Az RkpM fehérje funkciójának elemzése

Az RkpM fehérje funkciójának elemzése DIPLOMAMUNKA

Készítette: PÁLVÖLGYI ADRIENN Biológus hallgató

Témavezető: DR. PUTNOKY PÉTER Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék

PÉCS, 2004

PA_DIP04.doc

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. Bevezetés 1.2. Nitrogénkötő szervezetek 1.3. A szimbiózis kialakulása 1.3.1 A Nod faktor 1.3.2 A nitrogénkötésért felelős gének 1.4. Sejtfelszíni poliszacharidok 1.4.1. Az exopoliszacharidok 1.4.2. A lipopoliszacharidok 1.4.3. A kapszuláris poliszacharidok 2. A MUNKA ELŐZMÉNYEI 2.1. Spontán mutáns baktériumtörzsek izolálása 3. CÉLKITŰZÉSEK 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok 4.2. A baktériumok növesztése 4.3. Fágok szaporítása 4.4. A baktériumok keresztezése 4.5. Fágérzékenységi teszt 4.6. Összes DNS izolálás 4.7. Plazmid DNS izolálás 4.8. Polimeráz láncreakció (PCR) 4.9. Fragmentizolálás 4.10. DNS szekvenálás 4.11. Restrikciós emésztés 4.12. Gélelekroforézis 4.13. Kompetens sejt készítés 4.14. Ligálási reakció 4.15. Transzformálás 4.16. In vitro transzpozíciós mutagenezis 4.17. Bioinformatikai módszerek 5. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 5.1 Az rkp-4046 mutáció helyének meghatározása 5.2. A 16-3 bakteriofág receptor kialakításában részt vesz az RkpM fehérje 5.3. Az rkpM4046 allélban egy missense mutáció található 5.4. Újabb mutánsok vizsgálata 5.5. Komplementációs kísérlet a receptorfunkció bizonyítására 5.6. Az rkpM klónozása egy erős promoter után 5.7 Az rkpM expresszió hatása különböző mutáns törzsekben 5.8. Az rkpM gén bioinformatikai analízise 5.8.1. PLP kötés a DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családnál 5.8.2. Az RkpM fehérje DNS-kötő domént tartalmaz? 5.8.3 A bioinformatikai elemzések eredményeinek értékelése 6. ÖSSZEFOGLALÁS 7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK 8. RÖVIDÍTÉSEK KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS

PA_DIP04.doc

3 3 3 4 5 5 6 6 7 7 12 12 14 15 15 16 16 16 16 17 17 18 18 19 19 19 20 20 20 20 21 22 22 23 23 26 26 29 31 32 33 35 37 39 40 45 46

3

1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. Bevezetés A biológiai nirtogénkötés igen fontos szerepet tölt be az ökoszisztémában, része a folyamatos nitrogénkörforgásnak. A folyamatban számos baktérium vesz részt. A lebontó szervezetek által a szerves nitrogén vegyületek ammóniává alakulnak (ammonifikáció), illetve a légkörből nitrogénfixálás során a nitrogéngáz szintén ammóniává redukálódik. A redukált ammónia bizonyos arányát nitrifikáló baktériumok nitráttá oxidálják, mely denitrifikáció segítségével nitrogéngáz formájában újra a légkörbe juthat. A Föld légkörének 78%-át nitrogéngáz alkotja, ennek nagy részét a diazotróf szervezetek biológiai úton redukálják (Burns and Hardy, 1975). A növények egyik alapvető tápanyagforrása a talajból, kötött formában felvett nitrogén (nitrát, nitrit, ammónia). A növényekkel szimbiózist kialakító diazotróf baktériumok a légköri nitrogéngázt redukálják ammóniává, így az együttélés lehetőséget biztosít arra, hogy kimeríthetetlen nitrogén utánpótlásként szolgáljon a gazdanövények számára. 1.2. Nitrogénkötő szervezetek Nitrogénkötésre a cianobaktériumok mellett még néhány, szintén prokarióta szervezet képes. Leghatékonyabban a szimbiózisban élő baktériumok alkalmasak a nitrogénkötésre, de léteznek szabadonélő szervezetek is, mint a Klebsiella, Rhodospirillum, Azotobacter és Clostridium fajok. A szimbiotikus baktériumok a növénytől kapják meg a nitrogénkötéshez szükséges energiát. A cianobaktériumok mindenütt előforduló fotoautotróf prokarióták (Rippka et al., 1979). Ismerünk mind szabadon (Noctoc spp., Chlorogleosis spp.), mind szimbiózisban élő fajokat (Nostoc spp., Chalotrix spp.) (West and Adams, 1997). Ezen szervezeteknél a nitrogénfixálás és fotoszintézis együtt zajlik, de külön differenciálódott sejtekben. A nitrogén fixálása heterociszta sejtekben, a fotoszintézis vegetatív sejtekben történik (Wolk et al., 1994). A Nostoc fajok számos élőlénnyel képesek a szimbiózis kialakítására, úgymint az Azolla moha, a nyitvatermő cikász és a zárvatermő Gunnera növényekkel (Schenk, 1992). A rhizobiumok, a Rhizobiaceae családba tartozó, Gram-negatív, diazotróf talajbaktériumok (Rhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mezorhizobium), szimbiózist tudnak kialakítani a pillangósvirágú (Fabaceae) növényekkel (Dénairé et al., 1992), illetve a nem pillangósvirágú Parasponia fajokkal (Becking, 1992). A szimbiózis legfejlettebb formája az endoszimbiózis, melyet a rhizobiumok is alkalmaznak, partnerspecifikus módon jön létre. Ebben az esetben egy kölcsönösen hasznos együttélésről van szó (Allen and Allen, 1981). A baktérium megfelelő, redukált PA_DIP04.doc

4 nitrogénforrással látja el a növényt, míg a gazdanövény tápanyagot biztosít a baktérium számára. A vizsgálatunk tárgyát képező Sinorhizobium meliloti (régebbi nevén Rhizobium meliloti), szimbiotikus kapcsolatot képes kialakítani a lucerna (Medicago), lepkeszeg (Trigonella) és a somkóró (Melilotus) fajokkal. E különleges baktérium-növény kapcsolat régóta kutatott téma a világon, mind a Sinorhizobium meliloti, mind más rhizobium fajok esetében (pl. Sinorhizobium fredii). 1.3. A szimbiózis kialakulása A rhizobium és pillangósvirágúak közötti szimbiózis létrejöttének mechanizmusa hasonló a patogén baktériumok és az eukarióta sejtek kapcsolódásához (Hentschel et al., 2000). A szimbiózis kialakulása, igen összetett folyamat, mely komplex molekuláris jelcserén alapszik. Első lépésként a gazdanövény különféle, flavonoid típusú vegyületeket bocsájt ki a talajba (Redmond et al., 1986), ami pozitív kemotaxist vált ki (Currier and Strobel, 1974). Ennek hatására a baktériumok feldúsulnak a növény rhizoszférájában. A flavonoidok, melyek molekula

szerkezete

fajspecifikus

(Bladergroen

and

Spaink,

1998),

aktiválják

a

baktériumsejtekben található un. nodulációs (nod) gének expresszióját, aminek következtében a baktérium a növény felé kiválaszt egy szignált, a Nod faktort (Schultze et al., 1994), mely többek között a szimbiótikus gümő kialakulását indukálja. A fertőzés során a baktériumok a gyökérszőrőkhöz tapadnak (Mills and Bauer, 1985), a tapadást a növény által kiválasztott lectinek biztosítják (Diaz et al., 1989). Ezután történik a gyökérszőrök meggörbülése. A fertőzési helyen a sejtfal leépül és egy sejtfalösszetevőkből álló, újonnan lerakódó, belső csőszerű képlet, az infekciós fonal jön létre, mely folyamatosan növekszik, elágazik (Robertson and Lyttleton, 1982). Ezáltal jutnak el a baktériumok a gyökérszőrsejtektől a gümősejtekig, ahol a növényi sejt citoplazmájába endocitózissal lépnek be. A gümősejt belsejébe került baktériumok peribakteroid membránnal határoltak (Mellor and Werner, 1987). Mialatt a növény gyökerén kialakul a külön növényi szervként funkcionáló gümő (Dudley et al., 1987), a baktériumok fiziológiai és morfológiai változásokon mennek keresztül, egy időleges sejtorganellummá, un. bakteroiddá alakulnak. Miután megtörtént a baktériumok differenciálódása, megindul a nitrogenáz enzimkomplexet kódoló gének expressziója, így a szimbiotikus gümő alkalmassá válik a légköri nitrogén redukálására. A bakteroidok és a növény közötti anyagcseretermékek transzportja a szállítónyalábokon keresztül történik (Newcomb, 1981). A gümőfejlődésnek két típusát ismerjük. Az elkülönítés az állandó merisztéma meglétén, illetve hiányán alapszik (Luyten and Vanderleyden, 2000). Determinált gümő esetében a külső

