BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor pada bulan November 2009 sampai Juni 2010.
Bahan dan alat Bahan tanaman yang dipakai yaitu biji lada Petaling masak fisiologis. Media yang dipakai adalah media dasar MS (Murashige-Skoog) (Lampiran 1) dengan vitamin Schenk dan Hildebrandt (SH) dan B5 (Gamborg’s). Zat pengatur tumbuh yang dipakai adalah BAP 0.0 ppm, 0.3 ppm, 0.5 ppm, dan 1.0 ppm. Pematah dormansi yang digunakan adalah H2SO4 10 %, 15 %, dan 30 %. Bahan sterilisasi yang digunakan adalah HgCl2 2.5 %, alkohol 70 %, alkohol 96 %, glukosa 3 %, aquades steril, dan deterjen. Senyawa antioksidan yang digunakan adalah PVP 100 mg/l dan arang aktif 2 %. Bahan lain yang digunakan yaitu HCL 1.0 N dan 0.1 N, NaOH 1.0 N dan 0.1 N, alumunium foil, plastik wrap, spirtus, tissue, Phytagel. Peralatan untuk pembuatan media yaitu gelas ukur, labu takar, erlenmeyer, gelas piala, pipet volumetrik, magnetic stirer, spatula, hot plate, botol kultur, corong, timbangan analitik, pH meter, autoclave, dan oven. Peralatan untuk menanam antara lain Laminar Air Flow Cabinet, petridis, lampu bunsen, pinset, hand sprayer, pisau, dan gunting. Peralatan lain yang digunakan yaitu tabung plastic steril (corning), lemari asam, ruang gelap 21-25oC, ruang kultur dengan intensitas cahaya 1900 lux, rak kultur, penggaris dan kamera digital.
Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari tiga percobaan yaitu : 1. Percobaan Pematahan Dormansi Biji lada
13
Rancangan percobaan yang digunakan
yaitu Rancangan Kelompok
Lengkap Teracak (RKLT) dengan satu faktor yaitu konsentrasi H2SO4 (H) yang terdiri dari tiga taraf yaitu perendaman dalam H2SO4 10 % (H1), 15 % (H2), dan 30 % (H3) dengan lama perendaman masing-masing adalah lima menit. Percobaan ini dilakukan dengan delapan ulangan sehingga berjumlah 24 satuan percobaan. Setiap satu satuan percobaan terdiri dari satu botol kultur yang berisi 6 biji lada. Model rancangan yang digunakan pada percobaan 1 adalah : Yij = µ + τi + βj + εij i = 1,2,3,….. j = 1,2,3,……. Yij
= Nilai pengamatan pada perlakuan ke-i dan kelompok ke-j
µ
= Nilai tengah umum
τi
= Pengaruh Perlakuan ke-i
βj
= Pengaruh kelompok ke-j
εij
= Galat perlakuan ke –i dan kelompok ke-j 2. Percobaan Perkecambahan Biji Lada Rancangan percobaan yang digunakan yaitu Rancangan Acak Lengkap
(RAL) Faktorial dua faktor. Faktor pertama adalah konsentrasi BAP (B) dengan empat taraf yaitu 0.0 ppm (B0), 0.3 ppm (B1), 0.5 ppm (B2), dan 1.0 ppm (B3). Faktor kedua adalah senyawa antioksidan (C) terdiri dari dua jenis yaitu arang aktif 2 % (C1) dan PVP 100 mg/l (C2). Percobaan ini berjumlah delapan kombinasi perlakuan dengan sepuluh ulangan sehingga berjumlah 80 satuan percobaan. Setiap satu satuan percobaan terdiri dari satu botol kultur yang berisi 6 biji lada. 3. Percobaan Perbanyakan Tunas Lada Rancangan percobaan yang digunakan yaitu RAL Faktorial dua faktor. Faktor pertama adalah konsentrasi BAP (B) dengan empat taraf yaitu 0.0 ppm (B0), 0.3 ppm (B1), 0.5 ppm (B2), dan 1.0 ppm (B3) dan faktor kedua adalah pemberian vitamin (V) dengan dua jenis yaitu SH (V1) dan B5 (V2). Percobaan ini berjumlah delapan kombinasi perlakuan dengan sepuluh ulangan sehingga berjumlah 80 satuan percobaan. Setiap ulangan terdiri dari satu botol kultur yang berisi satu eksplan.
