In vivo interferencia: fehérjék, antitestek Toldy Erzsébet Vas Megye és Szombathely MJV Markusovszky Kórháza Központi Laboratórium, PTE ETK DMI Gyakorlati Diagnosztikai Tanszék, Szombathelyi Képzési Központ Endokrin betegségek laboratóriumi diagnosztikája kötelezı, szinten tartó továbbképzés, Rendezı: PTE, OTK, LMI Pécs, 2009. október 5-8. Szervezık: Prof. Dr. Kovács L. G., Prof. Dr. Ludány Andrea
IN VIVO INTERFERENCIÁK DEFINÍCIÓJA Ag + Ag* + Ab
K1
[AgAb] + [AgAb]*
K-1
A biológiai minta olyan rendkívüli adottsága, amely rejtett hibaként jelentkezhet az immun-analitika során
IN VIVO INTERFERENCIÁK OKA • A szokásostól eltérı fehérjefrakció arányok: rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek: - súlyos betegség, - gyógyszerhatás következményeként - terhesség,
• Endogén v. exogén szubsztanciák jelenléte: 1.) rendhagyó proteinek (pl. paraprotein) 2.) a módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 3.) az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte.
• A mérni kívánt hormon rendkívül magas koncentrációja
IN VIVO INTERFERENCIÁK OKA • A szokásostól eltérı fehérjefrakció arányok: rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek: - súlyos betegség, - gyógyszerhatás következményeként - terhesség
• Endogén v. exogén szubsztanciák jelenléte: 1.) rendhagyó proteinek (pl. paraprotein) 2.) a módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 3.) az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte.
• A mérni kívánt hormon rendkívül magas koncentrációja
Transzport protein interakciók: in vivo 1.) Peptideket szállítók: CRH-BP (placenta, 38 KD, CRH-t inaktiválja), IGFBP1-6, Albumin (Calcitonin, PTH, ACTH)
2.) Szteroid hormonokat szállítók: CBG, SHBG, D-vitamin -BG
3.) Pajzsmirigy hormonokat szállítók: TBG, Albumin, Transthyretin (prealbumin)
Analit specifikus interakciók: IGF-1 Korlátok: Specificitás Transzport protein interakciók – biológiailag aktív frakció mérése? Lelet-értelmezés
IGF-1: in vivo interakciók Biokémia: - 70 aminosavból álló egyszálú polipeptid: 7,5 KDa
Homológia: - proinzulin: 50 % - IGF-2 : 70 % - Insulin: 1% - TSH, LH: 0,05-0,24 %
Kötıfehérjék: - 6 izotípus , összes keringı mennyiség >95%-a kötött,
IGF-1 és a kötıfehérjék: BP1-6 BP IGF-1 1-2
+ BP IGF-1 4-6
α-subunit
α-subunit IGF-1
BP3
IGF-1
β-subunit
BP3
IGF-1
+
β-subunit
IGF-1
Az összes keringı IGF-1 mennyiségének: < 5% szabad - a szérum proteolitikus enzim aktivitása változik, - pH viszonyok - farmakonok
A szabad IGF-1 szint 3-5-szörösére változhat !
A totál IGF-1 mérés elıtt a kötıfehérjékbıl az IGF-1-et fel kell szabadítani MÓDSZEREK: 1.) Kromatográfiás módszer: - aranystandard: Sephadex G-75 savas gélfiltráció
2.) Savas-etanolos extrakció: - ha követi a BP-ék precipitációja, akkor jól használható
3.) IGF-1-et felszabadító disszociációs eljárás: egyéb „szétkapcsoló” reagensek gyártó specifikusak. - túlsúlyban IGF-2-t adnak a mintához, aminek következtében az IGF-1 felszabadul a fehérjekötésbıl, mert az IGF-2-nek nagyobb az affinitása.
Telítı (szendvics) IGF-1 módszer: savas Szilárd fázishoz kötött antitest
hidrolízis után totál - , elıkezelés nélkül szabad szintek IGF-1 IGF-1
BP3 IGF-1
BP3
Csekély veszteség
IGF-1 IGF-1
Szenzitívebb módszer, pontosabban mér az alacsony tartományban
Holland tapasztalat: IGF-1 külsı kontroll 40 35 30 25 20 15 10 5 0
Immulite 2000
IGF-1 nmol/l
▲ Advantage LMA ▲ RIA+Eigen RIA Biosource + RIA + Overig ◙ IRMA Overig
Célérték
0
10
20
IRMA DSL
30
40
- Hazánkban egy labor sem használ külsı kontrollt, mert nem elérhetı!