PA_DIP04.doc

5 kéregsejtekből indul a fejlődés, a merisztematikus aktivitás megszűnik a gümő kifejlődésével. Determinált gümőt a szója (Glycine max), bab (Phaseolus vulgaris) fajokon kívül más, főleg trópusi pillangósvirágú (Fabaceae) növény tud létrehozni. Indeterminált gümő esetében pedig a belső kéregsejtek állandó merisztematikus aktivitása jellemző, folyamatos növekedést biztosítva ezzel. Az indeterminált gümő, példaként említve a borsó (Pisum sativum), bükköny (Vicia sp.), lucerna (Medicago sp.) növényeknél fordul elő (Hirsch, 1992). A Sinorhizobium meliloti indeterminált, a Sinorhizobium fredii determinált gümőképződést indukál. 1.3.1 A Nod faktor A Nod faktornak fontos szerepe van a szimbiotikus gümő kialakításában, különféle növényi választ vált ki: a gyökér belső kéregsejtjei között dedifferenciáció és mitózis inicializálása, mely során egy új osztódószövet alakul ki, a gümőmerisztéma (Dudley et al., 1987), a növényi gének indukciója, a kálcium oszcilláció (Ehrhardt et al., 1996; Geurts and Bisseling, 2002), a gyökérszőrök görbülése (Catoira et al., 2000), infekciós fonal növekedése (Gage and Margolin, 2000). A nod génekben mutáns baktériumok nem képesek a gümőképződés elindítására (Nod- fenotípus). A nod géneket (pSymA megaplazmidon találhatóak) két csoportra oszthatjuk, az egyik csoportba (közös nod gének, nodA, nodB, nodC) azok a gének tartoznak, melyek a Nod faktor alapszerkezetének kialakítását végzik, a többi gén (nodFEG, nodH, nodPQ) a gazdaspecificitás szempontjából fontos. A növényi szignált (flavonoidok) a NodD fehérje képes felfogni, ez a fehérje aktiválja a többi nod gént, kapcsolódik a nod box-ként ismert konzerválódott szekvenciához. Ezzel ellentétes a represszor hatású, kromoszómán található nolR gén. A két regulátor fehérje (NodD, NolR) biztosítja a nod gének megfelelő szabályozását. A Nod faktor szerkezete egységesen lipo-kitooligoszacharid molekulákból állnak, erre a gazdaspecifitásért felelős gének különböző oldalláncokat helyeznek (Denarie and Debelle, 1996; Mergaert et al., 1997), így a különböző szerkezetű molekulák meghatározzák, hogy a baktérium mely növényt képes megfertőzni. A Nod faktor szekréciójáért a nodIJ gének felelősek. 1.3.2 A nitrogénkötésért felelős gének A nitrogénkötés megfelelő létrejöttéhez alacsony oxigén tenziójú (mikroaerofil) környezetre van szükség, ezt a növényi citoszolban lokalizálódó leghemoglobin molekula biztosítja. A késői bakteriális gének közé tartoznak a nif és bizonyos fix gének. A nitrogénfixáláshoz szükséges nitrogenáz enzimkomplex egyes részeit a nifHDK gének kódolják (Fischer, 1994). A nifH gén a homodimer Fe protein (dinitrogenáz reduktáz)

PA_DIP04.doc

6 szintéziséért, a nifD a "2$2 szerkezetű dinitrogenáz " alegység, míg a nifK a $ alegység kialakításáért felelős (Postgate, 1972). Továbbá a nifE, nifN, nifB gének a FeMo kofaktor szintézisét végzik (Dean et al., 1993), valamint a nifA génnek, mely egy transzkripciós aktivátor fehérjét kódol, a nitrogénfixálás szabályozásában van szerepe a fixLJ, fixK génekkel együtt. Az enzimkomlpex felé történő elektrontranszport biztosítását a fixABCX gének végzik (Earl et al., 1987). A nagy oxigén affinitású, memránba ágyazott, bakteriod specifikus citokróm oxidáz komplexet a fixNOQP gének kódolják (Preisig et al., 1993). Alacsony oxigén koncentráció esetén a szabályozó és szenzor funkciójú fixLJ gének aktiválják a fixK és nifA regulátor gént, ezáltal megindul a nif operon és több fix gén expressziója (David et al., 1988). A nif és fix gének regulációját alapvetően a nitrogéngáz és az oxigén koncentrációja határozza meg. 1.4. Sejtfelszíni poliszacharidok A rhizobiumok sejtfelszíni poliszacharidjai kulcsszerepet játszanak a szimbiózis kialakulásának lépéseiben: az infekciós fonal növekedésében, a gümő inváziójában, és a gazdaspecificitásban (Reuhs et al., 1998), valamint megvédik a baktériumot a környezeti ártalmakkal szemben. Hasonló szerkezetű sejtfelszíni struktúrákat a patogén baktériumoknál is találunk, ahol a patogenitást határozzák meg (Reuhs et al., 1993). A S. meliloti sejtfelszíni poliszacharidjai − sok más Gram-negatív baktériumhoz hasonlóan − az exopoliszacharid (EPS), lipopoliszacharid (LPS) és a kapszuláris poliszacharid (KPS) (Kannenberg and Brewin, 1994). A poliszacharidok szimbiózisban betöltött szerepére különböző baktérium mutánsok vizsgálatával derítettek fényt, ilyenek a gümő inváziójára képtelen, infekcióban hibás (Inf-) baktérium mutánsok, melyek el tudják indítani a gümőfejlődést, de nem képesek bejutni a belsejébe, “üres” gümők keletkeznek. 1.4.1. Az exopoliszacharidok A Rhizobium spp. által termelt exopoliszacharidoknak (EPS) két féle típusát ismerjük. Az egyik típus EPSII néven ismert, glükózt és galaktózt tartalmazó, diszacharid egységekből felépülő galaktoglükán. A másik típus a S. meliloti által is termelt EPSI (másnéven savas EPS) (Fraysse et al., 2003), amely egy szukcinoglükán egységekből álló heteropolimer, mely a sejt felszínén akkumulálódik, és a sejt környezetébe szekretálódik. A szukcinoglükán hét glükóz és egy galaktóz molekulát tartalmazó, ismétlődő alegységekből épül fel (Reuber and Walker, 1993). Az alegységeken szukcinil, acetil és piruvil módosításokat tartalmaz. Savas jellegét az uronsav, szukcinát, piruvát elemek jelenlétének köszönheti. A szukcinoglükán poliszacharid

PA_DIP04.doc

7 szintézise négy lépésből áll, melyért a pSymB megaplazmidon elhelyezkedő exo gének felelősek. Első lépésként, az UDP-glükóz és UDP-galaktóz szintézise történik (pl. exoB,C,N), majd egy sejtmembránba ágyazott lipid hordozó felszínén zajlik az ismétlődő oktoszacharid alegység szintézise nukleotid-cukorból (exoF,J,A,L,M,N,O,U). Következő lépésben az alegységek módosítása (szukcinil – exoH, acetil – exoZ, piruvil – exoV), majd legvégül az oktoszacharid alegységek polimerizációja, és a sejtfelszínre való transzfere történik (exoP,T,Q) (Leigh and Walker, 1994). Az exopoliszacharidnak alapvetően a nitrogénfixáló gümő létrehozásában, az infekciós fonal kialakulásában van meghatározó szerepe (Cheng and Walker, 1998; Gonzáles et al., 1998). Sok exopoliszacharid termelésében hibás S. meliloti törzs nem képes a növény inváziójára (Exo-, Inf- fenotípus), mert az infekciós fonalak abortálódnak a fejlődő gümő sejtjeinél (Müller et al., 1988). 1.4.2. A lipopoliszacharidok A lipopoliszacharidok (LPS) a Gram-negatív baktériumok sejtfelszínének fontos alkotóelemei, a külső membránhoz kapcsolódva helyezkednek el. A Rhizobium fajok konzerválodott szerkezetű LPS-el jellemezhetőek (Reuhs et al., 1998). Szerkezetileg három egységre bonthatók. A külső foszfolipid membránba egy un. horgonyzó molekulával, a lipidA egység segítségével rögzülnek. A horgonyzó egység különböző szerkezetű lehet a Rhizobium fajokban (Reuhs et al., 1995). Ehhez kapcsolódik egy úgynevezett “core” oligoszacharid, melyhez a törzsspecifikus O-antigén kötődik (Kannenberg and Brewin, 1994). A lipidA és a „core” oligoszacharid egységeket közösen az LPS „rough” (R-LPS) formájának nevezzük, míg az O-antigén egységet tartalmazó formát „smooth” LPS-nek (S-LPS) hívjuk. A S. meliloti LPS mutánsok szimbiózisra képesek a gazdanövénnyel, de a szimbiótikus kapcsolat lassabban alakul ki, mint a vad típusú baktériumok esetében (Lagares et al., 1992). Léteznek olyan baktérium törzsek is, mint például a S. meliloti 41 törzs, melyeknél az LPS nem játszik fontos szerepet a fertőzésben, vagy más struktúra veszi át a szerepét, itt az R-LPS forma hiányozhat. Más rhizobium fajoknál azonban sok esetben előfordul, hogy csak az LPS bizonyul lényeges tényezőnek, míg a többi (KPS, EPS) nem (Kannenberg and Brewin, 1994). 1.4.3. A kapszuláris poliszacharidok Léteznek olyan rhizobiumok, melyek nem termelik egyik formájú exopoliszacharidot sem, mégis szimbiózist tudnak kialakítani bármely gazdanövénnyel. Ennek oka az, hogy ezek a baktériumok olyan rhizobiális kapszuláris poliszacharidot (KPS vagy K-antigén) termelnek, mely átveszi az exopoliszacharid szerepét a szimbiózis kialakításában, ilyen baktérium a S.