14
Model rancangan yang digunakan pada percobaan 2 dan 3 adalah : Yijk = µ + ui + αj + βk + (αβ)jk + εijk i =1,2,3,…… j = 1,2,3,….. k = 1,2,3……. Yijk
= Nilai pengamatan untuk perlakuan satu ke-j, perlakuan dua ke-k dan ulangan ke-i
µ
= Nilai tengah umum
ui
= Ulangan ke-i
αj
= Pengaruh dari perlakuan satu ke-j
βk
= Pengaruh dari perlakuan dua ke-k
(αβ)jk = Pengaruh interaksi antara perlakuan satu ke-j dan perlakuan dua ke-k εijk
= Pengaruh galat percobaan perlakuan satu ke-j, perlakuan dua ke-k dan ulangan ke-i Pengujian data peubah yang diperoleh dilakukan melalui uji F (data
normal) dan jika hasilnya berbeda nyata, maka akan dilakukan analisis uji lanjut untuk nilai tengah dengan metode Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5 %. Data dengan keragaman yang melebihi 40 %, akan ditransformasi dengan √(x+0.5) atau log (x+1). Uji Nonparametrik untuk data tidak normal. Pelaksanaan Penelitian
Sterilisasi Botol Kultur dan Alat Tanam Pinset, pisau, petridish, gelas ukur, labu takar, erlenmeyer, pipet, gelas piala, dan botol kultur yang akan dipakai dicuci bersih dengan deterjen, kemudian disterilisasi selama satu jam pada suhu 1500C dengan oven.
Pembuatan Media 1.
Percobaan 1 dan 2
a.
Pembuatan media dengan arang aktif 2 % Pembuatan media dilakukan dengan cara memipet larutan stok hara makro 50 ml/l, stok hara mikro (kecuali FeSO4.7H2O + Na2EDTA.2H2O) 10 ml/l, stok besi (FeSO4.7H2O + Na2EDTA.2H2O) 10 ml/l, stok vitamin SH 1 ml/l, stok hormon BAP, dan stok Mio-inositol 10 ml/l, sukrosa 30 g/l dan arang
15
aktif 2 % dimasukkan ke media, lalu aquades diberikan sampai mendekati 1000 ml, diaduk hingga larut. Tingkat keasaman (pH) media diukur hingga 5.8, bila pH kurang tambahkan NaOH dan bila pH lebih tambahkan HCl. Aquades ditambahkan hingga mencapai 1000 ml. Pyhtagel 2.5 g/l dimasukkan ke media dan panaskan sambil diaduk sampai larut. b. Pembuatan media dengan PVP 100 mg/l Pembuatan media dilakukan dengan cara memipet larutan stok hara makro 50 ml/l, stok hara mikro (kecuali FeSO4.7H2O + Na2EDTA.2H2O) 10 ml/l, stok besi (FeSO4.7H2O + Na2EDTA.2H2O) 10 ml/l, stok vitamin SH 1 ml/l, stok hormon BAP, dan stok Mio-inositol 10 ml/l, sukrosa 30 g/l dimasukkan ke media, lalu aquades diberikan sampai mendekati 1000 ml, diaduk hingga larut. Tingkat keasaman (pH) media diukur hingga 5.8, bila pH kurang tambahkan NaOH dan bila pH lebih tambahkan HCl. Aquades ditambahkan hingga mencapai 1000 ml. Pyhtagel 2.5 g/l dan PVP 100 mg/l dimasukkan ke media, kemudian panaskan sambil diaduk sampai larut. 2.
Percobaan 3 Pembuatan media percobaan 1 dan 2 dilakukan dengan cara memipet larutan stok hara makro 50 ml/l, stok hara mikro (kecuali FeSO4.7H2O + Na2EDTA.2H2O) 10 ml/l, stok besi (FeSO4.7H2O + Na2EDTA.2H2O) 10 ml/l, stok vitamin SH 1 ml/l atau vitamin B5 1 ml/l, stok hormon BAP, dan stok Mio-inositol 10 ml/l, sukrosa 30 g/l dimasukkan ke media, lalu aquades diberikan sampai mendekati 1000 ml, diaduk hingga larut. Tingkat keasaman (pH) media diukur hingga 5.8, bila pH kurang tambahkan NaOH dan bila pH lebih tambahkan HCl. Aquades ditambahkan hingga mencapai 1000 ml. Pyhtagel 2.5 g/l dan PVP 100 mg/l dimasukkan ke media, kemudian panaskan sambil diaduk sampai larut. Media yang sudah dimasak tersebut dituang ke dalam botol-botol kultur
sebanyak 25 ml/botol. Botol-botol kultur tersebut ditutup dengan alumunium foil, lalu dimasukkan ke dalam autoclave dengan suhu 121 0C selama 15 menit.
