Doktori értekezés. Huszár Mónika. Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Doktori értekezés

Huszár Mónika Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Idei Miklós, D.Sc., az MTA Támogatott Kutatócsoportok Irodájának igazgatója Hivatalos bírálók: Dr. habil. Stampf György, egyetemi docens, Dr. Magyar Anna, tudományos főmunkatárs.

Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Prof. Dr. Klebovich Imre, egyetemi tanár, megbízott dékán Dr. habil. Torkos Kornél, egyetemi docens, Dr. Hrabák András, egyetemi docens, Ph.D.

Budapest 2010

Tartalomjegyzék 1.

Bevezetés .................................................................................................................. 6 1.1

Lipofilitás......................................................................................................... 10

1.1.1

A lipofilitás fogalma................................................................................. 10

1.1.2

Lipofilitásmérés ........................................................................................ 10

1.2

Foszfolipofilitás ............................................................................................... 12

1.2.1

A foszfolipofilitás fogalma....................................................................... 12

1.2.2

Az IAM oszlop felépítése ......................................................................... 13

1.2.3

Az IAM oszlop és a membrán kettősréteg összehasonlítása .................... 14

1.3

Az optimális lipo- és foszfolipofilitási tartomány ........................................... 15

1.4

Permeabilitás.................................................................................................... 20

1.4.1

A permeabilitás fogalma........................................................................... 20

1.4.2

Permeabilitás-mérés ................................................................................. 21

1.4.3

A permeabilitás-mérés jelentősége a gyógyszerkutatásban, a permeabilitás

ADME(T) paraméterként betöltött pozíciója ......................................................... 25 1.4.4 1.5

A számítás menete .................................................................................... 26

Biológiai vizsgálatok ....................................................................................... 28

1.5.1

Antiproliferációs vizsgálat........................................................................ 29

1.5.2

Apoptózis vizsgálatok .............................................................................. 30

1.5.3

Fénymikroszkópos vizsgálat..................................................................... 32

1.5.4

PARP (poli (ADP-ribóz) polimeráz) fragmentáció Western blotos

követése ................................................................................................................. 32 1.5.5

Áramlási citometria .................................................................................. 34

1.5.6

NOX-4 gátló hatás vizsgálata ................................................................... 34

2.

Célkitűzések ........................................................................................................... 37

3.

Anyagok és módszerek........................................................................................... 39 3.1

Vegyszerek....................................................................................................... 39

2

3.2

Vizsgált molekulacsaládok .............................................................................. 39

3.2.1

Izokromanon molekulacsalád ................................................................... 40

3.2.2

Redukált Mannich ketonok....................................................................... 42

3.2.3

Auronok és származékaik......................................................................... 43

3.2.4

Kromenonok ............................................................................................. 45

3.3

Módszerek........................................................................................................ 45

3.3.1

3.3.1.1

Lipofilitás- és foszfolipofilitás-mérés ............................................... 45

3.3.1.2

CLOGP-meghatározás ...................................................................... 48

3.3.1.3

Permeabilitás-mérés .......................................................................... 48

3.3.2

4.

Fiziko-kémiai módszerek ......................................................................... 45

Biológiai módszerek ................................................................................. 49

3.3.2.1

Antiproliferációs vizsgálat (MTT és MB teszt) ................................ 49

3.3.2.2

Fénymikroszkópos vizsgálat ............................................................. 49

3.3.2.3

PARP fragmentáció Western blotos követése:.................................. 50

3.3.2.4

Áramlási citometria ........................................................................... 50

3.3.2.5

H2O2/Tyr/LPO sejtes mérés[104]...................................................... 51

Eredmények és értékelésük .................................................................................... 52 4.1

Izokromanon molekulacsalád .......................................................................... 52

4.1.1

Fiziko-kémiai karakterizálás..................................................................... 53

4.1.1.1

Kromatográfiás mérés ....................................................................... 53

4.1.1.2

CLOGP-logk összefüggés ................................................................. 57

4.1.1.3

Permeabilitás-vizsgálat...................................................................... 58

4.1.2

Biológiai karakterizálás ............................................................................ 59

4.1.2.1

Az antiproliferációs hatás vizsgálata................................................. 59

4.1.2.2

Fénymikroszkópos vizsgálat ............................................................. 62

4.1.2.3

PARP fragmentáció Western blottos követése.................................. 63

4.1.2.4

Áramlási citometria (FACS) ............................................................. 63

3

4.2

Redukált Mannich ketonok .............................................................................. 65

4.2.1

4.2.1.1

Kromatográfiás paraméterek ............................................................. 66

4.2.1.2


4.2.1.3


4.2.2 4.3


Auronok ........................................................................................................... 72

4.3.1


4.3.1.1

Kromatográfiás mérések ................................................................... 74

4.3.1.2

CLOGP-logk összefüggés IAM oszlop esetén.................................. 75

4.3.1.3


4.3.2 4.4



Kromenonok .................................................................................................... 79

4.4.1


4.4.1.1

Kromatográfiás mérések ................................................................... 81

4.4.1.2


4.4.1.3


4.4.2


5.

Következtetések...................................................................................................... 85

6.

Összefoglalás .......................................................................................................... 89

Irodalomjegyzék ............................................................................................................. 91 Köszönetnyilvánítás ..................................................................................................... 108

4

Rövidítések jegyzéke A, B, Rkoef, SD, P, N: Az illesztett egyenes

NADPH:

paraméterei

dinukleotid-foszfát

AA: Akceptor tálcán mért abszorbancia

NOX: NADPH oxidáz

AcN: Acetonitril

P:

AD: Donor tálcán mért abszorbancia

molekula n-oktanol/víz rendszerben történő

ADME(T):

megoszlását adja meg).

Abszorpció

(Absorption),

Redukált

megoszlási

nikotinamid-adenin-

hányados

PAMPA:

Kiürülés (Excretion), Toxicitás (Toxicity).

Permeabilitási

Apuffer: A pufferoldat abszorbanciája

Membrane Permeability Assay)

c0: Kezdeti mintaoldat koncentráció

PARP: Poli (ADP-ribóz) polimeráz

cA: Akceptor koncentráció

PBS: Fiziológiás sót tartalmazó foszfát puffer

cD: Donor koncentráció

(Phosphate Buffer Saline)

cekv: Ekvilibrium koncentráció

Pe: Permeabilitás

a

logaritmusának

megoszlási számítással

hányados

QSAR:

meghatározott

Mesterséges

adott

Eloszlás(disztribúció), Lebomlás Metabolism),

CLOGP:

Parallel

(általában

Módszer

Membrán

(Parallel

Quantitive

Artificial

Structure-Activity

Relationship (Szerkezet–Hatás Összefüggés).

értéke

R: Felbontás

DMSO: Dimetil-szulfoxid

Red MK: Redukált Mannich keton

ER: Endoplazmatikus retikulum

ROS: Reaktív oxigén gyök

FACS: Áramlási citometria (Fluorescence-

RP: Fordított fázis

activated Cell Sorting)

S: A membrán szűrőfelülete

HPLC-DAD: Nagyfelbontású

T/C%: A kezelt és a kontrol sejtek általi

Folyadékkromatográf-Dióda Soros Detektorral

abszopció aránya (Treated/Control%)

HPLC-MS: Nagyfelbontású

t: inkubációs idő

Folyadékkromatográf-Tömegspektrométerrel

t0: holtidő

IAM

TEAP: Trietil-ammónium-foszfát puffer

oszlop:

Immobilizált

Mesterséges

Membrán oszlop

tm: migrációs idő

IC50: 50%-os gátló hatást okozó koncentráció

tmic:

(half maximal inhibitory concentration)

fázistartózkodási idő

IK: Izokromanon

tprop,mic: normalizált fázistartózkodási idő

k: retenciós faktor

tr: retenciós idő

LPO: Laktoperoxidáz enzim

Tyr: Tirozin

MB: Metilénkék

VA: Akceptor térfogat

MEKC:

Micelláris

Elektrokinetikus

micelláris

fázisra

vonatkozó

VD: Donor térfogat

Kromatográfia

W1/2: Kromatográfiás félértékszélesség

MLP: Molekuláris Lipofilitási Potenciál

α: Szelektivitási tényező

MTT:

em: Emissziós hullámhossz

3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

ex: Gerjesztési hullámhossz

difeniltetrazolium bromid (Tetrazol)

5

1. Bevezetés A gyógyszerkutatás igen sokrétű, összetett folyamat. Ahhoz, hogy egy gyógyszer jelölt molekulából valódi gyógyszert fejlesszünk ki az adott molekulára jellemző szintézisút megtalálása után a molekula teljes körű karakterizálására van szükség. Az első lépés tehát, amely ahhoz szükséges, hogy egyáltalán ki tudjunk választani egy megfelelően

ígéretesnek

vélt

komponenst,

a

kémiai-biológiai-farmakológiai

karakterizálás. Az itt végrehajtott vizsgálatsorozat, más néven farmakokinetikai jellemzés, elsősorban in vitro kísérletekből áll. A farmakokinetika a gyógyszermolekula szervezeten belüli sorsát, azaz sematikusan a szervezet gyógyszerre gyakorolt hatását kutatja [1]. A famakokinetikai vizsgálatok egyes fázisait az 1. táblázat tartalmazza, ezeket összefoglaló néven ADME(T) karakterizálásnak nevezzük. A gyógyszerkutatás második fő területe a farmakodinamikai jellemzés, amely a gyógyszer szervezetre gyakorolt hatását, illetve mellékhatását vizsgálja [2]. 1. táblázat: Farmakokinetikai és –dinamikai fázisok Farmakokinetikai fázisok

Farmakodinamikai fázisok

- A (absorption) = Felszívódás

- Klinikai hatásvizsgálat

- D (distribution) = eloszlás

- Toxikus hatásvizsgálat

- M (metabolism) = Lebomlás

- Mellékhatás-vizsgálat

- E (excretion) = Kiürülés - T (toxicity) = Toxicitás

Az egyes klinikai vizsgálatok közül az első átlagosan egy, a második kettő, a harmadik pedig akár három-négy évet is igénybe vehet. Ekkorra a még mindig csak „gyógyszerjelölt” molekulát már több ezer önkéntesen tesztelték le. A klinika IV. vizsgálat már a gyógyszerként említhető molekula teljes piaci életének nyomon követését tartalmazza, hiszen nem ritka, hogy még ebben a stádiumban is visszavonásra kerülnek bizonyos hatóanyagok. Ez történt például a Pfizer által 1997-ben piacra dobott antibiotikus hatású trovafloxacinnal, amelynek klinika IV. stádiumban kiderített hepatotoxikus tulajdonsága több mint 8 milliárd dollárjába került a Pfizernek [3][4][5],

6

vagy az antihisztaminként alkalmazott terfenadinnal, amely kardiális toxikus mellékhatása miatti visszavonása több mint 6 milliárd dollárba került [6][7][8]. Nem meglepő tehát, hogy a kutatók elsődleges célja már hosszú évek óta, hogy megfelelő,

nagy

hatékonyságú

és

gyors

módszereket

fejlesszenek

ki

a

gyógyszermolekulának alkalmas és biztosan nem alkalmas vegyületek elkülönítésére, szelektálására. Mégis, sok esetben (elsődlegesen a daganat ellenes szerek esetében) akár 6 évig is eltarthat az a folyamat, amíg az újonnan szintetizált vegyület eljut a klinikai vizsgálatokig. Tekintve, hogy manapság (elsődlegesen a rákkutatásban) egyre nagyobb mértékben kerül előtérbe, illetve nyer bizonyosságot az úgynevezett „személyre szabott terápia” érvényessége, igen fontos, hogy az úgynevezett farmakokinetikai vizsgálatokat minél jobban lerövidítsük, illetve minél költséghatékonyabbá tegyük. Ez a két dolog, pénz és idő, (sajnos) jelentős mértékben dominál minden típusú kutatásban. Ezek hiányában a harc igen reménytelennek tűnhet. A Tufts Center for the Study of Drug Development, Tufts University School of Medicine adatai alapján egy molekula gyógyszerré fejlesztése legalább 1 milliárd USA dollárba kerül, míg a gyógyszerjelölt komponens klinika I. fázisig történő eljutása 100 millió dollár. Szintén statisztikai adatok alapján, egy gyógyszerjelölt molekula fejlesztési stádiumban történő vizsgálata naponta 37000 USA dollárba kerül [9]. A pénzen, mint akadályozó tényezőn kívül az idővel való harc is meghatározza az egyes betegségek kezelési módját. A személyre szabott terápia, esetenként személyre szabott gyógyszer megalkotása igen nehezen alkalmazható abban az esetben, ha a gyógyszerfejlesztés akár 10-20 évet is igénybe vesz, hiszen vegyük csak figyelembe a KSH és Nemzeti Rákregiszter adatait [10], mely szerint minden évben átlagosan 66 ezer rákbeteget regisztrálnak és átlagosan 33 ezren halnak meg ebben a betegségben. A kérdés tehát adott: hogyan tudjuk lerövidíteni, illetve ezzel egyidejűleg biztonságosabbá, precízebbé tenni a gyógyszergyártás folyamatát? Értelemszerűen a klinikai szakaszok, ahol már egészséges önkénteseken történik az ellenőrzés, igen fontosak, nagy precizitást igényelnek és nem rövidíthetők le. Mivel az egész kutatási folyamatnak az alapja maga a szintézis, azaz az új gyógyszerjelölt molekula előállítása, így mind a gyógyszergyárak, mind pedig a kutatócsoportok igen nagy hangsúlyt fektetnek a szintetikus munkára. A szintézisút megtervezése, az irodalmazás, a hatásosnak vélt vegyülettípusok, ígéretes szerkezeti

7

jellemzők felderítése időigényes lehet, de mindezek ellenére is elmondható, hogy naponta akár több ezer molekula is előállításra kerül. A folyamat költség és időhatékonnyá tétele tehát elsődlegesen a farmakokinetikai stádiumban lehetséges. Mindezen, eddigiekben felsorolt tények alapján az 1990-es évek végére végre a nagy gyógyszergyárak is belátták, hogy egy molekula korai stádiumban történő alapos, precíz tesztelése elengedhetetlenül fontos. Ebből következett, hogy míg 1993-ban a gyógyszermolekulák mintegy 40%-a bukott meg ADME(T) szempontból, addig az 1990-es évek végére már csupán a 11%-uk. Ezen vizsgálatok népszerűségét, illetve jelentőségét adja továbbá, hogy viszonylag gyorsan és kevésbé költséges módon elvégezhetők. Ráadásul ezeknek a paramétereknek a meghatározásával kiváló lehetőség nyílik egy előzetes szelektálásra a gyógyszerjelölt molekulák között. Azok a komponensek ugyanis, amelyeknek már a fizikai-kémiai tulajdonsága sem felel meg az elvártnak, nem nevezhetők gyógyszerjelölt vegyületeknek [11][12][13][14][15]. Így a fiziko-kémiai és biológiai paraméterek közötti korreláció analízis segítségével a hatalmas halmazt alkotó, újonnan szintetizált molekulák könnyedén szétválaszthatóak lesznek hatástalan és hatásosnak vélt molekulák halmazára [16], amelynek segítségével már csak olyan molekulákat vetnek alá komoly klinikai vizsgálatoknak, amelyek farmakokinetikai tulajdonsága az elvártnak megfelelő [17][18][19][20][21][22]. Az ilyen, a kísérletek korai stádiumában elvégzett, hatékony, viszonylag gyors és alacsony költségű, ám de esszenciális vizsgálatokat manapság

egyre

többen

nevezik

„korai

ADME(T)”

karakterizálásnak

[16].

Természetesen ebbe a halmazba nem csupán a fiziko-kémiai, hanem bizonyos alapvető biológiai vizsgálatok is beletartoznak. Mindezen vizsgálatok tehát eldönthetik, hogy mit is nevezünk pontosan gyógyszerszerű („drug-like”) molekulának. Erre a kérdésre 1997-ben adott először választ Lipinski, aki leírta azokat az alapvető kritériumokat, amelyek hiányában a molekula nem szerepelhet gyógyszerjelöltként [13]. A szabályok tehát: - a kismolekulák móltömege nem lehet több, mint 500 g/mol, - a lipofilitást jellemző logP megoszlási hányados értéke nagyobb kell, hogy legyen, mint 5,

8

- maximálisan 5 hidrogénkötésben vehet részt a molekula, mint donor és maximum 10-ben, mint akceptor. A tudomány akkori állása szerint tehát minden olyan molekulát (kivéve a természetből származó anyagokat, az oligonukleotidokat, a proteineket és az aktív transzporttal szállítódó vegyületeket), amely nem teljesítette ezen követelményeket, fizikai-kémiai szempontból alkalmatlannak, biológiailag hozzáférhetetlennek minősítettek. Azóta természetesen szélesedett a kutatók látótere, ez pedig elsődlegesen a már fent említett „korai ADME(T)” karakterizálás térhódításának volt köszönhető. A molekulák fiziko-kémiai karakterizálásán túlmenően, az egyes paraméterek optimalizálása, a szerkezet hatással, biológiai hatékonysággal való összefüggésének vizsgálata szintén a kutatások középpontjába került. Adrian Albert már az 1970-es évek elején vizsgálta a különböző gyógyszerjelölt molekulák szerkezete, illetve biológiai hatékonysága közötti kapcsolatot (QSAR). Adrian Albert elsők között mutatott rá a szerkezet-hatékonyság vizsgálatok fontosságára [23]. Az ilyen jellegű kutatások a későbbiekben természetesen tovább folytatódtak, illetőleg a 90-es évek végére az előbb említett adatoknak megfelelően nagyobb hangsúlyt nyertek [24][25][26]. Egyre több kutató vélte biztos gyógyszerfejlesztési kiindulási pontnak, egy-egy ADME(T) paraméter meghatározását, az adott paraméter biológiai hatásmodifikáló szerepének értékelését [27], illetve az adott mennyiség optimalizálásának lehetőségét. Így egyre több vizsgálat irányult pl. a lipofilitás Lipinski általi optimalizálásának alátámasztására, illetve cáfolására, optimális hidrofilitási és hidrofobicitási értékek kijelölésére különböző vizsgálatokból származó lipofilitási értékekkel. Azonban már a korábbiakban is értelemszerű volt, hogy az optimalizálást nem csupán a lipofilitással,

hanem

egyéb,

ADME(T)

karakterizálási

szempontból

fontos

paraméterekkel is szükséges elvégezni [28]. Minél több, biohasznosíthatóság szempontjából fontos paramétert ismerünk, annál nagyobb eséllyel tudunk az adott hatóanyag-jelölt klinikai stádiumokban történő helytállására következtetéseket levonni. Jelen tanulmány a lipofilitás, foszfolipofilitás, illetve permeabilitás alapvető biológiai adatokon alapuló optimalizálásával foglalkozik.

9

1.1

Lipofilitás

1.1.1 A lipofilitás fogalma A lipofilitás az egyik legfontosabb és egyben legrégebb óta a molekulák abszorpciós képességének jellemzésére használt paraméter, amely alapvetően az egyes molekulák víz és oktanol közötti megoszlási hányadosával jellemezhető [29]. Egy molekula lipofilitását jellemezhetjük az ún. valódi partíciós koefficienssel, amely egy olyan nemionos komponens lipofilitását adja meg, amely megoszlása a két fázis között a pH-tól független, és a látszólagos vagy disztribúciós megoszlási hányadossal, amely az adott fázisban, adott pH-n jelenlevő valamennyi részecskét figyelembe veszi [30]. A molekulák lipofilitása elsődlegesen az adott komponens és a biológiai membrán közötti hidrofób kölcsönhatás erősségét karakterizálja. Munkám során a valódi megoszlási hányadossal jellemeztem az egyes molekulákat, hiszen ez az egyetemesen használt mennyiség. Ezt alátámasztja az a tény is, hogy az alapvető ADME(T) karakterizálás során legjobban jellemezhető és leginkább karakterizált passzív transzportban az ionos molekulák nem tudnak részt venni, tekintve, hogy a lipofil sejtmembránon történő áthatolásuk gátolt, hidrofil ionos sajátságuk miatt. 1.1.2 Lipofilitásmérés A lipofilitás jellemzésére eszközök és módszerek széles tárháza áll rendelkezésünkre [31][32][33][34][35]. Alapvetően két eljárásról, a direktről és az indirektről beszélhetünk. Kezdetben a direkt módszerek jelentettek standard megoldást, ilyen volt például a rázótölcséres eljárás. Ma már

ez

kevésbé

népszerű,

hiszen

nagy

minta,

idő

és

oldószer

igénye

környezettudatossági és anyagi okokból is gátat szab a módszernek. A módszer UV/VIS spektrofotometriás detektálással párosítva igen pontosnak mondható. A mérési eljárás egyik hátránya, hogy a termosztálás nehezen megoldható. A túl lipofil vagy éppen túl hidrofil molekulák pedig nem mérhetőek ezzel az módszerrel, hiszen ebben az esetben az egyik fázisban túlságosan kis koncentrációban jelen levő minta kimutatása nem lehetséges nagy pontossággal. A direkt módszerek közül manapság a leghatékonyabbnak tartott mérési eljárás a potenciometriás titrálás. Ebben az esetben a normál potenciometriás méréseknek

10

megfelelően járunk el, azonban a titrálás két különböző közegben, egy vizesben és egy szerves fázist, legtöbbször n-oktanolt tartalmazó közegben zajlik. A logP értékét a vizes közegben kapott titrálási görbe szerves fázis jelenlétében kapott görbéhez viszonyított eltérésből kapjuk meg. Ez a módszer kiválóan alkalmas a lipofilitás meghatározására, azonban természetesen csak abban az esetben, ha a minta oldódik az adott közegben. A mérés automatizálható, így könnyebben kivitelezhető, mint a rázótölcséres módszer. A számítógépes becslésen alapuló lipofilitás-meghatározás a legegyszerűbb, viszont korántsem teljes mértékben kielégítő eredménnyel szolgáló módszer. A kapott lipofilitás-érték ebben az esetben a CLOGP-nek nevezett kalkulált partíciós koefficiens. A CLOGP-számításra számos eljárás áll rendelkezésünkre. Ilyen például a Crippen’s, Viswanadhan’s, Broto’s módszer, amely során atomi fragmensek lipofilitásának ismeretében tudjuk meghatározni a CLOGP értéket [36], vagy a Testa által kifejlesztett molekuláris tulajdonságokon alapuló MLP eljárás [37]. A legelterjedtebb, legtöbb számítógépes program által használt módszer a fragmens alapú számítás, ahol az alapmolekula és a hozzá kapcsolódó fragmensek, szubsztituensek száma, pozíciója határozza meg a CLOGP értékét [31][38][39]. A számítógépes módszerek alapvető hátránya, hogy segítségükkel az ionos molekulák, illetve geometriai izomerek lipofilitása nem határozható meg, hiszen a töltésből, illetve térbeli elhelyezkedésből adódó lipofilitás-különbségek nem befolyásolják a számítást. Az indirekt eljárások közé soroljuk a kromatográfiás lipofilitás-mérő módszereket. Ezeknél az eljárásoknál természetesen nagyon fontos, hogy az adott kromatográfiás állófázissal minél hitelesebben tudjuk karakterizálni a membrán kettősréteget. Jelentős számú kutatást végeztek már állófázis fejlesztéssel kapcsolatban [29][40]. A kromatográfiás, indirekt eljárások közé tartozik például a micelláris elektrokinetikus kromatográfia, ahol a vegyület pszeudoállófázisként viselkedő micellák és mozgó vizes fázis közötti megoszlását vizsgáljuk. A mintakomponens, hidrofobicitásától függő mértékben fog kölcsönhatásba lépni a micellákkal, retenciós ideje tehát elsődlegesen attól függ, hogy mekkora lipofilitással rendelkezik. Az így mért egységet fázistartózkodási időnek (tmic) nevezzük. Az ebből számított, mértékegység nélküli normalizált fázistartózkodási időt ( t prop , mic  t mic , ahol tm a migrációs idő) hasonlítjuk a tm

számítógéppel meghatározott logP értékhez, amelyből korrelációs összefüggéssel a molekula lipofilitását tudhatjuk meg [41]. A MEKC mérések előnye, hogy az állófázis 11

könnyen változtatható, illetve annak minősége megválasztható olyan módon, hogy a membrán kettősréteget tudjuk modellezni vele [42]. A kromatográfiás eljárások közül lipofilitás-meghatározásra

alkalmazott

módszerek

legrégebbi

típusa

a

folyadékkromatográfiás mérés. Az elv gyakorlatilag igen hasonló, mint a MEKC esetében, hiszen itt is retenciós koefficienst mérünk, és ezt hasonlítjuk a számított logP értékhez. Egy-egy ilyen, lipofilitás-meghatározó módszer kiválóan alkalmas egész molekulakönyvtárak lipofilitásának jellemzésére, illetve szerkezet-hatás összefüggés vizsgálatra. Kromatográfiás mérések lévén, a meghatározások pontossága és érzékenysége igen nagy [30]. Ebben az esetben is a számítással kapott partíciós koefficiens és a retenciós faktor közötti korrelációt vizsgáljuk. Az így kapott, általában elvárható lineáris korreláció egyenlete: CLOGP  A  log k  B ,

ahol k a kromatográfiásan mért retenciós faktor: k 

tr  t0 t0

az egyenletben szereplő tr jelöli a komponens retenciós idejét, t0 pedig a holtidőt. Ezekkel az eljárásokkal lehetőségünk nyílik a különböző geometriai izomerek elválasztására is, így pedig lipofilitás szerinti megkülönböztetésére. Mindemellett így sokkal gyorsabban jutunk eredményhez, mint az előzőekben felsorolt módszerekkel. Az eszközök és módszerek sokasága, azok több előnye és szintén sok hátránya is azt mutatja, hogy minden esetben az adott molekuláknak, molekulacsaládoknak, illetve kutatási körülményeknek megfelelően kell megválasztanunk a számunkra leghatásosabb módszert. A lipofilitás kísérleti meghatározására tehát nem lehet kijelölni egy univerzálisan, minden esetben, minden molekulatípusra, minden feladatra alkalmazható módszert. Viszont a lipofilitás-meghatározás fontossága vitathatatlan. 1.2

Foszfolipofilitás

1.2.1 A foszfolipofilitás fogalma Amint azt már korábban említettem, a lipofilitást alapvetően a molekulák oktanol/víz közötti megoszlási hányadosával jellemezték. A kutatók azonban az idő előrehaladtával egyre nagyobb figyelmet szenteltek a molekulák és a biológiai membrán között létrejövő kapcsolat teljes körű karakterizálásának. Ezzel magyarázható az is, hogy az

12

eredeti n-oktanol/víz rendszer egyre több helyen cserélődött liposzóma/víz vagy liposzóma/puffer oldatelegyre. A cél tehát az volt, hogy még a kísérletek korai stádiumában minél pontosabban jellemezni tudjuk a gyógyszerkutatás szempontjából igen kritikus gyógyszer-membrán interakciót. A

foszfolipofilitás

az

ADME(T)

paraméterek

közül

szintén

a

molekulák

abszorpciójának, kiváltképpen a bélen keresztül történő felszívódásnak jellemzésére szolgáló paraméter. A lipofilitáshoz képest azonban több vagy inkább más fajta információhoz juthatunk általa. Míg a tradicionális, szilika felülethez kapcsolt alkil láncokat tartalmazó fordított fázisú oszlop esetén csupán hidrofób kölcsönhatásról beszélhetünk a molekula és az oszlop között, addig az IAM oszlopnál hidrofób, hidrogénhidas és ion-pár kölcsönhatás is létrejön. Ezen kölcsönhatások adott rendszerben létrejövő együttesét nevezzük foszfolipofilitásnak. Mérése szintén HPLCvel, egy specifikus kolonna, az úgynevezett IAM oszloppal történik. 1.2.2 Az IAM oszlop felépítése A

fordított

fázisú

oszlophoz képesti különbség

lényege tehát a létrejövő

kölcsönhatásokban van. Mint ismert, a biológiai membrán fő alkotóeleme a foszfatidilkolin. Az IAM oszlop specifitását a szilika felülethez aminopropil csoportokon keresztül kapcsolódó egyláncú foszfatidilkolin csoport alkotja. A nagy foszfatidilkolin csoport kiválóan alkalmas arra, hogy elfedje a szilika aminkötő részeit, így elkerülhetjük azon interakciók létrejöttét, amelyek meghamisítanák a folyadék-membrán kettősréteg modellezését. Az oszlop felülete C3 és C10 láncokkal utószilanizált, fiziológiás körülmények között pedig anionos tulajdonságú a jelenlevő foszfoészterek miatt. Az oszlop szintén kiválóan alkalmas az egyes molekulák bélen keresztüli penetrációs készségének becslésére. A kolonna segítségével nem csupán hidrofób, hanem hidrofil kölcsönhatásokat is tudunk jellemezni. Az első generációs IAM (IAM.PC.DD, Ld. 1. ábra) oszlopok hidrofobicitása még nem volt kielégítő. A fejlesztések során tehát ezt tovább növelték a foszfatidilkolin kettős láncú észterrel szubsztituált vegyületének az aminoszilikához történő kapcsolásával. Így a szilikához amidkötésen keresztül már dimirisztoil-foszfatidilkolin kapcsolódik (IAM.PC.DD2 oszlop).

