HŐSOKKFEHÉRJÉK ELLENI ANTITESTEK SZEREPE KÜLÖNBÖZŐ AUTOIMMUN BETEGSÉGEKBEN
Doktori értekezés tézisei Dr. Horváth Laura Elméleti és Klinikai Immunológia Program Doktori Iskola Semmelweis Egyetem, Budapest 2002
1
BEVEZETÉS Az autoimmun betegségek etiológiája, pontos pathogenezise ma sem tisztázott egyértelműen, és az oki kezelés hiányában igen korlátozottak a terápiás lehetőségek is. Számos kórképben ismertek olyan autoantigének, amelyek ellen a szervezet ismeretlen okból autoantitesteket és autoreaktív T sejteket termel, ugyanakkor általában egy-egy betegségben több feltételezett target antigén is szóba kerül. Nem ismert, hogy ezek közül melyik az az antigén, amelyik felelős a destruktív immunfolyamat elindításáért, melyek azok, amelyek a folyamat fenntartásában vesznek részt, és melyek azok, amelyek esetleg csak szekunder módon, mintegy mellékleletként detektálhatóak, funkciójuk nem jelentős, és csak a célszerv pusztulásának fokát jelzik. Nem ismert az sem, hogy mennyiben vesz részt az immunrendszer celluláris illetve humorális ága a sejtek illetve szövetek károsításában. Az utóbbi években kerültek a figyelem középpontjába a hősokkfehérjék, mint széles körben elterjedt, immundomináns, konzervatív sejtalkotórészek. Az úgynevezett természetes autoimmunitás részjelenségeként mind humoralis, mind celluláris immunreakció kimutatható a hősokkfehérjék ellen egészséges egyénekben is, és úgy tűnik, hogy a hsp elleni antitestek és autoreaktív T sejtek egy bizonyos alacsony reaktivitású szintje szükséges lenne az immunhomeosztázis fenntartásához. A hősokkfehérjék elleni immunválasz tehát fiziológiás a normál immunhomeosztázisban, mindemellett számos kórképben (autoimmun betegségek, atherosclerosis)
feltételezhető
a
normálisnál
fokozottabb,
vagy
éppen
gyengébb
hősokkfehérjék elleni immunreakció pathogenetikai szerepe, melynek oka a szabályozási mechanizmusok zavarában kereshető. Doktori munkám során a hősokkfehérjék elleni humorális immunválaszt vizsgáltam különböző autoimmun betegségekben, remélve, hogy ezáltal közelebb kerülhetünk az immunmediált kórképek természetének megismeréséhez, a természetes autoimmunitás pontosabb megértéséhez, esetleg új, az eddiginél hatékonyabb terápiás lehetőségek felfedezéséhez. CÉLKITŰZÉSEK 1. Hősokkfehérjék (humán hsp60, Mycobacterium bovis hsp65) elleni antitestek meghatározása különböző autoimmun kórképekben (szisztémás lupus erythematosus, SLE; polymyositis/ dermatoymositis, PM/DM; rheumatoid arthritis, RA; Raynaud szindróma, RS; nem differenciált kollagén betegség, NDC; szisztémás sclerosis, SSC; diabetes mellitus, DM)
2
2. C1q elleni antitestek meghatározása szisztémás autoimmun betegcsoportokban és ezen antitestek kapcsolatának vizsgálata különböző klinikai és laboratóriumi paraméterekkel SLEben 3. A C1q és hsp elleni antitestek korrelációjának, keresztreakciójának vizsgálata 4. A hsp elleni antitestek epitópspecificitásának vizsgálata és a p277 nevű hsp60 peptid elleni antitestek szintjének mérése 1-es típusú diabetes mellitusban. A hsp és p277 elleni antitestek kapcsolatának vizsgálata egyéb diabetesre jellemző autoantitestekkel (szigetsejt elleni antitest, glutaminsav dekarboxiláz elleni antitest, IA-2- vagy tirozin foszfatáz elleni antitest). MÓDSZEREK Betegek és kontrollok 122
szisztémás
lupus
erythematosusban,
14
gyulladásos
myopathiában
