16
DPTE 2004-2010 - Resultaten uit de projecten van het stimuleringsprogramma voor Regeneratieve Geneeskunde
Gerjo van Osch, Erasmus MC Rotterdam
Botvorming uit kraakbeen voorkomen
Verreweg het meeste onderzoek door tissue engineers aan kraakbeen geschiedt aan gewrichtskraakbeen. Het lichaam kent echter nog talloze andere soorten kraakbeen, zoals in het hoofdhalsgebied. Dat zijn bijvoorbeeld het kraakbeen van de oorschelp en het neustussenschot en in de luchtweg, waar het kraakbeen van levensbelang is. Die verschillende vormen van kraakbeen zijn allemaal anders en hebben ook verschillende mechanische functies. Medisch bioloog dr. Gerjo van Osch, werkzaam bij de afdelingen Orthopaedie en KNO van het Erasmus MC wil al die verschillende soorten kunnen maken. ‘Zowel vanuit een fundamenteel wetenschappelijk als een klinisch oogpunt wil ik de mechanismen waarlangs kraakbeen wordt gevormd zo fine tunen dat ik kan bepalen of er glasachtig (hyaline), elastisch of meer fibreus kraakbeen ontstaat.’ Daarvoor bestudeert Van Osch de verschillen tussen de diverse cellen die kraakbeen vormen en de groei- en afbraakfactoren die de uitkomst van de kraakbeendepositie sturen.
Van Osch heeft al snel geconstateerd dat onderzoek van de kraakbeenvorming in het lichaam bijna onbegonnen werk is. Niet alleen is het ene kraakbeen het andere niet, ook de cellen die erbij betrokken zijn, zijn verre van eenduidig. Er zijn diverse cellen geïsoleerd uit het beenmerg. De bekendste daarvan zijn de MSCs - de multipotente stromale stamcellen, genoemd naar het compartiment in het beenmerg (het stroma) waarin ze worden gevonden Zij kunnen vele soorten weefsels vormen, waaronder kraakbeen. Van Osch besloot te onderzoeken wat er in het embryo gebeurt. ‘Het vroege embryo kent nog geen bot, alleen kraakbeen’, zegt ze. ‘De botten ontstaan later uit die kraakbenige structuur. Die verbeent. Dat gebeurt ook als je een stukje kraakbeen, gemaakt uit MSCs, onder de huid van een muis plant. Dan groeit het uit tot prachtig bot; er groeien bloedvaatjes het kraakbeen in en botcellen gaan ernaar toe. Met behulp van MSCs en groeifactoren kunnen we dus kraakbeen maken dat lijkt op de kraakbenige groeischijven die zich bij kinderen in het bot bevinden en voor de groei zorgen.’
Het lukt Van Osch wel om dit soort kraakbeen te maken met MSCs. De kraakbeencellen uit het gewrichtskraakbeen echter, en die uit het kraakbeen in het oor en het neustussenschot, ondergaan zo’n metamorfose tot bot niet. Zulk kraakbeen blijft kraakbeen. Van Osch: ‘Blijkbaar zijn de MSCs anders dan de gedifferentieerde kraakbeencellen. We hebben onderzocht wat er in de cellen gebeurt tijdens het kweken van de cellen die we gebruiken om kraakbeen te maken.’
Donaties van patiënten Daarvoor hebben de onderzoekers kraakbeencellen uit oorschelp en neustussenschot van patiënten die bijvoorbeeld een neuscorrectie ondergingen, bestudeerd. Ze maakten met behulp van micro-array techniek profielen van de genexpressie van de cellen op het moment dat ze net uit de patiënt kwamen en nadat de cellen gedurende twee, vier en zes passages in het laboratorium waren doorgekweekt. ‘We hadden gedacht dat de profielen van de kraakbeencellen uit de twee verschillende bronnen met elke passage van de kweek meer op elkaar zouden gaan lijken, meer op een MSC die
immers ook vet en bot kan worden. Dat bleek niet het geval te zijn.’
Cartilage formed by human bone marrow derived mesenchymal stem cells in culture. Red stain is collagen type II containing matrix.