13

1. ábra: Az 1. (IAM.PC.DD) és 2. (IAM.PC.DD2) generációs IAM oszlop felépítése 1.2.3 Az IAM oszlop és a membrán kettősréteg összehasonlítása Amint az a 2. ábrán is látható az IAM oszlop tökéletes modellezője lehet a folyadékmembrán kettősrétegnek.

Km

KIAM

Szilika

Membrán kettősréteg

IAM HPLC oszlop

2. ábra: A membrán kettősréteg és az IAM oszlop szerkezeti felépítésének összehasonlítása A foszfatidilkolin csoportok kisebb számából és az IAM oszlop monoréteges felépítéséből adódóan az IAM oszlopot ugyan relatíve gyengébb elektrosztatikus

14

kölcsönhatások jellemzik, mint a valódi membrán kettősréteg és a gyógyszer molekula között kialakuló interakciót, de ez csak kis mértékben befolyásolja a modellezés, illetve a

szimuláció

pontosságát.

Sokkal

jelentősebb

szerepet

kap

az

elválasztás

hatékonyságában a foszfatidilkolin poláris feje [43]. Az elválasztásban szerepet játszó kölcsönhatások erőssége azonban nagymértékben függ a vizsgált molekulacsalád minőségétől is. Cohen és Leonard például a lipid kiválasztásban, lipid aggregációban, zsírsavak lebontásában is szerepet játszó epesók membránnal való kölcsönhatását vizsgálta. Mivel az epesók működése nagy mértékben függ a hidrofób-hidrofil egyensúlytól, így ezen vegyületek membránnal történő interakciójának pontos jellemzésére, a mind hidrofób mind pedig hidrofil sajátságú csoportokat tartalmazó IAM oszlop kiválóan alkalmas [25]. Az irodalomból ismert, hogy a gyógyszer molekula IAM oszlop-áramló fázis közötti megoszlása elsődlegesen a molekula méretétől, töltésétől illetve hidrofobicitásától és természetesen a kialakuló H-kötések erősségétől függ. Ezen a ponton jutunk megint vissza a már említett Lipinski-szabályokhoz. Lipinski pontosan ezeket a szempontokat emelte ki, mint kritikus mérőszámokat egy „gyógyszer-szerű” molekula esetén. Az IAM oszloppal tehát minden, a Lipinskiszabályban már említett paraméter jellemezhető. Az oszlop hátrányos tulajdonsága azonban, hogy élettartama sokkal rövidebb, mint a tradicionális fordított fázisú kolonnáé. 1.3

Az optimális lipo- és foszfolipofilitási tartomány

Amint arról már a korábbiakban szó volt, a Lipinski-féle „ötös szabály” volt gyakorlatilag az első olyan szabályrendszer, amely megerősítette az ADME(T) paraméterek és a fiziko-kémiai karakterizálás fontosságát. A kezdeti álláspont szerint tehát a lipofilitást jellemző partíciós koefficiensnek szigorúan 5 alatti értékűnek kell lennie. A Lipinski-szabály bevezetését követően számos vizsgálat irányult a „gyógyszer-szerű” molekula optimális lipofilitási értékének kijelölésére. Ezen vizsgálatok elsődlegesen a biológiai adatokra támaszkodva, korreláció analízisen alapultak. A vizsgált molekulakönyvtárak közé tartoztak tehát platina komplexek [20], dehidroartemisinin származékok [21], kalcium antagonista gyógyszermolekulák [22], illetőleg izokinolin-4,6-dion és tiadiazol származékok [44][45]. Ezen vegyületcsaládok

15

esetén sok esetben lineáris, néhány esetben viszont parabolikus összefüggést találtak a lipofilitás és a biológiai hatékonyság között. Külön nagy vizsgálati halmazt képviselnek a szerkezeti eltérésekből adódó lipofilitás mérések, illetve az ezen szerkezeti eltérések okozta biológiai hatékonyságbeli változások jellemzésére irányuló kutatások. Többek között Campos és munkatársai bizonyítottak a lipofilitás, szerkezet és biológiai aktivitás között kapcsolatot kolin kináz inhibitorok esetén [46]. Humán neutrofil elasztáz inhibitorok vizsgálatát végezték Tóth István és munkatársai. Kutatásaikban szintén korrelációanalízist hajtottak végre, illetve felderítették a molekulák szerkezetbeli változásának és ezzel egyidejűleg lipofilitásbeli módosulásának inhibíciós képességre gyakorolt hatását. A szintetizált, humán neutrofil elasztáz inhibitorként működő peptidekből egy növekvő lipofilitású sorozatot állítottak elő. Azt vizsgálták, hogy a növekvő logP hogyan befolyásolja a számos betegségben, úgy mint reumatoid artritisz illetve periodontitisz, szerepet játszó humán neutrofil elasztáz működését. A peptidekre vonatkozó vizsgálatok a magasabb lipofilitási tartományt jelölték ki ideálisnak. A lipofilitás felső határát Tóth és társai ugyan nem vizsgálták, ellenben sikerült megállapítaniuk, hogy a hatásért a neutrofil elasztázon jelenlevő hidrofób zseb a felelős [47][48][49][50]. A hidrofób zseb jelenléte tehát jelentősen determinálja az ideálisnak tekinthető lipofilitási tartományt. Számos kutatás irányult a molekulák lipofilitása és a hidrofób zseb jelenléte közötti kapcsolat vizsgálatára. Értelemszerűen ezen vizsgálatok általában lineáris korrelációt állapítottak meg a biológiai hatékonyság és a lipofilitás között. A hidrofób zseb ugyanis kedvezményezetten tud reakcióba, illetve kölcsönhatásba lépni a nagyobb lipofilitású gyógyszerjelölt komponensekkel. Quartere és munkatársai gyűrűs pszeudopeptid NK2 antagonistákat vizsgálva jutottak arra a következtetésre, hogy a növekvő lipofilitás megnöveli a biológiai aktivitást [51], Regan [52][53] és Kim [54] pedig hidrofób domain jelenlétét vizsgálta és bizonyította be. Az utóbbi kutatócsoport influenza neuronamidáz inhibitorok vizsgálatát végezte, míg az előbbi a különböző autoimmun betegségekben feltételezhetően szerepet játszó p38α MAP kináz esetén fedezett fel hidrofób domaint, amely kináz ezáltal sokkal könnyebben volt gátolható nagyobb lipofilitású (ez esetben terc-butil csoportot tartalmazó) inhibitorok által. A hidrofób zsebre vonatkozó tanulmányok tehát elsődlegesen magával a hidrofób domainnel való interakciót célozták meg. Értelemszerűen egy gyógyszer molekula

16

azonban az esetek döntő többségében nem hidrofób zsebbel történő interakció révén fejti ki hatását. A túl nagy lipofilitás pedig számos egyéb biológiai folyamatban kedvezőtlen gyógyszerjellemző lehet. A cél tehát a molekulák lipofilitásának optimalizálása,

a

lipofilitás

felső

és

alsó

határértékének

megtalálása

[55][56][57][58][59][60][61]. Több szempontot együttesen figyelembe véve tudunk tehát ideális tartományt kijelölni: 

a felső határérték maximumát meghatározó tényezők, a túl nagy lipofilitás hátrányai: - csökkent vízoldékonyság (különösen orálisan alkalmazott gyógyszer molekulák esetén probléma) - gátolt kiürülés, detoxifikáció (ez ugyanis sok esetben poláris körülmények között, a vesén keresztül következik be) - gátolt vér általi transzport, illetve vérben való nagyobb mértékű felhalmozódás [13][62] - toxikus hatás [55][56][57][58][59][63] - akkumuláció a szövetekben, membránban



az alsó határérték minimumát meghatározó tényezők, a túl alacsony lipofilitás hátrányai: - gátolt penetráció a hidrofób membránon keresztül, alacsony permeabilitás - túl gyors kiürülés a vizelettel [64][65] - vér-agy gáton történő gátolt penetráció [66][67][68][69].

Az ideális tartomány meghatározása során tehát számos szempontot figyelembe kell vennünk. A határérték pedig nem csupán az adott gyógyszermolekulától, annak méretétől, töltésétől és ezzel kapcsolatos hidrofób tulajdonságaitól függ, az ideális lipofilitási tartományt meghatározza a sejt, illetve a szövet típusa is [15]. Hogy mit is nevezünk Lipinski óta és az általa alkotott szabályokat tovább fejlesztve optimális partíciós értéknek, azt elsők között Coats és munkatársai vizsgálták. Kutatásaikban különböző réz-kelát komplexek citotoxikus aktivitása és lipofilitása közötti korreláció analízissel megállapították, hogy a lipofilitás felső és alsó határértékét parabolikus összefüggés segítségével tudják kijelölni [70]. Szintén parabolikus összefüggéssel tudta kiválasztani az ideálisnak vélt, sejtmembránon akadálymentesen áthaladó molekulák halmazát Veldman [71]. Kiterjedt tanulmányt folytatott M. J. Waring több ADME(T)

17

paraméter felső és alsó határértékének meghatározására, illetve kijelölésére. Tanulmányaiban említi többek között a lipofilitást és permeabilitást is. Megállapításai számos korábbi kutatáson alapulnak. Petrauskas például bevezette Lipinskivel ellentétben az ún. négyes szabályt. Eszerint egy hatékony szubsztrát molekulának nem lehet több mint 8 akceptor kötő helye, molekulatömege maximum 400 g/mol lehet, illetve pKa értéke 4-nél kisebb kell, hogy legyen. Szabályait a hidrogénkötések maximális számának kijelölésével, indirekt módon a lipofilitásra is kiterjesztette, hiszen ismert, hogy a hidrogénkötő akceptor helyek száma fordítottan arányos a lipofilitással [72]. Waring [63] elsődlegesen a lipofilitás és a molekulatömeg limitálására hívta fel a figyelmet, hiszen amennyiben ezen értékeknek meghatározzuk maximumát, illetve minimumát a „gyógyszer-szerű” molekulák esetén, már következtetések vonhatók le a permeabilitásra vonatkozóan. Értelemszerűen ezen paraméterek szoros összefüggésben állnak egymással és amint azt Waring is megfogalmazta, ezen értékek meghatározása a legegyszerűbb vizsgálatok közé tartozik, jelentőségük mégis szignifikáns. A kutatások elsődlegesen arra szerettek volna rávilágítani, hogy igen sok esetben a lipofilitás növekedése a toxicitás növekedésével járt együtt. Nem nehéz elképzelnünk, hogy amennyiben egy gyógyszermolekula túl hosszú ideig tartózkodik a zsírszövetben, membránban, azaz akkumulálódik ott, jótékony hatása megkérdőjelezhetővé válik, hosszú állás után könnyen beindulhatnak metabolizációs, bomlási folyamatok, a bomlás és átalakulási termékek pedig már helyenként teljesen más hatással rendelkeznek, mint az anyamolekula. Mindezek alapján, Leeson és Springthrope Nature című folyóiratban megírt cikkében 2007-ben egyetemes kijelentést tett, miszerint a molekulák CLOGP értéke nem lehet nagyobb, mint 3 [56]. 2008-ban ezt a megállapítást némiképp finomította Gleeson, aki a „négyes szabályt” alátámasztandó leírta, hogy a CLOGP értéke nem lehet nagyobb, mint 4, illetve a molekulatömegnek kisebbnek kell lennie 400 g/mol-nál [59]. Az elméletek alapján tehát pusztán a molekulatömeg és a logP értékének ismeretében következtetni tudunk a permeabilitásra. Ezen tanulmányok még nem szóltak a permeabilitással összefüggésbe hozható foszfolipofilitásról. Nem elhanyagolható azonban a foszfolipofilitás permeabilitással korrelációt mutató sajátsága. Szintén, az előzőekben megfogalmazott szabályoknak ellentmondó tény, hogy számos olyan molekula ismert, amely négynél nagyobb CLOGP értékével is permeabilisnek nevezhető és nincs toxikus hatása, viszont az előzőekben felsorolt szabályok fontos, a

18

kutatásokat megkönnyítő irányelvül szolgálnak a gyógyszerkutatás során, folyamatosan számításba véve a kilógó, szabályoktól eltérően viselkedő aktív gyógyszerjelölt molekulák jelenlétét a kutatásokban. A legtöbb tanulmány tehát pontos módszereket ad a kezünkbe a lipofilitás felső határértékének kijelölésére, kevesebb tanulmány veszi azonban figyelembe a szintén rendkívül lényeges alsó határérték bevezetésének szükségességét. A túl alacsony lipofilitású komponens azonban túl kis permeabilitással fog rendelkezni, így a molekula szöveteken, membránon vagy akár vér-agy gáton történő penetrációja gátolt lesz. A Waring tanulmány foglalkozik ugyan ezzel a kérdéssel is, azonban pontosan emiatt egy meglehetősen szűk CLOGP-tartományt jelöl ki ideális lipofilitási tartományként. A publikáció szerint ezen tartományon belül megtalálható molekulákról jó közelítéssel állíthatjuk (amennyiben molekulatömegük is ideálisnak nevezhető), hogy ADME(T) szempontból hatékony komponensekről van szó. Timmermann szintén alátámasztotta az optimális lipofilitási tartományról szóló elméleteket, hiszen publikációjában konkrét partíciós koefficienst, logP = 2,16 értéket jelöl meg ideális lipofilitásként [73]. Azon vizsgálatok, amelyek a lipofilitás és biológiai hatékonyság között parabolikus összefüggést keresnek adott molekulacsaládra vonatkozóan, alkalmasak lehetnek felső és alsó határértékek kijelölésére, tehát a korreláció analízis ideális kiindulási pont lehet optimalizációs célok eléréséhez. A vér-agy gáton át történő penetráció kérdésével és ennek optimális lipo-, és foszfolipofilitási

tartománnyal

való

kapcsolatával

szintén

több

kutatócsoport

foglalkozott már [66][67][68][69]. Ha körbejárjuk ezt a kérdéskört is, ismételten bizonyítást nyer a felső és alsó logP határérték meghatározásának szükségessége. A kis lipofilitású molekula ugyanis az előzőeknek megfelelően nem képes átjutni a vér-agy gáton, viszont a túl nagy lipofilitású könnyen csapdába esik a membrán belsejében [74]. Ezekben az esetekben is a parabolikus korreláció-keresés nyújthat megoldást az optimális tartomány kijelölésére. A különbség a lipofilitás és foszfolipofiltás között a jelenlevő interakciók számában és erősségében van. Ez azonban nem változtat az előbbiekben levezetett tényeken, az optimális foszfolipofilitási tartomány kijelölése ugyanolyan szempontok szerint történhet, mint a lipofilitásé. Ezt bizonyítja az is, hogy a lipo- és foszfolipofilitás között jó

közelítéssel

várhatunk

el

lineáris

korrelációt [43][75].

Természetesen

a

kölcsönhatások komplexitása eltér a két mennyiség esetén, de ez csupán az adott

19

gyógyszermolekulák fázistartózkodási idejének hosszán változtat. A tendencia továbbra is megmarad, a lipofilebb molekula több, míg a kevésbé lipofil kevesebb időt tölt el az adott állófázison [45]. A lipofilitás mellett a foszfolipofilitás is egyre elterjedtebben használt egyes molekulák biológiai aktivitásának becslésére. Ezzel a mennyiséggel az előbbiekben leírtaknak megfelelően a permeabilitás is jellemezhető és jó közelítéssel következtetni tudunk az egyes molekulák sejtmembránon keresztül történő penetrációjának képességére [7]. A gyógyszerfelvétel, illetve felszívódás foszfolipofilitással való lineáris kölcsönhatásáról több irodalmi hivatkozásban is olvashatunk. Azonban fontos tisztázni azt is, hogy a foszfolipofilitást sem lehet határtalanul növelni egy adott gyógyszermolekula esetén a korábban, a lipofilitás kapcsán felsorolt tényezők miatt. A cél itt is az optimalizáció, az alsó és felső határ kijelölése [76][77]. 1.4

Permeabilitás

1.4.1 A permeabilitás fogalma Az ADME(T) paraméterek közül manapság egyre nagyobb hangsúlyt kapó, szintén az abszorpció jellemzésére használt mennyiség a permeabilitás, amely mennyiség segítségével az adott molekula membránon történő átjutása közvetlen módon leírható. Ezzel a mennyiséggel elsődlegesen az orálisan alkalmazott gyógyszermolekulák gasztrointesztinális felszívódását tudjuk jellemezni. Már a kutatások korai fázisában el kell döntenünk az adott gyógyszerjelölt komponensről, hogy az orálisan adagolható-e, azaz képes-e felszívódni a bélen keresztül. Ez az egyik legfontosabb, biológiai hozzáférhetőségről információt adó paraméter [78]. A permeabilitás vizsgálatokkal alapvetően a gyógyszermolekulák sejtmembránon, illetve szöveten át történő aktív és passzív transzportját tudjuk jellemezni. Passzív transzport folyamatokról beszélhetünk olyan esetekben, amikor sejtes pumpa mechanizmus nem játszik szerepet, a hajtóerő pedig a koncentráció-gradiens. A folyamat gyakorlatilag plusz energia befektetést nem igényel, így akár élettelen környezetben is lejátszódhat. Az aktív transzport végbemenetelét már az ATP bontásából vagy elektrokémiai gradiensből származó energia segíti elő, hiszen ezen folyamatok általában a koncentráció-gradienssel ellentétes irányban játszódnak le.

20

Az aktív és passzív transzport folyamatok típusai [79]: Aktív transzport: -

Carrier-mechanizmus, amely során hordozó, többnyire enzim jellegű fehérje molekulák végzik az adott molekula membrán egyik oldaláról másikra történő szállítását.

-

Endocitózis, amely során membránhólyagba zárt molekula jut be a sejtmembránba.

-

Exocitózis, mely során a molekulák vezikuláris felszabadulása, sejtből való kiürülése következik be.

-

Nem potenciálfüggő ioncsatorna, amely esetben két integráns membránfehérje biztosítja a membránon történő átjutást.

Passzív transzport: -

Diffúzió, amelyet röviden spontán lejátszódó koncentráció kiegyenlítődésnek, homogenizálódásnak nevezhetünk.

-

Ozmózis révén szintén spontán homogenizáció következik be, de ezúttal egy féligáteresztő hártyán keresztül. Azaz ebben az esetben az oldószer molekulák áramlanak a töményebb oldat felé.

-

Facilitált diffúzió, amely karrier mediált folyamat, azonban energiát nem igényel, hiszen hajtóereje a koncentráció-gradiens.

-

Potenciálfüggő ioncsatornán történő áramlás, amely során két membránfehérje biztosítja a membránon történő átjutást, a hajtóerő pedig a sejt belseje, illetve külső része közötti potenciálkülönbség.

-

Filtráció, amely során a molekula a membrán pórusain, illetve intracelluláris réseken keresztül jut át a sejtmembránon.

1.4.2 Permeabilitás-mérés A transzport folyamatoknak tehát számos formája létezik. Mielőtt a gyógyszer jelölt molekulák transzport folyamatainak formáit elemeznénk, a legfontosabb annak eldöntése, hogy az adott komponens egyáltalán képes-e áthatolni a sejtmembránon. Láttunk már erre irányuló vizsgálati formákat, már ismert a foszfolipofilitás mérés is, amely kitűnő eszközként szolgálhat a molekulák permeabilitásának megbecsléséhez

21

[78], azonban az előzetes lipofilitással kapcsolatos méréseket fontos alátámasztanunk direkt permeabilitás mérésekkel is. A permeabilitási vizsgálatokat több különböző sejtvonalon, illetve mesterséges membránon lehet elvégezni. A két leggyakrabban használt módszer a PAMPA, illetve a Caco-2 heterogén humán epiteliális kolorektális adenokarcinóma sejtvonalon végzett eljárás (2. táblázat). A két módszer közötti nagy különbség, hogy az előbbi eljárással a kutatások kezdeti szakaszában tudjuk kiválóan modellezni egy adott molekula bizonyos koncentrációjú

oldatának,

adott

idő

elteltével,

passzív

transzporttal

történő

transzcelluláris áthaladását a membránon, míg az utóbbi módszer a passzív és aktív transzport folyamatokról együttesen ad információt és transz- és paracelluláris transzport egyaránt mérhető vele. Mivel a korábbiakban leírtaknak megfelelően a passzív transzport akár élettelen környezetben is lejátszódhat, így a PAMPA mérés nem celluláris körülmények között, hanem a sokkal könnyebben kezelhető mesterséges membrán segítségével zajlik. A módszer nagy előnye, gyógyszergyárak számára vonzó tulajdonsága még a könnyű automatizálhatóság (HTS). A Caco-2 módszer már élő, sejtes környezetben ad információt a molekulák penetrációs képességéről. Ez természetesen megnehezíti, de sokkal komplexebbé is teszi a permeabilitás vizsgálatot [80]. 2. táblázat: A PAMPA és a Caco2 sejtes módszer összehasonlítása Szempontok

PAMPA

Vizsgált folyamat

Passzív transzport mérése

Időigény

Gyors, könnyebben kivitelezhető

Automatizálhatóság

Automatizálható

Alkalmazott membrán

Mérés mesterséges membrán rétegen Az alkalmazott lipidösszetételtől és mikrotálca típustól függő membránréteg Alacsonyabb költségigényű

Az alkalmazott membrán jellemzői Költséghatékonyság

22

Caco-2 Passzív és aktív transzport folyamatok együttes mérése Időigényes, sok előkészületet igényel A sejtek folyamatos figyelmet igényelnek, nem automatizálható, laborfüggő Mérés egyrétegű sejtkultúrán Vastag, kevertetés nélküli vizes fázis a sejtek körül [81] Drága kivitelezésű

Mindkét módszernek megvannak tehát az előnyei és hátrányai is. Figyelembe véve azonban, hogy a gyógyszer molekulák mintegy 80%-a passzív transzport révén jut be az intesztinális epiteliumba [82], logikus választásnak tűnik a PAMPA módszer elvégzése mintegy a molekulák előszűrésére. A mérési eljárás igen sokféle módon kivitelezhető. A leglényegesebb paraméter a membrán elkészítésének módja, az alkalmazott lipid, sőt helyenként lipid-mentes membránalkotó réteg összetétele, vastagsága [81][83][84]. Ezen tulajdonságok kulcsfontosságúak és laboratóriumról laboratóriumra változnak. A mai napig nincs egy általánosan, mindenki által használt eljárás. A Kansy és társai által alkalmazott tojás lecitintől [78] vagy a Faller által kidolgozott foszfolipid-mentes hexadekán folyadékrétegtől kezdve [81], a Sugano által használt 5 lipidkomponensből álló keverékig [85], a módszerek széles tárházából válogathatunk [86][87]. A BD Gentest mindezen tanulmányokra alapozva megalkotta, az általunk is alkalmazott, saját fejlesztésű PAMPA mikrotálcáját. A tálca specifitását adja a lipid-olaj-lipid hármas réteg, illetve az oldószerként alkalmazott illékony oldószer. A tálca már a lipid réteggel együtt kerül forgalmazásra. Ennek hátránya lehet, hogy esetlegesen nem frissen készült membrán mikrotálcát kapunk kézhez, illetve, hogy a tálca előéletét nem ismerjük. Tárolása -20 ºC-on történik, amennyiben a szállítás során ez a hőmérséklet nem biztosított, a tálca működése nem megbízható. Előnye azonban a hagyományos mikrotálcával szemben, hogy a pórusokkal is rendelkező membrán nincs teljes mértékben átitatva az oldószerként használt folyadékkal, ilyen módon tehát nem képződik egy extra, a sejtmembránban fel nem lelhető gát a molekulák szabad áramlása előtt, illetve eltekinthetünk a lipidrészecskék oldószerben történő nem homogén eloszlásából adódó hibafaktortól. A tradicionális és a BD-fejlesztette tálca közötti különbségek a 3. és a 4. ábrán láthatóak.

23

3. ábra: Tradicionális PAMPA mikrotálca A BD által forgalmazott PAMPA mikrotálca esetén az eltérés elsődlegesen a lipidréteg elhelyezkedésében rejlik. Ebben az esetben ugyanis egy hidrofób olaj réteget felülről és alulról is körülvevő lipidréteg figyelhető meg. Az olaj rendkívül fontos szerepet tölt be, biztosítja a mikrotálca stabilitását. Ilyen módon tehát egy teljesen homogén, csak és kizárólag lipid és olaj részecskékből álló mesterséges membránhoz jutunk. Mindemellett az lipid-olaj-lipid hármas kitűnően tudja modellezni a membrán kettős réteget, hiszen az olaj képviseli a membrán kettős réteg hidrofób belső részét, az amfifil lipid pedig a vizes fázissal kettősréteget képező egységként szimulálja a membrán külső oldalát. További előnye a módszernek, hogy egy igen vékony lipid, illetve ultravékony olaj réteg áll rendelkezésünkre [88]. Ezzel a mikrotálcával tehát a mérések lerövidíthetők, hiszen a molekulák penetrációs ideje lecsökken, illetve szerkezetileg elkülönült rétegek alkotják a membrán struktúrát.

