a műtét utáni reepithelizáció elhúzódhat.
És miért in vivo konfokális mikroszkópia? Az „in vivo konfokális corneamikroszkópia” a szaruhártya élőben történő vizsgálatára alkalmas ideális eszköz. Segítségével a szaruhártya szerkezete, rétegei és sejtjei részletgazdagon, valós időben és főleg nem-invazív módon vizsgálhatók. Ahhoz hasonlítható tulajdonképpen, mintha hagyományos szövettani vizsgálatot végeznénk, annak invazivitása valamint festékek használata nélkül, és legfőképpen élő személyben. Alkalmazásával időben is tudunk változásokat, kórfolyamatokat nyomonkövetni. Az in vivo konfokális corneamikroszkópia segítségével hozzájárulhatunk a diabeteses keratopathia hátterének, részjelenségeinek megismeréséhez, progressziójának követéséhez,
a
terápiás
próbálkozások
hatásosságának
és
hatékonyságának
értékeléséhez. Jövőbeni klinikai jelentősége a diabeteses népességben szükségessé váló, a szaruhártyát érintő beavatkozások előtti prognosztikai vizsgálatok elvégzése lehet.
9
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
IV. IRODALMI HÁTTÉR 1. A szaruhártya diabetesben: diabeteses keratopathia A 2-es típusú diabetes mellitus a nyugati világ népbetegsége. A cukorbetegek számának jelentős növekedését prognosztizálja az ezzel foglalkozó, elmúlt években közölt valamennyi epidemiológiai tanulmány. Jelentősége azért is erősen növekszik, hiszen prevalenciájának növekedése mellett az egyre javuló egészségügyi gondozás miatt a betegek várhatóan egyre hosszabb ideig élnek együtt a betegséggel. Kiemelt jelentőségét mutatja, hogy az egyik legjelentősebb és legmagasabb impakt faktorú orvostudományi szaklap, a The Lancet 2008 májusában kiemelt szerkesztőségi cikkben foglalkozott a témával [6]. A cikk kiemeli, hogy a betegség és szövődményeinek korai felismerése és kezelése, különösen a magaskockázatú népességben, azért is különösen fontos, mert bár ezek a szövődmények igen súlyosak lehetnek és nagy gazdasági terhet is jelentenek, a cukorbetegséggel összefüggő morbiditás és mortalitás igen nagy mértékben megelőzhető [6]. Ez is magyarázza, hogy napjainkban a cukorbetegséggel kapcsolatban már nemcsak a hagyományos orvosi megközelítések fontosak, hanem a diabetes iránti érdeklődés a nemzetközi kutatás élvonalának érdeklődésének homlokterében áll. Kiemelt példák erre az 1-es típusú diabetes esetében alkalmazott hasnyálmirigy szigetsejt-transzplantáció, vagy őssejtkutatásban napjainkban elért eredmények, melyek a jövőben a betegség gyógyítását ígérhetik. A neves folyóirat kiemeli, hogy a cukorbetegség, mely évszázadok óta ismert kór, napjainkra izgalmas kutatási területté vált. A legfontosabb probléma a felfedezett alap- és klinikai kutatási eredmények értékes hasznosítása a klinikumban a betegek érdekében [6]. A régebbi epidemiológiai vizsgálatok jelentős része a cukorbetegséget egységes kórképnek kezelte, nem téve különbséget az 1-es és a 2-es típusú diabetes mellitus gyakorisági arányszámai között. A két diabetes-típus eltérő kóreredete mellett a két típus különböző földrajzi előfordulási gyakorisága is fontos különbség. 1997-ben a diagnosztikus kritériumokat valamint a szűrési módszereket egységesíteni ajánlotta az Amerikai Diabetes Társaság (American Diabetes Association, ADA) melyet a World Health Organization (WHO) is elfogadott. Ennek alapján a felismert cukorbetegek
10
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
számának további növekedése volt várható [7]. A Nemzetközi Diabetes Szövetség (International Diabetes Federation, IDF) adatai szerint 1985-ben világszerte 30 millió, 2000-ben 150 millió, 2003-ban 194 millió ember szenvedett cukorbetegségben [8]. Amos, McCarty és Zimmet a WHO ajánlásainak megfelelően végzett és értékelt diabetes-szűrésének eredményeit és előfordulási trendjét elemezve a 2-es típusú cukorbetegek számát 1997-ben az egész világra számolva 120 milliónak becsülte. Akkori véleményük szerint ez a szám 2010-re 215 millióra növekszik. Az emelkedés mértéke a fejlett és a fejlődő országokban azonos, a népesség szaporodásának eltérései miatt azonban a növekedés döntően a fejlődő országokban várható. Az 1-es típusú diabetes mellitus esetek 1997-re becsült 3,5 milliós értékét e tendenciákat alapul véve 2010-re 5 millióra becsülték [9]. Egy másik, 1998-ban publikált WHO-elemzés szerint a világ 20 éven felüli, felnőtt lakosságában átlagosan 4%-ra tehető a cukorbetegek aránya. Ekkor ezt az arányt 2025re várhatóan 5,4%-ra becsülték. Ekkori számítások szerint a növekedés a fejlett országokban 42%-os, azaz a betegek számának emelkedését 51-ről 72 millióra, a fejlődő országokban a növekedés 170%-os, azaz 84-ről 228 millióra emelkedését prognosztizálták [10]. A National Institute of Health újabb statisztikája szerint az Amerikai Egyesült Államokban (USA) 2007-ben 23,6 millió ember – az USA lakosságának 7,8%-a volt cukorbeteg [11]. A Nemzetközi Diabetes Szövetség (International Diabetes Federation, IDF) legújabb, 2006-ban publikált, 2007-re vonatkozó epidemiológiai statisztikai adatai szerint a cukorbetegség jelenleg a világon mintegy 246 millió beteget érint, mely a felnőtt (20-79 éves) populáció 5,9%-át jelenti. A 2-es típusú diabetes a betegség leggyakorbb típusa, az összes diabeteses eset 90-95%-át jelenti [5]. A cukorbetegség globálisan a negyedik vezető halálok, 2007-ben 3,8 millió halálért felelős világszerte. Vagyis, minden 10. másodpercben meghal valaki a világon a diabetesszel összefüggő okból [5]. A 2-es típusú cukorbetegség mind a fejlett, mind a fejlődő országokban komoly problémát jelent. Valaha a betegség szinte csak a felnőtteket érintette (régen ezért is
11
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
nevezték időskori cukorbetegségnek), ma már azonban a túlsúlyos serdülőkorúak körében is egyre gyakoribbá válik. A Nemzetközi Diabetes Szövetség (International Diabetes Federation, IDF) előrejelzése szerint a mostani 246 millióról (5,9%) 2025-re 380 millióra, a felnőtt lakosság 7,1%-ára fog emelkedni a betegek száma, azaz az évenkénti növekedést mintegy 7 millió főre becslik (1. ábra). A növekedés jellemző a gyermek- és fiatalkorú
1. ábra A diabetes prevalenciája világszerte 2007-ben és 2025-ben az IDF becslése alapján
12
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
betegeknél is, mind a fejlett, mind pedig a fejlődő országokat tekintve, azaz a jövőben a felnőttek mellett sok kamaszkorú beteggel is számolhatunk. A cukorbetegség növekedésének ütemét jól mutató szám szerint a Földön minden 10. másodpercben két embernél jelentkezik a kór [5]. Becslések szerint világszerte a diabeteses betegek 50%-a nem tud betegségéről, néhány országban ez az arány akár 80%-ra is rúghat [12]. Az Amerikai Egyesült Államokban – annak bevándorló ország, „népek olvasztótégelye” múltjából eredően – jól összehasonlítható, az azonos területen, országban élő, de különböző népcsoportokra és etnikumokra jellemző diabetes gyakoriság. A Centers for Disease Control and Prevention (CDC) által 2005-ben publikált, az Amerikai Egyesült Államok teljes lakosságára vonatkozó Nemzeti Diabetes Tényanyag (National Diabetes Fact Sheet) szerint 2005-ben az USA-ban a 20 évesnél idősebb lakosságból 20,6 millió fő volt cukorbeteg, ez a korcsoport tagjainak 9,6%-a, míg a 60 év feletti, idősebb korcsoportot vizsgálva a korcsoport 20,9%-a (10,3 millió fő) beteg. A különböző népcsoportok közti diabetes prevalencia a fehérbőrű lakosság körében volt a legalacsonyabb: 8,7%, ami 13,1 millió főt jelentett. A feketebőrű lakosság 13,3%-a (3,2 millió fő), míg a latin/hispán népességben a mexikói származásúakat vizsgálva 9,5% (2,5 millió fő) volt cukorbeteg. Az USA déli államaiban élő amerikai indiánok a diabetes által leginkább fenyegetett amerikai népességcsoport: körükben 26,7-27,6%-os diabetes prevalenciát becsült az Indian Health Service (IHS). Az amerikai őslakosság másik csoportjában, az alaszkai inuit (eszkimó) népességben a cukorbetegség sokkal ritkább: 8,1%. Az Amerikában élő ázsiai és csendes-óceáni szigeteki eredetű népességről nem történtek számszerű femérések cukorbetegség tekintetében, de náluk is a fehérbőrű lakosságénál 1,2-2-szer nagyobb prevalenciákat becsültek [13]. A cukorbetegség kórképhez köthető továbbá a csökkent glükóz-tolerancia (Impaired Glucose Tolerance, IGT) jelensége is. Az IGT a normális szénhidrát-anyagcsere megváltozásával jellemezhető kóros, de még nem cukorbeteg állapot, mikor az éhgyomri vércukorszint normális, viszont az étkezés utáni vércukorszint magasabb, mint az egészséges. Ez terheléses vércukor vizsgálattal mutatható ki. Továbbá magas vér-inzulinszint is jellemzi ezt az állapotot. Az IGT-t mutató egyéneknek szignifikánsan
13
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
magasabb a kockázata 2-es típusú diabetes kifejlődésére. A Nemzetközi Diabetes Szövetség (IDF) becslése szerint 2007-ben a világ felnőtt lakosságának 7,5%-a, azaz 308 millió fő mutatott károsodott glükóz toleranciát, mely az előrejelzések szerint 2025re 418 millióra, a felnőtt lakosság 8,1%-ára fog emelkedni (2. ábra). A már idézett WHO-elemzés hazánkban jelenleg 4,4%-os diabetes prevalenciát ad meg. 107 ezer férfi és 233 ezer nőbeteggel számol, a felnőtt lakosság számát 7 millió
2. ábra Az IGT prevalenciája világszerte 2007-ben és 2025-ben az IDF becslése alapján
14
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
515 ezerben adva meg. A közlemény 2025-re 7 millió 141 ezer felnőtt lakost prognosztizál, 4,9%-os diabetes prevalenciával [9]. Magyarországon a Központi Statisztikai Hivatal 1983-ban – utoljára – közzétett diabetes-morbiditási adata szerint 2,1% volt a cukorbetegek aránya. A regiszterrel, jó gondozóhálózattal rendelkező Békés és Tolna megye adatait elemezve 1990-ben 665 610 lakosra vonatkoztatva 4,54% volt az ismert cukorbetegek aránya. Ezen adatokból extrapolálva hazánkban 468 769 diabeteses beteget lehet feltételezni [14]. 1991-ben Budapesten öt kerületben kérdőíves módszerrel kapott adatok alapján 380 267 lakosból 16 482 cukorbeteget tartottak nyilván családorvosaik, amely 4,3%-os becsült prevalenciát jelent [15]. A diabetes mellitus nagy népegészségügyi fontossága miatt a cukorbetegséggel kapcsolatos kutatásokkal szemben támasztott igények folytán a megelőzés mellett annak jelentős területeit alkotják a betegség ill. szövődményeinek korai felismerésének lehetőségei, valamint a betegség időbeli és térbeli, populációk közti összehasonlítását is lehetővé tevő objektív kvantifikálhatóság. A világon és ezen belül hazánkban is növekvő számú cukorbetegek gondozásának, kezelésének alapkérdése a specifikus diabeteses szövődmények megelőzése, felismerése és kezelése. Speciális diabeteses microangiopathiás szövődmény a retino-, nephro- és neuropathia. A diabeteses retinopathia a világ legtöbb országában a vakság egyik fő oka. Az IDF adatai szerint a diabeteses retinopathia a fejlett országok munkaképes korú (20-65 éves) lakosságának látásvesztésének vezető oka [5]. Az USA-ra vonatkozó adatok szerint az országban a XX. század második felében a 20 év feletti lakosság vakságának okaként első helyen áll [16-18]. A Nemzetközi Diabetes Szövetség (International Diabetes Federation, IDF) becslése szerint világszerte több, mint 2,5 millió beteg szenved diabeteses retinopathiában [5]. Az Amerikai Diabetes Társaság (American Diabetes Association, ADA) adatai szerint diabeteses retinopathia miatt évente az Amerikai Egyesült Államokban 12 000 – 24 000 ember vakul meg, így a cukorbetegség az újonnan felfedezett vakság vezető oka a 20-74 éves népességben [19].
15
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
A cukorbetegek szemészeti szűrésének fontosságát támasztja alá továbbá, hogy a diabeteses retinopathia időben történő felismerése és lézerkezelése a súlyos látáskárosodás kifejlődésének valószínűségét 50-60%-kal csökkenti [19]. Megbízható, a diabeteses retinopathiára vonatkozó epidemiológiai adatokat az ún. Wisconsin-tanulmányból ismerünk [20, 21]. Eszerint a cukorbetegség 30 évi fennállása után csaknem minden betegben kialakul a retinopathia diabetica valamelyik formája. A cukorbetegség okozta vakság első vagy második helyen áll hazánkban is a megyei vaksági statisztikákban. Országosan mintegy 32-36 ezerre tehető a retinopathia diabetica miatt erősen csökkentlátók száma [22]. Schneider és Süveges 2004-ben felmérte a retinopathia diabetica epidemiológiai jellemzőit Magyarországon. 66 493 gondozott cukorbeteg összesített adatai alapján megállapították, hogy 23,5%-uk 1-es típusú, míg 65,4%-uk 2-es típusú diabetesben szenvedett (a többi beteg diabetes típusáról nem kaptak adatot). A gondozott betegek 7,27%-a vakult meg retinopathia diabetica miatt [23]. Németh és mtsai 2005-ben elemezték az 1996 és 2000 közötti vaksági okokat hazánkban. Magyarországon a vakság kalkulált incidenciáját 100 ezer lakosra vonatkoztatva 59,1-nek találták, azaz hazánkban évente mintegy 6 ezer új vak személyre kell számítanunk. Vizsgálatuk szerint a diabeteses retinopathia a teljes lakosság körében a vakság második leggyakoribb oka (esetek 15,6%-a), különösen sok áldozatot követelve a 40-60 és a 60-80 éves korcsoportokban [24]. A cukorbetegek jelentős hányadánál a betegség következtében kialakuló látásvesztés az esetek túlnyomó részében, 90-95%-ában megfelelő diabetes-gondozással és kellő időben elvégzett retinális lézeres fotokoagulációs kezelés elvégzésével megelőzhető lenne, míg a betegség előrehaladott állapotáig jutva a károsodás már visszafordíthatatlanná válik. Németh és mtsai javasolják, hogy a hangsúlyt a prevencióra és a rendszeres szemészeti ellenőrzésre kell(ene) helyezni [24]. A diabetes mellitus az egész szervezetet, így a szemet is érinti. A diabetológiai és a szemészeti gyakorlatban egyaránt a látást közvetlenül és irreverzibilisen veszélyeztető szövődmény, a retinopathia diabetica a legfontosabb kórkép, általában a figyelmünket erre fordítjuk. A cukorbetegség microvasculáris ill. neuropathiás szövőményei azonban a szemgolyó összes szövetét érintik. A szaruhártya cukorbetegség okozta érintettsége ugyan régóta ismeretes, de a diabeteses keratopathia jelentősége, - részben, mint önálló
16
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
kórkép, részben, mint az alapbetegség prognosztikai markere, - az utóbbi években került előtérbe. Felmerült a diabeteses keratopathia jelentősége a betegség korai felismerésében, illetve
a
betegség
és
bizonyos
szövődményei
progressziójának
objektív
kvantifikálhatóságában. Így a diabeteses keratopathia egyre szélesebb körben vizsgált kórképpé vált a klinikai orvostudományban [25-41], és a hozzá kapcsolódó alapkutatásban [42-61] mind világszerte, mind pedig hazánkban [62-65]. A nemzetközi szakirodalomban az utóbbi időben számos vizsgálat irányult a diabeteses keratopathia és a cukorbetegség által okozott egyéb szemészeti vagy szisztémás eltérések, elváltozások összefüggéseire [29, 30, 43-47]. A nem-diabeteses és a diabeteses népesség körében is egyre több olyan szemészeti – műtéti és optikai – beavatkozást végzünk, melyek a szaruhártyát érintik: kontaktlencseviselés, szürkehályogműtét során corneális sebkészítés, refraktív műtétek, szaruhártyaátültetés. Ám a diabeseses betegek diabeteses keratopathiában is szenvednek, melyet csökkent cornea érzékenység, elhúzódóbb cornealis sebgyógyulás, gyakoribb persistaló és recidiváló szaruhártya erosiók, ulcusok jellemeznek. Az in vivo konfokális corneamikroszkópia segítségével hozzájárulhatunk a diabeteses keratopathia hátterének, részjelenségeinek megismeréséhez, progressziójának követéséhez,
a
terápiás
próbálkozások
hatásosságának
és
hatékonyságának
értékeléséhez, valamint jövőbeni klinikai jelentősége a diabeteses népességben szükségessé váló, a szaruhártyát érintő beavatkozások előtti prognosztikai vizsgálatok elvégzése.
17
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2. A diabeteses szaruhártya-elváltozások klinikai jelentősége A diabetes a szaruhártya összes struktúrájára hatással van. Áttekintjük ezeket a hatásokat és ezek klinikai hatását, terápiás és sebészi összefüggéseit.
2.1. A cornea epithelium diabetes mellitusban A cornea epithelium morfológiai változásai diabetesben Diabetesesek cornea epithelium sejtjei sok morfológiai változást mutatnak. Ide tartoznak az epithelsejtréteg számbeli változása, a sejtszám csökkenése, szektorszerű elvékonyodása, bullák, pleomorphismus, polymegetismus, superficiális debris, a sötét/világos sejtek arányának eltolódása, mucoid anyag incorporálódása a sejtekbe, intracelluláris perinucleáris granuláris área megjelenése [66, 67]. Diabeteses aphakiás betegeken gyenge sejtdifferenciálódást, a felületi sejtek mikrovillusainak szabálytalan eloszlását és sorvadását, valamint nagyszámú tonofilamentumok megjelenést írták le [66-68].
Az epithelialis basalmembrán változásai A cukorbetegség a felgyorsult öregedés egy formájának tekinthető, megnövekedett sejtmegújulási aránnyal és ennek melléktermékeinek felhalmozódásával. Ennek következményeként a diabeteses corneákban gyakran lehet megfigyelni a basalmembrán abnormalitásait, mint például az epithelium basalmembránjának megvastagodását, a rétegek multiplicitását és folytonossághiányait [67, 69-73]. Fukushi és mtsai kísérletesen a basalis sejtekben glikogén felhalmozódását figyelték meg, mely elősegítette a basalmembrán károsodását és másodlagosan a stroma elülső részében a glikogén és glikogénszerű részecskék összecsapzódását [72]. Inzulinantiinzulin
immunkomplex
depozitumokat
is
leírtak
diabetesesek
epithelium
basalmembránjában [74, 75]. Diabeteses szaruhártyákban további basalmembránbeli eltéréseket is megfigyeltek: a IV típusú kollagén felszaporodását és megnövekedett glikozilációját, a fibronectin felszaporodását, az extracelluláris mátrix szintézis abnormális szabályozását, a laminin és heparanszulfát csökkenését [69, 76-79].
18
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Az epithelium tapadása és a gyógyulási ráta A basalmembrán komplex (lehorgonyzó fibrillumok, lehorgonyzó plakkok, basalis laminák és hemidesmosomák, melyek fontosak az epithelium és a basalmembrán normális tapadásához az alatta lévő stromához) különböző abnormalitásait figyelték meg diabeteses szaruhártyákban [80, 81]. Ilyenek a ritka hemidesmosomális tapadások, a hemidesmosomális réteg egyenetlensége, a basalis plasmalemma hosszúságának csökkenése, a hemidesmosomális tapadások alakjának különbözősége, a lehorgonyzó fibrillumok eloszlásának abnormalitása, a lehorgonyzó fibrillumok Bowman rétegbe való penetrálása [67, 69, 80-82]. Ezek a rendellenességek általában gyengítik a cornea epithelium tapadását és ronthatják a szaruhártya behámosodását [73, 82]. Ha az epitheliumot eltávolítják pars plana vitrectomia (PPV) során és vele együtt eltávolításra kerül a kóros diabeteses basalmembrán, elhúzódó postoperativ hámosodásra kell számítani [83, 84]. A basalmembrán szerepe a szaruhártya epithelium sebgyógyulásában igen fontos. Khodadoust és mtsai megfigyelték, hogy ép basalmembrán megléte esetén a reepithelizáció után már 2-3 nappal kialakul a szoros tapadás. Amennyiben viszont a basalmemrán eltávolítása miatt azt újra kell szintetizálni, ez a folyamat 6 hétig is elhúzódhat
[85].
Különböző,
diabeteses
állatokon
(patkány,
nyúl)
végzett
vizsgálatokban a diabeteses szaruhártyák behámosodási folyamatát az egészségeshez képest megváltozottnak találták, különböző tanulmányok szerint lehetett gyorsult vagy ellenkezőleg, elhúzódó, ez utóbbi magasabb vércukorszint esetén volt megfigyelhető [72, 86-89].
Az epithelium barrier funkciója Az epithelium barrier funkciója is megváltozhat diabetesben [73]. A cornea epithelium apicalisan elhelyezkedő zonula occludensei a víz és ionok számára diffúziós barrierként szolgálnak, ez kb. fele az egész szaruhártyában található barrierfunkciónak [90]. Stolwijk és mtsai megfigyelték, hogy a diabeteses corneák fluorescein permeabilitása helyi érzéstelenítés után szignifikánsan fokozódott, ezért javasolják cukorbetegeknél a helyi érzéstelenítő csepp –főleg ha benzalkonium-klorid tartalmú – használatának mérséklését [91]. Göbbels és mtsai meghatározták, hogy a cornea epithelialis permeabilitása átlagosan 5,43-szorosára növekedett diabeteses retinopathiás
19
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
betegeknél egészségesekéhez képest. Szoros korreláció volt az epitheliális permeabilitás és a diabetes fennállása valamint a retinális non-perfusiós területek megléte között [90].
A diabeteses szaruhártyahám-elváltozások klinikai manifesztációja A diabeteses corneális keratopathia jelentkezhet elsődlegesen (primér) vagy másodlagosan (secunder) valamilyen, a szövetet ért stresszhatás következtében. A primér diabeteses keratopathia klinikai megjelenési formáit az 1. táblázat tartalmazza. Schultz és mtsai kimutatták, hogy a cukorbetegek 47-64%-ának élete során előfordul valamilyen primér corneális epithel lézió [92]. Saini
és
Khandalavia
cukorbetegekben
a
szaruhártya
epithelium
fragilitásának/törékenységének jelentős, nem-proliferatív diabeteses retinopathiában szenvedő betegeknél 41%-os, míg proliferatív diabeteses retinopathiában szenvedőknél 84%-os növekedését figyelte meg, az egészségesekre jellemzőhöz képest [93]. Ez alapján javasolták, hogy a szaruhártya epithelium fragilitásának mértéke alkalmas
1. táblázat A primér diabeteses keratopathia klinikai megjelenési formái. (Sanchez-Thorin táblázata alapján módosítva) [73]
Epitheliális manifesztáció
elhúzódó hámosodás perzisztáló hámhiány recidiváló epitheliális erosio ulcus corneae keratopathia punctata superficialis keratitis filamentosa epitheliális fragilitás mikrocisztás oedema száraz szem szindróma csökkent szaruhártya érzékenység
Descemet-membrán manifesztáció
redők (Waite-Beetham vonalak)
Endothel manifesztáció
pigmentkiszórás cornea guttata „kalapált ezüst kinézet”
20
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
módszer lehet a diabeteses retinoapthia észlelésére és progressziójának követésére [93]. Már régóta ismert, hogy a cukorbetegek szaruhártyája, különösen az epitheliuma nagyobb kockázatú a szemészeti műtétek alatt és után is az egészséges populációéhoz képest [94-98]. A pars plana vitrectomia (PPV) műtétek után a cukorbetegek szaruhártyáin fellépő komplikációk csoportja külön nevet is kapott a szakirodalomban: diabeteses postvitrectomiás keratopathia. A PPV műtétek után fellépő szaruhártyakomplikációk hátterében különböző tanulmányok 83-100%-ban valószínűsítették a diabeteses etiológiát [94, 97, 98]. Ha az elvégzett PPV műtétek számára vetítjük a fellépő diabeteses postvitrectomiás keratopathia arányát, a legrégebbi tanulmányok 1565%-ot írtak [94, 97-99], és a későbbiek már csak kevesebb, mint 6%-os gyakoriságról számoltak be [100-102], feltehetőleg a korszerűbb alkalmazott műtéti technika miatt. A diabeteses postvitrectomiás keratopathia leggyakoribb megjelenési formái az elhúzódó hámosodás és a perzisztáló hámdefektusok [96, 98]. Snip és mtsai arról számoltak be, hogy ha PPV műtét közben a jobb láthatóság céljából szükségessé vált a szaruhártyahám eltávolítása, a műtétet követően a diabeteses betegek corneájának behámosodási folyamata hasonlóan zajlott, mint penetráló keratoplastica (PKP) után a donor korongjának a recipiens általi behámosodása [103].
2.2. Diabeteses corneális neuropathia A hosszan fennálló cukorbetegség leggyakoribb komplikációja a diabeteses polyneuropathia, melynek szemészeti manifesztációi a diabeteses corneális neuropathia és a trigeminus paraestesiák [92, 104-111].
Morfológiai változások Ishida és mtsai [112] és Rao [67] állatkísérleteik szövettani vizsgálatai alapján leírta diabeteseknék
a
Schwann
sejtek
basalis
laminájának
megvastagodását
és
elvékonyodását, az idegeken elhelyezkedő gyöngyfüzérszerű megvastagodások (beading) mintájának irreguláris eloszlását, és a nem myelinhüvelyes corneális idegek helyenkénti axonális degenerációját. Ezek a kutatók azt a következtetést vonták le, hogy mivel a diabeteses neuropathia korai manifesztációi megjelenhetnek a nem myelinizált cornea idegrostokon, és a szaruhárya avasculáris szövet voltát kihasználva, ezáltal a
21
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
diabeteses cornea mintegy modellként szolgálhat a diabeteses neuropathia vascularis eredetű hatásokkal összefüggésben nem levő megfigyelésére.
Funkcionális változások és klinikai összefüggései A diabeteses corneális neuropathia első jele a csökkent szaruhártya-érzékenység. Először Scullica és Proto [113] írták le, javasolták a diabetes nyomonkövetési technikájának a cornea aesthesiometert [114]. Számos közlemény számolt be a csökkent érzékenységről diabeteses populációban, 18-83%-os előfordulási gyakorisággal [28, 29, 38, 67, 104, 106, 107, 115]. A corneális hypaesthesia összefügg a korral, a betegség időtartamával, és a kezeletlen proliferatív retinopathiával [67, 112]. Érdekes módon, leírtak hosszan fennálló diabetes esetén normális corneaérzékenységet is [116-118]. Rogell fordított összefüggést talált a szaruhártya-érzékenység és a diabeteses retinopathia súlyossága között. Rogell tanulmányában javasolja, hogy a szaruhártyaérzékenység vizsgálatát a diabeteses retinopathia szűrővizsgálatára lehetne használni: az általa javasolt módszer szenzitivitása 88,9%, specificitása 77,8%, pozitív és negatív prediktív értéke 63,3% [73, 119].
2.3. A szaruhártya stroma diabetesben Herse kísérletében nem talált különbséget a normális és a diabeteses cornea stroma korong száraz súlya között. Ez alapján arra következtetett, hogy a diabeteses állatokban ismert megnövekedett szaruhártya-vastagság oka nem magának a stroma szövetének a felszaporodása, hanem a stroma fokozott víz imbibiciója, oedemája [120].
2.4. A Descemet-membrán diabetesben Waite és Beetham 1935-ben a New England Journal of Medicine szaklapban publikált tanulmányában a cukorbetegek szaruhártyáiban a Descemet-membránon megjelenő jellegzetes redőket írtak le, és megfigyelték, hogy ezek gyakorisága az életkor előrehaladtával növekszik [121]. Mocan és munkatársai in vivo konfokális mikroszkópia alkalmazásával élőben is megfigyelték ezen vonalakat [37] Henkind és Wise összefüggést találtak ezek redők megjelenése és proliferatív retinopathia megléte között [122]. Busted és munkatársai szerint a redők a megnövekedett szaruhártya hidráció miatt másodlagosan jelennek meg [123].
22
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Shetlar és mtsai transzmissziós elektronmikroszkópiával összehasonlították a Descemet-membrán vastagságát diabeteses és hasonló korú egészséges szaruhártyákon [124]. A módszerüknél a legkisebb kimutatható különbséget (MDD) 2,7%-nak becsülték, s emellett nem találtak szignifikáns vastagságbeli eltérést [124]. Megfigyeltek viszont a diabeteses szaruhártyák hátsó részében elhelyezkedő, abnormális, szalagszerű anyag lerakódását, melyhez hasonlóakat Fuchs dystrophiában és aphakiás bullosus keratopathiában írtak le [81, 124-127].
2.5. A cornea endothelium diabetesben Endothelsejt morfológia diabeteses corneában Az
endothelsejtek
hexagonalitásának
csökkenése
az
elégtelen
sejttérfogat
szabályozásnak jele. Ennek hátterében a cytoskeleton abnormalitásai állnak. Az F-aktin, mely a sejtbeli cytoskeleton fontos alkotórésze, és kulcsszerepe van az endothelsejtek alakjának és barrier funkciójának fenntartásában. Kim és munkatársai diabeteses endothelsejtekben kóros elhelyezkedésű F-aktin fibrillumokat írtak le a citoplazmában. Feltételezik, hogy ezek gátolják meg a sejtruptúrát, melyet a krónikus szorbitol indukálta ozmotikus stressz idézhetne elő [128]. Az endothelium sejtjeinek esetleges morfológiai változásaival, feltételezett fokozott polymegethismusával és pleomorphismusával is több tanulmány foglalkozott. Krónikusan
hyperglikémiás
diabeteses
kutyákon
és
patkányokon
végzett
állatkísérletekben leírtak fokozott polymegethismust és alacsonyabb pleomorphismust, összefüggésben a vércukorszint kontrolljával [129, 130]. Több tanulmány cukorbeteg embereknél is leírt megnövekedett endotheliális polymegethismust, csökkent pleomorfismust és sejtnagyság- és sejtkerületbeli differenciákat [131-137]. Lass és munkatársai szerint a legjellemzőbb változás diabetesben a sejtek területének változása [137]. További tanulmányok ezeket a változásokat korreláltatták az életkorral és a diabetes fennállásának idejével, így felfedve
és
megerősítve,
inzulindependens
formája
hogy
a
hasonló
diabetes,
különösen
változásokat
okoz,
annak mint
1-es a
típusú,
szaruhártya
endotheliumának öregedési folyamata [137, 138]. A diabetes fennállásának idejével is, és az életkor előrehaladtával ezek a változások összegződnek. Az endothelium ezen
23
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
abnormalitásai felvetik a lehetőségét, hogy a cukorbetegek szaruhártya endotheliuma kisebb endothelsejt-rezervvel rendelkezik, s ezáltal fogékonyabb lehet stressz (pl. trauma) okozta károsodásra [67, 131, 138]. Más vizsgálatok nem találtak az endotheliumban morfológiai eltérést [124, 139, 140], vagy csak 1-es típusú diabetes mellitusban [138]. Hazánkban Módis és mtsai vizsgálták a szaruhártya endotheliumát cukorbetegekben kontakt spekulár mikroszkópiával. Megfigyeléseik szerint a szaruhártya endotheliumát a diabetes mellitus mindkét típusában kóros szerkezetűnek találta: a sejtek átlagos területének és az endothelsejtek variációs koefficiensének (átlagos sejtterület standard deviációja/átlagos sejtterület) növekedését figyelték meg. Vizsgálataikban a cornealis endothelium sejtsűrűsége (sejt/mm2) kisebb volt a cukorbetegek szaruhártyájában, mint az egészségesek szemeiben; ez az eltérés 2-es típusú diabetes mellitus esetében szignifikáns volt és az 1-es típusnál is közelített hozzá, azonban nem mutatott szignifikáns különbséget, amikor a két diabetestípust egymással hasonlították össze [63]. Imre és mtsai in vivo konfokális mikroszkópos vizsgálatában a diabeteses szaruhártyák endothelium sejtrétegében fokozott pleomorphismust és polymegethismust figyelt meg, azonban az endothel sejtsűrűségének esetében szignifikáns csökkenést nem tudtak kimutatni [64].
Endothelsejt denzitás Számos
tanulmány
foglalkozott
szövettani
módszerekkel
illetve
spekulár
mikroszkópiával a szaruhártya endothelsejt sűrűségével, azaz denzitásával ill. annak esetleges változásával diabetesben. A legtöbb vizsgálat nem tudott összefüggést megerősíteni diabeteses betegek endotheliális sejt denzitása és a különböző szintű diabeteses retinopathia között, hasonló korú egészséges populációhoz viszonyítva [67, 123, 132, 133, 136-139, 141-143]. Ezzel szemben, más tanulmányokban beszámoltak az endothelsejtszám változásáról, általában kismértékű csökkenéséről cukorbetegekben [63, 131, 134, 135, 144, 145]. A fenti, ellentmondó eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy az endothelsejtszám és változása nem jó kórjelzője a diabeteses anyagcserezavarnak [146].
24
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
3. A szaruhártya beidegzése A szaruhártya az emberi szervezet egyik legdúsabban beidegzett szövete, mind az érző, mind pedig az autonóm idegrendszer felől dús beidegzést kap. Itt a legnagyobb az egységnyi területre eső érzőidegrostok száma [1, 2]. Ez az igen gazdag beidegzés elengedhetetlen az egészséges szemfelszín fenntartásában, trofikus funkciót lát el, fontos a szerepe a szaruhártya külső károsító hatásokkal szembeni védelmében, az epithelium integritásának biztosításában, a sejtproliferáció szabályozásában, a corneális sebgyógyulás és regeneráció elősegítésében [1, 147-149]. Ebben az esetben is érvényesül a struktúra és funkció szoros kapcsolata: a beidegzés jól korrelál a corneaérzékenységgel [38, 40, 150]. A beidegzés eloszlása a szaruhártyán belül sem egyenletes, homogén. A szaruhártyahám középső kétharmada 5-6-szor dúsabban beidegzett, mint a periférián [4]. A szaruhártya idegrostjainak túlnyomó többsége szenzoros, melyek a nervus trigeminus nervus ophthalmicus és maxillaris ágából erednek. A szaruhártya emlősökben szimpatikus beidegzést a ganglion cervicalis superiorból kap, de ennek mértéke fajonként változó, főemlősökben, köztük az emberben is, igen csekély számú. Paraszimpatikus beidegzés a ganglion ciliareból ered, megléte patkány és macska szaruhártyában bizonyított, de emberben csupán feltételezhető, eddig nem bizonyított [1]. A szaruhártya idegek (kb. 60–80 idegrostköteg) a limbusban körben a stroma középső rétegében lépnek be a szaruhártyába, a cornea felszínével párhuzamosan, és a szaruhártya centruma felé fordulnak. Az idegrostkötegek a limbustól kb. 1 mm-re elvesztik myelin-hüvelyüket, és innentől csak Schwann-sejtek burkolják őket. A myelin-hüvely elvesztése elengedhetetlen a szaruhártya átlátszóságának fenntartásához. Ezután a stromalis idegek kisebb idegkötegekre bomolva a szaruhártya állomány elülső harmadát előre ferdén átszelve haladnak a szaruhártya felszíne felé. A Bowmanmembránt áttörve, ismét a szaruhártya felszínével párhuzamos irányba fordulva fonatot képeznek: a basalis epithelialis sejtek rétege és a Bowman-membrán között alkotják a subbasalis
idegplexust
(subbasal
nerve
plexus,
SBN),
mely
egyenes
és
gyöngyfüzérszerű (beaded) idegrostok keveréke [1, 151, 152]. Egyes szerzők
25
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
megkülönböztetnek subepithelialis plexust is, mely a Bowman-membrán előtt helyezkedik el, de ez valószínűleg csak foltokban van jelen, és a szaruhártya centrumában nem is figyelték meg [153-155]. A szaruhártya epitheliuma közvetlenül a subbasalis plexusból kapja a beidegzését. A subbasalis idegplexusban az idegrostkötegek kisebb kötegekre ill. idegrostokra ágaznak, majd ismét irányt váltanak, és az egyes idegrostok a szaruhártya felszíne felé fordulnak, a basalis epithelialis sejtek között előrehaladva törnek a felszín felé, ahol a superficialis epitheliais sejtek között végződnek (3. ábra) [1, 3, 151, 156]. A subbasalis plexusban az egyes idegrostok átmérője 0,05 és 2,5 μm közötti, többségükben 0,1-0,5 μm méretűek [1, 157]. A gyöngyfüzérszerű idegrostokon a kitüremkedések („gyöngyök”, „beads”) lokális axon megvastagodások, melyek
3. ábra A szaruhártya epthelium beidegzésének sémás rajza Müller szerint [1, 4]
26
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
nagyszámú mitokrondriumot tartalmaznak, és ultrastukturális képen más szövetekben található nociceptor idegvégződésekhez hasonlóak [1]. Becslések szerint a superficiális epithelialis rétegben kb. 7 000 [1] – 16 000 [3] érzőidegvégződés található négyzetmilliméterenként. Összehasonlításként a corneális beidegzés 20-40-szerese a fog pulpáénak és 300-600-szorosa a bőrének [4]. A szaruhártya beidegzésének feltérképezése már régóta foglalkoztatja a kutatókat. Kezdetben nem álltak rendelkezésre in vivo vizsgálati módszerek. Cadaverból vagy enulkeált szemekből származó szaruhártyán szövettani feldolgozás és aranyklorid-, acetilkolinészteráz-
vagy
immunohisztokémiai
festés
után
fény-
illetve
elektronmikroszkóp alkalmazásával történtek vizsgálatok [1, 4, 151, 152, 156, 158167]. Azonban ezért ezek közös hátrányai a szövettani feldolgozásból eredő műtermékek keletkezése, illetve a post mortem vagy ex vivo fellépő idegdegeneráció. Müller elegáns transzmissziós elektronmikroszkópos tanulmányában bizonyította, hogy emberi cadaver szemben a subbasalis idegrostréteg a halál után 13,5 órával már jelentős degenerációt mutat [4]. A szaruhártya beidegzésnek vizsgálatát a konfokális mikroszkópia megjelenése forradalmasította. Az új eljárás megnyitotta a régóta várt lehetőség, a beidegzés in vivo vizsgálata előtt az utat. Ekkor láthattunk először subbasalis idegplexust élő, egészséges szaruhártyában. Az in vivo konfokális mikroszkópia hamarosan széleskörben használt eszközzé vált az egészséges cornealis beidegzés feltérképezésében és különféle kórállapotok vizsgálatában is [3, 41, 149, 150, 153, 155, 168-174]. Az évek során Müller és mtsai a szaruhártyaidegek megoszlására több elméleti modellt és sémát alkottak, a kornak megfelelő irodalmi és vizsgálati adatok alapján. A fény- és elektronmikroszkópos, az immunhisztokémiai, valamint az in vivo konfokális mikroszkópos vizsgálatokból szerzett ismeretek összegzése alapján a szaruhártya középső 5-6 mm átmérőjű korongjára vonatkozóan a szaruhárya csúcsán (apex) a subbasalis idegrostköteg orientációja elsősorban superior-inferior irányú, míg perifériásabban nasalis-temporalis irányban futnak (4. ábra) [1].