PA_DIP04.doc

8 meliloti 41 törzs exoB mutánsa (más néven AK631 - Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990). A KPS, mint egy kapszula veszi körül a baktérium sejtet, hidrát mátrixot alkot, amely rezisztenciát biztosít egyes bakteriofágokkal szemben, és védi a különféle abiotikus tényezőktől, mint a kiszáradás. Fontos a szimbiótikus felismerés korai szakaszában (Becquartde Kozak et al., 1997) A lipopoliszacharid egy konzerválódott szerkezetű poliszacharid, ezzel ellentétben a KPS törzsspecifikus, sok variánsa fordul elő (Forsberg and Reuhs, 1997; Reuhs, 1997). A KPS nem rendelkezik horgonyzó molekulával, hanem szorosan kapcsolódik a baktérium

felszínéhez.

A

K-antigén

széleskörben

elterjedt

a

talajbaktériumokban,

rhizobiumokban először a Sinorhizobium fredii USDA205 törzsben izolálták (1.ábra) és kiderült, hogy strukturálisan analóg az E. coli II-es csoportba tartozó K-antigénjével, ahol a patogenitásban van szerepe (Reuhs et al., 1993; Rosenow et al., 1995).

1. ábra: A S. fredii USDA205 törzs KR1 antigén ismétlődő egységének (Kdops) elsődleges szerkezete (Reuhs et al., 1993). A rhizobiumok KPS molekulái (1. táblázat) tartalmaznak megegyező és eltérő egységeket, közös elemek a hexóz és 1-karboxy-2-keto-3-deoxy cukrokból álló ismétlődő egységek, mint a sziálsav vagy a 3-deoxy-D-manno-2-oktulozonsav (Kdo), különböznek a glikozil alegységek elrendezésében, a térszerkezetükben, a kapcsolódó oldalláncok mintázatában, molekula méretben (Forsberg and Reuhs, 1997). A S. meliloti és S. fredii baktériumok K-antigénjei, Reuhs és munkatársai által igen jól jellemzett poliszacharidok. A S. meliloti AK631 törzse KR5 antigén néven ismert kapszuláris poliszacharidot termel. A KR5 antigén diszacharid alegységekből épül fel. Az alegység egy glükuronsavból és egy 5,7diamino-3,5,7,9-tetradeoxi nonulozonsavból áll, melyen 7-N-acetil és 5-N-β-hidroxibutiril módosítások is találhatók (Reuhs et al., 1998; Reuhs és Glushka, nem közölt eredmények). Az elmúlt évek kutatásai során három régiót azonosítottak az S. meliloti 41 törzsben, melyek a KPS bioszintéziséért felelősek (rkp-1, rkp-2, rkp-3 régiók).

PA_DIP04.doc

9 1. táblázat: A K-antigén szerkezete néhány Rhizobium fajnál (Reuhs et al., 1998). Pse: pseudaminsav, Ac: acetil csoport, $-OH-But: $-OH-Butiril csoport. K-antigén

Törzs

Molekuláris szerkezet

Hivatkozás

KR1

S. fredii USDA205

[→3-"-D-Galp-(1→5)-$-D-Kdop-(2→]n

Reuhs et al., 1993

KR3

S. fredii USDA257

[→3)-$-D-Manp-(1→5)-$-D-Kdop-(2→]n

Forsberg and Reush 1997

KR5

S. meliloti AK631

[−$-GlcA→Pse5N($-OH-But)7NAc−]n

Reuhs nem közölt eredm.

KR6

S. meliloti NGR247

[−"-Glc→"-NeuNAc−]n

Reuhs et al., 1998

KR7

S. meliloti NGR185

[−$-GlcNAc→$-Kdo−]n

Reuhs et al., 1998

Az rkp-1 régióban 10 gén található (rkpA-J). A gének nagy része olyan fehérjéket kódol, melyek hasonlóak a különböző zsírsavszintézisben részt vevő enzimekkel, ezek a fehérjék a lipofil molekulák módosításában és szállításában játszanak szerepet (Kiss and Kondorosi, 1997; Petrovics et al., 1993). Az említett gének feladata − a feltételezések szerint − , hogy a Kantigén bioszintéziséhez szükséges lipid hordozót létrehozzák. Az RkpJ fehérjének a kapszuláris poliszacharid transzportjában lehet szerepe, mert az E. coli KpsS fehérjéjével homológ. Ha mutáció történik az említett génekben, akkor a KPS nem jelenik meg a baktérium felszínén. Az rkp-1 régióban nincsenek olyan gének, melyeknek a cukoralegységek bioszintézisében vagy a KPS polimerizációjában lenne szerepe. Az rkp-2 régióban két olyan gén található, melyek a vad típusú LPS kialakításához szükségesek. Az lpsL gén által kódolt fehérje egy UDP-glükuronsav epimeráz, mely a lipopoliszacharid bioszintézisében fontos. A másik fehérje, az RkpK egy UDP-glükóz dehidrogenáz, amely az UDP-glükóz UDP-glükuronsavvá oxidálását katalizálja. Az RkpK fehérje az LPS és a KPS bioszintézisében is fontos (Kereszt et al., 1998). A pSymB megaplazmidon található rkp-3 régióban 10 gént (rkpL-Z) azonosítottak (Kiss et al., 2001), melyek pontos funkciója homológiák alapján feltételezett, még kísérletesen nem bizonyított (2. táblázat). Az rkp-1 és rkp-2 régió általánosan előfordul a Sinorhizobium genusban, ezzel szemben az rkp-3 régió csak a S. meliloti 41 törzsben található meg. A KPS bioszintézisért, és a sejtfelszínre való exportálásáért, valamint a növény infekciójáért felelősek. Az egy policisztronos operont alkotó rkpL-Q gének között vannak olyan gének, melyek homológiát mutatnak különféle transzferáz enzimet kódoló génekkel (például: rkpM, rkpO, rkpP). Feltételezett funkciójuk a cukor prekurzorok bioszintézise a KPS polimer számára. Transzkripciójuk független a fordított orientációval rendelkező rkpR, rkpT, rkpS génektől. E három gén feladata valószínű az, hogy a KPS polimert transzportálják a citoplazmából a sejtfelszínre. Az rkpT és rkpS olyan szekvencia motívummal rendelkeznek, mely specifikus az

PA_DIP04.doc

10 ABC transzporter családban. A régió utolsó génje a polymerizáció szabályozását biztosító rkpZ, melyet korábban lpsZ génként azonosítottak (Brzoska and Signer, 1991). Az RkpZ fehérje homológ az E. coli KpsC fehérjéjével, melyről tudjuk, hogy befolyása van a termelt KPS méretére és exportjára (Reuhs et al., 1995).

2. táblázat: Az rkp-3 régióban található gének feltételezett szerepe. A táblázatban feltüntettük a homológ fehérjék bizonyított vagy feltételezett funkcióját, valamint azokat a szervezeteket, melyekben az adott homológ fehérje található.

rkp-3 gén

Feltételezett szerep

Homológ fehérje

Homológ szervezet

Homológ fehérje szerepe

rkpL

dNTP-hexóz-dehidratáz / epimeráz

Jhp0778 Cap5E FlmA

Helicobacter pylori Staphylococcus aureus Aeromonas caviea

Cukor-nukleotid szintézis UDP-glükóz epimeráz O-antigén bioszintézis

rkpM

DegT/DnrJ/EryC/StrS aminotranszferáz

FlmB SpsC WlbF

Aeromonas caviae Methanococcus janaschii Bordatella bronchiseptica

O-antigén bioszintézis Poliszacharid szintézis Amino-cukor szintézis

rkpN

Pse aktiválás

NeuA NeuA KpsU

Aeromonas caviae E. coli E. coli

O-antigén bioszintézis CMP-NeuNAC szintáz CMP-KDO szintáz

rkpO

transzferáz

FlmD FlaR SpsG/H

Aeromonas caviae Caulobacter crescentus Methanococcus janaschii

O-antigén bioszintézis Flagelláris protein Poliszacharid szintézis

rkpP

acetiltranszferázok

FlaG SpeG

Caulobacter crescentus E.coli

Flagelláris protein Acil transzferáz

rkpQ

Pse szintézis

NeuB NeuB NeuB

Aeromonas caviae Helicobacter pylori E.coli

O-antigén bioszintézis Sziálsav szintáz NeuNAC kondenzáció

rkpR

KPS export a periplazmatikus téren keresztül

KpsE BexC CtrB

E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis

KPS export protein

rkpS

ABC transzporter KPS export a sejtmembránon át

KpsT BexA CtrB

E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis

KPS export protein

rkpT

ABC-2 típ.transzporter KPS export a sejtmembránon át

KpsM BexB CtrC

E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis

KPS export protein

rkpZ

Lánchosszúság meghatározása

LpsZ KpsC LipA

R. meliloti E. coli Neisseria meningitidis

LPS modifikáció KPS export protein KPS modifikáció

rkpY

Poliszacharid szintézis

PA_DIP04.doc

-

Nincs homológja

11 Az előzőekben ismertetett poliszacharidok fontos feladatot töltenek be a baktériumnövény szimbiózis kialakulásában, a baktérium külső környezeti tényezők elleni védelmében. Az EPS és KPS szerkezete nagymértékben különbözik, mégis azonos szerepet töltenek be a szimbiózisban, a S. meliloti AK631 törzsnél az EPS feladatát a kapszuláris poliszacharid veszi át. Ismeretes, hogy a baktérium és a gazdanövény közötti kapcsolat igen specifikus a poliszacharidok tekintetében is. Az, hogy alapvetően eltérő szerkezetű poliszacharidok helyettesíteni képesek egymást az invázió folyamatában arra utal, hogy a növény több független mechanizmussal is felismerheti a baktériumot.