4. ábra: BD Gentest Mikrotálca A mérések detektálására több lehetőség is van. A legegyszerűbb eljárás a spektrofotometriás UV detektálás. A módszer hátránya, hogy kevésbé szelektív és

24

pontos, illetve, hogy nem UV-aktív molekulák mérésére nem alkalmas. Előnye a könnyű automatizálhatóság, illetve a gyors mérési lehetőség. Az érzékenység természetesen az adott komponensekre jellemző hullámhosszakon történő méréssel javítható. Előtesztelésre kiválóan alkalmazható módszer. Pontosabb analízist tesz lehetővé a HPLC-DAD, esetleg HPLC-MS módszerek alkalmazása. Az automatizálás ebben az esetben azonban nehezebben megoldható, hiszen minden esetben az adott molekulacsaládra vonatkozó mérési körülményeket szükséges beállítanunk, így a folyamat sokkal időigényesebb, azonban cserébe érzékenyebb detektálásra, pontosabb analízisre van lehetőségünk. 1.4.3 A permeabilitás-mérés jelentősége a gyógyszerkutatásban, a permeabilitás ADME(T) paraméterként betöltött pozíciója Az IAM oszloppal mért eredmények támpontul szolgálhatnak a PAMPA mérés során [89], azonban a két mérési módszer között alapvető különbségek vannak. Az IAM oszlopon ugyanis egy dinamikus, folyamatosan változó rendszer segítségével tudunk következtetéseket

levonni

a

minták

sejtmembránnal

történő

kölcsönhatására

vonatkozólag. A PAMPA vizsgálat ezzel szemben egy állandó, egyensúlyi rendszert modellező, elsődlegesen a sejtmembránon történő áthatolási képességről információt adó módszer. Szintén alapvető különbség, hogy amint az az 1.4.2 fejezetben olvasható, a BD-mikrotálcákon csupán kis mennyiségű, illékony oldószerréteg foglal helyet, míg az IAM oszloppal történő mérés során folyamatos a szerves és szervetlen oldószer jelenléte, ami a pH-t is nagyban befolyásoló körülménynek számít. Hasonló a helyzet a fordított fázisú kolonna esetén is, ahol ugyan nem találunk foszfatidilkolin csoportokat, de az itt mért lipofilitási értékekből is hasznos információkhoz juthatunk a molekulák permeabilitására, dinamikus rendszerben történő viselkedésére vonatkozóan [81]. Az előző összefoglalás alapján az egyes permeabilitás mérési módszerek közötti eltérés elsősorban az alkalmazott lipid oldat összetételében rejlik. A molekulák lipofilitásának ismerete a mérések előtt igen lényeges, főként abban az esetben, ha a vizsgálatokat oldószerrel és lipiddel átitatott (régi típusú tálca, 3. ábra), nem pedig rétegesen elhelyezkedő lipid réteget tartalmazó (BD tálca, 4. ábra) mesterséges membránnal végezzük. Még a BD által forgalmazott mikrotálcával sem tudjuk teljes mértékben kivédeni a membrán felületén jelenlevő vizes fázis modifikáló hatását. A legpontosabb

25

permeabilitás-meghatározást a már az előzőekben tárgyalt, közepes, azaz ideális lipo-, illetve foszfolipofilitású molekulákon végezhetjük el. A mérés egyes módszereknél kevésbé, másoknál nagyobb mértékben fellépő hibája ugyanis, hogy a túl kicsi vagy túl nagy lipofilitású molekulák permeabilitása helyenként pontatlanul határozható meg csupán. A jelenlevő vizes fázis ugyanis sok esetben akadályozza a nagyobb lipofilitású molekulák membránig történő eljutását, így azok permeabilitása a valódinál kisebbnek tűnhet, a kisebb lipofilitású molekulák pedig könnyedén be tudnak jutni a vizes fázisba, így permeabilitásuk a valódinál nagyobbnak minősül. A hiba természetesen nagy mértékben lecsökken abban az esetben, ha az alkalmazott oldószer illékonyabb, és a lipid részecskék rétegezve, nem pedig az oldószerben diszpergálva helyezkednek el a pórusok között. Az előzetes lipofilitás mérések azonban valóban elengedhetetlenek, hiszen segítségükkel akár lehetőségünk is nyílik a szélsőséges partíciós koefficienssel bíró molekulák előszelektálására. A PAMPA mérések nagy előnye még, hogy a kísérlet több hőmérsékleten és különböző pH-értékeken is elvégezhető. A legáltalánosabban használt pH a 7,4 és a 4,0, a legtöbbször

alkalmazott

hőmérséklet

pedig

szobahőmérséklet

vagy

37

ºC.

Természetesen a pH és a hőmérséklet változtatása a molekulák permeációs készségére is hatással van. A tapasztalatok szerint a pH elsősorban a bázikus és savas karakterű vegyületekre van hatással, hiszen az előbbi permeabilitása nő, az utóbbié viszont csökken csökkenő pH-értékkel, a semleges molekulák penetrációs képessége azonban nem módosul nagy mértékben a pH-változtatás hatására. A hőmérséklet emelkedése viszont egyértelműen megnöveli a permeabilitást. Az új típusú, BD által fejlesztett PAMPA mikrotálca mesterséges membrán rétege sokkal vékonyabb, így gyorsabban átjárható, az inkubációs idő jelentősen lerövidül. Míg a manuálisan készített mesterséges membrán esetén ez legalább 16 óra, addig a gyárilag előállított mikrotálcánál már 5 óra is elegendő. 1.4.4 A számítás menete A permeabilitási mérésből több különböző, az adott gyógyszermolekulára jellemző értéket tudunk kiszámítani. Az általunk alkalmazott spektrofotometriás detektálás szintén lehetővé teszi ezen paraméterek meghatározását. Az így kapott adatokkal történő számítás menete a következőképpen zajlik:

26

A mért abszorbancia adatokból elsőként a donor és akceptor mikrotálcán levő oldatkoncentrációt (cD és cA) határozzuk meg: cD  c0  c A  c0 

AD  Apuffer A0  Apuffer AA  Apuffer A0  Apuffer

ahol c0 a kezdeti mintakoncentrációt, AD és AA a donor és akceptor mikrotálcán mért abszorpciót, Apuffer pedig az alkalmazott pufferoldat abszorpcióját jelöli adott mérési hullámhosszakon.

Ezen adatok ismeretében meghatározható a permeabilitás (Pe):   ln 1  c A cekv   Pe  S   1  1   t VA   VD ahol cekv az ekvilibrium koncentráció: cekv 

cD  VD  c A  VA VD  VA

VD a donor térfogat (0,3 ml), VA az akceptopir térfogat (0,2 ml), S a membrán szűrőfelülete, t pedig az inkubációs idő másodpercben mérve. Az így kapott mennyiségekből tehát következtetni tudunk a mintakomponensek membránon történő átjutásának valószínűségére. A kapott permeabilitás-értékek alapján pedig az adott vegyületeket permeabilitásuk szerinti csoportokba sorolhatjuk aszerint, hogy a mérés során a mintakomponensek az alsó vagy a felső mikrotálcára kerültek: Alsó (donor) mikrotálcára pipettázott komponensek esetén: Pe > 1,5  10 6 cm/s (azaz logPe > -5,82): nagy permeabilitású molekula Pe < 1,5  10 6 cm/s (azaz logPe < -5,82): kis permeabilitású molekula Felső mikrotálcára (akceptor tálcára) pipettázott komponensek esetén: Pe > 4,0  10 6 cm/s (azaz logPe > -5,40): nagy permeabilitású molekula Pe < 4,0  10 6 cm/s (azaz logPe < -5,40): kis permeabilitású molekula 27

Permeabilitás vizsgálat esetén nincs egzaktan ideális permeabilitásúnak nevezett molekula. A vegyületekről alapvetően azt tudjuk meg, hogy azok kis vagy nagy permeabilitásúak-e. Ez alapján pedig ki tudjuk szelektálni az ideálisnak és nem ideálisnak tartott gyógyszer jelölt molekulákat. 1.5

Biológiai vizsgálatok

A gyógyszerkutatás farmakokinetikai fázisában, a biológiai vizsgálatok elsődlegesen sejttenyészeten történnek. A cél, hogy adott humán, illetve állati eredetű sejtvonalakon megállapítsuk a gyógyszerjelölt molekulák biológiai hatékonyságát. Mivel munkám elsődlegesen antitumor vegyületek vizsgálatára irányult, így az inhibitorok biológiai hatékonyságát

elsődlegesen

antiproliferációs,

citosztatikus,

illetve

citotoxikus

hatásukkal jellemeztem. A citosztatikumok hatására a sejtek nem szaporodnak, nem proliferálnak tovább, életképességük megváltozik. A citotoxikus anyagok hatására pedig a sejtek el is pusztulnak. Egy gyógyszerjelölt molekula inhibíciós képességét számszerűen jellemezhetjük az IC50 értékkel, amely azt az inhibitor-koncentráció értéket adja meg, amely elégséges ahhoz, hogy egy adott biológiai folyamatot gátoljunk. A mi esetünkben az IC50 érték azt az inhibitor-koncentráció értéket jelentette, amely hatására az adott sejtkultúrában, adott inkubálási idő után, a kezelt mintában a sejtek aránya a kontrolhoz képest 50%. Az antiproliferációs vizsgálatokat követően, több ígéretesnek vélt molekula apoptotikus hatását is analizáltuk. Apoptózis vagy programozott sejthalál definíciójával, folyamatával az 1.5.2 fejezetben foglalkozunk. Vizsgálataimat elsődlegesen flavonoid típusú, illetve flavonoidokból származtatható molekulák hatásmechanizmusának tanulmányozása köré építettem. A flavonoidok későbbi tárgyalása során több referenciában is utalni fogok ezen molekulák igen sokrétű biológiai hatékonyságára. A flavonoid molekulák sejtes tesztekben bebizonyított antiproliferációs hatása mellett [90], fontos kiemelni egyes flavonoid származékoknak, a ROS termelő NADPH oxidáz enzimet gátló sajátságát is [91]. Ebből adódóan vizsgálataink során egyes flavonoidok sejtes vizsgálattal mért NOX-4 gátló hatása és azok farmakokinetikai tulajdonságai közötti összefüggéseket is kutattuk.

28

1.5.1 Antiproliferációs vizsgálat Az antiproliferációs vizsgálatok között alapvetően kétféle vizsgálatot, MB és MTT tesztet különböztetünk meg. Mindkét teszt egy olyan, az élő sejtben lévő különböző dehidrogenáz és reduktáz enzimek aktivitásán alapuló kolorimetriás módszer, amely az antitumor inhibitor molekulák, sejtek életképességének megváltozására gyakorolt hatását méri az adott sejtvonalon. Mindkét vizsgálat hátterében színreakcióval kísért redox folyamat áll, melyek során a kulcsszerepet játszó leuko MB, az élő sejtek mitokondriális dehidrogenáz enzimei révén oxidálódik (5. ábra), az MTT pedig az élő sejtekben található mitokondriális reduktázok hatására redukálódik (6. ábra). Az MB teszt során a redukált formában színtelen leuko MB kék színű lesz, míg az MTT tesztben a sárga 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid bordó formazánná alakul át.

5. ábra: Metilénkéken lejátszódó redoxi folyamat

6. ábra: Tetrazolon lejátszódó redoxi folyamat

Így könnyen mérhető tehát a sejtek metabolikus aktivitása, illetve az élő sejtek aránya. A kolorimetriás meghatározás által számszerűen a kezelt sejtek és a kontroll sejtek általi

29

abszorpció aránya (T/C%) meghatározható. Az így kapott T/C% értékeket a koncentráció függvényében ábrázolva kiszámítható az IC50-érték. Az ilyen jellegű vizsgálatok elsőrendűek korai ADME(T) karakterizálás szempontjából, hiszen a vizsgálatok viszonylag rövid idő alatt végrehajthatóak és különböző eredetű daganatos sejtvonalak széles skáláján elvégezhetőek. Ezzel az eljárással tehát képet kapunk arról, hogy mely molekulák képesek a sejtek metabolikus aktivitásának modifikálására. A vizsgálat azonban általános jellegű, hiszen minden sejtre, egészségesre és betegre egyaránt vonatkozik. A következő lépcső tehát, hogy eldöntsük, a hatásosnak vélt molekula apoptotikus vagy toxikus sajátságú-e. Apoptózis vizsgálatoknak azonban már csak az előzetes „gyógyszerjelöltségi” vizsgálatokban megfelelőnek bizonyult molekulákat vetjük alá. Az ilyen vegyületeket pedig az MTT vagy MB teszt alapján kapott biológiai adatok fiziko-kémiai jellemzőkkel - úgymint lipo- vagy foszfolipofilitás, illetve permeabilitás - történő összevetése révén választjuk ki. Itt kap jelentős szerepet a korábbiakban már említett korrelációanalízis, illetve az optimális lipo- és foszfolipofilitási tartományok kijelölése. A fiziko-kémiai és antiproliferációs

szempontból

ideálisnak,

azaz

biohozzáférhetőnek

kiválasztott

molekulákat analizáljuk tehát tovább farmakokinetikai, illetve farmakodinámiai oldalról is [45]. 1.5.2 Apoptózis vizsgálatok A normál MB vagy MTT tesztek által kapunk némi utalást arra, hogy az adott inhibitor toxikusan vagy apoptotikusan öli-e a sejteket, hiszen azok a molekulák, amelyek hirtelen,

adott

koncentráción

bekövetkező

sejtszámcsökkenést

idéznek

elő,

feltételezhetően toxikusak lesznek, míg a lassan, a koncentrációval arányos sejtszámcsökkenést eredményező inhibitorok esélyesebbek arra, hogy apoptotikusak legyenek. Az apoptózis, más néven programozott sejthalál már az 1960-as évek óta tárgyalt jelenség. Igen fontos szerepet játszik az élő szervezetben végbemenő számos folyamatban. A sejtek halálát jellemző folyamatokat, a nekrózis és az apoptózis közötti különbséget először 1972-ben definiálta Kerr, Wyllie és Currie [92]. Az apoptózisnak számos morfológiai jele van. A programozott sejthalál a sejt illetve pontosabban a citoplazma összezsugorodásával, az endoplazmatikus retikulum

30

megnyúlásával, a kromatin kondenzációjával és sejtmag köré rendeződésével kezdődik. Ezt követően a plazma membrán egy ún. vezikuláris túlnövekedésen (membrán „blebbing”: membrán hólyagok keletkezése, membrán asszimetria felbomlása, foszfatidil szerin a belső membrán felületéről a külső felé fordul) megy keresztül, amelyet kis apoptotikus, plazma membránnal körbevett testek képződése követ. Ezek a citoszollal, kondenzált kromatinnal és egyéb sejtösszetevőkkel megtöltött testek pedig fagocitózis útján távoznak a szövetből. Apoptózis útján tehát úgy ürülnek ki a halott sejtek a szervezetből, hogy azok az esetek többségében nem vagy sokkal kisebb mértékben idéznek elő gyulladást. A nekrózis ettől eltérő folyamat. A plazmamembrán vezikuláris túlnövekedése itt is megfigyelhető, azonban a membránon ekkor apró pórusok képződnek, amely a sejt tartalmának membránon kívülre történő ürüléséhez vezet, ez pedig gyulladásos folyamatot indít be. A folyamatokat a 7. ábra mutatja be. Apoptózis sejtzsugorodás, kromatin kondenzáció, ER megnyúlás

Vezikuláris túlnövekedés

Az apoptotikus testecskék fagocitózisa

Élő sejt

Nekrózis Sejtduzzadás

Gyulladással járó sejtlízis Vezikuláris túlnövekedés, a plazmemembrán integritásának megszűnése, a sejt taralmának membránon kívülre ürítése

7. ábra: Az apoptózis, illetve a nekrózis folyamata [92][93][94]

31

Nagyon fontos szempont tehát, hogy a gyógyszermolekula a daganatos sejtek apoptotikus halálát idézze elő. Ez szintén egy olyan kritérium, amelyet lényeges még a kísérletek kezdeti szakaszában tisztázni. 1.5.3 Fénymikroszkópos vizsgálat A vizsgálat során az adott inhibitor különböző koncentrációjú oldatával kezelt sejteken, adott időtartam alatt bekövetkező morfológiai változásokat elemezzük. Ezzel az eljárással elsődlegesen morfológiai adatokat nyerünk. A sejteken a fent felsorolt apoptózisra utaló morfológiai jeleket vizsgáljuk. Az egyes sejtek összezsugorodása, szomszédjaiktól való elszakadása, médiumban való úszása mind-mind apoptózisra utaló jel lehet. 1.5.4 PARP (poli (ADP-ribóz) polimeráz) fragmentáció Western blotos követése A PARP nevű enzim élettani szerepe igen jelentős. Génexpresszióban, replikációban és még sok más biológiai folyamatban betöltött szabályozó funkcióján kívül, jelentős szerepe van a sejthalál folyamatában is. A PARP enzim egy- vagy kétszálú DNS-szál törés esetén DNS hibajavításban vesz részt (8. ábra). Amennyiben kis mértékű DNS-szál sérülés következik be, a PARP enzim hisztonokhoz kapcsolódva önmagán, illetve a hisztonokon egy polimerizációs folyamatot indít be, mely során nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+) molekulát először nikotin-amidra és ADP-ribózra hasítja, majd az ADP-ribózt akceptor fehérjékhez kapcsolva beindítja az ADP-ribóz polimerizációs folyamatát. A poli-ADPribózilált hisztonok ezáltal tehát fel tudják lazítani a DNS szerkezetét, így a hibajavítás könnyebben kivitelezhetővé válik [4] [95].

32

8. ábra: A PARP fragmentálódásának folyamata A PARP azonban csak abban az esetben képes DNS hibajavításra, amennyiben a DNSszál csak kis mértékben károsodott. Nagyobb károsodás esetén általában két lehetőség van. Az egyik az apoptotikus, a másik pedig a nekrotikus sejthalál [96]. Az előbbi akkor következik be, amikor a DNS-szál nem javítható, illetve amikor a PARP nem működik, az utóbbi pedig, amikor erőteljes, több DNS-szálat is érintő károsodás következik be (pl. ROS hatására), amely során a túl nagy PARP aktiváció túl nagy mennyiségű NAD+ molekulát kötne le, leállítva ezzel több, a sejt működéséhez szükséges biológiai folyamatot. Mivel az apoptózis és a PARP általi hibajavítás is igen energiaigényes folyamat, így az egyik csak akkor tud akadálymentesen működni, ha a másik ki van kapcsolva. A daganatos sejtek elpusztításában folytatott harcban a korábban említett okok miatt az apoptotikus sejthalál beindítása a cél, ezen folyamat megvalósulásának egyik formája, ha az apoptózis mediátoraként funkcionáló ún. kaszpázok lehasítják a PARP enzimet. PARP enzim nélkül a DNS hibajavítás igen időigényes folyamattá válik, mindemellett pedig NAD+ molekula DNS hibajavításban betöltött szerepétől mentesül, így energiája teljes részét az apoptotikus folyamatra tudja fordítani. Az az inhibitor molekula tehát, amelynek hatására a PARP enzim lehasítása bekövetkezik, azaz amely beindítja az apoptózist elindító kaszpázok működését, jó eséllyel nevezhető apoptotikus hatásúnak. A PARP lehasadásának tényét Western blot módszer

33

segítségével tudjuk bizonyítani. A 116 kDa méretű PARP 89 kDa-nál megfigyelhető fő fragmentumnak megjelenése jó eséllyel az apoptózis bekövetkeztének jelzője. 1.5.5 Áramlási citometria Áramlási citométerrel az egyes individuális sejtek és az egész populáció vizsgálatára is lehetőségünk van. A módszerrel morfológiai, a sejt nagyságára, granuláltságára vonatkozó elemzést végezhetünk. Az inhibitorral kezelt sejtek vizsgálata a sejtek permeabilizásával kezdődik. Ezt követően történhet meg a festék (esetünkben propidium-jodid) sejtbe jutása, illetve a jelölt sejtek detektálása. A fragmentált DNS-t tartalmazó sejtállomány mérése során több, különböző mérettartományba eső sejtpopulációt kapuzunk ki. Eszerint megkülönböztetjük a G1-, az S- és a G2M-frakciót, illetve a számunkra legérdekesebb subG1 frakciót [97]. Nevéből is következően ez utóbbi tartalmazza a legkisebb DNSfragmenseket, egészen pontosan az apoptotikus sejteket reprezentáló DNS-töredékeket [98]. A DNS profilból tehát következtetni tudunk az apoptózis mértékére adott inkubálási idő után, az inhibitor adott koncentrációjú oldatával kezelt sejteken [99]. Ez tehát minden esetben a kiindulási pont. Szintén segít a már az előzőekben tárgyalt optimális lipo- és foszfolipofilitási tartomány kijelölése, amellyel tehát megkapjuk azon molekulákat, amelyek nem csupán antiproliferációs, hanem apoptotikus képességgel is bírnak. 1.5.6 NOX-4 gátló hatás vizsgálata 

NOX enzim gátlás jelentősége

Rengeteg kutatás folyik a manapság egyre híresebbé, illetve hírhedtebbé váló ROS gyökökről, azok keletkezéséről, illetve befogásának, gátlásának lehetőségéről. A ROS molekulák több folyamat révén is létrejöhetnek a szervezetben. Alapvetően a szervezet bizonyos

biológiai

folyamataihoz,

apoptózishoz,

jeltovábbításhoz,

sejtek

szaporodásához szükséges molekulákról van szó. A velük kapcsolatos problémák természetesen akkor merülnek fel, amikor azok a szervezetben túl nagy számban vannak jelen. A légzési láncban, az oxigén átalakulása révén sok esetben víz mellett szuperoxid (egy

ROS

molekula)

is

keletkezik,

34

emellett

limfociták

baktériumokkal,

mikroorganizmusokkal folytatott küzdelme során is nagy számban jönnek létre és nem utolsósorban környezeti hatások, helytelen táplálkozás és a dohányzás is megnöveli a ROS molekulák számát a szervezetben. A 90-es évek végétől egyre több tanulmány megállapította, hogy a ROS molekulák egyik legfőbb termelője elektronáramlás révén, a NADPH oxidáz és annak számos izoenzim formája. A ROS molekulák, mint például a szuperoxid vagy a szervezetbe kerülő fémszennyezők révén szuperoxidból keletkező hidroxil-gyökök rengeteg különböző betegség előidézői lehetnek. Működésük túlzott aktivitásuk révén sejtmembrán, illetve lipid peroxidáció általi lipidkárosodást idézhetnek elő, roncsolhatják és megváltoztathatják bizonyos proteinek szerkezetét ezáltal lerontva vagy megszűntetve azok enzimfunkcióját, és károsíthatják a DNS-t is, annak mutációját idézhetik elő. Mindezen folyamatok pedig a legkülönfélébb betegségekben játszhatnak szerepet, úgymint szív és érrendszeri megbetegedések, Alzheimer kór, gyulladásos folyamatok, autoimmun betegségek (rheumatoid arthritis, lupusz vagy diabétesz) [100][101][102][103]. A ROS termelők közül kiemelt helyet elfoglaló NADPH oxidáz és annak is legfontosabb, az érfali simaizom és endotél sejtekben lejátszódó legtöbb folyamatban szerepet játszó NOX-4 izoenzim gátlása tehát kulcsfontosságú lehet prevenciós szempontból. A ROS molekulák gátlására a szervezetben működő antioxidáns izoenzimeken kívül alkalmasak lehetnek még kis molekulák. Ezek közül is megkülönböztetünk vízben oldékony (hidrofil) vegyületeket, amelyek a vérben, illetve a szervezetben lévő folyadékokban találhatók meg, és zsírban oldékony (lipofil), membránban lokalizált tagokat [103]. A molekulák lipofilitásának kulcs szerepe lehet a NOX-4 gátlásban is. Egy szerkezet-hatás összefüggés optimalizációval felderíthetők az ígéretesnek vélt NOX gátló molekulák csakúgy, mint az előzőekben tárgyalt antitumor hatásúak. Így tehát az előbbiekben felsorolt vizsgálatoktól teljes mértékben eltérő, nem elsődlegesen apoptózist előidéző inhibitorok fiziko-kémiai karakterizálását is elvégeztük, illetve megkerestük a biológiai inhibíciós hatás ismeretében optimálisnak tekinthető lipo-, illetve foszfolipofilitási tartományt. 

H2O2/Tyr/LPO sejtes mérési módszer

Az eljárást a Semmelweis Egyetemen dolgozták ki Donkó és társai [104]. A módszer alapvetően az antibakteriális aktivitással rendelkező, emlős peroxidáz családba tartozó LPO enzim működésén alapul. Több tanulmány is bizonyította, hogy az LPO

35

alacsonyabb és magasabb rendű élő szervezetekben is képes a tirozin ditirozinná alakítására H2O2 jelenlétében (9. ábra).

9. ábra: Tirozin reakciója H2O2-dal LPO jelenlétében Donkó és munkatársai bebizonyították, hogy ez a reakció kiválóan alkalmazható a NOX enzim által termelt H2O2 mérésére is, hiszen a ditirozin igen érzékenyen detektálható fluoreszcenciásan. Így tehát már kis mennyiségű H2O2 is kimutatható, azaz a NOX enzimatikus aktivitása nyomon követhető a módszer által.

36

2. Célkitűzések Fő célom 4 különböző molekulacsalád fiziko-kémiai jellemzése, illetve az így nyert adatok

biológiai

vizsgálatokból

származó

mérési

eredményekkel

történő

összehasonlítása. A 4 molekulacsalád közé különböző flavonoidokból származtatható, azokkal szerkezetbeli vagy tulajdonságbeli kapcsolatban álló vegyületek tartoznak. A molekulakönyvtárak közül három esetében az egyes tagok antiproliferációs és apoptotikus képességét kívánom jellemezni, míg a negyedik család NOX inhibíciós tulajdonságait,

illetve

ezen

tulajdonságok

fizikai-kémiai

paraméterekkel

való

kapcsolatát vizsgálom meg. Elemezni kívánom az egyes szerkezeti eltérések, szubsztituensek biológiai hatékonyságra gyakorolt hatását, így tehát szerkezet-hatás összefüggés vizsgálatot szeretnék elvégezni az adott molekulacsaládokra külön-külön nézve. Célom továbbá olyan HPLC alapú elválasztási módszerek kidolgozása, amelyekkel az egyes vegyületek szelektíven, gyorsan és érzékenyen detektálhatók, illetve az egyes szerkezeti izomerek, az azonos szubsztituenssel, de eltérő gyűrűtagszámmal bíró komponensek és a szerkezeti izomerek szelektíven, lehetőség szerint alapvonalon elválaszthatók egymástól a szimultán mérésekben. Az így kidolgozott módszerrel a vegyületek lipofilitását is meg szeretném határozni, majd pedig megvizsgálom a számított és mért lipofilitási értékekek között fennálló esetleges korrelációt. Szintén HPLC alapú metódussal jellemezném az egyes molekulakönyvtárak tagjainak foszfolipofilitását és az így kapott eredményeket összevetem a számított lipofilitás értékekkel. A 4 molekulacsalád vizsgálatával továbbá karakterizálni tudom a fordított fázisú, illetve az IAM oszlop közötti különbségeket, illetve hasonlóságokat. A biohozzáférhetőség, illetve gyógyszerfelszívódás jellemzését az előbbi vizsgálatokon kívül permeabilitás-méréssel is el szeretném végezni. Az előző vizsgálatokban összegyűjtött fiziko-kémiai paramétereket sejtes rendszerben mért biológiai tesztekkel megállapított hatékonyságvizsgálat alapján szeretném optimalizálni, kijelölve ezzel az adott gyógyszerjelölt családokra jellemző optimális lipo- és foszfolipofilitási tartományt. A korrelációanalízis alapján szeretném összegyűjteni az ideális antiproliferatív, illetve NOX gátló hatással bíró molekulákat, további vizsgálatok céljából.