27
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
4. ábra A szaruhártya beidegzésének sémás rajza Müller szerint [1]
A szaruhártyaidegek két- és háromdimenziós struktúrájának további vizsgálatában két, Guthoff és McGhee professzorok vezette kutatócsoport jeleskedett, ebben az alkalmazott laser-scanning konfokális mikroszkóp segítette őket [3, 150, 155, 172, 173]. Patel és mtsai három egészséges szemet vizsgálva megalkották az emberi szaruhártya subbasalis idegplexusának kétdimenziós térképét. Mindhárom vizsgált személyben az óramutató járásának megfelelő irányú, örvényszerű idegrostmintázatot írtak le, a szaruhártya csúcsa (apex) alatt 1-2 mm-rel található központtal [150]. További vizsgálatukban egy vizsgált személy szaruhártyájának hat hetes követéses vizsgálatában bebizonyították, hogy a subbasalis idegrostréteg nem állandó, hanem dinamikusan változó struktúra. Az örvényszerű elrendezés centripetalis irányban mozog az óramutató járásának megfelelően [172]. Az életkor nem befolyásolja a subbasalis plexus morfológiáját [175]. Az életkor hatása az idegrostok számára ellentmondásos, azonos munkacsoporton belüli két különböző tanulmány szerint az életkor növekedésével az egységnyi területre jutó idegrostsűrűség nem változik [176] illetve csökken [177].
28
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
4. Cornea idegek diabetes mellitusban, perifériás neuropathia A diabetes prevalenciája drámai növekedést mutat világszerte, ezzel összefüggésben a diabetes okozta krónikus szövődmények gyakorisága várhatóan növekedni fog a közeljövőben [178]. A diabeteses betegek krónikus munkaképtelenségének leggyakoribb oka a diabeteses neuropathia, különösen a perifériás diabeteses neuropathia. A perifériás diabeteses neuropathia a betegek 50%-át érinti a diagnózis felállítása utáni 25 éven belül [179]. Az Amerikai Diabetes Társaság (American Diabetes Association, ADA) legfrissebb adatai szerint a cukorbetegek 60-70%-a szenved az idegrendszer enyhébb vagy súlyosabb károsodásától. Ennek következtében jellemző az érzészavar, ill. a fájdalomérzet károsodása különösen a lábakban és kezekben, a gyomorban meglassult emésztés, carpal tunnel szindróma és egyéb ideggyógyászati problémák [19]. A hosszan fennálló, fel nem ismert és/vagy kezeletlen perifériás diabeteses neuropathia nem gyógyuló lábfertőzésekhez, fekélyekhez vezethet. A betegek lábujjait, lábát amputálni kell, mely jelentős életminőségromláshoz, munkaképtelenséghez vezet, és megnöveli a mortalitást is [180]. A perifériás diabeteses neuropathia korai és pontos diagnosztizálása és kvantifikálása nagyon fontos valamennyi veszélyeztetett betegnél, csökkentve ezáltal a morbiditást és lehetővé téve a megfelelő kezelést [181]. A perifériás diabeteses neuropathia a klinikumban gyakran nem kerül diagnosztizálásra vagy csak késői stádiumban kerül felismerésre, mivel a perifériás diabeteses neuropathia korai felismerésére szolgáló egyszerű, non-invazív vizsgáló módszer jelenleg nem ismeretes [35, 182, 183]. A perifériás neuropathia általában már csak akkor kerül felfedezésre, amikor már előrehaladott klinikai tünetek keletkeznek. Korai diagnózisra jelenleg elektrofiziológiai vizsgálatok [35] illetve újabban bőr-biopszia használatos [184-186]. Az elektrofiziológiai vizsgálatok azonban nem tudják kimutatni a finom, apró idegrost károsodást, mely a diabeteses neuropathia alapját képezik. A bőrbiopsziával ki lehet mutatni a finom elváltozásokat, egyes idegrostok lézióját, de a módszer hátránya annak invazivitása. Mint már említettük, a szaruhártya az emberi szervezet legsűrűbben innervált szövete [1, 3, 151]. A szaruhártya beidegzésének – ezen belül különösen a subbasalis idegrostrétegnek – kvalitatív és kvantitatív vizsgálata a nem invazív in vivo konfokális mikroszkópia segítségével ideális módszernek tűnik az idegrostok pathológiájának korai felismerésére diabeteses betegeknél [25, 32, 35].
29
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
5. A szaruhártya autofluoreszcenciája (cornealis autofluoreszcencia, CAF) A cornea autofluoreszcenciájának mérése és változása a szaruhártya-metabolizmus különböző kórállapotok miatt fellépő megváltozásának érzékeny indikátora [187, 188]. Van Best kutatócsoportja és nyomunkban más szerzők kimutatták, hogy a corneális autofluoreszcencia (CAF) diabeteses betegek szaruhártyájában magasabb, mint egészséges kontrollszemélyekében [42-46, 65, 189-191]. Az eltérés a diabeteses retinopathia súlyosságával korrelál [46, 132, 138, 190, 192, 193], s a szaruhártya autofluoreszcenciájának emelkedése kb. 6 hónappal megelőzi a diabeteses retinopathia progresszióját [46]. Megfigyelték továbbá, hogy inzulindependens diabetes mellitusban a corneális autofluoreszcencia fordítottan arányos a corneális endotheliumban a hexagonális sejtek arányával [132]. A CAF cukorbetegekben megfigyelt emelkedésének hátterében feltehetőleg az késői glikációs végtermékek (advanced glycation end products, AGE), a mitochondriális anyagcsere károsodás következményeként a fluoroforok, a fluoreszcens proteinek (flavoproteinek és piridin nukleotidok) stromális felhalmozódása áll [45, 65, 132, 188, 192, 194]. A CAF előnye, hogy nem invazív módon, nagyon rövid idő – pár perc – alatt mérhető, és emelkedése prediktív a mérést követő egy évben esetleg szükségessé váló retinális lézerkezelésre [43, 46].
30
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
6. In vivo konfokális corneamikroszkópia Az in vivo konfokális corneamikroszkópia in vivo, valós idejű és nem-invazív módszer
a
cornea
szerkezetének
és
sejtrétegeinek
vizsgálatára.
Az
eljárás
nagyfelbontású, sejtszintű képet biztosít a szaruhártya tetszőleges igen vékony szeletéről, megengedve a bennefoglalt struktúrák elemzését in vivo, anélkül, hogy hagyományos szövettani eljárások alkalmazására kényszerülnénk. Így a módszer folyamatok követésére is alkalmas, mivel a vizsgálat szükség esetén tetszőleges számban megismételhető [2, 195-204]. Napjainkra a szaruhártya in vivo konfokális mikroszkópos vizsgálata széleskörben használt és jelentős eszközzé vált a mindennapi szemészeti klinikai gyakorlatban és a kutatásban. Az in vivo konfokális corneamikroszkópia segítségével hozzájárulhatunk a diabeteses keratopathia hátterének, részjelenségeinek megismeréséhez, progressziójának követéséhez,
a
terápiás
próbálkozások
hatásosságának
és
hatékonyságának
értékeléséhez, valamint jövőbeni klinikai jelentősége a diabeteses népességben szükségessé váló, a szaruhártyát érintő beavatkozások előtti prognosztikai vizsgálatok elvégzése. A konfokális corneamikroszkópia az ún. konfokális elven alapul. Mivel a konfokális mikroszkópban a megvilágítás (kondenzor) és az obszerváció (objektív) fókuszpontja egybeesik, csak a fókuszközeli tetszőlegesen kicsi térfogatban lévő struktúrákról visszavert fény alkot képet, mert a közös fókuszponton kívüli objektumokról visszaverődő fény szóródik. A konfokális módszer ezen képessége, hogy csak a fókuszsíkból érkező fénysugarak alkossanak képet, a hagyományos fénymikroszkópiánál vagy a rélámpás vizsgálatnál lényegesen nagyobb felbontóképességet tesz lehetővé. Napjaink modern konfokális mikroszkópjaiban a módszer laterális felbontóképessége így akár 1-2 μm, míg axiális felbontóképessége 4-10 μm is lehet [200], a nagyítást akár 600-800-szorosára is növelve [205, 206].
31
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
A konfokális corneamikroszkópia története, fejlődése, típusai Az első konfokális elven alapuló mikroszkópot Marvin Minsky, a Harvard Egyetem fiatal kutatója 1955-ben mutatta be [207]. Az új mikroszkópos technikával készült képek a vizsgált szövet felszínével párhuzamosak, ún. „en face” képek. Az addig ismeretes tradicionális szövettani módszereknél a képek általában a felszínre merőlegesen kerültek vizsgálatra. Továbbá a hagyományos mikroszkópok a vizsgált szövet által visszavert illetve átbocsájtott összes fényt összegyűjtötték, beleértve a vizsgált szövetréteg alatti és feletti összes reflektált fénymennyiséget. Ezek a nem kívánatos fénymennyiségek optikai műtermékeket, zajt eredményeznek, rontva ezzel a vizsgált szövetréteg képminőségét. A Minsky fejlesztette új mikroszkóp, az ún. konfokális mikroszkóp újdonsága és jelentősége, hogy kirekesztette ezeket a műtermékeket. A konfokális mikroszkóp az ún. pinhole (pontszerű nyílás) jelenségen alapul. Minsky két pontszerű lyukat helyezett el, egyet a fényforrás elé, amely fókuszálta a fénysugarat a vizsgálandó szövetbe, a másikat a kamera vagy a szem elé, mely a reflektált fényt fókuszálta képalkotáshoz. Ezt a rendszert úgy kalibrálta, hogy a rendszer kiiktatta a nem kívánt fényreflexeket [168, 195, 207]. A működési elv – azaz, hogy a megvilágítás (kondenzor) és az obszerváció (objektív) fókuszpontja egybeesik – alapján nevezte el Minsky ezt a technikát „konfokálisnak” (5. ábra). Ez
az
új,
ún.
konfokális
technika
éles
képeket
eredményezett
kiváló
kontraszthatással. A Minsky-féle kezdeti konfokális mikroszkóp továbbfejlesztésével született meg a modern konfokális mikroszkóp, ahol a kondenzor helyét fehér fény vagy fókuszált lézerfény vette át, a vizsgáló szemrészét pedig elektronikus digitális detektor [2, 196, 200]. A kiváló képminőség mellett azonban a pontszerű lyukon keresztüli kép nagysága meglehetősen kicsi volt. A kapott képet a minta pásztázásával lehetett növelni, Minsky konfokális mikroszkópja még a vizsgálandó mintát mozgatta. Petran és mtsai kiküszöbölték ezt a hátrányt, 1968-ban kifejlesztve a tandem scanning konfokális mikroszkópia (TSCM) módszerét. Az újítás a Nipkow-lemez felhasználásán alapul, melyet korábban a táviratok kódolására és dekódolására alkalmaztak [208]. Ez a lemez kb. 14 000 (későbbi modellben 64 000) kis, 20-80 μm-es
32
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
5. ábra Konfokális mikroszkópok elve, felépítése: A: TSCM, B: SSCM [200]
lyukat tartalmaz, melyek mindegyike 180º-ra van elforgatva egymáshoz viszonyítva (innen a „tandem” elnevezés), ezáltal egyidejűleg lehetséges a detektor és az illuminátor alkalmazása, így érvényesül a konfokális elv. A 14 000 kis lyuk 40 archimédeszi spirálba van elrendezve, a sok kis lyukon áthaladó fénynyaláb egyidejűleg vizsgálható az X-Y tengely mentén. A 40 szeparált spirál segítségével mindenkor szimultán vizsgálható néhány száz kis lyuk képe. Ha ezt a lemezt folyamatosan elforgatják, a teljes szövet vizsgálható [208]. Ez a gyors szkennelés lehetővé teszi a valós idejű vizsgálatot, mely videószalagon vagy számítógép képernyőn nyomon követhető. A TSCM rendszer hátránya, hogy a Nipkow-lemezen egyidejűleg a megvilágító fény csupán 0,5-1%-a halad át, azaz a kép igen gyenge megvilágításának lekűzdésére nagyon erős fényforrást (xenon vagy higanygőz lámpát) igényel [200, 209]. A Petran-féle kezdeti TSCM-et szalamandrák és békák natív agy- és ganglion sejtjeinek vizsgálatára használták [210]. Közel két évtizednek kellett eltelnie, míg szem szövetet vizsgáltak a módszerrel. 1985-ben Lemp és mtsai ex vivo teljes vastagságú humán corneát, illetve in situ nyúl corneát vizsgáltak [211]. Bár az elmúlt évtizedek során több szemészeti intézményben és tanulmányban használtak TSCM-ot, jelenleg már nem gyártják, és az újabb két elven alapuló eszköz, a scanning-slit konfokális mikroszkóp és a laser scanning konfokális mikroszkóp kiszorította a piacról. A TSCM kifejlesztésével párhuzamosan indult meg az ún. scanning-slit konfokális mikroszkópia (SSCM) fejlődése is. Az elv alapja az 1969-ben megjelent, Svishchev fejlesztette ún. szkennelő kétoldalú tükör konfokális mikroszkóp [212-214], majd ennek továbbfejlesztései a Maurice [215] által és Koester [216, 217] által egymástól
33
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
függetlenül megalkotott mikroszkópok, illetve a való idejű szkennelést lehetővé tévő Masters és Thaer-féle módosítás [214, 218]. A scanning-slit konfokális mikroszkópia a forgó Nipkow-lemez helyett két, egymással szinkronizáltan mozgó, ún. konfokális rést használ. Az egyik rés a fényforrás, a másik a detektor előtt helyezkedik el. Bár a rések elvileg csak egyik irányban pontszerűek, optikai tulajdonságuk miatt használatban gyakorlatilag ennek tekinthetők. A készülék belsejében mozgatható tükörrendszer található. A szkennelés a rések és a tükörrendszer mozgatásával történik [197, 200]. A pontszerű fényforrás helyett rés alkalmazása két előnnyel jár. A SSCM-t jelentősen nagyobb fényerő (light throughput) jellemzi, mint a TSCM-et, így sokkal gyengébb fényforrás (12V-os halogén lámpa) használata is elegendő, és hosszabb ideig tartó vizsgálat is biztonságosan megengedhető [198]. McLaren és mtsai szerint a SSCM alkalmazásával élesebb, kontrasztosabb kép nyerhető, mint TSCM-val, így alacsonyabb kontrasztú szaruhártyarétegek vizsgálata is lehetővé válik [219]. További előny, hogy a módszerrel több pont vizsgálata történik egyidejűleg, a vizsgálat sokkal gyorsabbá, és a szemmozgásokra kevésbé érzékennyé válik. A SSCM-pal másodpercenként 25 mozgástól független kép készíthető [197, 198, 200, 205, 218, 220]. A SSCM kereskedelemben kapható, és kiváló tulajdonságai és felhasználhatósága miatt igen széles körben alkalmazott változata a Tomey cég által gyártott Confoscan P4 mikroszkóp (Tomey, Fortune Technologies, Vigonza, Olaszország és Erlangen, Németország) volt. (Ezen doktori disszertációban szereplő tanulmányainkban ezt a típusú készüléket használtuk.) A későbbiekben a technológiát a Nidek cég vette meg és fejlesztette tovább a Tomey-féle műszert. Jelenleg a Nidek Confoscan 4. generációs készüléke (Nidek Technologies, Tokyo, Japán) van kereskedelmi forgalomban. A különböző elvű in vivo konfokális mikroszkópok családjának legfiatalabb tagja a Heidelberg Retina Tomograph (HRT) Guthoff és munkatársai által továbbfejlesztett módosítása, a Rostock Cornea Modul (RCM), azaz a laser scanning konfokális mikroszkóp (LSCM) (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Németország). A készülék koherens, nagy intenzitású, 670 nm hullámhosszúságú vörös lézerfényt használ, fényforrásként dióda-lézer szolgál. Ez I-es osztályú lézer, azaz a szem szöveteire nézve nem kockázatos az alkalmazása [150]. Maga az ún. Rostock Cornea Modul egy, a HRT-
34
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
II. készülékre szerelhető objektív rendszer. A HRT-RCM rendszer másodpercenként 30 kép készítésére alkalmas, a laterális felbontóképessége 1 µm, axiális felbontóképessége 4 μm, azaz néhány mikrométer vékonyságú optikai szelet vizsgálható. A LSCM rendszer előnye a szélesebb szemészeti felhasználhatósága: míg a SSCM csak a corneát képes vizsgálni, addig a lézer scanning mikroszkóppal a szaruhártyán kívül jól vizsgálható a limbus, a kötőhártya, az ínhártya, a szemhéjak és a könnyfilm is. A LSCM kontrasztosabb képet ad, mint akár az SSCM, akár pedig a TSCM. Hátránya viszont az endothelium vizsgálatánál jelentkezik, melyről sokkal rosszabb minőségű képet ad, valamint kontakt vizsgálati módszernél fogva a szaruhártyát vizsgálat közben lelapítja, ezáltal műtermékeket okozhat [176, 203, 221, 222]. Szaflik tanulmánya, melyben azonos személyek szaruhártyáját vizsgálta egymás után scanning-slit és laser scanning konfokális mikroszkópiával, felhívja a figyelmet, hogy a HRT-RCM alkalmazásával mintegy 30%-kal magasabb sejtszámértékeket kapott, mint akár a SSCM-pal, akár pedig spekulár mikroszkópiával nyert értékek voltak [222]. Jelenleg a szaruhártya vizsgálatához minden konfokális mikroszkóp valamiféle valós vagy virtuális kontakust igényel. A TSCM és a SSCM esetében gél-immerziós objektív használatos, azaz vizsgálatkor az objektív lencse és a szaruhártya között viszkózus gél helyezkedik el. Ennek előnye, hogy vizsgálat közben nem lapítja le a corneát, és ezáltal nem okoz műtermékeket a képen. A LSCM esetében egyszerhasználatos, ún. TomoCap PMMA-műanyag feltét segítségével direkt kontaktusra van szükség. Itt előnyként említhetjük, hogy az egyszerhasználatos feltétek nagyobb sterilitást tesznek lehetővé. Mindkét jelenleg alkalmazott rendszernél vannak kezdeti törekvések teljesen nonkontakt vizsgálatra a könnyfilm vizsgálata céljából [2, 199, 200, 203, 221].
35
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
7. Az egészséges cornea konfokális képe Az egészséges szaruhártya illetve struktúráinak konfokális mikroszkópos képeken való megjelenésének ismerete alapvető jelentőségű, hiszen csak erre a módszerre jellemző jellegzetességei vannak és csak ennek tudatában lehet felismerni a kóros elváltozásokat. A konfokális szaruhártya-mikroszkópia által ábrázolt képek igen speciálisak a többi, hagyományos mikroszkóp által alkotott képhez képest. Míg a szaruhártyáról a hagyományos mikroszkópiával nyert képek a cornea felszínére merőlegesen készültek, a konfokális mikroszkópos képek a coronalis síkban, a szaruhártya felszínével párhuzamosan, ún. „en face” ábrázolják a szövetet. Így konfokális mikroszkópia alkalmazásakor mind a vizsgálónak, mind pedig a konfokális mikroszkópos képeket megtekintő személynek, olvasónak is tisztában kell lennie a speciálisan erre a módszerre jellemző képpel, a szaruhártya struktúráinak és morfológiájának megjelenésével, illetve a módszer alkalmazása során keletkező esetleges artefaktumokkal [199]. Általános elvként elmondható, hogy a konfokális mikroszkópos képalkotás során egy sejtes elem vagy struktúra minél jobban reflektálja, visszaveri a fényt, annál fényesebbnek látszik a képen.
Epithelium Az epithelium vastagságát laser scanning konfokális mikroszkóppal Eckard és mtsai centrálisan 54 ± 7 µm, perifériásan 61 ± 5 µm vastagságúnak mérték [223]. Az epitheliumnak három elkülöníthető rétege van: a basalis epithelialis, a szárnyas vagy wing, és superficialis epithelialis sejtréteg. A basalis epithelialis réteg sejtjei a perilimbális őssejtekből származnak, a szaruhártyába vándorolva alkotják a basalis epithelialis réteget, majd átalakulnak poligonális szárnyassejtekké. Ezen középső réteg sejtjei differenciálódnak tovább a felszínes hámsejtekké. Mindhárom rétegben előfordulhatnak a Langerhans-sejtek, mint nagy, reflektáló dendritikus elemek. Zhivov kimutatta, hogy ezek a Langerhans-sejtek a periférián háromszor sűrűbben találhatók, mint a szaruhártya centrumában [224].
36
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Felszíni vagy superficialis epithelialis sejtek Általában egy vagy két sejtsor vastag réteg, a sejtek laposak, poligonálisak, fehér fény konfokális mikroszkópos képen fényes sejthatárokkal, fényes sejtmaggal [225, 226]. Az epithelium másik két sejttípusánál nagyobbak, leírtak 50 µm nagyságúakat is [223]. Eckard és mtsai laser scanning konfokális mikroszkópos módszerrel az epithel-sejteket fényes cytoplasmájúnak látta sötét magokkal [223]. Mindkét technika az epithel-sejtek nagy variabilitását találta mind nagyságban, mind fényességben. Feltételezik, hogy a fényes sejtek metabolikusan aktív sejtek, míg a sötét sejtek elhalt, desquamálódó epithelialis sejtek [196, 224-227].
Szárnyas- vagy wing-sejtek 2-6 sejtsorból álló, középső réteg, egyforma alakú és méretű poligonális sejtekből áll, melyek cytoplasmája sötét, határa fényes. A basalis epithelialis sejteknél nagyobb méretűek, de kisebbek a felszínieknél [223, 225].
Basalis epithelialis sejtek A basalis epithelialis sejtek 10-15 µm átmérőjűek, hasonló méretűek és alakúak, a Bowman-membrán előtt egy sejtréteget alkotnak. Konfokális mikroszkópos képen ezek a sejtek a fényt viszonylag gyengén reflektálják, a cytoplasmájuk igen alacsony reflektivitású, a magasabb reflektivitású sejthatárok megfigyelhetők [225, 226].
Bowman-membrán A Bowman-membrán egy kb. 12 µm vastag, sejtmentes réteg, mely véletlenszerűen eloszló kollagén-fibrillumokból áll [225]. Konfokális mikroszkópos képen amorf membrán, mely csak az anatómiai határai alapján ismerhető fel, így a magas reflektivitású subbasalis idegrost hálózat segítségével [199, 225]. Kobayashi és mtsai a Bowman-membrán alatt közvetlenül a corneális idegeknél kevésbé reflektív polimorf struktúrákat találtak, melyek 515 µm-nyi fibrilláris szerkezetűek. Feltételezésük szerint ezek a mikroszerkezetek az elülső stroma kollagénjeinek Bowman-membránhoz való kapcsolódásai, és ezek alkotják a szaruhártya elülső mozaikjait [174].
Stroma A szaruhártya stroma keratocytákból, kollagénből és alapszövetből áll. A stroma keratocytái legsűrűbben a Bowman-membrán alatt találhatók. Mustonen és mtsai az elülső stromaréteg keratocytáinak sűrűségét 1058 ± 217 sejt/mm²–nek mérték, ez a szám hátrafelé haladva 771 ± 135 sejt/mm²–re csökken [225]. Patel és mtsai ezt a megfigyelést
37
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
megerősítették [228]. Más szerzők, Berlau és mtsai [229] és a mi munkacsoportunk [26, 227] a legmagasabb keratocyta sűrűséget szintén az elülső stromarétegben mérték, de a legalacsonyabbat nem a stroma hátsó, hanem középső részén. Patel és mtsai vizsgálatuk során leírták, hogy a centrális keratocyták sűrűsége korral évente 0,45%-kal csökken [228]. Ez a lelet hasonló ugyanezen szerzőcsoport korábbi megfigyeléséhez: az endothelsejtszám Bourne és mtsai által észlelt 0,6%-os évenkénti csökkenéséhez [230]. A konfokális mikroszkópos képeken a stromális keratocyták cytoplasmája, a sejthatárok és a kollagén anyag alacsony reflektivitásúak [225]. A keratocyták sejtmagjai ezzel szemben határozott, fényes, hyperreflektív képletekként ábrázolódnak a sötét kollagén mátrixban [225]. Továbbá a keratocytákon kívül a stromában különböző alakú, magas reflektivitású idegrostkötegek is megfigyelhetők ferdén lefutva a kollagénrostok között.
Descemet-membrán A Descemet-membrán a corneális endothelium lamina basalisa, mely az élet folyamán egyre vastagabb lesz: 3-4 µm a születéskor, és felnőttkorban 10-12 µm vastag [231]. Mivel nincsenek sejtek, sejtmagok benne, az alacsony reflektivitás a direkt láthatóságot nem teszi lehetővé konfokális mikroszkópiával, hacsak jelentősebb fibrosis nincs a Descemetmembránban. A Bowman-réteghez hasonlóan, a Descemet-membrán rétege is elkülöníthető a határoló rétegek anatómiája alapján: felismerését a határoló hátsó stromaréteg keratocytái illetve az endothel-sejtek teszik lehetővé [225].
Endothelium Az endothelium sejtjei hexagonális alakú sejtek, számuk egy szaruhártyában kb. 500 000, az átlagos sejtsűrűség 3055 ± 386 sejt/mm² [225]. Ismeretes, hogy ezek a sejtek nem képesek osztódni, a sejtek abszolút száma korral csökken. Bourne tanulmánya arról számol be, hogy a sejtvesztés 10 éven keresztül vizsgálva 0,6 ± 0,5% évente felnőtteknél [230]. Konfokális mikroszkópos képen az endothel-sejtek sejttestjei reflektálnak és ábrázolódnak, közöttük a sejthatárok ill. a sejtmagjuk sötét, nem látható [225]. Ez a kép megegyezik a spekulármikroszkópos képpel.
Corneális beidegzés A szaruhártya – különösképpen az epithelium – az emberi szervezet egyik legsűrűbben innervált felszínes szövete. Mint már említettük, a szaruhártya innervációja 20-40-szerese a fog pulpájának, vagy 300-600-szorosa a bőrének [1, 4]. Ugyancsak Müller vizsgálataiból ismeretes, hogy a cornea epitheliumának centrális kétharmada 5-6-szor sűrűbben innervált,
38
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
mint a periféria [1, 4]. Guthoff és mtsai kimutatták, hogy a szaruhártya stromájának elülső egyharmadában kb. 60-80 idegköteg lép be. Ezután az idegrostkötegek ferdén haladnak az ún. subbasalis plexusba, mely közvetlenül a Bowman-réteg alatt található [3]. Az epithelium valószínűleg közvetlenül ebből a subbasalis plexusból kapja saját beidegzését. Igen nagy sűrűségben, négyzetmilliméterenként Müller szerint 7 000, Guthoff szerint kb. 16 000 idegvégződés feltételezhető a superficiális epithelialis rétegben [1, 3]. A corneális idegek magas reflektivitásúak, és fényes, elágazódó vonalaknak látszanak a stromán illetve az epitheliumon belül a konfokális mikroszkópos képen. A konfokális mikroszkópia alkalmazásával a szaruhártyáról nyert képek esetén a módszer alkalmazása során keletkező esetleges artefaktumokkal is tisztában kell lennie a vizsgálónak. A szaruhártya idegek vizsgálata során tudnunk kell, milyen struktúrák ábrázolódhatnak még konfokális mikroszkópia során vonalszerű képletként. Chiou és mtsai 110 személy 153 szemét vizsgálva megállapították, hogy konfokális mikroszkópiával a szaruhártyában vonalszerű képletként jelenhetnek meg a szaruhártyaidegek, erek (vaszkuláris képletek), gombák, a lattice és a posterior polymorph cornea dystrophia, és a Descemet-membrán redői. Ezek közül viszont csak a szaruhártyaidegek voltak láthatók normál, egészséges szemekben [232]. Mustonen és mtsai nagyszámú egészséges ember szaruhártyájának in vivo konfokális mikroszkópiás tanulmányában vizsgálta az esetleges nemi vagy oldalbeli különbséget. Férfiak és nők, valamint azonos személy jobb és bal szemének szaruhártyáiban a sejtek mérete ill. sejtsűrűsége között egyik sejtrétegben sem talált szignifikáns különbséget. Korral járó sejtsűrűség csökkenést csak az endothelium rétegben figyeltek meg [225]. Niederer és mtsai sem találtak különbséget egészséges férfiak és nők szaruhártya sejtjeinek és beidegzésének sűrűsége között, valamint részletesebben vizsgálták a korosodás hatását ezen paraméterekre. Szignifikáns korral járó sejtsűrűség csökkenést találtak a stroma keratocyták elülső és hátsó rétegében, az endotheliumban, valamint a subbasalis idegrostrétegben az idegrostok számának csökkenését figyelték meg. Nem találtak összefüggést a kor és a basalis epithelialis sejtek sűrűsége, illetve a centrális szaruhártya vastagság között [177].
39
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
8. Konfokális mikroszkópia a klinikai gyakorlatban Az egészséges szaruhártya konfokális képének ismerete adja az alapot a pathológiás elváltozások felismerésére. A teljesség igénye nélkül a következőkben összefoglaló következik a konfokális cornea mikroszkópia jelen szerepéről, helyéről a szemészeti gyakorlatban. Ám ez az áttekintés azért sem lehet teljes, mert a felhasználás köre napról napra bővül.
Corneális fertőzések A szaruhártya-gyulladások megfelelő kezelése sokszor késik a kórokozó tenyésztés eredményének megérkezéséig. Az in vivo konfokális mikroszkópia megjelenésekor számos szerző próbálta meg a kórokozók azonosítására használni az új eszközt: gomba, Acanthamoeba, baktériumok és mikrosporidiumok esetén. Noha maguk a vírusok meglehetősen kicsik a konfokális képalkotáshoz, az adenovírus okozta subepitheliális infiltrátumok vizsgálatáról számolt be Guthoff munkacsoportja és Dosso és mtsai [233, 234]. Gombás fertőzés esetén hyperreflektív, elongált filamentumokat lehet megfigyelni. Florakis és mtsai Fusarium solani okozta keratitis esetén az elülső szaruhártyafelszínnel
párhuzamos
hyperreflektív
filamentumokat
figyeltek
meg,
melyek
valószínűleg a corneális rostok mentén szaporodtak [235]. Aspergillus fumigatus hasonló kinézetű, hyperreflektivitású filamentumai 45º-ban elágazódóak Avunduk és mtsai vizsgálatai alapján [236]. Az Acanthamoeba okozta keratitis gyors diagnosztizálásában a konfokális corneamikroszkópia alapvető fontosságú. Az első in vivo kimutatások Auran és Cavanagh nevéhez fűződnek [195, 237]. Jellegzetes konfokális mikroszkópos képe a 10-25 µm átmérőjű, feltűnően magas reflektivitású, kerek vagy ovoid, kettős-falú cysták jelenléte a stromában [201, 238-241]. A klasszikus lépesméz-szerű stroma-mintázat oka a körülírt stromális destrukció optikailag áttűnő sok apró ürege [240]. A betegséghez kapcsolódó radialis keratoneuritis a konfokális mikroszkópos képen rendellenesen megvastagodott, kaliberingadozásokat mutató szaruhártyaidegek képében jelentkezik [201, 238-244]. Egy közelmúltbeli, 53 betegen végzett nagy tanulmány szerint a tapasztalt vizsgáló által végzett és klinikai összefüggéseiben értelmezett konfokális mikroszkópia igen szenzitív és specifikus módszer az Acanthamoeba okozta keratitis
40
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
diagnosztizálásában [244]. Hazánkban Imre és mtsai hat Acanthamoeba-keratitises beteg konfokális mikroszkópos vizsgálatáról számolt be [245]. A baktériumok átlagosan 1,5-2 µm nagyságúak, konfokális mikroszkópos képen magas reflektivitású kis képletekként ábrázolódnak a szaruhártyában, de méretüknél fogva elég nehezen észlelhetők. Kis méretük miatt differenciáldiagnosztikára a konfokális corneamikroszkópia néhány kivétellel nem alkalmas [201]. Sutphin és mtsai ferőzéses eredetű crystallin keratitis esetén tű-szerű depozitumokat és kristályokat figyeltek meg [246]. Vaddavalli és mtsai Nocardia asteroides fertőzés esetén magas reflektivitású, rövid, vékony, gyöngysorszerű, gyakran derékszögben elágazódó filamentumokat találtak [247]. Borrelia keratitis esetében Shah és mtsai jellegzetes magas reflektivitású kerek depozitumokat figyeltek meg, melyek egyenes vonalban sorakoztak [248]. Alsuhaibani és mtsai keratoconjunctivitis epidemica után előforduló subepitheliális infiltratumokat vizsgálva, a basalis epithelialis rétegben, a basalmembrán területében valamint az elülső stromában számos, magas reflektivitású Langerhans-sejteket találtak megnyúlt nyúlványokkal. A szaruhártya centrumában az elülső és a középső stromarétegben magas reflektivitású fuziformis sejtek – aktivált keratocyták -, valamint kerek, gyulladásos sejtek voltak megfigyelhetők [249]. Hasonló sejtes elváltozásokat talált Rosenberg, Tervo, és Müller herpeses keratitis eseteiben [250].
Corneális dystrophiák Noha ezeknek a kórképeknek jól definiálható réslámpás képe van, de valamennyi szaruhártya-dystophiának megvan a maga jellegzetes konfokális mikroszkópos képe is, melynek leírásával számos szerző foglalkozott. Meesmann-dystrophiánál Patel és mtsai cirkuláris, ovális vagy könnycsepp-alakú hyporeflektív területeket figyeltek meg a basalis epitheliális sejtrétegben [251]. Ku és mtsai Salzmann-noduláris dystrophiában irreguláris alakú basalis sejteket találtak megnövekedett extracelluláris reflektivitással a nodulák területében [252]. Lattice-dystrophiában Rosenberg és mtsai vonalszerű és elágazódó magas hyperreflektív struktúrákat találtak, elmosódott széllel, változó reflektivitással a stromában [253].
41
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Reis-Bückler dystrophiában a Bowman-membrán területében, főleg centrálisan számos szürkés finom opacitást írtak le, melyek az elülső stromába is beterjednek [254]. Granuláris dystrophiában a stroma-depozitumok extracellulárisan elhelyezkedő, kifejezetten reflektáló anyagok egészséges szövettel körülvéve [254]. Schnyder-féle kristályos cornea dystrophiában a reflektáló kristályos anyag összecsapzódása az elülső stromális keratocytákban látható. Előrehaladottabb esetben denz kristályok, fibrotikus stroma és károsodott idegrostok figyelhetők meg [255]. Bár az endothelium vizsgálatára hagyományosan a spekulár mikroszkópiát használták, bizonyos esetekben, így pl. cornea-oedema fennállásakor a konfokális corneamikroszkópia több információt ad a spekulár mikroszkópiánál, így cornea guttata illetve Fuchs-féle endo-epitheliális dystrophia eseteiben. Chiou és mtsai csökkent endothelsejtszámot találtak, pleomorfismussal és polymegethismussal. A gutták az endothelium szintjében kerekded hyporeflektív foltokként ábrázolódnak, néha közepükön fényesebb területtel. A cornea-oedema a basalis epithelialis sejtek bulláival van összefüggésben, a kóros Bowman-réteg diffúz, kifejezett reflektivitású, hiányoznak az idegek, a stromában sötét kötegek, lacunák láthatók [256].
Keratoconus Keratoconus eseteiben a tanulmányok nagy része leíró jellegű, a kóros elváltozások sejtszintű megfigyeléseiről számolnak be. Hollingsworth és mtsai a Bowman-membránhoz közeli gyűrődéseket, szakadásokat, Vogt-féle striákat írtak le keratoconusban [257, 258]. A megnyúlt keratocyták közel párhuzamosan rendeződtek a szaruhártya csúcsánál, a keratocyták denzitása mind az elülső, mind a hátsó stromában csökkent Erie és mtsai megfigyelése szerint kontaktlencsét viselő keratoconusos betegeknél [259]. Fibroblast-aktivitásra utaló hyperreflektív magvú keratocytákat, megnyúlt endothelsejteket, és acut hydrops eseteiben az elülső stromában, valamint a szaruhártya hámjában oedemát írt le Grupcheva és mtsai [260]. Patel és McGhee kóros subbasalis idegrosthálózatról számoltak be keratoconus esetén összehasonlítva azokat egészséges szaruhártyákkal. A kiboltosulás csúcsán az idegrostok kanyargós hálózatát figyelték meg, melyek sok zárt hurkot alkottak. A
42
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
kiboltosulás topográfiás bázisán az idegrostok koncentrikus lefutással követték a kóros területet. Továbbá megfigyelték, hogy a subbasalis idegrostok denzitása szignifikánsan kisebb volt a keratoconusos szaruhártyák centrumában, mind az egészséges kontrolloknál [261]. Erie és mtsai 10-19%-kal alacsonyabbnak találták a keratocyták sűrűségét a szaruhártyában egészséges kontrollszemélyekkel összehasonlítva, azonban nem volt megfigyelhető szignifikáns korreláció a keratocyta denzitás változása és a keratoconus súlyossága között [259]. Munkacsoportunk
16
keratoconusban
szenvedő
beteget
vizsgálva
hasonló
morfológiai eltérésekről (megnyúlt, hiperreflektív magvú és megváltozott elrendezésű epithelialis sejtek, magas reflektivitású csomók a Bowman-membrán szintjében, károsodott subbasalis idegrost plexus), valamint a stroma minden rétegében az egészségesekéhez viszonyítottan csökkent keratocyta sűrűségről számolt be [262].
Kontaktlencse-viselés A konfokális mikroszkópia kiváló vizsgáló módszernek tűnik a tartós kontaktlencseviselés szaruhártyára kifejtett hatásának nyomonkövetésére [263]. Kaufman és mtsai kontaktlencse viselőknél endothel-oedemát és a keratocyták sejtmagjainak megnagyobbodását találták [264]. Zhivov és mtsai a Langerhans-sejtek sűrűségének duplájára növekedését látták, mint krónikus károsodás mutatóját kontaktlencse-viselőknél [265]. Noha klinikailag a hosszas kontaktlencse-viselés csökkent szaruhártya-érzékenységet okoz, Patel és mtsai nem találtak kóros elváltozást a szaruhártya idegek eloszlásában és morfológiájában [266]. Ez a tény arra utal, hogy a csökkent szaruhártya-érzékenység inkább funkcionális idegelváltozás eredménye, mint strukturális károsodás. A keratocyták denzitásának megváltozása kontaktlencse-viselőknél ellentmondásos. Patel és mtsai nem találtak eltérést a keratocyták sűrűségében normális egyedekhez hasonlítva [266]. Jalbert és Stapleton vizsgálatai alapján tartós kontaktlencse-viselőknél mind az elülső, mind a hátsó stromaréteg keratocyta-denzitása csökkent [267], Efron és mtsai csak a hátsó stroma-rétegben találtak szignifikáns keratocyta-szám csökkenést [268, 269].
43
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Ladage és mtsai 24 órás orthokeratológiai kontaktlencseviselés után Pseudomonas aeruginosa szignifikánsan megnövekedett szaruhártya-kötődését mutatta ki konfokális mikroszkópiával [270].
Idegentest sérülés Resch és mtsai 9, fém idegentest sérülést szenvedett beteg szaruhártyáját vizsgálták Heidelberg Retina Tomograph II (HRT II) Rostock Cornea Module alkalmazásával, összhasonlítva a sérült szemet az ellenoldali éppel. A superficiális epithelium szabálytalanságán és részleges hiányán kívül megfigyelték a basalis epithelialis sejtek sűrűségének csökkenését, a szaruhártyaállományban aktivált keratocyták megjelenését, valamint a Langerhans-sejtek számának jelentős növekedését [271].
Száraz szem szindróma Több szerző tanulmányozta in vivo konfokális mikroszkópiával a különböző eredetű száraz szem szindrómában szenvedő betegek tünetei mögött felfedezhető strukturális elváltozást. A vizsgált kórképek igen széles spektrumát fogták át a vizsgálatok: a könnyfilm rendellenességével összefüggő keratoconjunctivitis sicca (aqueous tear deficiency),
Sjögren-szindrómához
szemszárazság,
ocularis
rosacea,
ill.
rheumatoid
arthritishez
pajzsmirigybetegséggel
kapcsolódó
összefüggő
Graves-
ophthalmopathia, lagophthalmus kapcsán kialakuló száraz szem szindróma [38, 272282]. Az összes tanulmányban közös megfigyelés volt in vivo konfokális mikroszkópiával a
superficialis
epithelialis
réteg
–
elsősorban
foltokban
megfigyelhető
–
szabálytalansága, a epithelsejtek számának ill. sűrűségének csökkenése, valamint a subbasalis idegrostrétegben az idegrostok lefutásának, elágazódásainak és gyöngyfüzérilletve orsószerű megvastagodásainak rendellenessége [38, 272-282]. Tuominen és mtsai ill. Tuisku és mtsai Sjögren szindrómás betegeikben bár az idegrostok morfológiai eltéréseit írták le, de nem találtak idegrostsűrűségbeli eltérést [272,
277].