PA_DIP04.doc

12 2. ELŐZMÉNYEK A szimbiózis kialakulásában különböző növényi, illetve bakteriális gének játszanak szerepet. Ezen gének egy részet már számos kutatócsoport jellemezte. A növény inváziójához szükséges bakteriális gének funkciójáról viszonylag még keveset tudunk, ezért az említett folyamat pontosabb megismerése érdekében, jónéhány infekcióban hibás (Inf-) S. meliloti mutánst izoláltak, jellemeztek már, melyek nem képesek bejutni a növény belsejébe, így a szimbiózis kialakulása elakad a gümőfejlődés korai fázisában. Az Inf- fenotípusú mutánsokkal történő fertőzés során „üres” gümők jönnek létre, segítségükkel sikerült kimutatni, hogy a szimbiózis kialakulásának ebben a szakaszában a baktérium különböző poliszacharidjainak fontos szerep jut. Ezen kívül kimutatták, hogy a funkcionális gümő képződéséhez nélkülözhetetlen az EPS, illetve KPS valamelyikének jelenléte (Walker, 1992). A S. meliloti AK631 törzs például EPS-t nem termel, mégis képes szimbiózist kialakítani a gazdanövényeivel, mivel a törzs által termelt KPS helyettesíteni tudja az exopoliszacharidokat a gümőfejlődés során (Putnoky et al., 1990; Petrovics et al., 1993). Bizonyos vizsgálatok, melyeket több S. meliloti törzsön végeztek arra utalnak, hogy a KPS-nek akár elsődleges szerepe is lehet az infekciós folyamatban (B. Reuhs személyes közlés). Munkánkban szerettük volna jobban megismerni a KPS endoszimbiózisban betöltött szerepét.

Konkrétan

arra

voltunk

kíváncsiak,

hogy

létezik-e

olyan

funkcionális

molekularészlet, bioszintézisben bekövetkező utólagos módosítás a KPS-t illetően, melynek hiányában a szimbiózis az infekciós lépésben elakad. Az EPS esetében már végeztek kísérletet ennek bizonyítására (Leigh et al., 1985). A kapszuláris poliszacharid szerkezetének gazdaspecifikus vonatkozásainak megismeréséhez olyan mutáns baktériumtörzsek izolálására volt szükség, melyek felszínén a KPS kismértékben módosult. Ezen fenotípust okozó genetikai mutáció(k) helyének pontos behatárolásával a feltételezett gazdaspecifitásért felelős gén(ek) meghatározhatók. 2.1. Spontán mutáns baktériumtörzsek izolálása Előzetes információk alapján tudtuk, hogy több Inf- S. meliloti mutáns, mely nem termelt exopoliszacharidot, rezisztenciát mutatott a 16-3 fággal szemben (Putnoky et al., 1988). Gyanítani lehetett, hogy az Inf- fenotípusú törzsek (mint az AK631 törzs is), az invázióra képtelen tulajdonságuk mellett, a fággal szemben mutatott rezisztenciájukat is a KPS hiányának vagy hibájának köszönhetik. Következésképpen, a poliszacharid bioszintézise és a

PA_DIP04.doc

13 fágreceptor jelenléte, nagy valószínűséggel összefügg. Ezen információkból kiindulva feltételezték azt, hogy a KPS-molekula egyúttal receptorként szolgálhat a 16-3 fág számára (Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990). Munkánkban olyan baktérium-mutánsokra volt szükség, melyek felszínén a KPS módosult formában van jelen. Ennek érdekében csoportunkban olyan mutánsizolálási eljárást alkalmaztak (Hoffman Gyula munkája), melynek során a S. meliloti 41 törzsre specifikus 16-3 bakteriofágot alkalmazták szelekciós eszközként. Az RM41 törzsből izolált mutációk azonosítása az un. host-range jelenség segítségével történt. A fág baktériumfelszínt felismerő fehérjéjét kódoló gén mutációja révén alakul ki a host-range (gazdaspecifitási) mutáció. Ha egy fágra rezisztenssé vált baktérium-mutánson lehetséges host-range fágmutánst izolálni, akkor a baktérium mutáns felszínén a fágreceptor jelen van, de feltehetően módosult formában. Mivel a jelenség lehetővé teszi host-range fágmutánsok adszorbcióját, ezért valószínű, hogy „finom” szerkezetbeli változás történhetett. Ezen kísérlet elvégzésével sikerült olyan baktérium mutánst izolálni (GH4046 törzs), mely rezisztens volt a 16-3 fággal szemben, tehát feltételezhetően a KPS megváltozott formában van jelen a sejtfelszínen. Ezzel párhozamosan, sikerült izolálni egy feltehetően módosult farkirosttal rendelkező host-range fágot (16-3 h5), mely fertőzni képes az izolált baktériumot.

PA_DIP04.doc

14

3. CÉLKITŰZÉSEK A munkánk célja az volt, hogy komplementációs kísérletekkel azonosítsuk az izolált mutáció(k) helyét, valamint megállapítsuk a mutáció(k) jellegét bázissorrend meghatározással, mely megmutatja milyen változás történt DNS, illetve fehérje szekvencia szinten. Kíváncsiak voltunk, hogy a KPS valóban fágreceptor szerepet is betölthet, vagy valamilyen más struktúra látja el a feladatot, mely kapcsolatban van a KPS génjeivel. Ez utóbbi esetben tudni szerettük volna, hogy a fágreceptor milyen módon épül fel és mely fehérjék alkotják. A fágreceptor szerkezetét meghatározó gén(ek) azonosítható(k) a mutáció(k) helyének pontos behatárolásával. Amennyiben a fágreceptor valóban a KPS, úgy ezzel a módszerrel még ismeretlen bioszintézis-gének azonosítására is lehetőség nyílhat. Ezen kívül, minél többet szerettünk volna megtudni az érintett gén(ek) funkciójáról, természetéről bioinformatikai analízis segítségével. A GH4046 törzsön izolált host-range fág (16-3 h5) oldalán is elindult a jelenség vizsgálata a csoportunkban (Békási Krisztina, illetve Maász Anita diplomadolgozata, 2004.).

PA_DIP04.doc

15

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok Munkánk során használt baktérium és bakteriofág törzsek, valamint plazmidok jellemzőit a 3. táblázat tartalmazza. 3. táblázat: Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok. ELNEVEZÉS

JELLEMZŐK

REFERENCIA

Sinorhizobium meliloti RM41

S. meliloti vad típusú (Exo+, Nod+, Fix+)

Szende K.

AK631

RM41 exoB631 (Nod+ Fix+)

Kondorosi Á.

GH4046

RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns

Hoffmann Gy.

GH4178

RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns

Hoffmann Gy.

GH4180

RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns

Hoffman Gy

R

R

AK631 rkpM::Tn5 (212) Km Sm

Kiss et al., 2001

JF1754

met leu his hsr- hsm+

Friesen, J

PP219

JF1754 (pRK2013)

Putnoky P.

XL1 Blue pBS::rkpM Kpn-Sal AmpR

Ez a munka

AT212

Escherichia coli

AV4189 AV4190 AV4191 AV4223

XL1 Blue pSem91::rkpM EcoRV KmR

Ez a munka S

R

AV4258

XL1 Blue (pAV4223 Km::Cm(F-778)) Km Cm

Ez a munka

XL1 Blue

RecA1,endA1,gyrA96,thi-1, hsdR17,supE44,relA1

Bullock et al., 1987

R

lacZ∆M15 Tc

-

F’ traD36 proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 / e14 (McrA )∆(lac-proAB) endA1 gyrA96 (Nalr) thi-1 hsdR17(rk mk+) glnV44 relA1 recA1

Yanisch-P et al., 1985

16-3

S.meliloti 41 törzs fágja

Orosz and Sik, 1970

16-3 h5

S.meliloti GH4046 törzsre specifikus host-range mutáns

Hoffmann Gy.

AmpR

Stratagen, USA

JM109

Bakteriofágok

Plazmidok pBluescript SK II (+/−) pBBR1 MCS-3 pSem91 pRK2013

R

Széles gazdaspecifitású konjugatív plazmid Tc

Kovach et al., 1994

R

Semsey et al., 1999

Expressziós vektor Km

R

Helper plazmid keresztezéshez Km

Ditta et al., 1980

___________________________________________________________________________

PA_DIP04.doc

16 4.2. A baktériumok növesztése A S. meliloti törzseket TA (Orosz et al., 1973) vagy GTS (minimál) (Kiss et al., 1979) táptalajokon 32 oC -on, az E. coli törzseket pedig LB (Sambrook et al., 1989) tápközegben 37 o

C-on növesztettük. A táptalajok a megfelelő antibiotikumot a 4. táblázatban feltüntetett

végkoncentrációban tartalmazták. 4. táblázat: Az antibiotikumok végkoncentrációja (:g/ml) Antibiotikum