Szteroid transzport-proteinek: tesztoszteron a keringésben Az összes keringı ıTesztoszteron%-ában
110% 100%
Szabad T
90%
2-3%
Biológiailag
80%
Albumin-T
70%
50%
hasznosítható
60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
CBG-T 3,5%
SHBG-T
44%
Koncentráció arányok: albumin vs. SHBG Átlag plazma szintek+SE
Tesztoszteron kötési affinitás csökken 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
Eltérés: 1025-szörös 827 µmol/l
Albumin
33 nmol/l
SHBG
A kötıkapacitások hasonlóak
A biológiailag aktív tesztoszteron frakciók Származtatott Származtatott bioaktív Tesztoszteron (T) szintek bioaktív
Rövidítése Rövidítése
Definíció Definíció (mértékegység) (mértékegység)
Szabad szintek* SzabadT T szintek*
fTc fTc
TT TT - (SHBG_T+Alb_T) - (SHBG_T+Alb_T)
Biológiailag Biológiailag hasznosítható T* hasznosítható T*
BA-T BA-T
fTfT++Alb_T Alb_T
Szabad index Szabad T T index
fTi fTi
[TT(nmol/l)/SHBG(nmol/l)]*100 [TT(nmol/l)/SHBG(nmol/l)]*100
Tesztoszteron (T) szintek
*matematikai formula: www.him-link.com
Receptor a sejtmembránon
Fontos reguláló szerep: Steroid-SHBG interakciók k1
Szteroidot kötı hely
+
k2
SHBG +
k3
Receptor kötı hely
k4
SHBG-receptor komplex +
k5
k6
k7 +
Szteroid-SHBG komplex a keringésben
X
cAMP Szteroid-SHBG-receptor komplex
Pajzsmirigy hormonok transzportja A pm. hormonok >99%-a fehérjéhez
Spencer,AACC, Expert Access, 2009
VÉR
kötve kering
Biológiai hatás
Perifériás szövetek
Eltérı analitikai megközelítések a szabad hormonfrakciók megítélésére
A rutin fT4 módszerek kötıfehérje függık, ezért csak „becsült” értékek
Spencer,AACC, Expert Access, 2009
Klinikai szituációk, amikor változnak a pajzsmirigy kötıfehérjék
Spencer,AACC, Expert Access, 7/8/2009
TBG ⇑
TBG ⇓
Alb. PreAlb⇓ ⇓
Totál T4 és fT4 változások Nonthyroidal illness-ben: Equilibrium Dializis ⇔ Rutin
fT4 szintek között
Az alacsony albuminszintő NTI betegek szérumához albumint adva: Equilibrium Dializis ⇔ Rutin fT4 szintek között
Spencer C. ,AACC, Expert Access, 7/8/2009
A rutin fT4 módszereket úgy fejlesztették ki, hogy legyızzék a gyakoribb fehérjefrakció rendellenességeket, cserében viszont az albuminkötıdésnek és a szenzitivitásnak ártanak.
Élettani állapotok: pszichés vagy fizikális stress ACTH, Cortisol, katecholaminok, TSH, PRL, hGH, AVP, Oxytocin.,
Stress hatás idıtartama, súlyossága Kisebb
Nagyobb
Aldosteron, PRA, ANP ⇑
pl. betegség mőtét
TNF-α α IL-1,6
Csökken: májban : 5’MD aktivitás ⇓, T3 ⇓,
Infekció
Akut fázisreakciók Vermes és mtsai, 2001
A T4, TSH hormonkötı-proteinek
Neuroendokrin válasz súlyos betegségben • Hypophysis -adrenális tengely aktiváció • Hypophysis -genitális és pajzsmirigy tengely inhibició • Eltolja a szokásos referencia tartományokat • További komplikációk: -változás a táplálkozásban -gyógyszerhatások
Gyógyszerhatások In vivo
In vitro
• Béta blokkolók: PRA ↓ • ACE-, AR- blokkolók: PRA↑ • Ca-csatorna blokkolók: ALD↓ PRL ↑ • Spironolacton: ALD ↑ • Antikoncipiensek: BP, PRL↑ • Amiodaron fT4↑ fT3 ↓ • Adrenerg szerek: TSH ↓ • Neuroleptikumok, antidepresszánsok: PRL↑
• Steroid assayk-ben számtalan metabolit és gyógyszer zavarhat • Heparin, phenytoin, carbamazepin, salicylat,-fT4,fT3 ↑ • Biotin • Fluoroforok • Exogén T4 mérése szubsztituált betegekben • Insulinnal, v. GH-val kezelt beteg
NORMÁL TERHESSÉG: változások a referencia tartományban Rendkívüli fiziológiás Az analitikai módszer állapotból adódóan korlátai miatt • Speciális biomolekulák megjelenése: Placentális steroid és protein hormonok szöveti tömeggel jól korreláló fehérjék, pl PAPP-A, Inhibin-A, •Haemodilúció miatt csökken: összes protein, albumin, ferritin, transferin szaturáció, vas, karbamid, kreatinin, Mg, Na, K.