(polymyositis/dermatomyositis), 21 rheumatoid arthritisben, 27 Raynaud szindrómában, 33 nem differenciált kötőszöveti betegségben, 55 szisztémás sclerosisban és 83 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő beteget vizsgáltunk. Kontrollként 192 felnőtt egészséges véradó és 81 egészséges, diabetes szempontjából negatív családi anamnézisű gyermek szerepelt. Vizsgálati módszerek A hősokkfehérjék, C1q és p277 elleni antitestek szintjének mérése szilárd fázisú ELISA módszerrel történt. A C1q és hősokkfehérjék elleni antitestek keresztreakciójának vizsgálatára kompetitív ELISA módszert dolgoztunk ki. Az epitóp analízis első lépéseként Chou-Fasman analízis segítségével megbecsültük a hsp60 és hsp65 molekulákon valószínűleg antigénként szereplő béta-kanyarulatokat. Ezután 92 dekamer, 5 aminosavval átfedő peptidszakaszt szintetizáltunk polietilén tűk hegyén, a várható epitóp régióknak megfelelően. Módosított ELISA módszerrel mértük meg a tűk hegyéhez kötött peptidekhez kötődő antitestek szintjét. A szigetsejt elleni antitestek (ICA) mérése indirekt immunfluorescenciás módszerrel történt. A glutaminsav dekarboxiláz és az IA-2 elleni antitestek méréséhez kereskedelmi radioimmuno assay kitet használtunk. A C3 koncentráció mérése radio-immundiffúziós, az antiDNA antitestek meghatározása indirekt immunfluorescenciás módszerrel történt. A szérum alfa-2-HS glikoprotein szintet rakéta-immunelektroforézissel határoztuk meg.
3
EREDMÉNYEK Hsp60, hsp65- illetve C1q elleni antitestek előfordulása autoimmun kórképekben, korreláció a vizsgált antitestek szintje között C1q és human hsp60- illetve M. bovis hsp65 elleni antitestek szintjét mértük meg különböző autoimmun betegcsoportokban illetve kontrollként egészséges felnőtt véradókban. Szignifikánsan (p<0.0001) magasabb anti-C1q titert találtunk az SLE-s betegekben (133.3±25.57 AU/ml, átlag±SEM) a kontroll csoporthoz viszonyítva (7.52±2.14 AU/ml). Nem volt szignifikáns különbség a többi autoimmun betegcsoport és a kontroll csoport között. A C1q antitestekkel ellentétben sem az anti-hsp60, sem az anti-hsp65 antitestek szintje nem tért el a kontrollokétól SLE-s betegekben. Az NDC csoportban szignifikánsan magasabb antihsp60 (217±34 AU/ml vs. 139.6±10 AU/ml, p=0.0061) és anti-hsp65 (31±6.3 AU/ml vs. 18.9±2.1 AU/ml, p=0.036) szinteket észleltünk a kontrollokhoz képest. A többi csoportban nem volt különbség a hősokkfehérjék elleni antitestek szintjében. Megnéztük a korrelációt a vizsgált antitestek szintje között. Szignifikáns pozitív korreláció volt az anti-hsp60 és antihsp65 antitestek titere között minden vizsgált csoportban. A C1q antitest és az anti-hsp60At szintek között nem észleltünk korrelációt egyetlen csoportban sem, míg a C1q antitestek titere az anti-hsp65At szinttel gyenge, de szignifikáns pozitív korrelációt mutatott az NDC csoportban. Anti-C1q és anti-hsp65 antitestek közötti keresztreakció Annak eldöntésére, hogy a C1q illetve hsp65 elleni antitestek között az NDC csoportban észlelt korreláció a megfelelő B sejt klónok szimultán aktivációja-e, vagy pedig az antitestek keresztreakciójának köszönhető, kompetitív ELISA rendszert állítottunk be. Magas anti-C1q, anti-hsp60 és anti-hsp65 antitestekkel rendelkező nem differenciált kötőszöveti betegségben szenvedő beteg szérumából tisztított IgG higítási sorozatát kevertük össze humán rekombináns hsp60-nal, M. bovis hsp65-tel, negatív kontrollként egy másik rekombináns, irreleváns fehérjével (CD4), tisztított C1q-val, illetve „üres” PBS oldattal, és adtuk hozzá C1q-val fedett lemezhez. A hsp60 erősen, a hsp65 gyengébben (az irreleváns peptidhez hasonló mértékben) gyengítette az NDC-IgG kötődését a C1q-val fedett lemezhez. A C1q jelenléte nem befolyásolta a kötődést. A humán hsp60 által okozott gátlás dózisfüggő volt, míg a hsp65 és CD4 hatása nem változott a fehérjék dózisának változtatásával.