E. coli

S. meliloti

Tetraciklin

15

15

Kanamicin

30

200

Kloramfenikol

5

5

Ampicillin

200

--

4.3. Fágok szaporítása A felszaporítani kívánt fág egy tarfoltját 10 ml TA folyadékba tettük, és 0,2 ml éjszakán át felnövesztett baktériumtörzs hozzáadása után a lombikot 32 °C-on, 12-24 órán át rázattuk. A fáglizátumhoz néhány csepp kloroformot adtunk, majd meghatároztuk a fágszámot úgy, hogy 0,1 ml megfelelően hígított fágot, 0,2 ml éjszakán át felnövesztett baktériumot és 4ml TA fedőagart összekeverve TA lemez tetejére rétegeztünk. A lemezeket 12-24 órán át 32 °Con történő inkubálás után értékeltük ki. A fáglizátumok általában 109 részecskét tartalmaztak milliliterenként. 4.4. A baktériumok keresztezése A keresztezni kívánt baktériumokat és a “helper” (PP211) törzset felnövesztettük a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó komplett táptalajon. A keresztezést 0.9%-os NaCloldatban felszuszpendált baktériumokkal végeztük, TA lemezen összecseppentve őket. 16-24 órás 32 oC -on történő inkubálás után a felnőtt baktériumokat felszuszpendáltuk, és a megfelelő antibiotikumot tartalmazó szelektív lemezre kentük különböző hígításban. 4.5. Fágérzékenységi teszt A baktériumok fágérzékenységét 16-3 vad típusú, 16-3h5 host-range mutáns bakteriofágokkal szemben vizsgáltuk. A vizsgálni kívánt baktériumot tartalmazó TA fedőagar felszínére 1 µl, körülbelül 106 darab fágot tartalmazó lizátumot cseppentettünk, és 24 órás inkubációs idő után vizsgáltuk, hogy bekövetkezett-e a lízis vagy sem. PA_DIP04.doc

17 4.6. Összes DNS izolálás 1.5 ml, éjszakán át növesztett, baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük és 300 µl TE oldatban (50 mM TrisHCL, 20 mM EDTA, pH 8,0) szuszpendáltuk. 100 µl 5% SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 µl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk hozzá. 1-3 órás 37oC-os inkubálás után 500 µl fenollal ráztuk össze, majd centrifugálás után a felülúszót újabb Eppendorf-csőbe pipettáztuk át. 500 µl fenol:kloroform oldattal (25 térfogat fenol:24 térfogat kloroform:1 térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze. Centrifugálás után a felülúszóhoz 500 µl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform:1 térfogat izoamil-alkohol) adtunk, összeráztuk és centrifugáltuk. A vizes fázist 1000 µl etanollal kicsaptuk. A kocsonyás csapadékot új, 500 µl 70%-os etanol tartalmú, eppendorf csőbe tettük át pipettahegy segítségével. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítást követően, a DNS csapadékot 100 µl steril desztillált vízben oldottuk fel (Meade et al., 1982 ). A pSEM91 plazmid vektorba történő rkpM inszert beépülésének tesztelésére gyors DNS izolálási technikát használtunk. A vizsgálni kívánt baktériumot felszuszpendáltuk 100µl steril desztillált vízben, 5 percig 100°C-on forraltuk, majd 5 percig 0°C-on inkubáltuk. Ezután a mintát 5 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót új csőbe pipettáztuk és higítottuk (10x). 4.7. Plazmid DNS izolálás A plazmid vagy kozmid DNS-t E. coli esetén 3-3 ml LB tápfolyadékban, S. meliloti esetén pedig TA tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett sejtekből Ish-Horowicz és Burke (Ish-Horovicz and Burke, 1981) szerint alkalikus lízissel preparáltuk. 1.5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe tettünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük. A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCL, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz pH 8.0) szuszpendáltuk fel. A feltárást óvatos keverés mellett 200 µl NS oldat (0.2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0°C-on inkubáltuk, majd erős rázással 160 µl jéghideg Na-acetát oldatot (3M, pH 4.8) adtunk hozzájuk. 5 perces 0°C-os inkubáció után 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszóból 400 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 10 perc -20°C-os inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk és szárítottuk. A csapadékot 100 µl Tris-pufferben (50 mM TrisHCL, 100 mM Na-acetát, pH 8.0) oldottuk fel, majd 200 µl etanollal ismét kicsaptuk. 10 perc 0°C-os inkubáció után a csapadékot centrifugáltuk, szárítottuk, majd 30 µl RNáz-os trideszt vízben (100 µl/ml RNázA) oldottuk fel.

PA_DIP04.doc

18 A szekvenáláshoz és a transzpozíciós in vitro reakcióhoz készített preparátumoknál további tisztítási lépést iktattunk be. A plazmid DNS izolálálás végén 50 µl RNáz-os desztillált vízben vettük fel a csapadékot, majd 0.1 térfogat 10% SDS és 1 térfogat 7,5 M NH4-acetát után 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután centrifugáltuk 5 percig és a felülúszót új csőbe pipettáztuk, ehhez 0,6 térfogat izopropanolt adtunk és -20°C -ra tettük 20 percig. Az inkubálás után etanolos mosás, és szárítás következett. A csapadékot 40 µl steril desztillált vízbe vettük fel. 4.8. Polimeráz láncreakció (PCR) Az rkpM gént magába foglaló, illetve ennek egy részét tartalmazó DNS-szakaszt sokszoroztuk meg polimeráz láncreakció segítségével. A felhasznált oligonukleotidokat az 5. táblázat tartalmazza. DNS szekvencia meghatározáshoz az rkpM4046, illetve rkpM4178 allélt magába foglaló DNS szakaszt az RM-15 és RM-13 primerekkel, valamint az alábbiakban részletezett RKP-M program alkalmazásával amplifikáltuk (1625 bp). A klónozáshoz használt rkpM allél felsokszorozásához ugyanezen primereket, és a valószínűsíthetően jobb hatásfokkal tompa végeket létrehozó Pfu DNS-polimerázt alkalmaztuk (RKP-M1 program). A pSEM91 plazmid vektorba történő rkpM inszert beépülésének tesztelésére két belső primert (RM-23, RM-25) használtunk fel, melyekkel 1% agaróz gélen is könnyen detektálható (558 bp) fragmentet kaptunk (RKP-M2 program). Az alábbi PCR-programokat alkalmaztuk: RKP-M

RKP-M1

RKP-M2

1. 1 min. 94°C 2. 30 sec. 94oC 3. 30 sec. 62oC 4. 1 min. 72oC 5.34× a második lépésre 6. 30 sec. 20oC 7. End

1. 1 min 95°C 2. 1 min 95°C 3. 30 sec. 62oC 4. 3 min 72oC 5. 34× a második lépésre 6. 5 min 72oC 7. 1 min 20oC 8. End

1. 1 min. 94°C 2. 30 sec. 94oC 3. 30 sec. 59oC 4. 1 min. 72oC 5.34× a második lépésre 6. 30 sec. 20oC 7. End

4.9. Fragmentizolálás A PCR terméket agaróz gélelektroforézis segítségével tisztítottuk. Az izolálni kívánt fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk és 20 perces 60V feszültség melletti elektroforézis után az izolálandó fragment a papírra került. A papírt eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t 100 µl 1M NaCl oldattal mostuk le, kétszer egymás után. A DNS kicsapása 20 µl 3M Na-acetát oldattal (pH 7,0) és 120 µl izo-propanollal történt. 20 perces -20oC-os inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl steril desztillált vízben oldottuk fel a csapadékot. PA_DIP04.doc

19 4.10. DNS-szekvenálás Az izolált PCR fragmenteket, DNS szekvencia meghatározás céljából a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumába küldtük el. A szekvenálási reakcióhoz felhasznált oligonukleotidok fő jellemzőit az 5. táblázat foglalja össze. 5. táblázat: A szekvenálási reakcióhoz felhasznált oligonukleotidok ___________________________________________________________________________ Oligonukletid neve Nukleotidszekvencia Számított Tm (oC) ___________________________________________________________________________ RM-15 primer

5’-

GCATTAGGCCCGGGGAGAAGC

-3’

RM-13 primer

5’-

CAGGCCGAAGGAACGGAACCTC

RM-25 primer

5’-

CGAGCCAAGGTGGACTTCGTT

-3’

59,4

RM-23 primer

5’-

CAGGCCGGAATAGCTGTCAGG

-3’

59,5

RM-35 primer

5’-

CTGGCTCGGCGATATGATAAG

-3’

54,9

RM-33 primer

5’-

AGCGAAATGCACGAGCACAAC

-3’

59,0

-3’

62,4 62,0

4.11. Restrikciós emésztés, kettős emésztés A DNS minták restrikciós emésztését Sambrook és mtsai szerint végeztük. (Sambrook et al., 1989). A kettős emésztés esetén, az első enzimreakció után a minta DNS tartalmát kicsaptuk 0,1 térfogat 3M Na-acetát (pH=7) és 2 térfogat et-OH (96%) hozzáadásával, és min. 20 percig inkubáltuk -20°C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70% et-OH mosás, szárítás után 30µl steril desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a második enzimreakciót. 4.12. Gélelekroforézis A fragmentek elválasztására 1%-os agaróz gélt használtunk. Az elválasztásra szánt DNS mintához, az alábbiakban leírt összetételű STOP-oldatot adtunk (5xSTOP-ból a végtérfogat 1/5-ét). A gélelektroforézist minigél esetében 60V-on, fragmentizolálásnál 40V-on végeztük. Kontrollként, PstI enzimmel emésztett, λ DNS-t alkalmaztunk. 1%-os agaróz gél: 1 g agaróz, 100 ml 1xTBE puffer, 100 µl etidium-bromid (100 µg/ml). 5xSTOP 20 ml-hez: 2 g ficoll, 10 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0), 40 mg brómfenolkék (BFB). 5xTBE törzsoldat: 54 g TRIS, 27,5g bórsav, 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) / 1000 ml.