8 weeks after subcutaneous implantatoin in mice, the cartilage is replaced by bone
De kraakbeencellen die uit het oor komen, blijken twee groeifactoren (BMP5 en IGF1) in extra grote hoeveelheden aan te maken. Deze cellen maken ook het beste kraakbeen. De kraakbeencellen uit het neustussenschot produceren opvallend veel van twee enzymen die de extracellulaire matrix, waarin de cellen liggen, afbreken (MMP13 en ADAMTS5). Die enzymen breken zowel het collageen als het glycosaminoglycaan in het kraakbeen af. Van Osch: ‘Blijkbaar onthouden de cellen van welke oorsprong ze afkomstig zijn. We proberen die informatie te gebruiken om cellen te stimuleren kraakbeen in voldoende grote hoeveelheid en van het juiste type te maken. Er zijn grote verschillen tussen de weefselmonsters die we van patiënten krijgen. Sommige mensen maken gemakkelijk en goed kraakbeen aan, anderen veel minder. Er is niet alleen verschil tussen donors, in het algemeen maken kraakbeencellen uit het
oor beter kraakbeen dan die uit de neus. We denken dat ze dat doen doordat ze factoren uitscheiden die andere cellen stimuleren.’ Om dat te achterhalen, ging Van Osch weer te rade bij de embryonale kraakbeenvorming. Ze vond belangrijke verschillen tussen MSCs, kraakbeencellen uit het gewricht en de ‘groeischijf’ in de embryonale botjes, wat betreft diverse signaleringsroutes in de cellen. Sommige factoren zijn nodig in het begin van de ontwikkeling van het embryo, maar als ze iets later in die ontwikkeling worden uitgeschakeld, stokt het verbeningsproces.
Vroeger in het kweekproces Van Osch: ‘Wat we hebben gevonden, zetten we nu in om MSCs te stimuleren beter kraakbeen te maken. Zover zijn we nog niet. Wij gaan er wel nog steeds van uit dat de MSCs alle typen chondrocyten kunnen vormen, maar we weten nog niet hoe we dat moeten stimuleren.’ Daarover is Van Osch wel wat teleurgesteld.
‘Hoewel ik ben begonnen met te proberen het ontstaan van het gewenste type kraakbeen uit MSCs te sturen, moet ik constateren dat we niet op de goede weg zitten. We weten niet hoe we het juiste kraakbeen moeten maken. Wel weten we nu dat je zo kraakbeen kunt maken, maar zetten we dat in een muis, dan verandert binnen acht weken al het kraakbeen in bot. Dat is een leuke conclusie voor mensen die met bot werken, niet voor kraakbeenonderzoekers. We hebben wel veel inzicht gekregen in verschillen tussen cellen en het belang van een goede timing bij het toevoegen van groeifactoren in celkweek. Ik denk dat we nog vroeger in het kweekproces moeten kijken wat precies in de cellen gebeurt en daar ingrijpen.’
17
DPTE 2004-2010 - Resultaten uit de projecten van het stimuleringsprogramma voor Regeneratieve Geneeskunde
Pieter Buma, UMC St Radboud Nijmegen
Op zoek naar het beste van twee werelden
Het ene kraakbeen is het andere niet. Het kraakbeen van de oorschelp is flexibel, dat van het neustussenschot is wat steviger en het kraakbeen in de gewrichten is uitermate hard, maar het kraakbeen van de meniscus is weer anders. Hoewel de kraakbeencellen in principe dezelfde zijn, maken ze op de diverse plaatsen een andere extracellulaire matrix. Dit materiaal waarin de cellen zijn ingebed, geeft het kraakbeen zijn kenmerkende eigenschappen. Collageen, een eiwit waarvan meer dan een handvol verschillende typen bekend zijn, vormt een belangrijk bestanddeel van het kraakbeen. Hoewel de structuur van kraakbeen eenvoudig lijkt, blijkt deze moeilijk na te bootsen. Tissue engineers zoeken nog steeds naar de juiste materialen met de juiste mechanische en biologische eigenschappen. Prof. dr. Pieter Buma, hoogleraar Experimentele Orthopedie, bij het UMC St Radboud in Nijmegen is één van hen. ‘We waren niet zo tevreden over de bestaande polymere dragers die we, samen met anderen, hadden ontwikkeld ter vervanging van de meniscus in het kniegewricht. We wilden ze graag combineren met dragermateriaal van biologische oorsprong.’