4
C1q ellenes antitestek kapcsolata egyéb vizsgált paraméterekkel szisztémás lupus erythematosusban Mivel SLE-s betegekben észleltünk a kontrollokénál szignifikánsan magasabb C1q antitest szintet, ebben a kórképben vizsgáltuk tovább a C1q antitestek tulajdonságait, életkorral és néhány SLE-re jellemző klinikai adattal való összefüggését. C1q-antitestek változása az életkor függvényében Szoros negatív korrelációt észleltünk az SLE-s betegek életkora és a C1q antitestek titere között (Spearman korrelációs koefficiens –0.4, p<0.0001). A C1q antitestek tehát gyakrabban voltak jelen a fiatalabb betegekben. Korreláció a C1qAt-ek és különböző laboratóriumi paraméterek, valamint az SLE aktivitása között Összehasonlítottuk a C1q antitestek szintjét néhány SLE-re jellemző laboratóriumi paraméterrel. Összehasonlítva magas (>66 AU/ml) és alacsony (<66 AU/ml) C1q antitest titerű betegeket, magas antitest szint esetén szignifikánsan alacsonyabb C3 szintet (p<0.0001), magasabb anti-dsDNA szintet (p<0.0001) és alacsonyabb alfa-2-HSgp szintet észleltünk (p=0.018). Korrelációkat vizsgálva: Pozitív korrelációt találtunk a teljes szérum IgG koncentrációval (r=0.33, p=0.0085), az antinukleáris faktor (ANF) pozitivitással (r=0.54, p<0.0001) és a dupla szálú DNS (dsDNA) elleni antitest szinttel (r=0.45, p<0.0001). Negatív volt a korreláció a C3 komplement komponens szintjével (r=-0.4, p<0.0001) és az alfa-2HSgp negatív akut fázis fehérje szérumszintjével (r=-0.29, p=0.06). Nem találtunk korrelációt a szérum IgA-, IgM-, alfa-2 makroglobulin-, transzferrin-, alfa-2 haptoglobin-, orozomukoid és immunkomplex szintjével, sem a rheuma faktor pozitivitással. A klinikai aktivitás és a C1q antitestek kapcsolatát vizsgálva azt találtuk, hogy míg a remisszióban lévő betegeknek csak 15%-ában, az aktív stádiumban lévőknek viszont 41%ában volt magas C1q antitest titere. A különbség erősen szignifikáns (p<0.0011, Fisher’s exact teszt, odds ratio: 3.96 (95% CI: 1.73-9.03). A C1qAt szintek medián (interquartilis) értéke 0 (0-35.0), illetve 36.0 (0-262.5) U/ml a remisszióban illetve az aktív stádiumban lévő betegekben (p<0.0001). Figyelembe véve a C1q antitestek előfordulásának változását az életkorral, többszörös logisztikus regressziós analízis segítségével kiszámoltuk az aktivitás és a C1qAt szint korra igazított kapcsolatát is, a különbség így is szignifikáns maradt (p=0.002). Meghatároztuk a betegek SLEDAI indexét is, az aktivitás illetve súlyosság ezen jelzője is szignifikánsan korrelált a C1q antitestek szintjével (r=0.24, p=0.006). 21 SLE-s betegtől relapszusban és remisszióban vett szérumminta is rendelkezésünkre állt, így lehetőségünk volt a C1q antitesteknek a klinikai aktivitással való változását nyomon 5
követni. Aktív stádiumban jelentősen (p=0.0017, Wilcoxon teszt) magasabb C1q antitest titert (219.2±87.5 AU/ml) mértünk, mint remissziós fázisban (24.56±12.14 AU/ml). Ezzel ellentétben sem a hsp60-, sem a hsp65 antitestek szintje nem mutatott összefüggést a klinikai aktivitással. Korreláció a C1qAt-ek és különböző szervi manifesztációk között Megvizsgáltuk az összefüggést a C1q antitestek titere és a vérvétel időpontjában fennálló különböző SLE-re jellemző szervi manifesztációk között. Vese érintettség (nephritis) volt jelen 3/66 (4.5%) inaktív és 19/70 (27%) aktív betegben (p=0.0003, Fischer’s exact teszt), és 11/93 (12%) C1qAt – illetve 11/36 (31%) C1qAt + betegben (p=0.017, Fischer’s exact teszt). Egyetlen kivételtől eltekintve minden C1q pozitív és veseérintettséggel rendelkező beteg klinikailag aktív stádiumban volt. Vese biopszia történt 23 betegben. A C1q antitest titere és a hisztológia (diffúz-proliferatív-, membranosus-, fokális-szegmentális