PA_DIP04.doc

20 4.13. Kompetens sejt készítés Kompetens sejtek készítéséhez XL1-Blue, valamint JM109 E. coli törzset használtunk. 200 ml SOB táptalajban (2% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, pH 7.0) éjszakán át 22°C-on növesztett baktériumkultúrát 10 percre jégre tettünk. A 10 perces centrifugálással (4000 rpm) összegyűjtött sejteket 80 ml hideg TB pufferben (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl, pH 6.7) szuszpendáltuk. 10 percig jégen inkubáltuk, majd centrifugálással összegyűjtöttük a sejteket, és 20 ml jéghideg TB pufferben szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 1.5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket Eppendorf-csövekbe szétosztva -80°C-os hűtőben fagyasztottuk és tároltuk transzformációig (Inoue et al., 1990). 4.14. Ligálás A ligálási elegyet vektor DNS oldat, fragment DNS oldat, ligáz puffer (5×koncentráció: 200 mM TrisHCL, 50 mM MgCl2, 50 mM dithiotreitol (DTT) 2,5 mM ATP, pH 7.8) és steril desztillált víz felhasználásával készítettük. A fragment mennyisége tízszeres volt a vektor mennyiségéhez képest. A reakcióhoz T4 DNS ligázt használtunk, és az elegyet legalább 2 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk. 4.15. Transzformálás Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -20°C-ról jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 30 percig jégen inkubáltuk, majd 3 perces 37°C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 400 µl SOC oldatot (2% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM glükóz, pH 7.0) adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra tettük. pBluescript használata esetén a táptalajba 40 µl IPTG (100 mM) és 40 µl Xgal oldatot (2%,dimetil-formamidban) tettünk, és a transzformánsokat kék-fehér screen segítségével detektáltuk. (Inoue et al., 1990). A transzpozíciós mutagenezisnél antibiotikumot használtunk szelekciós eszközként (Km, Cam). 4.16. In vitro transzpozíciós mutagenezis A pSEM91 plazmid vektor transzpozonos mutagenezisét a TGS II Kit (Template Generation SystemTM II, TGSTM II, F-702; Haapa et al., 1999) alapján végeztük el. A cél a vektoron lévő rezisztencia marker megváltoztatása volt. Kloramfenikol rezisztencia gént juttattunk be a kanamicin génbe. Plazmid DNS tisztítás után megmértük a minta DNSkoncentrációját. A reakcióhoz szükséges DNS mennyiséget a target DNS hossza (8,4 kb) PA_DIP04.doc

21 alapján (40 ng DNS/ kb) határoztuk meg. A meghatározott térfogatú DNS mintához, 4 µl 5x puffert, 1 µl (20 ng/µl) kloramfenikol rezisztenciagént hordozó entranszpozont, 1 µl (0,22 µg/µl) MuA transzpozáz enzimet adtunk, majd az elegyet 20 µl-re egészítettük ki steril desztillált vízzel. A mintát 1 órán át 30°C -on inkubáltuk, ezután 10 percig 75°C -on inaktiváltuk, majd transzformáltuk. 4.17. Bioinformatikai módszerek Az RkpM fehérje homológok keresésére az NCBI honlapon elérhető

BLASTP

programot

használtuk (Altschul et al., 1990; www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). A homológ funkcionális doménekről a PROSITE (Falquet et al., 2002; www.expasy.org/prosite) és Pfam (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam) adatbázisokból gyűjtöttünk információkat. Motívum elemzést a UNIX rendszer alatt működő EMBOSS programcsomag

PATMATDB

programjával

végeztünk. A fehérje további elemzésére, HTH motívum prediktálásra, többszörös illesztések elvégzésére az ExPASy Molecular Biology Server honlapon (Gasteiger et al., 2003, www.expasy.org), és a Lion Bioscience AG,

SRS

programjában (srs.ebi.ac.uk/Tools) elérhető

eszközöket alkalmaztuk. A feltételezett transzmembrán domének elemzését a TopPred programmal végeztük (Claros and Heijne, 1994; www.sbc.su.se/~erikw/toppred2).

PA_DIP04.doc

22

5. EREDMÉNYEK 5.1. Az rkp-4046 mutáció helyének meghatározása Munkánk megkezdésekor rendelkezésünkre állt a GH4046 spontán mutáns S.meliloti törzs, mely rezisztens a vad típusú 16-3 bakteriofággal szemben, viszont a 16-3 h5 host range fág fertőzni képes. Az volt a célunk, hogy megtaláljuk a mutációt szenvedett gén pontos helyét, majd a mutáció jellegét. Mivel sejtettük, hogy a változás valamelyik KPS bioszintézisért felelős génben van, ezért először azt kellett megállapítanunk, hogy az rkp-4046 mutáció egy már azonosított vagy egy ismeretlen rkp génben történt. Ennek kiderítésére genetikai komplementációs kísérleteket végeztünk.

2. ábra: Az rkp-3 régió szerkezete (Kiss et al., 2001). fent: Feltüntettük a pAT399 és a pAT401 kozmid klónokban található inszertek által lefedett részeket. A régión belül néhány restrikciós enzim hasítóhelyét is jelöltük (E: EcoRI; B: BamHI; H: HinDIII). lent: Nyilakkal az azonosított gének helyét és irányultságát jelöltük.

Az első komplementációs kísérletben azt vizsgáltuk, hogy melyik rkp régióban található a mutáció. Az rkp-3 régiót két átfedő kozmid klón tartalmazta (pAT399, pAT401; 2.ábra), ezért ezeket külön kellett vizsgálni. A kísérlet eredményeként megállapítottuk, hogy az rkp4046 mutáció az rkp-3 régió bal oldali szakaszán (pAT399) található. A következő komplementációs kísérlettel a mutáció rkp-3 régióban található helyét kerestük. A régióban található gének elhelyezkedése és teljes nukleotidszekvenciája már ismert volt (Kiss et al., 2001). Az eredmények alapján, a régiót számos – a kapszuláris poliszacharid-bioszintézisben részt vevő – rkp gén alkotja (2. ábra).

PA_DIP04.doc

23 Az előző kísérletből tudtuk, hogy a mutáció a pAT399 kozmid klón szakaszára esik. Eredményeink szerint az rkp-4046 mutáció az rkpM génben van, tehát a GH4046 baktériumtörzs az rkpM egy mutáns allélját hordozza. Ezt rkpM4046 allélnak neveztük el. (A komplementációs kísérletek részletes leírása, Deák Veronika diplomadolgozatában található). 5.2. A 16-3 bakteriofág receptor kialakításában részt vesz az RkpM fehérje. A csoportunkban végzett egyéb kísérletek alapján megállapították, hogy az általunk vizsgált GH4046 mutáns törzs egyáltalán nem termel kapszuláris poliszacharidot ugyanúgy, mint az AT212 (rkpM::Tn5) mutáns törzs sem, melyen nem lehet host-range fágot izolálni és az rkpM génben egy Tn5 transzpozont tartalmaz, így elrontva a gén működését. Ez arra utalt, hogy a 16-3 fág receptora valószínűleg nem a KPS, mint azt előzőleg feltételeztük. Ezen információkból kiindulva valószínű, hogy a host-range fágmutánsok esetében az „elsődleges” receptorként szolgáló KPS hiányában egy másik sejtfelszíni poliszacharid veheti át annak szerepét. Ha ez így van, akkor minden rkp mutánson, de legalább az rkpM::Tn5(212) mutációt hordozó baktériumon lehetséges volna a host-range fágmutánsok izolálása. Ezt több független kísérletben is megpróbáltuk, de minden alkalommal csak a kontrollként alkalmazott GH4046 törzsön kaptunk plakkokat. Tehát közvetett bizonyíték mutatott arra, hogy a fágreceptor nem a KPS és, hogy az rkpM4046 allél egy különleges mutációt hordoz, mely egy megváltozott szerkezetű fágreceptort eredményez. Kézenfekvő volt ezek után a feltételezés, hogy maga az RkpM fehérje szolgál fágreceptorként, és az rkpM4046 allél valószínűleg csak egyetlen aminosavcserét eredményező (un. missense) mutációt tartalmaz. 5.3. Az rkpM4046 allélban egy missense mutáció található A továbbiakban arra kerestünk választ, hogy az rkpM4046 allélban DNS szekvencia szinten milyen változás történt. A vadtípusú szekvencia (AK631) pontos bázissorrendje már ismeretes volt (AC: AJ245666; Kiss et al., 2001), ezért megtervezhettük a mutáns gén megsokszorozásához, illetve szekvencia meghatározásához szükséges oligonukleotidokat. A GH4046 baktériumtörzs össz-DNS preparátumából polimeráz láncreakció (PCR) segítségével a kívánt DNS-szakaszt megsokszoroztuk, majd izoláltuk ezt a fragmentet, agaróz gélelektroforézis alkalmazásával. Mivel a PCR-fragment 1625 bázispár hosszúságú, míg a benne foglalt rkpM gén 1161 bázispárnyi, ezért a mutáns allél DNS-szekvenciájának meghatározásához – a PCRprimereken kívül – szükség volt még négy oligonukleotid tervezésére, hogy mindkét szálon

PA_DIP04.doc

24 lehetővé tegyék az egymással átfedő leolvasások a nukleotidsorrend biztonságos meghatározását (3.ábra).