16
Pembuatan Larutan Glukosa 3 % Larutan Glukosa 3 % adalah larutan yang mengandung 30 g glukosa pada setiap 1000 ml aquades. Tahap awal yang harus dilakukan dalam pembuatan larutan glukosa 3 % adalah dengan menimbang glukosa sebanyak 30 g, kemudian campurkan dengan 1000 ml aquades dan diaduk sampai glukosa larut. pH larutan tersebut diukur hingga 5.8 bila pH kurang tambahkan NaOH dan bila pH lebih tambahkan HCl, kemudian larutan glukosa tersebut dipanaskan sampai mendidih. Wadah larutan glukosa 3 % yang sudah dimasak ditutup dengan alumunium foil lalu dimasukkan ke dalam autoclave dengan suhu 121 0C selama 15 menit.
Percobaan Pematahan Dormansi Biji Lada Biji lada dibilas dengan alkohol 96 %, lalu dicuci dengan deterjen sampai bersih. Biji disimpan ke dalam tabung plastik steril (corning). Perlakuan pematahan dormansi dilaksanakan dengan merendam biji ke dalam H2SO4 10 % (H1), 15 % (H2), dan 30 % (H3) selama lima menit. Biji lada tersebut dibilas dengan aquades steril kemudian direndam dengan HgCl2 2.5 % selama 4 menit dan dibilas dengan aquades steril kembali sebanyak tiga kali (di lemari asam). Biji lada tersebut dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet, direndam dengan alkohol 96 % selama 5 menit sambil dikocok-kocok kemudian direndam dengan alkohol 70 % selama lima menit, dilakukan sebanyak empat kali secara bergantian. Biji direndam dengan aquades steril selama lima menit, lalu dibilas dengan aquades sebanyak tiga kali. Biji dituangkan dalam petridish untuk dikupas dan dilukai kemudian direndam dalam glukosa 3 %, kemudian ditanam.
Percobaan Perkecambahan Biji Lada Biji lada yang telah steril dan diberi H2SO4 ditanam pada media pelakuan untuk perkecambahan in vitro yaitu B0C1, B0C2, B1C1, B1C2, B2C1, B2C2, B3C1, dan B3C2. Biji lada yang telah ditanam disimpan dalam ruang gelap sampai berkecambah dan sudah tumbuh daun, lalu dipindahkan ke ruang kultur.
17
Percobaan Perbanyakan Tunas Lada Kecambah in vitro lada yang dihasilkan dibuang akarnya, lalu ditanam pada media MS0+PVP 300 mg/l dan disimpan dalam ruang kultur sampai menghasilkan beberapa buku. Potong buku satu tunas lalu ditanam pada media perlakuan B0V1, B0V2, B1V1, B1V2, B2V1, B2V2, B3V1, dan B3V2, disimpan diruang kultur, satu eksplan dalam satu botol.
Pengamatan Pengamatan dilakukan setiap minggu dengan peubah yang diamati yaitu : 1.
Percobaan pematahan dormansi biji lada • Potensi tumbuh maksimum (PTM) Pengamatan dilakukan terhadap jumlah biji yang berkecambah sampai akhir pengamatan, rumus untuk perhitungan sebagai berikut :
• Awal biji berkecambah yaitu waktu yang dibutuhkan biji untuk berkecambah, diukur berdasarkan hari setelah tanam (HST). 2.
Percobaan perkecambahan biji lada • Potensi tumbuh maksimum (PTM) • Awal biji berkecambah yaitu waktu yang dibutuhkan biji untuk berkecambah, diukur berdasarkan hari setelah tanam (HST). • Biji lada yang mengkalus • Tingkat kontaminasi (K)
• Tingkat pencoklatan (P)
3.
Percobaan perbanyakan tunas lada • Jumlah tunas yaitu jumlah tunas yang baru terbentuk. • Jumlah buku yaitu jumlah buku pada tunas yang baru terbentuk. • Tinggi tunas, diukur dengan menggunakan penggaris.
18
• Jumlah daun yaitu jumlah daun yang baru terbentuk. • Tingkat kontaminasi • Tingkat pencoklatan • Warna daun, diamati secara visual.
19
Gambar 2. Alur Penelitian Keterangan : 1.
Biji lada yang digunakan sebagai eksplan adalah biji lada yang telah masak fisiologis.
2.
Biji lada diberi perlakuan pematahan dormansi, disterilisasi, dilukai, dan direndam ke dalam glukosa 3 %.
3.
Biji lada ditanam pada media perlakuan perkecambahan lalu disimpan dalam ruang kultur.
4.
Biji lada yang telah berkecambah
5.
Kecambah biji lada dibuang kotiledon dan akarnya dan ditanam pada media MS0 + PVP 300 mg/l .
6.
Kecambah biji lada tumbuh sempurna
7.
Kecambah yang telah tumbuh sempurna kemudian dibuang akarnya dan dipotong-potong setiap buku satu tunas.
8.
Buku satu tunas ditanam pada media perlakuan perbanyakan tunas.