glomerulonephritis) között nem volt összefüggés. Lymphadenopathia és pleuritis/pericarditis is gyakrabban volt jelen C1q antitest pozitivitás esetén, de a különbségek nem érték el a szignifikancia szintjét. A C1qAt-ek titere nem mutatott összefüggést más szervek érintettségével. A hősokkfehérje elleni antitestek és a különböző szervi manifesztációk között egyáltalán nem találtunk összefüggést. Hősokkfehérjék elleni antitestek 1-es típusú diabetes mellitusban A humán hsp60- és Mycobacterium bovis hsp65 elleni antitestek szintjét frissen diagnosztizált diabeteses gyermekekben és negatív családi anamnézisű egészséges gyermekekben hasonlítottuk össze. Nem találtunk különbséget a két csoport között egyik antitest szintjében sem. A hsp60 és 65 elleni antitestek szintje egymással szoros korrelációt mutatott mindkét csoportban (diabeteses csoport: Spearman r=0.27, p=0.01; kontroll csoport r=0.4, p=(0.0002). P277 elleni antitestek 1-es típusú diabetes mellitusban Mind az anti-humán, mind az anti-M. bovis p277 antitestek szintje (medián, 25-75 percentilis) szignifikánsan (humán: p=0.0002, M. bovis: p=0.0044) magasabb volt diabeteses gyermekekben (humán: 20.75 (13.07-27.27) AU/ml; M. bovis: 16.71 (13.02-22.68) AU/ml) mint egészséges kontrollokban (humán: 12.48 (9-20.39) AU/ml, M. bovis: 12.88 (9.31-20.37) AU/ml). Többszörös logisztikus regressziós analízissel számolva a magas anti-p277 ellenes (akár humán akár M.bovis) antitest szintű gyermekek 2-3-szor nagyobb eséllyel lesznek diabetesesek mint az alacsony antitest titerű gyermekek.
6
Erős pozitív korrelációt észleltünk a humán és M. bovis p277 elleni antitestek szintje között mindkét csoportban (diabeteses gyermekek: r=0.6563, p<0.0001, egészséges gyermekek: r=0.7981, p<0.0001, Spearman teszt). A p277 elleni antitestek specificitásának bizonyítására egy magas p277At szintű gyermek savójából IgG-t tisztítottunk. Az így tisztított IgG-nek p277-hez való kötődését sikerült specifikusan gátolnunk a teljes hsp60 molekulával, míg a kontrollként használt BSA nem gátolta az IgG/p277 kötődést. A hsp60 elleni antitestek epitópspecificitásának vizsgálata 1-es típusú diabetes mellitusban Megvizsgáltuk, hogy melyek lehetnek azok a specifikus lineáris epitópok, amelyek ellen az anti-hsp60 antitestek irányulnak. Átfedő peptidsorozatot szintetizáltunk polietilén tűk hegyén a feltételezett hsp60 és hsp65 epitóp régióknak megfelelően. 8 diabetes mellitusos és 11 egészséges gyermek szérumának reaktivitását vizsgáltuk a peptidek ellen. Olyan szérumokat válogattunk mindkét csoportból, amelyekben magas anti-hsp60At szintet mértünk. Szignifikáns különbséget (p<0.0001) a diabeteses és az egészséges csoport között a vizsgált epitóp régiók közül kettőben találtunk. Ezek a hsp60 AA394-413 és AA435-454 illetve hsp65 AA366-385 és AA408-427 régióknak felelnek meg, a diabeteses gyermekek jelentősen magasabb reaktivitást mutattak ezen két peptid ellen mint az egészségesek. Az említett hsp60 és hsp65 peptidek homológok, aminosav szekvenciájuk nagyon hasonló. Egyéb diabetesre jellemző antitestek (ICA, GADA, IA-2At) vizsgálata Néhány egyéb, autoimmun diabetesre jellemző antitestet (ICA, GADA, IA-2At) is meghatároztunk a diabeteses gyermekekben, illetve részben az egészségesekben (ICA) is. A diabeteses csoportban a gyermekek 48%-a (40/83) volt ICA pozitív, 56%-a (47/83) GADA pozitív és 55%-a (46/83) IA-2At pozitív. A kontroll csoportban nem észleltünk ICA pozitivitást. Vizsgáltuk az összefüggést a különböző antitestek előfordulása illetve szintje között. Nem volt korreláció az ICA és az anti-hsp- vagy anti-p277At szintek között. Nem korrelált sem a GADA, sem az IA-2At szint a hősokkfehérje és a peptid elleni antitest titerrel.