3. ábra: A PCR és a szekvenálási reakciókhoz felhasznált oligonukletidok elhelyezkedése. A PCR reakcióhoz az Rm-15 és az Rm-13 primereket alkalmaztuk. A DNS-szekvencia meghatározásához – az előbbieken kívül – szükség volt még négy oligonukleotidra (Rm-25; Rm-35; Rm-23; Rm-33; pontos szekvenciájukat az 5. táblázat tartalmazza).

Az izolált PCR-fragment nukleotid szekvenciáját a tervezett oligonukleotidok segítségével, szubklónozás nélkül, direkt úton határoztuk meg. A részszekvenciák összeillesztése után megállapítottuk, hogy az rkpM4046 allél, meglepő módon, két missense mutációt hordoz a gén 3' végének közelében. Ezek alapján nem tudtuk eldönteni, hogy mindkettő mutáció vagy csak az egyik felelős a megváltozott szerkezetű fágreceptor kialakulásáért. A probléma oka az, hogy a vadtípusú szekvencia megállapítása az AK631 törzs alapján történt, míg a GH4046 mutáns az RM41 törzsből lett izolálva. Feltételeztük, hogy csak az egyik mutáció okozza az RkpM fehérje funkcióvesztését. Ennek kiderítésére az rkpM41 nukleotid sorrendjét is meghatároztuk, így kiderült, hogy az AK631 és RM41 között is létezett egy eltérés, mely semlegesnek bizonyult a fágreceptor kialakulása és a KPS bioszintézis szempontjából, mivel mindkettő termel KPS-t és szenzitív a 16-3 fággal szemben. Az rkpM41 vadtípusú és rkpM4046 mutáns allél közötti eltérés egy aminosav cseréjét jelenti az általa kódolt fehérje C-terminális részén. (Az rkpM41 allél szekvenálása lsd. Deák Veronika diplomadolgozata, 2004). A vad típusú allél leucint (Leu252) meghatározó kodonjának (TTG) egyik bázisa megváltozott (TTC), mely fenilalanin (Phe252) beépülését okozza az aminosavlánc adott pozíciójába (4. ábra).

PA_DIP04.doc

25

4. ábra: A vad típusú rkpM gén nukleotidsorrendjét illetve az általa meghatározott aminosavszekvenciát tartalmazza az ábra. Feltüntettük a GH4046, GH4178 és GH4180 baktériumtörzsek mutáns alléljának felsokszorozásához és DNS-szekvencia meghatározásához alkalmazott oligonukleotidok (Rm-13, Rm-15, Rm-23, Rm-25, Rm-33, Rm-35) elhelyezkedését. A sárgával kiemelt TTG kodon a GH4046 és GH4178 törzsekben azonosított mutáció helyét jelöli, ahol ez TTC kodonra változott. A mutáció eredményeként leucin (L252) helyett fenilalanin (P252) épül be a fehérje adott pozíciójába.

PA_DIP04.doc

26 5.4. Újabb mutánsok vizsgálata Kíváncsiak voltunk arra, hogy csak az RkpM fehérje alkotja-e a fágreceptort, illetve annak mely részei vesznek részt a felismerésben. Hogy közelebb kerüljünk a válaszhoz, tanszékünkön újabb mutánsokat izoláltak, hasonló módszerekkel a már leírtakhoz (2. fejezet). Ezek az rkp-4178 és az rkp-4180 mutációkat hordozó törzsek. Mindkét törzsből DNS-t izolálva, megsokszoroztuk az rkpM gént hordozó DNS szakaszt PCR reakció segítségével, és kimutattuk, hogy az rkp-4178 mutáció teljesen megegyezik az előzőekben vizsgált rkpM4046 mutációval (4. ábra). Tehát, egy teljesen független mutánsizolálás és szekvencia meghatározás megerősítette előző eredményeinket. Az rkp-4180 mutáció vizsgálata azonban más eredményt hozott. Ebben az esetben az rkpM génben nem találtunk semmilyen mutációt. Az előzetes komplementációs eredmények szerint (Szabó Csilla munkája), a mutáció ez esetben az rkp-3 régió más génjének területére esik, ami arra enged következtetni, hogy az RkpM fehérjén kívül más alkotója is van a fágreceptornak. Végeredményben, az a következtetés vonható le, hogy az RkpM fehérje a fágreceptor alkotóeleme, C-terminális része a fággal való kapcsolat kialakításában közvetlen szerepet játszik. Mindezt alátámasztja a host-range fágok vizsgálata is (Békási Krisztina, illetve Maász Anita diplomadolgozata 2004.), ahol a h génben történt missense mutáció lehetővé teszi, hogy az RkpM4046 fehérjét tartalmazó baktériumokon a host-range mutáns fág szaporodhasson. Tehát, egy baktériumfehérje egyetlen aminosavának megváltozása következtében megszűnt felismerési folyamatot a fág egy fehérjéjének egyetlen aminosavában bekövetkezett megváltozása helyre tudta állítani. Ez, a két fehérje közvetlen kölcsönhatására utal. Hasonló jelenséget már más rendszerekben is kimutattak. Például az Escherichia coli K-12 törzse és a λ fág esetében a fág receptora a maltóz és maltodextrinek transzportjáért felelős külső membránfehérje, a MalB. Ezzel közvetlen kölcsönhatásban a fág farkirost J fehérjéje áll. A malB génben történő pontmutációkra, melyek fágrezisztenciát eredményeznek, a host-range fágok szintén egy-egy missense mutációval „reagálnak”, melyek mind a j génnek a farkirost C terminálisát kódoló részére estek (Wang et al., 1998; Werts et al., 1994). 5.5. Komplementációs kísérlet a receptorfunkció bizonyítására A következő kísérletekben tovább szerettük volna erősíteni a feltevésünket, miszerint az RkpM fehérje a fágreceptor alkotórésze. Ennek bebizonyítására újabb komplementációs kísérletet terveztünk. A vadtípusú (rkpM), illetve a mutáns gént (rkpM4046), olyan S. meliloti törzsbe kívántuk bejuttatni konjugáció segítségével, mely egyáltalán nem termel kapszuláris

PA_DIP04.doc

27 poliszacharidot (az rkpM4046 klónozása és az ehhez kapcsolódó komplementációs kísérlet Deák Veronika diplomadolgozatában, 2004., szerepel). Ilyen törzs a már említett rkpM::Tn5(212) (AT212) mutáns. Azt reméltük, így helyreáll a fággal való fertőzhetőség a vadtípus bejuttatása esetén a 16-3, a mutáns allél bejuttatása esetén a 16-3 h5 host-range bakteriofággal. A vadtípusú génnel történő komplementáció kontrollként is szolgál az rkpM4046 allél vizsgálatához. Az első komplementációs kísérletnél (lsd. 5.1 bekezdés), ahol a GH4046 törzsben történő mutáció pontos helyét határoztuk meg, az rkpL-Q génekben külön-külön Tn5 transzpozont tartalamzó plazmidokat juttattunk be a mutáns baktériumba. Mivel valószínű, hogy az rkpL-Q gének egy policisztronos egységbe tartoznak, feltételezhető, hogy egy promóterről íródnak át, ezért a konjugáció során azt reméltük, hogy érvényesül a transzpozon beépülésének poláris hatása, azaz a tőle „down-stream” elhelyezkedő összes gén átíródásának blokkolása. A kísérletben kiderült, hogy a poláris hatás nem érvényesül. Ebből arra következtettünk, hogy a beépült Tn5 transzpozonon van olyan promóter-szerű szekvencia, mely elegendő az inszerció után elhelyezkedő gének expressziójához, vagy eleve az rkp-3 régió tartalmaz ilyen szekvenciákat. Ezen információkat figyelembe véve, a konjugációs kísérlet elvégzéséhez olyan plazmidot konstruáltunk, mely az rkp-3 régióból csak az rkpM gént tartalmazza. Először a vadtípusú S. meliloti (RM41) törzsből össz-DNS preparátumot készítettünk, majd az Rm-13 és Rm-15 primerek segítségével, polimeráz láncreakcióval megsokszoroztuk az rkpM gén megfelelő hosszúságú szakaszát (1161 bp). A DNS-fragment izolálása után következett a fragment ligálása a pBluescript vektoron lévő KpnI-SalI helyre. Mivel a pBBR1 MCS-3 vektoron lévő KpnI-PstI helyre szerettük volna ligálni az rkpM fragmentet, de az nem tartalmazott PstI restrikciós hasítóhelyet, ezért alkalmaztuk először a pBluescript vektort (5. ábra). A pBBR1 MCS-3 vektor KpnI-PstI helyére történő inszert beépülést restrikciós emésztéssel ellenőriztünk. Az rkpM gént hordozó plazmidszármazékot konjugációval bejuttattuk az S. meliloti rkpM::Tn5(212) mutánsba, majd a komplementáció sikerét fágteszttel vizsgáltuk. A kísérletben nem sikerült komplementálni az rkpM::Tn5(212) mutánst, nem állt vissza a vad típusú 16-3 bakteriofággal történő fertőzhetőség. A mutáns rkpM4046 alléllal történő hasonló vizsgálat sem volt eredményes (Deák Veronika diplomadolgozata, 2004). A klónozásos kísérlet eredményeiből kiindulva valószínű, hogy a vektorba épített rkpM inszert eleje nem tartalmaz ilyen promoter jellegű szekvenciát, tehát a következőkben olyan plazmidot kell terveznünk, ahol az inszertet közvetlenül a promóter után építjük be.