Al geruime tijd werkten Buma en zijn collega’s van het Orthopedisch Onderzoeks laboratorium met een dragermateriaal dat bestaat uit een combinatie van caprolactaan en poly-uretaan (PCL-PU). Daarvan maakten zij dragers ter vervanging van een deel van de meniscus. Samen met Polyganics, een Gronings polymeertechnisch bedrijf, ontwierpen zij verschillende nieuwe polymere dragers (scaffolds) van polyurethaan, die een wijdmazige poreuze matrix opleveren. In het lichaam breekt het materiaal af door hydrolyse, zodat het langzaam maar zeker vervangen wordt door de natuurlijke extracellulaire matrix die de kraakbeencellen zelf produceren. ‘Toch wilden wij een nog beter drager materiaal voor het herstellen van kraakbeen’, zegt Buma. ‘Bij het behandelen van kraakbeenbeschadigingen in gewrichten is men wel in staat kraakbeen te laten teruggroeien vanuit het eronder liggende botweefsel, maar dat is niet de goede vorm. Het is nogal fibreus, nogal zacht, terwijl op die plek behoefte is aan het steviger en stoot bestendiger hyaline kraakbeen. Daarin bevindt zich vooral het type I collageen in plaats van type II. Bovendien verliep de
ingroei van nieuw weefsel niet snel genoeg in proefdieren.’ De onderzoekers bedachten om twee soorten matrixen met elkaar te combineren en zo het beste van twee werelden over te houden: de sterkte van de polymere matrix en de bindingsmogelijkheden voor groeifactoren van het collageen. ‘Het was eerder al mogelijk gebleken groeifactoren te koppelen aan collageen’, zegt Buma. ‘Maar het blijkt in de praktijk lastig om de twee verschillende soorten dragermateriaal met elkaar te combineren. Het idee was om type I collageen in opgeloste vorm te laten neerslaan in een poreuze drager van het polymeer en daar vervolgens heparine aan te koppelen - dat beschermt groeifactoren tegen afbraak - en er tenslotte de groeifactoren aan te hangen. Hoe wij het ook probeerden, het lukte maar niet het collageen op een gecontroleerde manier in de polymere scaffold te krijgen.’
Eiwit-linkertje De onderzoekers hebben wel veel geleerd over waarom bepaalde zaken niet werken zoals ze hadden gehoopt. Maar ze ervoeren de uitkom-
Onderzoeker bij het BozeElectroForce apparaat waarmee belastingproeven op scaffolds uitgevoerd worden
sten toch als een teleurstelling. Buma: ‘Daar kwam ook bij dat we erg veel moeite hebben gehad met het differentiëren van de stamcellen. Uiteindelijk zijn we overgestapt op een meer directer manier van het activeren van polymeren. Langs chemische weg hebben we na de polymerisatie van het molecuul weer een aantal esterverbindingen open gebroken. Daar koppelen we dan via een speciaal ontworpen “eiwit-linkertje” de heparine aan. Het eiwit-linkertje is een soort verbindingsstuk met aan de ene kant een bindingplaats voor het polymeer en aan de andere kant voor eiwitten, zoals heparine en groeifactoren.’
de vezels in de scaffold zijn gerangschikt, invloed heeft op de manier waarop kraakbeendefecten herstellen. We proberen nu een dragermateriaal te maken dat an-isotroop is, dus waarin de poriestructuur geen specifieke richting heeft en de moleculen niet kriskras door elkaar liggen. We denken dan dat cellen die vanuit het bot de matrix ingroeien efficiënter hun werk kunnen doen doordat de ze sneller op hun plek aankomen en vervolgens een kraakbeen vormen met een meer hyaline structuur. Het effect van deze an-isotrope scaffolds gaan we nu in dieren onderzoeken.’