7
MEGBESZÉLÉS A vizsgált szisztémás autoimmun kórképek közül egyedül nem differenciált kollagén betegségben találtunk magasabb hősokkfehérje ellenes antitest titert. A kontroll csoporthoz viszonyítva mind a hsp60, mind a hsp65 elleni antitestek titere magasabb volt. A C1q és hsp ellenes antitestek közötti korrelációt, melyet korábban HIV fertőzöttekben kimutattak, szintén csak ebben a betegcsoportban tudtuk kimutatni. Ebből arra következtethetünk, hogy a C1q ellenes antitestek epitópspecificitása különböző kórképekben (illetve egészségesekben) különbözhet, és az antitestek a C1q molekula más-más részei ellen irányulhatnak. Más lehet ezen antitestek pathogenetikai szerepe, komplement aktiváló képessége, klinikai jelentősége. Mindezen adatok szintén megerősítik a nem differenciált kollagén betegségnek, mint különálló klinikai entitásnak a létjogosultságát. Az irodalmi adatokkal megegyezően SLE-s betegekben jelentősen gyakoribb volt a C1qAt pozitív betegek előfordulása, mint az egészségesekben. Nem volt gyakoribb a C1qAt előfordulása a többi autoimmun betegcsoportban. Nem differenciált kollagén betegségben 9.1%-os (3/33) volt a C1qAt pozitívak aránya, elképzelhető, hogy ezek a betegek fognak később SLE felé differenciálódni. Eredményeink az irodalmi adatokkal egyezően szoros pozitív korrelációt mutattak az SLE klinikai aktivitása és a C1qAt-ek titere között. Szintén ki tudtuk mutatni az antitest titernek korral változó szintjét a mi beteganyagunkban is. A szervi érintettség tekintetében egyedül a lupus nephritissel találtunk korrelációt, ez is megfelel az irodalomban megjelent közléseknek. Laboratóriumi aktivitási értékekkel is összefüggött a C1q antitestek szintje: alacsony C3 és magas anti-dsDNA szintet találtunk a C1q pozitív betegekben. Elsőként vizsgáltuk viszont a C1q antitestek kapcsolatát egy negatív akut fázis fehérjével, az alfa-2-HSgp-vel. Negatív korrelációt találtunk közöttük. A hősokkfehérje ellenes antitestek, melyeknek szintjét nem találtuk magasabbnak SLE-ben, nem voltak kapcsolatban az SLE-re jellemző laboratóriumi és klinikai paraméterekkel sem. A mi adataink tehát nem valószínűsítenek szerepet ezen antitesteknek a szisztémás lupus erythematosus pathogenezisében. Az, hogy SLE-ben nem észleltünk emelkedett hsp60 ellenes antitest szintet, alátámasztja munkacsoportunk azon elméletét, hogy a magas anti-hsp60At szint (melyet bizonyos autoimmun betegségekben illetve súlyos coronariasclerosisban írtak le) nem szekunder jelenség, nem magyarázható egyszerűen poliklonális B sejt aktivációval, hanem primer, genetikai okokra vezethető vissza. A hsp60 molekulának egy erősen immunogén peptidje, a p277 állatkísérleti modellekben protektívnek és terápiás hatásúnak bizonyult. A peptid NOD egerekben szubkután adagolva 8