Tuisku
csoportja
továbbá
antigénprezentáló
dendritikus
sejtek
felszaporodását figyelte meg [277]. Benitez del Castillo és mtsai több tanulmányukban is a superficialis epithelialis sejtek sűrűségének csökkenéséről és a subbasalis idegek csökkent sűrűségéről számoltak be. Erős korrelációt találtak a superficialis epithelialis sejtek és a subbasalis
44
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
idegek száma/sűrűsége, ill. az idegrostok száma és a cornea érzékenység csökkenése között [38, 273]. Villani és mtsai Sjögren szindrómás betegekben szintén a superficialis epithelialis sejtek és a subbasalis idegek csökkent sűrűségéről számoltak be, valamint száraz szem szindrómával szövődött rheumatoid arthritises betegekben az előbbieken kívül az elülső stromarétegben a keratocyták aktivációját és a subbasalis idegrostok jellegzetes morfológiai változásait figyelte meg [275, 278]. Tuominen és mtsai szintén az aktivált keratocyták számának növekedéséről számolt be [272]. Erdélyi és mtsai szintén az epithelialis sejtek számának csökkenéséről számoltak be, valamint a subbasalis idegrostréteg morfológiai eltérései mellett egyik tanulmányukban találtak idegrostsűrűségbeli csökkenést [274], míg egy másikban nem [282]. Az előzőekkel ellentétben Zhang és mtsai Sjögren szindrómás betegeikben az átlagos idegrostszámot megnövekedettnek találták, valamint az idegek kanyargósabbá válását és elágazásbeli mintázatuk megváltozását találták. Feltételezésük szerint ezek a változások a megkísérelt idegregenerációra utalnak [279]. Hosal és mtsai Sjögren szindrómás betegekben a szaruhártyaérzékenység-csökkenés ellenére sem talált morfológiai eltérést az idegrostokban [280]. Száraz szem szindrómában az epithelréteg és a teljes szaruhártya elvékonyodását figyelte meg Liu és Pflugfelder ill. Erdélyi és mtsai [281, 282], míg Tuominen és mtsai ill.
Villani
és
mtsai
a
teljes
szaruhártya-vastagság
csökkenését
a
stroma
elvékonyodásával magyarázta [272, 275]. Erdélyi és mtsai továbbá azt is leírták, hogy az epithelium a lagophthalmusos betegcsoportban a szaruhártya perifériás, alsó területén volt a legvékonyabb, ahol a könnyfilm kenőfunkciója legkevésbé érvényesül [282]. Az epithelsejtek épségének feltétele a megfelelő beidegzés. Benitez del Castillo és mtsai szerint amellett, hogy az idegek száma száraz szemben csökkent, rajtuk az orsószerű megvastagodások sűrűsége fokozott, ami aktivitásfokozódásra utal és az epithelsejtek regenerációját célozza [273].
Konfokális corneamikroszkópia szemsebészeti beavatkozások után Szaruhártya-transzplantáció után in vivo konfokális mikroszkópia segítségével sejtszinten tanulmányozhatók az átültetett korong egyes rétegei és az azokban zajló
45
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
változások. Hollingsworth és mtsai 4 beteg szaruhártya-átültetése után egy éven át folytatott
követéses
vizsgálatukban
a
műtét
után
közvetlenül
nem
láttak
szaruhártyaidegeket sem a subbasalis idegrostréteg szintjében, sem a stromában, míg egy évvel a műtét után már láthatóak voltak vékony idegrostok. A keratocyta sűrűség a stroma elülső és hátsó részében a teljes vizsgálat ideje alatt csökkent értéket mutatott, és az elülő stromában aktivált keratocyták voltak megfigyelhetők. Az endothelium sejtdenzitásának csökkenése a 12 hónap alatt felgyorult ütemben zajlott [283]. Darwish és mtsai szintén egy éven át követett 20 szaruhártya-átültetésen átesett beteget. A vizsgálat ideje alatt a subbasalis idegrostrétegben nem tudtak idegeket kimutatni, miközben a műtét után lecsökkent szaruhártya-érzékenység a 12. hónapra visszatért normál értékére [284]. McGhee és Bourne professzorok kutatócsoportjai vizsgálták a szaruhártya-átültetés hosszútávú hatásait in vivo konfokális mikroszkópiával. Az előbbiből Niederer és mtsai a transzplantált corneában az összes vizsgált sejtrétegben (epithelium, stroma, endothelium) sejt-sűrűségbeli csökkenést és a subbasalis idegrostréteg minőségi és mennyiségi elváltozásait találták még 40 évvel a műtét után is [285]. Az utóbbiból Patel és mtsai szerint a keratocyta-sűrűség a műtét után csökkent értéket mutatott mind a tiszta, mind pedig a késői endothelium elégtelenséget (late endothelial failure) mutató korongok esetében, de egymástól nem különbözött ezutóbbi csoportoknál. Vizsgálatuk szerint a subbasalis idegrostsűrűség még 30 évvel a műtét után sem mutat teljes gyógyulást [286, 287]. Vizsgálták in vivo konfokális mikroszkópiával a szaruhártya-átültetés szövődményeit is. Niederer és mtsai leírtak két esetben subepithelialis infiltrátumokat, mint a kilökődési reakció jelét [288], valamint Forseto Ados és mtsai bemutatták a szaruhártya-átültetés utáni hámbenövés (epithelial ingrowth) esetét, melyet a vizsgálat után szövettani módszerekkel is megerősítettek [289]. Hazánkban Imre és mtsai végeztek konfokális mikroszkópos vizsgálatokat szaruhártya-átültetés után. Hét esetet vizsgálva, 66 hónapos nyomonkövetés alatt keratocyta és endothelsejtszám csökkenést figyeltek meg [290, 291]. Több munkacsoport vizsgálta in vivo konfokális mikroszkópia segítségével trabculectomia
műtét
után
a
posztoperatív
46
gyulladás
mértékét,
valamint
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
összehasonlították a jól működő és az elégtelen filtrációs párna funkciót [292-294]. Sbeity egy beteg kapcsán a blebitis mértékének ill. a terápia hatásosságának követésére használta az in vivo konfokális mikroszkópiát [295].
Refraktív sebészet A konfokális szaruhártyamikroszkópia a refraktív sebészi beavatkozások utáni komplikációk, sebgyógyulási problémák megértésében, nyomonkövetésében is igen hasznosnak bizonyult. Rajan és mtsai konfokális mikroszkópiával követték négy héten keresztül in vitro emberi szaruhártyamodellen a sejtszintű változásokat fotorefraktív keratektómia (photorefractive keratectomy, PRK), laser-assisted subepithelial keratectomy (LASEK) illetve laser in-situ keratomileusis (LASIK) beavatkozás után. A hámosodás PRK után 92 ± 10 órával lett teljes, LASEK után a hámlebeny az alkohol hatására teljesen nekrotizált, de 24 órás prolongált látenciával, 120 ± 5 órával a beavatkozás után teljesen újrahámosodott. A keratocyta-veszteség arányos volt az abláció mélységével [296]. Konfokális mikroszkópia segítségével a refraktív sebészeti szövődmények is nyomon követhetők.
A
PRK
utáni
szaruhártya-homály,
az
ún.
„haze”,
konfokális
mikroszkópiával vizsgálva aktivált keratocytáknak bizonyultak [297, 298]. Rajan és mtsai kimutatták, hogy 4 diopriaértéket kezelt PRK illetve 9 dioptriaértéket kezelt PRK beavatkozás után 4 héttel a keratocyták denzitása 98 illetve 111%-a volt a preoperatív sűrűségnek [296]. A nagyobb dioptriaérték (D) kezelése, azaz a nagyobb ablációs mélység, több keratocytát aktivált, ez lehet a magyarázata a nagyobb dioptriájú PRK kezeléseknél gyakrabban előforduló haze-nek és regressziónak [297, 298]. PRK utáni számos elváltozást írtak le konfokális mikroszkópia segítségével, így subepitheliális extracelluláris mátrix depozitumokat, hyperreflektív, tű-alakú illetve finomabb lineáris struktúrákat az elülső stromában [299, 300]. A Bowman-membránt, amint az várható volt, nem sikerült kimutatni. Erie és mtsai kimutatták, hogy a posztoperatív keratocyta-sűrűség valamennyi stromális régióban azonnal megnövekszik PRK után, majd szignifikánsan csökken a PRK előtti teljes vastagságú stroma elülső 10%-ával vagy a PRK után a nem kezelt stromaterülettel összehasonlítva [301]. A subbasalis idegrost sűrűség a kezelés után lecsökken, mielőtt később visszatérne a műtét előtti értékekhez [299, 302, 303]. Erie és mtsai vizsgálták az idegek
47
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
regenerálódását is PRK után, leírtak aberráns idegeket, irreguláris elágazódásokkal [304]. LASIK–beavatkozás után is számos elváltozást írtak le konfokális mikroszkópia segítségével: a Bowman membrán mikroredőit, elvágott subbasalis idegeket, a lebeny mikroredőit, interface-partikulumokat, keratocyta-aktiválódást [297, 305-314]. Erie és mtsai kimutatták, hogy LASIK-műtét után a lebenyben és a retroablációs stromaréteg elülső részében a keratocyta-denzitás csökken a műtétet követő 6 hónapban, és a lebenyben a keratocyták számának helyreállása lassú folyamat [315]. Pisella és mtsai a LASIK-műtét után nyomon követve a keratocyták denzitását megfigyelték, hogy az a műtét után egy hónappal a hátsó stromában szignifikánsan fokozódott, majd a harmadik hónapra szignifikánsan lecsökkent, és az eredeti szintet a műtét után fél év múlva érte el [316]. Ismeretes a LASIK-műtét után a corneális idegrostok átvágása miatt kialakuló száraz-szem-tünetegyüttes. Lee és mtsai konfokális mikroszkópos vizsgálatai szerint a LASIK-beavatkozás után egy hónappal a subbasalis idegrostok denzitása 90%-kal csökken, de a sűrűség normalizálódása 3-6 hónapon belül megindul, 2 évvel a műtét után vizsgálva az idegrostok sűrűsége a preoperatív érték 50%-a [317]. Más vizsgálatok szerint a szaruhártya idegrost-denzitása a PRK után 2 évvel teljesen helyreáll [297]. Erie és mtsai kimutatták, hogy bár a subbasalis idegrostok száma közvetlenül a PRK illetve LASIK műtét után lecsökken, évekkel a műtét után ez visszatér a kiindulási értékre mindkét műtéttípus esetében [303]. Linna és mtsai összefüggést találtak a rövid, átvágott subbasalis idegrostok és a csökkent
szaruhártya-érzékenység
között
LASIK-műtét
után.
A
szaruhártya
érzékenysége 6 hónap után normalizálódik [318]. Kaufman és mtsai szerint LASIK beavatkozás során a lebeny alatti interface vonala felhasználható mélységmérésre, a lebeny illetve a kezelés utáni maradék stromaágy vastagságának ellenőrzésére [297]. Meg kell jegyezni azonban, hogy a konfokális mikroszkóppal
és
ultrahangos
pachymetriával
végzett
corneavastagság-mérés
összehasonlítása McLaren és mtsai vizsgálatában 2,8-39 µm különbséget eredményezett [319]. Kaufman és mtsai nyomon követték és összehasonlították továbbá a lebeny alatti
48
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
interface-ben lerakódott hyperreflektív benignus partikulumok sorsát, posztoperatív gyulladásos sejteket, diffúz lamelláris keratitis lefolyását is [297, 320]. Nyomon követhető a LASIK–műtét olyan ritka komplikációjának lefolyása is konfokális cornea-mikroszkópiával, mint a hámbenövés: fényes, erősen reflektáló sejtmagvú sejtfészkek láthatók az interface-ben [321]. A legújabb technika, a femtosecond-LASIK lebenye alatt Sonigo és mtsai találtak újabban partikulákat, bizonyítva ezzel, hogy azok eredete nem a mechanikus mikrokeratómok oszcillációjából ered. A femtosecond-technika után kifejezettebb fibrotikus reakciót figyeltek meg a lebenyszél körül, mint mechanikus mikrokeratóm használata után [322, 323].
49
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
V. CÉLKITŰZÉSEK 1. Módszer kifejlesztése és validálása a cornea különböző rétegeiben történő sejtszámolásra in vivo scanning slit konfokális mikroszkópia alkalmazásával Egészséges szaruhártyák in vivo kvantitatív vizsgálata konfokális mikroszkópiával Vizsgálatunk célja volt kidolgozni és validálni egy nem invazív, gyors, megbízható és reprodukálható módszert, mellyel egy, a kereskedelmi forgalomban kapható scanning-slit rendszerű konfokális corneamikroszkóp használatával, in vivo a cornea különböző rétegeiben kvantitatív (pl. sejtsűrűség) vizsgálatok végezhetők. Az in vivo konfokális corneamikroszkópián alapuló kvantitatív vizsgálati módszerek elfogadhatósága az adott minták hagyományos szövettani módszerekkel történő validálásán, és a konfokális mikroszkópos mérések megbízhatóságának (reliability) és reprodukálhatóságának (repeatability) vizsgálatán és bizonyításán alapul. Célunk volt a validálás során leírni a szaruhártyarétegek konfokális mikroszkópos jellemzőin alapuló klasszifikációját, a képrögzítés és a szemimanuális, sejtek megjelölésén alapuló sejtszámolás technikáját, a felszíni és térfogati sejtdenzitás meghatározásának módjait, a mérések reprodukálhatóságának mértékét, a kapott sejdenzitásértékek hagyományos szövettani módszereken alapuló validálását, valamint az
egészséges
vizsgálati
személyeken
végzett
méréseink
eredményeinek
összehasonlítását az irodalmi adatokkal.
2. A diabeteses keratopathia vizsgálata in mikroszkópiával: kvantitatív és kvalitatív vizsgálatok
vivo
konfokális
2.A. A cukorbetegség hatásának vizsgálata a szaruhártya különböző rétegeiben a sejtek sűrűségére A diabetes mellitus, különösen annak leggyakoribb, ún. 2-es típusa, napjainkra népbetegséggé lett. A cukorbetegség a szem minden szövetét érinti, károsítja. Bár legismertebb, széleskörben vizsgált és publikált szemészeti szövődménye a diabeteses retinopathia, az utóbbi időben egyre nagyobb szakmai figyelem fordul a korábban
50
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
elhanyagolt diabeteses keratopathia felé. Felmerült a diabeteses keratopathia jelentősége a betegség korai felismerésében, illetve a betegség és bizonyos szövődményei progressziójának objektív kvantifikálhatóságában is. Célkitűzésünk a cukorbetegek szaruhártyáiban a betegség korai fázisában megjelenő kvalitatív és főleg kvantitatív változások vizsgálata volt, különös tekintettel a sejtszámváltozásra. Célunk volt az általunk korábban kidolgozott és validált módszer szerint meghatározni a szaruhártya hat sejtrétegében a vonatkozó sejtsűrűséget, majd összehasonlítani a diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek szaruhártyájában kapott adatokat. A cornea autofluoreszcenciája (CAF) diabeteses betegek szaruhártyájában magasabb, mint egészséges kontrollszemélyekében. Célunk volt vizsgálni, hogy a diabeteses betegek szaruhártyájában fellépő emelkedett autofluoreszcencia hátterében állhat-e a sejtdenzitás változása.
2.B. A subbasalis szaruhártyáiban
idegrostréteg
vizsgálata
diabeteses
betegek
A diabeteses betegek krónikus munkaképtelenségének leggyakoribb oka a diabeteses neuropathia, különösen a perifériás diabeteses neuropathia. Ennek korai és pontos diagnosztizálása és kvantifikálása nagyon fontos valamennyi veszélyeztetett betegnél, csökkentve ezáltal a morbiditást és lehetővé téve az időben megkezdett és megfelelő kezelést. Mint már említettük, a szaruhártya az emberi szervezet egyik legsűrűbben innervált szövete. A szaruhártya hámjának elváltozása, a cornealis epitheliopathia klinikailag jól ismert diabeteses betegeknél. Vizsgálatunk célja a szaruhártya beidegzésének – különösen a subbasalis idegrostrétegnek –, valamint a szomszédos sejtrétegeknek kvalitatív és kvantitatív vizsgálata volt a nem invazív in vivo konfokális mikroszkópia segítségével az idegrostok pathológiájának korai felismerésére enyhe ill. közepes fokú diabeteses retinopathiában szenvedő cukorbetegeknél.
51
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Vizsgálataink során megfigyeltünk közvetlenül a basalis epithelialis sejtréteg alatt elhelyezkedő magasreflektivitású sejteket (HRC). További vizsgálatunk célja ezen sejtek tulajdonságainak, számuknak változásának megfigyelése, illetve valószínű azonosítása volt.
2.C. A szaruhártya stroma vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban: stromális idegek, és egyéb magasreflektivitású képletek A szaruhártya állományáról készített konfokális mikroszkópos képeken a jellemzően megfigyelhető képletek a nagyszámú keratocyta sejtmagok. Ám a szaruhártya stromában ezeken kívül más, egyéb struktúrák is ábrázolódhatnak. Célunk volt a stromális idegek meglétét, morfológiáját, lefutását megfigyelni 2-es típusú diabeteses betegek, valamint egészséges kontrollszemélyek szaruhártya állományában készített konfokális mikroszkópos képeinken. A szaruhártya stromájában sajátságos, igen magas reflektivitású fejből és halványabb (egyenes vagy hullámos) farokból álló képleteket is észleltünk. Célunk volt ezen képletek sajátságainak megfigyelése, morfológiai és denzitásbeli változásainak in vivo vizsgálata, 2-es típusú diabeteses betegek és egészségesek szemében.
52
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
VI. MÓDSZEREK A validáláshoz szükséges mérések esetében a vizsgált személyek mindkét szemének, a diabeteses betegcsoportokkal kapcsolatos tanulmányok esetében a vizsgált személyek bal szemének corneáját vizsgáltuk Tomey Confoscan P4 scanning-slit konfokális mikroszkóppal. A bal szem kiválasztása önkényesen, a statisztikai hibalehetőség csökkentése érdekében történt, hiszen az irododalmi adatok [225] és a mi vizsgálataink szerint sem különböznek egymástól az azonos személy jobb és bal szemének szaruhártya sejtsűrűség értékei. A szaruhártya centrumában az optikai tengely mentén arra merőlegesen az epithelium és az endothelium között rétegenként készítettünk felvételeket.
Helyszín A vizsgálatokat Portugáliában, Coimbrában a Coimbrai Egyetem Institute of Biomedical Research on Light and Image (IBILI) intézetének Center of Ophthalmology részlegében végeztem, szoros együttműködésben a Coimbrai Egyetemi Kórház szemészeti ambulanciájával (betegek toborzása és első vizsgálata), az Association for Innovation and Biomedical Research on Light and Image (AIBILI)–vel (cornealis autofluoreszcencia mérések), a Coimbrai Egyetem Fizika Tanszékével és az Institute of Biomedical Research on Light and Image (IBILI) Instrumentation részlegével (műszerezettség, statisztika), valamint Dr. Linda J. Müllerrel az amszterdami The Netherlands Ophthalmic Research Institute-ból (szaruhártyaidegek és dendritikus sejtek témakörben). Vizsgálataimat témavezetőim: a budapesti Semmelweis Egyetemről Dr. Süveges Ildikó professzornő, a Coimbrai Egyetemen Dr. José G. Cunha-Vaz professzor és a hollandiai Leideni Egyetemről érkezett Dr. Jaap A. Van Best vendégprofesszor irányításával végeztem.
53
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Vizsgálati személyek csoportjai, betegcsoportok 1. Mérések egészséges kontroll vizsgálati személyeken, sejtszámolási módszer kidolgozása, validálása Húsz egészséges vizsgálati személyt toboroztunk, életkoruk 28 és 74 év között (átlag: 53,7 év) volt, kórtörténetükben szemészeti és/vagy szisztémás betegség nem szerepelt. Az in vivo konfokális mikroszkópos vizsgálat előtt minden személy megelőző réslámpás biomikroszkópos vizsgálaton esett át. A konfokális vizsgálat a protokoll szerint történt, a hat szaruhártyarétegben sejtdenzitást számoltunk, majd ezeket az adatokat/értékeket összehasonlítottuk az irodalomban fellelhető hasonló adatokkal.
2.A. Sejtdenzitás-vizsgálatok diabeteses betegek szaruhártyáiban Tizenöt 2-es típusú, nem inzulin dependens diabetes mellitusban (NIDDM) szenvedő 39 és 69 év közötti (átlag: 60,9 ± 8,5 év), inzulinkezelésben nem részesülő beteget (9 férfi és 6 nő), választottunk ki egy prospektív leíró tanulmányhoz. A betegeket azok közül toboroztuk, akik először jelentek meg a Coimbrai Egyetemi Kórház szemészeti ambulanciáján, és enyhe, az Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) [324] tanulmány szerinti klasszifikáció szerint 20-as szintű retinopathiájuk (csak microaneurysmsák, egyéb tünetek hiányoznak) volt. A vizsgálatból kizárásra kerültek akik
kontaktlencsét
viseltek,
akut
szemészeti
beteségben
szenvedtek,
vagy
kórtörténetükben a diabetestől eltérő egyéb szemészeti betegség előfordult. A résztvevő csoportban a cukorbetegség fennállási ideje 2 és 20 év közötti (átlag: 11,3 ± 6,2 év). Kontrollként tizenöt egészséges (nem diabeteses), életkor szerint egyeztetett személyt (4 férfi, 11 nő), életkoruk 35 és 74 év közötti (átlag: 59,3 ± 11,0 év) választottunk, akik nem viseltek kontaktlencsét és kórtörténetükben szemészeti betegség nem fordult elő (ld. 6. táblázat). A betegek és a kontrollszemélyek kiválasztása 2001 júliusa és 2002 júliusa között folyamatosan történt. Az in vivo konfokális mikroszkópos vizsgálat előtt minden személy alapos réslámpás biomikroszkópos vizsgálaton és az epithelium esetleges elváltozásait felfedő fluoreszcein festésen esett át. A vizsgált személyek bal szemének corneáját vizsgáltuk Tomey Confoscan P4 scanning-slit konfokális mikroszkóppal. A szaruhártya centrumában az optikai tengely
54
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
mentén arra merőlegesen az epithelium és az endothelium között rétegenként felvételeket készítettünk. A szaruhártya hat sejtrétegéről készült felvételeket elemeztük.
2.B. A subbasalis szaruhártyáiban
idegrostréteg
vizsgálata
diabeteses
betegek
Húsz 2-es típusú, nem inzulin dependens diabetes mellitusban (NIDDM) szenvedő, inzulinkezelésben nem részesülő, 50 és 75 év közötti életkorú beteget (11 férfi és 9 nő) választottunk ki a prospektív leíró tanulmányhoz. Közülük az Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) [324] tanulmány szerinti klasszifikáció szerint 10 enyhe fokú (ETDRS 20-as szint, DP20) és 10 közepes fokú (ETDRS 35-ös szint, DP35) diabeteses retinopathiában (DR) szenvedő beteg volt. Életkor szerinti megoszlásuk a két betegcsoportban, valamint a 10 korban megfelelő egészséges kontrollszemély esetében hasonló volt; az enyhe fokú retinopathiában szenvedő betegcsoportban 58,9 ± 9,37 év, a közepes fokú retinopathiában szenvedő betegcsoportban 60,1 ± 5,65 év, valamint az egészéges kontrollszemélyek csoportjában 60,1 ± 7,98 év volt az áltagéletkor ill. az életkorok szórása (ld. 10. táblázat). Mint az előző esetben, itt is a vizsgált személyek bal szemének corneáját vizsgáltuk Tomey Confoscan P4 scanning-slit konfokális mikroszkóppal. A szaruhártya centrumában az optikai tengely mentén arra merőlegesen az epithelium és az endothelium között rétegenként felvételeket készítettünk. Az epitheliumról, a subbasalis idegrostrétegről és az elülső stromáról készült felvételeket elemeztük. A képelemzéshez kiválasztottuk a subbasalis idegrostrétegnek megfelelő képeket. A képelemzés során meghatároztuk képenként a látható idegrostok számát. Továbbá, magasreflektivitású sejteket (highly reflective cells, HRC) figyeltünk meg a basalis epithelialis sejtek rétege alatt, jellemzően a subbasalis idegek mentén. Meghatároztuk ezek számát képernyőnként.
2.C. A szaruhártya stroma vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban Nyolc 2-es típusú, nem inzulin dependens diabetes mellitusban (NIDDM) szenvedő, inzulinkezelésben nem részesülő, 50 és 75 év közötti életkorú beteget (4 férfi és 4 nő) választottunk ki a prospektív leíró tanulmányhoz. Közülük az Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) [324] tanulmány szerinti klasszifikáció szerint
55
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
négy enyhe fokú (ETDRS 20-as szint, DP20) és négy közepes fokú (ETDRS 35-ös szint, DP35) diabeteses retinopathiában (DR) szenvedő beteg volt. Életkor szerinti megoszlásuk a két betegcsoportban, valamint a 8, korban megfelelő egészséges kontrollszemély esetében hasonló volt; az enyhe fokú retinopathiában szenvedő betegcsoportban
60,2 ± 8,37
év,
a
közepes
fokú
retinopathiában
szenvedő
betegcsoportban 62,1 ± 5,43 év, valamint az egészéges kontrollszemélyek csoportjában 62,33 ± 6,98 év volt az áltagéletkor ill. az életkorok szórása. A vizsgált személyek bal szemének corneáját vizsgáltuk Tomey Confoscan P4 scanning-slit konfokális mikroszkóppal. A szaruhártya centrumában az optikai tengely mentén arra merőlegesen az epithelium és az endothelium között rétegenként felvételeket készítettünk. A szaruhártya állományáról készült felvételeket vizsgáltuk és elemeztük a benne megfigyelt nem keratocyta képleteket. A képelemzéshez kiválogattuk az adott személy szaruhártya stromájának teljes vastagságában készült, a keratocytákon kívül egyéb képleteket is tartalmazó képeket. Megfigyeltük a stromális idegek meglétét, lefutását. A szaruhártya állományában látott sajátságos, igen magas reflektivitású fejből és halványabb (egyenes vagy hullámos) farokból álló képleteket is észleltünk. Ezek számát egyetlen, az epitheliumtól endotheliumig tartó területet áttekintő, konfokális mikroszkópos vizsgálat alatt készült képeken határoztuk meg.
Etikai kérdések A vizsgálatok kivitelezése a Helsinki Deklaráció elvei szerint, és a Coimbrai Egyetemi Kórház Orvosi Etikai Bizottsága jóváhagyásával történt. A kísérletben résztvevő összes vizsgálati személytől tájékozott beleegyezést kaptunk a vizsgálat természetéről és lehetséges következményeiről való részletes felvilágosítás után.
Eszközök Az emberi szaruhártyák in vivo vizsgálatára használt konfokális mikroszkóp ún. scanning-slit rendszerű konfokális corneamikroszkóp (Confoscan P4, Tomey, Fortune Technologies, Vigonza, Olaszország) volt, standard Achroplan nem-applanáló immerziós objektívvel (Zeiss, Oberkochen, Németország, 40x/0,75 numerikus apertúra) [149, 225] (6. ábra). A műszer a konfokális elven alapulva, a szaruhártya a fókuszsíkhoz
56
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
közel eső kis mérési térfogatban, ún. optikai szeletben, lévő struktúráiról in vivo visszaverődő fényt ábrázolja egy számítógép képernyőjén, miközben a máshonnan visszaverődő fény szóródik, s nem ábrázolódik a képernyőn.
A vizsgálat menete A vizsgálathoz a beteget egy csepp helyi érzéstelenítő szemcsepp (0,4% oxybuprocaine chlorhydrate, Anestocil, Oftalder, Oeiras, Portugália) és egy csepp tiszta gél (Na-hyaluronát 10 mg/ml, Healon, Pharmacia & Upjohn, Uppsala, Svédország), mint az objektív lencse és a szaruhártya között az optikai csatolásra szolgáló viszkózus immerziós folyadék becseppentése után a mikroszkóp elé ültettük. A fej- és szemmozgás minimalizálására álltámaszt és a vizsgálttal ellenoldali szem elé villogó fixációs segédfényt alkalmaztunk. A vizsgált személy a vizsgálatkor egyenesen előre tekintett. A vizsgálandó optikai szelet a szaruhártya bármely részére pozícionálható a mikroszkóp fókuszsíkjának x-, y- és z-tengelyben történő eltolásával. A vizsgálat megkezdésekor a mikroszkóp objektívét az x-y tengelyben mozgatva a
6. ábra A Tomey Confoscan P4 konfokális mikroszkóp használat közben
57
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
szaruhártya centrumába pozícionáltuk, majd a képrögzítést a szaruhártya optikai tengelye (z-tengely) mentén manuálisan, a mikroszkóp mikrométer csavarja segítségével, léptetve végeztük. A képrögzítés során az aktuálisan kiválaszott optikai szelet struktúrái valós időben (25 képkocka/másodperc mintavételezéssel) ábrázolódtak a számítógép képernyőjén, miközben ezzel egyidejűleg VHS szalagon rögzítésre kerültek [149, 170, 218]. Vizsgálataink során a szaruhártya centrumában, az optikai tengely mentén, arra merőlegesen, az epithelium és az endothelium között valós időben 6-10 teljes vastagságú scan került rögzítésre. Biztosítandó, hogy a regisztrátumon a szaruhártyarétegekről egymástól független, és kellőképpen változatos képek (független minták) kerüljenek rögzítésre, a középső stroma réteg kivételével az összes szaruhártyaréteg esetén az objektívlencsét újrafókuszáltuk a vizsgált rétegen belül a szaruhártya optikai tengelyére merőlegesen tetszőleges irányban kb. 50 µm-rel eltolva. A középső stroma réteg esetében, mivel annak mélysége (helyzete a ztengelyben)
a
többi
vizsgált
szaruhártyarétegénél
tágabban
meghatározott,
az
objektívlencsét a szaruhártya optikai tengelye mentén mozgattuk el kb. 50 µm-rel. Egy szem vizsgálatának teljes ideje kb. két-három percet vett igénybe, a nyers regisztrátumon szemenként kb. 3000 – 4500 képkockát eredményezve. A mérési térfogat dimenziói: 10 µm névleges optikai rétegvastagság [325], a képernyőn ábrázolódó legnagyobb használható terület 336 x 254 µm, míg a legnagyobb sejtdenzitás mérésre használható számolókeret (counting frame) 293 x 213 µm. A méréseket USAF 1951-es tesztábra használatával végeztük. A képfeldolgozás utólagosan zajlott, azaz a rögzített képek kvalitatív és kvantitatív elemzésére már a vizsgált személy távozása után került sor. A legjobb képminőségű (legjobban fókuszált, mozgási műtermékektől mentes) és az adott vizsgálat céljának megfelelő képek kiválasztása vizsgált szemenként kb. egy óra időtartamot vett igénybe. Kvantitatív analízis során minden felvételt két vizsgáló személy elemzett, egymástól függetlenül. A képanalízis során az adott vizsgálat céljának megfelelő szaruhártyarétegről válogattunk képeket előre meghatározott szaruhártyaréteg klasszifikáció alapján.
58
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
A szaruhártyarétegek klasszifikációja in vivo konfokális corneamikroszkópos analízishez A szaruhártya különböző rétegeiben történő sejtszámoláshoz hat szaruhártyaréteget különítettünk el: a superficialis epithelialialis réteget, a basalis epithelialis réteget, az elülső-, a középső-, és a hátsó stromaréteget, valamint az endotheliumot. Vizsgálatunkban figyelmünket elsősorban az epithelium superficialis, legkülső rétegére, amely az állandó fiziológiás sejtvesztés helyszíne, a basalis epithelialis sejtek rétegére, mely az epithelium folyamatos megújulásáért felelős, az endotheliumra, amely a cornea víztartalmának szabályozásán keresztül a szaruhártya stroma átlátszóságáért felelős, fordítottuk [326]. Elemeztük továbbá a sejtdenzitást a szaruhártya stroma elülső részében, közvetlenül a Bowman-membrán alatt; a stroma hátsó részében, közvetlenül a Descemet-membrán és endothelium előtt; valamint a stroma középső részében félúton az elülső és a hátsó stroma között. Ennek a szigorú mintavételezési protokollnak az előnye, hogy a szaruhártya rétegek jól azonosíthatóak és elkülöníthetőek, és az egyes szaruhártyák között a mintavételezési hiba minimális [227]. A szaruhártya subbasalis idegrostrétegének vizsgálatához a képanalízis során különös figyelmet fordítottunk a subepithelialis ideg plexusra valamint a vele szomszédos sejtrétegekre: az epitheliumra és az elülső stroma rétegekre. A szaruhártyarétegek klasszifikációját az alábbi jellemzőik alapján végeztük. 1. Superficialis ill. felszíni epithelium. (7. ábra A) A szaruhártya felszínes, avagy legkülső rétege a superficialis epithelialis sejtek rétege. Az in vivo konfokális corneamikroszkópos képen ezen macskakőszerű sejtek megjelenése fényes (magas reflektivitású) kerek sejtmag sötét (alacsony reflektivitású), sokszögletű sejt közepén. A sejtek 40-50 µm átmérőjűek és megközelítőleg 4 m vastagságúak [198, 327, 328]. A sejtmag átlagos átmérője 4 m. A superficialis epithelialis sejtek a rétegben egymáshoz képest véletlenszerűen elszórtan helyezkednek el, a réteg megközelítőleg 10 m vastagságú. A superficialis epithelialis sejteket nem szabad összetévesztenünk a közvetlenül alattuk
elhelyezkedő
ún.
szárnyas
sejtekkel,
melyek
szabályosabb
alakúak,
szabályosabban oszlanak el és kapcsolódnak egymáshoz, és közvetlenül a basalis epithelialis sejtek rétege fölött helyezkednek el [328, 329].
59
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2. Basalis epithelialis sejtek rétege. (7. ábra B) A basalis epithelialis sejtek rétege egyetlen réteget (ún. monolayert) képez közvetlenül a Bowman-membrán fölött. Az in vivo konfokális corneamikroszkópos képen szabályosan elhelyekedő, apró, hexagonális, optikailag nem reflektív (sötét), reflektívebb (világosabb) sejtmembránnal körülvett sejtek egyetlen rétegeként jelenik meg. A basalis epithelialis sejtek vastagsága kb. 20 µm, átmérője kb. 10 µm [198, 327, 328]. 3. Subbasalis ideg plexus: subbasalis idegrostkötegek rétege. (8. ábra) A szaruhártya idegei a limbusban lépnek be a szaruhártya állományába, a többségük a
7. ábra Egészséges szaruhártya rétegeinek típusos képe. A: superficialis epithelium, B: basalis epithelialis sejtek rétege, C: elülső stroma, D: középső stroma, E: hátsó stroma, F: endothelium.
60
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
stroma elülső harmadában helyezkedik el, majd a felszín felé fordulva a basalis epithelialis sejtek rétege és a Bowman-membrán között plexust képez, mely jellemzően egyenes
és
gyöngyfüzérszerű
idegrostok
keveréke.
Az
in
vivo
konfokális
corneamikroszkópos képen a szaruhártyaidegek magas reflektivitású (világos) kötegekként jelennek meg sötét háttér előtt. A subbasalis idegrostrétegben megfigyelhetők az idegek lefutása mellett azok elágazásai (Y alak), egymáshoz való kapcsolódásaik (H alak) és viszonyuk [1, 149]. 4. Elülső stroma-réteg. (7. ábra C) A Bowman-membrán alatt közvetlenül elhelyezkedő első réteget tekintettük vizsgálataink során elülső stroma rétegnek. In vivo konfokális mikroszkópos képen normális esetben, egészséges szaruhártyában – ha pl. nincs gyulladás jelen – a stromában a keratocyták cytoplasmája nem, csak a sejtmagjai ábrázolódnak. Határozott körvonalú, sokszögletű fényes (magas reflektivitású) képletekként jelennek meg a sötét háttér előtt [228, 330]. Egy keratocyta sejtmag maximális hossza 50 m, szélessége általában 15 µm, vastagsága kb. 1-2 m [329, 331]. A becsült rétegvastagság 150 m [330]. Jellemzően igen sejtdús réteg; melyben nagy stromalis idegrostkötegek futnak [151-153, 198, 327]. A keratocyták magjai jól elkülöníthetőek az idegek mentén esetleg megfigyehető Schwann-sejtek magjaitól, az elhelyezkedésük alapján.
8. ábra Egészséges szaruhártya subbasalis idegrostrétegének típusos képe.
61
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
5. Középső vagy mid-stroma-réteg. (7. ábra D) A középső stroma-réteg az elülső és a hátsó stroma-réteg között húzódik. Benne keratocyták sejtmagjait figyelhetjük meg és általában láthatunk nagy stromalis idegrostkötegeket is [149, 152]. A réteg a stroma elülső rétegénél kevésbé sejtdús. Ezen keratocyták magjaira jellemző a szabályos, ovális alak, véletlenszerű orientáció, és az egyenletes eloszlás. A keratocyta sejtmagok mérete a stroma középső rétegében hasonló az elülső rétegében leírtakhoz. 6. Hátsó- vagy posterior stroma-réteg. (7. ábra E) A szaruhártya stroma hátsó rétegének a Descemet-membrán előtt elhelyezkedő stromarészt nevezzük. A rétegvastagság kb. 100 μm [330]. A keratocyták magja szabályos, ovális, a középső stromában jellemzőnél megnyúltabb [198]. A sejtmagok a többi stomarétegnél szabályosabb elrendeződést mutatnak, gyakran egymásra merőlegesen (Linda Müller szóbeli közlése). A stroma hátsó része feltehetőleg nem tartalmaz idegrostkötegeket [1, 149, 332]. 7. Endothelium. (7. ábra F) Az endothelium a szaruhártya legbelső rétege, mely a szaruhártya állományát a szem elülső csarnokától és benne a csarnokvíztől határolja, és aktívan biztosítja a szaruhártya dehidrált állapotát. Az endothelium lépesméz-szerűen elhelyezkedő hatszögletű sejtek egyetlen rétegéből áll (monolayer) [198]. Az in vivo konfokális corneamikroszkópos képen az endothelium megjelenése típusosan lépesmézszerű: szabályosan elhelyezkedő, hexagonális, optikailag reflektív (világosabb) sejtek jól látható, optikailag kevésbé reflektív (sötétebb) sejthatárokkal. Scanning-slit konfokális mikroszópiával ez a legkönnyebben azonosítható sejtréteg. Az endothelialis sejtek átmérője átlagosan 18-20 µm, vastagsága 5-6 m [198, 225]. A rétegvastagság is természetesen 5-6 m.
A sejtszámolás módszere A sejtszámolás első lépéseként a vizsgálatkor rögzített videószalagról kiválasztottuk a legjobban fókuszált, éles, mozgási műtermékektől mentes képeket. Ezután az adott képen a számolandó sejtek megjelölése manuálisan történt: a számítógép képernyőjén az
adott
szaruhártyarétegnek
megfelelő,
előre
meghatározott
négyszögletes
számolókereten belül minden, a klasszifikáció alapján meghatározott sejtet vagy sejtmagot megjelöltünk. Gundersen-féle torzításmentes számolókeretet (9. ábra) [227, 333, 334] alkalmaztunk: minden sejt ill. sejtmag jelölésre és számolásra került a kereten
62
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Megszámolandó sejtek
Kizárt élek
Nem megszámolandó sejtek
9. ábra Gundersen-féle torzításmentes számolókeret alkalmazása a sejtszámolásban
belül, még a kereten csak részlegesen belül elhelyezkedők is, kivéve, ha érintették a számolókeret két előre meghatározott élét (exclusion edges). A számolókeret pontos méretét és a benne elhelyezkedő képletek/sejtek felszíni sejtdenzitását (sejtek száma per mm2) a Confoscan mikroszkóp integrált számítógépes programja (Confo-Commander v2.7.1, Tomey, Erlangen, Németország) számolta ki. Az eljárás hitelességének verifkálása a „Validálás, Képméret és torzítás” részben leírtak alapján történt. A superficialis epithelialis, basalis epithelialis és az endothelialis sejtek esetében egységnyi területre eső, felszíni sejtdenzitást (sejtek száma per mm2) számoltunk, mivel ezek a sejtek megközelítőleg monolayert képeznek. A stromalis rétegek (elülső-, középső- és hátsó-stroma) esetében első lépésként a keratocyta sejtmagok felszíni sejtdenzitását (NA = sejtek száma per mm2) határoztuk meg a Confoscan mikroszkóp integrált számítógépes programja alkalmazásával a számolókeret és a megjelölt sejtmagok segítségével. Ezután, a stromális rétegekben szükséges egységnyi térfogatra eső, térfogati sejtdenzitás (NV = sejtek száma per mm3) kiszámítása sztereológiai elvek felhasználásával történt. Ehhez a számításhoz a mért felszíni sejtdenzitást elosztottuk az
63
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
optikai szeletvastagság (t) és a keratocyták az optikai szeletre merőleges átlagméretének (D) összegével: Nv = NA/(t + D) Ez a egyenlet az Abercrombie-féle korrekciós faktorból származik [335]. A vastagság t értéke (8 μm: lásd „Validálás eredményei”) a konfokális mikroszkóp pontválasz-függvényének (PSF) félértékszélességéből (FWHM) ered. A D értékének 1 μm-t vettünk, a szaruhártya fénymikroszkópos keresztmetszeti képein történt méréseink alapján. Ez az érték megfelel a szakirodalomban leírt keratocyta vastagságnak [329, 331]. Így számításaink során a képlet nevezőjében 9 µm optikai rétegvastagsággal számoltunk. Vizsgálatainkat a mikroszkópot a szaruhártya optikai tengelye mentén mozgatva, arra merőleges síkban végeztük. A teljes stromára vonatkozó sejtdenzitást az elülső-, középső és hátsó stroma sejtdenzitásainak súlyozott átlagából számoltuk, ahol a súlyszámként az adott réteg relatív vastagságát vettük figyelembe. Vizsgálataink során a sejtszámolás mindig két vizsgáló személy által történt, egymástól függetlenül, maszkolt módon. Rövid pilot tanulmányt követően a sejtek felismerése, azonosítása és megszámolása a két vizsgáló személy közötti megegyezés alapján történt.