37

Az így összegyűjtött adatok alapján szeretnék egy olyan „korai ADME(T)karakterizáláson” alapuló vizsgálatsorozatot kidolgozni, amelynek segítségével költségés időhatékony módon kijelölhetők olyan szerkezeti jellemvonások, optimális lipo- és foszfolipofilitási tartományok, amelyek ismeretében csak a valóban gyógyszer-szerű karakterrel rendelkező molekulák jutnak el a sokkal időigényesebb farmakodinamikai vizsgálatokig.

38

3. Anyagok és módszerek 3.1

Vegyszerek

A trietilamint, AcN-t, ortofoszforsavat, metanolt, etanolt, metilénkék festéket és a szintézisekhez alkalmazott kiindulási molekulákat a Fluka (Buchs, Svájc), illetve a Sigma Aldrich Kft. (St. Louis, MO, USA) szállította. A NOX inhibitor molekulák a Vichem hierarchikusan felépített molekulakönyvtárából, az ott szereplő kináz inhibitorok közül választottuk ki. Az oldatok készítéséhez Elgastat UHP rendszer (Elga Ltd., Bucks, Anglia) által előállított baktériummentes bidesztillált vizet használtunk. A biológiai kísérletekben felhasznált anyagok, sejtek: A431-es humán epidermoid karcinóma sejtvonal (ECACC No. 85090402, European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, Anglia), PARP Ab egér antitest (Cell Signalling Technology, Inc. Danvers,

MA,

USA),

peroxidázzal

jelölt

másodlagos

antitest

(Amersham,

Buckinghamshire, Anglia), propidium-jodid (Sigma Aldrich Kft., St. Louis, MO, USA), tripszin (Sigma Aldrich Kft., St. Louis, MO, USA), DMEM sejttenyésztő médium (Sigma Aldrich Kft., St. Louis, MO, USA), fötális borjú szérum (Sigma Aldrich Kft., St. Louis, MO, USA), penicillin, sztreptomicin, L-glutamin (Gibco Life Sci., Sigma Aldrich Kft., St. Louis, MO, USA) sejttenyésztő flaskák (Corning Rt., Corning, NY, USA), 24 lyukú mikrotálca (Sarstedt Rt., Newton, NC, USA), röntgenfilm (KODAK XOMAT AR FILM, Cedex, Franciaország). 3.2

Vizsgált molekulacsaládok

Munkám célja volt, hogy azonos molekulacsaládba tartozó, illetve hasonló kémiai karakterrel rendelkező molekulakönyvtárakat vizsgáljak, ezáltal lehetővé téve azok összehasonlítását, illetve az egyes szubsztituensek biológiai hatásmodifikáló szerepének feltárását. A négy molekulacsalád közötti közös pont a flavonoidokkal való rokonság. Kutatócsoportunk

már

számos

flavonoid

típusú,

az

általam

is

vizsgált

molekulakönyvtárakhoz hasonló szerkezetű molekulacsaládot vizsgált. Ilyenek voltak a tetralonok [105], Mannich ketonok (MK) [106] vagy a benzilidén-cikloalkanonok [107]. Minden vizsgált molekulacsaládban megtalálható a telítetlen ciklikus keton részlet, amely több szintetikus homoizoflavonoidban is fellelhető. A flavonoidokról manapság

39

már egyre több ismeretanyagot szerezhetünk, hiszen antioxidánsként betöltött szerepük a figyelem középpontjába vonzotta őket. A flavonoidok nagy számban találhatók meg élő szervezetekben. Elsősorban a növények, növényi pigmentek alkotó elemei [108]. Bár antioxidáns, gyökfogó tulajdonságuk a legszélesebb körben ismert biológiai sajátság, ma már tudjuk, hogy antiallergén, gyulladásgátló [109], antibakteriális [110] és sejtes tesztekben bizonyított daganat ellenes hatásuk is van [90]. Összefoglalóan biológiai válasz módosítóknak szokták őket nevezni a rengeteg biológiai folyamatban történő részvételük miatt. Toxikus hatásuk, sok más hasonlóan aktív növényi eredetű hatóanyaggal szemben pedig kisebbnek mondható, így alkalmazásuk, humán táplálkozásba történő beépítésük igen jótékony hatású lehet. A flavonoidok számos pozitív tulajdonságából kiindulva teszteltünk hasonló alap struktúrával rendelkező vegyületcsaládokat. A vegyületcsaládok mindegyike tartalmazott tehát telítetlen keton vagy abból származtatható részletet. Az α,β-telítetlen ketonok számos esetben kiváló gombaölőként szoktak viselkedni [111], de más egyéb hatásuk is ismert. A pontos biológiai hatásmechanizmus ugyan még nem teljesen ismert, de feltételezések már születtek arra vonatkozóan, hogy a keto-csoportnak igen jelentős szerepe van az egyes biológiai folyamatok lejátszódásában. A dolgozat által tárgyalt molekulakönyvtárak a következők voltak: -

izokromanonok (IK-sor)

-

redukált Mannich ketonok (red MK-sor)

-

auronok, tioauronok, szulfonok (Auronok)

-

kromenonok

3.2.1 Izokromanon molekulacsalád A kromanon típusú vegyületek szintén megtalálhatók a természetben. Kinyerésük sok esetben történik növényi eredetű élő szervezetből és számos szintézisúton is hozzájuthatunk ezen molekulákhoz. Fellelhető bennük az α,β-telítetlen keton részlet. Gyógyszerfejlesztési szempontból kiemelt helyet nyertek a számos, természetben előforduló kromanon ismert biológiai hatása és egyéb, akár szintetikus, akár növényi eredetű vegyületeinek, származékainak biológiai folyamatokban betöltött szerepe miatt.

40

Példaként említhetjük a természetben előforduló 6-metil-4-kromanont, amely bengáli birsből (Aegle marmelos) kivont vegyület, és amely jól funkcionált humán tumor sejtvonalakon, beleértve a K562 leukémia sejtvonalat is [112]. A telítetlen ketonok táborába tartoznak a kromanonok izomer származékai, az izokromanonok is (10. ábra). Az izokromanon típusú vegyületeknek is számos biológiai hatása ismert. Ezek közül is a vizsgált 3-izokromanon vegyületek már ismert hatásai a következők: -

antibakteriális hatás,

-

gombaölő hatás,

-

rovarölő hatás,

-

fitotoxicitás (oosoponol, fusarubin, canescin) [113][114][115][116][117].

A 3-izokromanon alapmolekula különböző szubsztituensekkel rendelkező 4-arilmetilén3-izokromanon [118][119] származékokat egy új szemszögből vizsgáltuk. A vegyületek antiproliferációs képességét, az ígéretes molekulák apoptotikus hatását, illetve az egyes fiziko-kémiai paraméterek arilmetilén szubsztituenstől függő változását, ezek biológiai paraméterekkel való összefüggését elemeztük. Szintézis Az arilmetilén származékokat a Pécsi Tudományegyetemen, Dr. Lóránd Tamás kutatócsoportjában állították elő [119]. A szintézis során a szubsztituálatlan 3izokromanon molekula a megfelelő aldehid származékkal Knoevenagel kondenzáció révén egyesül (10. ábra). Katalizátorként piperidin bázist alkalmaztak. A reakció 140 ºC-on, argon atmoszféra alatt játszódott le. A vegyületek tisztítását oszlop kromatográfiás eljárással, majd ezt követően etanolból történő rekrisztallizációval végezték.

10. ábra: 4-arilmetilén-3-izokromanon szintézis

41

3.2.2 Redukált Mannich ketonok A telítetlen ketonok közé tartozó MK vegyületek redukálásával nyert vegyületek biológiai tulajdonságairól kevés ismeretanyag állt rendelkezésünkre. A redukált, illetve oxidált formát összehasonlító közlemény már született, melyben a vegyületeket elsősorban antibakteriális tulajdonságaik alapján vizsgálták, illetve hasonlították össze [120]. A korábbiakban a csoportunk által is vizsgált tetralon, benzilidéncikloalkanon és kromanon vegyületek [105][107] bizonyított antimikrobiális hatása révén elvárt volt, hogy az arilidén cikloalkanonokból Mannich reakcióval szintetizálható MK molekulák hasonló effektus létrehozására lesznek képesek. A molekulák az anyamolekuláknál sokkal vízoldékonyabbak, illetve antimikrobiálisan nagyobb hatásúnak bizonyultak. Gram-pozitív (Staphylococcus saprophyticus, S. aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis) és Gram-negatív baktérium törzsek, illetve Escherichia coli ellen mutattak jelentős hatást [111][121]. Már ezekben a tanulmányokban felmerült a keto csoport funkcionális

jelentősége,

munkacsoportja

így

az MK

tehát

következő

lépésként

vegyületek ketocsoportjának

Lóránd

Tamás

redukciójával red

és MK

molekulákat, azaz aminoalkoholokat szintetizált (11. ábra). A red MK csoport tagjainak tanulmányaink kezdetén még kevesebb biológiai tulajdonsága volt ismert, a Mannich ketonok viszont a gyógyszergyártás kedvelt alapanyagainak bizonyultak. Antimikrobiális hatásukon kívül számos biológiai hatásukról szólnak közlemények. Ilyenek például: -

gombaölő hatás [111],

-

antitumor hatás [122],

-

központi idegrendszeri hatás [123],

-

antivirális effektus [124],

-

antimalaricum [125],

-

anticonvulsivum (görcsoldó) [126],

-

fájdalom- és gyulladáscsökkentő hatás [127].

Szintézis A vegyületek kiindulási molekuláit benzilidéncikloalkanonokból Mannich reakcióval állították elő. A telítetlen és kondenzált gyűrűs MK molekulák hidrogén-kloriddal 42

alkotott komplexéből NaBH4-del történő redukció révén jöttek létre a vizsgált red MK vegyületek (11. ábra). A reakció bázikus körülmények között, 0 ºC-on játszódott le. A vegyületek tisztítása oszlopkromatográfiásan történt [120].

11. ábra: Mannich ketonok redukciója a telítetlen Mannich ketonok példáján bemutatva 3.2.3 Auronok és származékaik Szintén telítetlen keton részletet tartalmazó, a korábbiakban kutatócsoportunk által vizsgált molekulacsaládok körébe illeszthető molekulák az auronok. Számos gyógyszerfejlesztési szempontból fontos tulajdonságuk közül csupán néhányat emelek ki: -

gyulladáscsökkentő hatás, fülcseppként már alkalmazott gyógyszerhatóanyag (Forte füllcsepp),

-

citotoxikus hatás [128],

-

antiasztmatikus hatás [129],

-

antitumor hatás [130],

-

antibakteriális hatás[131].

Az auronok, tioauronok és szulfonok között alapvetően csupán a heterociklusos gyűrű heteroatomjában van különbség (34. ábra). Az egyes vegyülettípusok, adott molekulacsaládon belül az R1 és R2 szubsztituensben térhetnek el egymástól (18., 19., 20. táblázat) [132]. Szintézis a) Auronok A szintézist a Debreceni Egyetemen Patonai Tamás és kutatócsoportja végezte. Kiindulási anyagként 2-hidroxikalkon molekulát választottak, amelyet két féle reakcióban alakították auronná. Az egyik reakcióban reagensként higany(II)-acetátot [133], a másikban trimetilszilil-azidot alkalmaztak (12. ábra) [134].

43

12. ábra: Az auronok szintézisének reakcióegyenlete b) Tioauronok Az 1-tioauronok 1-tiokumaran-3-on molekula és megfelelően szubsztituált benzaldehid forró metanolos oldatának reakciójából piridin katalizátor jelenlétében jöttek létre (13. ábra) [135].

13. ábra: A tioauronok szintézisének reakcióegyenlete c) Szulfoxid: A szulfoxidot tioauron dimetildioxirán általi oxidációja révén állították elő (14. ábra) [136].

14. ábra: A szulfoxid szintézisének reakcióegyenlete

d) Szulfonok: A szulfonok szintézisét kétféleképpen hajtották végre. Az egyik reakcióban a tioauron molekulát dimetildioxiránnal [136], a másikban pedig H2O2/ecetsav eleggyel [137] oxidálták (15. ábra).

44

15. ábra: A szulfonok szintézisének reakcióegyenlete 3.2.4 Kromenonok A kromenon vegyületek szintén a flavonoidok közé tartoznak (39. ábra). Számos, a flavonoidokra jellemző biokémiai hatékonysággal rendelkeznek. Különböző szintetikus módszerekkel előállíthatók, illetve több a természetben előforduló élő szervezetből is kivonhatók [138]. Fontos biokémiai, gyógyszerkutatási szempontból jelentős tulajdonságaik: -

antihiperglikémiás tulajdonság (diabétesz kezelése) [139],

-

potenciális szteroid szulfatáz inhibitor (ezáltal endometriális daganatellenes szer) [140],

-

gombaölő hatás [141],

-

antibakteriális hatás [141],

-

AIDS ellenes hatás [142].

A vizsgált kromenon vegyületeket a Vichem Hierarchikusan Felépített Kémiai Könyvtárából, az ott szereplő, kereskedelmi úton beszerzett kináz inhibitorok közül választottuk ki. 3.3

Módszerek

3.3.1 Fiziko-kémiai módszerek 3.3.1.1 Lipofilitás- és foszfolipofilitás-mérés Mindkét mérést HPLC segítségével végeztük el. A vizsgálatok közötti egyezéseket és különbségeket a 3. táblázat tartalmazza.

45



Mintaelőkészítés:

A minták 0,5 mg/ml-es oldatát AcN : víz (3:1) arányú elegyével készítettük. A minták oldatát ezt követően 0,2 µm Millipore szűrőn szűrtük le. Minden mintát a mérés előtt közvetlenül, frissen készítettünk elő. 

Mérési paraméterek:

A mérésekhez alkalmazott puffer: 0,083M TEAP, amely a 0,083M koncentrációjú foszforsav oldat, trietil-amminnal pufferolt oldata. A pH-beállítást a mérés típusától függően végeztük. 3. táblázat: A különböző molekulacsaládok kromatográfiás analízisénél alkalmazott paraméterek

Mérési adatok

HPLC

Oszlop

Eluensek

Áramlási sebesség Injektálási térfogat det. Toszlop

Lipofilitás-mérés (RP oszlop) IK sor, red MK sor, auronok

Foszfolipofilitás-mérés (IAM oszlop) IK sor, red NOX inh. MK sor, Auronok NOX inh. JASCO 2089 JASCO 2089 Varian 9012 eluens szállító eluens szállító eluens-szállító rendszer, 2077 rendszer, 2077 rendszer, 9065 multi multi Polikróm hullámhossz hullámhossz diódasoros detektor, detektor, detektor, Rheodyne Rheodyne Rheodyne injektor injektor injektor

Varian 9012 eluens-szállító rendszer, 9065 Polikróm diódasoros detektor, Rheodyne injektor Hypersil 5 MOS Gemini C18, 5µm, 250x4,6 5µm, mm (BST Kft., 150X4,6mm Magyarország) A” eluens: 0,083M TEAP, pH 2,25 „B” eluens: 95% AcN + 5% „A” eluens keveréke

IAM.PC.DD2, 12µm, 100X4,6mm

IAM.PC.DD, 12 µm, 150X4,6mm

A” eluens: 0,083M TEAP, pH 7,4 „B” eluens: 95% AcN + 5% „A” eluens keveréke

1 ml/perc

1 ml/perc

20 µl

20 µl

254 nm 20 ºC

254 nm 20 ºC

46



Mérések menete:

Az egyes molekulacsaládok minden tagját elsőként gradiens módszerrel elemeztük (4. táblázat). 4. táblázat: Alkalmazott eluensösszetétel Idő 0 20 25 30

A% 100 0 0 100

B% 0 100 100 0

Az így kapott eredmények alapján megválasztott izokratikus körülmények (5. táblázat) között határoztuk meg a molekulák retenciós idejét. 5. táblázat: Izokratikus kromatográfiás méréseknél alkalmazott eluensösszetétel Vizsgált molekulacsalád IK-sor Red MK-sor Auronok NOX inhibitorok

Eluens összetétel RP oszlop IAM oszlop 40% AcN / 60% „A” 24% AcN / 76% „A” eluens eluens 24% AcN / 76% „A” 24% AcN / 76% „A” eluens eluens 52% AcN / 48% „A” 33% AcN / 67% „A” eluens [132] eluens 40% AcN / 60% „A” 33% AcN / 67% „A” eluens eluens

A holtidőt (t0) a lipofilitás-mérések során víz, a foszfolipofilitás-méréseknél pedig citromsav oldat injektálásával határoztuk meg. A mérések reprodukálhatóságát három párhuzamos méréssel ellenőriztük. Az egyes molekulacsaládokon belül, ahol volt rá lehetőség, a szerkezeti izomerek, az azonos izomériával, de eltérő szubsztituenssel rendelkező tagok és az azonos szubsztituenssel, de eltérő gyűrűtagszámmal rendelkező molekulák szimultán mérését is elvégeztük.

47

3.3.1.2 CLOGP-meghatározás A számítógépes kalkulációhoz fragmens alapú számítást alkalmaztunk. Az alkalmazott program neve 3DNET4W (Vichem Kft., 1022 Budapest, Hermann O. u. 15., [email protected], *2002*) [13] [31] [38] [39]. 3.3.1.3 Permeabilitás-mérés Minden molekulacsalád permeabilitását ugyanolyan körülmények között vizsgáltuk. A molekulák permeabilitását PAMPA módszer segítségével állapítottuk meg. 


A minták 10 mM-os tömény DMSO-ban feloldott törzsoldatát PBS puffer segítségével hígítottuk 200 µM-osra. Az így kapott munkaoldatokkal végeztük a vizsgálatokat. Így a mérés során mindössze 2% DMSO-t tartalmaztak az egyes munkaoldatok, amely a sejtes vizsgálatoknál is határértéken belülinek minősül. 

Mérési paraméterek:

PAMPA mikrotálca: BD Gentest 96 lyukú, előre gyártott PAMPA mikrotálca (sorszám: 353015-G). Detektor: BioTek, Synergy2 Multi-Mode Microplate Reader (UV/VIS detektálás).  Mérés menete (16. ábra): -

Az előre gyártott (membránnal előzetesen, gyárilag ellátott) PAMPA mikrotálcák tárolása -20 ºC-on történt, így használat előtt minden esetben legalább fél órát szobahőmérsékleten álltak, hogy kiolvadjanak.

-

A donor mikrotálca minden üregébe 300 µl, 200 µM mintaoldatot pipettáztunk.

-

Az akceptor mikrotálca üregeibe 200 µl PBS puffer került.

-

Az akceptor mikrotálca lassú mozdulattal történő donor tálcára helyezését követően 5 órás szobahőmérsékleten történő inkubáció következett.

-

5 óra elteltével a 2 mikrotálca szétválasztását követően az akceptor és donor tálcán levő oldatok abszorbanciájának detektálása UV/VIS spektrofotometria segítségével történt.

48

16. ábra: A PAMPA mérés menete 3.3.2 Biológiai módszerek 3.3.2.1 Antiproliferációs vizsgálat (MTT és MB teszt) 

Mérés menete:

-

Az A431 humán epidermoid karcinóma sejteket 10% fötális borjú szérumot, 10000 U/ml penicillint, 200 mM L-glutamint és 10 mg/ml streptomycint (Gibco, Life Sci) tartalmazó DMEM sejttenyésztő médiumban, 37 ºC-on, CO2 alatt tartottuk fenn.

-

A sejtkiültetési idő 16 óra volt.

-

Az inkubálás a vegyületekkel történő kezelés után 48 órán keresztül zajlott.

-

A fixálást 10%-os paraformaldehiddel 0,9% NaCl-oldatban végeztük.

-

A sejtek festését a módszer típusától függően 1% MB-vel, illetve MTT-vel hajtottuk végre.

-

A PBS-sel történő mosást követően mind az apoptotikus, mind a nekrotikus sejtek elváltak a flaska felületétől.

-

Az MB-vel vagy MTT-vel színezett sejteket etanol (100%) : 0,1 M HCl 1:1 arányú elegyében történő oldása után kolorimetriásan, 650 nm-en detektáltuk.

3.3.2.2 Fénymikroszkópos vizsgálat A 24 lyukú mikrotálcán fenntartott A431-es sejteket 200-szoros nagyítású Axiovert 200 mikroszkóppal vizsgáltuk.

49

3.3.2.3 PARP fragmentáció Western blotos követése: 


-

Az A431-es sejteket az inhibitorok 1, 5 és 10 µM-os oldatával kezeltük, majd 24 órán keresztül inkubáltuk.

-

Sejtek lizálása triton-base lízis puffer proteáz és foszfatáz inhibitorokkal kevert oldatával történt, amelyet 10 perces jégen történő inkubáció, illetve 1200 g/percen, 10 percen keresztül, 4 ºC-on végzett centrifugálás követett. Ezt követően a triton-oldékony felülúszó folyadék szolgált a vizsgálat mintaoldatául.

-

A mintaoldatot mintapufferrel kevertük össze, majd 5 percen keresztül forraltuk. Ezután következett a Western blot mérés.



Western blot:

-

A mintaoldat 8%-os nátrium-dodecil-szulfát gélen történő futtatása után a fehérjék blottolását nitrocellulóz membránon végeztük. Elsődleges antitest: totál és hasított PARP elleni nyúl antitest (Cell Signaling

-

Technology Danvers, MA,USA; Kat. szám: 9542, illetve 9541). -

Másodlagos antitest: peroxidázzal jelölt kecske másodlagos antitest (Cell Signalling Technology Danvers, MA, USA; Cat. no:7074). Az előhívást színreakció alapján, Amersham’s kemilumineszcenciás rendszerrel,

-

kemilumineszcencián alapuló (ECL) Western blot detektáló reagenssel, röntgen filmmel (KODAK X-OMAT AR FILM) hajtottuk végre. 3.3.2.4 Áramlási citometria 

Mérés menete -

A sejteket 10% fötális borjú szérumot tartalmazó DMEM sejttenyésztő médiumban, 37 ºC-on 24 órán keresztül tartottuk fenn.

-

A letapadt (kb. 50000 sejt/lyuk) sejteket az inhibitorok 1 és 10 µM-os oldatával kezeltük.

-

-20 ºC-os 70%-os etanollal legalább 1 napig fixáltunk.

-

A fixálást követően 1000 g/percen, 4 ºC-on 10 percig centrifugáltunk.

50

-

Az oldathoz apoptózis puffert (200 mM Na2HPO4 (pH = 7,8)) és 100 µg/ml RNázt adtunk. A festés 10 µg/ml propidium-jodiddal történt.

-

A sub-G1 (apoptotikus sejtek) frakció méréséhez FACS Calibur (BD Biosciences) márkájú áramlási citométert alkalmaztunk. Az analízishez használt program pedig a CellQuest nevet viseli.

3.3.2.5 H2O2/Tyr/LPO sejtes mérés[104] 

Mérés menete [143]: -

Vizsgált sejtvonal: transzfektált HEK 293 FS sejtek. A sejteket 5% fötális borjú szérumot, 1% penicillin-Streptomycint (Gibco, Life Sci) tartalmazó DMEM sejttenyésztő médiumban, 37 ºC-on, CO2 alatt tartottuk fenn.

-

Az inhibitorok 10 µM-os oldatával történő kezelést követő inkubációs idő fél óra volt, 37 ºC-on.

-

Az inkubációs idő leteltével az inhibíciós reakciót 2 mM L-tirozint és 160 mU/ml laktoperoxidázt tartalmazó H-médiummal (50 µl) állítottuk le.

A mérés fluoreszcenciás detektálással (ex = 330 ± 40 nm, em = 405 ± 10nm) történt.

51

4. Eredmények és értékelésük 4.1

Izokromanon molekulacsalád

17. ábra: A vizsgált molekulák alapszerkezete 6. táblázat: A mért és számított adatok táblázatos összefoglalása Vegyület

Szubsztituens

1E 1Z 2E 3E 3Z 4Z 5E 6Z 6E

Fenil Fenil 3'-piridil 1-metil-2’-pirrolil 1-metil-2’-pirrolil 2',6'-Cl2-C6H3 2'-CH3O-C6H4 2'-Cl-C6H4 2'-Cl-C6H4 2',3'-(CH3O)2 C6H3 2',4'-(CH3O)2C6H3 2'-O2N-C6H4 2'-O2N-C6H4 2'-furil 2'-furil 2'-Br-C6H4 3'-OH-C6H4

7E 8E 9Z 9E 10Z 10E 11E 12E

logk (C8)* 0,241 0,213 -0,394 0,061 0,036 0,524 0,278 0,388 0,382

logk (IAM)* 0,725 0,629 -0,190 0,519 0,506 1,183 0,736 1,012 0,959

CLOGP

logPe*

3,8 3,8 2,3 2,5 2,5 5,3 3,8 4,5 4,5

-4,23 -4,28 -4,70 -4,84 -4,76 -5,09 -4,97 -5,30 -5,09

IC50 / μM** 6,3 20,6 20,6 86,7 100,0 100,0 8,1 34,8 7,1

0,195

0,547

3,5

-5,19

15,2

0,302

0,826

3,8

-5,26

0,3

0,138 0,089 0,098 -0,022 0,416 -0,202

0,622 0,457 0,639 0,403 1,017 0,600

3,6 3,6 3,0 3,0 4,7 3,2

-4,86 -5,15 -4,75 -4,77 -5,96 -5,04

55,0 14,1 51,0 55,0 10,3 7,6

* Az értékek relatív standard deviációja 2%-nál kisebb, jelen táblázatban szereplő adatok individuálisan injektált vegyületekre vonatkoznak, az azonos napon végzett ismételt mérések száma 3. ** Az értékek relatív standard deviációja 10%-nál kisebb, az ismételt mérések száma 3.

52

4.1.1 Fiziko-kémiai karakterizálás 4.1.1.1 Kromatográfiás mérés A fordított fázisú oszlopon sikerült olyan kromatográfiás izokratikus módszert kidolgoznunk, amellyel 14 percen belüli szeparációt értünk el minden IK (17. ábra) molekulára. Az IAM oszlopon létrejövő, az elméleti bevezetőben említett, összetettebb és sokkal szélesebb spektrumú interakciók miatt, a foszfolipofilitás értékek a nagyobb retenciós faktorok felé tolódtak ki, az elválasztás ezen az oszlopon 21 percen belül jött létre. A két oszlop karakterizálását 3 különböző paraméterrel, a szelektivitási tényezővel (α, elvárt érték:  > 1), a felbontással (R, elvárt érték: R = 1, ahol nincs alapvonal elválás, de a komponensek megkülönböztethetőek; R ≥ 1,5: alapvonal elválás), illetve a kinetikai hatékonyságot jellemző kromatográfiás csúcsszélességgel, (félértékszélesség, w1/2) végeztük el. Korábbi tanulmányainkat követve elsődlegesen olyan módszert szerettünk volna kidolgozni, amely alkalmas arra, hogy kis szerkezeti különbségekkel rendelkező komponensek is elválaszthatóak legyenek egymástól. Az általunk kidolgozott eljárás, mind a C8, mind pedig az IAM oszlopon hatékonynak bizonyult ebből a szempontból. 