megállította az autoimmun diabetogén folyamatot, még előrehaladott stádiumban is. A peptid kedvező hatásával párhuzamosan p277 elleni antitestek -, és a káros Th1 helyett kedvező Th2 típusú p277 elleni T sejtek megjelenését észlelték. Nincs azonban irodalmi adat a p277 elleni antitestek humán vonatkozásáról. Elsőként vizsgáltuk ezen antitestek szintjét nagy számú betegen 1-es típusú diabetes mellitusban. A humán és M. bovis p277 elleni antitestek szintjét szignifikánsan magasabbnak találtuk a diabeteses gyermekekben az egészségesekhez képest. A hsp60 molekulának két olyan lineáris epitópját sikerült azonosítani, amelyek ellen magasabb titerben tartalmaztak antitesteket a diabeteses gyermekek savói, mint az egészségesek. Az egyik epitóp (AA435-454 a hsp60-ban és AA408-427 a hsp65-ben) szinte teljesen megfelel a p277 peptidszakasznak (AA437-460 a hsp60 molekulában, AA409-432 a hsp65 molekulában). A másik epitóp régió, amely ellen a diabetesesekből származó savók magasabb reaktivitás mutattak az AA394-413 (hsp60) illetve AA366-385 (hsp65). Ez az aminosav szakasz teljesen homológ a GAD molekula AA520-534 szakaszának megfelelő doménjével. Mindemellett nem találtunk azonban különbséget a teljes hsp molekulák elleni antitestek szintjében a diabeteses és az egészséges gyermekek között. Az epitópspecificitás vizsgálata megmagyarázza ezt az eredményt, hiszen a vizsgált epitóp régiók többségének esetében nem volt különbség az ellenük irányuló antitestek titerében a két csoport között. A diabetes mellitusos gyermekek savójában talált epitópspecifikus hsp60 antitestek jelentősége nem teljesen egyértelmű. Elképzelhető, hogy szerepük van a béta sejtek ellen irányuló immunfolyamatokban, ugyanakkor az is lehetséges, hogy jelenlétük csak a béta sejtek destrukciójának, pusztulásának következménye illetve tükrözője. A rendelkezésre álló adatok alapján biztos következtetéseket nem vonhatunk le a hsp60 elleni immunreakció diabetesben betöltött szerepével kapcsolatban. Elképzelhető, hogy a NOD egér modellben észlelthez hasonlóan magas a hsp65 elleni antitestek titere a prediabeteses időszakban majd az össz-hspantitest titer lecsökken a betegség klinikai manifesztációjának idejére, és ezután már csak a potenciálisan pathogén, csak bizonyos epitópok ellen irányuló antitestek detektálhatóak magasabb titerben. Következtethetünk tehát arra, hogy a hősokkfehérjék elleni antitesteknek szerepe lehet bizonyos autoimmun illetve egyéb immun-mechanizmusú betegségek pathogenezisében (NDC, 1-es típusú diabetes mellitus, atherosclerosis). Az antitesteknek feltétlenül érdemes megvizsgálni az epitópspecificitását is, mivel olyan esetekben is, ahol a teljes hősokkfehérje elleni antitest szintek nem különböznek, jelentős különbségek derülhetnek ki az antitestek epitópspecificitását illetően (diabetes – p277, GAD-szerű epitóp), és ennek fontos klinikai relevanciája lehet. Igen bíztatóak a p277 peptiddel állatkísérletekben kapott eredmények. Ha 9