Validálás Pontválasz-függvény (point spread function, PSF) A mikroszkóp optikai szekcionáló képessége az axiális felbontóképességtől függ. Az axialis felbontóképesség a pontválasz-függvény félértékszélessége (full-width at half maximum, FWHM) által meghatározott. A pontválasz-függvény magasreflektivitású minta fókuszsíkon keresztüli axiális mozgatásával mérhető [336]. A kísérleti set-up egy Melles-Griot MicroBlock™ 17 AMB 003 (Irvine, CA, U.S.A.) precíziós pozicionálóra szerelt Melles-Griot model 01 MFG 011 síktükörből állt. A mikroszkóp rögzítve volt, a fókusz adott síkra volt beállítva, majd a tükröt ezen a síkon keresztül mozgattuk 1 µmes lépésekben. Minden lépésben rögzítettük a tükör képét, majd az egyes képek intenzitásértékeiből kiszámítottuk a félértékszélességet.
64
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Képméret és torzítás A mikroszkóp optikai rendszerének ill. a képernyőnek a torzítását USAF 1951-es tesztábra (Melles-Griot model 04TRP003) (10. ábra) segítségével mértük, melyet különböző pozíciókban helyeztünk el a mikroszkóp előtt. A céltárgy egy kalibrált négyzetének méretét (55,2 µm x 55,2 µm) a Confoscan P4 szofverével minden pozícióban kiszámítottuk. A Confoscan P4 szoftver által megadott területértéket szintén hitelesítettük a céltárggyal.
A szaruhártyarétegek klasszifikációjának validálása A szaruhártyarétegek fent leírt definíciói és jellemzői alapján történő morfológiai klasszifikációját úgy validáltuk, hogy megmértük a mérési térfogat pozícióját az optikai tengely mentén. Ezt egy, a mikroszkóp mikrométercsavarjára szerelt preciziós potenciométerhez kötött digitális voltmérő segítségével oldottuk meg. Ez a módszer azonban nem mozgó (immobilis) szemet igényelt, hogy a referencia réteg és a optikai szeletek azonos koordinátarendszerben kerülhessenek rögzítésre. Mérést két szemen végeztünk, mérésünk alanyaként egyik alkalommal egész donor szemet (két óra post mortem), másik alkalommal egy egészséges élő személy egyik szemét használtuk. A konfokális mikroszkópos vizsgálatot a protokoll szerint végeztük, és kiválasztott képek mélységi helyzetét összehasonlítottuk a réteg morfológiai klasszifikációjával. Az általunk nem vizsgált rétegek vastagságértékeit az irodalmi adatok alapján vettük figyelembe: szárnyas sejtek (wing cells) rétege 20 µm [328, 329], Bowman-membrán 10 µm [327, 329] és Descemet-membrán 10 µm [327].
10. ábra USAF 1951-es tesztábra és scanning-slit konfokális mikroszkópos képe
65
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
A mérések megismételhetősége Az
adott
meneten
belüli
ismételhetőség
(intra-session
repeatability)
meghatározásához az adott szaruhártyán egy adott vizsgálati alkalommal rögzített képekből két különböző alkalommal válogattunk a sejtszámolásra optimális és legmegfelelőbb képeket. A mérések közötti ismételhetőség (inter-session repeatability) meghatározásához az adott szaruhártyán magát a vizsgálatot is megismételtük, a második vizsgálat az első alkalom után 14 nappal történt. A mérést két vizsgálószemély végezte három egészséges önkéntes szaruhártyáján. Az ismételhetőségi koefficiensek számítása a Brit Szabványügyi Hivatal (British Standards Institution) iránymutatása alapján történt [337]. A koefficiensek kiszámításához a mérések közti különbség standard deviációját 1,96-tal szoroztuk meg. Ez képviseli a kísérletek közti maximum megjósolt különbséget 95%-os konfidenciaszint mellett.
A sejtdenzitások validációja A konfokális corneamikroszkóp alkalmazásával végzett sejtdenzitás méréseinket minden szaruhártyaréteg esetében ugyanazon a szaruhártyán végzett hagyományos szövettani módszerrel validáltuk. Három friss humán donor corneán végeztünk konfokális corneamikroszkópos, majd fénymikroszkópos (Nikon Eclipse TE 300, Tokyo, Japán) vizsgálatot a szaruhártya optikai tengelyére merőleges képsíkokban, majd a két módszerrel kapott eredményeket összehasonlítottuk (11. ábra). A szaruhártyák donorai szemészeti betegségektől mentesek voltak. A donor corneák megelőző biomikroszkópos vizsgálat során épnek tűntek, nem mutattak semmilyen morfológiai elváltozást. A donor szemek begyűjtése után (két óra post mortem), a szaruhártya minden rétegére kiterjedően a vizsgálati protokollnak megfelelő konfokális mikroszkópos vizsgáltot végeztünk. Közvetlenül a vizsgálat után a szaruhártyát kimetszettük 8 mm átmérőjű kalibrált trepán alkalmazásával és 10%-os pufferolt formalinnal fixáltuk. A fixálás után a szaruhártyakorong átmérőjét mérőkörző segítségével megmértük. A zsugorodás mértékét a szaruhártyakorong fixálás előtti és utáni átmérőjének összehasonlításából nyertük. A szaruhártyakorong szövettani vizsgálatra előkészítése paraffinba beágyazással, majd 8 µm vastagságú frontális metszetek vágásával folytatódott. A metszeteket hematoxylin-eosinnal festettük. A térfogati sejtdenzitást a megfelelő felszíni sejtdenzitásból számítottuk, hasonlóan, mint a konfokális
66
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
11. ábra Basalis epithelialis sejtréteg „en face” képe A: szövettani módszerrel (hematoxylin-eosin festés), B: konfokális mikroszkópiával
mikroszkópos módszernél (sztereológiai eljárás alkalmazásával), a szövetzsugorodás figyelembevételével,
melyet
minden
szaruhártyaréteg
esetében
egyenlőnek
feltételeztünk. Az eredményeket Bland és Altman statisztikai módszere szerint elemeztük [338].
Statisztikai módszerek Minden szaruhártyaréteg esetében kiszámítottuk az átlagos sejtdenzitást minden vizsgált csoportra és vizsgáló személyre vonatkozóan. A sejdenzitás értékek rétegenkénti eloszlásának normalitását D’Agostino-féle eljárással vizsgáltuk, mind a diabeteses betegcsoportokban, mind pedig az egészséges kontrollcsoportban [339]. A diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek értékei közötti különbséget a superficialis epithelialis, basalis epithelialis, endothelialis és teljes stroma rétegek esetén kétszélű t-próbával elemeztük, amikor az értékek normáleloszlást mutattak, és a MannWhitney
U
teszttel,
amikor
nem
mutattak
normáleloszlást.
A
többszörös
összehasonlítások során a szignifikanciaszinteket Bonferroni eljárása szerint korrigáltuk [340]. A vizsgálatot úgy terveztük, hogy 5%-os első fajú hiba mellett ( = 0,05), 90% statisztikai erővel ( = 0,1) már 30% eltérést ki tudjon mutatni a teljes stromális sejtdenzitásban. Ez az eltérési szint azért fontos, mert segít megállapítani, hogy a diabeteses szaruhártyákban észlelt autofluoreszcenciaváltozás (+42% az ETDRS szerinti 20-as szintű diabeteses retinopathiákban) miképpen viszonyul a stromális sejtek sűrűségének változásához. A diabeteses szaruhártyákon végzett sejdenzitás vizsgálat esetében a kísérlet tervezése során a validálás során egészséges szarhártyákon azonos
67
PhD értekezés metodikával
Dr. Popper Mónika mért
sejdenzitás
értékeket
illetve
azok
szórásait
tekintettük
referenciaértéknek [227]. A legkisebb érzékelhető különbség értékei minden szaruhártya réteg esetén a minta méretéből, a mért szórásból, valamint a t-eloszlás kritikus értékeiből lettek számítva az elvárt szignifikanciaszint és statisztikai erő mellett ( = 0,05, = 0,10) [339]. Ezek az értékek azt a legkisebb különbséget jelentik, amely az esetek 90%-ában 95%-os biztonsággal detektálható. A három stromális réteg (mélység) átlagos denzitásértékének egészségesek és betegek közötti összehasonlítására varianciaanalízist (ANOVA) végeztünk, Tukey-féle post hoc összehasonlítással, amennyiben az eloszlások normálisak voltak, Nemenyi próbával [341] kiegészítve. A subbasalis idegrostréteg vizsgálata során a minták normalitását Shapiro-Wilk teszttel ellenőriztük. A minták közötti különbséget az eloszlás normalitása esetén ANOVA-val végeztük, Tukey-féle post hoc összehasonlítással, egyébként KruskalWallis tesztet alkalmaztunk. Az elvárt szignifikanciaszint minden esetben 0,05 volt. A szaruhártya stromában megfigyelt magasreflektivitású képletek számának és értékeinek összehasonlítására kétszélű t-próbát alkalmaztunk.
68
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
VII. EREDMÉNYEK 1. Mérések egészséges kontroll vizsgálati személyeken, a sejtszámolási módszer kidolgozása, validálása eredményei. Pontválasz-függvény (point spread function, PSF), képméret és torzítás A mért pontválasz-függvény (PSF) félértékszélességének (FWHM) értéke 8 m. A képtorzítás eredményértékeit az 2. táblázat tartalmazza. Az 55,2 µm x 55,2 µm (= 0.00305 mm2) méretű kalibrációs minta a képernyő öt különböző pontján mért átlagos
szélessége
57,4 ± 0,9
µm,
magassága
53,0 ± 1,4
µm,
területe
0,00304 ± 0,000094 volt. A maximális eltérés kisebb volt, mint 3%.
2. táblázat Kép torzítás. Helyzet a képernyőn*
Szélesség† (µm)
Magasság† (µm)
Terület† (mm2)
Centrum
57
52
0,00297
Alul balra
56
54
0,00302
Alul jobbra
58
52
0,00302
Felül balra
58
54
0,00313
Felül jobbra
58
54
0,00313
Átlag ± standard deviáció
57,4 ± 0,9
53,0 ± 1,4
0,00304 ± 0,000094
*A 55,2 µm x 55,2 µm = 0.00305 mm2 méretű kalibrációs minta helyzete a képernyőn. † Mért értékek.
A szaruhártyarétegek klasszifikációjának validálása A 3. táblázat tartalmazza a morfológiai klasszifikáció validálásának eredményeit. Minden, a klasszifikáció szerint meghatározott szaruhártyaréteg az elvárt mélységben került kiválasztásra, kivéve az in vivo mért basalis epithelialis sejtréteg, mely 3%-kal volt az elvárt pozíció alatt. A cornea teljes vastagságértékét minden esetben ultrahangos pachymetriával (Pachette®, DGH Technology Inc., Exton, PA, U.S.A.) erősítettük meg.
69
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
A mérések megismételhetősége: adott meneten belüli ismételhetőség (intra-session repeatability) és mérések közötti ismételhetőség (inter-session repeatability) Az átlagos (minden szaruhártyarétegre, mindkét vizsgálószemélyre vonatkozó) adott meneten belüli ismételhetőségi koefficiens 5,8 % (0,4 – 10,2%), és az átlagos menetek közötti ismételhetőségi koefficiens 8,3% (1,9 – 16,9%) volt. Mindkét esetben az endothelium rétegénél volt megfigyelhető a legjobb megismételhetőség.
A sejtdenzitások validálása A 4. táblázat mutatja be a konfokális mikroszkóppal mért sejtdenzitások validálását hagyományos szövettani módszerrel. Az eredményeket három humán donor szaruhártya felhasználásával nyertük, azonos szemek konfokális mikroszkópos vizsgálatával, majd hagyományos szövettani feldolgozása útján. A két módszer révén nyert értékek közötti eltérés átlagosan -1,3% volt, és -24,1% (hátsó stroma réteg) és +16,4% (basalis epithelialis réteg) között változott. A két eljárás stromarétegekre vonatkozó sejtdenzitásértékek átlagos különbsége -2377 sejt/mm3 volt. A megegyezés 95%-os konfidenciaküszöbei -10742 sejt/mm3 és 5989 sejt/mm3 voltak. A két módszer superficialis epithelialis, basalis epithelialis és endothelialis rétegekre vonatkozó sejtdenzitásértékek átlagos különbsége -22,1, 899,1 és 231,1 sejt/mm2 volt. A mért átlagos szövetzsugorodás 6,0% volt.
Az egészséges vizsgálati személyek szaruhártyáiban mért sejtdenzitásértékek Az egészséges vizsgálati személyek szaruhártyáiban mért sejtdenzitásértékek meghatározásához minden szaruhártyaréteg esetében öt különböző képen végeztünk sejtszámolást. A kapott sejtdenzitás eredményeinket az 5. táblázat foglalja össze és hasonlítja az irodalomban található más szerzők vizsgálataihoz.
70
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
A superficialis epithelialis sejtréteg felszíni sejtdenzitása 759 ± 162 sejt/mm2 (átlag ± SD; N=20) volt. A basalis epithelialis sejtréteg felszíni sejtdenzitása 5817 ± 632 sejt/mm2 volt. A
szaruhártyastroma
(19578 ± 4421 sejt/mm3)
középső
rétegének
szignifikánsan
alacsonyabb
térfogati volt,
sejtdenzitása
mint
(28616 ± 3081 sejt/mm3) vagy hátsó stromarétegé (26073 ± 5962 sejt/mm3). Az endothelium felszíni sejtdenzitása 2743 ± 285 sejt/mm2 volt.
71
az
elülső-
3. táblázat A szaruhártyarétegek mélysége. Elméleti értékek †
Sejt vagy szaruhártya réteg *
Az endotheliumtól mért távolság in vitro (donor szem)
Vastagság
Tartomány a szaruhártyában
1. vizsgálószemély ‡
2. vizsgálószemély ‡
in vivo (egészséges személy) Ultrahangos pachymetria
1. vizsgálószemély ‡
Ultrahangos pachymetria
(m)
%
%
(m)
%
(m)
%
(m)
(m)
%
(m)
Superficiális epithelialis
10
2
98 – 100
629
100
640
100
675,0 ± 5,1
580
100
555,0 ± 3,4
(Szárnyas/wing sejtek)
20
4
94 – 98
-
-
-
-
-
-
-
-
Basalis epithelialis
20
4
90 – 94
572
91
581
91
-
502
87
-
(Bowman-membrán)
10
2
88 – 90
-
-
-
-
-
-
-
-
Elülső stroma
150
30
58 – 88
559
89
556
87
-
440
76
-
Középső stroma
174
34,8
23,2 – 58
267
42
298
47
-
188
32
-
Hátsó stroma
100
20
3,2 – 23,2
53,6
8,6
59,5
9,3
-
37,2
6,4
-
(Descemet-membrán)
10
2
1,2 – 3,2
-
-
-
-
-
-
-
Endothelialis
6
1,2
0 – 1,2
0
0
0
-
0
0
-
500
100
Összesen
0
* Szaruhártya sejtréteg a klasszifikáció alapján. Zárójelben: csak irodalmi adatok. †
Specifikáció alapján és feltételezve, hogy a normál szaruhártya vastagsága 500 m.
‡
Távolság a konfokális mikroszkóp mélység pozíció állító csavarjához kapcsolt kalibrált potenciométerrel.
4. táblázat A konfokális mikroszkópos módszerrel nyert sejtdenzitásértékek validálása (3 donor szemen). Sejtréteg*
Felszíni sejtdenzitás (sejt/mm2)
Térfogati sejtdenzitás † (sejt/mm3)
Különbség
Konfokális
Szövettan‡
átlag ± SD (%)
átlag ± SD (%)
Superficiális epith.
1014 ± 129 (12,7)
1037 ± 222 (21,4)
- 2,2
Basalis epithelialis
5945 ± 622 (10,5)
5046 ± 896 (17,8)
Elülső stromalis
320,9 ± 81.6 (25,4)
Középső stromalis
Különbség
Konfokális
Szövettan‡
átlag ± SD (%)
átlag ± SD (%)
+ 16,4
-
-
-
316,0 ± 77,8 (24,6)
+ 1,5
35740 ± 8075 (22,6)
33484 ± 9099 (27,2)
+ 6,5
193,2 ± 48.7 (25,2)
212,5 ± 15,0 (7,1)
- 9,5
21205 ± 4982 (23,5)
24284 ± 3617 (14,9)
- 13,5
Hátsó stromalis
233,1 ± 55.5 (23,8)
296,9 ± 74,1 (24,9)
- 24,1
26401 ± 6911 (26,2)
32708 ± 9054 (27,7)
- 21,3
Endothelialis
2455 ± 285 (11,6)
2224 ± 563 (25,3)
+ 9,9
-
-
-
(%)
* Szaruhártya sejtréteg a klasszifikáció alapján. †
Térfogati sejtdenzitás: mért felszíni sejtdenzitás értékből sztereológiai módszerekkel számítva.
‡
Azonos minta szövettani vizsgálata, korrigálva 6,0% szövetzsugorodás miatt.
(%)
5. táblázat Szaruhártya sejtdenzitás értékek különböző tanulmányokban. Szaruhártya sejtréteg
Típus*
Átlagos sejdenzitás ( %SD) Tanulmányunk
Patel és mtsai [228]
Hahnel és mtsai [330]
Berlau és mtsai [229]
Mustonen és mtsai [225]
Grupcheva és mtsai [342]
N† = 20
N† = 69
N† = 3 in vitro
N† = 49
N† = 58
N† = 30
24-74 év‡
12-80 év‡
-
22-69 év‡
20-84 év‡
70 ±5 év
Superficiális epithelialis
s
759 (21,4)
-
-
-
1213 (30,5)
-
Basalis epithelialis
s
5817 (10,9)
-
-
-
5699 (10,6)
-
Elülső stromalis
v
28616 (20,7)
28838 (30,9)
26100
24320 (27,7)
-
27417 (16,9)
Középső stromalis
v
19578 (22,6)
19241 (15,0)
18500
11610 (37,0)
-
-
Hátsó stromalis
v
26073 (11,8)
19947 (16,3)
14100
18850 (24,5)
-
32325 (15,2)
Endothelialis
s
2743 (10,4)
-
-
-
3055 (12,6)
* s = felszíni sejtdenzitás (sejt/mm2); v = térfogati sejtdenzitás (sejt/mm3) †
N = szemek száma
‡
Életkor.
- Nem meghatározott
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2.A. A diabeteses betegek szaruhártyáiban mért sejtdenzitásmérés eredményei A tanulmányban résztvevő diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek klinikai adatait az 6. táblázat tartalmazza. A diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek életkora nem különbözött egymástól szignifikánsan (kétszélű tpróba, p = 0,67). Minden, a vizsgálatban résztvevő szaruhártya teljesen transparens volt és réslámpás vizsgálattal nem mutatott semmilyen kórosat. Szembetűnő, látható morfológiai eltérést a diabeteses betegek és az egészséges 6. táblázat A vizsgált személyek klinikai adatai (Sejtrétegek denzitása esetén)
Egészséges kontroll személyek
Diabeteses betegek
Szám
15
15
Nem
4 férfi, 11 nő
9 férfi, 6 nő
Életkor (átlag ± SD) (év)
59,3 ± 11,0*
60,9 ± 8,5*
Életkor (év)
35 – 74
39 – 69
Diabetes fennállási ideje (átlag ± SD) (év)
11,3 ± 6,2
Diabetes fennállási ideje (év)
2 - 20
* Nem szignifikáns különbség a diabeteses betegcsoport és az egészséges kontrollcsoport között (Kétszélű tpróba, p = 0,672)
kontrollszemélyek sejtjei között egyik szaruhártyarétegben sem figyeltünk meg. Enyhe diabeteses retinopathiában szenvedő beteg szaruhártyájának jellemző in vivo konfokális mikroszkópos képei láthatóak a 12. ábran. A számított sejtdenzitásértékek minden szaruhártyarétegben az optikai tengely mentén normáleloszlást mutattak a D’Agostino-féle próba szerint. Mivel a vizsgálószemélyek
által
mért
értékek
közötti
ismételhetőség
(inter-observer
repeatability) átlagosan 7,2% volt, a két vizsgálószemély által mért értékek átlagolásra kerültek. Az eredményeket a 7 – 9. táblázat foglalja össze.
75
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
12. ábra Enyhe diabeteses retinopathiában szenvedő 67 éves férfibeteg (20 éve NIDDM) szaruhártyájának típusos in vivo konfokális mikroszkópos képe. A: superficialis epithelium, B: basalis epithelialis sejtek rétege, C: elülső stroma, D: középső stroma, E: hátsó stroma, F: endothelium.
76
7. táblázat Sejtdejtdenzitás értékek diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek szaruhártyáiban. Réteg
Egységnyi területre jutó sejtszám
Egységnyi térfogatra jutó sejtszám
(sejt/mm2)*
(sejt/mm3)*†
Egészséges
Diabeteses
Egészséges
kontrollok
betegek
kontrollok
átlag ± SD (%)
átlag ± SD (%)
Superficialis epithelialis
725 ± 171 (23,6)
Eltérés
MDD§
Diabeteses betegek
Relatív
p-érték‡
átlag ± SD
átlag ± SD
(%)
815 ± 260 (31,9)
-
-
+ 12,4
0,5
270 (37,2%)
Basalis epithelialis
5950 ± 653 (11,0) 5060 ± 301 (5,9)
-
-
- 15,0
0,0004
624 (10,5%)
Teljes stroma
180 ± 27.3 (15,2) 201 ± 18.9 (9,3)
19980 ±3031
22360 ± 2088
+ 11,9
0,07
3194 (14,2%)
Endothelium
2690± 302 (11,2) 2660 ± 364 (13,7)
-
-
- 1,5
> 0,5
411 (15,2%)
* Mindkét vizsgálószemély által mért értékek átlaga † Az egységnyi területre jutó sejtszám értékből számítva az effektív optikai vastagság (9µm) felhasználásával [227] ‡ Kétszélű t-próba, a rétegek közötti többszörös összehasonlítás Bonferroni módszere szerint korrigálva § Legkisebb kimutatható különbség (MDD): az a legkisebb különség, ami az esetek 90%-ában 95%-os valószínűséggel detektálható ( = 0,05, = 0,10)
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
8. táblázat A szaruhártya stroma rétegek sejtdejtdenzitás értékei diabeteses betegekben és egészséges kontrollszemélyekben Sejtréteg
Egységnyi térfogatra jutó sejtszám (sejt/mm3)*† Egészséges kontrollok
Diabeteses betegek
átlag ± SD (%)
átlag ± SD (%)
Elülső stromalis
26300 ± 4090 (15,6) 27560 ± 3880 (14,1)
Középső stromalis
19390 ± 3120 (16,1)
Hátsó stromalis
25700 ± 3260 (12,7) 25790 ± 3090 (12,0)
21930 ± 2110 (9,6)
*, † mint a 7. táblázatban
Az egységnyi területre eső sejtszám a superficialis epithelialis, basalis epithelialis és endothelialis rétegekben, az egységnyi térfogatra eső sejtszám a teljes stromában és a diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek közti relatív különbségek a 7. táblázatban szerepelnek. A basalis epithelialis rétegben erőteljesen szignifikánsan alacsonyabb sejtdenzitást figyeltünk
meg
a
diabeteses
betegek
szemében,
mint
az
egészséges
kontrollszemélyekében (-15,0%, p = 0,0004). A többi szaruhártyarétegben nem találtunk szignifikáns sejtdenzitásbeli különbséget a diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek között (p > 0,07). Az egységnyi térfogatra eső stromalis sejtek (keratocyták) számát (8. táblázat) kétutas ANOVA módszerrel elemeztük, faktorként a betegség megléte és a stromaréteg (mélység) szerepelt. A csoportok közötti post-hoc összevetést Tukey-teszttel végeztük. Az analízis alapján a betegség megléte (egészséges vagy cukorbeteg) mint faktor nincs hatással a stromalis sejtsűrűségre (p = 0,067; legkisebb kimutatható különbség, MDD: 1090 sejt/mm3). Ezzel szemben a stromális réteg (mélység) mint faktor szignifikáns hatással bír a stromális sejtsűrűségre, mégpedig úgy, hogy a középső stroma sejtsűrűsége szignifikánsan alacsonyabb mint akár az elülső, akár a hátsó stromáé (p < 0,0001; MDD: 6540 sejt/mm3). Másképp fogalmazva: annak ellenére, hogy a középső
stromaréteg
sejtsűrűsége
mind
betegekben,
mind
egészségesekben
alacsonyabb, mint az elülső vagy hátsó stromáé, nem találtunk szignifikáns eltérést a két
78
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
9. táblázat A szaruhártya stroma rétegek (mélységek) sejtdenzitásai közötti különbségek Stroma rétegek
Egészséges kontrollok
Diabeteses betegek
Differencia
Szignifikancia
Differencia
Szignifikancia
(%)
(p-érték)†
(%)
(p-érték)†
Középső vs. Elülső
-26,3
<0,001
-20.4
<0,001
Középső vs. Hátsó
-24,6
<0,001
-15.0
<0,02
Hátsó vs. Elülső
-2,6
>0,5
-6.4
0,429
Mindhárom réteg
<0,0005
<0,0005
†
ANOVA az átlagos sejtdenzitások többszörös összehasonlítására a három stromális rétegben (mélységben)
vizsgált csoportban az azonos mélységben levő sejtrétegeket összevetve. Nem találtunk továbbá kapcsolatot a betegség megléte és a stromális réteg (mélység) között (p = 0,36). A szaruhártya stroma különböző rétegeiben (mélységeiben) mért sejtdenzitás értékeket a 9. táblázatban mutatjuk be, mind diabeteses betegekben, mind pedig egészséges kontrollszemélyekben. Az eredményeink megerősítik, hogy a stroma középső részében a sejtdenzitás alacsonyabb, mint az elülső és a hátsó stroma részben, mind diabeteses betegekben, mind pedig egészséges kontrollszemélyekben. A stroma különböző rétegeiben (mélységeiben) mért relatív sejtdenzitás értékek különbségei minden vizsgálati személy esetében kiszámításra kerültek. A sejtdenzitás értékek variációját kétfaktoros ANOVA-val dolgoztuk fel, egyik faktorként a betegség meglétét, másik faktorként pedig a stromaréteget tekintve. Az elemzés kimutatta, hogy a betegség meglétének nincs hatása a relatív sejtsűrűség variációira (p = 0,17), bár a relatív sejtdenzitás variációja a középső és a hátsó stroma között majdnem szignifikánsan alacsonyabb volt cukorbetegekben, mint egészségesekben (p = 0,053).
79
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
10. táblázat A vizsgált személyek klinikai adatai (Subbasalis idegrostréteg vizsgálata esetén) Egészséges kontroll személyek
Diabeteses betegek, enyhe retinopathia (DP 20)
Diabeteses betegek, közepes retinopathia (DP 35)
Szám
10
10
10
Nem
4 férfi, 6 nő
5 férfi, 5 nő
6 férfi, 4 nő
Életkor (átlag ± SD) (év)
60,1 ± 7,98
58,9 ± 9,37
60,1 ± 5,65
Életkor (év)
28 – 74
39 – 69
57 – 67
Diabetes fennállási ideje (átlag ± SD) (év)
12,3 ± 5,6
16,3 ± 12,3
Diabetes fennállási ideje (év)
3 - 20
5 - 40
2.B. A subbasalis idegrostréteg vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban eredményei A tanulmányban résztvevő diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek klinikai adatait az 10. táblázat tartalmazza. A diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek életkora nem különbözött egymástól szignifikánsan. A vizsgálatban résztvevő minden szaruhártya teljesen transzparens volt és réslámpás vizsgálattal nem mutatott semmilyen kórosat. A képelemzés során kiválasztottuk a subbasalis idegrostrétegnek megfelelő képeket, majd ezeken meghatároztuk képenként a látható idegrostok számát. A diabeteses betegcsoportokban és az egészséges kontrollszemélyek szaruhártyáiban a subbasalis idegrostok képenkénti átlagos számát a 11. táblázat tartalmazza. A subbasalis idegrostok képenkénti átlagos száma enyhe fokú diabeteses retinopathiában és közepes fokú diabeteses retinopathiában szenvedő betegek corneáiban egymáshoz 11. táblázat A diabeteses betegcsoportokban és az egészséges kontrollszemélyek szaruhártyáiban a subbasalis idegrostok képenkénti átlagos száma. Subbasalis idegrost köteg / kép DP 20
DP 35
HC
n = 10
n = 10
n = 10
1,25 ± 0,52
1,22 ± 0,60
3,90 ± 1,13
80
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
13. ábra Subbasalis idegrostréteg típusos in vivo konfokális mikroszópos képe A: egészséges szaruhártyában, B: diabeteses szaruhártyában
hasonló: 1,25 ± 0,52 és 1,22 ± 0,60 (p = 0,996), azonban mindkettőben szignifikánsan alacsonyabb, mint egészséges kontrollokéban (3,90 ± 1,13) (p < 0,001). A diabeteses corneák subbasalis idegrostrétegének denzitásbeli csökkenése mellett megfigyeltük az idegrostkötegek kanyargósabbá válását. A 13. ábra egészséges (A kép) és diabeteses (B kép) szaruhártyában a subbasalis plexusban az idegrostkötegek (nerve fiber bundles, NFB) típusos megjelenését mutatja in vivo scanning-slit konfokális mikroszkópos képeken. A 14. ábra egészséges (A kép) és diabeteses (B kép) szaruhártyában a subbasalis plexusban az idegrostkötegek (nerve fiber bundles, NFB) típusos megjelenését mutatja in vitro, félvastag metszetek toluidinkék festése utáni fénymikroszkópos képeken. (A képeket munkatársunk, Dr. Linda J. Müller készítette a The Netherlands Ophthalmic Research Institute (NORI)-ban, Amszterdamban.) A 15. ábran diabeteses szaruhártyák subbasalis plexus idegrostkötegeinek és subbasalis rétegben található magasreflektivitású sejteknek az in vivo konfokális mikroszkópos képeken megfigyelthez hasonló jellemzők láthatók in vitro vizsgálat 12. táblázat A diabeteses betegcsoportokban és az egészséges kontrollszemélyek szaruhártyáiban a basalis epithelialis réteg sejtdenzitásértékei. Basalis epithelialis sejtek denzitása (sejt/mm2) DP 20
DP 35
HC
n = 10
n = 10
n = 10
5145 ± 237
5042 ± 236
5648 ± 236
81
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
során fénymikroszkópos képeken (A,B kép) valamint a deformálódott/degenerálódott idegek transzmissziós elektronmikroszkópos képeken (C,D kép). (A képeket munkatársunk, Dr. Linda J. Müller készítette a The Netherlands Ophthalmic Research Institute (NORI)-ban, Amszterdamban.) A diabeteses betegcsoportokban és az egészséges kontrollszemélyek szaruhártyáiban a basalis epithelialis réteg sejtdenzitásértékeit a 12. táblázat tartalmazza. A basalis epithelialis réteg sejtdenzitása enyhe fokú diabeteses retinopathiában és közepes fokú diabeteses
retinopathiában
szenvedő
betegek
corneáiban
nem
különbözött
szignifikánsan egymástól. Hasonlóan a subbasalis idegek sűrűségéhez, a basalis epithelialis sejtek denzitása is szignifikánsan alacsonyabb volt mindkét diabeteses csoportban, mint egészséges kontrollokéban (p < 0,001). Továbbá, magasreflektivitású sejteket (highly reflective cells, HRC) figyeltünk meg
14. ábra Subbasalis idegrostréteg in vitro fénymikroszkópos képe (félvastag metszet, toluidinkék festés) A: egészséges szaruhártyában, B: diabeteses szaruhártyában
15. ábra Diabeteses cornea subbasalis idegrostrétege A,B: in vitro fénymikroszkópos képen (félvastag metszet, toluidinkék festés), C,D: deformálódott/degenerálódott idegek transzmissziós elektronmikroszkópos képeken
82
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
13. táblázat A diabeteses betegcsoportokban és az egészséges kontrollszemélyek szaruhártyáiban a subbasalis rétegben található magasreflektivitású sejtek sejtdenzitásértékei. Magasreflektivitású sejtek / kép DP 20
DP 35
HC
n = 10
n = 10
n = 10
2,36 ± 1,12
3,10 ± 0,97
1,13 ± 0,72
a basalis epithelialis sejtek rétege alatt, jellemzően a subbasalis idegek mentén (ld. 16. ábra). Ezen magasreflektivású sejtek morfológiája különbözik a keratocyták magjától. A diabeteses betegcsoportokban és az egészséges kontrollszemélyek szaruhártyáiban a subbasalis rétegben található magasreflektivitású sejtek sejtdenzitásértékeit a 13. táblázat tartalmazza. A subbasalis rétegben található magasreflektivitású sejtek magasabb denzitását figyeltük meg mind enyhe fokú diabeteses retinopathiában, mind pedig közepes fokú diabeteses retinopathiában szenvedő betegek szaruhártyáiban az egészséges kontrollokéhoz (p < 0,02) viszonyítva. A subbasalis rétegben található magasreflektivitású sejtek számában nem volt szignifikáns különbség az enyhe és a közepes fokú diabeteses betegcsoport között (p = 0,207). A
16.
ábra
magasreflektivitású
diabeteses sejtek
szaruhártyában
típusos
a
megjelenését
subbasalis
rétegben
mutatja
subbasalis
a
található plexus
idegrostkötegei (NFB) mentén, in vivo scanning-slit konfokális mikroszkópos képeken. A képeken háttérben (nem fókuszban) az elülső stroma keratocytáinak sejtmagjai láthatók.
16. ábra Subbasalis idegrostréteg in vivo SSCM képei. Vékony idegrostkötegek (NFB) közelében magasreflektivitású sejtek (HRC) láthatók
83
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2.C. A szaruhártya stroma vizsgálatának eredményei diabeteses betegek szaruhártyáiban: stromális idegek, és egyéb magasreflektivitású képletek A szaruhártya állományának elülső és középső részében készített konfokális mikroszkópos képeinken, bizonyos felvételeken vaskos kötegszerű reflektív képleteket figyeltünk meg, melyek stromális idegeknek felelnek meg (17. ábra). In vivo konfokális corneamikroszkópos vizsgálataink során a szaruhártya stromájában igen magas reflektivitású fejből és halványabb (egyenes vagy hullámos) farokból álló képleteket figyeltünk meg, melyek elsősorban a szaruhártya stroma elülső és középső részében, ritkábban a hátsó részében helyezkednek el. Gyakran stromalis idegek mentén figyelhetők meg (18. ábra). A szaruhártya állományában egy, az epitheliumtól endotheliumig tartó területet áttekintő, konfokális mikroszkópos vizsgálat alatt átlagosan 52,5 ± 9,3 ilyen képletet találunk enyhe fokú diabeteses retinopathiában (DR) szenvedő betegekben, 40,0 ± 14,0 darabot közepes fokú DR-ban szenvedő betegek szaruhártyájában, míg egészséges
17. ábra Stromális idegek in vivo SSCM képei
84
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
18. ábra A szaruhártya stromában megfigyelt magas reflektivitású fejből és halványabb (egyenes vagy hullámos) farokból álló képletek, valamint stromális idegek, keratocyták in vivo SSCM képe, diabeteses betegek felvételei
kontrollszemélyek szaruhártyájában szignifikánsan alacsonyabb mennyiséget (6,8 ± 2,1, p < 0,001). A közepes fokú DR-ban szenvedő betegek szaruhártyájában ezeket a képleteket gyakrabban figyeltük meg a stroma hátsó részében, mint egyhe fokú DR-s betegeknél vagy egészségeseknél, és ilyenkor a közelükben kanyargós lefutású stromalis idegeket is gyakran láttunk. Egészségesekben a szaruhártya centrumában a hátsó stromában általában nem találhatók idegek. Az említett képletek átlagos hossza 19,5 ± 5,7 µm és szélessége 10,4 ± 4,4 µm, míg a keratocyták magjára jellemző hossz- és vastagságméretek 27,2 ± 2,5 µm és 9,5 ± 3,5 µm. Szignifikáns különbség van a képletek és a keratocyták magjának hossza között (p < 0,001), de nincs a vastagságuk között (p = 0,16). Az ép stromalis idegek egyenes lefutást mutatnak, elágazásokkal. A diabeteses betegek szaruhártyaállományában szintén megfigyeltünk a nagy stromalis idegekhez hasonló méretekkel (8–11 µm) rendelkező, hosszú, ám kanyargós lefutást mutató képleteket (19. ábra).
85
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
19. ábra Diabeteses betegek szaruhártya stromában megfigyelt kanyargós stromális ideg in vivo SSCM képe
86
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
VIII. MEGBESZÉLÉS 1. Mérések egészséges kontroll vizsgálati személyeken, in vivo sejtszámolási módszer kidolgozása, validálása Mint már említettük, a konfokális corneamikroszkópia in vivo, valós idejű és neminvazív módszer a szaruhártya szerkezetének és sejtrétegeinek vizsgálatára. A módszer a konfokális elven alapul, csak az egy tetszőleges kicsi térfogatban lévő struktúrákról visszaverődő fény ábrázolódik, mert a máshonnan visszaverődő, szórt fényt kizárva, így nagyfelbontású képeket biztosít a szaruhártya egy igen vékony szeletéről, megengedve benne struktúrák elemzését in vivo, anélkül, hogy hagyományos szövettani módszer alkalmazására kényszerülnénk. Módszert fejlesztettünk ki és validáltunk a szaruhártya különböző rétegeiben történő in vivo sejtszámolásra scanning slit konfokális mikrorszkópia alkalmazásával. Kimutattuk, hogy élő, eszméletén levő vizsgálati személyben, Tomey Confoscan P4 típusú konfokális corneamikroszkóp alkalmazásával a szaruhártya különböző rétegeiben megismételhető kvantitatív vizsgálatok lehetségesek szemimanuális sejtszámolási technika akalmazásával a kidolgozott morfológiai szaruhártyaréteg klasszifikáció alapján.
Megvizsgáltuk
minden
szaruhártyarétegre,
mindkét
vizsgálószemélyre
vonatkozó átlagos mérésen belüli és mérések közötti megismételhetőséget (intra- és intersession repeatability). A legjobb megismételhetőség az endothelium rétegénél volt megfigyelhető, mely a réteg jellemző morfológiai tulajdonságainak köszönhető, azaz a szabályos mintázatának és a sejtek magasabb reflektivitásának, melyek jelentősen megkönnyítik a sejtek azonosítását és számolását. Az általunk használt konfokális mikroszkóp mért pontválasz-függvény félérték szélessége (8 m) jól megfelel a Confoscan P4 konfokális mikroszkóp más szerzők által leírt jellemző illetve a műszer specifikációjában megadott axiális optikai rétegvastagság (10 m) értékének [197, 198, 225], és valószínűleg jobb, mint amit Cavanagh és mtsai említenek a Tomey scanning-slit rendszerű konfokális mikroszkópra jellemző értéknek (15 m) [209].