• Növekszik: Akutfázis-proteinek: fibrinogén, We koleszterin, triglicerid, FFA Hormonok (progesteron, ösztradiol, PRL, ACTH, kortizol, aldoszteron, PTH, stb.) Transport proteinek: TBG, CBG, SHBG, DBG, Cöruloplazmin,
A matrix effektus kihat a mért eredményre: Albumin Globulin frakció Ionerısség
IMMUNO-ASSAY
Abszolút totál és szabad hormon hormonszintek meghatározása terhességben? Standard mátrix = gravida szérum mátrix FFA In vitro hormonszintet ionerısség csökkentı tényezık: Albumin ↓ TBG ↑ In vitro hormonszinteket növel Immuno-assay-vel nem megoldott
TBG szint változása az ösztrogén-hatás függvényében (N=240) Koncentráció növekedés: 3-szoros! 700
TBG nmol/l
* *
600 500
* * *
* * *
400 300 200
Alb.:
N
N
Kontroll Antikoncipienst szedı
~30%
16.
32. gestációs hét
Toldy E., Lıcsei Z., Rigó E., Kneffel P, Szabolcs I., Kovács G.L.: Comparative analytical evaluation of thyroid hormone levels in pregnancy and in women taking oral contraceptives: a study from an iodine deficient area. Gynecol. Endocrinol, 2004; 8: 1-8.
fT4 pmol/l
Szabad T4 meghatározás háromféle módszerrel (n=240) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
Kontroll Kontroll Gravida Gravida16. 16.hetes hetes
Anticoncipienst Anticoncipienstszedı szedı Gravida Gravida32. 32.hetes hetes
* *
* * *
*
*
* *
X
Egylépéses tracer analóg
Egylépéses antitest jelölt
Kétlépéses antigén jelölt
Toldy E., Lıcsei Z., Rigó E., Kneffel P, Szabolcs I., Kovács G.L.: Comparative analytical evaluation of thyroid hormone levels in pregnancy and in women taking oral contraceptives: a study from an iodine deficient area. Gynecol. Endocrinol, 2004; 8: 1-8.
Gyakoriság (%)
Referencia tartomány alatti szabad T4 értékek euthyreoid nıkben (n=240) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Anticoncipienst Anticoncipienstszedı szedı Gravid Gravid16. 16.hetes hetes Gravid Gravid32. 32.hetes hetes
X
egylépéses egylépéses Kétlépéses tracer analóg antitestjelölt antigénjelölt
Toldy E., Lıcsei Z., Rigó E., Kneffel P, Szabolcs I., Kovács G.L.: Comparative analytical evaluation of thyroid hormone levels in pregnancy and in women taking oral contraceptives: a study from an iodine deficient area. Gynecol. Endocrinol, 2004; 8: 1-8.
IN VIVO INTERFERENCIÁK OKA • A szokásostól eltérı fehérjefrakció arányok: rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek: - terhesség, - súlyos betegség, - gyógyszerhatás következményeként
• Endogén v. exogén szubsztanciák jelenléte: 1.) rendhagyó proteinek (pl. paraprotein) 2.) a módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 3.) az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte.
• A mérni kívánt hormon rendkívül magas koncentrációja
Immunglobulinok (vagy paraproteinek) okozta keresztreakciók feltételei 1.) Az analitre nézve antigénkötı-molekularésszel rendelkezı – specifikus- antitestek jelenléte a szérumban. 2.) A zavaró specifikus antitest koncentráció viszonya a módszer méréstartományát elérı, vagy azt meghaladó legyen. 3.) Aspecifikus immunglobulinok, illetve paraproteinek kóros mennyiségi arányai.
Interferenciáért felelıs endogén antitestek I. Specifikus antitestek az analit ellen II. Heterophyl antitestek III. Reuma faktor IV. Human anti-animal-antitestek V. Human-antihuman-antitestek (HAHA) ?
I. Specifikus autoantitestek • Izotípusuk: fıként IgG , de leírtak már IgM, IgA-izoformát is
Prolactin :
H2 O
gS S S G I GI I g g g G G G
H2 O
I gS I G g G
H2 O
• Gyakoriságuk- eltérı:
H2 H2 S I SO I S S O S S SS g
H2 O
normál populáció: 2%, hyperprolactinaemia: 21-46%
Tg: DTC-ben 26% T4, T3: normál 0,3-1,8%, betegekben: 5-25% TSH: 0.02%
II. Heterophyl antitestek • prevalencia: 0,5-12% III. Reuma faktor • Elıfordulásuk: a normál populációban (idısebb kor): 5-10%, autoimmun betegekben gyakrabban. • Rheumatoid arthritis kezdeti stádium elsı év: 40-60%, késıbb: 80% • Úgy viselkednek, mint a heterophyl antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötıdnek. IV. Human anti-animal-antitestek (HAMA) • Szérum koncentrációi: µg/L-g/L is lehet, évekig perzisztálhatnak a keringésben • Elıfordulásuk: 1-80% is lehet.