mindez igazolódik humán vonatkozásban is, új távlatok nyílhatnak meg az 1-es típusú diabetes megelőzésében és kezelésében. A p277 peptid szubkután adagolásával az immunrendszer kedvező irányú modulálása lenne a cél, azáltal, hogy a peptid a káros Th1 típusú immunreakciót a kedvező Th2 irányba tereli el. A mi eredményeink (friss diabeteses gyermekekben talált magasabb p277 elleni antitest szint, illetve fokozott reaktivitás a hsp60 molekula p277 epitópja ellen) beleilleszthetőek ebbe a hipotézisbe, ha feltételezzük, hogy a magasabb p277 elleni antitest szint a szervezet részéről egy protektív, de nem elég erős próbálkozás arra, hogy a diabetes kialakulását megelőzze. A peptid adagolásával ez a vonal talán felerősíthető, gyengítve ezzel párhuzamosan a káros Th1 irányú vonalat. Persze mindez csak abban az esetben igaz, ha bebizonyosodik, hogy az állatkísérleti modellben leírt immunológiai folyamatok hasonlóan alakulnak emberben is, éppen ezért szükséges minél több humán vizsgálat. A fázis II. stádiumban lévő klinikai vizsgálatok eddigi eredményei mindenesetre kedvezőek, bár még korai lenne végső következtetéseket levonni. További terveink között szerepel olyan longitudinális vizsgálat kivitelezése, amelyben a leendő diabeteses betegeket már a prediabeteses fázisban kiszűrve elkezdjük vizsgálni a hsp és p277 elleni autoantitesteket, követjük az antitest szintben bekövetkezett változásokat a diabetes kialakulásával és a betegség előrehaladásával párhuzamosan, így talán teljesebb képet kaphatunk majd az antitestek viselkedéséről és komolyabb következtetéseket vonhatunk le a pathogenetikai szerepet illetően is. Mindezek segítségével talán közelebb kerülhetünk olyan új terápiás eljárások kidolgozásához, amelyek egészen új utat jelentenek a diabetes kezelésében, és talán elérhető közelségbe kerül a megelőzés is. Az értekezésben leírt legfontosabb új eredmények összefoglalása, következtetések Összefoglalva tehát, az értekezésben ismertetett kísérletek eredményeiből az alábbi fontosabb következtetéseket vonhatjuk le: 1. A nem differenciált kötőszöveti betegség, mint önálló klinikai entitás létezését a mi eredményeink is megerősítik, mivel egyedül ebben a betegcsoportban találtunk az egészségesekétől eltérő, magasabb anti-hsp60 és anti-hsp65 antitestszinteket, és szintén egyedül ebben a betegcsoportban észleltünk korrelációt a hősokkfehérje és a C1q elleni antitestek szintje között. 2. A C1q elleni antitesteknek az általunk vizsgált betegcsoportok közül csak SLE-ben volt emelkedett a szintje. Bizonyos akut fázis fehérjékkel, a klinikai aktivitással és a veseérintettséggel észlelt korreláció utalhat ezen antitestek pathogenetikai szerepére. A
10
C1q pozitív nem differenciált kollagén betegeket érdemes szorosan követni, mivel elképzelhető, hogy később SLE felé differenciálódik tovább a betegségük. 3. A hsp és C1q elleni antitestek keresztreakciójának vizsgálata során kapott eredményeinkből
arra
következtethetünk,
hogy
a
C1q
ellenes
antitestek
epitópspecificitása különböző kórképekben (illetve egészségesekben) különbözhet, és az antitestek a C1q molekula más-más részei ellen irányulhatnak. 4. 1-es típusú diabetes mellitusban azonosítottunk két olyan epitóp régiót a hsp60 molekulán belül, amelyek ellen a diabeteses gyermekek fokozott antitest reaktivitást mutattak. Állatkísérleti és az eddigi humán vizsgálatok adatait figyelembe véve ezen peptidek ellen irányuló immunreakciónak fontos szerepe lehet az 1-es típusú diabetes mellitus pathogenezisében.