Luidsprekers De groep van Buma werkt met andere onderzoeksgroepen ook aan matrixen die volledig zijn opgebouwd uit collageen. Die kunnen worden gebruikt voor het opvullen van relatief kleine defecten in kraakbeen welke niet teveel worden belast. Daar ligt de aandacht vooral op de structuur van het dragermateriaal. Buma: ‘Wij denken dat de wijze waarop
In zijn orthopedisch onderzoekslab bestudeert Buma ook de invloed van mechanische druk op de ontwikkeling van kraakbeen. ‘We hebben een bioreactor waarin mechanische krachten kunnen worden uitgeoefend op de scaffolds. De reactor wordt gestuurd met behulp van een magneetveld, vergelijkbaar met de wijze waarop luidsprekers werken. Dat
moet op zeer subtiele en gecontroleerde wijze gebeuren en daarvoor is ook een producent van luidsprekers en versterkers ingeschakeld. We onderzoeken of we de ontwikkeling van kraakbeencellen tot het produceren van de juiste extracellulaire matrix op dezelfde manier kunnen beïnvloeden als met groeifactoren die de differentiatie van cellen sturen.’ De onderzoekers gaan zich vooral richten op de tissue engineering van meniscusweefsel. Buma: ‘Scheuren in de meniscus vormen een belangrijk klinisch probleem dat ook nauwe relaties heeft met het ontstaan van schade aan het gewrichtskraakbeen. Het concept van de an-isotrope scaffolds zou voor meniscusweefsel nog wel eens belangrijker kunnen zijn dan voor gewrichtskraakbeen.’
18
DPTE 2004-2010 - Resultaten uit de projecten van het stimuleringsprogramma voor Regeneratieve Geneeskunde
Peter van der Kraan, UMC St Radboud Nijmegen
Giftige kraakbeensoep in gewrichten
Dr. Peter van der Kraan is geïnteresseerd in soep. In synoviale soep wel te verstaan. Een mengsel van weefselvocht, eiwitten en andere factoren dat zich bevindt in de gewrichtsholte. In gezonde toestand voedt deze gewrichtsvloeistof het kraakbeen en levert zij de noodzakelijke smering van het gewricht. Maar gaat er iets mis door bijvoorbeeld een beschadiging van het kraakbeen of een ontsteking, dan kan die voedende soep veranderen in een kwaadaardig brouwsel dat het herstel van kraakbeen juist blokkeert of het kraakbeen zelfs afbreekt. Doordat de giftige soep het herstel van kraakbeen blokkeert, gaat het langzaam maar zeker steeds verder kapot en ontstaat uiteindelijk, soms pas na tientallen jaren, artrose in het gewricht. In het pijnlijke gewricht wordt het van kwaad tot erger tot een vervanging ervan uiteindelijk niet valt te vermijden. Bij de afdeling Reumatologie van het Nijmeegse UMC St Radboud onderzoekt pathobioloog Van der Kraan hoe de synoviale soep weer op smaak kan worden gebracht.