87
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
A kép méretbeli hibája és torzítása jócskán az elfogadható határokon belül volt (3%). A szaruhártyarétegek mélységére vonatkozó mérések (3. táblázat) megmutatták, hogy a morfológiai alapú réteg- és sejt klasszifikáció használatával lehetséges a szaruhártya különböző rétegeinek jól megismételhető, következetes elkülönítése. Bármilyen új vizsgálati módszer hasznossága és megbízhatósága csak a korábban már alkalmazott és megbízhatónak bizonyult vizsgálati módszerekkel való összevetés útján bizonyítható. Ezért bármilyen, az in vivo konfokális corneamikroszkópián alapuló kvantitatív módszer, legyen az a sejtek méretének vagy sűrűségének meghatározása, csak az adott minták hagyományos szövettani módszerekkel történő feldolgozásával és elemzésével kapott adatokkal való módszeres összevetése (validálás) után, valamint a konfokális
mikroszkópos
mérések
megbízhatóságának
(reliability)
és
reprodukálhatóságának (repeatability) vizsgálata után válhat elfogadottá. A konfokális corneamikroszkóp alkalmazásával végzett sejtdenzitás méréseink hagyományos szövettani módszerrel történő validálása során mind a hat szaruhártya réteg esetében (4. táblázat) a két módszer elfogadható egyezését találtuk, mivel a két különböző módszerrel mért minden denzitáskülönbség a megegyezés szerinti/megfelelő határok közé esett. A konfokális mikroszkópos és hagyományos szövettani módszerekkel mért denzitásértékek legnagyobb különbségét a szaruhártya stroma hátsó rétegében (a posterior stromában) észleltük. Hasonló tapasztalatról számoltak be Patel és mtsai is [343], akik feltételezik, hogy a nagyobb különbség hátterében a szaruhártya stroma hátsó rétegét érő kevesebb fény és/vagy a szövetzsugorodás esetleges egyenetlensége állhat. Feltételezzük továbbá, hogy a konfokális mikroszkópos és hagyományos szövettani módszerekkel mért denzitásértékek közötti különbség eredhet a szövettani feldolgozás során a minta paraffinba való beágyazásából, mely ferde metszeteket eredményezhet. Az
egészséges
vizsgálati
személyek
szaruhártyáiban
mért
átlagos
sejtdenzitásértékeket az 5. táblázatban hasonlítottuk a megfelelő irodalmi adatokhoz. Az egészséges vizsgálati személyek szaruhártyáiban a superficialis epithelialis és basalis epithelialis sejtrétegben és az endotheliumban mért átlagos felszíni sejtdenzitásértékek megfeleltek a Mustonen és mtsai által mérteknek [225] (5. táblázat). Az egészséges vizsgálati személyek mindhárom szaruhártya stromarétegében mért átlagos térfogati
88
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
sejtdenzitásértékek (2,5·104 sejt/mm3) megközelítőleg megfeleltek a korábbi konfokális corneamikroszkópos vizsgálatok értékeinek: kb 2·104 sejt/mm3, [228, 229, 330] 1,6·104 sejt/mm3 [344], 4,1·104 sejt/mm3 [345] (5. táblázat). Ciancaglini és mtsai [346] a miénkhez hasonló rendszerű, de eltérő típusú műszert (Nidek Confoscan 2.0) alkalmazva a szaruhártya stroma elülső és hátsó részében az általunk mértnél magasabb felszíni sejtdenzitás értékeket írt le (értékek 650 és 514, szemben az általunk mért 258 és 235 sejt/mm2). Ezek a magasabb sejtdenzitásértékek feltehetőleg egy, az általunk használtnál
kevésbé
szigorú
sejtszámolási
algoritmus
eredményei.
A
mi
vizsgálatunkban a három stromaréteg sejtdenzitásértékének átlagos standard deviációja 28,6%, mely érték megfelel az egészséges vizsgálati személyekre vonatkozó, az irodalomban fellelhető értékeknek (28,8% [229], 14%-tól 31%-ig [228]). A szaruhártyastroma középső részében alacsonyabb sejtdenzitást mértünk, mint az elülső (31,6%) és hátsó (24,9%) stroma rétegben. Ez a megfigyelésünk megerősíti Petroll és mtsai korábbi megfigyelését nyúl szaruhártyában (a stromában antroposterior irányban 30%-os sejtdenzitás csökkenés és enyhe emelkedés a Descemet-membránhoz közeli régióban [347]) és Berlau és mtsai megfigyelését egészséges emberi szaruhártyában (a legalacsonyabb sejtdenzitás érték a stroma középső részében [229]). Vizsgálatunkban a sejtdenzitás a szaruhártyastroma elülső részében magasabb volt, mint a hátsó stromarészben, de a különbség nem volt szignifikáns, szemben más szerzők vizsgálataival (+46% [330], +31% [228], +22% [229], -15% [342], +21% [346]). A szaruhártya stroma középső rétegére jellemző alacsonyabb sejtdenzitás lehetséges magyarázata a középső stromarétegnek az elülső- és hátsó stroma réteghez képesti alacsonyabb oxigén ellátottága lehet, mely hátterében az oxigén diffúzió mind az epithelium felőli, mind az endothelium felőli élettani korlátozottsága áll. A stroma rétegeiben a különböző oxigén koncentráció részben felelős lehet különböző stromarétegekben jellemző keratocyták morfológiai eltéréseiért is [330, 331]. Vizsgálatunkkal megmutattuk, hogy lehetséges in vivo a szaruhártya rétegekben pontos
és
megbízható
sejtdenzitásmérés
corneamikroszkóppal.
89
scanning-slit
rendszerű
konfokális
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2. A diabeteses keratopathia vizsgálata in vivo konfokális mikroszkópiával: kvantitatív és kvalitatív vizsgálatok 2.A. Sejtdenzitás-vizsgálatok diabeteses betegek szaruhártyáiban A diabeteses szem vizsgálata különös jelentőséggel bír napjaink egészségügyében, mivel a nyugati világban a látáscsökkenésnek és vakságnak az egyik legfőbb oka a cukorbetegség [17, 18, 348-353], így a diabeteses retinopathia grading-je napjainkban a klinikai gyakorlatban mind fontosabbá válik. A cukorbetegséggel összefüggő szaruhártyaelváltozások, melyeket diabeteses keratopathiának nevezünk, a betegek több, mint 70%-ában megfigyelhetők, és egyre szélesebb körben vizsgáltak [73, 354]. Ezek között klinikalag is megfigyehető elváltozások vannak: fokozott epithelialis törékenység [93], recidiváló szaruhártya erosiók
[73,
355],
csökkent
corneaérzékenység
[145,
356],
megnövekedett
autofluoreszcencia [46, 190], károsodott sebgyógyulás [73, 92, 355], megváltozott epithelialis [357] és endotheliális [358] barrier funkció és megnövekedett hajlam szaruhártyafekélyekre és –oedemára. Kísérletes tanulmányok leírtak sejtszintű elváltozásokat: az epithelium basalmembrán változását [33, 57-59, 69, 70, 76], a kollagénstruktúra megváltozását [359], az epithelium és az endothelium sejtjeiben polymegethismust
és
pleomorphismust
[132,
134,
135,
143],
a
subbasalis
idegrostrétegben az idegrostkötegek csökkent számát [25, 40, 360] és megnövekedett tortuozitását [32]. Célkitűzésünk a cukorbetegek szaruhártyáiban a betegség korai fázisában megjelenő kvalitatív és főleg kvantitatív változások vizsgálata volt, különös tekintettel a sejtszámváltozásra. A diabeteses corneák vizsgálataiban a különböző szaruhártyarétegekben mért sejtdenzitásértékek hasonló nagyságrendűek voltak, mint az azonos műszerrel és mérési protokollal végzett korábbi, egészséges szemekben végzett vizsgálatunknál [227]. Vizsálataink során a sejdenzitást a szaruhártya centrumában, az optikai tengelyben mértük. Mivel nem zárható ki, hogy a sejtdenzitás a szaruhártyarétegekben változhat a
90
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
szaruhártya perifériája felé, ahol a corneavastagság is nagyobb, lehetséges, hogy az általunk mért sejtdenzitás értékek nem jellemzik a teljes szélességében a réteget. A sejtdenzitásvizsgálatnál a diabeteses betegcsoport összes tagja enyhe fokú diabeteses retinopathiában (ETDRS szerinti 20-as szint) szenvedett. Bár a betegek jól beállított anyagcsereállapottal rendelkeztek, a microaneurysmák jelenléte elnyújtott hiperglikémiára utal, melyet a diabeteses retinopathiában fellépő vaszkuláris károsodás elsődleges okának tartunk [349, 350].
Superficialis epithelialis sejtek rétege Vizsgálatunkban
a
diabeteses
betegek
és
egészséges
kontrollszemélyek
szaruhártyáiban a superficialis epithelium sejtdenzitása nem különbözött egymástól szignifikánsan (p = 0,27). Korábbi vizsgálatok során diabetesben a basalis epithelialis sejtek magasabb turnover-ét valószínűsítették [33, 77], mely (feltehetőleg) ezeknek a sejteknek a felgyorsult differenciációjára és érésére utal. Elvileg ez a diabeteses szaruhártyákban a superficialis epithelialis sejtek megnövekedett sejtdenzitását eredményezné. Ez a lehetőség teljesen nem zárható ki a mi tanulmányunk alapján sem, mivel a superficialis epithelialis sejtek denzitására vonatkozó legkisebb kimutatható különbség (MDD) az egészségesekben mérhető denzitásérték 37%-ra tehető.
Basalis epithelialis sejtek rétege A basalis epithelialis réteg sejtdenzitása szignifikánsan alacsonyabb a diabeteses betegek szaruhártyáiban, mint az egészséges kontrollszemélyekében (-15%, p = 0,0004, 7. táblázat). Ez az eredmény ellentmond Frueh és mtsai megfigyelésének [143], akik nem találtak szignifikáns különbséget a diabeteses és egészséges személyek basalis epithelialis réteg sejtdenzitása között, habár az általuk leírt vizsgálatban a diabeteses betegcsoportban az denzitás átlagértéke 13%-kal alacsonyabb volt, mint a kontrollcsoportban. Az is említésre méltó, hogy az egészséges vizsgálati személyek basalis epithelialis rétegének sejtdenzitásértéke Frueh és mtsai megfigyelésében jóval alacsonyabb, mint amit a mi korábbi, a módszer validálására irányuló vizsgálatunk során leírtunk [227], vagy más szerzők leírtak [225, 361, 362]. A szaruhártya bármely adott kompartmentjében a sejtdenzitás steady state állapota a sejtproliferáció, differentáció, migráció és sejthalál szigorú szabályozásának és egyensúlyának eredménye. Habár a tanulmányunkban bemutatott adatok nem adnak
91
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
egyértelmű magyarázatot a basalis epithelialis sejtek csökkent sejtdezitásértékére diabeteses személyekben, különböző mechanizmusok kombinációja állhat vele összefüggésben illetve a hátterében. (1) Az in vivo konfokális mikroszkópiával a 2-es típusú diabeteses betegekben további vizsgálatunkban megfigyelt [25, 227] és 1-es típusú diabetesben az irodalomban leírt [40] károsodott subbasalis idegplexus eredményezheti a basalis epithelialis sejtek deplécióját, mivel a szaruhártya epithelium metabolizmusa a megfelelő cornealis beidegzéstől függ [32, 363]. A cornea szenzoros beidegzése látja el a szaruhártyát trofikus neuropeptidekkel, mint például a substance P és a calcitonin gene-related peptide (CGRP), melyek in vitro a cornealis epithelialis sejteknek mitosis rátáját növelik és befolyásolhatják az epithelialis sejtek viselkedését, mint a differenciáció és migráció [1, 364, 365]. (2) A diabetesszel kapcsolatba hozható anyagcsere rendellenességek érintik a basalmembránt és a basalis epithelialis sejteket, befolyásolják ezen sejtek adhezív tulajdonságukat és így a migrációjukat. A diabeteses szaruhártyákban ismert, hogy a basalis sejtek membránjában a hemidezmoszómák által elfoglalt terület aránya csökkent az egészségeshez képest [76, 82] és megváltozott a sejt- és extracelluláris mátrix (ECM) közötti viszony [76]. In vitro tanulmányok leírták, hogy a fibronectin nem-enzimatikus glikációja csökkenti az epithelialis sejtek adhézióját az extracelluláris mátrix ezen fehérjéjéhez, felvetve, hogy a glikált fehérjék befolyásolhatják az epithelialis sejtek tapadását és migrációját [366]. Továbbá a szaruhártya basalmembránjának adhéziós komplexei diabetesben szintén változás jeleit mutatják. Az adhéziós komplexek összetevőinek, mint a nidogen-1/entactin, a laminin-1, a laminin-10 és az epithelialis integrin α3β1, megfogyatkozását diabetesben több tanulmány leírta [55, 57, 59], és ez a molekuláris mechanizmus állhat az epithelialis sejtek adhéziójának rendellenességei hátterében. Az epithelialis sejtek specifikus proteinase activitásának szembetűnő megnövekedése szintén hozzájárulhat a basalmembrán és az adhézió változásaihoz [55, 56]. Egy másik tanulmány kimutatta [367], hogy a laminin glikációja a tapadó epithelialis sejtek számának szignifikáns csökkenéséhez vezetett. Így, a diabeteses szaruhártyákban a sejt adhézió károsodása valószínűleg befolyásolja a sejt migrációt, és szerepet játszhat a diabeteses betegekben megfigyelt basalis epithelialis sejtdenzitás csökkenésben.
92
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
(3) A diabeteses szaruhártyára jellemző változások egyike a megvastagodott basalmembrán [73, 354], melynek hátterében a basalis epithelialis sejtek fokális degenerációja következtében a sejthalál és -regeneráció megnövekedett rátáját valószínűsítik [33, 77]. A túl gyors sejt differenciáció és érés is hozzájárulhat a basalis epithelialis sejtdenzitás csökkenéséhez.
Szaruhártya stroma: keratocyták A szaruhártya stromában a mért keratocyta sejtdenzitás értékek túlbecsültek lehetnek, mert a térfogati sejtdenzitásértékek kiszámítása az Abercrombie-féle módszeren alapult, mely nem tökéletesen gömb alakzatok esetén hajlamos az érték 5 és 10%
közti
túlbecslésére
[335].
Mivel
a
betegcsoportokban
és
egészséges
kontrollszemélyekben is ugyanazt a műszert használtuk és azonos vizsgálati protokollt alkalmaztunk, a számított sejtdenzitásértékek összehasonlíthatók a csoportok között. A három szaruhártya stroma rétegben (mélységben) az átlagos standard deviáció kevesebb volt, mint 16,1% egészségesekben és diabeteses betegekben (8. táblázat), hasonlóan az egészséges szaruhártyákban végzett két korábbi tanulmányban leírthoz (28,8% [229], 14 – 31% [228]). A stroma egymásnak megfelelő sejtrétegei között ANOVA analízis végzésével nem találtunk sejtdenzitásbeli különbséget a diabeteses és egészséges kontrollszemélyek stromális sejtdenzitásaiban (p = 0,067). Vizsgálatunkban az egészséges vizsgálati személyek szaruhártyájában az optikai tengely
mentén
megfigyelt
jellemző
keratocyta
denzitás
eloszlás,
azaz
a
szaruhártyastroma középső részében az elülső (26,3%) és a hátsó (24,6%) stroma rétegben mértnél alacsonyabb sejtdenzitás megerősíti, amit a mi korábbi, a módszer validálására irányuló vizsgálatunk során egészséges emberi szaruhártyákban leírtunk [227], vagy Petroll és mtsai megfigyeltek nyúlban [347] és Berlau és mtsai szintén egészséges emberi szaruhártyában [229]. Jelen vizsgálatunkban a diabeteses betegek szaruhártyáiban is hasonló keratocyta denzitás eloszlást találtunk. A szaruhártya stroma középső rétegére jellemző alacsonyabb sejtdenzitás lehetséges magyarázata a többi stromarétegénél alacsonyabb oxigén ellátottsága lehet. Bár a diabeteses betegcsoportban, az egészséges kontrollszemélyek szaruhártyáihoz hasonlóan jellemző volt a stroma középső részének az elülső- és hátsó stromarétegeihez viszonyított alacsonyabb sejtdenzitása, a diabetes betegek szaruhártyáiban ez a
93
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
csökkenés kevésbé volt kifejezett, mint az egészséges kontrollcsoportban (15,0% versus 24,6%, p = 0,053, 9. táblázat), a különbség éppen nem szignifikáns. Ennek lehetséges magyarázata a szaruhártya megnövekedett glükóz koncentrációja diabetesben [97, 367, 368]. A megnövekedett glükóz koncentráció a nem-enzimatikus glikáció mértékét növeli és következményesen a késői glikációs végtermékek (AGE) felszaporodását eredményezi [192, 367]. Emberi bőr fibroblast tenyészetekkel végzett in vitro vizsgálatok szerint az AGE-k up-regulálják a kötőszöveti növekedési faktort (CTGF) [369]. A CTGF indukálja az extracelluláris mátrix (ECM) alkotóelemeit és növeli a fibroblast proliferációt [369]. Emiatt feltételezhetjük, a diabeteses szaruhártyában az AGE-k megnövekedett szintje a CTGF koncentráció emelkedéséhez és a fibroblast proliferáció növekedéséhez vezethet [369]. A megnövekedett fibroblast proliferáció megtöbbszörözi a stroma középső rétegének normálisan alacsony anyagcsere állapotát diabetesben, így az egészségesekben jellemzőnél magasabb keratocyta denzitást okozva. Vizsgálatunkban a szaruhártyastroma elülső részében magasabb sejtdenzitást mértünk, mint a hátsó stromarészben, de a különbség nem volt szignifikáns (egészséges kontrollszemélyekben 2,6%, diabeteses betegekben 6,4%), szemben más szerzők vizsgálataival (+46% [330], +31% [228], +22% [229], -15% [342], -21% [346]). A tanulmányok közötti eltérés hátterében az egyik lehetséges ok a tanulmányunkban a vonatkozó legkisebb kimutatható különbség (MDD; 6540 sejt/mm3) állhat, ami gyakorlatban azt jelenti, hogy a stroma elülső rétegére jellemző sejtdenzitás értékének 25%-ánál nagyobb különbség érzékelhető. További lehetséges ok lehet az eltérő tanulmányokban a stroma hátulsó rétegének (posterior stroma) eltérő definíciója, illetve adott tanulmányban [346] a szaruhártya vizsgált betegsége. Vizsgálatunkban nem találtunk szignifikáns összefüggést a szaruhártya stroma középső rétegének sejtdenzitása és a vizsgált személyek életkora között, sem a diabeteses betegcsoportban, sem pedig az egészséges kontrollszemélyekben. Ez ellentmond két korábbi és egy frissebb, egészséges személyeken végzett tanulmánynak [177, 228, 229]. Ennek valószínű oka a mi vizsgálatunk szűk korcsoportválasztása (többségében 50 és 70 év közötti vizsgálati személyek).
94
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Endothelium A szaruhártya endothelium átlagos sejtdenzitása diabeteses betegekben nem különbözött szignifikánsan az egészséges kontrollszemélyekétől (p > 0,5, 7. táblázat). Ez megerősíti korábbi spekulármikroszkópos [132, 133, 138, 142] és konfokális mikroszkópos
[143]
tanulmányok
megfigyeléseit.
Más
spekulármikroszkópos
vizsgálatok leírták az átlagos endothelialis sejtdenzitás csökkenését (5% [135] és 4% [134]) 2-es típusú diabetesben. Módis és mtsai cukorbetegekben a cornealis endothelium sejtsűrűségét kisebbnek találták az egészségesekénél, ez az eltérés 2-es típusú diabetes mellitus esetében szignifikáns volt és az 1-es típusnál közelített hozzá [63]. A mi konfokális mikroszkópos vizsgálatunk nem zárja ki hasonló sejtdenzitás csökkenés elméleti lehetőségét, mivel a vizsgált minta kis mérete miatt a statisztikai erő nem elegendő 5% különbség szignifikáns felismerésére (7. táblázat). Megjegyzendő, hogy mivel a szaruhártya spekulármikroszkópos és in vivo scanning-slit konfokális mikroszkópos vizsgálatai az endothelium sejtdenzitásának vonatkozásában hasonló eredményre vezetnek [370-373], a két módszer bármelyikével nyert eredmény egymással összevethető, valid. Az endothelium sejtjeinek esetleges morfológiai változásaival is több tanulmány foglalkozott. Míg néhány spekulármikroszkópos tanulmány [131, 132, 134, 135] leírt diabeteses szaruhártyákban gyakoribb polymegethismust és pleomorphismust, más vizsgálatok nem találtak morfológiai eltérést [124, 139], vagy csak 1-es típusú diabetes mellitusban [138]. Ezen megfigyelések közötti eltérés hátterében a betegség eltérő fennállási ideje, állapotának súlyossága vagy a kezelés és anyagcsereállapot kontroll eltérő sikeressége állhat [139]. Eltérő betegeken végzett tanulmányok, még hasonló betegség fennállási idő és súlyosság esetén is, változó eredényeket említenek [131, 135, 139]. Még jól kontrollált anyagcsereállapotú betegben is írtak le morfológiai eltérést [135]. Mivel a polymegethismus és pleomorphismus előfordulása az életkor előrehaladtával szintén emelkedik [374], a diabeteses betegcsoport és a hozzá életkor szerint egyeztetett egészséges kontrollcsoport szaruhártyáiban megfigyelhető morfológiai eltérés kisebb az idősebb életkor esetén. Larsson és mtsai ezt a magyarázatot valószínűsítették vizsgálatukban a 2-es tpusú diabeteses betegek és kontrollszemélyek endotheliumában a morfológiai eltérések hiánya hátterében [138]. Schultz és mtsai viszont tanulmányukban
95
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
[131] megfigyeltek morfológiai eltérést minden korcsoportban, mind 1-es, mind pedig 2-es típusú diabetes mellitusban [131]. A különböző endothelium morfológiai eltéréseivel kapcsolatos tanulmányok megfigyeléseinek eltérései hátterében állhat a vizsgálat elégtelen statisztikai ereje [139] és/vagy az endothelium sejtek területének és alakjának meghatározására szolgáló módszerek változatossága. A némely tanulmányok által leírt morfológiai elváltozások nem voltak mindig szabad szemmel, pusztán vizuális megfigyelés útján detektálhatók, hanem számítógéppel segített morphometriás eszközök felhasználását igényelték [131]. In vivo konfokális corneamikroszkópos vizsálatunk során nem találtunk szemmel látható
morfológiai
eltérést
a
diabeteses
betegcsoport
és
az
egészséges
kontrollszemélyek szaruhártya endothelium sejtjeinek között. Hasonló eredményről számolt be Morishige és mtsai konfokális mikroszkópos tanulmánya [140]. Egyik tanulmány sem alkalmazott számítógéppel segített morphometriás eszközöket. Összegezve, tanulmányunk in vivo sejtdenzitás értékeket szolgáltat az optikai tengely mentén, arra merőlegesen a szaruhártya hat rétegében (mélységében) 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő, enyhe fokú diabeteses retinopathiát mutató betegekben és egészséges kontrollszemélyekben. A diabeteses betegcsoport és egészséges kontrollcsoport szaruhártyarétegeinek sejtdenzitásai között szignifikáns különbséget a basalis epithelialis sejtek rétegében találtunk (-15,0%, p < 0,001), más rétegben szignifikáns eltérést nem figyeltünk meg. A diabetesesekben megfigyelt alacsonyabb basalis epithelialis sejtdenzitás hátterében különböző folyamatok, mechanizmusok kombinációja állhat, mint például a subbasalis idegrostréteg szintjén jelentkező károsodott szaruhártya beidegzés, a basalmembrán elváltozásai, vagy a basalis epithelialis sejtek magasabb turnover rátája. Mind a diabeteses betegcsoportban, mind pedig az egészséges kontrollcsoportban a szaruhártya stroma középső rétegében az elülső- és hátsó rétegéhez képest szignifikánsan alacsonyabb sejtdenzitást figyeltünk meg, ennek hátterében a különböző stroma-mélységek eltérő oxigénelátottsága állhat. Lehetséges, hogy tanulmányunkban a szaruhártya hat sejtrétege közül azért találtunk csupán a basalis epithelialis sejtek rétegében szignifikáns különbséget a diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek között, mert vizsgálatunkban szereplő diabeteses betegeink a diabeteses retinopathia, mint a betegség szemészeti
96
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
szövődményeinek súlyosságának besorolására szolgáló beosztás, enyhe szintjével rendekeztek. Vizsgálatunkban a diabeteses betegcsoport diabeteses retinopathiájának súlyossági szintje az ETDRS beosztás szerint 20-as szintű volt, mely megfelel a módosított Airlie House klasszifikáció 2-es fokának (grade 2) [324]. Egy korábbi vizsgálatban [46] ilyen retinopathia fokú betegek átlagos cornealis autofluoreszcencia értéke 16,3 ± 4,3 ng fluoreszcein equivalens per ml, szemben az egészségesekre jellemző 11,4 ± 2,8 ng fluoreszcein
equivalens
per
ml
értékkel,
mely
megfelel
42%-os
cornealis
autofluoreszcencia emelkedésnek a betegcsoportban (p < 0,004). Mivel a cornealis autofluoreszcencia emelkedés a szaruhártyában homogén egyenletes eloszlást mutat [44], és vizsgálatunkban a betegcsoportunkban (az egészségesekhez viszonyítva) a teljes szaruhártya stromára vonatkozó sejtdenzitásemelkedés 11,9% (p = 0,07, 7. táblázat), valószínűsíthető, hogy a diabetesesekben megfigyelt cornealis autofluoreszcencia emelkedésért nem, vagy nem kizárólag a stroma sejtdenzitás változásai felelősek. A basalis epithelialis réteg sejtdenzitásváltozásának szerepe is kizárható a cornealis autofloureszcenciának a szaruhártyában a cornealis axis mentén megfigyelt homogén egyenletes eloszlása miatt.
97
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2.B. A subbasalis idegrostréteg vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban A diabeteses betegek munkaképtelenségének, rokkantságának egyik fő oka a perifériás diabeteses neuropathia, mely krónikus végtagfekélyekhez és amputációhoz vezethet [178-181]. A perifériás diabeteses neuropathia klinikai értékelésére különböző screening tesztek ismeretesek, mint pl. a nem invazív Michigan Neuropathy Screening Instrument (MNSI), illetve invazívabb technikák, mint az elektrofiziológiai vizsgálatok vagy a bőr-biopszia. Az invazív tesztek hátránya még a szoros nyomon követés szükségessége, hiszen éppen ennek a beteganyagnak vannak sebgyógyulási problémái és nagyobb hajlama a fertőzésre. Ezért használják a gyakorlatban gyakrabban az MNSIhez hasonló screening teszteket, ezeknek nincs mellékhatásuk, viszont a kis idegrostok morfológiájának és funkciójának finom változásait nem jelzik [375-377]. Ezek a tények teszik kívánatossá új módszerek alkalmazását a perifériás diabeteses neuropathia mértékének megítélésére. A szaruhártya az emberi szervezet egyik legsűrűbben innervált szövete, így adódik a lehetőség, hogy a diabeteses perifériás neuropathia vizsgálatára alkalmas lehet. Az in vivo konfokális mikroszkópia képes a szaruhártya-idegek, különösen a subbasalis plexus reprodukálható vizsgálatára, nem invazív módon. A szaruhártya subbasalis idegrost-plexusa egy egyrétegű, nem-myelinizált idegrostréteg, melynek vastagsága 4 µm. Ezt a réteget könnyen lehet in vivo konfokális mikroszkópiával vizsgálni és dokumentálni [25, 31, 32, 35, 149, 150, 172, 175, 177, 378, 379]. Vizsgálatunk célja volt in vivo konfokális corneamikroszkópia alkalmazásával vizsgálni a szaruhártya subbasalis idegrostrétegét és annak szöveti környezetét 2-es típusú diabetes mellitusban. Kimutattuk, hogy a 2-es típusú diabeteses betegek szaruhártyájában a subbasalis idegrostréteg denzitása – már a betegség korai szakaszában – szignifikánsan csökkent, csakúgy, mint a basalis epithelialis sejtek sűrűsége. A subbasalis idegrostok és basalis epithelialis sejtek diabetesesekben megfigyelt denzitáscsökkenése véleményünk szerint jellemző a betegségre, és ezek a változások kapcsolatban állhatnak egymással.
98
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Korábban Rosenberg és mtsai 1-es típusú diabeteses betegeket vizsgálva kimutatták, hogy a cornealis subbasalis idegplexusban szignifikánsan kevesebb idegrost található diabetesben, a betegség valamennyi, így enyhe, közepes és súlyos stádiumában, mint az egészséges kontrollok szaruhártyájában, felvetve a fokozott idegrost-degenerációt. Továbbá kimutatták mechanikus aesthesiometerrel, hogy a kevesebb idegrosttal arányosan csökken a szaruhártya érzékenység is [40]. A téma aktualitását mutatja, hogy a kérdés különböző aspektusaival a nemzetközi szakirodalomban vizsgálatainkkal egyidőben és azt követően több munkacsoport is foglalkozott, s a cukorbetegek subbasalis idegrost-plexusának konfokális mikroszkópos vizsgálatáról azóta több szerző is beszámolt [31, 32, 35, 36, 64, 380]. Malik és mtsai is statisztikailag szignifikánsan kevesebb idegrostot találtak diabetesesek
subbasalis
plexusában
összehasonlítva
egészséges
kontrollokéval.
Kimutatták továbbá, hogy az idegrostok számának csökkenése arányos a diabetes súlyossági fokával [31, 381]. Mocan és mtsai proliferatív diabeteses retinopathia esetén alacsonyabb subbasalis idegrostsűrűséget figyeltek meg retinopathiát nem mutató diabeteses betegekéhez képest [36]. Az idegrost-elágazások számának szignifikáns csökkenését is kimutatták diabeteses betegek corneális subbasalis plexusában, mely a neuropathia súlyosságával párhuzamos csökkent regeneratív-képességgel magyarázható [31, 381]. Kallinkos és mtsai konfokális mikroszkóppal vizsgálták a cornealis subbasalis plexus idegrostjainak lefutásának kanyargósságát, ún. tortuozitását diabeteses és egészséges egyéneken. A szerzők a diabeteses betegek subbasalis plexus idegrostjainak fokozott tortuozitását figyelték meg, mely a perifériás diabeteses neuropathia súlyosságával korrelált, de kortól, diabetes fennállásának tartamától és glikémias kontrolltól függetlennek bizonyult. Feltételezik ennek alapján, hogy a megnövekedett tortuozitás az idegrostok degenerációjának és regenerációjának morfológiai markere lehet [32]. Midena és mtsai megvizsgálták 1-es és 2-es típusú cukorbetegeknél a subbasalis plexus károsodása hogyan korrelál a perifériás neuropathiával. A subbasalis idegrostréteg megfigyelésére vizsgálták: a rostok ill. a gyöngyfüzérszerű rostok számát, a rostok elágazódásának és a rostok tortuozitásának mértékét [35]. A corneális subbasalis idegrostok paraméterei statisztikailag szignifikánsan különböztek egymástól
99
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
a diabeteses és az egészséges csoportban. A rostok és a gyöngyfüzérszerű rostok száma, valamint a rostok elágazódása szignifikánsan alacsonyabb volt a diabeteses csoportban, míg a rostok kanyargóssága, tortuozitása megnövekedett [35]. A subbasalis idegrostok és basalis epithelialis sejtek diabetesesekben általunk megfigyelt egymással összefüggő denzitáscsökkenését Chang és mtsai megerősítették [380]. Ezek a tanulmányok mind arra utalnak, hogy a subbasalis plexus paraméterei cukorbetegekben
szignifikánsan
különböznek
az
egészségesekétől.
Diabeteses
szemekben a corneális subbasalis plexus idegrostjainak száma szignifikánsan csökkent, és a megmaradt rostokon is megfigyelhetők morfológiai elváltozások, károsodások. A látható rostok tortuozitásának növekedése degeneráció illetve rost-regeneráció jele. Hasonlóan a csökkent idegrostelágazódások is a csökkent regenerálódási képességre utalnak. Az idegrostok gyöngyfüzér jellege a corneális subbasalis plexus metabolikus aktivitásának jele, a megvastagodások a mitochondriumok felhalmozódásának felelnek meg az idegrost mentén [1]. A gyöngyfüzérszerű megvastagodások számának szignifikáns csökkenése a diabeteses kis idegrostok kóros metabolikus aktivitására utal [35]. Malik és Efron kutatócsoportja bizonyította a cukorbetegségben a szaruhártya és a bőr beidegzésének egymásnak megfelelő károsodását, s így a non-invazív in vivo konfokális corneamikroszkópia szerepét a perifériás neuropathia progressziójának vagy kezelési hatékonyságának nyomonkövetésében [29]. Majd elegáns felhasználását is adták megfigyelésüknek: pancreas-transzplantáción átesett 1-es típusú diabeteses betegek szaruhártyáit vizsgálva a műtét után idegregenerációt figyeltek meg a subbasalis idegrostrétegben [30]. Vizsgálataink során megfigyeltünk közvetlenül a basalis epithelialis sejtréteg alatt elhelyezkedő magasreflektivitású sejteket (HRC). További vizsgálatunk célja ezen sejtek tulajdonságainak, számuk változásának megfigyelése, illetve valószínű azonosítása volt. Az említett magasreflektivitású sejtek száma szignifikánsan magasabb volt az enyhe ill. közepes fokú diabeteses retinopathiában szenvedő betegek szemében, mint egészségesekében, ellentétben a subbasalis idegrostok és a basalis epithelialis sejtek esetében megfigyelt csökkenéssel.
100
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Mivel a subbasalis idegrost plexus ill. a legelülső stromaréteg szintjében megfigyelt magasreflektivitású sejtek morfológiája különbözik a keratocyták magjától és jellemzően a basalis epithelialis sejtek rétege alatt, a subbasalis idegek mentén helyezkednek el, Langerhans-féle, avagy dendritikus sejteknek tartjuk őket [224, 265, 271, 382-384].
101
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2.C. A szaruhártya stroma vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban: stromális idegek, és egyéb magasreflektivitású képletek A szaruhártya állományának elülső és középső részében készített konfokális mikroszkópos képeinken, bizonyos felvételeken vaskos kötegszerű reflektív képleteket figyeltünk meg, melyek stromális idegeknek felelnek meg. A stromális idegek vastagságát, hosszát, számát ill. sűrűségét scanning-slit konfokális mikroszkópos képeken nem lehet megbízhatóan meghatározni. A stromában az idegek átlósan futnak, és ezért az a konfokális mikroszkópos „en face” képen változó irányú és méretű metszetük ill. vetületük ábrázolódik. A stromális idegek mérete és lefutása miatt a rögzített képek csak igen kis részében, esetlegesen találhatjuk meg őket. Egy napjainkban megjelent, a szaruhártya stroma idegeire fókuszáló tanulmányban a 99 vizsgált egészséges szemből 14-ben nem tudtak stromalis ideget találni [379]. A normál, egészséges szaruhártya stromális idegeivel az irodalomban csak igen csekély számú vizsgálat foglalkozik. A jelenlegi tudásunk nagy része post mortem vizsgálatokon alapul [1, 4, 151], és a miénken kívül csak két in vivo konfokális mikroszkópos tanulmányról [149, 379] tudunk, mely foglalkozott a kérdéssel, közülük az egyik napjainkban jelent meg. Az ép stromalis idegek egyenes lefutást mutatnak, Y alakú elágazásokkal. Konfokális mikroszkópos képen vaskos, magas reflektivitású kötegekként ábrázolódnak [149]. Visser és mtsai nemrég az általuk használt Heidelberg Retina Tomograph – Rostock Cornea Modullal készített képeken a stromális idegek másik populációját azonosította: vékony, kanyargós lefutású, gyöngyfüzérszerű rostokat. Véleményük szerint ezek a rostok scanning-slit konfokális mikroszkópiával nem, csak laser scanning konfokális mikroszkópiával ábrázolódnak [379]. A diabeteses betegek szaruhártyaállományában megfigyeltünk a nagy stromalis idegekhez hasonló vastagsággal (8–11 µm) rendelkező, hosszú, ám kanyargós lefutást mutató képleteket. Ezeket károsodott, degenerálódott stromális idegeknek tartjuk.
102
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Mocan és mtsai hasonló kanyargós stromális idegek megfigyeléséről számoltak be diabeteses betegcsoportban [36]. A szaruhártya stromájában igen magas reflektivitású fejből és halványabb (egyenes vagy hullámos) farokból álló képleteket is megfigyeltünk. Ezek elsősorban a szaruhártya stroma elülső és középső, ritkábban a hátsó részében helyezkednek el, s gyakran stromalis idegek mentén figyelhetők meg. Előfordulásuk szignifikánsan gyakoribb enyhe- illetve közepes fokú DR-ban szenvedő betegek szaruhártyájában, mint egészséges kontrollszemélyekében. Ezen képletek pontos eredete még ismeretlen. A közepes fokú DR-ban szenvedő betegek szaruhártyájában ezeket a képleteket gyakrabban figyeltük meg a stroma hátsó részében, mint egyhe fokú DR-s betegeknél vagy egészségeseknél, és ilyenkor a közelükben kanyargós lefutású stromalis idegeket is gyakran láttunk. Egészségesekben, a szaruhártya centrumában a hátsó stromában általában nem találhatók idegek.
103
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
IX. AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉNYEINEK ÖSSZEFOGLALÁSA, AZ ÚJ EREDMÉNYEK JELENTŐSÉGE 1. Módszer kifejlesztése és validálása a cornea különböző rétegeiben történő sejtszámolásra in vivo scanning slit konfokális mikroszkópia alkalmazásával Gyors, megbízható és reprodukálható módszert dolgoztunk ki az emberi szaruhártya különböző rétegeinek nem invazív in vivo kvantitatív vizsgálatára scanning-slit rendszerű konfokális corneamikroszkóp (SSCM) használatával. Az in vivo konfokális mikroszkópiával mért sejdenzitásértékeket hagyományos szövettani módszerrel validáltuk. Leírtuk
a
szaruhártyarétegek
konfokális
mikroszkópos
jellemzőin
alapuló
klasszifikációját, a képrögzítés és a szemimanuális, sejtek megjelölésén alapuló sejtszámolás pontos technikáját, a felszíni és térfogati sejtdenzitás meghatározásának módjait, a mérések reprodukálhatóságának mértékét. Eljárásunk megbízható sejtdenzitás értékeket szolgáltat az optikai tengely mentén, arra merőlegesen a szaruhártya hat rétegében (mélységében) in vivo. A módszerünk jelentőségét mutatja, hogy a nemzetközi irodalomban azóta is folyamatos iránta az érdeklődés, a szaruhártya sejtsűrűség vizsgálatai iránt érdeklődő kollegáktól rendszeresen kapunk megkeresést. Ezen disszertáció végső beadásának időpontjáig (2009. július) 17 független hivatkozás megjelenéséről szereztünk tudomást, közötte egy tankönyv fejezetben idézik [176, 200, 201, 219, 221, 263, 271, 275, 385393].
2. A diabeteses keratopathia vizsgálata in vivo konfokális mikroszkópiával: kvantitatív és kvalitatív vizsgálatok Vizsgálatainkkal hozzájárultunk a cukorbetegség okozta szemészeti szövődmények közül a diabeteses keratopathiáról alkotott jelenlegi tudományos és klinikai
104
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
ismeretekhez, már a betegség igen korai stádiumában fellépő szaruhártyaelváltozások in vivo konfokális mikroszkópos vizsgálatával. Mind a téma, mind pedig a mi vizsgálataink jelentőségét és időszerűségét mutatja a vizsgálatainkkal közel egyidőben végzett és azóta publikált egyre nagyobb számú tanulmány [30-32, 35-37, 64, 140, 380, 381].
2.A. A cukorbetegség hatásának vizsgálata a szaruhártya különböző rétegeiben a sejtek sűrűségére Az általunk korábban kidolgozott és validált nem invazív in vivo vizsgálati módszer szerint meghatároztuk a szaruhártya hat sejtrétegében a vonatkozó sejtsűrűséget, majd összehasonlítottuk
a
diabeteses
betegek
és
egészséges
kontrollszemélyek
szaruhártyájában kapott adatokat. A diabeteses betegcsoport és egészséges kontrollcsoport szaruhártyarétegeinek sejtdenzitásai között szignifikáns különbséget a basalis epithelialis sejtek rétegében találtunk, más rétegben szignifikáns eltérést nem figyeltünk meg. A szaruhártya stroma középső részében a sejtdenzitás alacsonyabb, mint az elülső és a hátsó stroma részben, mind diabeteses betegekben, mind pedig egészséges kontrollszemélyekben.
Bár
a
diabeteses
betegcsoportban,
az
egészséges
kontrollszemélyek szaruhártyáihoz hasonlóan jellemző volt a stroma középső részének az elülső- és hátsó stromarétegeihez viszonyított alacsonyabb sejtdenzitása, a diabeteses betegek szaruhártyáiban ez a csökkenés kevésbé volt kifejezett, mint az egészséges kontrollcsoportban (15,0% versus 24,6%, p = 0,053), a különbség éppen nem szignifikáns. Vizsgáltuk, hogy a corneális autofluoreszcencia (CAF) diabeteses betegek szaruhártyájában megfigyelt emelkedését magyarázhatja-e a sejtszám- vagy sejtsűrűség változása. Kimutattuk, hogy a jelenségért nem, vagy nem kizárólag a stroma sejtdenzitás változásai felelősek. A basalis epithelialis réteg sejtdenzitásváltozásának szerepe is kizárható a cornealis autofloureszcenciának a szaruhártyában a cornealis axis mentén megfigyelt homogén egyenletes eloszlása miatt.