11
A doktori értekezésben összefoglalt saját és társszerzős közlemények:
1. L. Horváth, L. Czirják, B. Fekete, L. Jakab, Z. Prohászka, L. Cervenák, L. Romics, M. Singh, MR Daha, G. Füst: Levels of antibodies against C1q and 60 kD familiy of heatshock proteins in the sera of patients with various autoimmune diseases. Immunology Letters. 2001; 75: 103-109 IF: 1.546 2. Z. Prohászka, J. Duba, L. Horváth, A. Császár, I. Karádi, A. Szebeni, M. Singh, B. Fekete, L. Romics, G. Füst: Comparative study on antibodies to human and bacterial 60 kD Heat shock proteins in a large cohort of patients with coronary hart disease and healthy subjects. Eur J Clin Invest. 2001; 31(4): 285-292 IF: 2.071 3. L. Horváth, L.Czirják, B. Fekete, L. Jakab, T. Pozsonyi, L. Kalabay, L.Romics, K. Miklós, L.Varga, Z. Prohászka, A. Szakács, E. Nagy, MR Daha and G. Füst High levels of antibodies against C1q are associated with the disease activity and nephritis but not with other organ manifestations in SLE patients. Clin Exp Rheum 2001 NovDec; 19(6): 667-72 IF: 1.638 4. L. Horváth, L. Cervenak, M. Oroszlán, Z. Prohászka, K. Uray, F. Hudecz, É. Baranyi, L. Madácsy, M. Singh, L. Romics, G. Füst and P. Pánczél: Antibodies against different epitopes of heat-shock protein 60 in children with type 1 diabetes mellitus. Immunology Letters 2002 Mar 1; 80(3): 155-62 IF: 1.546 Az értekezés témájában megjelent társszerzős közlemények: 1. J. Kramer, P. Harcos, Z. Prohászka, L. Horváth, I. Karádi, M. Singh, A. Császár, L. Romics, G. Füst: Studies on the frequencies of some complement protein alleles and serum levels of anti-heat-shock protein antibodies in cerebrovascular diseases. Stroke. 2000; 31: 2648-2652 IF: 6.008 2. K. Burian, Z. Kis, D. Virok, V. Endresz, Z. Prohászka, J. Duba, K. Berencsi, K. Boda, L. Horváth, L. Romics, G. Füst, É. Gönczöl: Independent and Joint Effects of Antibodies to Human Heat-Shock Protein 60 and Chlamydia pneumoniae Infection in the Development of Coronary Atherosclerosis. Circulation. 2001 Mar 20; 103(11): 1503-1508 IF: 10.893
12
3. L. Kalabay, B. Fekete, L. Czirják, L. Horváth, M.R.Daha, A. Veres, G. Fónyad, A. Horváth, Á. Viczián, M. Singh, I. Hoffer, G. Füst, L. Romics, Z. Prohászka: Helicobacter pylori infection in connective tissue disorders is associated with high levels of antibodies to mycobacterial hsp65 but not to human hsp60. Helicobacter 2002 accepted IF: 2.639 Más témában megjelent társszerzős közlemények: 1. IJ. Sorensen, E. Holm Nielsen, L. Schroder, A. Voss, L. Horváth, SE. Svehag: Complexes of serum amyloid P component and DNA in serum from healthy individuals and systemic lupus erythematosus patients. J Clin Immunol. 2000 Nov; 20(6): 408-15 IF: 3.383 2. J. Szabó, L. Cervenák, F.D. Tóth, Z. Prohászka, L. Horváth, K. Kerekes, Z. Beck, A. Bácsi, A. Erdei, E.I.B. Peerschke, G. Füst, B. Gebrehiwet: Soluble gC1q-R/p33, a Cell Protein That Binds to the Globular „Heads” of C1q Effectively Inhibits the Growth of HIV-1 Strains In Cell Cultures. J Clin Immunol. 2001 May; 99(2): 222-31 IF: 3.383 3. Cs. Szalai, J. Duba, Z. Prohászka, Á. Kalina, T. Szabó, B.Nagy, L.Horváth, A. Császár: Involvement of polymorphisms in the chemokine system in the susceptibility for coronary artery disease (CAD). Coincidence of elevated Lp(a) and MCP-1-2518 G/G genotype in CAD patients. Atherosclerosis 2001 Sep; 158(1): 233-9 IF: 3.386 4. Á. Kalina, A. Császár, G. Füst, B. Nagy, Cs. Szalai, I. Karádi, J. Duba, Z. Prohászka, L. Horváth, H. Dieplinger: The association of serum lipoprotein(a) levels, apolipoprotein(a) size and (TTTTA0n polymorphism with coronary heart disease. Clinica Chimica Acta 2001; 309: 45-51 IF: 1.041 5. A. Horváth, D. Bánhegyi, A. Bíró, E. Újhelyi, A. Veres, L. Horváth, Z. Prohászka, A. Bácsi, V. Tarján, L. Romics, I. Horváth, FD. Tóth, G. Füst, I. Karádi: High level of anticholesterol antibodies (ACHA) in HIV patients. Normalization of serum ACHA concentration after introduction of HAART. Immunobiology 2001 Aug; 203(5): 75668 IF: 2.416
13