Met zijn kraakbeen moet een mens zijn hele leven doen. Kraakbeen kan zichzelf niet repareren. Vandaar dat een ontsteking van kraakbeen of een trauma, zoals een sport ongeluk, zulke dramatische gevolgen voor een gewricht kan hebben. Soms ontstaat de kraakbeenafbraak door een voorafgaande ontsteking (de arthritis), in andere gevallen volgt de ontsteking juist op de kraakbeen afbraak, bijvoorbeeld na een trauma, een ongeval of een sportblessure. Het gewrichtskraakbeen dient als een soort stootkussen en moet de krachten die op een gewricht werken gelijkmatig verdelen. Kraakbeen bestaat dan ook vooral uit een netwerk van eiwit- en suikermoleculen die, in het geval van de gewrichten, het weefsel stijfheid en een groot dempend vermogen geeft. Er bevinden zich relatief weinig cellen in het kraakbeen en er lopen geen bloedvaatjes doorheen. De cellen worden voorzien van (weinig) zuurstof en voedingsstoffen door de pompfunctie die in het kraakbeen ontstaat als er kracht op wordt uitgeoefend. Van der Kraan: ‘Soms komt er bij een ontsteking of een beschadiging wel wat herstel op gang, maar die weinige cellen
zijn niet in staat het hele weefsel te herstellen. Ze hebben al hun handen vol om het te onderhouden.’ Doordat het kraakbeen zich na een trauma niet kan herstellen, gaat het mis met de gelijkmatige drukverdeling in het gewricht. Daardoor wordt de schade groter en vermindert de functie van het kraakbeen verder, zodat het van kwaad tot erger gaat en het gewricht pijnlijk en zelfs onbruikbaar wordt. ‘Op het moment dat er een trauma is, verandert de toestand in het gewricht doordat er altijd ontstekingsachtige verschijnselen optreden die de beschadigingen op proberen te ruimen. Er komen ontstekingscellen, zoals macrofagen, die allerlei signaalstoffen afgeven’, zegt Van der Kraan. ‘Onze hypothese is dat daardoor in het de gewrichtsvloeistof allerlei factoren terecht komen die een negatief effect hebben op de kraakbeencellen (de chondrocyten) en de stamcellen, die vanuit het beenmerg komen om te helpen. Er blijken inderdaad zeer potente factoren in de gewrichtssoep te zitten die de vorming van kraakbeen uit stamcellen
blokkeren en een algemeen negatief effect op de kraakbeenvorming hebben. Bijvoorbeeld de cytokinen IL-1 en TNF.’
Vier signaalroutes
Effect of IL-1 on chondrogenesis of human MSC – P van der Kraan.
Dus gingen de onderzoekers op zoek naar manieren om die negatieve effecten van de gewrichtsvloeistof te blokkeren. Daartoe zijn ze begonnen met de samenstelling van de soep en de stamcellen in kaart te brengen en te vergelijken met een gezonde situatie. Ze zetten daarbij micro-arrays in om de activiteit van tienduizenden genen in de stam cellen te bepalen en geavanceerde analytische software om daarin patronen te herkennen. Daarbij ontdekten ze een aantal interessante verschillen in de activiteit van vier signaalroutes die betrokken lijken te zijn bij de vorming van kraakbeen uit stamcellen. Van der Kraan: ‘Maar er waren ook routes bij die een meer algemene rol in cellen spelen en niet louter zijn gericht op de vorming van kraakbeen. Er zijn chemische verbindingen te koop die verschillende stap-
pen in de diverse routes kunnen remmen. Of we maken die zelf in het lab. We onderzoeken nu het effect van zulke stoffen. We hopen zo te komen op middelen die de vorming van kraakbeen stimuleren. Zo kunnen we wellicht de techniek ondersteunen die nu het meest wordt toegepast voor het repareren van kraakbeen dat is beschadigd na een trauma.’ Die techniek behelst het boren van een gaatje in de beschadiging van het kraakbeen tot in het eronder liggende bot, zodat daaruit stamcellen naar het kraakbeen kunnen migreren. De resultaten daarvan vallen tegen doordat er onvoldoende kraakbeen wordt gevormd. ‘Als de patiënt tegelijkertijd gedurende korte tijd een middel slikt dat, via de door ons gevonden route in de stamcellen, de vorming van kraakbeen stimuleert, is het succes wellicht groter. Je kunt ook denken aan het aanbrengen van een tijdelijk depot van zo’n stof in het gewricht’, hoopt Van der Kraan.
Zover is het nog lang niet, waarschuwt hij. ‘Het is nog te vroeg voor farmaceutica. Onze hypothese blijkt te kloppen: factoren in de gewrichtsvloeistof belemmeren de vorming van kraakbeen en dat is terug te vinden op specifieke plaatsen in de signaalroutes van de stamcellen. We zijn nu bezig de door ons in een in weefselkweekmodel gevonden remmende stoffen toe te passen in vivo met een muizenmodel. We hadden gehoopt dat we nu verder zouden zijn, maar wetenschap is nu eenmaal een kwestie van slechts kleine stapjes vooruit.’