Szimultán mérések

-

E/Z izomerek elválasztása

Sikerült meghatároznunk a számítás alapján azonos vagy nagyon hasonló CLOGP értékkel rendelkező molekulák lipo- és foszfolipofilitását. El tudtuk tehát választani egymástól az egyes E/Z szerkezeti izomereket mindkét oszlopon (18. ábra, 19. ábra, 7. táblázat).

53

600 6,8

500 400

7,3

300 200 100 0

9E 9Z 0

2.5

5.0

10.0

7.5

12.5

15.0

t / perc

18. ábra: 9E és 9Z molekula elválasztása C8 oszlopon

6,0

200 4,6

150 100 50 0

9E 0

2.5

9Z

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

t / perc

19. ábra: 9E és 9Z molekula elválasztása IAM oszlopon 7. táblázat: Az elválasztás hatékonyságának jellemzése RP és IAM oszlopon RP oszlop α9E/Z

R9E/Z

1,1

1,4

IAM oszlop W1/2

9E 0,20

9Z 0,22

α9E/Z

R9E/Z

1,5

1,9

W1/2 9E 0,41

9Z 0,51

- Szerkezeti izomer molekulák elválasztása Szintén sikeresen elválasztottuk egymástól az egyes, eltérő szubsztituenssel rendelkező szerkezeti izomereket. Mivel a vizsgálatok már hamar kiderítették, hogy az E-izomerek biohozzáférhetőség szempontjából ideálisabbnak tekinthetők, így szimultán analízist ezeken a tagokon végeztünk. Ezek közül alapvonal elválasztást sikerült elérnünk a 2E,

54

3E, 5E, 7E, 11E és 12E tagok között fordított fázisú oszlopon (20. ábra, 8. táblázat) illetve a 2E, 6E, 8E, 10E, 11E és 12E molekulák között az IAM oszlopon (21. ábra, 8. táblázat). 500 4,1

400 300 200

6,5

100

7,9 8,9

5,0

0

11,2

2E 12E 3E 7E 5E 0

2.5

5.0

11E

10.0

7.5

12.5

15.0

17.5

20.0

t / perc

20. ábra: 2E, 12E, 3E, 7E, 5E és 11E izomerek szimultán analízise C8 oszlopon

80

11,3

70 2,1

60

4,2

50

13,1

40 6,0

30

8,5

20 10 0 -10

2E 0

2.5

10E 5.0

6E

8E

12E 7.5

10.0

11E 12.5

15.0

17.5

20.0

t / perc

21. ábra: 2E, 10E, 12E, 8E, 6E és 11E izomerek szimultán analízise IAM oszlopon 8. táblázat: Az elválasztás hatékonyságának jellemzése RP és IAM oszlopon  (RP oszlop)  (IAM oszlop) 2E/12E 12E/3E 3E/7E 7E/5E 5E/11E 2E/10E 10E/12E 12E/8E 8E/6E 6E/11E 1,8 1,8 1,4 1,2 1,4 3,3 1,6 1,5 1,4 1,2

55

R (RP oszlop)

R (IAM oszlop)

2E/12E 12E/3E 3E/7E 7E/5E 5E/11E 2E/10E 10E/12E 12E/8E 8E/6E 6E/11E 3,9

2E 0,12

5,3

3,6

2,1

W1/2 / min (RP oszlop) 12E 3E 7E 5E 0,15 0,20 0,25 0,28

4,3

11E 0,36

3,9

2E 0,23

2,2

1,7

1,9

W1/2 / min (IAM oszlop) 10E 12E 8E 6E 0,38 0,62 0,99 0,91

1,0

11E 1,15

Amint az az adatokból, illetve a kromatogramokon is jól látható, majdnem mindenhol sikerült alapvonal elválasztást végeznünk. Csupán az IAM oszlop esetén a 6E / 11E molekulák közötti felbontás volt kisebb, mint 1,5. Azonban az R értéke itt is elérte az 1et, a két csúcs tehát nem vált el alapvonalon, de megkülönböztethető egymástól. Az α értékek bizonyítják, hogy a módszer valóban szelektív volt mindkét oszlop esetén. A kinetikai hatékonyság tekintetében pedig egyértelműen az RP oszlop szerepelt jobban. Az egyes csúcsok félértékszélessége ugyanis sokkal nagyobb volt az IAM oszlop esetén. Ennek több oka is lehet. Az IAM oszlop fejlesztése során eleinte problémát okozott az oszlop biológiai membránhoz képesti kisebb hidrofobicitása. A régi típusú IAM oszlophoz képest, az új széria állófázisának hidrofobicitása a jelen levő észter kötések miatt növekedett meg. A hidrofobicitás növekedése, illetve az IAM oszlopon létrejövő különböző kölcsönhatások komplexitása miatt fordulhat elő, hogy az egyes komponensek hosszabb időt töltenek az oszlop felületén. A HPLC-s mérési módszer és a lipofilitás szerkezetfüggését bizonyítja az is, hogy az elválasztás során a molekulacsalád di- és monometoxi (7E, 5E) tagjai között a C8-as oszlopon 0,3, az IAM oszlopon pedig 1,9, míg az izomer dimetoxi tagok (7E, 8E) között 0,4 és 3,1 volt a retenciós faktorok közötti különbség. Ez pedig bizonyítja a kutatócsoportunk által már több esetben, például az MK-sor vagy arilidén-tetralonok [106][105] esetén is megfigyelt és leírt ismereteket, miszerint a lipofilitást és foszfolipofilitást nem csupán az egyes szubsztituensek kémiai jellege, hanem térbeli elhelyezkedése is befolyásolja. A két oszlopra jellemző retenciós faktor-különbségek szignifikáns eltérése pedig újabb bizonyíték arra, hogy a membrán oszlopon sokkal összetettebb kölcsönhatások lépnek fel az adott molekula és az állófázis között.

56

4.1.1.2 CLOGP-logk összefüggés A vizsgálat célja a számított és mért lipofilitás és foszfolipofilitás értékek összehasonlítása volt. A c log P  A  log k  B egyenlet alapján lineáris összefüggést vártunk el a mért és számított értékek között. Mindkét oszlopon az elvárásoknak megfelelő korrelációt kaptunk (22., 23. ábra). 5.5 5.0

CLOGP

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 -0.4

-0.6

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

logk (C8)

22. ábra: CLOGP-logk összefüggés az IK-sor esetén C8 oszlopon 5.5 5.0

CLOGP

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 -0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

logk (IAM)

23. ábra: CLOGP-logk összefüggés az IK-sor esetén IAM oszlopon Mind az IAM mind pedig a fordított fázisú C8 oszlopon mért logk értékek lineáris korrelációban álltak a CLOGP értékekkel. A korrelációanalízist elvégeztük külön-külön a teljes molekulacsaládra, illetve az E- és Z-izomerekre is (9. táblázat).

57

9. táblázat: A korrelációt jellemző paraméterek a fordított fázisú és az IAM oszlopon C8 oszlop Az egyenes paraméterei

CLOGP vs. logk

CLOGP vs. logk E-izomerek

CLOGP vs. logk Z-izomerek

A* B* Rkoef* SD* P* N*

3,116 3,098 0,872 0,413 <1*10-4 17

3,209 2,549 0,864 0,392 6,00*10-4 11

-0,466 0,184 0,983 0,038 4,11*10-4 6

Az egyenes paraméterei A* B* Rkoef* SD* P* N*

IAM oszlop CLOGP vs. logk CLOGP vs. logk E-izomerek 2,096 2,348 2,302 1,955 0,867 0,870 0,424 0,385 -4 <1*10 5,13*10-4 17 11

CLOGP vs. logk Z-izomerek 1,112 3,497 0,937 0,389 5,79*10-3 6

*ahol A a meredekség, B a metszeti érték, Rkoef. a korrelációs koefficiens, SD az illesztés standard deviációja, P annak a valószínűsége, hogy az Rkoef. értéke nulla és N az adatpontok száma.

Az adatok közül az egyeneseket legjobban jellemző két adat a korrelációs koefficiens (R), melynek értéke minél közelebb van egyhez, annál szignifikánsabb korrelációról beszélünk, illetve a valószínűség (P), mely minél kisebb, annál kisebb a valószínűsége annak, hogy a korreláció nem véletlenszerű összefüggés eredménye. A kevesebb adatpontból álló Z-izomerekhez tartozó grafikon esetén a P nagyobb. A számunkra fontos E-izomerek, illetve a teljes adathalmaz esetén azonban egyértelmű lineáris korrelációról beszélhetünk. 4.1.1.3 Permeabilitás-vizsgálat A

mesterséges

membránnal,

PAMPA

teszttel

végzett

vizsgálat segítségével

megállapítottuk az egyes molekulák penetrációs, membránon történő áthatolási képességét. Amint az az adatokból (6. táblázat) is jól látható, minden molekula -5,82-nél nagyobb logPe értékkel bír, így az általános, az 1.4. fejezetben leírt szabályok alapján

58

minden molekula nagy permeabilitású. Az egyes vegyületek mesterséges membránon történő áthatolása ez alapján nem gátolt. A PAMPA teszt eredménye, a korábbiakban leírtak alapján, együttesen tükrözi az egyes vegyületek hidrofil és hidrofób környezetben történő viselkedését is, hiszen a molekuláknak egy hidrofil (PBS, lipid réteg), illetve egy hidrofób (olaj + lipid réteg) rétegen is át kell hatolniuk ahhoz, hogy az akceptor tálcára jussanak, így permeabilitás szempontjából leginkább határérték, mintsem ideális tartomány határozható meg. A PAMPA teszt alapján tehát megállapítottuk, hogy statikus körülmények között, egyensúlyi rendszerben a vegyületek passzív transzporttal történő penetrációra alkalmasak. 4.1.2 Biológiai karakterizálás 4.1.2.1 Az antiproliferációs hatás vizsgálata Az IK sor molekuláinak antiproliferációs képességeit elsődlegesen MB teszt segítségével vizsgáltuk. A teszt eredményeként a T/C%-értékekből számítottuk ki az IC50 adatokat (6. táblázat). A 17 izokromanon molekulából három (5E, 6E, 12E) mutatott jó antiproliferációs hatást, míg egy molekula (8E) kiemelkedőnek bizonyult, 0,3 µM IC50-értékkel. Általánosságban megállapítottuk, hogy az E-izomerek optimálisabban viselkedtek, mind a fiziko-kémiai, mind a biológiai vizsgálatokban, mint a Z-izomerek. Ezek közül is a szubsztituensként metoxi-fenil csoportot tartalmazó vegyületek voltak kiemelkedőek, így tehát az egyes E-izomerek ilyen irányú szubsztitúciója mindenképp ígéretes lehet. A fiziko-kémiai és biológiai paraméterek közötti összefüggés keresése végett, a kapott metabolikus aktivitásra mutató adatokat (IC50) összehasonlítottuk a lipo- (24. ábra) és foszfolipofilitás (25. ábra) értékekkel. Az összehasonlítást szintén grafikus ábrázolás, korrelációanalízis segítségével végeztük el.

59

100

IC 50 / M

80 60 40

2E

20

12E

0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

3.0

2.5

4.0

3.5

k (C8)

24. ábra: IC50-k összefüggés az IK-sor esetén C8 oszlopon

100

IC50 / M

80 60 40

2E

20 0 -2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

k (IAM)

25. ábra: IC50-k összefüggés az IK-sor esetén IAM oszlopon 10. táblázat: A korrelációt jellemző paraméterek a fordított fázisú és az IAM oszlopon C8 oszlop Az egyenes adatai A* B1* B2* Rkoef* SD* P* N*

IC50 vs. k** 268,015 -249,72270 59,538 0,834 20,903 7,88*10-4 15

60

IC50 vs. k E-izomerek** 210,371 -194,232 45,200 0,800 20,172 4,95*10-2 9

IAM oszlop Az egyenes adatai A* B1* B2* Rkoef* SD* P* N*

IC50 vs. k E-izomerek** 106,541 -33,601 2,518 0,805 17,911 3,52*10-1 10

IC50 vs. k** 124,159 -29,594 1,849 0,696 26,789 1,35*10-2 16

*A, B1, B2, Rkoef, SD és P a polinomot jellemző paraméterek, ahol A, B1, B2 a koefficiensek, Rkoef a korrelációs koefficiens, SD a standard deviáció, P annak a valószínűsége, hogy az Rkoef nulla, N az adatok száma. **Az adatok a kieső értékek (outlierek) nélküli ábrázolásból származnak

Az MB teszttel megállapított IC50 értékek mind az IAM, mind pedig a C8 oszloppal mért lipo- és foszfolipofilitási értékekkel parabolikus összefüggést mutattak. Az összefüggés parabolikus volt az egész molekulacsaládra és külön az E-izomerekre is (10. táblázat). Így tehát az IK sor esetén is bebizonyosodott, hogy a közepes lipofilitási értékekkel rendelkező

molekulák

lehetnek

alkalmas

gyógyszerjelölt

vegyületek.

A

korrelációanalízis során, a fordított fázisú oszlop esetén kettő, míg az IAM oszlopnál egy kieső adatot (outliert) találtunk, melyeket az Allan és munkatársai által bevezetett „leave one out” módszer segítségével szelektáltunk ki. A fordított fázisú oszlop esetén ezek a molekulák a 3’-piridil (2E), illetve a 3’-hidroxi-fenil (12E) származékok voltak, míg az IAM oszlopnál már csupán a 2E molekula szerepelt kieső adatként. Mindkét molekula a viszonylag alacsony lipofilitás-érték miatt (2E: logkC8 = -0,394, logkIAM = -0,190; 12E: logkC8 = -0,202, logkIAM = 0,600) került a kieső értékek közé, hiszen alacsony lipofilitásuk ellenére biológiailag az ideálisabb molekulák táborába sorolhatók. A N-heteroatomot, illetve OH-csoportot tartalmazó molekulák kis lipofilitása, nagyobb hidrofilitásuk miatt teljesen logikus. Az ilyen heteroatomot tartalmazó szubsztituenssel rendelkező vegyületeknek általában véve kisebb a lipofilitása. Az ennek ellenére fennálló, a vártnál nagyobb biológiai aktivitásuk teszi őket kieső értékké. Ez jelentheti a molekulák aktív transzport révén történő sejtmagba jutását,

illetve

hatásuk

ilyenformán

történő 61

expresszálódását,

vagy

más

hatásmechanizmusbeli egyedi sajátságot. Amint azt már az elméleti bevezetőben is említettem a Lipinski-szabályokat is csupán általános érvényű törvényként alkották meg,

azóta

számos,

gyógyszerhatóanyaggá.

a A

szabályoktól kieső

eltérően

értékekért

felelős

viselkedő molekulák

molekula tehát

vált

további,

időigényesebb, egyedi hatásmechanizmusbeli vizsgálat után sorolhatóak be a „gyógyszer-szerű” vagy a „gyógyszernek alkalmatlan” molekulák táborába. Az eddigi tanulmányaink során gyűjtött tapasztalataink alapján viszont elsődleges célunk az ideálisnak vélt gyógyszer jelölt molekulák további karakterizálása, a Lipinski-szabály vagy attól eltérő tendenciák kutatása volt. 4.1.2.2 Fénymikroszkópos vizsgálat Morfológiai vizsgálatot a legkiemelkedőbb, optimális lipofilitással (k = 2,0), illetve IC50 értékkel (IC50 = 0,3 µM) rendelkező 8E (4E-((2’,4’-dimetoxifenil-4-metilén)-3izokromanon) molekulán végeztünk.

26. ábra: A431 sejtek fénymikroszkópos felvétele a 8E molekula 1, 5, illetve 10 µM-os oldatával történő kezelés után, 24 óra elteltével A 26. ábrán jól látható, hogy már a molekula 1 µM-os oldata jelentős morfológiai változást idézett elő 24 órás inkubációs idő elteltével. A kezelt sejteken apoptózisra utaló jeleket figyeltünk meg, a sejtek összegömbölyödtek és -zsugorodtak, elváltak a szomszédos sejtektől és a médiumban úsztak. Ez a vizsgálat tehát alátámasztotta az eddigi eredményeket a 8E molekulára vonatkozóan. A többi, vizsgált izokromanon molekulán ilyen jelentős morfológiai eltérés nem volt megfigyelhető.

62

4.1.2.3 PARP fragmentáció Western blottos követése Az eddigi eredményeink további alátámasztása céljából immunoblot módszer segítségével végeztünk vizsgálatot a DNS hibajavító enzim, az úgynevezett PARP molekula lehasadására, speciális PARP Ab nyúl antitest segítségével. A vizsgálatot mind a hasított, mind pedig a normál alap PARP antitesttel elvégeztük. Mindkét esetben kaszpáz általi apoptózisra utaló jeleket találtunk. Amint arról az elméleti áttekintésben is szó volt már, a sejtek inhibitorral történő kezelése által a PARP enzim működésében funkcionális változás következhet be. Habár a PARP enzim lehasítása nem szükséges feltétele az apoptózis létrejöttének, de az enzimet gátló, annak fragmentálódását előidéző molekula nagy valószínűséggel apoptotikus hatású. A vizsgálatok során a 8E molekula 1, 5 és 10 µM-os oldatával kezelt sejteket Western blot analízisnek vetettük alá. Minden esetben, így tehát már 1 µM-os oldatban is megfigyelhető volt a PARP-ra jellemző 89 kDa-nál jelentkező fő fragmentum. A hasított fragmentum aránya a koncentrációval arányosan nőtt, illetve már 5 µM-ban maximum értéket ért el (27. ábra).

27. ábra: A PARP fragmentáció Western blottos követése a 8E molekula 1, 5, illetve 10 µM-os oldatával történő kezelés után Spontán apoptózis: kb. 5%-os 4.1.2.4 Áramlási citometria (FACS) Az apoptózis későbbi fázisának detektálására, a subG1 frakció jelenlétének vizsgálatára végeztünk FACS analízist. Az inhibitorok 1 és 10 µM-os oldatával történő kezelés után

63

propidium jodidos festést alkalmazva végeztük el a FACS mérést. Az inhibitorok közül kiválasztottuk az 1E (fenil-származék) fénymikroszkópos vizsgálat alapján inaktívnak vélt, az 5E (2’-metoxifenil-származék) bizonyos mértékű apoptotikus aktivitást mutató, illetve a 8E (2’,4’-dimetoxifenil-származék) jó eséllyel, PARP és fénymikroszkópos vizsgálat alapján is apoptotikus hatásúnak vélt molekulákat. 11. táblázat: A FACS módszerrel megállapított inhibíciós értékek és azok szórása Komponens IK 1E IK 5E IK 8E

Inhibíció / % 11,99 ± 0,27 27,58 ± 3,65 68,28 ± 1,67

28. ábra: A FACS módszerrel kapott adatok grafikus ábrázolása A vizsgálat alapján, amint az az eredményekből is látható, kiderült, hogy az 1E molekula valóban nem rendelkezik apoptotikus hatással, illetve az 5E molekula DNS fragmentációt előidéző képessége is sokkal kevésbé jelentős, mint a kiemelkedő eredményt mutató, már 1 µM-os oldatban is 68,28 ± 1,67%-os apoptotikus frakciót létrehozó 8E molekula (11. táblázat, 28. ábra). Mindezek alapján tehát több mérés is alátámasztja, hogy a kiválasztott 4E-((2’,4’dimetoxifenil-4-metilén)-3-izokromanon (8E) molekula valóban apoptózisra utaló

64

jelenséget idéz elő A431-es sejteken, tehát mind fiziko-kémiai mind biológiai szempontból epidermális karcinóma sejtek elleni potenciális daganatellenes hatással bír. 4.2

Redukált Mannich ketonok

29. ábra: „A” vegyületcsoport

„B” vegyületcsoport

Cikloalkanol származékok

Indenol és naftalenol származékok

12. táblázat: A mért és számolt adatok táblázatos összefoglalása „A” vegyület csoport red MK-1Z red MK-1E red MK-2E

R1

R2

n

logk (C8)*

4-morfolinil 4-morfolinil 1-piperidil

2 2 1

0,246 0,148 0,167

0,386 0,500 0,475

3,1 3,1 3,8

-3,84 -3,88 -4,97

red MK-3E

1-piperidil

1

0,183

0,439

3,1

-5,04

red MK-4Z red MK-5E red MK-5Z red MK-6Z red MK-7Z

4-morfolinil 1-piperidil 1-piperidil 4-morfolinil 1-piperidil 4-Me-1piperidil

Fenil Fenil Fenil 4’-MeOfenil Fenil Fenil Fenil Fenil Fenil

3 3 3 4 4

0,348 0,678 0,621 0,525 0,784

0,634 0,812 0,804 0,817 1,026

4,9 4,9 4,9 4,3 5,5

-4,83 -4,92 -4,91 -4,91 -4,89

2

0,246

0,884

4,1

-4,86

red MK-8E

„B” vegyület csoport red MK-9E red MK-10E

Fenil

R

n

1’-pirrolidinil 1’-morfolinil

2 1

logk (C8)* -0,206 -0,483

logk CLOGP logPe* (IAM)*

logk CLOGP (IAM)* 0,897 2,7 0,229 1,5

logPe* -5,07 -5,09

* Az értékek relatív standard deviációja 2%-nál kisebb, jelen táblázatban szereplő adatok individuálisan injektált vegyületekre vonatkoznak, az azonos napon végzett ismételt mérések száma 3.

A red MK vegyületek (29. ábra) vizsgálatát a csoport korábbi, MK-soron végzett analízise alapján végeztük el, hiszen az elsődleges cél a redukció biokémiai

65

következményeinek felfedezése volt. A korábbi vizsgálatok [144] alapján ugyanis azt feltételeztük, hogy a vegyületek biokémiai hatékonysága a MK molekulák ketocsoportjával, annak bizonyos enzimek tiol csoportjával történő reakciójával hozható összefüggésbe [120]. Ezeken a vegyületeken is elvégeztük a fizikai—kémiai (12. táblázat) és MTT teszten alapuló biológiai (16. táblázat) karakterizálást. 4.2.1 Fiziko-kémiai karakterizálás 4.2.1.1 Kromatográfiás paraméterek Az MK-család vizsgálatával szerzett tapasztalatok [144] alapján végeztük el a lipofilitásvizsgálatot. Az oxocsoport hidroxiddá történő átalakulása miatt a vegyületek nagyobb vízoldékonysága, ezzel együtt MK molekulákhoz képesti kisebb lipofilitása volt várható. Ilyen jellegű szignifikáns eltérést azonban nem tapasztaltunk a vizsgált vegyületcsaládok között. A vegyületek CLOGP-értéke, illetve mért logkC8 és logkIAM értékei alapján, ahogy az várható is volt, a nagy szénatomszámú gyűrűt tartalmazó cikloalkanon molekuláknak volt a legnagyobb lipofilitása, a kondenzált gyűrűt tartalmazó komponenseknek („B” molekulacsalád) pedig a legkisebb. A fordított fázisú, illetve az IAM oszlopon mért retenciós idők között nem tapasztaltunk számottevő különbséget. Míg a C8 oszlopon az elválasztást 17,5 percen belül tudtuk kivitelezni minden komponensre, addig az IAM oszlop esetén 16,5 perc alatt eluálódott a molekulacsalád összes tagja. Sikerült olyan elválasztást kidolgoznunk, amely mindkét oszlopon ekvivalensen alkalmazható volt a komponensek analízisére (3., 5. táblázat). Ezzel az eljárással ráadásul különbséget tudtunk tenni olyan molekulák lipofilitása, illetve foszfolipofilitása között, amelyek a számítás alapján azonos CLOGP-vel rendelkeznek. Így például a számításos módszer nem tudta értelmezni a 7 (n=3) gyűrűtagszámmal bíró alapmolekula morfolinil (red MK-4Z) és piperidil (red MK-5Z) származéka közötti különbséget. A számítások alapján ezek ugyanakkora lipofilitással rendelkeznek. A mérés azonban kimutatta, hogy jelentős az eltérés a k értékek között (kC8 = 1,950; kIAM = 2,058).

66



Szimultán mérések

-

E/Z módosulatok:

Egy rendszerben, egyszerre vizsgálva az egyes minták E, illetve Z módosulatait, alapvonal-elválást tapasztaltunk az red MK-1Z és -E izomerek között (30. ábra, 31. ábra), illetve ugyan nem alapvonalon, de szintén elvált egymástól a red MK-5 molekula Z és E izomere mind az IAM mind pedig a C8 oszlopon (13. táblázat). 500 5.9

400 300 6.8

200 100 0

1E 1Z 0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

t / perc

30. ábra: Red MK-1E és -Z izomerek szimultán analízise C8 oszlopon

200 6.1

150 5.0

100

50

0

1Z 0

2.5

1E

5.0

7.5

10.0

12.5

t / perc

31. ábra: Red MK-1E és -Z izomerek szimultán analízise IAM oszlopon

67

13. táblázat: Az elválasztás hatékonyságának jellemzése C8 és IAM oszlopon C8 oszlop

-

α1E/Z

R1E/Z

1,3

2,3

IAM oszlop W1/2

1E 0,21

1Z 0,25

α1E/Z

R1E/Z

1,3

1,4

W1/2 1E 0,44

1Z 0,53

A gyűrűtagszám növekedése:

A piperidil (R1), illetve fenil-szubsztituenst (R2) tartalmazó vegyületek közül elválasztottuk egymástól az 5 szénatomos (red MK-2E) és a 7 szénatomos (red MK-4Z) benzilidén-cikloalkanon alapmolekulával rendelkező vegyületeket. Ezek a molekulák kiválóan elválaszthatóak voltak egymástól izokratikus körülmények között is. A piperidin és fenil szubsztituenssel rendelkező vegyületek 7 (red MK-5Z), illetve 8 (red MK-7Z) C-atomszámú cikloalkanonjai is alapvonalon váltak el egymástól. A morfolinil és fenil szubsztituenst tartalmazó red MK-1Z és a red MK-6Z jelű molekulák cikloalkanon alapváza 6 illetve 7 gyűrűtagszámú. Amint az a 14, táblázatból is látható, ezeknél is alapvonal-elválást tapasztaltunk mindkét oszlopon történt analízis során. 14. táblázat: Az elválasztás hatékonyságának jellemzése C8 és IAM oszlopon C8 oszlop α R IAM oszlop α R

Red MK 7Z/5Z 1,5 3,7 Red MK 7Z/5Z 1,5 2,7

Red MK 6Z/1Z 2,0 5,7 Red MK 6Z/1Z 2,5 4,9

Red MK 4Z/2E 1,6 3,1 Red MK 4Z/2E 1,4 1,7

Általánosan elmondható tehát, hogy megfelelően szelektív és nagy felbontású módszert sikerült kidolgoznunk mindkét oszlopra, a kinetikai hatékonyság azonban a red MKcsalád esetén is nagyobb volt a fordított fázisú kolonnán. 4.2.1.2 CLOGP-logk összefüggés Mindkét oszlop esetén lineáris korrelációt állapítottunk meg a mért és számított adatok között (15. táblázat). Kiugró adatot nem találtunk, minden adatpont hibahatáron belül

68

illeszkedett az illesztett egyenesre. Az IAM oszlop esetén az adatok nagyobb logktartományt fognak át, tehát az egyes mintakomponensek foszfolipofilitás szempontjából nagyobb diverzitást mutatnak (32. ábra, 33. ábra).