105
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2.B. A subbasalis idegrostréteg vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban A szaruhártya subbasalis idegrostrétegét és annak szöveti környezetét in vivo konfokális corneamikroszkópia alkalmazásával 2-es típusú diabetes mellitusban vizsgálva kimutattuk, hogy a 2-es típusú diabeteses betegek szaruhártyájában a subbasalis idegrostréteg – már a betegség korai szakaszában – károsodott, denzitása szignifikánsan csökkent, csakúgy, mint a basalis epithelialis sejtek sűrűsége. A subbasalis idegrostok és basalis epithelialis sejtek diabetesesekben megfigyelt denzitáscsökkenése véleményünk szerint jellemző a betegségre, és ezek a változások kapcsolatban állhatnak egymással. Vizsgálataink során megfigyeltünk a subbasalis idegplexus rétegében, közvetlenül a basalis epithelialis sejtréteg alatt elhelyezkedő magasreflektivitású sejteket, melyek száma szignifikánsan magasabb volt az enyhe ill. közepes fokú diabeteses retinopathiában szenvedő betegek szaruhártyájában, mint egészségesekében. Ezeket a sejteket Langerhans-féle avagy dendritikus sejteknek tartjuk.
2.C. A szaruhártya stroma vizsgálata diabeteses betegek szaruhártyáiban: stromális idegek, és egyéb magasreflektivitású képletek A nemzetközi irodalomban tudomásunk szerint elsőként vizsgáltuk a szaruhártya stromalis idegeinek meglétét, morfológiáját és lefutását 2-es típusú diabeteses betegek szaruhártyáiban in vivo konfokális mikroszkópiával. A diabeteses betegek szaruhártyaállományában megfigyeltünk a nagy stromalis idegekhez hasonló méretekkel, vastagsággal rendelkező, hosszú, ám kanyargós lefutást mutató képleteket. Ezeket károsodott, degenerálódott vagy kórosan regenerálódó stromális idegeknek tartjuk. A szaruhártya stromájában sajátságos, igen magas reflektivitású fejből és halványabb (egyenes vagy hullámos) farokból álló képleteket is észleltünk. Megfigyeltük, hogy az említett képletek egészségesekben szignifkánsan kevésbé fordulnak elő, mint diabetesesekben. Ezen képletek pontos eredete még ismeretlen.
106
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
X. ÖSSZEFOGLALÁS Az
átlátszó
szaruhártya
az
emberi
szervezet
egyik
legcsodálatosabb
és
legfigyelemreméltóbb szövete. A cornea épségéhez, átlátszóságának fenntartásához rétegeinek, sejtszerkezetének kényes egyensúlya szükséges, valamint ez az emberi szervezet egyik legdúsabban beidegzett szövete. A diabetes, különösen annak leggyakoribb típusa, a 2-es típusú diabetes mellitus a fejlett világ népbetegsége. Napjainkban a cukorbetegség jelentőségének növekedésével a diabeteses keratopathia szerepe is egyre fontosabbá válik a betegség korai felismerésében, illetve a betegség és bizonyos szövődményei progressziójának objektív kvantifikálhatóságában.
A
cukorbetegek
szaruhártyáiban
jellemző
elváltozások
feltehetőleg összefüggést mutatnak a perifériás neuropathiával, valamint elhúzódó, rosszabb sebgyógyuláshoz vezetnek. Az in vivo konfokális corneamikroszkópia a szaruhártya élőben történő vizsgálatára alkalmas ideális eszköz. Segítségével a szaruhártya szerkezete, rétegei és sejtjei részletgazdagon, valós időben és főleg nem-invazív módon vizsgálhatók. Vizsgálataink során gyors és megbízható módszert dolgoztunk ki az emberi szaruhártya különböző rétegeinek nem-invazív in vivo kvantitatív vizsgálatára scanningslit rendszerű konfokális corneamikroszkóp használatával. Módszerünk validálása során bizonyítottuk az eljárás megbízhatóságát és reprodukálhatóságát. Az általunk korábban kidolgozott és validált módszer szerint meghatároztuk a szaruhártya hat sejtrétegében a vonatkozó sejtsűrűséget, majd összehasonlítottuk a diabeteses betegek és egészséges kontrollszemélyek szaruhártyájában kapott adatokat. A diabeteses betegcsoport és egészséges kontrollcsoport szaruhártyarétegeinek sejtdenzitásai között a hat sejtréteg közül a basalis epithelialis sejtek rétegében találtunk szignifikáns különbséget (csökkenést). Vizsgáltuk a szaruhártya subbasalis idegrostrétegét és annak szöveti környezetét in vivo konfokális corneamikroszkópiával. Kimutattuk, hogy a 2-es típusú diabeteses betegek szaruhártyájában a subbasalis idegrostréteg már a betegség korai szakaszában károsodik, denzitása szignifikánsan csökken, csakúgy, mint a basalis epithelialis sejtek
107
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
sűrűsége. A subbasalis idegplexus réteg környezetében magasreflektivitású sejteket figyeltünk
meg,
melyek
száma
magasabb
a
cukorbetegek
szemében,
mint
egészségesekében. Ezeket a sejteket dendritikus sejteknek tartjuk. A nemzetközi irodalomban tudomásunk szerint először vizsgáltuk a szaruhártya stromalis idegeit cukorbetegségben, megfigyeltünk károsodott, degenerálódott vagy kórosan regenerálódó stromális idegeket. A szaruhártya stromájában sajátságos, igen magas reflektivitású fejből és halványabb farokból álló képleteket is észleltünk, ezen képletek egészségesekben szignifkánsan kevésbé fordulnak elő, mint diabetesesekben. Ezen képletek pontos eredete még ismeretlen. Vizsgálatainkkal hozzájárultunk a cukorbetegség okozta szemészeti szövődmények közül a diabeteses keratopathiáról alkotott jelenlegi tudományos és klinikai ismeretekhez, már a betegség igen korai stádiumában fellépő szaruhártyaelváltozások in vivo konfokális mikroszkópos vizsgálatával. Vizsgálataink jövőbeni klinikai jelentősége a kórfolyamatok és kezelések eredményességének pontosabb követésén túl a diabeteses népességben szükségessé váló, a szaruhártyát érintő beavatkozások előtti prognosztikai vizsgálatok elvégzése lehet.
108
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
XI. SUMMARY In vivo corneal confocal microscopy in diabetes The transparent cornea is one of the most interesting and most remarkable tissues in the human body. The maintenance of corneal transparency depends on the delicate balance of the components of its highly complex structure, also including one of the densest innervations in the human body. Diabetes, especially its most prevalent type, type-2 diabetes is endemic in developed nations. Nowadays, with the increasing importance of the disease, the detection of diabetic keratopathy is also gaining importance in early detection, and objective quantification of disease progression, and evaluation of the risk of complications. Diabetic keratopathy causes impaired corneal wound healing; and are believed to be related to peripheral diabetic neuropathy. In vivo confocal microscopy is an ideal approach for the investigation of the cornea in vivo. It can visualize the structure, layers, and cells of the cornea with high resolution, in real time, and non-invasively. We developed and validated a non-invasive, fast, reliable and reproducible method for in vivo quantitative (cell counting) measurements of corneal cell layers using a commercially available scanning-slit confocal microscope. We have proven the reliability and reproducibility of the method by validation. We performed in vivo cell density estimation and comparison in six layers along the optical axis of the cornea of type-2 diabetic patients and healthy controls using the noninvasive cell counting method we developed and validated. We found significant difference between cell densities of diabetic patients and healthy controls in the basal epithelial layer (the cell densities of diabetics being lower) but not in the other layers. By in vivo confocal microscopic evaluation of the subbasal nerve layer, we demonstrated that corneal innervation is impaired in diabetes already at an early stage of the disease. The number of subbasal nerve fiber bundles is significantly decreased in type-2 diabetic patients, when compared to healthy controls, likewise the basal
109
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
epithelial cell density. Furthermore, we observed very highly reflective cells immediately beneath the basal epithelial cells’ layer, typically in close vicinity of subbasal nerves. We consider these most probably Langerhans- or dendritic cells. According to our knowledge we were the first to investigate and describe corneal stromal nerves in diabetes using in vivo corneal confocal microscopy. We observed degenerated or pathologically regenerating stromal nerves. In the corneal stroma, structures consisting of a highly reflective head and a vague tail were also found. The origin of these structures is yet unknown, nevertheless we observed that they are significantly less prevalent in healthy controls then in diabetics. From the ophthalmological complications of diabetes, we contributed to the body of clinical and scientific knowledge regarding diabetic keratopathy by showing that changes occurring already in the early stages of disease can be visualized and evaluated non-invasively using in vivo confocal microscopy. Taken together, we showed that in vivo confocal microscopy can evaluate diabetesrelated changes in the cornea. The future clinical potential of the technique, besides follow-up of disease progression and treatment efficacy, lies in its possible prognostic value for the evaluation of diabetic population before interventions affecting the cornea.
110
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
XII. SUMÁRIO Microscopia confocal da córnea in vivo na diabetes A córnea é um dos tecidos mais interessantes e notáveis do corpo humano. A manutenção da transparência da córnea depende de um balanço delicado entre os diversos componentes da sua estrutura altamente complexa, que inclui uma das enervações mais densas do corpo humano. A diabetes, especialmente o seu tipo mais prevalente, diabetes tipo 2, é endémica nos países desenvolvidos. Actualmente, com a relevância crescente desta doença, a detecção da queratopatia diabética tem vindo a adquirir importância na detecção precoce e quantificação objectiva da progressão da doença e na avaliação do risco de complicações. A queratopatia diabética compromete a cicatrização corneana; pensa-se que está relacionada com a neuropatia diabética periférica. A microscopia confocal in vivo constitui a abordagem ideal para a investigação in vivo da córnea. Permite visualizar, com elevada resolução, a estrutura, as camadas e as células da córnea, em tempo real e de forma não invasiva. Desenvolvemos e validámos um método não invasivo, rápido, fiável e reprodutível para medições in vivo quantitativas (contagem de células) das camadas celulares da córnea, com base num microscópio confocal de varrimento de fenda disponível comercialmente. Demonstrámos a fiabilidade e reprodutibilidade do método através da sua validação. Procedemos à estimação e comparação in vivo da densidade celular em seis camadas definidas ao longo do eixo óptico da córnea, em pacientes com diabetes de tipo 2 e em controlos saudáveis, utilizando o método não invasivo de contagem de células por nós desenvolvido e validado. Encontrámos diferenças significativas, nas densidades celulares entre diabéticos e controlos saudáveis, na camada basal epitelial (com as densidades dos diabéticos a serem inferiores). Não encontramos diferenças nas outras camadas. Através da avaliação in vivo, por microscopia confocal, da camada de nervos sub-basal, demonstrámos que a enervação da córnea está comprometida, nos diabéticos,
111
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
logo numa fase inicial da doença. O número de feixes de fibras nervosas sub-basais está substancialmente diminuído nos doentes com diabetes de tipo 2, quando comprado com controlos saudáveis, tal como sucede com a densidade de células basais epiteliais. Mais ainda, observámos células muito reflectivas imediatamente abaixo da camada de células basais epiteliais, tipicamente na vizinhança próxima dos nervos sub-basais. Consideramos que estas células são, muito provavelmente, células de Langerhans ou dendríticas. De acordo com o nosso conhecimento, fomos os primeiros a investigar e a descrever os nervos do estroma da córnea, em diabetes, através de microscopia confocal da córnea in vivo. Observámos nervos do estroma degenerados ou com regeneração patológica. Encontrámos ainda, no estroma da córnea, estruturas compostas por uma cabeça muito reflectiva e uma cauda vaga. A origem destas estruturas ainda permanece desconhecida. Contudo, observámos que são significativamente menos prevalentes nos controlos saudáveis do que em diabéticos. No que respeita às complicações oftalmológicas da diabetes, contribuímos para o corpo de conhecimento científico e clínico relativo à queratopatia diabética mostrando que alterações que ocorrem logo nas fases iniciais da doença podem ser observadas e avaliadas, de forma não-invasiva, através da microscopia confocal in vivo Em suma, mostrámos que a microscopia confocal in vivo permite avaliar alterações da córnea relacionadas com a diabetes. O potencial clínico futuro desta técnica reside, para além do seguimento da progressão da doença e da eficácia do tratamento, no possível valor de prognóstico para a avaliação da população diabética antes de intervenções que afectem a córnea.
112
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
XIII. IRODALOMJEGYZÉK 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.
Muller LJ, Marfurt CF, Kruse F, Tervo TM. (2003) Corneal nerves: structure, contents and function. Exp Eye Res, 76(5): 521-542. Dhaliwal JS, Kaufman SC, Chiou AG. (2007) Current applications of clinical confocal microscopy. Curr Opin Ophthalmol, 18(4): 300-307. Guthoff RF, Wienss H, Hahnel C, Wree A. (2005) Epithelial innervation of human cornea: a three-dimensional study using confocal laser scanning fluorescence microscopy. Cornea, 24(5): 608-613. Muller LJ, Vrensen GF, Pels L, Cardozo BN, Willekens B. (1997) Architecture of human corneal nerves. Invest Ophthalmol Vis Sci, 38(5): 985-994. International Diabetes Federation: Diabetes Atlas, third edition. 2006 [letöltve: 2008. május 30.]; URL: http://www.eatlas.idf.org/media/. The global challenge of diabetes. (2008) The Lancet, 371: 1723. The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus: Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. (1997) Diabetes Care, 20: 1183-1197. International Diabetes Federation. [letöltve: 2008. május 30.]; URL: http://www.idf.org/home/index.cfm?node=264. Amos AF, McCarty DJ, Zimmet P. (1997) The rising global burden of diabetes and its complications: estimates and projections to the year 2010. Diabet Med, 14 Suppl 5: S1-85. King H, Aubert RE, Herman WH. (1998) Global burden of diabetes, 1995-2025: prevalence, numerical estimates, and projections. Diabetes Care, 21(9): 1414-1431. National Diabetes Information Clearinghouse, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, NIH: National Diabetes Statistics, 2007. 2008 [letöltve: 2009. április 1.]; URL: http://diabetes.niddk.nih.gov/DM/PUBS/statistics/. International Diabetes Federation. [letöltve: 2008. május 30.]; URL: http://www.idf.org/home/index.cfm?node=37. Centers for Disease Control and Prevention: National diabetes fact sheet: general information and national estimates on diabetes in the United States, Department of Health and Human Services CfDCaP, (szerk.), Atlanta, GA, 2005. Kerényi Z. A diabetes mellitus leíró epidemiológiája Magyarországon. In: Halmos T és Jermendy G (szerk.) Diabetes mellitus - Elmélet és klinikum. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 2002: 66-69. Nemzeti Diabetes Program Bizottság: Magyar Nemzeti Diabetes Program. (1995) Diabetologia Hungarica, 3: 145-168. National Diabetes Data Group: Diabetes in America. National Institutes of Health, Washington DC, 1995. Aiello LP, Gardner TW, King GL, Blankenship G, Cavallerano JD, Ferris FL, 3rd, Klein R. (1998) Diabetic retinopathy. Diabetes Care, 21(1): 143-156. Cunha-Vaz J és Bernardes R. (2005) Nonproliferative retinopathy in diabetes type 2. Initial stages and characterization of phenotypes. Prog Retin Eye Res, 24(3): 355-377. The American Diabetes Association: Complications of Diabetes in the United States. [letöltve: 2008. május 30.]; URL: http://www.diabetes.org/diabetes-statistics/complications.jsp. Klein R, Klein BE, Moss SE, Davis MD, DeMets DL. (1989) The Wisconsin Epidemiologic Study of Diabetic Retinopathy. IX. Four-year incidence and progression of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years. Arch Ophthalmol, 107(2): 237-243. Klein R, Klein BE, Moss SE, Davis MD, DeMets DL. (1989) The Wisconsin Epidemiologic Study of Diabetic Retinopathy. X. Four-year incidence and progression of diabetic retinopathy when age at diagnosis is 30 years or more. Arch Ophthalmol, 107(2): 244-249. Süveges I és Brooser G. A diabetes mellitus szemészeti szövődményei. In: Halmos T és Jermendy G (szerk.) Diabetes mellitus - Elmélet és klinikum. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 2002: 424-449. Schneider M és Süveges I. (2004) Retinopathia diabetica: magyarországi epidemiológiai adatok. Szemészet, 141: 449-452.
113
PhD értekezés 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.
39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46.
Dr. Popper Mónika
Németh J, Frigyik A, Vastag O, Göcze P, Pető T, Elek I, Adatszolgáltatók. (2005) Vaksági okok Magyarországon 1996 és 2000 között. Szemészet, 142: 127-133. Popper M, Quadrado MJ, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA, Muller LJ. (2005) Subbasal nerves and highly reflective cells in corneas of diabetic patients: In vivo evaluation by confocal microscopy. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 46: E-Abstract 879. Quadrado MJ, Popper M, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA. (2006) Diabetes and corneal cell densities in humans by in vivo confocal microscopy. Cornea, 25(7): 761-768. Quadrado MJ, Popper M, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA, Muller LJ. (2005) Highly reflective cells in the corneal stroma visualized by in vivo confocal microscopy. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 46: E-Abstract 2194. Tavakoli M, Kallinikos PA, Efron N, Boulton AJ, Malik RA. (2007) Corneal sensitivity is reduced and relates to the severity of neuropathy in patients with diabetes. Diabetes Care, 30(7): 1895-1897. Quattrini C, Tavakoli M, Jeziorska M, Kallinikos P, Tesfaye S, Finnigan J, Marshall A, Boulton AJ, Efron N, Malik RA. (2007) Surrogate markers of small fiber damage in human diabetic neuropathy. Diabetes, 56(8): 2148-2154. Mehra S, Tavakoli M, Kallinikos PA, Efron N, Boulton AJ, Augustine T, Malik RA. (2007) Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes. Diabetes Care. Malik RA, Kallinikos P, Abbott CA, van Schie CH, Morgan P, Efron N, Boulton AJ. (2003) Corneal confocal microscopy: a non-invasive surrogate of nerve fibre damage and repair in diabetic patients. Diabetologia, 46(5): 683-688. Kallinikos P, Berhanu M, O'Donnell C, Boulton AJ, Efron N, Malik RA. (2004) Corneal nerve tortuosity in diabetic patients with neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci, 45(2): 418-422. Rehany U, Ishii Y, Lahav M, Rumelt S. (2000) Ultrastructural changes in corneas of diabetic patients: an electron-microscopy study. Cornea, 19(4): 534-538. Lockwood A, Hope-Ross M, Chell P. (2006) Neurotrophic keratopathy and diabetes mellitus. Eye, 20(7): 837-839. Midena E, Brugin E, Ghirlando A, Sommavilla M, Avogaro A. (2006) Corneal diabetic neuropathy: a confocal microscopy study. J Refract Surg, 22(9 Suppl): S1047-1052. Mocan MC, Durukan I, Irkec M, Orhan M. (2006) Morphologic alterations of both the stromal and subbasal nerves in the corneas of patients with diabetes. Cornea, 25(7): 769-773. Mocan MC, Irkec M, Orhan M. (2006) Evidence of Waite-Beetham lines in the corneas of diabetic patients as detected by in vivo confocal microscopy. Eye, 20(12): 1488-1490. Benitez-Del-Castillo JM, Acosta MC, Wassfi MA, Diaz-Valle D, Gegundez JA, Fernandez C, Garcia-Sanchez J. (2007) Relation between corneal innervation with confocal microscopy and corneal sensitivity with noncontact esthesiometry in patients with dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci, 48(1): 173-181. Chikama T, Wakuta M, Liu Y, Nishida T. (2007) Deviated mechanism of wound healing in diabetic corneas. Cornea, 26(9 Suppl 1): S75-81. Rosenberg ME, Tervo TM, Immonen IJ, Muller LJ, Gronhagen-Riska C, Vesaluoma MH. (2000) Corneal structure and sensitivity in type 1 diabetes mellitus. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41(10): 2915-2921. Rosenberg ME, Tervo TM, Petroll WM, Vesaluoma MH. (2000) In vivo confocal microscopy of patients with corneal recurrent erosion syndrome or epithelial basement membrane dystrophy. Ophthalmology, 107(3): 565-573. Van Schaik HJ, Alkemade C, Swart W, Van Best JA. (1999) Autofluorescence of the diabetic and healthy human cornea in vivo at different excitation wavelengths. Exp Eye Res, 68(1): 1-8. Van Schaik HJ, Benitez del Castillo JM, Caubergh MJ, Gobert A, Leite E, Moldow B, Rosas V, Van Best JA. (1998) Evaluation of diabetic retinopathy by fluorophotometry. European concerted action on ocular fluorometry. Int Ophthalmol, 22(2): 97-104. Van Schaik HJ, Coppens J, Van den Berg TJ, Van Best JA. (1999) Autofluorescence distribution along the corneal axis in diabetic and healthy humans. Exp Eye Res, 69(5): 505-510. Stolwijk TR, van Best JA, Boot JP, Oosterhuis JA. (1990) Corneal autofluorescence in diabetic and penetrating keratoplasty patients as measured by fluorophotometry. Exp Eye Res, 51(4): 403-409. Stolwijk TR, van Best JA, Oosterhuis JA, Swart W. (1992) Corneal autofluorescence: an indicator of diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci, 33(1): 92-97.
114
PhD értekezés 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55.
56.
57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68.
Dr. Popper Mónika
Stolwijk TR, Kuizenga A, van Haeringen NJ, Kijlstra A, Oosterhuis JA, van Best JA. (1994) Analysis of tear fluid proteins in insulin-dependent diabetes mellitus. Acta Ophthalmol (Copenh), 72(3): 357-362. Rehany U, Ishii Y, Lahav M, Rumelt S. (2000) Collagen pleomorphism in Descemet's membrane of streptozotocin-induced diabetic rats: an electron microscopy study. Cornea, 19(3): 390-392. Klocek MS, Sassani JW, McLaughlin PJ, Zagon IS. (2007) Topically applied naltrexone restores corneal reepithelialization in diabetic rats. J Ocul Pharmacol Ther, 23(2): 89-102. Zagon IS, Jenkins JB, Sassani JW, Wylie JD, Ruth TB, Fry JL, Lang CM, McLaughlin PJ. (2002) Naltrexone, an opioid antagonist, facilitates reepithelialization of the cornea in diabetic rat. Diabetes, 51(10): 3055-3062. Zagon IS, Klocek MS, Sassani JW, Mauger DT, McLaughlin PJ. (2006) Corneal safety of topically applied naltrexone. J Ocul Pharmacol Ther, 22(5): 377-387. Zagon IS, Klocek MS, Sassani JW, McLaughlin PJ. (2007) Use of topical insulin to normalize corneal epithelial healing in diabetes mellitus. Arch Ophthalmol, 125(8): 1082-1088. Zagon IS, Sassani JW, McLaughlin PJ. (2006) Insulin treatment ameliorates impaired corneal reepithelialization in diabetic rats. Diabetes, 55(4): 1141-1147. Zagon IS, Sassani JW, Myers RL, McLaughlin PJ. (2007) Naltrexone accelerates healing without compromise of adhesion complexes in normal and diabetic corneal epithelium. Brain Res Bull, 72(1): 18-24. Saghizadeh M, Brown DJ, Castellon R, Chwa M, Huang GH, Ljubimova JY, Rosenberg S, Spirin KS, Stolitenko RB, Adachi W, Kinoshita S, Murphy G, Windsor LJ, Kenney MC, Ljubimov AV. (2001) Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol, 158(2): 723-734. Saghizadeh M, Kramerov AA, Tajbakhsh J, Aoki AM, Wang C, Chai NN, Ljubimova JY, Sasaki T, Sosne G, Carlson MR, Nelson SF, Ljubimov AV. (2005) Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci, 46(10): 3604-3615. Kabosova A, Kramerov AA, Aoki AM, Murphy G, Zieske JD, Ljubimov AV. (2003) Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res, 77(2): 211-217. Ljubimov AV, Burgeson RE, Butkowski RJ, Couchman JR, Zardi L, Ninomiya Y, Sado Y, Huang ZS, Nesburn AB, Kenney MC. (1996) Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy. J Histochem Cytochem, 44(12): 1469-1479. Ljubimov AV, Huang ZS, Huang GH, Burgeson RE, Gullberg D, Miner JH, Ninomiya Y, Sado Y, Kenney MC. (1998) Human corneal epithelial basement membrane and integrin alterations in diabetes and diabetic retinopathy. J Histochem Cytochem, 46(9): 1033-1041. Wakuta M, Morishige N, Chikama T, Seki K, Nagano T, Nishida T. (2007) Delayed wound closure and phenotypic changes in corneal epithelium of the spontaneously diabetic GotoKakizaki rat. Invest Ophthalmol Vis Sci, 48(2): 590-596. Spirin KS, Saghizadeh M, Lewin SL, Zardi L, Kenney MC, Ljubimov AV. (1999) Basement membrane and growth factor gene expression in normal and diabetic human retinas. Curr Eye Res, 18(6): 490-499. Popper M, Quadrado MJ, Nagy ZZ, Süveges I, Van Best JA. (2002) A szaruhártya különböző rétegeiben történő sejtszámolás konfokális mikroszkóppal diabeteses és egészséges szemeken. Szemészet, 139(Suppl. (Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Miskolc)): 32-33. Módis L, Kettesy B, Kemény Beke Á, Berta A. (2000) A cornealis endothelium diabetes mellitusban. Szemészet, 137: 157-161. Imre L, Papp A, Nagymihály A. (2003) Diabeteses betegek corneájának in vivo konfokális korneamikroszkópos vizsgálata. Szemészet, 140: 251-254. Borbándy Á, Bíbok G, Seres A. (2004) Cornea és lencse autofluoreszcenciája 1-es típusú diabeteses betegekben – hároméves követés. Szemészet, 141: 405-408. Friend J és Thoft RA. (1984) The diabetic cornea. Int Ophthalmol Clin, 24(4): 111-123. Rao GN. (1987) Dr. P. Siva Reddy Oration. Diabetic keratopathy. Indian J Ophthalmol, 35(5-6): 16-36. Tsubota K, Chiba K, Shimazaki J. (1991) Corneal epithelium in diabetic patients. Cornea, 10(2): 156-160.
115
PhD értekezés 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95.
Dr. Popper Mónika
Azar DT, Spurr-Michaud SJ, Tisdale AS, Gipson IK. (1989) Decreased penetration of anchoring fibrils into the diabetic stroma. A morphometric analysis. Arch Ophthalmol, 107(10): 1520-1523. Taylor HR és Kimsey RA. (1981) Corneal epithelial basement membrane changes in diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 20(4): 548-553. Siperstein MD. (1972) Capillary basement membranes and diabetic microangiopathy. Adv Intern Med, 18: 325-344. Fukushi S, Merola LO, Tanaka M, Datiles M, Kinoshita JH. (1980) Reepithelialization of denuded corneas in diabetic rats. Exp Eye Res, 31(5): 611-621. Sanchez-Thorin JC. (1998) The cornea in diabetes mellitus. Int Ophthalmol Clin, 38(2): 19-36. Melato M, Antonutto G, Manconi R, Ponte E. (1982) Ocular deposits of immunoglobulin in diabetic retinopathy. Can J Ophthalmol, 17(1): 45-46. Weiss JS, Sang DN, Albert DM. (1990) Immunofluorescent characteristics of the diabetic cornea. Cornea, 9(2): 131-138. Azar DT, Spurr-Michaud SJ, Tisdale AS, Gipson IK. (1992) Altered epithelial-basement membrane interactions in diabetic corneas. Arch Ophthalmol, 110(4): 537-540. Vracko R. (1974) Basal lamina layering in diabetes mellitus. Evidence for accelerated rate of cell death and cell regeneration. Diabetes, 23(2): 94-104. Tarsio JF, Wigness B, Rhode TD, Rupp WM, Buchwald H, Furcht LT. (1985) Nonenzymatic glycation of fibronectin and alterations in the molecular association of cell matrix and basement membrane components in diabetes mellitus. Diabetes, 34(5): 477-484. Wu VY, Wilson B, Cohen MP. (1987) Disturbances in glomerular basement membrane glycosaminoglycans in experimental diabetes. Diabetes, 36(6): 679-683. Gipson IK, Grill SM, Spurr SJ, Brennan SJ. (1983) Hemidesmosome formation in vitro. J Cell Biol, 97(3): 849-857. Gipson IK, Spurr-Michaud SJ, Tisdale AS. (1987) Anchoring fibrils form a complex network in human and rabbit cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci, 28(2): 212-220. Tabatabay CA, Bumbacher M, Baumgartner B, Leuenberger PM. (1988) Reduced number of hemidesmosomes in the corneal epithelium of diabetics with proliferative vitreoretinopathy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 226(4): 389-392. Kenyon KR, Stark WJ, Stone DL. (1976) Corneal endothelial degeneration and fibrous proliferation after plana vitrectomy. Am J Ophthalmol, 81(4): 486-490. Azar DT és Gipson IK. (1989) Repair of the corneal epithelial adhesion structures following keratectomy wounds in diabetic rabbits. Acta Ophthalmol Suppl, 192: 72-79. Khodadoust AA, Silverstein AM, Kenyon DR, Dowling JE. (1968) Adhesion of regenerating corneal epithelium. The role of basement membrane. Am J Ophthalmol, 65(3): 339-348. Friend J, Kiorpes TC, Thoft RA. (1981) Diabetes mellitus and the rabbit corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci, 21(2): 317-321. Friend J, Ishii Y, Thoft RA. (1982) Corneal epithelial changes in diabetic rats. Ophthalmic Res, 14(4): 269-278. Hatchell DL, Magolan JJ, Jr., Besson MJ, Goldman AI, Pederson HJ, Schultz KJ. (1983) Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol, 101(3): 469-471. Datiles MB, Kador PF, Fukui HN, Hu TS, Kinoshita JH. (1983) Corneal re-epithelialization in galactosemic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci, 24(5): 563-569. Gobbels M, Spitznas M, Oldendoerp J. (1989) Impairment of corneal epithelial barrier function in diabetics. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 227(2): 142-144. Stolwijk TR, van Best JA, Boor JP, Lemkes HH, Oosterhuis JA. (1990) Corneal epithelial barrier function after oxybuprocaine provocation in diabetics. Invest Ophthalmol Vis Sci, 31(3): 436-439. Schultz RO, Van Horn DL, Peters MA, Klewin KM, Schutten WH. (1981) Diabetic keratopathy. Trans Am Ophthalmol Soc, 79: 180-199. Saini JS és Khandalavla B. (1995) Corneal epithelial fragility in diabetes mellitus. Can J Ophthalmol, 30(3): 142-146. Brightbill FS, Myers FL, Bresnick GH. (1978) Postvitrectomy keratopathy. Am J Ophthalmol, 85(5 Pt 1): 651-655. Brodrick JD. (1975) Corneal problems after retinal and vitreous surgery. Trans Ophthalmol Soc U K, 95(1): 138-141.
116
PhD értekezés 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126.
Dr. Popper Mónika
Faulborn J, Conway BP, Machemer R. (1978) Surgical complications of pars plana vitreous surgery. Ophthalmology, 85(2): 116-125. Foulks GN, Thoft RA, Perry HD, Tolentino FI. (1979) Factors related to corneal epithelial complications after closed vitrectomy in diabetics. Arch Ophthalmol, 97(6): 1076-1078. Perry HD, Foulks GN, Thoft RA, Tolentino FI. (1978) Corneal complications after closed vitrectomy through the pars plana. Arch Ophthalmol, 96(8): 1401-1403. Chung H, Tolentino FI, Cajita VN, Acosta J, Refojo MF. (1988) Reevaluation of corneal complications after closed vitrectomy. Arch Ophthalmol, 106(7): 916-919. Buettner H és Bourne WM. (1981) Effect of trans pars plana surgery on the corneal endothelium. Dev Ophthalmol, 2: 28-34. Friberg TR, Doran DL, Lazenby FL. (1984) The effect of vitreous and retinal surgery on corneal endothelial cell density. Ophthalmology, 91(10): 1166-1169. Schachat AP, Oyakawa RT, Michels RG, Rice TA. (1983) Complications of vitreous surgery for diabetic retinopathy. II. Postoperative complications. Ophthalmology, 90(5): 522-530. Snip RC, Thoft RA, Tolentino FI. (1980) Similar epithelial healing rates of the corneas of diabetic and nondiabetic patients. Am J Ophthalmol, 90(4): 463-468. Schultz RO, Peters MA, Sobocinski K, Nassif K, Schultz KJ. (1983) Diabetic corneal neuropathy. Trans Am Ophthalmol Soc, 81: 107-124. Hyndiuk RA, Kazarian EL, Schultz RO, Seideman S. (1977) Neurotrophic corneal ulcers in diabetes mellitus. Arch Ophthalmol, 95(12): 2193-2196. Schwartz DE. (1974) Corneal sensitivity in diabetics. Arch Ophthalmol, 91(3): 174-178. Martin XY és Safran AB. (1988) Corneal hypoesthesia. Surv Ophthalmol, 33(1): 28-40. Boulton AJ és Malik RA. (1998) Diabetic neuropathy. Med Clin North Am, 82(4): 909-929. Malik RA. (1997) The pathology of human diabetic neuropathy. Diabetes, 46 Suppl 2: S50-53. Malik RA. (2003) Current and future strategies for the management of diabetic neuropathy. Treat Endocrinol, 2(6): 389-400. Malik RA. (2008) Early detection of nerve damage and repair in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol, 4(12): 646-647. Ishida N, Rao GN, del Cerro M, Aquavella JV. (1984) Corneal nerve alterations in diabetes mellitus. Arch Ophthalmol, 102(9): 1380-1384. Scullica L és Proto F. (1965) [Clinical and statistical findings on corneal sensitivity in diabetics]. Boll Ocul, 44(12): 944-954. Daubs JG. (1975) Diabetes screening with corneal aesthesiometer. Am J Optom Physiol Opt, 52(1): 31-35. Nielsen NV és Lund FS. (1979) Diabetic polyneuropathy. Corneal sensitivity, vibratory perception and Achilles tendon reflex in diabetics. Acta Neurol Scand, 59(1): 15-22. Nielsen NV. (1978) Corneal sensitivity and vibratory perception in diabetes mellitus. Acta Ophthalmol (Copenh), 56(3): 406-411. Kinoshita JH, Fukushi S, Kador P, Merola LO. (1979) Aldose reductase in diabetic complications of the eye. Metabolism, 28(4 Suppl 1): 462-469. Kinoshita JH. (1986) Aldose reductase in the diabetic eye. XLIII Edward Jackson memorial lecture. Am J Ophthalmol, 102(6): 685-692. Rogell GD. (1980) Corneal hypesthesia and retinopathy in diabetes mellitus. Ophthalmology, 87(3): 229-233. Herse PR. (1990) Corneal hydration control in normal and alloxan-induced diabetic rabbits. Invest Ophthalmol Vis Sci, 31(11): 2205-2213. Waite JH és Beetham WP. (1935) The visual mechanism in diabetes mellitus (a comparative study of 2002 diabetics, and 457 non-diabetics for control). N Engl J Med, 212: 367–443. Henkind P és Wise GN. (1961) Descemet's wrinkles in diabetes. Am J Ophthalmol, 52: 371-374. Busted N, Olsen T, Schmitz O. (1981) Clinical observations on the corneal thickness and the corneal endothelium in diabetes mellitus. Br J Ophthalmol, 65(10): 687-690. Shetlar DJ, Bourne WM, Campbell RJ. (1989) Morphologic evaluation of Descemet's membrane and corneal endothelium in diabetes mellitus. Ophthalmology, 96(2): 247-250. Johnson DH, Bourne WM, Campbell RJ. (1982) The ultrastructure of Descemet's membrane. I. Changes with age in normal corneas. Arch Ophthalmol, 100(12): 1942-1947. Johnson DH, Bourne WM, Campbell RJ. (1982) The ultrastructure of Descemet's membrane. II. Aphakic bullous keratopathy. Arch Ophthalmol, 100(12): 1948-1951.
117
PhD értekezés 127. 128. 129. 130. 131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. 138. 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152.
Dr. Popper Mónika
Bourne WM, Johnson DH, Campbell RJ. (1982) The ultrastructure of Descemet's membrane. III. Fuchs' dystrophy. Arch Ophthalmol, 100(12): 1952-1955. Kim EK, Geroski DH, Holley GP, Urken SI, Edelhauser HF. (1992) Corneal endothelial cytoskeletal changes in F-actin with aging, diabetes, and after cytochalasin exposure. Am J Ophthalmol, 114(3): 329-335. Meyer LA, Ubels JL, Edelhauser HF. (1988) Corneal endothelial morphology in the rat. Effects of aging, diabetes, and topical aldose reductase inhibitor treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci, 29(6): 940-948. Yee RW, Matsuda M, Kern TS, Engerman RL, Edelhauser HF. (1985) Corneal endothelial changes in diabetic dogs. Curr Eye Res, 4(7): 759-766. Schultz RO, Matsuda M, Yee RW, Edelhauser HF, Schultz KJ. (1984) Corneal endothelial changes in type I and type II diabetes mellitus. Am J Ophthalmol, 98(4): 401-410. Keoleian GM, Pach JM, Hodge DO, Trocme SD, Bourne WM. (1992) Structural and functional studies of the corneal endothelium in diabetes mellitus. Am J Ophthalmol, 113(1): 64-70. Matsuda M, Ohguro N, Ishimoto I, Fukuda M. (1990) Relationship of corneal endothelial morphology to diabetic retinopathy, duration of diabetes and glycemic control. Jpn J Ophthalmol, 34(1): 53-56. Inoue K, Kato S, Inoue Y, Amano S, Oshika T. (2002) The corneal endothelium and thickness in type II diabetes mellitus. Jpn J Ophthalmol, 46(1): 65-69. Roszkowska AM, Tringali CG, Colosi P, Squeri CA, Ferreri G. (1999) Corneal endothelium evaluation in type I and type II diabetes mellitus. Ophthalmologica, 213(4): 258-261. Itoi M, Nakamura T, Mizobe K, Kodama Y, Nakagawa N. (1989) Specular microscopic studies of the corneal endothelia of Japanese diabetics. Cornea, 8(1): 2-6. Lass JH, Spurney RV, Dutt RM, Andersson H, Kochar H, Rodman HM, Stern RC, Doershuk CF. (1985) A morphologic and fluorophotometric analysis of the corneal endothelium in type I diabetes mellitus and cystic fibrosis. Am J Ophthalmol, 100(6): 783-788. Larsson LI, Bourne WM, Pach JM, Brubaker RF. (1996) Structure and function of the corneal endothelium in diabetes mellitus type I and type II. Arch Ophthalmol, 114(1): 9-14. Weston BC, Bourne WM, Polse KA, Hodge DO. (1995) Corneal hydration control in diabetes mellitus. Invest Ophthalmol Vis Sci, 36(3): 586-595. Morishige N, Chikama TI, Sassa Y, Nishida T. (2001) Abnormal light scattering detected by confocal biomicroscopy at the corneal epithelial basement membrane of subjects with type II diabetes. Diabetologia, 44(3): 340-345. Barchiesi BJ, Eckel RH, Ellis PP. (1991) The cornea and disorders of lipid metabolism. Surv Ophthalmol, 36(1): 1-22. Pardos GJ és Krachmer JH. (1980) Comparison of endothelial cell density in diabetics and a control population. Am J Ophthalmol, 90(2): 172-174. Frueh BE, Korner U, Bohnke M. (1995) [Confocal microscopy of the cornea in patients with diabetes]. Klin Monatsbl Augenheilkd, 206(5): 317-319. de la Messeliere S és Renard G. (1987) [The corneal endothelium of diabetic patients. A study using specular microscopy]. J Fr Ophtalmol, 10(11): 647-655. McNamara NA, Brand RJ, Polse KA, Bourne WM. (1998) Corneal function during normal and high serum glucose levels in diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 39(1): 3-17. Aaberg TM. (1984) Correlation between corneal endothelial morphology and function. Am J Ophthalmol, 98(4): 510-512. Belmonte C, Acosta MC, Gallar J. (2004) Neural basis of sensation in intact and injured corneas. Exp Eye Res, 78(3): 513-525. Belmonte C, Aracil A, Acosta MC, Luna C, Gallar J. (2004) Nerves and sensations from the eye surface. Ocul Surf, 2(4): 248-253. Oliveira-Soto L és Efron N. (2001) Morphology of corneal nerves using confocal microscopy. Cornea, 20(4): 374-384. Patel DV és McGhee CN. (2005) Mapping of the normal human corneal sub-Basal nerve plexus by in vivo laser scanning confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci, 46(12): 4485-4488. Muller LJ, Pels L, Vrensen GF. (1996) Ultrastructural organization of human corneal nerves. Invest Ophthalmol Vis Sci, 37(4): 476-488. Schimmelpfennig B. (1982) Nerve structures in human central corneal epithelium. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 218(1): 14-20.