A human anti-animal antitestek ellen keletkezı további antitestek
Állati antitest
Human antiidiotípiás antitest Human anti-anti idiotípiás antitest
Human anti-izotípiás antibody Kricka: Clin. Chem. 1999.
Az állati antitestek ellen keletkezı IgG interakciók
)
Y
Y Y Y
Tévesen magas
*
Tévesen alacsony
)
YY Y
*
Szilárd fázishoz kötött specifikus Ab
Anti idiotípiás Ab *Jelet adó Ab
Anti-anti idiotípiás Ab vagy
Anti izotípiás Ab
IN VIVO INTERFERENCIÁK OKA • A szokásostól eltérı fehérjefrakció arányok: rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek: - terhesség, - súlyos betegség, - gyógyszerhatás következményeként
• Endogén v. exogén szubsztanciák jelenléte: 1.) rendhagyó proteinek (pl. paraprotein) 2.) a módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 3.) az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte.
• A mérni kívánt hormon rendkívül magas koncentrációja
Rendkívül magas hormonszint: "High Dose Hook" jelenség
Captures antitest
Jelölt antitest
2.
1.
3.
Jel nagysága
Antigén
Szilárd fázis
Tévesen leolvasott alacsony koncentráció
Valós magas koncentráció
Analitikai gondok: a biológiai minta Hook effektusok Low dose
High dose
MIT TEHET A LABORATÓRIUM? • Plauzibilítási kontroll • Visszatekintı biokémiai kontroll (delta check) • Blokkoló beszerzése
ágenseket
használó
• Analitikai megközelítések
assay-k
Módszerek az interakciót okozó antitestek kiszőrésére 1.) Gyárilag az assay pufferhez blokkoló ágenst - borjú v. murin immunglobulin, - nem specifikus egér antitest (MAK33) - Biotinizált egyszárú antitest használata Warren D.J. et al. CEA Clin.Chem. 2005.
2.) A minta elıkezelése az immuno-assay elıtt: -
kezelés PEG, alkohol, ammónium szulfát oldattal Protein A kromatográfia, ultrafiltráció, Gél diffúziós kromatográfia Detergens szulfhydril ágens Minták hıkezelése Minták hígítása szériában (non linear response) Alternatív módszer, Visszanyerés–teszt, vagy az antitestet közvetlenül mérı módszer. pl. TgAb
Kell-e szőrni RF interferenciákra a laboratóriumnak ? Marks V. et al. Clin. Chem. 2002.
• 10 Rf-pozitív donor mintáját 74 analitre 66 laborban vizsgáltak • 3445 eredménybıl 8,7 %-a volt tévesen pozitív. • 21 % -a közülük durván félrevezetı tévesen pozitív lelet volt. • A blokkoló reagenssel történı kezelés után 4,2%-ra csökkentek a téves leletek.
Random hibával számolni kell és a klinikusokkal tudatni kell az interferenciák jelentıségét.
Kell-e szőrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban? (Ismail A. A, et al. Clin. Chem. 2002.) Vizsgált szérum: 5310 28 esetben félrevezetı FSH, LH, TSH vizsgálati eredmény született antitest interferencia miatt.
0,53 % • Mivel ezek a vizsgálatok milliókra rúgnak a UK ban, így a kellemetlen következmények ezreket érintenek. Ezért a korai kiszőrésük lenne indokolt.
Kell-e szőrni antitest interferenciákra a laboratóriumban? IGEN, ha .
• a populáció jelentıs %-át érinti és az eredmény a döntéshozatalban meghatározó. pl. bbPRL, Tg • Az anamnesis megköveteli
Laboratóriumé a felelısség!
Az in vivo fehérje-interferenciák kiküszöbölése: LEHETETLEN, DE…. …..együtt kell élni vele a következıképpen: • Több módszert kell elérhetıvé tenni • Team munkában: - tudatosítani kell a klinikusokban az immunanalitikai módszerek korlátait, - klinikai összefüggéseket ismertté kell tenni a labor felé.
Az interakciók mértéke módszerfüggı • Jelölési technika: alternatív v. izotóp? -fluoreszcens, kemilumineszcens módszerek jobban ki vannak téve a matrix effektusból adódó interakcióknak
• Kivitelezés: automata, vagy manuális? - az extrakciós módszerek nem kompatibilisek az automatizációval - kinetikus jel-detektálás
Hamis eredmény
Köszönet a megtisztelı figyelemért!