6

5

4

3

2

1

-0.6

-0.3

0

0.6

0.3

0.9

logk (C8)

32. ábra: CLOGP-logk összefüggés a red MK-sor esetén C8 oszlopon

6

5

4

3

2

1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 1.2

logk (IAM)

33. ábra: CLOGP-logk összefüggés a red MK-sor esetén IAM oszlopon

69

15. táblázat: Az elválasztás hatékonyságának jellemzése C8 és IAM oszlopon Az egyenes paraméterei A* B* Rkoef* SD* P* N*

C8 oszlop IAM oszlop CLOGP vs. logk 2,990 2,694 2,753 2,252 0,915 0,907 0,486 0,508 -4 <1*10 <1*10-4 12 12


4.2.1.3 Permeabilitás-vizsgálat A vizsgálat alapján minden, általunk elemzett red MK molekula képes a sejtmembránon keresztül történő passzív transzportra, azaz minden vegyület nagy permeabilitással bír. A biológiai hatékonyságot tehát ez a paraméter nem befolyásolhatta. 4.2.2 Biológiai karakterizálás A red MK-családot alapvetően antiproliferációs teszt segítségével A431-es sejtvonalon vizsgáltuk. A kapott adatokat a szintézis során kiindulási vegyületként szolgáló MK-sor IC50-értékeivel hasonlítottuk össze (16. táblázat). 16. táblázat: A red MK-vegyületek és az MK-vegyületcsalád A431-es sejtvonalon mért IC50-adatainak összefoglalása „A” vegyület csoport Redukált Oxidált R1 R2 forma forma red MK-1Z 4-morfolinil Fenil MK-1 red MK-1E 4-morfolinil Fenil red MK-2E MK-2 1-piperidil Fenil red MK-3E MK-3 1-piperidil 4’-MeO-fenil red MK-4Z MK-4 1-morfolinil Fenil red MK-5E 1-piperidil Fenil MK-5 red MK-5Z 1-piperidil Fenil red MK-6Z MK-6 4-morfolinil Fenil red MK-7Z MK-7 1-piperidil Fenil red MK-8E MK-8 4-Me-1piperidil Fenil

70

n 2 2 1 1 3 3 3 4 4 2

IC50 / µM IC50 / µM (red MK)* (MK)* 102,7 75,9 104,5 93,6 7,6 108,6 21,4 81,3 77,8 83,5 5,2 61,3 97,2 21,2 55,3 21,9 85,9 4,5

„B” vegyület csoport Redukált Oxidált forma forma red MK-9E MK-9 red MK-10E MK-10

R

n

1’-pirrolidinil 1’-morfolinil

2 1

IC50 / µM (red MK)* 96,8 90,4

IC50 / µM (MK)* 20,7 8,1

* Az értékek relatív standard deviációja 10%-nál kisebb, az ismételt mérések száma 3.

Jól látható a redukált és nem redukált (azaz hidroxil-csoport helyett keto csoportot tartalmazó) MK molekulák MTT teszttel mért IC50 adataiból, hogy a két molekulacsalád vegyületei között jelentős hatékonyságbeli különbség van. Az antiproliferációs teszt tehát alátámasztja azt az elméletet, mely szerint a keto-csoportnak jelentős szerepe van a biológiai hatásban. A red MK sor 10 µM-os oldatát A431 sejtvonalon kívül még 6 másik sejttípuson is teszteltük (17. táblázat). Antiproliferációs hatást feltételeztünk azon vegyületek esetén, amelyek 50%-nál nagyobb gátlást idéztek elő 10 µM-os oldatukkal. A red MK-család esetén egyik molekula sem mutatott az elvártnak megfelelő vagy annál nagyobb mértékű inhibíciós effektust. Ezek az adatok is alátámasztják az előbbi állítást a keto- csoport lényeges szerepéről a biológiai hatásban. 17. táblázat: A red MK-vegyületek 10 µM-os oldatának hat különböző sejtvonalon mért T/C% értékeinek* összefoglalása „A” vegyület csoport red MK-1Z red MK-1E red MK-2E red MK-3E red MK-4Z red MK-5E red MK-5Z red MK-6Z red MK-7Z red MK-8E „B” vegyület csoport red MK-9E red MK-10E

HCC827

HT29

Jurcat

MCF7

Panc-1

PC3

97,6 104,4 88,4 106,7 100,1 83,5 61,3 97,2 55,3 85,9

98,3 105,5 103,4 97,1 95,8 97,6 86,5 91,5 86,8 88,2

100,7 102,2 107,3 96,1 85,2 96,7 85,9 92,8 68,0 82,1

90,6 92,4 90,7 92,8 84,5 84,4 64,7 81,3 69,1 78,6

102,7 104,5 93,6 108,6 81,3 85,7 84,4 82,8 79,2 87,6

101,9 104,7 98,8 102,8 98,2 83,5 61,3 97,2 55,3 85,9

HCC827

HT29

Jurcat

MCF7

Panc-1

PC3

102,3 101,3

100,5 104,9

94,6 91,8

85,8 93,0

96,8 90,4

105,9 99,8

* Az értékek relatív standard deviációja 10%-nál kisebb, az ismételt mérések száma 3.

71

A pontos mechanizmus továbbra is csak feltételezés tárgya, de a keto-csoport enzimek tiol-csoportjával történő reakciója továbbra is egy lehetséges variáció. 4.3

Auronok

Az auron molekulacsaládon belül 3 különböző könyvtár vizsgálatát végeztük el. Ezek voltak az auronok, a tioauronok, illetve a szulfonok (18., 19., 20. táblázat). Egy molekula képviselte a vizsgálat során a szulfoxidok csoportját. A molekulák RP oszlopon történő karakterizálását kutatócsoportunkból Hallgas B. és munkatársai már korábban elvégezték [132].

34. ábra: Az auronok és származékaik alapszerkezete: X = O: auronok; X = S: tioauronok; X = SO: Szulfoxid (2.16); X = SO2: szulfonok 18. táblázat: Auron csoport

Vegy.

R1

R2

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 1.17

H H H H H H H H H H H H H 5-Me 5-Cl 5-F 6-BnO

H 2'-Me 2'-MeO 4'-Me 4'-iPr 4'-MeO 4'-BnO 4'-F 4'-Cl 4'-Br 4'-CN 3',4'-OCH2O 3',4'-OCH2CH2O H H H H

X=O logk logk (C8)* (IAM)* 0,050 0,351 0,144 0,355 0,163 0,458 0,187 0,515 0,526 0,842 0,021 0,338 0,496 1,026 0,060 0,383 0,269 0,709 0,313 0,749 -0,008 0,247 -0,053 0,302 -0,036 0,542 0,200 0,505 0,265 0,332 0,093 0,344 0,495 0,974

72

CLOG P 4,3 4,8 4,2 4,8 5,7 4,2 6,0 4,4 5,0 5,2 3,7 3,9 4,2 4,8 5,0 4,5 6,1

logPe* -5,57 -5,64 -5,21 -5,48 -5,58 -5,56 -5,38 -5,58 -5,43 -5,58 -5,56 -5,22 -5,10 -5,60 -4,74 -5,24

IC50 / µM** 100,0 71,8 100,0 55,5 34,9 100,0 100,0 100,0 34,0 54,7 100,0 100,0 100,0 20,3 19,5 38,9 100,0

1.18 1.19

6,7(BnO)2 5-Br

H

0,787

-

7,5

-5,54

100,0

H

-

0,719

5,2

-5,44

9,3

19. táblázat: Tioauron csoport

Vegy.

R1

R2

2.1 2.2 2.3 2.4 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 2.14 2.15 2.16*

H H H H H H H H H H H H H H H

H 2'-Me 3'-Me 4'-Me 4-Me2N 4'-MeO 3',4'-(MeO)2 3',4'-OCH2O 4'-F 4'-Cl 3',4'-Cl2 4'-Br 4'-CN 4-NO2 H

X=S logk (IAM)* 0,720 0,748 0,907 0,822 0,880 0,702 0,507 0,700 0,647 0,958 1,116 0,489 0,656 -0,393

logk (C8)* 0,210 0,315 0,393 0,374 0,212 0,199 -0,035 0,099 0,190 0,400 0,621 0,444 0,067 0,162 -0,635

CLOGP

logPe*

4,6 5,1 5,1 5,1 4,8 4,6 4,3 4,2 4,8 5,4 5,9 5,5 4,1 4,4 2,5

-5,31 -5,51 -5,80 -5,21 -5,64 -5,36 -5,11 -5,70 -5,40 -5,05 -5,60 -5,12 -5,10 -5,36 -5,33

CLOGP

logPe*

2,8 3,3 2,7 2,5 2,4 2,9 3,5 3,7 3,3

-4,84 -4,89 -4,86 -4,92 -5,07 -4,77 -4,88 -5,08 -5,05

IC50 / µM** 22,9 9,3 15,0 70,3 27,0 32,7 27,5 20,2 100,0 23,6 49,1 63,3 63,3 64,2 4,3

*X = SO: szulfoxid 20. táblázat: Szulfoncsoport

Vegy.

R1

R2

2.17 2.18 2.19 2.20 2.21 2.22 2.23 2.24 2.25

H H H H H H H H H

H 4'-Me 4'-MeO 3',4'-(MeO)2 3',4'-OCH2O 4'-F 4'-Cl 4'-Br 2'-Me

logk (C8)* -0,291 -0,101 -0,232 -0,394 -0,300 -0,317 -0,060 0,006 -0,201

X = SO2 logk (IAM)* -0,027 0,116 -0,025 -0,143 0,036 0,036

IC50 / µM** 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 23,5 45,6 100,0


73

4.3.1 Fiziko-kémiai karakterizálás 4.3.1.1 Kromatográfiás mérések Az IAM oszlopon történő elválasztás 24 percen belül volt kivitelezhető a molekulacsalád minden tagjára. Ahogy már korábbi tanulmányaink során (pl. IK sor) is megfigyelhettük, az auronok esetén is a halogenid szubsztituenst tartalmazó molekulatagok rendelkeztek a legnagyobb foszfolipofilitással, leszámítva a benziloxiszármazékokat. Ezek közül is a 2.13, 4’-bromo tioauron származéknak volt a legnagyobb a foszfolipofilitása. A halogén szubsztitúció a F < Cl < Br sorrendben (1.8, 1.9, 1.10, illetve 2.10, 2.11, 2.13) változtatta a logk értékeket. A fluorral szubsztituált származékok kilógtak a sorból, hiszen ezek az alapmolekulával közel azonos logkértékkel bírtak, ami valószínűleg a fluor kis atomrádiuszával hozható összefüggésbe. A szulfoncsoport tagjairól, illetve a 2.16-os számú szulfoxidról elmondható, hogy a legkisebb foszfolipofilitású molekulák. Így tehát az oxigén atomok számának növekedése a heterociklikus gyűrű kén atomján egyértelműen csökkenti a logk értéket. Akárcsak a red MK családnál, az auronok esetén is megfigyelhető volt, hogy a molekulatagok foszfolipofilitási tartománya sokkal diverzebb, szélesebb, mint a lipofilitási tartománya. Az egyes szubsztituensek cseréje az alapmolekulán sokkal nagyobb mértékű logk változást idézett elő az IAM oszlop esetén, mint a C8 oszlopon (pl. 1.4: metil csoporttal történő szubsztitúció: kC8 = 1,54, kIAM = 3,27; 1.5: izopropil csoporttal történő szubsztitúció: kC8 = 3,36, kIAM = 6,94). Akárcsak az előző két molekulacsaládnál, az auronok esetén is sikerült olyan kromatográfiás módszert kidolgoznunk, amely alkalmas volt kis szerkezeti eltérések kimutatására is. Így tehát jelentősen különbözött egymástól a metil-szubsztituenst különböző (orto és para) pozícióban tartalmazó molekulák foszfolipofilitás-értéke mind az auronok (1.2, 1.4 molekulák), mind pedig a tioauronok (2.2, 2.4 molekulák) esetén. Ezeknek a molekuláknak rendre ugyanakkora volt a CLOGP értéke. A 2’-metil származék 4’-származékhoz képesti lipofilitás csökkenése szterikus tényezőkkel hozható összefüggésbe. A metil-csoport 2’-pozícióban történő kapcsolódása ugyanis a molekula gömbszerűvé válását idézte elő, azaz a molekula síkalkata gömb alkatú lett. Ezt molekulamodellezés segítségével tudtuk megállapítani (Chemdraw Ultra: MM2 módszer). Ez a térszerkezeti változás pedig minden esetben a lipofilitás csökkenését

74

idézte elő. A többi, metil szubsztituenst tartalmazó molekula mind-mind síkalkatú maradt a metil-csoporttal történő egyesülést követően is. A metoxi csoportot tartalmazó auronoknál és tioauronoknál az orto helyzetű szubsztitúció

megnövelte,

míg

a

para

helyzetű

lecsökkentette

a

lipo-

és

foszfolipofilitást. A metoxi csoport ilyen típusú viselkedése mindkét oszlopon megfigyelhető volt. Ebben az esetben is a 2’-pozíción szubsztituált vegyület szferikus tulajdonsága lehetett a döntő, lipofilitás-csökkentő tényező. A retenciós faktorokat együttesen, molekulacsaládokra lebontva megfigyelve tehát jól látható, hogy az oxigén heteroatom kénatomra történő cseréje növeli, míg a kén atom SO vagy SO2-csoporttal történő helyettesítése jelentősen lecsökkenti a lipo- és foszfolipofilitást. A fiziko-kémiai paraméterek ilyen jellegű változása pedig jól láthatóan kihat a biológiai aktivitásra is (ld. 4.3.2. fejezet). 4.3.1.2 CLOGP-logk összefüggés IAM oszlop esetén A teljes könyvtárra (35. ábra, 21. táblázat) és az auron (36. ábra, 22. táblázat) és tioauron almolekulakönyvtárra (37. ábra, 23. táblázat) is megvizsgáltuk a korrelációs összefüggést a mért és számított adatok között. Teljes auron könyvtár 6

1.15 5

CLOGP

a)

4

3

2.21

2 -0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

logk (IAM)

35. ábra: CLOGP-logk összefüggés a teljes auron családra IAM oszlopon

75

21. táblázat: Az elválasztás hatékonyságának jellemzése a teljes auron családra IAM oszlopon Az egyenes paraméterei

CLOGP-logk kieső adatokkal 3,165 2,467 0,910 0,402 <1*10-4 38

A* B* Rkoef* SD* P* N*

IAM oszlop CLOGP-logk kieső adatok nélkül 3,187 2,413 0,929 0,343 <1*10-4 36


b) Auronok: 6.5 6.0

1.15

CLOGP

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

logk (IAM)

36. ábra: CLOGP-logk összefüggés az auron alcsaládra IAM oszlopon 22. táblázat: Az elválasztás hatékonyságának jellemzése az auron alcsaládra IAM oszlopon Az egyenes paraméterei A* B* Rkoef* SD* P* N*

IAM oszlop CLOGP-logk kieső adattal 2,455 3,459 0,881 0,330 <1*10-4 18

CLOGP-logk kieső adat nélkül 3,290 2,666 0,931 0,262 <1*10-4 17


76

c) Tioauronok 5.6

CLOGP

5.2

4.8

4.4

4.0

0.4

0.8

0.6

1.0

1.2

logk (IAM)

37. ábra: CLOGP-logk összefüggés a tioauron alcsaládra IAM oszlopon 23. táblázat: Az elválasztás hatékonyságának jellemzése a tioauron alcsaládra IAM oszlopon Az egyenes paraméterei A* B* Rkoef* SD* P* N*

CLOGP-logk 2,268 3,054 0,875 0,232 <1*10-4 13


Az

egyenesek

paramétereiből

jól

látható,

hogy

úgy

a

teljes,

mint

az

almolekulakönyvtárak esetén is lineáris korrelációt találtunk. Habár a korrelációs koefficiens értéke az elvártnak megfelelő mind a 38 molekulatagot együttesen ábrázolva, még jobb korreláció figyelhető meg abban az esetben, ha 2 vegyületet kieső értéknek tekintünk a már az IK-sornál is alkalmazott Allen-féle „leave one out” módszer [145] alapján. Kieső adatnak tekinthető tehát az 5-kloroauron (1.15), illetve a 3’,4’metiléndioxol-származék (2.21). Ezek figyelmen kívül hagyásával egyértelműen jobb korrelációt kapunk, de mint említettem, az Rkoef értéke kielégítő minden esetben.

77

4.3.1.3 Permeabilitás-vizsgálat A 18-20. táblázatokban összefoglalt eredményekből látható, hogy minden komponens nagy permeabilitással bírt az auron molekulacsaládból. Így tehát a komponensek passzív transzporttal történő áramlása nincs akadályoztatva. 4.3.2 Biológiai karakterizálás Az auron molekulacsalád biológiai aktivitását szintén antiproliferációs teszttel, MTT módszerrel vizsgáltuk. Amint azt már a fiziko-kémiai karakterizálásnál említettem, a lipofilitás

és

foszfolipofilitás

szerint

egységes

képet

mutatnak

az

egyes

molekulacsaládok. A szulfonok lipo- és foszfolipofilitása, a polarizált S-O kötés jelenléte miatt, túl alacsonynak bizonyult. Ez összhangban van a kapott biológiai adatokkal, hiszen a szulfonok minden tagja inaktívnak bizonyult az antiproliferációs tesztekben. Ez is alátámasztja az eddigi, előzőekben tárgyalt molekulacsaládokra vonatkozó megállapításainkat, miszerint az alacsony lipofilitású molekulák nagy eséllyel buknak meg a sejtes tesztekben. Az auronoknál jobban szerepeltek a tioauronok az MTT mérésekben. Mindezek alapján tehát elmondható, hogy az oxigén atom kén atommal történő cseréje növeli, míg a SO vagy SO2 csoport beépítése csökkenti a molekulák „gyógyszer-szerűségét”.

100

100

80

80

IC50 / M

IC50 / M

2.13

60 40

60 40

20

20

0

0 0

1

2

3

4

5

6

7

k (C8)

0

2

4

6

8

10

12

14

k (IAM)

38. ábra: IC50-k összefüggés a teljes auron molekulakönyvtár esetén C8 és IAM oszlopon

78

Az auronok esetén is kijelöltünk tehát egy általunk optimálisnak vélt tartományt, amelyen belül a biológiai, illetve fiziko-kémiai szempontból is ideális molekulák találhatók (38. ábra). Ez a tartomány nagyjából egybe esik az IK-sornál már kijelölt tartománnyal. Az RP oszlop esetén kC8 1 és 3 között van, míg az IAM oszlopnál a már megszokott szélesebb tartományt felölelő halmazról van szó, itt a kIAM 2 és 8 között helyezhető el. Egy kieső adattal kell számolnunk az IAM oszlopon történt mérés adatainak tárgyalásánál. Ez az érték a 4’-bromotioauron származékhoz (2.13) tartozik. Az érték azonban nem szignifikánsan kieső adat, hiszen ez a vegyület a 63,3 µM-os IC50 értékkel semmiképp nem jelölhető ki ideális molekulaként, amint azt a k-érték is mutatja. Mindezek alapján tehát az auronok nagy molekulakönyvtárára is sikerült kijelölnünk egy ideális lipo-és foszfolipofilitási tartományt. 4.4

Kromenonok

A kromenon molekulacsalád (39. ábra, 24. táblázat), amint azt már a bevezetőben is említettem, eltér az eddig tárgyalt vegyületektől. Sokoldalú felhasználási lehetőségük, számos pozitív, már ismert biológiai hatásuk ellenére, mi NOX gátlóként mutatott aktivitásukat használtuk fel vizsgálataink alapjául. Jelen tanulmány elsődleges célja az volt, hogy egy antiproliferációs hatással nem, azonban más biológiai aktivitással rendelkező molekulacsaládra is megpróbáljunk kijelölni egy optimalizált tartományt, amelyben az ideális gyógyszerjelölt vegyületek vannak.

39. ábra: A kromenon molekulák alapszerkezete

79

24. táblázat: Vizsgált vegyületek Vegy. 3617 3627 3630 3631 3635 3731 3735 3733 3736 3664 3646 3614 3638 3610 3621 3611 3618

R1 5,7-(OH)2 5,7-(OH)2 3-OH, 7-OMe 5,7-(OH)2 7-OMe 5,7-OMe, 8-(5,5'-Me2, 4-oxi-4,5-dihidrofuranil) H 5,7-(OMe)2 7-OMe 7-OH 3,5,7-(OH)3 5,7-(OH)2-3-(3,4,5-(OH)3-6-MeOHtetrahidropiran-2-oxi) 5,7-(OH)2 3,5,7-(OH)3 3,7-(OH)2-5-OMe 3,7-(OH)2 5,7-(OH)2, 8-OMe

R2 4’-OH-2-Ph 4’-OMe-2-Ph 3’,4’-(OMe)2-2-Ph 3’-OH, 4’-OMe-2-Ph 4’-OH-2-Ph 2-Ph 4’-NO2-2-Ph 2-Ph 2-Ph 3’,4’-(OH)2-3-Ph 3’,4’-(OH)2-2-Ph 3’,4’-(OH)2-2-Ph 3’,4’-(OH)2-2-Ph 2’,4’-(OH)2-2-Ph 3’,4’-(OH)2-2-Ph 3’,4’-(OH)2-2-Ph 4’-OH-3-Ph

25. táblázat: A mért és számított adatok táblázatos összefoglalása Vegy. logk(C18)* logk(IAM)* NOX inh. / % CLOGP 3617 0,561 0,577 0 2,0 3627 0,479 0,548 33 2,4 3630 0,988 38 2,6 3631 0,461 0,381 -5 1,9 3635 0,507 0,494 0 2,7 3731 0,874 0,105 24 3,7 3735 1,084 0,404 4 3,3 3733 0,797 0,335 -4 3,3 3736 0,997 0,493 0 3,2 3664 0,026 0,070 86 1,5 3646 0,190 94 1,3 3614 -0,494 105 -0,3 3638 0,286 106 2,3 3610 0,201 -0,212 105 0,7 3621 -0,098 100 1,1 3611 0,036 94 1,5 3618 0,534 -0,048 82 1,6

logPe* IC50 / µM** -6,39 71,58 -6,21 34,15 -6,09 100 -6,61 100 -5,58 100 -5,67 100 -6,15 84,58 -5,12 100 -5,25 100 -6,40 100 -6,48 100 -7,32 100 -6,85 100 -7,08 100 -7,03 83,32 -6,42 31,42 -5,01 54,03


80

4.4.1 Fiziko-kémiai karakterizálás 4.4.1.1 Kromatográfiás mérések Valószínűleg a molekulák számos hidroxil-csoportja, ebből adódóan kis lipofilitása és nagyszámú H-kötés kialakítására való képessége miatt számos molekulát nem tudtunk az IAM oszlopon karakterizálni (25. táblázat). Több molekula adott igen aszimmetrikus csúcsot annak ellenére, hogy minden komponens kiváló kinetikai hatékonysággal volt mérhető C18 oszlopon. A táblázat adataiból kiderül, hogy épp a biológiai szempontból leghatékonyabbnak vélt komponenseket nem lehetett IAM oszlopon elválasztani, ennek okát keresve két lehetőséget kellett megfontolnunk. Az egyik, hogy a molekulák passzív transzporttal történő szállítódása, sejtmagba jutása gátolt, így nem képesek az IAM oszloppal létrejövő interakcióra vagy fennragadnak annak felületén. A másik elképzelés az előbbivel szorosan összefügg, talán egymásból következik. Eszerint az IAM oszlop speciális karakterével, az azon elhelyezkedő ionos csoportok jelenlétével lehet összefüggésben a vegyületek viselkedése, hiszen megfigyelhető, hogy tendenciózusan a négy vagy annál több hidroxil-csoportot tartalmazó molekulákat vagy nem tudtuk detektálni vagy asszimmetrikus (tailing) csúcsot (3610) kaptunk a kidolgozott mérési eljárással. Szintén megfigyelhető, hogy az R1 csoportként definiált szubsztituensek pozíciója is befolyásolta az analízist. A 3, 5, illetve 3,5,7 helyzetben helyet foglaló OHvagy OMe-csoportok jelenlétében szintén nem tudtunk az IAM oszlopon megfelelő hatékonyságú elválasztást végrehajtani. Egy esetet kivéve, amely esetben a komponenst ugyan tudtuk detektálni, de a kapott csúcs asszimetrikus volt (3610). Az ilyen vegyületeket tehát nem tudtuk IAM oszlopon analizálni. Az R1 csoporton 5,7 pozícióban elhelyezkedő szubsztituenst tartalmazó vegyületek viszont általában mérhetőek voltak a kidolgozott eljárással. Az analízis kinetikai hatékonysága IAM oszlopon a kromenonok esetén is kisebb volt, mint a fordított fázison.

81

4.4.1.2 CLOGP-logk összefüggés 4

CLOGP

3

2

1

0

-1 -0.5

0.5

0.0

1.0

logk (C18)

40. ábra: CLOGP-logk összefüggés a kromenonokra C18 oszlopon 26. táblázat: Az elválasztás hatékonyságának jellemzése a kromenon család esetén C18 oszlopon Az egyenes paraméterei A* B* Rkoef* SD* P* N*

CLOGP-logk 1,085 2,198 0,898 0,482 <1*10-4 17


A fordított fázison kapott CLOGP-logk összefüggésre lineáris korrelációt sikerült kimutatnunk, 0,898-as korrelációs koefficiens értékkel (40. ábra, 26. táblázat). Értelemszerűen, a nagy, négynél nagyobb számú OH-csoporttal bíró molekuláknak, azaz elsősorban az IAM oszlop által el nem választható vegyületeknek, volt a legkisebb a lipofilitása (3638, 3646, 3614, 3621, 3611 és az IAM oszlopon aszimmetrikus csúcsot adó 3610 molekula).