118
PhD értekezés 153. 154. 155. 156. 157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. 164. 165. 166. 167. 168. 169. 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177.
Dr. Popper Mónika
Auran JD, Koester CJ, Kleiman NJ, Rapaport R, Bomann JS, Wirotsko BM, Florakis GJ, Koniarek JP. (1995) Scanning slit confocal microscopic observation of cell morphology and movement within the normal human anterior cornea. Ophthalmology, 102(1): 33-41. Patel D és McGhee CN. (2008) In vivo confocal microscopy of human corneal nerves in health, in ocular and systemic disease, and following corneal surgery: a review. Br J Ophthalmol. Stachs O, Zhivov A, Kraak R, Stave J, Guthoff R. (2007) In vivo three-dimensional confocal laser scanning microscopy of the epithelial nerve structure in the human cornea. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 245(4): 569-575. Ueda S, del Cerro M, LoCascio JA, Aquavella JV. (1989) Peptidergic and catecholaminergic fibers in the human corneal epithelium. An immunohistochemical and electron microscopic study. Acta Ophthalmol Suppl, 192: 80-90. Belmonte C, Garcia.Hirschfeld J, Gallar J. (1997) Neurobiology of Ocular Pain. Progr Ret Eye Res, 16(1): 117-156. Matsuda H. (1968) [Electron microscopic study of the corneal nerve with special reference to the nerve endings]. Nippon Ganka Gakkai Zasshi, 72(7): 880-893. Martinez R. (1940) Etude sur l'innervation de la cornée humaine. Invest Biol, 32: 75-109. Rozsa AJ és Beuerman RW. (1982) Density and organization of free nerve endings in the corneal epithelium of the rabbit. Pain, 14(2): 105-120. Tervo T és Palkama A. (1978) Innervation of the rabbit cornea. A histochemical and electronmicroscopic study. Acta Anat (Basel), 102(2): 164-175. Marfurt CF, Murphy CJ, Florczak JL. (2001) Morphology and neurochemistry of canine corneal innervation. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42(10): 2242-2251. Marfurt CF, Kingsley RE, Echtenkamp SE. (1989) Sensory and sympathetic innervation of the mammalian cornea. A retrograde tracing study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 30(3): 461-472. Jones MA és Marfurt CF. (1998) Peptidergic innervation of the rat cornea. Exp Eye Res, 66(4): 421-435. Marfurt CF, Jones MA, Thrasher K. (1998) Parasympathetic innervation of the rat cornea. Exp Eye Res, 66(4): 437-448. Beckers HJ, Klooster J, Vrensen GF, Lamers WP. (1992) Ultrastructural identification of trigeminal nerve endings in the rat cornea and iris. Invest Ophthalmol Vis Sci, 33(6): 19791986. Beckers HJ, Klooster J, Vrensen GF, Lamers WP. (1993) Substance P in rat corneal and iridal nerves: an ultrastructural immunohistochemical study. Ophthalmic Res, 25(3): 192-200. Cavanagh HD, Jester JV, Essepian J, Shields W, Lemp MA. (1990) Confocal microscopy of the living eye. CLAO J, 16(1): 65-73. Masters BR és Thaer AA. (1994) In vivo human corneal confocal microscopy of identical fields of subepithelial nerve plexus, basal epithelial, and wing cells at different times. Microsc Res Tech, 29(5): 350-356. Wiegand W, Thaer AA, Kroll P, Geyer OC, Garcia AJ. (1995) Optical sectioning of the cornea with a new confocal in vivo slit-scanning videomicroscope. Ophthalmology, 102(4): 568-575. Richter A, Slowik C, Somodi S, Vick HP, Guthoff R. (1997) [In vivo imaging of corneal innervation in the human using confocal microscopy]. Ophthalmologe, 94(2): 141-146. Patel DV és McGhee CN. (2008) In vivo laser scanning confocal microscopy confirms that the human corneal sub-basal nerve plexus is a highly dynamic structure. Invest Ophthalmol Vis Sci, 49(8): 3409-3412. Stachs O, Knappe S, Zhivov A, Kraak R, Stave J, Guthoff RF. (2006) [Three-dimensional confocal laser scanning microscopy of the corneal nerve structure]. Klin Monatsbl Augenheilkd, 223(7): 583-588. Kobayashi A, Yokogawa H, Sugiyama K. (2006) In vivo laser confocal microscopy of Bowman's layer of the cornea. Ophthalmology, 113(12): 2203-2208. Erie JC, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. (2005) The effect of age on the corneal subbasal nerve plexus. Cornea, 24(6): 705-709. Patel DV, In vivo confocal microscopy of the cornea in health and disease (PhD thesis), in Department of Ophthalmology. University of Auckland, Auckland, New Zealand, 2005. Niederer RL, Perumal D, Sherwin T, McGhee CN. (2007) Age-related differences in the normal human cornea: a laser scanning in vivo confocal microscopy study. Br J Ophthalmol, 91(9): 1165-1169.
119
PhD értekezés 178. 179. 180. 181. 182. 183. 184. 185. 186. 187. 188. 189. 190. 191. 192. 193. 194. 195. 196. 197. 198. 199. 200. 201.
Dr. Popper Mónika
Mokdad AH, Ford ES, Bowman BA, Nelson DE, Engelgau MM, Vinicor F, Marks JS. (2000) Diabetes trends in the U.S.: 1990-1998. Diabetes Care, 23(9): 1278-1283. Gooch C és Podwall D. (2004) The diabetic neuropathies. Neurologist, 10(6): 311-322. Partanen J, Niskanen L, Lehtinen J, Mervaala E, Siitonen O, Uusitupa M. (1995) Natural history of peripheral neuropathy in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med, 333(2): 89-94. Park TS, Park JH, Baek HS. (2004) Can diabetic neuropathy be prevented? Diabetes Res Clin Pract, 66 Suppl 1: S53-56. Nasseri K, Strijers RL, Dekhuijzen LS, Buster M, Bertelsmann FW. (1998) Reproducibility of different methods for diagnosing and monitoring diabetic neuropathy. Electromyogr Clin Neurophysiol, 38(5): 295-299. Rahman M, Griffin SJ, Rathmann W, Wareham NJ. (2003) How should peripheral neuropathy be assessed in people with diabetes in primary care? A population-based comparison of four measures. Diabet Med, 20(5): 368-374. Aprile I, Stalberg E, Caliandro P, Pazzaglia C, Tonali P, Padua L. (2004) Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments--a comment. Brain, 127(Pt 12): E20; author reply E21. Lauria G, McArthur JC, Hauer PE, Griffin JW, Cornblath DR. (1998) Neuropathological alterations in diabetic truncal neuropathy: evaluation by skin biopsy. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 65(5): 762-766. Pittenger GL, Ray M, Burcus NI, McNulty P, Basta B, Vinik AI. (2004) Intraepidermal nerve fibers are indicators of small-fiber neuropathy in both diabetic and nondiabetic patients. Diabetes Care, 27(8): 1974-1979. Van Schaik HJ és Van Best JA. (1997) A solid fluorescence reference for corneal autofluorescence measurements. Exp Eye Res, 64(1): 121-123. Laing RA, Fischbarg J, Chance B. (1980) Noninvasive measurements of pyridine nucleotide fluorescence from the cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci, 19(1): 96-102. Van Best JA és Docchio F. (1998) Simple, low-cost, portable corneal fluorometer for detection of the level of diabetic retinopathy. Appl Opt, 37(19): 4303-4311. Kessel L, Moldow B, van Best JA, Sander B. (2003) Corneal autofluorescence in relation to permeability of the blood-aqueous barrier in diabetic patients with clinically significant macular edema and in an age-matched control group. Curr Eye Res, 26(5): 307-312. Janiec S, Rzendkowski M, Bolek S. (1994) The relation between corneal autofluorescence, endothelial cell count and severity of the diabetic retinopathy. Int Ophthalmol, 18(4): 205-209. Sato E, Mori F, Igarashi S, Abiko T, Takeda M, Ishiko S, Yoshida A. (2001) Corneal advanced glycation end products increase in patients with proliferative diabetic retinopathy. Diabetes Care, 24(3): 479-482. Rovati L és Docchio F. (2004) Autofluorescence methods in ophthalmology. J Biomed Opt, 9(1): 9-21. Ishino Y, Yokoi N, Yasuhara T, Yamasaki T, Koizumi K, Ikeda T, Kinoshita S. (2001) Investigation of Corneal Autofluorescence in Diabetic Patients. Jpn J Ophthalmol, 45(1): 116. Cavanagh HD, Petroll WM, Alizadeh H, He YG, McCulley JP, Jester JV. (1993) Clinical and diagnostic use of in vivo confocal microscopy in patients with corneal disease. Ophthalmology, 100(10): 1444-1454. Jalbert I, Stapleton F, Papas E, Sweeney DF, Coroneo M. (2003) In vivo confocal microscopy of the human cornea. Br J Ophthalmol, 87(2): 225-236. Masters BR és Bohnke M. (2002) Three-dimensional confocal microscopy of the living human eye. Annu Rev Biomed Eng, 4: 69-91. Bohnke M és Masters BR. (1999) Confocal microscopy of the cornea. Prog Retin Eye Res, 18(5): 553-628. Kaufman SC, Musch DC, Belin MW, Cohen EJ, Meisler DM, Reinhart WJ, Udell IJ, Van Meter WS. (2004) Confocal microscopy: a report by the American Academy of Ophthalmology. Ophthalmology, 111(2): 396-406. Patel DV és McGhee CN. (2007) Contemporary in vivo confocal microscopy of the living human cornea using white light and laser scanning techniques: a major review. Clin Experiment Ophthalmol, 35(1): 71-88. Chiou AG, Kaufman SC, Kaufman HE, Beuerman RW. (2006) Clinical corneal confocal microscopy. Surv Ophthalmol, 51(5): 482-500.
120
PhD értekezés 202. 203. 204. 205. 206. 207. 208. 209. 210. 211. 212. 213. 214. 215. 216. 217. 218. 219. 220. 221. 222. 223. 224. 225. 226. 227.
Dr. Popper Mónika
Mastropasqua L és Nubile M. Confocal Microscopy of the Cornea. Slack Incorporated, 2002. Guthoff RF, Baudouin C, Stave J. Atlas of Confocal Laser Scanning In-vivo Microscopy in Ophthalmology - Principles and Applications in Diagnostic and Therapeutic Ophthalmology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 2006. Imre L. (1999) Első hazai tapasztalatok konfokális corneamikroszkópiával. Szemészet, 136: 97102. Efron N, Perez-Gomez I, Mutalib HA, Hollingsworth J. (2001) Confocal microscopy of the normal human cornea. Cont Lens Anterior Eye, 24(1): 16-24. Guthoff RF és Stave J. In vivo micro morphology of the cornea: Confocal microscopy principles and clinical application. In: Reinhard T, Larkin F Cornea and External eye disease. 16 th ed. Springer; 2006. p. 174-81. (szerk.) Cornea and External Eye Disease. Springer, 2006: 174-181. Minsky M. (1988) Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning, 10: 128138. Petran M, Hadravsky M, Egger MD, Galambos R. (1968) Tandem-scanning reflected-light microscope. J Optics Soc Am, 58: 661-664. Cavanagh HD, El-Agha MS, Petroll WM, Jester JV. (2000) Specular microscopy, confocal microscopy, and ultrasound biomicroscopy: diagnostic tools of the past quarter century. Cornea, 19(5): 712-722. Egger MD és Petran M. (1967) New reflected-light microscope for viewing unstained brain and ganglion cells. Science, 157(786): 305-307. Lemp MA, Dilly PN, Boyde A. (1985) Tandem-scanning (confocal) microscopy of the fullthickness cornea. Cornea, 4(4): 205-209. Svishchev GM. (1969) Microscope for the study of transparent lightscattering objects in incident light. Opt Spectrosc, 26: 171-172. Svishchev GM. (1971) Image contrast in a microscope with synchronous object scanning by slit field diagrams. Opt Spectrosc, 30: 188–191. Masters BR. (2004) David Maurice's contributions to optical ophthalmic instrumentation: roots of the scanning slit clinical confocal microscope. Exp Eye Res, 78(3): 315-326. Maurice DM. (1974) A scanning slit optical microscope. Invest Ophthalmol, 13(12): 1033-1037. Koester CJ. (1980) Scanning mirror microscope with optical sectioning characteristics: applications to ophthalmology. Appl Opt, 19: 1749–1757. Koester CJ, Auran JD, Rosskothen HD, Florakis GJ, Tackaberry RB. (1993) Clinical microscopy of the cornea utilizing optical sectioning and a high-numerical-aperture objective. J Opt Soc Am A, 10(7): 1670-1679. Masters BR és Thaer AA. (1994) Real-time scanning slit confocal microscopy of the in vivo human cornea. Appl Opt, 33: 695–701. McLaren JW, Nau CB, Kitzmann AS, Bourne WM. (2005) Keratocyte density: comparison of two confocal microscopes. Eye Contact Lens, 31(1): 28-33. Masters BR és Bohnke M. (2001) Confocal microscopy of the human cornea in vivo. Int Ophthalmol, 23(4-6): 199-206. Zhivov A, Stachs O, Kraak R, Stave J, Guthoff RF. (2006) In vivo confocal microscopy of the ocular surface. Ocul Surf, 4(2): 81-93. Szaflik JP. (2007) Comparison of in vivo confocal microscopy of human cornea by white light scanning slit and laser scanning systems. Cornea, 26(4): 438-445. Eckard A, Stave J, Guthoff RF. (2006) In vivo investigations of the corneal epithelium with the confocal Rostock Laser Scanning Microscope (RLSM). Cornea, 25(2): 127-131. Zhivov A, Stave J, Vollmar B, Guthoff R. (2005) In vivo confocal microscopic evaluation of Langerhans cell density and distribution in the normal human corneal epithelium. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 243(10): 1056-1061. Mustonen RK, McDonald MB, Srivannaboon S, Tan AL, Doubrava MW, Kim CK. (1998) Normal human corneal cell populations evaluated by in vivo scanning slit confocal microscopy. Cornea, 17(5): 485-492. Tomii S és Kinoshita S. (1994) Observations of human corneal epithelium by tandem scanning confocal microscope. Scanning, 16(5): 305-306. Popper M, Morgado AM, Quadrado MJ, Van Best JA. (2004) Corneal cell density measurement in vivo by scanning slit confocal microscopy: method and validation. Ophthalmic Res, 36(5): 270-276.
121
PhD értekezés 228. 229. 230. 231. 232. 233. 234. 235. 236. 237. 238. 239. 240. 241. 242. 243. 244. 245. 246. 247. 248. 249. 250. 251. 252.
Dr. Popper Mónika
Patel S, McLaren J, Hodge D, Bourne W. (2001) Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42(2): 333-339. Berlau J, Becker HH, Stave J, Oriwol C, Guthoff RF. (2002) Depth and age-dependent distribution of keratocytes in healthy human corneas: a study using scanning-slit confocal microscopy in vivo. J Cataract Refract Surg, 28(4): 611-616. Bourne WM, Nelson LR, Hodge DO. (1997) Central corneal endothelial cell changes over a ten-year period. Invest Ophthalmol Vis Sci, 38(3): 779-782. Murphy C, Alvarado J, Juster R. (1984) Prenatal and postnatal growth of the human Descemet's membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci, 25(12): 1402-1415. Chiou AG, Kaufman SC, Beuerman RW, Ohta T, Kaufman HE. (1999) Differential diagnosis of linear corneal images on confocal microscopy. Cornea, 18(1): 63-66. Knappe S, Stave J, Guthoff RF. (2005) [Epidemic keratoconjunctivitis. In vivo images of corneal structures with the confocal Rostocker laser scanning microscope (RLSM)]. Ophthalmologe, 102(8): 798-801. Dosso AA és Rungger-Brandle E. (2008) Clinical course of epidemic keratoconjunctivitis: evaluation by in vivo confocal microscopy. Cornea, 27(3): 263-268. Florakis GJ, Moazami G, Schubert H, Koester CJ, Auran JD. (1997) Scanning slit confocal microscopy of fungal keratitis. Arch Ophthalmol, 115(11): 1461-1463. Avunduk AM, Beuerman RW, Varnell ED, Kaufman HE. (2003) Confocal microscopy of Aspergillus fumigatus keratitis. Br J Ophthalmol, 87(4): 409-410. Auran JD, Starr MB, Koester CJ, LaBombardi VJ. (1994) In vivo scanning slit confocal microscopy of Acanthamoeba keratitis. A case report. Cornea, 13(2): 183-185. Nakano E, Oliveira M, Portellinha W, de Freitas D, Nakano K. (2004) Confocal microscopy in early diagnosis of Acanthamoeba keratitis. J Refract Surg, 20(5 Suppl): S737-740. Pfister DR, Cameron JD, Krachmer JH, Holland EJ. (1996) Confocal microscopy findings of Acanthamoeba keratitis. Am J Ophthalmol, 121(2): 119-128. Parmar DN, Awwad ST, Petroll WM, Bowman RW, McCulley JP, Cavanagh HD. (2006) Tandem scanning confocal corneal microscopy in the diagnosis of suspected acanthamoeba keratitis. Ophthalmology, 113(4): 538-547. Winchester K, Mathers WD, Sutphin JE, Daley TE. (1995) Diagnosis of Acanthamoeba keratitis in vivo with confocal microscopy. Cornea, 14(1): 10-17. Efron N. (2007) Contact lens-induced changes in the anterior eye as observed in vivo with the confocal microscope. Prog Retin Eye Res, 26(4): 398-436. Kobayashi A, Ishibashi Y, Oikawa Y, Yokogawa H, Sugiyama K. (2008) In vivo and ex vivo laser confocal microscopy findings in patients with early-stage acanthamoeba keratitis. Cornea, 27(4): 439-445. Tu EY, Joslin CE, Sugar J, Booton GC, Shoff ME, Fuerst PA. (2008) The relative value of confocal microscopy and superficial corneal scrapings in the diagnosis of Acanthamoeba keratitis. Cornea, 27(7): 764-772. Imre L, Tóth J, Megyesi M, Lukáts O, Resch M. (2004) Az Acanthamoeba-keratitis in vivo diagnosztikája konfokális korneamikroszkóppal. Szemészet, 141: 359-363. Sutphin JE, Kantor AL, Mathers WD, Mehaffey MG. (1997) Evaluation of infectious crystalline keratitis with confocal microscopy in a case series. Cornea, 16(1): 21-26. Vaddavalli PK, Garg P, Sharma S, Thomas R, Rao GN. (2006) Confocal microscopy for Nocardia keratitis. Ophthalmology, 113(9): 1645-1650. Shah GK, Pfister D, Probst LE, Ferrieri P, Holland E. (1996) Diagnosis of microsporidial keratitis by confocal microscopy and the chromatrope stain. Am J Ophthalmol, 121(1): 89-91. Alsuhaibani AH, Sutphin JE, Wagoner MD. (2006) Confocal microscopy of subepithelial infiltrates occurring after epidemic keratoconjunctivitis. Cornea, 25(9): 1102-1104. Rosenberg ME, Tervo TM, Muller LJ, Moilanen JA, Vesaluoma MH. (2002) In vivo confocal microscopy after herpes keratitis. Cornea, 21(3): 265-269. Patel DV, Grupcheva CN, McGhee CN. (2005) Imaging the microstructural abnormalities of meesmann corneal dystrophy by in vivo confocal microscopy. Cornea, 24(6): 669-673. Ku JY, Grupcheva CN, McGhee CN. (2002) Microstructural analysis of Salzmann's nodular degeneration by in vivo confocal microscopy. Clin Experiment Ophthalmol, 30(5): 367-368.
122
PhD értekezés 253. 254. 255. 256. 257. 258. 259. 260. 261. 262. 263. 264. 265. 266. 267. 268. 269. 270. 271. 272. 273. 274. 275. 276.
Dr. Popper Mónika
Rosenberg ME, Tervo TM, Gallar J, Acosta MC, Muller LJ, Moilanen JA, Tarkkanen AH, Vesaluoma MH. (2001) Corneal morphology and sensitivity in lattice dystrophy type II (familial amyloidosis, Finnish type). Invest Ophthalmol Vis Sci, 42(3): 634-641. Werner LP, Werner L, Dighiero P, Legeais JM, Renard G. (1999) Confocal microscopy in Bowman and stromal corneal dystrophies. Ophthalmology, 106(9): 1697-1704. Vesaluoma MH, Linna TU, Sankila EM, Weiss JS, Tervo TM. (1999) In vivo confocal microscopy of a family with Schnyder crystalline corneal dystrophy. Ophthalmology, 106(5): 944-951. Chiou AG, Kaufman SC, Beuerman RW, Ohta T, Soliman H, Kaufman HE. (1999) Confocal microscopy in cornea guttata and Fuchs' endothelial dystrophy. Br J Ophthalmol, 83(2): 185189. Hollingsworth JG, Bonshek RE, Efron N. (2005) Correlation of the appearance of the keratoconic cornea in vivo by confocal microscopy and in vitro by light microscopy. Cornea, 24(4): 397-405. Hollingsworth JG és Efron N. (2005) Observations of banding patterns (Vogt striae) in keratoconus: a confocal microscopy study. Cornea, 24(2): 162-166. Erie JC, Patel SV, McLaren JW, Nau CB, Hodge DO, Bourne WM. (2002) Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study(a). Am J Ophthalmol, 134(5): 689-695. Grupcheva CN, Craig JP, Sherwin T, McGhee CN. (2001) Differential diagnosis of corneal oedema assisted by in vivo confocal microscopy. Clin Experiment Ophthalmol, 29(3): 133-137. Patel DV és McGhee CN. (2006) Mapping the corneal sub-basal nerve plexus in keratoconus by in vivo laser scanning confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci, 47(4): 1348-1351. Quadrado MJ, Popper M, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA. (2004) Microscopia Confocal in Vivo: Alterações Morfológicas no Queratocone. Exp Ophthalmol, 30: 11-16. Efron N, Morgan PB, Makrynioti D. (2007) Chronic morbidity of corneal infiltrative events associated with contact lens wear. Cornea, 26(7): 793-799. Kaufman SC, Hamano H, Beuerman RW, Laird JA, Thompson HW. (1996) Transient corneal stromal and endothelial changes following soft contact lens wear: a study with confocal microscopy. CLAO J, 22(2): 127-132. Zhivov A, Stave J, Vollmar B, Guthoff R. (2007) In vivo confocal microscopic evaluation of langerhans cell density and distribution in the corneal epithelium of healthy volunteers and contact lens wearers. Cornea, 26(1): 47-54. Patel SV, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. (2002) Confocal microscopy in vivo in corneas of long-term contact lens wearers. Invest Ophthalmol Vis Sci, 43(4): 995-1003. Jalbert I és Stapleton F. (1999) Effect of lens wear on corneal stroma: preliminary findings. Aust N Z J Ophthalmol, 27(3-4): 211-213. Efron N, Mutalib HA, Perez-Gomez I, Koh HH. (2002) Confocal microscopic observations of the human cornea following overnight contact lens wear. Clin Exp Optom, 85(3): 149-155. Efron N, Perez-Gomez I, Morgan PB. (2002) Confocal microscopic observations of stromal keratocytes during extended contact lens wear. Clin Exp Optom, 85(3): 156-160. Ladage PM, Yamamoto N, Robertson DM, Jester JV, Petroll WM, Cavanagh HD. (2004) Pseudomonas aeruginosa corneal binding after 24-hour orthokeratology lens wear. Eye Contact Lens, 30(3): 173-178. Resch MD, Imre L, Tapaszto B, Nemeth J. (2008) Confocal microscopic evidence of increased Langerhans cell activity after corneal metal foreign body removal. Eur J Ophthalmol, 18(5): 703-707. Tuominen IS, Konttinen YT, Vesaluoma MH, Moilanen JA, Helinto M, Tervo TM. (2003) Corneal innervation and morphology in primary Sjogren's syndrome. Invest Ophthalmol Vis Sci, 44(6): 2545-2549. Benitez del Castillo JM, Wasfy MA, Fernandez C, Garcia-Sanchez J. (2004) An in vivo confocal masked study on corneal epithelium and subbasal nerves in patients with dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci, 45(9): 3030-3035. Erdelyi B, Kraak R, Zhivov A, Guthoff R, Nemeth J. (2007) In vivo confocal laser scanning microscopy of the cornea in dry eye. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 245(1): 39-44. Villani E, Galimberti D, Viola F, Mapelli C, Ratiglia R. (2007) The cornea in Sjogren's syndrome: an in vivo confocal study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 48(5): 2017-2022. De Nicola R, Labbe A, Amar N, Dupas B, Baudouin C. (2005) [In vivo confocal microscopy and ocular surface diseases: anatomical-clinical correlations]. J Fr Ophtalmol, 28(7): 691-698.
123
PhD értekezés 277. 278. 279. 280. 281. 282. 283. 284. 285. 286. 287. 288. 289. 290. 291. 292. 293. 294. 295. 296. 297. 298. 299. 300. 301.
Dr. Popper Mónika
Tuisku IS, Konttinen YT, Konttinen LM, Tervo TM. (2008) Alterations in corneal sensitivity and nerve morphology in patients with primary Sjogren's syndrome. Exp Eye Res, 86(6): 879885. Villani E, Galimberti D, Viola F, Mapelli C, Del Papa N, Ratiglia R. (2008) Corneal involvement in rheumatoid arthritis: an in vivo confocal study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 49(2): 560-564. Zhang M, Chen J, Luo L, Xiao Q, Sun M, Liu Z. (2005) Altered corneal nerves in aqueous tear deficiency viewed by in vivo confocal microscopy. Cornea, 24(7): 818-824. Hosal BM, Ornek N, Zilelioglu G, Elhan AH. (2005) Morphology of corneal nerves and corneal sensation in dry eye: a preliminary study. Eye, 19(12): 1276-1279. Liu Z és Pflugfelder SC. (1999) Corneal thickness is reduced in dry eye. Cornea, 18(4): 403407. Erdélyi B, Kraak R, Guthoff R, Németh J. (2005) Konfokális korneamikroszkópos vizsgálatok száraz szem betegségben. Szemészet, 142: 135-138. Hollingsworth JG, Efron N, Tullo AB. (2006) A longitudinal case series investigating cellular changes to the transplanted cornea using confocal microscopy. Cont Lens Anterior Eye, 29(3): 135-141. Darwish T, Brahma A, Efron N, O'Donnell C. (2007) Subbasal Nerve Regeneration After Penetrating Keratoplasty. Cornea, 26(8): 935-940. Niederer RL, Perumal D, Sherwin T, McGhee CN. (2007) Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: an in vivo confocal microscopy study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 48(2): 621-626. Patel SV, Erie JC, McLaren JW, Bourne WM. (2007) Keratocyte and subbasal nerve density after penetrating keratoplasty. Trans Am Ophthalmol Soc, 105: 180-189; discussion 189-190. Patel SV, Erie JC, McLaren JW, Bourne WM. (2007) Keratocyte density and recovery of subbasal nerves after penetrating keratoplasty and in late endothelial failure. Arch Ophthalmol, 125(12): 1693-1698. Niederer RL, Sherwin T, McGhee CN. (2007) In vivo confocal microscopy of subepithelial infiltrates in human corneal transplant rejection. Cornea, 26(4): 501-504. Forseto Ados S, dos Santos MS, Sampaio A, Mascaro V, Nose W. (2006) Diagnosis of epithelial ingrowth after penetrating keratoplasty with confocal microscopy. Cornea, 25(9): 1124-1127. Imre L, Resch M, Nagymihaly A. (2005) [In vivo confocal corneal microscopy after keratoplasty]. Ophthalmologe, 102(2): 140-146. Imre L, Kerényi Á, Nagymihály A. (2003) In vivo konfokális korneamikroszkópia szövődménymentes keratoplasztikák után. Szemészet, 140: 211-216. Labbe A, Dupas B, Hamard P, Baudouin C. (2005) In vivo confocal microscopy study of blebs after filtering surgery. Ophthalmology, 112(11): 1979.e1971-e1979 Messmer EM, Zapp DM, Mackert MJ, Thiel M, Kampik A. (2006) In vivo confocal microscopy of filtering blebs after trabeculectomy. Arch Ophthalmol, 124(8): 1095-1103. Amar N, Labbe A, Hamard P, Dupas B, Baudouin C. (2008) Filtering blebs and aqueous pathway an immunocytological and in vivo confocal microscopy study. Ophthalmology, 115(7): 1154-1161 e1154. Sbeity Z, Radcliffe N, Palmiero PM, Tello C, Liebmann J, Ritch R. (2008) Non-contact in vivo scanning laser microscopy of blebitis. Eye: 2008 Aug 2008. [Epub ahead of print]. Rajan MS, Watters W, Patmore A, Marshall J. (2005) In vitro human corneal model to investigate stromal epithelial interactions following refractive surgery. J Cataract Refract Surg, 31(9): 1789-1801. Kaufman SC és Kaufman HE. (2006) How has confocal microscopy helped us in refractive surgery? Curr Opin Ophthalmol, 17(4): 380-388. Chew SJ, Beuerman RW, Kaufman HE, McDonald MB. (1995) In vivo confocal microscopy of corneal wound healing after excimer laser photorefractive keratectomy. CLAO J, 21(4): 273280. Erie JC. (2003) Corneal wound healing after photorefractive keratectomy: a 3-year confocal microscopy study. Trans Am Ophthalmol Soc, 101: 293-333. Erie JC, Patel SV, McLaren JW, Maguire LJ, Ramirez M, Bourne W. (2000) Keratocyte density in vivo after photorefractive keratectomy in humans. Am J Ophthalmol, 129(5): 703. Erie JC, Patel SV, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. (2003) Keratocyte density in the human cornea after photorefractive keratectomy. Arch Ophthalmol, 121(6): 770-776.
124
PhD értekezés 302. 303. 304. 305. 306. 307. 308. 309. 310. 311. 312. 313. 314. 315. 316. 317. 318. 319. 320. 321. 322. 323.
Dr. Popper Mónika
Moilanen JA, Vesaluoma MH, Muller LJ, Tervo TM. (2003) Long-term corneal morphology after PRK by in vivo confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci, 44(3): 1064-1069. Erie JC, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. (2005) Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK. Am J Ophthalmol, 140(6): 1059-1064. Erie JC, Patel SV, Bourne WM. (2003) Aberrant corneal nerve regeneration after PRK. Cornea, 22(7): 684-686. Avunduk AM, Senft CJ, Emerah S, Varnell ED, Kaufman HE. (2004) Corneal healing after uncomplicated LASIK and its relationship to refractive changes: a six-month prospective confocal study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 45(5): 1334-1339. Buhren J és Kohnen T. (2003) Corneal wound healing after laser in situ keratomileusis flap lift and epithelial abrasion. J Cataract Refract Surg, 29(10): 2007-2012. Kohnen T, Buhren J, Baumeister M. (2001) Confocal microscopic imaging of reticular folds in a laser in situ keratomileusis flap. J Refract Surg, 17(6): 689-691. Linna TU, Perez-Santonja JJ, Tervo KM, Sakla HF, Alio y Sanz JL, Tervo TM. (1998) Recovery of corneal nerve morphology following laser in situ keratomileusis. Exp Eye Res, 66(6): 755763. Perez-Gomez I és Efron N. (2003) Change to corneal morphology after refractive surgery (myopic laser in situ keratomileusis) as viewed with a confocal microscope. Optom Vis Sci, 80(10): 690-697. Perez-Gomez I és Efron N. (2003) Confocal microscopic evaluation of particles at the corneal flap interface after myopic laser in situ keratomileusis. J Cataract Refract Surg, 29(7): 13731377. Slowik C, Somodi S, Richter A, Guthoff R. (1996) Assessment of corneal alterations following laser in situ keratomileusis by confocal slit scanning microscopy. Ger J Ophthalmol, 5(6): 526531. Tervo T és Moilanen J. (2003) In vivo confocal microscopy for evaluation of wound healing following corneal refractive surgery. Prog Retin Eye Res, 22(3): 339-358. Vesaluoma M, Perez-Santonja J, Petroll WM, Linna T, Alio J, Tervo T. (2000) Corneal stromal changes induced by myopic LASIK. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41(2): 369-376. Vesaluoma MH, Petroll WM, Perez-Santonja JJ, Valle TU, Alio JL, Tervo TM. (2000) Laser in situ keratomileusis flap margin: wound healing and complications imaged by in vivo confocal microscopy. Am J Ophthalmol, 130(5): 564-573. Erie JC, Nau CB, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. (2004) Long-term keratocyte deficits in the corneal stroma after LASIK. Ophthalmology, 111(7): 1356-1361. Pisella PJ, Auzerie O, Bokobza Y, Debbasch C, Baudouin C. (2001) Evaluation of corneal stromal changes in vivo after laser in situ keratomileusis with confocal microscopy. Ophthalmology, 108(10): 1744-1750. Lee BH, McLaren JW, Erie JC, Hodge DO, Bourne WM. (2002) Reinnervation in the cornea after LASIK. Invest Ophthalmol Vis Sci, 43(12): 3660-3664. Linna TU, Vesaluoma MH, Perez-Santonja JJ, Petroll WM, Alio JL, Tervo TM. (2000) Effect of myopic LASIK on corneal sensitivity and morphology of subbasal nerves. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41(2): 393-397. McLaren JW, Nau CB, Erie JC, Bourne WM. (2004) Corneal thickness measurement by confocal microscopy, ultrasound, and scanning slit methods. Am J Ophthalmol, 137(6): 10111020. Kaufman SC, Maitchouk DY, Chiou AG, Beuerman RW. (1998) Interface inflammation after laser in situ keratomileusis. Sands of the Sahara syndrome. J Cataract Refract Surg, 24(12): 1589-1593. Grupcheva CN, Malik TY, Craig JP, McGhee CN. (2001) In vivo confocal microscopy of corneal epithelial ingrowth through a laser in situ keratomileusis flap buttonhole. J Cataract Refract Surg, 27(8): 1318-1322. Sonigo B, Chong Sit D, Ancel JM, Auclin F, Bokobza Y, Baudouin C. (2005) [In vivo confocal microscopy evaluation of corneal changes induced after LASIK using the IntraLase femtosecond laser technique]. J Fr Ophtalmol, 28(5): 463-472. Sonigo B, Iordanidou V, Chong-Sit D, Auclin F, Ancel JM, Labbe A, Baudouin C. (2006) In vivo corneal confocal microscopy comparison of intralase femtosecond laser and mechanical microkeratome for laser in situ keratomileusis. Invest Ophthalmol Vis Sci, 47(7): 2803-2811.
125
PhD értekezés 324.
325. 326. 327. 328. 329. 330. 331. 332. 333.
334. 335. 336. 337. 338. 339. 340. 341. 342. 343. 344. 345. 346. 347. 348. 349.
Dr. Popper Mónika
Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group: Grading diabetic retinopathy from stereoscopic color fundus photographs--an extension of the modified Airlie House classification. ETDRS report number 10. Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group. (1991) Ophthalmology, 98(5 Suppl): 786-806. Tomey Confoscan P4 Users' Manual. Tomey, Fortune Technologies, Vigonza / Erlangen. Joyce NC. (2003) Proliferative capacity of the corneal endothelium. Prog Retin Eye Res, 22(3): 359-389. Rodrigues MM, Waring GO, Hackett J, Donohoo P. Cornea. In: Jakobiec FA (szerk.) Ocular Anatomy, Embryology and Teratology. Harper & Row, Philadelphia, 1982: 153–165. Masters BR és Thaer AA. (1995) In vivo real-time confocal microscopy of wing cells in the human cornea: A new benchmark for in vivo corneal microscopy. Bioimages, 3: 7–11. Smolek MK és Klyce SD. Cornea. In: Tasman W és Jaeger EA (szerk.) Duane’s Foundations of Clinical Ophthalmology. Lippincott-Raven, Philadelphia, 1995. Hahnel C, Somodi S, Weiss DG, Guthoff RF. (2000) The keratocyte network of human cornea: a three-dimensional study using confocal laser scanning fluorescence microscopy. Cornea, 19(2): 185-193. Muller LJ, Pels L, Vrensen GF. (1995) Novel aspects of the ultrastructural organization of human corneal keratocytes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 36(13): 2557-2567. Oliveira-Soto L és Efron N. (2003) Assessing the cornea by in vivo confocal microscopy. Clin Experiment Ophthalmol, 31(1): 83-84; author reply 84-86. Gundersen HJ, Bendtsen TF, Korbo L, Marcussen N, Moller A, Nielsen K, Nyengaard JR, Pakkenberg B, Sorensen FB, Vesterby A, et al. (1988) Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. Apmis, 96(5): 379394. Gundersen HJG. (1977) Notes on the estimation of the numerical density of arbitrary profiles: The edge effect. J Microsc, 111: 219-223. Abercrombie M. (1946) Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec, 94: 239-247. Wilson T. Optical aspects of confocal microscopy. In: Wilson T (szerk.) Confocal Microscopy. Academic Press, London, 1990: 93-141. British Standards Institution: Precision of Test Methods 1: Guide for the Determination and Reproducibility for a Standard Test Method, Institution BS, (szerk.). BSI, London, 1975. Bland JM és Altman DG. (1986) Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet, 1(8476): 307-310. Zar JH. Biostatistical Analysis. Prentice-Hall, Englewood Cliff, NJ, 1984. Weisstein EW. Bonferroni correction. [letöltve: 2004. június 15.]; URL: http://mathworld.wolfram.com/BonferroniCorrection.html. Nemenyi PB, Distribution-free multiple comparisons (PhD thesis). Princeton University, 1963. Grupcheva CN, Craig J, Sherwin T, McGhee J, McGhee C. (2001) Stereological analysis of keratocyte density in the human cornea using in vivo confocal microscopy as an optical dissector. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42: S281, ARVO abstract 1524. Patel SV, McLaren JW, Camp JJ, Nelson LR, Bourne WM. (1999) Automated quantification of keratocyte density by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(2): 320326. Stave J, Slowik C, Somodi S, Hahnel C, Grummer G, Guthoff R. (1998) [Keratinocyte density of the cornea in vivo. Automated measurement with a modified confocal microscopy MICROPHTHAL]. Klin Monatsbl Augenheilkd, 213(1): 38-44. Moller-Pedersen T, Ledet T, Ehlers N. (1994) The keratocyte density of human donor corneas. Curr Eye Res, 13(2): 163-169. Ciancaglini M, Carpineto P, Zuppardi E, Nubile M, Doronzo E, Mastropasqua L. (2001) In vivo confocal microscopy of patients with amiodarone-induced keratopathy. Cornea, 20(4): 368-373. Petroll WM, Boettcher K, Barry P, Cavanagh HD, Jester JV. (1995) Quantitative assessment of anteroposterior keratocyte density in the normal rabbit cornea. Cornea, 14(1): 3-9. Merimee TJ. (1990) Diabetic retinopathy. A synthesis of perspectives. N Engl J Med, 322(14): 978-983. Fong DS, Aiello LP, Ferris FL, 3rd, Klein R. (2004) Diabetic retinopathy. Diabetes Care, 27(10): 2540-2553.
126
PhD értekezés 350. 351. 352. 353. 354. 355. 356. 357. 358. 359. 360.
361. 362. 363. 364. 365. 366. 367. 368. 369.
370. 371. 372. 373.