82

4.4.1.3 Permeabilitás-vizsgálat A molekulák permeabilitás szempontjából igen egységes képet mutattak. Öt vegyületet kivéve mindegyik az alacsony permeabilitású anyagok közé tartozott. Kutatócsoportunk által folyamatban levő vizsgálatok alapján feltételezzük, hogy a NOX-4 enzim a plazma membránban és nem a sejtmagban helyezkedik el, amennyiben ez valóban helytálló feltételezés, az inhibitor molekulának valószínűleg nem szükséges egészen a sejtmagig eljutnia, hogy hatását kifejtse. Emellett ismert, hogy a NOX enzim által termelt H2O2 membránok közötti diffúziója nem gátolt [145], azaz a sejten kívüli térben is elhelyezkedhet,

így

annak

semlegesítésére

szintén

alkalmas

lehet

egy

kis

permeabilitással rendelkező vegyület is. A nagy inhibíciós képességgel bíró molekulák közül a 3618-as vegyület logPe értéke átlépte az -5,82-es határértéket, logPe = -5,01-es permeabilitásával a nagy, de nem kiemelkedően nagy permeabilitású vegyületek közé sorolható. Elképzelhető, hogy a molekula egy része a plazma membránban maradt, így inhibíciós hatását, ha kisebb koncentrációban is, de kifejthette, amennyiben a NOX-4 enzim valóban itt helyezkedik el. Fontos szem előtt tartani továbbá, hogy az aktív transzport lehetőségét sem tudjuk kizárni. A PAMPA vizsgálat tehát a NOX inhibitorok esetén elsősorban azt a célt szolgálta, hogy alátámasszuk az RP oszlopon, illetve az IAM kolonnán nyert adatokat, amelyek azt sugallták, hogy az aktív molekulák nem feltétlenül jutnak el a sejtmagig a sejtes kezelés során. Mivel a PAMPA által nyert permeabilitási adatok többnyire összhangban voltak a kromatográfiásan kapott értékekkel, így ez a vizsgálat is azt mutatta, hogy a NOX-4 inhibitorok közül nagyobb hatásfokot érhetünk el, ha kisebb lipo/foszfolipofilitású, illetve kisebb permeabilitású molekulákat választunk. 4.4.2 Biológiai karakterizálás A kromenon molekulák NOX-4 inhibiciós képességét az elméleti bevezetőben már részletezett H2O2/Tyr/LPO módszerrel vizsgáltuk [143]. Annak érdekében, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy ezeket a vegyületeket fiziko-kémiai szempontból karakterizálva valóban egy új, eddigi vizsgálatainktól eltérő aspektusból alkothatunk meg általános érvényű szabályszerűséget az optimális lipo- és foszfolipofilitási tartományra vonatkozóan, megvizsgáltuk a kromenonok antiproliferációs képességét is MTT teszt segítségével. A tesztben kivétel nélkül az összes molekula hatástalannak 83

bizonyult. Így tehát az optimális lipofilitási tartományt egyedül a NOX inhibíciós képességek alapján jelöltük ki. Az optimális tartomány kereséséhez ebben az esetben is a kapott biológiai adatokat (ez esetben inhibíciós értékeket) hasonlítottuk a mért lipofilitáshoz.

125

Inhibíció / %

100 75 50 25 0 -25 -2.5

0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

k (C18)

41. ábra: NOX-4 inhibició - kC18 összefüggés a kromenon molekulák esetén Amint azt a 41. ábra is mutatja, a legkisebb lipofilitású, illetve többnyire a legtöbb hidroxil-csoportot tartalmazó vegyületek bizonyultak a leghatékonyabbnak. Az inhibíciós képesség szempontjából is a 3,5 vagy a 3,5,7 pozícióban történő szubsztitúció bizonyult ideálisnak. Az optimális lipofilitási tartomány tehát ezen molekulák által jelölhető ki, azaz 0,3 és 3,4 retenciós faktor értékek között, tehát a korábbi tapasztalatainkhoz képest extrém alacsony értékek körül mozog. Egy molekulát (3618) kivéve mindegyiknek kettő alatt van a k értéke. A rendkívül alacsony tartomány azért is lehetséges ebben az esetben, hiszen, amint azt már a 4.4.1.3 fejezetben is tárgyaltuk, a NOX-4 gátlóknak valószínűleg nem feltétlenül szükséges eljutniuk a sejtmagig ahhoz, hogy hatásukat kifejtsék. A NOX-4 enzim plazma membránban levő jelenlétét kutatócsoportunk folyamatosan vizsgálja. Eddig mikroszkópos felvétellel tudtunk meggyőződni (publikáció készítése folyamatban) az enzim membránban történő elhelyezkedéséről az általunk használt transzfektált HEK 293 FS sejtvonal esetén. Mivel a NOX enzim által termelt H2O2 membránok közötti áramlása szabad [145], tehát elhelyezkedése semmiképp nem korlátozódik a sejtmagra, a kromenonok gyökfogóként is megállhatják a helyüket extrém alacsony lipofilitásuk ellenére is.

84

5. Következtetések A bevezetésben már tárgyalt elveket alapul véve, kromatográfiás és időhatékony, ám fontos adatokat szolgáltató biológiai vizsgálatokat felhasználva mutattuk meg, hogy a kutatások korai stádiumában elvégzett vizsgálatok milyen jelentős szerepet töltenek be a gyógyszerfejlesztésben. Amint az már kutatásaink kezdeti stádiumában, illetve az irodalmi áttekintésből is sejthető volt, a Lipinski-szabályok ugyan ideális alapelvül szolgálnak a gyógyszerkutatásban, azonban ma már tudjuk, hogy ezek csupán alapokat szolgáltatnak, azaz szélesebb spektrumot kell lefednünk, amennyiben valóban hatékony gyógyszerjelölteket szelektáló metódust akarunk kidolgozni. Korán nyilvánvalóvá vált például, hogy a lipofilitási értéket optimalizálni kell. A határértékek kijelölése jelentősen függ azonban a biológiai céltól, azaz attól, hogy mi ellen keresünk hatóanyagot. Antiproliferációs vizsgálataink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a közepes lipofilitás, azaz a nem túl kicsi és nem túl nagy lipofilitású molekulák jó eséllyel küzdik le a szervezet által alkotott, hatásuk kifejtését gátló hidrofób és hidrofil akadályokat. Egy esetben, követve a korábbi kutatásokat [70][71], parabolikus összefüggéssel

tudtuk

alátámasztani

elméletünket

(IK-sor),

egy

másik

molekulacsaládnál (auronok) pedig korrelációt ugyan nem állapítottunk meg, de az IC50-k összefüggés egyértelműen kijelölte az ideálisnak tekinthető molekulák tartományát közepes k értékeknél. A red MK-sort egy más aspektusból tudtuk megvizsgálni. Ezeknél a vegyületeknél a keto-csoport és annak enzimekkel létrejövő interakciójának biológiai hatásban betöltött szerepét vizsgáltuk. Az ADME(T) paraméterek térhódításában szerepet játszó szerkezet-hatás összefüggés fontosságát [23] több molekulacsalád vizsgálatával is alá tudtuk támasztani. A lipofilitás szempontjából ideálisnak tekinthető red MK vegyületek 7 sejtvonalon bizonyultak hatástalannak, amely a funkciós csoport minden más paramétert felülíró jelentőségére hívja fel a figyelmet. A molekulacsaládok vizsgálatával lehetőségünk nyílt különböző szerkezeti izomériával bíró vegyületek analizálására, illetve azok elválasztására. A szerkezet és a hatás közötti összefüggést az IK-család esetén is felfedeztünk. Az E, azaz transz helyzetű szubsztitúcióval szintetizált vegyületek között biokémiailag és fizikailag is alkalmasabb komponenseket találtunk, mint a Z, azaz cisz molekulák között.

85

Örök kérdés a lipofilitás meghatározásában hogy mennyire bízhatunk a számítógépes kalkuláció eredményében. Az általunk végzett vizsgálatok alapján egyrészről kiderült, hogy a lipo- és foszfolipofilitási értékek lineáris korrelációban állnak a CLOGPértékekkel, azonban fontos kiemelni az azonos CLOGP-vel bíró vegyületeket (elsősorban szerkezeti izomerek), amelyek a számításos módszerrel nem, de méréssel megkülönböztethetők voltak egymástól. Szerkezet-hatás összefüggést megvizsgáltuk az auron típusú molekulák esetén is. Az alapszerkezetet nem csupán a hozzá kapcsolódó szubsztituensekkel tudjuk modifikálni, maszkírozni. A biológiai, illetve fiziko-kémiai alkalmasságban nagy szerepet játszhat a gyűrűs molekulákban, a gyűrűben jelen levő heteroatom minősége. Az auronok esetén több almolekulacsaládot vizsgálva arra a megállapításra jutottunk, hogy az oxigén atomkén atom cserével nő, míg a kén-SO vagy SO2 csoporttal történő cserével csökken a retenció és a biológiai hatékonyság. A szerkezet-hatás és optimalizációs vizsgálatokat kiterjesztve, azok minél pontosabb kivitelezése érdekében az egyes molekulakönyvtárakat két különböző állófázison is karakterizáltuk. Mivel kutatásaink középpontjában a sejtmembránon történő áthatolás lehetősége állt, így nem csupán a hagyományosan alkalmazott fordított fázisú oszlopot, hanem a membrán kettősréteget modellező, mesterséges membránt tartalmazó IAM oszlopot is alkalmaztuk. A két oszlop közötti elsődleges és legszembetűnőbb különbség az elválasztás időtartamában és az oszlopok kinetikai hatékonyságában volt. Az IAM oszlop esetén sokkal nagyobb retenciós idővel eluálódó komponenseket és nagyobb félértékszélességgel jellemezhető csúcsokat kaptunk. Ennek okát alapvetően két tényezővel tudtuk magyarázni. Az egyik az IAM oszlop esetén fennálló, a bevezetőben már tárgyalt számos kölcsönhatás (úgymint elektrosztatikus, hidrofób, hidrogén hidas, esetleg ionos) jelenléte, a másik pedig a módosított, új generációs IAM oszlopok megnövekedett lipofilitása, amelyet a fejlesztők a foszfatidilkolin kettős láncú észterrel szubsztituált vegyületének az aminoszilikához történő kapcsolásával értek el. A két oszlop szelektivitásban és felbontóképességben azonban nem különbözött egymástól. A kétféle kromatográfiás eljárással pedig nem csupán optimális lipofilitási, de optimális foszfolipofilitási tartományt is ki tudtunk jelölni. Egyedül az utoljára tárgyalt NOX-4 inhibitoroknál ütköztünk akadályba. Az itt tapasztalt észrevételeink alapján az IAM oszlopon (egyébként teljes mértékben elvárt

86

módon) nem volt lehetőség extrém kis lipofilitással bíró vegyületek elemzésére. Az antiproliferatív effektust mutató molekulákkal szemben, a NOX-4 inhibitor molekulák közül nem a közepes, hanem a kis, illetve extrém alacsony lipofilitású vegyületek bizonyultak igen hatékonynak. Ez valószínűleg összefügg azzal a feltételezéssel, miszerint a NOX-4 enzim az általunk használt transzfektált HEK 293 FS sejtvonal esetén nem a sejtmagban, hanem a plazmamembránban található meg, így elméletünk alapján a hatóanyagnak nem szükséges áthaladnia a nagy lipofilitású sejtmembrán alkotóelemeken. Tehát két verziót feltételezhetünk. Az egyik szerint az inhibitor molekulák nem jutnak el a sejtmagig, hanem hatásukat a plazma membránban fejtik ki. A másik alapján pedig a minták aktív transzporttal szállítódnak. Igen fontos tehát, hogy a gyógyszerkutatás során a legelső eldöntendő kérdés az, hogy mi ellen keresünk hatóanyagot. Az így szerzett adatok, illetve az IAM és fordított fázisú oszlop segítségével végzett vizsgálatok alátámasztására, mintegy előkarakterizálásra permeabilitás-mérési módszert alkalmaztunk. A PAMPA (mesterséges membránon történő mérésre alkalmas) eljárással kapott adatokra egyetemesen kijelölt értékek alapján eldönthető, hogy mely anyag rendelkezik nagy és mely kis permeabilitással. A NOX-4 inhibitorokra a permeabilitási vizsgálatban is jelentősen kis logPe értékeket tudtunk megállapítani. A PAMPA teszt által megállapított permeabilitási érték egy egzakt meghatározási módszer az egyes vegyületek penetrációs készségére. Azonban az egyetemesen használt határértékek nem optimális tartományt jelölnek ki. Az IK és red MK sor esetén minden molekula sejtmembránon keresztüli penetrációra alkalmasnak bizonyult. Mivel ezzel a módszerrel csupán spektrofotometriás detektálásra volt lehetőségünk, így optimalizálni nem tudtunk. A kromatográfiásan egyedileg, adott molekulacsaládra kidolgozott nagy érzékenységű lipofilitás meghatározásra irányuló módszerek természetesen sokkal hatékonyabban vethetők össze a kromatográfiásan nyert permeabilitási értékekkel. A kormatográfiás meghatározással sokkal szelektívebben tudjuk az igen kis, 10-6-10-7-es adatok közötti különbségeket detektálni. A PAMPA módszer azonban kiválóan alkalmas előszelektálásra, illetve annak alátámasztására, hogy adott molekula képes vagy nem képes penetrációra a sejtmembránon keresztül. A permeabilitási, lipo- és foszfolipofilitási, illetve az antiproliferációs értékeket, azaz viszonylag könnyen, idő- és költséghatékonyan meghatározott adatokat alapul véve

87

tehát lehetőségünk nyílik az úgynevezett szelektálásra. Természetesen a szelektálás során kettőnél több halmazt is alkothatunk, hiszen képezhetnek külön halmazt a már említett kiugró adatokhoz tartozó molekulák is, azonban ezen vegyületek vizsgálata sok esetben hosszadalmas biológiai mechanizmusbeli kutatást von maga után. Így tehát az általunk is használt hatásos és hatástalan molekulákat tartalmazó halmazok megalkotásával sikeresen kiválaszthatjuk a továbbiakban vizsgálni kívánt vegyületeket. Így tettünk az IK-család esetén. A szelekció hatékonyságát és a korai ADME(T) paraméterek meghatározásának fontosságát jelzi, hogy végül ki tudtuk választani a 4E((2’,4’-dimetoxifenil-4-metilén)-3-izokromanon

molekulát,

amely

több

biológiai

analízisben is kiemelkedő, apoptotikusnak tekinthető hatásmechanizmust mutató vegyületnek bizonyult a vizsgált, humán epidermoid karcinóma sejtvonalon.

88

6. Összefoglalás Jelen értekezés 4 molekulacsalád fiziko-kémiai és biológiai karakterizálásáról, egyes „korai ADME(T)” paraméterek, úgy mint lipofilitás, foszfolipofilitás, permeabilitás, meghatározásáról,

illetve

ezen

paraméterek

biológiai

aktivitással

történő

összehasonlításáról szól. Munkám során három molekulakönyvtár antiproliferációs és egy molekulacsalád NOX-4 inhibíciós hatásának szerkezetfüggését, illetve fizikokémiai paraméterekkel történő korrelációját kutattam. - Különböző szerkezeti (E és Z) izomerek szimultán analízisével bizonyítottam a kidolgozott kromatográfiás eljárások hatékonyságát. - Minden vizsgált molekulacsalád esetén lineáris korrelációt találtam a mért és számított lipo- és foszfolipofilitásérték között. - A mérés fontosságát kiemelendő elválasztottam egymástól az azonos CLOGP értékkel

bíró

molekulákat,

azaz

meghatároztam

azok

egyedi

lipo-

és

foszfolipofilitását. - 4 molekulacsalád segítségével karakterizáltam a kromatográfiás mérések során alkalmazott fordított fázisú és immobilizált mesterséges membrán oszlopot. - Az ADME(T) karakterizálás részeként megvizsgáltam az egyes molekulacsaládok tagjainak penetrációs képességét PAMPA módszer segítségével. - Legfőbb törekvésem az volt, hogy egy olyan lehetőleg minél több fiziko-kémiai és biológiai paraméterrel alátámasztott optimálisnak nevezhető tartományt jelöljek ki, amely több molekulacsaládon keresztül mintegy általános trendet mutat meg alapvető „korai-ADME(T)” szempontból elvárt tulajdonságokra vonatkozólag. Az optimalizálás részeként megállapítottam, hogy a vizsgált molekulakönyvtárak esetén az antiproliferációs képességgel bíró vegyületeknél a közepes, míg a NOX-4 inhibitoroknál az alacsony lipo- és foszfolipofilitási tartomány az ideális. Eredményeim

bizonyítják,

hogy

a

lipofilitás

és

a

biológiai

hatás

közötti

korrelációkeresés igen fontos része a gyógyszerkutatásnak és, hogy az ún. „korai ADME(T)” vizsgálatok által kiválóan szelektálhatóak ki a hatástalan komponensek.

89

Summary In this study four molecule libraries have been characterised using “early ADME(T)” parameters, such as lipophilicity, phospholipophilicity, permeability. Out of the four molecule libraries, three were studied as potential antitumour drug molecules and one as a group of NOX-4 inhibitor candidates. Our aim was to perform a complete correlation analysis between the biological and the physico-chemical data and to study the structure-activity relationship. - Chromatographic separation was carried out on all of the four molecule libraries. Applying the performed highly effective and fast methods, geometric isomers (trans and cis isomers) could be separated and measured simultaneously. - Linear correlation was found between the calculated and measured lipo- and phospholipophilicity values. - Molecules

having

the

same

CLOGP

values

could

also

be

separated

chromatographically. It proves the importance of the measuring procedure compare to the calculation method. - Two columns, such as reversed phase and immobilized artificial membrane columns were characterised using four different molecule libraries. - Permeability, therefore the penetration ability of the potential drug molecules has also been studied applying PAMPA method. - Our aim was to perform a method where as much ADME(T) parameters as possible are used to establish an optimal range of the biological and physicho-chemical data. Using this range a general trend could be created which might be applicable to define the drug-likeness behaviour of a potential drug molecule. In our study, the optimal range proved to be at middle lipo- and phospholipophilicity values for the potential anti-tumour drug compounds and at low lipo- and phospholipophilicity for the NOX4 inhibitors. Our results proved that the correlation analysis between the physicho-chemical and biological data and generally the “early ADME(T)” characterisation is an important and efficient part of the drug discovery. It can be perfectly used to separate the effective from the non-effective, the useful from the not so promising molecules.

90

Irodalomjegyzék [1] Mosby ; Mosby's Dictionary of Medicine, Nursing, & Health Professions. Elsevier Health Sciences, Philadelphia, 2006. [2] http://ec.europa.eu/enterprise/sectors/pharmaceuticals/documents/eudralex/index_en.ht m [3] Ball P., Mandell L., Niki Y., Tillotson G.. (1999) Comparative tolerability of the newer fluoroquinolone antibacterials. Drug Safety, 21: 407-421. [4] http://www.rndsystems.com/product_detail_objectname_parp_colorimetric_assay.aspx [5] http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsand Providers/DrugSafetyInformationforHeathcareProfessionals/PublicHealthAdvisories/U CM053104 [6] Honig P.K., Wortham D.C., Zamani K., Conner D.P, Mullin J.C., Cantilena L.R.. (1993) Terfenadine-ketoconazole interaction. Pharmacokinetic and electrocardiographic consequences. JAMA, 269: 1513-1518. [7] http://www.registech.com/Markets/IAM.html [8] http://www.scienceblog.com/community/older/archives/M/1/fda0462.htm [9] DiMasi J.A., Hansen R.W., Grabowski H.G.. (2003) The price of innovation: new estimates of drug development costs. J Health Economics, 22: 151-185. [10] Ottó Szabolcs, Kásler Miklós. (2005) A hazai és nemzetközi daganatos halálozási és megbetegedési mutatók alakulása. A népegészségügyi programok jellegzetességei és várható eredményei. Magyar Onkol., 49: 99-107. [11] Hansch C., Leo A.; Exploring QSAR Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology. American Chemical Society, Washington, 1995. [12] Terrett N.K., Gardner M., Gordon W. D., Kobylecki J. R., Steele J.. (1995) Combinatorial synthesis — the design of compound libraries and their application to drug discovery. Tetrahedron, 51: 8135-8173.

91

[13] Lipinski A. C., Lombardo F., Dominy W. B., Feeney J. P.. (1997) Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv. Drug Deliv. Rev., 23: 3-25. [14] Rishton M. G.. (2003) Nonleadlikeness and leadlikeness in biochemical screening. Drug Discov. Today, 8: 86-96. [15] Van de Waterbeemd H., Smith A. D., Beaumont K., K. D. Walker. (2001) Property-based design: optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem., 44: 1313-1333. [16] Tsaioun K., Bottlaender M., Mabondzo A.. (2009) ADDME – Avoiding Drug Development Mistakes Early: central nervous system drug discovery perspective. BMC Neurology, 9 (Suppl 1):S1: 1-11. [17] Alonso M. M., Asumendi A., Villar J., Gil J. M., Martínez- Merino V., Encío I., Migliaccio M.. (2003) New benzo(b)thiophenesulphonamide 1,1-dioxide derivatives induce a reactive oxygen species-mediated process of apoptosis in tumour cells. Oncogene, 22: 3759-3769. [18] Villar R., Encio I., Migliaccio M., Gila J. M., Martinez-Merino V.. (2004) Synthesis and cytotoxic activity of lipophilic sulphonamide derivatives of the benzo[b]thiophene 1,1-dioxide. Bioorgan. Med. Chem., 12: 963-968. [19] Encío I., Morré D.J., Villar R., Gil J. M., Martínez-Merino V.. (2005) Benzo[b]thiophenesulphonamide 1,1-dioxide derivatives inhibit tNOX activity in a redox state-dependent manner. Br. J. Cancer, 92: 690 - 695. [20] Yu Y., Lou L, Liu W., Zhu H., Ye Q., Chen X., W. Gao, S. Hou. (2008) Synthesis and anticancer activity of lipophilic platinum(II) complexes of 3,5-diisopropylsalicylate. Eur. J. Med. Chem., 43: 1438-1443. [21] Woerdenbag H., Moskal T., Pras N., Malingré T.. (1993) Cytotoxicity of artemisinin-related endoperoxides to Ehrlich ascites tumor cells. J. Nat. Prod., 56: 849856. [22] John G., Shrivastava R., Chevalier A., J. Pognat, R. Massingham. (1993) An in vitro investigation of the relationships between potency, lipophilicity, cytotoxicity and

92

chemical class of representative calcium antagonist drugs. Pharmacol. Res., 27: 253262. [23] Albert A.. (1971) Relations between molecular structure and biologicalactivity: stages in the evolution of current concepts. Annu. Rev. Pharmacol., 11: 13-36. [24] Burgen S. A.. (1981) Conformational changes and drug action. Fed. Proc., 40: 2723-2728. [25] Cohen E. D., Leonard R. M.. (1995) Immobilized artificial membrane chromatography: a rapid and accurate HPLC method for predicting bile salt-membrane interactions. J. of Lipid Research, 36: 2251-2260. [26] Barrett I., Meegan J. M., Hughes B. R., Carr M., Knox J. S. A., Artemenko N., Golfis G., Zisterer M. D., Lloyd G. D.. (2008) Synthesis, biological evaluation, structural-activity relationship, and docking study for a series of benzoxepin-derived estrogen receptor modulators. Bioorg. Med. Chem., 16: 9554-9573. [27] Chohan K. K., Paine W. S., Waters J. N.. (2006) Quantitative structure activity relationships in drug metabolism. Curr. Top. Med. Chem., 6: 1569-1578. [28] Avdeef A.; Absorption and drug development. Solubility, permeability and charge state, New York, 2003. [29] Valkó K.. (2004) Application of high-performance liquid chromatography based measurements of lipophilicity to model biological distribution. J. Chromatogr. A, 1037: 299-310. [30] Takácsné Novák K., Völgyi G.. (2005) A fizikai-kémiai jellemzés helye és módszerei a gyógyszerkutatásban. Magyar Kémiai Folyóirat, 4: 169-176. [31] Xue L., Bajorath J.. (2000) Molecular descriptors in chemoinformatics, computational combinatorial chemistry, and virtual screening. Comb. Chem. High T. Scr., 3: 363. [32] Braumann Th., Weber G., Grimme H. L.. (1983) Quantitative structure—activity relationships for herbicides: Reversed-phase liquid chromatographic retention parameter, log kw, versus liquid-liquid partition coefficient as a model of the

93

hydrophobicity of phenylureas, s-triazines and phenoxycarbonic ac. J. Chromatogr., 261: 329-343. [33] Lambert J. W.. (1993) Modeling oil—water partitioning and membrane permeation using reversed-phase chromatography. J. Chromatogr., 656: 469-484. [34] Valkó K., My Du Ch., Bevan C., P D. Reynolds, Abraham H. M.. (2001) Rapid Method for the Estimation of Octanol/Water Partition Coefficient (Log Poct) from Gradient RP-HPLC Retention and a Hydrogen Bond Acidity Term (zetaalpha(2)(H)). Curr. Med. Chem., 8: 1137-1146. [35] Escuder-Gilabert L., Martinez-Pla J. J., Sagrado S., Villanueva-Camanas M. R., Medina-Hernández J. M.. (2003) Biopartitioning micellar separation methods: modelling drug absorption. J. Chromatogr. B, 797: 21-35. [36] Djakovic-Sekulic T., Acanski M., Perisic-Janjic N.. (2002) Evaluation of the predictive power of calculation procedure for molecular hydrophobicity of some estradiol derivates. J. Chromatogr. B, 766: 67-75. [37] Carrupt A. P., Testa B., Gaillard P.; Reviews in computational chemistry: Computational Approaches to Lipophilicity: Methods and Applications. Wiley-VCH, New York, 1997: 241-315. [38] Hansch C., Leo A.; Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. Wiley, New York, 1979. [39] Takács-Novák K.. (1998) Computerized logP prediction using fragment methods. Acta Pharm. Hung. (in Hungarian), 68: 39-48. [40] Vallat P., Fan W., Tayar El. N., Carrupt A. P., Testa B.. (1992) Solvatochromic analysis of the retention mechanism of two novel stationary phases used for measuring lipophilicity by RP-HPLC. J. Liquid Chromatogr., 15: 2133. [41] Dobos Zs., Kiss É., Hallgas B., Kéri Gy., Idei M.. (2005) Micellar proportion: A parameter to compare the hydrophobicity of the pseudostationary phases or that of the analytes in micellar electrokinetic chromatography. Electrophoresis, 26: 849-857.

94

[42] Varga A., Huszár M., Dobos Zs., Kiss É., Horváth A., Idei M.. (2009) Characterisation of mixed lithium dodecyl sulphate/lithium perfluorooctanesulphonate pseudo-stationary phases in MEKC. Electrophoresis, 30: 1923-1928. [43] Taillardat-Bertschinger A., Marca Martinet A. C., Carrupt P-A., Reist M., Caron G., Fruttero R., Testa B.. () Molecular Factors Influencing Retention on Immobilized Artifical Membranes (IAM) Compared to Partitioning in Liposomes and n-Octanol. Pharmaceut. Res., 19: 729-737. [44] Verma P. R., Hansch C.. (2004) . Elucidation of structure-activity relationships for 2- or 6-substituted-5,8-dimethoxy-1,4-naphthoquinones. Bioorg. Med. Chem., 12: 59976009. [45] Matysiak J.. (2007) Evaluation of electronic, lipophilic and membrane affinity effects on antiproliferative activity of 5-substituted-2-(2,4-dihydroxyphenyl)- 1,3,4thiadiazoles against various human cancer cells. Eur. J. Med. Chem., 42: 940-947. [46] Campos J., Nunez C. M., Conejo-Garcia A., Sanchez-Martin M. R., HernandezAlcoceba R., Rodriguez-Gonzalez A., Lacal C. J., Gallo A. M., Espinosa A.. (2003) A. QSAR-derived choline kinase inhibitors: how rational can antiproliferative drug design be? Curr. Med. Chem., 10: 1095-1112. [47] Tóth I., Christodoulou M., Bankowsky K., Flinn N., Gibbons A. W., Godeau G., Moczar E., Hornebeck W.. (1995) . Design of potent lipophilic-peptide inhibitors of human neutrophil elastase: In vitro and in vivo studies. Int. J. Pharm., 125: 117-122. [48] Hornebeck W., Moczar E., Szecsi J., Robert L.. (1985) Fatty acid peptide derivatives as model compounds to protect elastin against degradation by elastases. Biochem. Pharmacol., 34: 3315-3321. [49] Lafuma C., Frisdal E., Robert L., Moczar E., Lefrancier P., Hornebeck W.; Lipopeptides as biofunctional inhibitors of elastase-induced emphysema in mice by intratracheal pretreatment with oleoyl-alanyl-alanyl-prolylvaline. Marraud, M.; Vitoux, B., Eds; Second Forum on Peptides, Colloque INSERM / John Libbey Euro. Colloque INSERM / John Libbey Eurotext. Ltd., Nancy, 1989: 321-324.