Dr. Popper Mónika
Fong DS, Aiello L, Gardner TW, King GL, Blankenship G, Cavallerano JD, Ferris FL, 3rd, Klein R. (2004) Retinopathy in diabetes. Diabetes Care, 27 Suppl 1: S84-87. Fong DS, Aiello L, Gardner TW, King GL, Blankenship G, Cavallerano JD, Ferris FL, 3rd, Klein R. (2003) Diabetic retinopathy. Diabetes Care, 26(1): 226-229. Sanchez-Thorin JC. (1997) Retinopathy and type 2 diabetes. Diabetes Care, 20(9): 1491-1493. Sanchez-Thorin JC. (1998) The epidemiology of diabetes mellitus and diabetic retinopathy. Int Ophthalmol Clin, 38(2): 11-18. Herse PR. (1988) A review of manifestations of diabetes mellitus in the anterior eye and cornea. Am J Optom Physiol Opt, 65(3): 224-230. Didenko TN, Smoliakova GP, Sorokin EL, Egorov VV. (1999) [Clinical and pathogenetic features of neurotrophic corneal disorders in diabetes]. Vestn Oftalmol, 115(6): 7-11. Touzeau O, Levet L, Borderie V, Bouchard P, Laroche L. (2004) [Anterior segment of the eye and diabetes mellitus]. J Fr Ophtalmol, 27(8): 859-870. Gekka M, Miyata K, Nagai Y, Nemoto S, Sameshima T, Tanabe T, Maruoka S, Nakahara M, Kato S, Amano S. (2004) Corneal epithelial barrier function in diabetic patients. Cornea, 23(1): 35-37. Saini JS és Mittal S. (1996) In vivo assessment of corneal endothelial function in diabetes mellitus. Arch Ophthalmol, 114(6): 649-653. Sady C, Khosrof S, Nagaraj R. (1995) Advanced Maillard reaction and crosslinking of corneal collagen in diabetes. Biochem Biophys Res Commun, 214(3): 793-797. Popper M, Quadrado MJ, Morgado AM, Murta JN, Müller LJ, Van Best JA. (2007) A szaruhártya subbasalis idegrostrétegének és basalis epithelialis sejtrétegének vizsgálata 2-es típusú diabeteses betegeken in vivo konfokális mikroszkópia alkalmazásával. Szemészet, 144(Suppl. (Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Debrecen)): 73-74. Harrison DA, Joos C, Ambrosio Jr R. (2003) Morphology of corneal Basal epithelial cells by in vivo slit-scanning confocal microscopy. Cornea, 22(3): 246-248. Vanathi M, Tandon R, Sharma N, Titiyal JS, Pandey RM, Vajpayee RB. (2003) In-vivo slit scanning confocal microscopy of normal corneas in Indian eyes. Indian J Ophthalmol, 51(3): 225-230. Beuerman RW és Schimmelpfennig B. (1980) Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol, 69(1): 196-201. Garcia-Hirschfeld J, Lopez-Briones LG, Belmonte C. (1994) Neurotrophic influences on corneal epithelial cells. Exp Eye Res, 59(5): 597-605. Reid TW, Murphy CJ, Iwahashi CK, Foster BA, Mannis MJ. (1993) Stimulation of epithelial cell growth by the neuropeptide substance P. J Cell Biochem, 52(4): 476-485. McDermott AM, Xiao TL, Kern TS, Murphy CJ. (2003) Non-enzymatic glycation in corneas from normal and diabetic donors and its effects on epithelial cell attachment in vitro. Optometry, 74(7): 443-452. Kaji Y, Usui T, Oshika T, Matsubara M, Yamashita H, Araie M, Murata T, Ishibashi T, Nagai R, Horiuchi S, Amano S. (2000) Advanced glycation end products in diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41(2): 362-368. Davies PD, Duncan G, Pynsent PB, Arber DL, Lucas VA. (1984) Aqueous humour glucose concentration in cataract patients and its effect on the lens. Exp Eye Res, 39(5): 605-609. Twigg SM, Chen MM, Joly AH, Chakrapani SD, Tsubaki J, Kim HS, Oh Y, Rosenfeld RG. (2001) Advanced glycosylation end products up-regulate connective tissue growth factor (insulin-like growth factor-binding protein-related protein 2) in human fibroblasts: a potential mechanism for expansion of extracellular matrix in diabetes mellitus. Endocrinology, 142(5): 1760-1769. Hara M, Morishige N, Chikama T, Nishida T. (2003) Comparison of confocal biomicroscopy and noncontact specular microscopy for evaluation of the corneal endothelium. Cornea, 22(6): 512-515. Klais CM, Buhren J, Kohnen T. (2003) Comparison of endothelial cell count using confocal and contact specular microscopy. Ophthalmologica, 217(2): 99-103. Modis L, Jr., Langenbucher A, Seitz B. (2002) Corneal endothelial cell density and pachymetry measured by contact and noncontact specular microscopy. J Cataract Refract Surg, 28(10): 1763-1769. Imre L és Nagymihaly A. (2001) Reliability and reproducibility of corneal endothelial image analysis by in vivo confocal microscopy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 239(5): 356-360.
127
PhD értekezés 374. 375. 376. 377. 378. 379. 380. 381. 382. 383. 384. 385. 386. 387. 388. 389. 390. 391. 392. 393.
Dr. Popper Mónika
Carlson KH, Bourne WM, McLaren JW, Brubaker RF. (1988) Variations in human corneal endothelial cell morphology and permeability to fluorescein with age. Exp Eye Res, 47(1): 2741. Bax G, Fagherazzi C, Piarulli F, Nicolucci A, Fedele D. (1996) Reproducibility of Michigan Neuropathy Screening Instrument (MNSI). A comparison with tests using the vibratory and thermal perception thresholds. Diabetes Care, 19(8): 904-905. Lunetta M, Le Moli R, Grasso G, Sangiorgio L. (1998) A simplified diagnostic test for ambulatory screening of peripheral diabetic neuropathy. Diabetes Res Clin Pract, 39(3): 165172. Feldman EL, Stevens MJ, Thomas PK, Brown MB, Canal N, Greene DA. (1994) A practical two-step quantitative clinical and electrophysiological assessment for the diagnosis and staging of diabetic neuropathy. Diabetes Care, 17(11): 1281-1289. Grupcheva CN, Wong T, Riley AF, McGhee CN. (2002) Assessing the sub-basal nerve plexus of the living healthy human cornea by in vivo confocal microscopy. Clin Experiment Ophthalmol, 30(3): 187-190. Visser N, McGhee CN, Patel DV. (2009) Laser-scanning in vivo confocal microscopy reveals two morphologically distinct populations of stromal nerves in normal human corneas. Br J Ophthalmol, 93(4): 506-509. Chang PY, Carrel H, Huang JS, Wang IJ, Hou YC, Chen WL, Wang JY, Hu FR. (2006) Decreased density of corneal basal epithelium and subbasal corneal nerve bundle changes in patients with diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol, 142(3): 488-490. Hossain P, Sachdev A, Malik RA. (2005) Early detection of diabetic peripheral neuropathy with corneal confocal microscopy. Lancet, 366(9494): 1340-1343. Mastropasqua L, Nubile M, Lanzini M, Carpineto P, Ciancaglini M, Pannellini T, Di Nicola M, Dua HS. (2006) Epithelial dendritic cell distribution in normal and inflamed human cornea: in vivo confocal microscopy study. Am J Ophthalmol, 142(5): 736-744. Yamagami S, Yokoo S, Usui T, Yamagami H, Amano S, Ebihara N. (2005) Distinct populations of dendritic cells in the normal human donor corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci, 46(12): 4489-4494. Hamrah P, Liu Y, Zhang Q, Dana MR. (2003) The corneal stroma is endowed with a significant number of resident dendritic cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 44(2): 581-589. McLaren JW, Patel SV, Nau CB, Bourne WM. (2008) Automated assessment of keratocyte density in clinical confocal microscopy of the corneal stroma. J Microsc, 229(Pt 1): 21-31. Navratil M, Mabbott GA, Arriaga EA. (2006) Chemical microscopy applied to biological systems. Anal Chem, 78(12): 4005-4020. Wolffsohn JS és Peterson RC. (2006) Anterior ophthalmic imaging. Clin Exp Optom, 89(4): 205-214. Wolffsohn J. Ophthalmic Imaging. Eye Essentials, (szerk.) Doshi S és Harvey W. Elsevier Health Sciences - Butterworth Heinemann, 2008. Niederer RL, Laser scanning in vivo confocal microscopy of cornea microstucture in inherited and acquired corneal disease (PhD thesis), in Department of Ophthalmology. University of Auckland, Auckland, New Zealand, 2008. Yuasa M, Kobayashi A, Yokogawa H, Sugiyama K. (2008) In vivo laser confocal microscopic analysis of murine cornea and lens microstructures. Ophthalmic Surg Lasers Imaging, 39(5): 391-396. Mendrinos E, Dosso A, Sommerhalder J, Shaarawy T. (2008) Coupling of HRT II and AS-OCT to evaluate corneal endothelial cell loss and in vivo visualization of the Ahmed glaucoma valve implant. Eye. Guthoff RF, Zhivov A, Stachs O. (2009) In vivo confocal microscopy, an inner vision of the cornea - a major review. Clin Experiment Ophthalmol, 37(1): 100-117. Efron N, Al-Dossari M, Pritchard N. (2009) In vivo confocal microscopy of the bulbar conjunctiva. Clin Experiment Ophthalmol, 37(4): 335-344.
128
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
XIV. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Szakmai folyóiratban megjelent közlemények a disszertáció témájában Quadrado MJ, Popper M, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA. Diabetes and Corneal Cell Densities in Humans by In-vivo Confocal Microscopy. Cornea 2006; 25: 761-768 (IF: 1.708) Popper M, Morgado AM, Quadrado MJ, Van Best JA. Corneal Cell Density Measurement in vivo by Scanning Slit Confocal Microscopy: Method and Validation, Ophthalmic Res 2004; 36: 270-276 (DOI:10.1159/000081207) (IF: 1.000) Quadrado MJ, Popper M, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA. Microscopia Confocal in Vivo: Alterações Morfológicas no Queratocone. Exp Ophthalmol 2004; 30: 11-16
Szakmai folyóiratban megjelent, a disszertáció témájától független közlemények Nagy ZZs, Seres A, Popper M, Borbándy Á, Süveges I. A cornealis autofluoreszcencia változása fotorefraktív keratectomiát követően, Szemészet (Ophthalmologia Hungarica) 2004; 141: 309-311 Nagy ZZs, Popper M, Süveges I. A recidiváló szaruhártya-erózió kezelése, Orvosi Hetilap 2004; 145(24): 1283-1285 Popper M, Nagy ZZs. Fototerápiás keratektómia alkalmazása a recidiváló cornea eróziók kezelésében. Szemészet (Ophthalmologia Hungarica) 2003; 140: 233238 Popper M, Resch M, Süveges I. LASIK-módszer és a topográfián alapuló egyéni kezelési terv a perforáló keratoplasztika után fellépő magas dioptriaértékű irreguláris astigmia sebészi kezelésében. Szemészet (Ophthalmologia Hungarica) 2003; 140: 21-25 Resch M, Popper M. A pásztázó és repülő ponttechnikával végzett fotorefraktív keratectomia eredményei hypermetropiában. Orvosi Hetilap 2003; 144(4): 179185 Nagy ZZ, Munkácsy Gy, Popper M. Photorefractive Keratectomy Using the Meditec MEL 70 G-scan Laser for Hyperopia and Hyperopic Astigmatism. J Refract Surg 2002; 18: 542-550 (IF: 2.307) Nagy ZZs, Resch M, Popper M. A fotorefraktív keratectomia szerepe a radiális keratotomia utáni reziduális/regresszív myopia és a lézeres thermokeratoplastica utáni reziduális hypermetropia kezelésében. Szemészet (Ophthalmologia Hungarica) 2002; 139: 243-248
129
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Idézhető absztraktok a disszertáció témájában Popper M, Quadrado MJ, Morgado AM, Murta JN, Müller LJ, Van Best JA: A szaruhártya subbasalis idegrostrétegének és basalis epithelialis sejtrétegének vizsgálata 2-es típusú diabeteses betegeken in vivo konfokális mikroszkópia alkalmazásával, előadás, Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Debrecen Idézhető absztrakt: Szemészet 2007; 144(Suppl.): 73-74. Popper M, Quadrado MJ, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Subbasal nerves and highly reflective cells in corneas of diabetic patients: in vivo evaluation by confocal microscopy, poszter előadás, ARVO meeting, Ft. Lauderdale, FL, USA Idézhető absztrakt: Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: E-Abstract 879. ARVO Foundation / Lapp Travel Grant Award Quadrado MJ, Popper M, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Highly reflective cells in the corneal stroma visualized by in vivo confocal microscopy, poszter előadás, ARVO meeting, Ft. Lauderdale, FL, USA Idézhető absztrakt: Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: E-Abstract 2194. Popper M, Quadrado MJ, Morgado M, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Subbasal nerves and possible dendritic cells in diabetic patients by in vivo scanning-slit confocal microscopy, előadás, XLVII Congresso Português de Oftalmologia, Viseu, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2004; 28(6): 6 Quadrado MJ, Popper M, Morgado M, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: ”Highly reflective cells” (HRC) no estroma de diabéticos visualizadas por microscopia confocal in vivo, előadás, XLVII Congresso Português de Oftalmologia, Viseu, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2004; 28(6): 7 Popper M, Quadrado MJ, Morgado M, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Subbasal nerves and possible dendritic cells in diabetic patients by in vivo scanning-slit confocal microscopy, előadás, EVER meeting, Vilamoura, Portugália Idézhető absztrakt: Ophthalmic Research 2004, Vol. 36, Suppl. 1 Quadrado MJ, Popper M, Morgado M, Van Best JA, Murta JN, Müller LJ: Highly reflective cells in the stroma of diabetic patients visualized by in vivo confocal microscopy, poszter & „rapid fire” előadás, EVER meeting, Vilamoura, Portugália Idézhető absztrakt: Ophthalmic Research 2004, Vol. 36, Suppl. 1 Popper M, Morgado AM Quadrado MJ, Van Best JA: In vivo corneal cell density measurement by scanning-slit confocal microscopy: Method and Validation, poszter előadás, ARVO meeting, Ft. Lauderdale, FL, USA Idézhető absztrakt: Invest Ophthalmol Vis Sci 2004, 45: E-Abstract 150. Quadrado MJ, Morgado AM, Popper M, Van Best JA. Diabetes and Corneal Cell Densities by Confocal Microscopy, poszter előadás, ARVO meeting, Ft. Lauderdale, FL, USA Idézhető absztrakt: Invest Ophthalmol Vis Sci 2004, 45: E-Abstract 3812.
130
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Popper M, Quadrado MJ, Van Best JA, Morgado AM, Murta J: Densidade celular da a córnea através da microscopia confocal: metolodogia e validação, előadás, XLVI Congresso Português de Oftalmologia, Vilamoura, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2003; 27(4): 10 Quadrado MJ, Popper M, Van Best JA, Morgado AM, Cardoso L, Murta J: Microscopia confocal de fluorescência endógena da córnea, előadás, XLVI Congresso Português de Oftalmologia, Vilamoura, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2003; 27(4): 11 Popper M, Quadrado MJ, Morgado M, Murta J, Van Best JA: The use of confocal microscopy for evaluation of cell densities in diabetic patients, előadás, EVER meeting, Alicante, Spanyolország Idézhető absztrakt: Ophthalmic Research 2003; Vol. 35, Suppl. 1 Quadrado MJ, Popper M, Murta JN: Microscopia confocal no queratocone e após introdução de aneis intraestromais, előadás, XLV Congresso Português de Oftalmologia, Funchal, Madeira, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2002; 26(4): 94 Quadrado MJ, Morgado M, Popper M, Murta JN, Van Best JA: Densidade celular nas diferentes camadas corneanas através da microscopia confocal, előadás, XLV Congresso Português de Oftalmologia, Funchal, Madeira, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2002; 26(4): 97 Popper M, Quadrado MJ, Nagy ZZs, Süveges I, Van Best JA: A szaruhártya különböző rétegeiben történő sejtszámolás konfokális mikroszkóppal diabeteses és egészséges szemeken, előadás, Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Miskolc Idézhető absztrakt: Szemészet 2002; 139(Suppl.): 32-33. Quadrado MJ, Van Best JA, Morgado M, Popper M, Murta JN, Cunha-Vaz J: Densidade das celulas da córnea em doentes diabéticos e normais utilizando microscopia confocal in vivo, előadás, XLIV Congresso Português de Oftalmologia, Porto, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2001; 25(4)
A disszertáció témájától független idézhető absztraktok Popper M, Bausz M, Túri É, Sényi K, Knézy K, Süveges I: Congenital aniridia, előadás, EVER meeting, Portoroz, Szlovénia Idézhető absztrakt: Acta Ophthalmologica Scandinavica 2007; Vol. 85, s240, Abstract 3339 Popper M, Bausz M, Túri É, Sényi K, Süveges I: Congenitalis aniridia, előadás, Magyar Műlencse Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság évenkénti kongresszusa (SHIOL), Keszthely Idézhető absztrakt: Szemészet (Suppl.) „Legjobb Fiatal Előadó 1. helyezés” díja
131
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
A disszertáció témájában tartott előadások 2007. Popper M, Quadrado MJ, Morgado AM, Murta JN, Müller LJ, Van Best JA: A szaruhártya subbasalis idegrostrétegének és basalis epithelialis sejtrétegének vizsgálata 2-es típusú diabeteses betegeken in vivo konfokális mikroszkópia alkalmazásával, előadás, Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Debrecen Idézhető absztrakt: Szemészet 2007; 144(Suppl.): 73-74. 2005. Popper M, Quadrado MJ, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Subbasal nerves and highly reflective cells in corneas of diabetic patients: in vivo evaluation by confocal microscopy, előadás, Dia do Centro de Oftalmologia, XV International Meeting of Ophthalmology, Coimbra, Portugália 2005. Quadrado MJ, Popper M, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Highly reflective cells in the corneal stroma visualized by in vivo confocal microscopy, előadás, Dia do Centro de Oftalmologia, XV International Meeting of Ophthalmology, Coimbra, Portugália 2005. Popper M, Quadrado MJ, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Subbasal nerves and highly reflective cells in corneas of diabetic patients: in vivo evaluation by confocal microscopy, poszter előadás, ARVO meeting, Ft. Lauderdale, FL, USA Idézhető absztrakt: Invest Ophthalmol Vis Sci 2005, 46: E-Abstract 879. ARVO Foundation / Lapp Travel Grant Award 2005. Quadrado MJ, Popper M, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Highly reflective cells in the corneal stroma visualized by in vivo confocal microscopy, poszter előadás, ARVO meeting, Ft. Lauderdale, FL, USA Idézhető absztrakt: Invest Ophthalmol Vis Sci 2005, 46: E-Abstract 2194. 2004. Popper M, Quadrado MJ, Morgado M, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Subbasal nerves and possible dendritic cells in diabetic patients by in vivo scanning-slit confocal microscopy, előadás, XLVII Congresso Português de Oftalmologia, Viseu, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2004; 28(6): 6 2004. Quadrado MJ, Popper M, Morgado M, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: ”Highly reflective cells” (HRC) no estroma de diabéticos visualizadas por microscopia confocal in vivo, előadás, XLVII Congresso Português de Oftalmologia, Viseu, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2004; 28(6): 7 2004. Popper M, Quadrado MJ, Morgado M, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: In vivo scanning-slit confocal microscopy in diabetic patients: Subbasal nerve alterations and possible dendritic cells, poszter előadás, IV Congresso de Investigação em Medicina, Coimbra, Portugália 2004. Quadrado MJ, Popper M, Morgado M, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Highly reflective cells in the corneal stroma visualized by in vivo confocal microscopy, poszter előadás, IV Congresso de Investigação em Medicina, Coimbra, Portugália
132
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2004. Van Best JA, Popper M, Morgado AM, Quadrado MJ: A method for confocal microscopy of the cornea, előadás, Oogheelkundige Fysica dag, Amsterdam, Hollandia 2004. Popper M, Quadrado MJ, Morgado M, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Subbasal nerves and possible dendritic cells in diabetic patients by in vivo scanning-slit confocal microscopy, előadás, EVER meeting, Vilamoura, Portugália Idézhető absztrakt: Ophthalmic Research 2004, Vol. 36, Suppl. 1 2004. Quadrado MJ, Popper M, Morgado M, Van Best JA, Murta JN, Müller LJ: Highly reflective cells in the stroma of diabetic patients visualized by in vivo confocal microscopy, poszter & „rapid fire” előadás, EVER meeting, Vilamoura, Portugália Idézhető absztrakt: Ophthalmic Research 2004, Vol. 36, Suppl. 1 2004. Quadrado MJ, Morgado AM, Popper M, Murta JN, Van Best JA: Densidade celular em córneas diabéticas. Estudos „in vivo” através de Microscopia Confocal, előadás, Thea&IBILI Ocular Surface Symposium, Coimbra, Portugália 2004. Popper M, Morgado AM Quadrado MJ, Van Best JA: In vivo corneal cell density measurement by scanning-slit confocal microscopy: Method and Validation, poszter előadás, ARVO meeting, Ft. Lauderdale, FL, USA Idézhető absztrakt: Invest Ophthalmol Vis Sci 2004, 45: E-Abstract 150. 2004. Quadrado MJ, Morgado AM, Popper M, Van Best JA. Diabetes and Corneal Cell Densities by Confocal Microscopy, poszter előadás, ARVO meeting, Ft. Lauderdale, FL, USA Idézhető absztrakt: Invest Ophthalmol Vis Sci 2004, 45: E-Abstract 3812. 2003. Popper M, Quadrado MJ, Van Best JA, Morgado AM, Murta J: Densidade celular da a córnea através da microscopia confocal: metolodogia e validação, előadás, XLVI Congresso Português de Oftalmologia, Vilamoura, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2003; 27(4): 10 2003. Quadrado MJ, Popper M, Van Best JA, Morgado AM, Cardoso L, Murta J: Microscopia confocal de fluorescência endógena da córnea, előadás, XLVI Congresso Português de Oftalmologia, Vilamoura, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2003; 27(4): 11 2003. Popper M, Quadrado MJ, Morgado M, Murta J, Van Best JA: The use of confocal microscopy for evaluation of cell densities in diabetic patients, előadás, EVER meeting, Alicante, Spanyolország Idézhető absztrakt: Ophthalmic Research 2003; Vol. 35, Suppl. 1 2003. Van Best JA, Morgado M, Quadrado MJ, Popper M: Corneal Autofluorescence by Confocal Microscopy, előadás, Symposium of the International Society of Ocular Fluorometry (ISOF), Madrid, Spanyolország
133
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2002. Quadrado MJ, Popper M, Murta JN: Microscopia confocal no queratocone e após introdução de aneis intraestromais, előadás, XLV Congresso Português de Oftalmologia, Funchal, Madeira, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2002; 26(4): 94 2002. Quadrado MJ, Morgado M, Popper M, Murta JN, Van Best JA: Densidade celular nas diferentes camadas corneanas através da microscopia confocal, előadás, XLV Congresso Português de Oftalmologia, Funchal, Madeira, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2002; 26(4): 97 2002. Quadrado MJ, Morgado M, Popper M, Van Best JA.: Cell counting in corneal layers by confocal microscopy, előadás, Symposium of Ophthalmic Physics of the Netherlands Society for Biophysics and Biomedical Technology, Rotterdam, Hollandia 2002. Popper M, Quadrado MJ, Nagy ZZs, Süveges I, Van Best JA: A szaruhártya különböző rétegeiben történő sejtszámolás konfokális mikroszkóppal diabeteses és egészséges szemeken, előadás, Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Miskolc Idézhető absztrakt: Szemészet 2002; 139(Suppl.): 32-33. 2002. Popper M, Quadrado MJ, Nagy ZZs, Süveges I, Van Best JA: A szaruhártya különböző rétegeiben történő sejtszámolás konfokális mikroszkóppal diabeteses és egészséges szemeken, előadás, Semmelweis Egyetem PhD Tudományos Napok Budapest 2001. Quadrado MJ, Van Best JA, Morgado M, Popper M, Murta JN, Cunha-Vaz J: Densidade das celulas da córnea em doentes diabéticos e normais utilizando microscopia confocal in vivo, előadás, XLIV Congresso Português de Oftalmologia, Porto, Portugália Idézhető absztrakt: Oftalmologia 2001; 25(4)
A disszertáció témájától független témákban tartott előadások 2009. Popper M, Bausz M, Sényi K, Túri É, Knézy K, Sényi K, Süveges I: Congenital aniridia, előadás, Európai Szemorvostársaság évenkénti kongresszusa (SOE), Amszterdam, Hollandia (elfogadva) 2009. Popper M, Bausz M, Sényi K, Kerek A, Palotás Cs, Süveges I: Elülső szegment OCT vizsgálatok congenitalis aniridiás betegeknél, előadás, Magyar Műlencse Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság évenkénti kongresszusa (SHIOL), Keszthely 2007. Popper M, Bausz M, Túri É, Sényi K, Knézy K, Süveges I: Congenital aniridia, előadás, EVER meeting, Portoroz, Szlovénia Idézhető absztrakt: Acta Ophthalmologica Scandinavica 2007, Vol. 85, s240, Abstract 3339
134
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
2007. Popper M, Bausz M, Túri É, Sényi K, Süveges I: Congenitalis aniridia, előadás, Magyar Műlencse Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság évenkénti kongresszusa (SHIOL), Keszthely Idézhető absztrakt: Szemészet (Suppl.) „Legjobb Fiatal Előadó 1. helyezés” díja 2001. Popper M, Nagy ZZs, Seres A, Süveges I: Changes in Corneal Autofluorescence Following Photorefractive Keratectomy, előadás, 27th Annual Eastern-Atlantic Student Research Forum, Miami, FL, USA 2001. Nagy ZZs, Popper M, Seres A., Süveges I.: A cornea autofluorescenciájának változása PRK kezeléseket követően, előadás, Magyar Műlencse Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság évenkénti kongresszusa, Keszthely Idézhető absztrakt: Szemészet (Suppl.) 2000. Popper M., Nagy ZZs, Seres A, Süveges I: A szaruhártya autofluorescenciájának változása fotorefraktív keratektómia után, előadás, „Első Szakmai Nyílt Nap Sorozat” keretében az I. sz. Szemészeti Klinika által szervezett „Szemtől szemben a szemészettel” című rendezvényén 2000. Popper M, Nagy ZZs, Seres A, Süveges I: A szaruhártya autofluorescenciájának változása fotorefraktív keratektómia után, előadás, Semmelweis Egyetem 2000. évi Tudományos Diákköri Konferenciája - 1. díj és a Magyar Szemorvostársaság Különdíja 2000. Popper M, Nagy ZZs, Süveges I: Excimer Laser Phototherapeutic Keratectomy For Recurrent Corneal Erosions, előadás, 8th Annual International Ain Shams Medical Students Congress, Kairó, Egyiptom - „First Prize for the Outstanding Research” 1999. Popper M, Nagy ZZs, Süveges I: Excimer Laser Phototherapeutic Keratectomy, előadás és poszter, 10th European Students Conference at the Charité, Berlin, Németország - “Award for The Most Outstanding Ophthalmology Presentation“ 1999.
Popper M, Nagy ZZs, Süveges I: Phototherapiás keratectomiáról, előadás, Semmelweis Egyetem 1999. évi Tudományos Diákköri Konferenciája - 2. díj
135
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
Az értekezés témájában elnyert díjak és ösztöndíjak 2001. Pro Renovanda Cultura Hungariae Alapítvány Diákcsere Mozgalomért Szakalapítvány ösztöndíja (Coimbrai Egyetemen végzett kutatásra, 2001. október) 2002-2003. INFARMED Investigation Scholarship a Coimbrai Egyetem, Portugália, „Center of Ophthalmology, Biomedical Institute for Research on Light and Image (IBILI)” intézetében végzett kutatásra ösztöndíj 2003. Fundação Calouste Gulbenkian utazási ösztöndíja (EVER 2003) 2003-2005. Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Lisszabon, Portugália PhD hallgatói (“Bolsa Doutoramento”) ösztöndíja (SFRH/BD/13710/2003) 2005.
Fundação Calouste Gulbenkian utazási ösztöndíja (ARVO 2005)
2005.
ARVO Foundation / Lapp Travel Grant Award
Az értekezés témájától független témákban elnyert díjak és ösztöndíjak 1997. Az I.sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet évenkénti tanulmányi versenyén 3. helyezés 1998. Rektori Pályázat: 2. díj (Kórélettani Intézet, témavezető: Prof. Dr. Szollár Lajos) 1999. 2. díj a Semmelweis Egyetem 1999. évi Tudományos Diákköri Konferenciáján 1999. Az I. sz. Szemészeti Klinika évenkénti tanulmányi versenyén 3. helyezés 1999. Az Igazságügy Orvostani Intézet évenkénti tanulmányi versenyén 1. helyezés 1999. A Szemészet (előadás és poszter) szekció 1. díja (“Award for The Most Outstanding Ophthalmology Presentation“) a 10th European Students Conference at the Charité–n, Berlin, Németország 2000. A Konferencia 1. díja („First Prize for the Outstanding Research”) az 8th Annual International Ain Shams Medical Students Congress–en, Kairó, Egyiptom 2000. 1. díj és a Magyar Szemorvostársaság Különdíja a Semmelweis Egyetem 2000. évi Tudományos Diákköri Konferenciáján 2000. Rektori Pályázat: 1. díj (I. sz. Szemészeti Klinika, témavezető: Prof. Dr. Süveges Ildikó) 2000. „Teva-Biogal Díj” a Biogal-Teva Pharma Rt. által meghirdetett pályázaton 2001. január-március: Az Amerikai Magyar Orvosszövetség (HMAA) ösztöndíja gyakorlat (Szemészet) céljából az Egyesült Államokban a State University of New York at Buffalo, Department of Ophthalmology-n (2 hónap cornea- és általános-, 1 hónap gyerekszemészet részlegen), Buffalo, NY, USA 2007. Magyar Műlencse Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság (SHIOL) éves kongresszusán „Legjobb Fiatal Előadó 1. helyezés” díja, Keszthely 2007. Magyar Szemorvostársaság Március 15-i pályázatának 1. díja 2009. European Society of Ophthalmology (SOE) 2009 Educational Grant for Ophthalmologists-in-training 2009. European Board of Ophthalmology (EBO) Residency Exchange Grant
136
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
XV. A DISSZERTÁCIÓ TÁRGYÁRA VONATKOZÓ FÜGGETLEN HIVATKOZÁSOK Popper M, Morgado AM, Quadrado MJ, Van Best JA. Corneal Cell Density Measurement in vivo by Scanning Slit Confocal Microscopy: Method and Validation, Ophthalmic Res 2004; 36: 270-276 (IF: 1.000) Hivatkozások: C1. McLaren JW, Nau CB, Kitzmann AS, Bourne WM. Keratocyte Density: Comparison of Two Confocal Microscopes. Eye Contact Lens 2005; 31: 28-33. C2. Patel DV. In vivo confocal microscopy of the cornea in health and disease. PhD thesis, Department of Ophthalmology, University of Auckland, New Zealand, 2005. C3. Zhivov A, Stachs O, Kraak R, Stave J, Guthoff RF. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. Ocul Surf 2006; 4: 81-93 C4. Navratil M, Mabbott GA, Arriaga EA. Chemical microscopy applied to biological systems. Analytical Chemistry 2006; 78: 4005-4019. C5. Wolffsohn JS, Peterson RC. Anterior ophthalmic imaging. Clin Exp Optom 2006; 89: 205-214. C6. Chiou AGY, Kaufman SC, Kaufman HE, Beuerman RW. Clinical corneal confocal microscopy. Surv Ophthalmol 2006; 51: 482-500. C7. Patel DV, McGhee CNJ. Contemporary in vivo confocal microscopy of the living human cornea using white light and laser scanning techniques: a major review. Clin Experiment Ophthalmol 2007; 35: 71-88. C8. Villani E, Galimberti D, Viola F, Mapelli C, Ratiglia R. The cornea in Sjogren's syndrome: An in vivo confocal study. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007; 48: 20172022. C9. Efron N, Morgan PB, Makrynioti D. Chronic morbidity of corneal infiltrative events associated with contact lens wear. Cornea 2007; 26: 793-799. C10. McLaren JW, Patel SV, Nau CB, Bourne WM. Automated assessment of keratocyte density in clinical confocal microscopy of the corneal stroma. J Microsc 2008; 229: 21-31. C11. Niederer RL. Laser scanning in vivo confocal microscopy of cornea microstucture in inherited and acquired corneal disease. PhD thesis, Department of Ophthalmology, University of Auckland, New Zealand, 2008. C12. Yuasa M, Kobayashi A, Yokogawa H, Sugiyama K. In Vivo Laser Confocal Microscopic Analysis of Murine Cornea and Lens Microstructures. Ophthalmic Surg Lasers Imaging 2008;39:391-396. C13. James Wolffsohn. Ophthalmic Imaging. Elsevier Health Sciences, 2008. ISBN 0750688572, 9780750688574 C14. Resch MD, Imre L, Tapasztó B, Németh J. Confocal microscopic evidence of increased Langerhans cell activity after corneal metal foreign body removal. Eur J Ophthalmol 2008; 18: 703-707.
137
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
C15. Mendrinos E, Dosso A, Sommerhalder J, Shaarawy T. Coupling of HRT II and AS-OCT to evaluate corneal endothelial cell loss and in vivo visualization of the Ahmed glaucoma valve implant. Eye, advance online publication 24 October 2008; doi: 10.1038/eye.2008.321 C16. Guthoff RF, Zhivov A, Stachs O. In vivo confocal microscopy, an inner vision of the cornea – a major review. Clin Experiment Ophthalmol 2009; 37: 100-117. C17. Efron N, Al-Dossari M, Pritchard N. In vivo confocal microscopy of the bulbar conjunctiva. Clin Experiment Ophthalmol 2009; 37: 335-344.
Quadrado MJ, Popper M, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA. Diabetes and Corneal Cell Densities in Humans by In-vivo Confocal Microscopy. Cornea 2006; 25: 761-768 (IF: 1.708) Hivatkozások: C1. Dhaliwal JS, Kaufman SC, Chiou AGY. Current applications of clinical confocal microscopy. Curr Opin Ophthalmol 2007; 18: 300-307. C2. Gao Yan, Li Bing, Zhao Ju Wei. In vivo confocal microscopy histological observation and evaluation of sensation in PDR patients’ cornea. Chinese Journal of Practical Ophthalmology 2007; 25: 1190-1193. (kínai nyelven) C3. Javadi MA, Zarei-Ghanavati S. Cataract and Diabetes Mellitus. Bina J Ophthalmol 2007; 13: 89-103. (arab nyelven) C4. Beardsley RM, de Paiva CS, Power DFMS, Pflugfelder SC. Desiccating Stress Decreases Apical Corneal Epithelial Cell Size-Modulation by the Metalloproteinase Inhibitor Doxycycline. Cornea 2008; 27: 935-940. C5. Hu Y, Matsumoto Y, Adan ES. Corneal In Vivo Confocal Scanning Laser Microscopy in Patients with Atopic Keratoconjunctivitis. Ophthalmology 2008; 115: 2004-2012. C6. Wei Ji-Ye, Ornberg RL, Graff G. Use of thy1-fp transgenic mouse for the identification of ophthalmic agents. 2008; Pre-grant patent publication 20080188573 available from the US Patent Office C7. Midena E, Cortese M, Miotto S, Gambato C, Cavarzeran F, Ghirlando A. Confocal microscopy of corneal sub-basal nerve plexus: a quantitative and qualitative analysis in healthy and pathologic eyes. J Refract Surg 2009; 25:S125130. C8. Chen WL, Lin CT, Ko PS, Yeh PT, Kuan YH, Hu FR, Yang CM. In vivo confocal microscopic findings of corneal wound healing after corneal epithelial debridement in diabetic vitrectomy. Ophthalmology 2009; 116: 1038-1047.
Popper M, Quadrado MJ, Morgado AM, Murta JN, Van Best JA, Müller LJ: Subbasal nerves and highly reflective cells in corneas of diabetic patients: in vivo evaluation by confocal microscopy, poszter előadás, ARVO meeting, Ft. Lauderdale, FL, USA. Idézhető absztrakt: Invest Ophthalmol Vis Sci 2005, 46: E-Abstract 879. ARVO Foundation / Lapp Travel Grant Award Hivatkozások:
138
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
C1. Midena E, Brugin E, Ghirlando A, Sommavilla M, Avogaro A. Corneal diabetic neuropathy: a confocal microscopy study. J Refract Surg 2006; 22(9 Suppl): S1047-1052. C2. Dhaliwal JS, Kaufman SC, Chiou AGY. Current applications of clinical confocal microscopy. Curr Opin Ophthalmol 2007; 18: 300-307.
139
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
XVI. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS, ACKNOWLEDGEMENTS Legelőször is köszönöm és ajánlom ezt a munkát Szüleimnek, Édesanyámnak, Dr. Kerek Andreának, aki anyai szeretetén (amiről nem lehet többet szavakban kifejezni) kívül beoltott a szemészet iránti szeretetével, és Édesapámnak, Dr. Popper György matematikus professzornak, akitől a kutatás szeretetét és a tudományos gondolkodást örököltem és tanultam, valamint akik kisgyermek korom óta szeretnek, inspirálnak, bátorítanak és támogatnak minden célom elérésében. Ez a munka nagymértékben az ő sikerük is. Köszönöm Férjemnek, Dr. Kozák Lajos Rudolfnak, akivel orvosi tanulmányaim első napja óta közös úton járunk, akivel külföldi kutatói éveinket is együtt éltük át, és aki szerelmén kívül tudósként is társam. A tudományról való beszélgetéseink nélkül ez a munka sem lenne ugyanaz. Köszönettel tartozom Dr. Süveges Ildikó professzornőnek, hogy program- és témavezetőként tudományos diákkörös korom óta doktoranduszként és rezidensként is folyamatosan támogatott és tanácsaival ellátott. Köszönöm Dr. Németh János professzor úr támogatását, aki klinikaigazgatóként folyamatosan tudományos munkára ösztönzött. Köszönöm Dr. Nagy Zoltán Zsolt professzor úrnak közös munkáinkat, a folyamatos támogatását és barátságát. Köszönöm Dr. Bausz Mária klinikai főorvosnak a Szemklinikán nyújtott folyamatos támogatásáért, kedvességéért és a disszertációm aprólékos javításáért. Köszönöm Dr. Resch Miklós egyetemi tanársegédnek, disszertációm munkahelyi vitájának opponensének a rengeteg kitűnő és baráti tanácsot. Vast majority of this work was done at the Center of Ophthalmology, Institute of Biomedical Research on Light and Image (IBILI) in Coimbra, Portugal. I kindly thank Professor Dr. José G. Cunha-Vaz for providing me the opportunity to work in his institute and supporting my work all the way.
140
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
I am deeply grateful to my supervisor in Coimbra, Professor Dr. Jaap A. Van Best, the great ophthalmic researcher & physicist, for his continuous inspiration, support and advices. I have learned a lot on confocal microscopy and corneal autofluorescence from him. As a visiting professor from Leiden, he was a foreigner in Portugal as well, I must also thank him teaching me so much about living abroad as a researcher. I am also very thankful to Professor Dr. António Miguel Morgado from IBILI’s Department of Instrumentation, „the” engineer and great friend, for working together for long hours on the confocal microscope, teaching me so much and last but not least for the valuable discussions which he was always available for whenever I needed. O Miguel, muito obrigada! I also wish to thank Dr. Maria João Quadrado, ophthalmologist member of our group, for our common works with the confocal microscope and diabetic patients, and for her friendship. I wish to thank the great expert on corneal nerves, Dr. Linda J. Müller from The Netherlands Ophthalmic Research Institute, Amsterdam, The Netherlands for teaching me so much about corneal nerves and dendritic cells, and also for providing me some great images. Many thanks to Dr. Paulo Pereira for sharing with us his expertise in biochemistry and helping us whenever needed; to Professor Dr. Joaquim Neto Murta for his kind support; to Mrs. Alda Gonçalves, the best secretary, for arranging us nearly everything; to Mrs. Cristina Ramos, the great librarian, for checking English syntax and grammar in our papers; to Dr. Júlia Verissimo and Isabel Garrido for helping us with the histological preparations; and to Graciete Abreu for her assistance. Many thanks to my Portuguese friend, Maria Fátima Loureiro da Silva, for our common chats at IBILI. Working at IBILI with the abovementioned colleagues was a marvellous and challenging school and one of the best three years in my life. Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem Doktori Iskolájának a PhD ösztöndíjamért, illetve a Pro Renovanda Cultura Hungariae Alapítvány Diákcsere Mozgalomért Szakalapítvány ösztöndíjáért.
141
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
I must acknowledge those institutions that supported my research and stay in Portugal and supported to present my work at great international meetings: Infarmed, Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT; SFRH/BD/13710/2003) and Fundação Calouste Gulbenkian. I wish to thank Mrs. Joanne G. Angle, executive director of ARVO, and for the ARVO Foundation for providing me the Lapp Travel Grant Award, being the first Hungarian receiving such a support. Köszönöm a Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Titkárságán Marosfalvi Anitának, Márton Emőkének, Pintérné Marádi Annának és Rab Tímeának, hogy végtelen türelemmel voltak mindig segítségemre.
142
PhD értekezés
Dr. Popper Mónika
XVII. AZ ÉRTEKEZÉSHEZ KAPCSOLÓDÓ PUBLIKÁCIÓK KÜLÖNLENYOMATAI
143