95

[50] Boduier C., Godeau G., Hornebeck W., Robert L., Bieth G. J.. (1991) The elastolytic activity of cathepsin G: An ex vivo study with dermal elastin. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 4: 497-503. [51] Quartara L., Fabbri G., Ricci R., Patacchini R., Pestellini V., Maggi A. C., Pavone V., Giachetti A., Arcamone F.. (1994) Influence of lipophilicity on the biological activity of cyclic pseudopeptide NK-2 receptor antagonists. J. Med. Chem., 37: 36303638. [52] Regan J., Breitfelder S., Cirillo P., Gilmore T., Graham A. G., Hickey E., Klaus B., Madwed J., Moriak M., Moss N., Pargellis C., Pav S., Proto A., Swinamer A., Tong L., Torcellini C.. (2002) Pyrazole urea-based inhibitors of p38 MAP kinase: from lead compound to clinical candidate. J. Med. Chem., 45: 2994-3008. [53] Regan J., Capolino A., Cirillo F. P., Gilmore T., Graham G. A., Hickey E., Kroe K. R., Madwed J., Moriak M., Nelson R., Pargellis A. C., Swinamer A., Torcellini C., Tsang M., Moss N.. (2003) Structure-activity relationships of the p38r MAP kinase inhibitor

1-(5-tert-Butyl-2-p-tolyl-2H-pyrazol-3-yl)-3-[4-(2-morpholin-4-yl-

ethoxy)naphthalen-1-yl]urea (BIRB 796). J. Med. Chem., 46: 4676-4686. [54] Kim U. C., Lew W., Williams A. M., Liu H., Zhang L., Swaminathan S., Bischofberger N., Chen S. M., Mendel B. D., Tai Y. C., Laver G. W., Stevens C. R.. (1997) Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity. J. Am. Chem. Soc., 119: 681-690. [55] Wenlock C. M., Austin P. R., Barton P., Davis M. A., Leeson D. P.. (2003) A comparison of physiochemical property profiles of development and marketed oral drugs. J. Med. Chem., 46: 1250-1256. [56] Leeson D. P., Springthorpe B.. (2007) The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry. Nat. Rev. Drug Disov., 6: 881-890. [57] Hughes D. J., Blagg J., Price A. D., Bailey S., DeCrescenzo A. G., Devraj V. R., Ellsworth E., Fobian M. Y., Gibbs E. M., Gilles W. R., Greene N., Huang E., KriegerBurke T., Loesel J., Wager T., Whiteley L., Zhang Y.. (2008) Physiochemical drug

96

properties associated with in vivo toxicological outcomes. Bioorg. Med. Chem. Lett., 18: 4872-4875. [58] Waring J. M., Johnstone C.. (2007) A quantitative assessment of hERG liability as a function of lipophilicity. Bioorg. Med. Chem. Lett., 17: 1759-1764. [59] Gleeson P. J. M.. (2008) Generation of a set of simple, interpretable ADMET rules of thumb. J. Med. Chem., 51: 817-834. [60] Waterhouse N. R.. (2003) Determination of lipophilicity and its use as a predictor of blood-brain barrier penetration of molecular imaging agents. Mol. Imaging Biol., 5(6): 376-389. [61] Fish V. P., Ryckmans T., Stobie A., Wakenhut F.. (2008) [4-(Phenoxy)pyridin-3yl]methylamines: A new class of selective noradrenaline reuptake inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett., 18: 1795-1798. [62] Takahashi K., Kunishiro K., Kasai M., Miike T., Kurahashi K., Shirahase H.. (2008) Relationships between lipophilicity and biological activities in a series of indoline-based anti-oxidative acyl-CoA:cholesterol acyltransferase (ACAT) inhibitors. Arzneimittelforschung, 58: 662-672. [63] Waring J. M.. (2009) Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates—Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability. Bioorg. Med. Chem. Lett., 19: 2844-2851. [64] Pop E., Oniciu C. D., Pape E. M., Cramer T. C., J.-L. H. Dasseux. (2004) Lipophilicity parameters and biological activity in a series of compounds with potential cardiovascular applications. Croat. Chem. Acta, 77: 301-306. [65] Fahr A., van Hoogevest P., Kuntsche J., S. Leigh L. M.. (2006) Lipophilic drug transfer between liposomal and biological membranes: what does it mean for parenteral and oral drug delivery? J. Liposome Res., 16: 281-301. [66] Levin A. V.. (1980) Relationship of octanol/water partition coefficient and molecular weight to rat brain capillary permeability. J. Med. Chem., 23: 682-684.

97

[67] Atkinson F., Cole S., Green C., van de Waterbeemd H.. (2002) Lipophilicity and other parameters affecting brain penetration. Curr. Med. Chem.- Central Nervous System Agents, 2: 229-240. [68] Ballet S., Misicka A., Kosson P., Lemieux C., Chung N, Schiller P.W., Lipkowski W. A., Tourwé D.. (2008) Blood-brain barrier penetration by two dermorphin tetrapeptide analogues: role of lipophilicity vs structural flexibility. J. Med. Chem., 51: 2571-2574. [69] De Lange C.- M. E., de Boer A. G. B., Breimer D. D.. (1999) Microdialysis for pharmacokinetic analysis of drug transport to the brain. Adv. Drug Deliv. Rev., 36: 211227. [70] Coats A. E., Milstein R. S., Pleiss A. M., A. J. Roesener. (1978) Comparative analysis

of

the

cytotoxicity

of

substituted

[phenylglyoxal

bis(4-methyl-3-

thiosemicarbazone)]copper(II) chel-ates. 2. Parabolic correlations and their implications for selective toxicity. J. Med. Chem., 21: 804-809. [71] Veldman J. R., Zerp S., Van Blitterswijk J. W., Verheij M.. (2004) N-hexanoylsphingomyelin potentiates in vitro doxorubicin cytotoxicity by enhancing its cellular influx. Br. J. Cancer, 90: 917-925. [72] Didziapetris R., Japertas P., Avdeef A., Petrauskas A.. (2003) Classification analysis of Pglycoprotein substrate specificity. J Drug Target, 11: 391-406. [73] Timmermans B. P., Brands A., van Zwieten P.A.. (1977) Lipophilicity and brain disposition of clonidine and structurally related imidazolidines. N-S. Arch. Pharmacol., 300: 217-226. [74] Gimenez F., Fernandez C., Mabondzo A.. (2004) Transport of HIV protease inhibitors through the blood-brain barrier and interactions with the efflux proteins, pglycoprotein and multidrug resistance proteins. J. Acq. Immun. Def. Synd., 36: 649658. [75] Wunderli-Allenspach H., Ottiger C.. (1999) Immobilized Artificial Membrane (lAM)-HPLC for Partition Studies of Neutral and Ionized Acids and Bases in Comparison with the Liposomal Partition System. Pharmaceut. Res., 16: 643-650.

98

[76] Kulig K., Malawska B.. (2006) Estimation of phospholipophilicity of 1-[3(arylpiperazin-1-yl)-propyl]-pyrrolidin-2-one derivatives on immobilized artificial membrane stationary phase and its correlation with biological data. Biomed. Chromatogr., 20: 1129-1135. [77] Ward S. R., Davies J., Hodges G., Roberts W. D.. (2003) Applications of immobilised artificial membrane chromatography to quaternary alkylammonium sulfobetaines and comparison of chromatographic methods for estimating the octanol– water partition coefficient. J. Chromatogr. A, 1007: 67-75. [78] Kansy M., Senner F., Gubernator K.. (1998) Physicochemical High Throughput Screening: Parallel Artificial Membrane Permeation Assay in the Description of Passive Absorption Processes. J. Med. Chem., 41: 1007-1010. [79] Pratt A. C., Voet D., Voet J.; Fundamentals of biochemistry upgrade. Wiley & Sons Inc., New York, 2002: 264-266. [80] Hubatsch I., Ragnarsson G. E. E., Artursson P.. (2007) Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols, 2: 2111-2119. [81] Wohnsland F., Faller B.. (2001) High-Throughput Permeability pH Profile and High-Throughput Alkane/Water log P with Artificial Membranes. J. Med. Chem., 44: 923-930. [82] Brennan B. M.. (2000) Drug Discovery (Filtering out Failures Early in the Game). Chem. & Eng. News, 78: 63-73. [83] Thompson M., Krull J. U., Worsfold J. P.. (1980) The structure and electrochemical properties of a polymer-supported lipid biosensor. Anal. Chim. Acta, 117: 133-145. [84] Thompson M., Lennox B. R., McClelland A. R.. (1982) Structure and Electrochemical Properties of Microfiltration Filter-Lipid Membrane Systems. Anal. Chem., 54: 76-81. [85] Sugano K., Hamada H., Machida M., Ushio H., Saitoh K., Terada K.. (2001) Optimized Conditions of Bio-mimetic Artificial Membrane Permeability Assay. Int. J. Pharm., 228: 181-188. 99

[86] Avdeef A., Strafford M., Block E., Balogh P. M., Chambliss W., Khan I.. (2001) Drug Absorption In Vitro Model: Filter-Immobilized Artificial Membranes. 2. Studies of the Permeability Properties of Lactones in Piper methysticum Forst. Eur. J. Pharm. Sci., 14: 271-280. [87] Avdeef A., Artursson P., Neuhoff S., Lazarova L., Grasjö J., Tavelin S.. (2005) Caco-2 Permeability of Weakly Basic Drugs Predicted with the Double-Sink PAMPA pKaflux Method. Eur. J. Pharm. Sci., 24: 333-349. [88] Chen X., Murawski A., Patel K.. (2008) A novel design of artificial membrane for improving the PAMPA model. Pharm. Res., 25: 1511-1520. [89] Artursson P., Karlsson J.. (1991) Correlation Between Oral Drug Adsorption in Humans and Apparent Drug Permeability Coefficients in Human Intestinal Epithelial (Caco-2) Cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 175: 880-885. [90] De Sousa R. R., Queiroz C. K., Souza C. A., Gurgueira A. S., Augusto C. A., Miranda A. M., Peppelenbosch P. M., Ferreira V. C., Aoyama H.. (2007) Phosphoprotein levels, MAPK activities and NFkappaB expression are affected by fisetin. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 22: 439-444. [91] Duthie G. G., Crozier A.. (2000) Plant-derived phenolic antioxidants. Curr. Opin. Lipid., 11: 43-47. [92] Kerr F. J., Wyllie H. A., Currie R. A.. (1972) Kerr, JF, Wyllie, AH and Currie, AR (1972). "Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, 26: 239-257. [93] Goodlett R. C., Horn H. K.. (2001) Mechanisms of alcohol-induced damage to the developing nervous system. Alcohol Research & Health, 25: 175-184. [94] Van Cruchten S., Van Den Broeck W.. (2002) Morphological and biochemical aspects of apoptosis, oncosis and necrosis. Anat Histol Embryol, 31: 214-223. [95] Satoh S. M., Lindahl T.. (1992) Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature, 356: 356-358. [96] Virág L., Szabó C.. (2002) The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Pharmacol. Reviews, 54: 375-429.

100

[97] Herrmann M., Lorenz M. H., Vollm R., Gr nkem M., Woithm W., Kaldenm R. J.. (1994) A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acids Res., 22: 5506-5507. [98] http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/apoptosis/dnafragmentation/ [99] Longobardi Givan A.; Flow cytometry: First Principles. Wiley & Sons Inc., New Hampshire, 2001. [100] Taylor A., Marisa H.. (2001) Assessment of nutritional influences on risk for cataract. Nutrition, 17: 845-857. [101] Langseth L.; Oxidants, antioxidants, and disease prevention. ILSI, Brussels, 1995. [102] Lachance A. P., Nakat Z., Jeong W.-S. (2001) Antioxidants: An integrative approach. Nutrition, 17: 835-838. [103] Frei B.. (1994) Reactive Oxygen Species and Antioxidant Vitamins: Mechanisms of Action. The American Journal of Medicine, 97: 3A-7S. [104] Donkó Á., Orient A., Szabó T. P., Németh G., Vántus T., Kéri Gy., Örfi L., Hunyady L., Buday M., Geiszt M.. (2009) Detection of hydrogen peroxide by lactoperoxidase-mediated dityrosine formation. Free Rad. Res., 43: 440-445. [105] Hallgas B., Dobos Zs., sz E., Hollósy F., Schwab E. R., Szabó Z. E., Erős D., Idei M., G. Kéri, Lóránd T.. (2005) Characterization of lipophilicity and antiproliferative activity of E-2-arylmethylene-1-tetralones and their heteroanalogues. J. Chromatogr. B, 819: 283-291. [106] Dobos Zs., Lóránd T., Hollósy F., Hallgas B., Erős D., Mészáros Gy., Kéri Gy., Idei M.. (2004) Determination of the basicity of Mannich ketones by capillary electrophoresis. J. Chromatogr. B, 799: 179-183. [107] Hallgas B., Dobos Zs., Agócs A., Idei M., Kéri G., Loránd T., Mészáros G.. (2007)

Lipophilicity

and

antiproliferative

activity

profiling

of

2-

benzylidencycloalkanones. J. Chromatogr. B, 856: 148-155. [108] Spencer P. E. J.. (2008) Flavonoids: modulators of brain function? Br. J. Nutrition, 99: ES60-ES77.

101

[109] Yamamoto Y., Gaynor R.B.. (2001) Therapeutic potential of inhibition of the NFκB pathway in the treatment of inflammation and cancer. J. Clin.Invest., 107: 135-142. [110] Cushnie P. T. T., Lamb J. A.. (2005) Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Ag., 26: 343-356. [111] Lóránd T., Kocsis B., Sohár P., Nagy G., Kispál Gy., Krane H.-G., Schmitt H., Weckert E.. (2001) Synthesis and antibacterial study of unsaturated Mannich ketones. Eur. J. Med. Chem., 36: 705-717. [112] Sadashiva S. R., Tamizmani T. C., Balasubramanian T., Rupeshkumar M., Balachandrin I.. (2009) In vitro glucose uptake by isolated rat hemi-diaphragm study of Aegle marmelos Correa root. Bangladesh J. Pharmacol., 4: 65-68. [113] Dimmock R. J., Wong L. C. M.. (1976) Bioactivities and potential uses in drug design of acyclic α β -unsaturated ketones. Can. J. Pharm. Sci., 11: 35-53. [114] Geiger H.; The Flavanoids. Chapman & Hill Ltd., London, 1988: 389-397. [115] Ammar S. M., Gerber N. N., Mc Daniel E. L.. (1979) New antibiotic pigments related to fusarubin from fusarium solani (MART.) sacc. , 32: 679-684. [116] Ravisé , Kirkiacharian S. B.. (1978) Effect of the structure of phenolic compounds on the growth inhibition of Phytophthora parasitica and the activity of parasitogenic enzymes. III. Homo-isoflavanones. Phytopath. Zeitschrift, 92: 36-50. [117] Kern H.. (1978) The naphthazarins of fusarium. Ann. Phytopathol., 10: 327-345. [118] Keresztury G., Holly S., Sundius T., Lóránd T.. (2002) Analysis of vibrational spectra of some new E- and Z-4-arylidene-3-isochromanones. Vib. Spectrosc., 29: 5359. [119] Lóránd T., Forgó P., Földesi A., Ősz E., Prókai L.. (2002) Improved solvent-free synthesis and structure elucidation of (E)- and (Z)-4-(arylmethylene)-3-isochromanones. Eur. J. Org. Chem., 17: 2996-3003. [120] Lóránd T., Ősz E., Kispál Gy., Nagy G., Weckert E., Luebbert D., Meents A., Kocsis B., Prókai L.. (2004) Diastereoselective reduction of cyclic bioactive Mannich ketones. Arkivoc vii, : 34-52.

102

[121] Dimmock R. J., Gureshi M. A., Noble M. L., Smith J. P., Baker A. H.. (1976) Comparison of antimicrobial activity of nuclear-substituted aromatic esters of 5dimethylamino-1-phenyl-3-pentanol and 3-dimethylamino-1-phenyl-1-propanol with related cyclic analogs. J. Pharm. Sci., 65: 38-43. [122] Holla S. B., Veerendra B., Shivananda K. M., Poojary B.. (2003) Synthesis characterization and anticancer activity studies on some mannich bases derived from 1,2,4-triazoles. Eur. J. Med. Chem., 38: 759-767. [123] Knabe J., Buch H.P., Schmitt W.. (1983) Derivatives of barbituric acid cytostatic and CNS activities of chiral barbiturate mannich-bases. Arch. Pharm. Chem. Life Sci., 316: 1051-1053. [124] Sriram D., Bal R. T., Yogeesswari P.. (2005) Synthesis, antiviral and antibacterial activities of isatin mannich bases. Med. Chem. Res., 14: 11-28. [125] Lopes F., Capela R., Goncaves O. J., Horton N. P., Hursthouse B. M., Iley J., Casimiro M. C., Bom J., Moreire R.. (2004) Amidomethylation of amodiaquine: antimalarial N-mannich base derivatives. Tetrahedron Lett., 45: 7663-7666. [126] Dimmock R. J., Jonnalagadda S. S., Phillips A. O., Erciyas E., Shyam K., Semple A. H.. (1992) Anticonvulsant properties of some mannich bases of conjugated arylidene ketones. J. Pharm. Sci., 81: 436-440. [127] Gokce E., Bakir G., Sahin F. M., Kupeli E., Yesilada E.. (2005) Synthesis of new mannich bases of arylpyridazinones as analgesic and anti-inflammatory agents. Arzneim. Forsch., 55: 318-325. [128] Kayser O., Kiderlen F. A., Folkens U., Kolodziej H.. (1999) In vitro leishmanicidal activity of aurones. Planta Med., 65: 316-319. [129] Snader M. K., Willis R. C.. (17. 08. 1976) Substituted aurones. Egyesült Államok, United States Patent: 05/4757226. [130] Huang W., Liu Z. M., Li T., Tan Y., Yang F. G.. (2007) Design, syntheses, and antitumor activity of novel chromone and aurone derivatives. Bioorg. Med. Chem., 15: 5191-5197.

103

[131] Ferreiraa O. E., Salvadorb J. M., Pralc M. F. E., Alfieri C. S., Itod Y. I., Dias A. D.. (2004) A New Heptasubstituted (E)-Aurone Glucoside and Other Aromatic Compounds of Gomphrena agrestis with Biological Activity. Z. Naturforsch., 59c: 499505. [132] Hallgas B., Patonay T., Kiss-Szikszai A., Dobos Zs., Hollósy F., Erős D., Őrfi L., Kéri Gy., Idei M.. (2004) Comparison of measured and calculated lipophilicity of substituted aurones and related compounds. J. Chromatogr. B, 801: 229-235. [133] Grundon F. M., Stewart D., Watts E. W.. (1975) Oxidative cyclisation of 2’hydroxychalcones to aurones using mercury(II) acetate in dimethyl sulphoxide. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 772-773. [134] Litkei G., Patonay T.. (1983) Flavonoids 37. Ring Contraction and Ring Enlargement Reactions with Trimethylsilyl Azide in the Field of Flavonoids. Acta Chim. Hung., 114: 47-56. [135] Yamaguchi T., Seki T., Tamaki T., Ichimura K.. (1992) Photochromism of Hemithioindigo Derivatives. I. Preparation and Photochromic Properties in Organic Solvents. B. Chem. Soc. Jpn., 65: 649-656. [136] Adam W., Golsch D., Hadjiarapoglou L., Lévai A., Nemes C., Patonay T.. (1994) Dioxirane oxidation of (Z)-1-thioaurones, (E)-3-arylidene-1-thiochroman-4-ones and (E)-3-arylidene-1-thioflavan-4-ones. Tetrahedron, 50: 13113-13120. [137] Mustafa A., Sallam M. M.. (1959) Experiments with 2-Arylidene-3(2H)thianaphthenone-1,1-dioxides. II. Reactions of p-Thiocresol and of Grignard Reagents with 2-Arylidene-3(2H)-thianaphthenone-1,1-dioxides. J. Am. Chem. Soc., 81: 19801983. [138] Kong F., Carter T. G.. (2003) Remisporine B, a novel dimeric chromenone derived from spontaneous Diels–Alder reaction of remisporine. Tetrahedron Lett., 44: 3119-3122. [139] Raju C. B., Tiwari K. A., Kumar A. J., Ali A. Z., Agawane B. S., Saidachary G., Madhusudana K.. (2010) α-Glucosidase inhibitory antihyperglycemic activity of substituted chromenone derivatives. Bioorg. Med. Chem., 18: 358-365.

104

[140] Horváth A., Nossbaumer P., Wolff B., Billich A.. (2004) 2-(1-Adamantyl)-4(thio)chromenone-6-carboxylic Acids: Potent Reversible Inhibitors of Human Steroid Sulfatase. J. Med. Chem., 47: 4268-4276. [141] Vijayakumar S. B., Sivaram J.. (1997) Antifungal activity of coumarin and its derivatives on pathogenic fungi. J. Maharashtra Agric. Univ. , 22: 346-347. [142] David B., Knoxville N. T.. (12. 01. 1998) Pyran-chromenone compounds, their synthesis and anti-HIV activity. Egyesült Államok, United States Patent: 5843990. [143] Borbély G., Szabadkai I., Horváth Z., Markó P., Varga Z., Breza N., Baska F., Vántus T., Huszár M., Geiszt M., Hunyady L., Buday L., Örfi L., Kéri Gy.. (2010) Small-Molecule Inhibitors of NADPH Oxidase 4. J. Med. Chem., 53: 6758-6762. [144] Hollósy F., Lóránd T., Örfi L., Erős D., Kéri Gy., Idei M.. (2002) Evaluation of Hydrophobicity and Antitumor Activity of a Molecule Library of Mannich Ketones of Cycloalkanones. J. Liq. Chrom & Rel. Technol., 25: 1129-1143. [145] Allen M. D.. (1974) The relationship between variable selection and prediction. Technometrics, 16: 125-127. [146] Willekens H., Chamnongpol S., Davey M., Schraudner M., Langebartels C., Van Montagu M., Inzé D., Van Camp W.. (1997) Catalase is a sink for H2O2 and is indispensable for stress defence in C3 plants. The EMBO Journal, 16: 4806-4816.

105

Saját közlemények Az értekezés témájában megjelent közlemények: 1.

Huszar M., Varga A., Horvath A., Lorand T., Agocs A., Idei M., Mandl J., Vantus T., Keri, G.. (2010) Comparative Characterization of Experimental and Calculated Lipophilicity and Anti-Tumour Activity of Isochromanone Derivatives. Curr. Med. Chem., 17: 321-333. IF: 4,94.

2.

Huszár M., Hallgas B., Idei M., Kiss-Szikszai A., Horváth A., Patonay T.. (2008) Lipophilicity of Substituted Aurones and Related Compounds Measured on Immobilized Artificial Membrane (IAM) and Conventional C8 (MOS) Columns. J. of Liq. Chrom. and Rel. Technologies, 31: 3143–3158. IF: 0,98.

3.

Huszár M., Idei M., Vántus T., Varga A., Agócs A., Kéri G., Lóránd T.. Characterisation of the promising members from the isochromanone molecule library. ISC 2008 - 27th International Symposium on Chromatography, 2008, Münster, Németország.

4.

Lóránd T., Huszár M., Vántus T., Idei M., Horváth A., Kéri G.. Lipophilicity and antiproliferative activity profiling of 4-(arylmethylene)-3-isochromanones. 4th Summer School "Medicinal Chemistry", 2008, Regensburg, Németország.

5.

Huszár M., Hallgas B., Idei M., Erős D., Szabó E. Z., Bökönyi G., Vántus T., Kéri G., Lóránd T.. Measuring of the lipophilicity and biological properties of the isochromanone molecular library. 31st International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, 2007, Ghent, Belgium.

6.

Huszár M., Varga A., Horváth A., Lóránd T., Agócs A., Vántus T., Kéri Gy., Idei M.. ADME(T) Parameters of Fused Mannich Ketone and Isochromanone Molecular Libraries Collected by Separation Methods. 7th Aegean Analytical Chemistry Days, 2010, Lesvos, Görögország.

106

Egyéb közlemények: 7.

Varga A., Huszár M., Dobos Zs., Kiss É., Horváth A., Idei M.. (2009) Characterisation

of

mixed

lithium

dodecyl

sulphate/lithium

perfluorooctanesulphonate pseudo-stationary phases in MEKC. Electrophoresis, 30: 1923–1928. IF: 3,609. 8.

Borbély G., Szabadkai I., Horváth Z., Markó P., Varga Z., Breza N., Vántus T., Huszár M., Geiszt M., Donkó Á., Hunyady L., Buday L., Őrfi L., Kéri Gy.. (2010) Small - molecule inhibitors of Nox-4 NAD(P)H oxidase. J. Med. Chem. 53 (18): 6758-6762. IF: 4,802.

9.

Huszár M., Varga A., Metlen A., Horváth A., Vántus T., Rodríguez H., Idei M., Kéri G.; Rogers R. D.. Analytical and biological study of a new hydroxiquinoline-based library. COIL-3, 3rd Congress on Ionic Liquids, 2009, Cairns, Ausztrália.

10. Reischl R. J., Carrozzo M. M., Bomke S., Huszar M.. Enantioseparation of amino acids after labelling of the N-terminus with ferrocenylpropionate using quinine based stationary phases and LC-ESI-MS/MS detection. HPLC 2010, 2010, Boston, Egyesült Államok.

107

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet szeretnék mondani: -

Dr. Idei Miklósnak, témavezetőmnek a rengeteg szakmai segítségért, a folyamatos támogatásért, értékes tanácsaiért. Külön köszönettel tartozom azért, hogy még külföldi tanulmányaim és munkám alatt is folyamatosan számíthattam rá.

-

Prof. Dr. Kéri Györgynek, a Jeltovábbítási Terápiás Kutatócsoport vezetőjének, aki számos hasznos tanáccsal látott el és akitől rengeteg bátorítást kaptam mind hazai, mind pedig külföldi kutatómunkám során.

-

Prof. Dr. Mandl Józsefnek, az SE Orvos Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet, illetve az MTA-SE Pathobiokémiai Kutatócsoport vezetőjének, aki lehetőséget adott, hogy intézetében, illetve csoportjában végezhessem kutatómunkám.

-

Külön köszönettel tartozom Dr. Horváth Anikónak, akire nem csak szakmailag, de emberileg is mindig számíthattam, illetve Dr. Vántus Tibornak, aki sokat segített abban, hogy kémiai ismereteimet kibővítsem biológiai tudásanyaggal is.

-

Munkatársaimnak, Bökönyi Györgyinek, Tanai Henriettenek, Varga Andrásnak, Varga Attilának, Hallgas Balázsnak, Zdravicsné Szabó Editnek, Borbély Gábornak, Székely Edina Ritának, Dr. Bencze Gyulának és Tóvári Emőkének a szakmai és emberi téren nyújtott segítségért.

-

Nagyon köszönöm páromnak, szüleimnek és barátaimnak a sok-sok bíztatást, sok türelmet és támogatást, amelyet az évek során kaptam és amely nélkül nem készülhetett volna el ez a dolgozat.

108

Doktori értekezés. Huszár Mónika. Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Recommend Documents