PA_DIP04.doc

28

5. ábra: Az rkpM gén klónozása pBBR1 MCS-3 vektorba. Az ábrán a munka egyes lépései láthatók. A gént PCR segítségével amplifikáltuk, majd a fragment izolálása után ligáltuk a pBluescript II SK(+) vektor KpnI-SalI helyére, majd a pBBR1 MCS-3 vektor KpnI-PstI helyre.

PA_DIP04.doc

29 5.6. Az rkpM klónozása egy erős promóter után Az előző kísérlet nem hozta meg a várt eredményt, ezért, hogy biztosítsuk az rkpM gén expresszióját, egy újabb klónozási kísérletet végeztünk. A vadtípusú rkpM gént a pSEM91 expressziós vektorba juttattuk be, közvetlenül a Ptac promóter után. Az rkpM4046 mutáns génnel is elvégeztük a kísérletet (Deák Veronika diplomadolgozata, 2004). Kezdetként, hasonlóan az előbbi klónozási kísérlethez, polimeráz láncreakciót alkalmaztunk a megfelelő DNS szakasz megsokszorozására, de ebben nem az általánosan használt Taq polimeráz enzimet használtuk, hanem a fragment végén nagyobb hatékonysággal tompa véget létrehozó Pfu polimerázt. A fragment izolálása után szintén pBluescript vektorba ligáltuk az inszertet, de ebben az esetben a vektoron lévő EcoRV helyre. Mivel itt nem irányított inszertbevitel volt, mint az első klónozásnál (5.5 pont), meg kellett állapítani, hogy az inszert megfelelő orientációban épült-e be. Ennek kiderítésére restrikciós emésztést végeztünk. A megfelelő orientációjú konstrukciót (6. ábra) SmaI enzimmel emésztettük, és fragmentizolálás után, a pSEM91 vektor EcoRV helyére ligáltuk. Az inszertet tartalmazó plazmidot XL1Blue sejtbe transzformáltuk, ezután meg kellett állapítanunk az inszert beépülését és annak orientációját. A transzformánsokból öszes DNS-t izoláltunk „gyors” DNS preparálással, majd az rkpM inszertet amplifikáltuk PCR segítségével (RM-23, RM-25 primerek). Azokon az izolált plazmidokon, melyeknél a PCR reakció kimutatta az inszert jelenlétét, restrikciós emésztést végeztünk SalI enzim segítségével. A inszertet megfelelő orientációban tartalmazó származékot a fragmentek mérete alapján tudtuk kiválasztani (pAV4223). A kísérlet során felmerült egy probléma, miszerint a komplementációban recipiensként használt AT212 (rkpM::Tn5) törzs szintén Km rezisztencia génnel rendelkezik, mint a pSEM91 vektor. Így nem tudjuk kiszelektálni azokat a S.meliloti, rkpM::Tn5(212) sejteket, melyekbe a konjugáció során bejutott az rkpM gént tartalmazó pSEM91 plazmid. Ennek megoldására, in vitro transzpozíciós mutagenezissel a vektor Km rezisztenciagénjébe egy kloramfenikol (Cam) rezisztenciagént juttattunk be, ezzel elrontva a Km rezisztenciáért felelős gént. Transzformálás után azokat a sejteket kerestük (pAV4223 Km::Cm(F-778)), melyek Km szenzitív és Cam rezisztensek voltak. Az entranszpozon beépülését restrikciós emésztéssel is ellenőriztük (7. ábra). A klónozásos és transzpozíciós kísérletek végére egy olyan plazmidszármazékkal (pAV4258) rendelkeztünk, mely tartalmazta a pSEM91 expressziós vektoron a Ptac promoter után építve az rkpM vadtípusú gént, és a kanamicin rezisztencia gént inaktiváló kloramfenikol rezisztenciát hordozó entranszpozont.

PA_DIP04.doc

30

6. ábra: Az rkpM gén klónozása pSEM91 expressziós vektorba A klónozási folyamat egyes lépéseit szemlélteti az ábra. PCR segítségével megsokszoroztuk a vizsgált gént, a fragment izolálását követően a pBluescript II SK(+) vektor EcoRV helyére ligáltuk, majd a pSEM91 vektor szintén EcoRV helyére. Végül in vitro transzpozíciós mutagenezissel Cam rezisztenciagént juttattunk a plazmid Km génjébe.

PA_DIP04.doc

31

7. ábra: Az in vitro mutagenezis ellenőrzése restrikciós emésztéssel. (A) A bal oldali fotón látható a SalI enzimmel emésztett pAV4223 plazmid, három fragment keletkezik (5,2kb; 1,7kb; 1,2kb). (B) A jobb oldali fotón az 1,3kb-os entranszpozon beépülését követő restrikciós emésztés (SalI) eredménye látható. Az 1,2kb-os fragmentből a beépülés hatására 2,5kb-os fragment keletkezett. λ: PstI enzimmel emésztett lambda DNS

5.7. Az rkpM expresszió hatása különböző mutáns törzsekben A kísérletben továbbra is azt szerettük volna megtudni, hogy az RkpM fehérje részt vesz-e a fágreceptor kialakításában. A klónozás során létrehozott pAV4258 plazmidot juttatuk be konjugáció segítségével az AT212 (rkpM::Tn5), a receptor mutáns GH4046 (rkpM4046), illetve kontrollként a vad típusú AK631 törzsekbe. A komplementáció sikerét, vagyis a transzkonjugáns baktériumok fenotípusát fágteszttel ellenőriztük. Az AK631 törzset mind a 16-3, mind a 16-3 h5, ezzel ellentétben a GH4046 törzset csak a 16-3 h5 bakteriofág képes fertőzni, viszont az AT212 törzset egyik sem. A kísérletben azt figyeltük, hogy az említett fenotípusok hogyan változnak meg a Ptac::rkpM konstrukció jelenlétében. Eredményként azt vártuk, hogy az AT212 (rkpM::Tn5) törzsbe, plazmidon bejuttatott vadtípusú rkpM gén képes helyreállítani mindkét fággal történő fertőzhetőséget. Ez nem sikerült, a mutáns rkpM4046 génnel történő konjugáció sem hozott eredményt, ebben az esetben azt reméltük, hogy az AT212 törzs 16-3 h5 fággal szembeni fertőzhetősége áll helyre (Deák Veronika diplomadolgozat, 2004). A kísérlet pozitív eredménye, hogy a bejutatott vadtípusú rkpM az AK631 esetén nem csökkentette a fágokkal való fertőzhetőséget, a GH4046 törzset pedig fertőzhetővé tette a vadtípusú 16-3 fággal szemben (6. táblázat).

PA_DIP04.doc

32 6. táblázat: A komplementációs kísérlet eredménye. Donor törzs: AV4258. Feltüntettük a recipiensek fágfertőzhetőségét konjugáció előtt és után. Fenotípus (Fágfertőzés)

Recipiens törzsek

Transzkonjugáns fenotípus (Fágfertőzés)

16-3

h5

16-3

h5

AK631 (vad típus)

+

+

+

+

4046

−

+

+

+

AT212 (rkpM::Tn5)

−

−

−

−

Az AT212 (rkpM::Tn5) törzsel történő konjugáció során valószínű, hogy a Tn5 transzpozon poláris hatása valahogyan mégis megnyílvánul, vagy a kialakításban résztvevő gének nem tudják létre hozni a fágreceptort. A mutáns rkpM4046 gén bevitelével csökken az AK631 törzs mindkét fággal történő fertőzhetősége (Deák Veronika diplomadolgozat, 2004). Ezek alapján azt is feltételezhetjük, hogy az RkpM fehérje önmagában represszor hatású lehet, ha nem tudja kialakítani a fágreceptort és a KPS bioszintézisben sem vesz részt. A jelenség következetesebb körüljárásához további kísérletek szükségesek, mivel bonyolultabb folyamatról lehet szó, mint azt gondoltuk. Azt is meg kell állapítani, hogy a külön bejuttatott RkpM fehérje mennyire befolyásolja a KPS termelést. 5.8. Az rkpM gén bioinformatikai analízise Ahhoz, hogy minél többet megtudjunk egy ismeretlen génről, illetve az általa kódolt fehérjéről, további információkat bioinformatikai eszközök segítségével nyerhetünk. Ezen ismeretek

felhasználásával

olyan

biológiai

kísérleteket

tervezhetünk,

melyekkel

megállapítható a fehérje természete, funkciója. Az S. meliloti baktérium KPS bioszintézisben szerepet játszó rkpM génjének nukleotid és fehérjeszkvenciája már rendelkezésre állt (AC: AJ245666). Ismert volt, hogy a

BLASTP

homológia keresés alapján az RkpM szekvenciája nagyban hasonlít a DegT/EryC/DnrJ/StrS piridoxál-foszfát (PLP) függő aminotranszferáz családba tartozó fehérjékkel (Kiss et al., 2001). Az említett családba tartozó fehérjék főként poliszacharid és antibiotikum bioszintézisért felelősek. Már a bevezetőben említettük, hogy az rkp-3 régió a KR5 antigén szintézisének törzsspecifikus génjeit tartalmazza és csak a S. meliloti 41 törzs rendelkezik ezen génekkel. A GC-tartalom és a kodonhasználat elemzésével kiderült, hogy az rkp-3 régió génjei valószínűleg horizontális transzfer segítségével, újonnan szerzett gének. Az egyes kódoló szekvenciák különböző kodonhasználattal rendelkeznek, valamint a régió génjeinek GC-

PA_DIP04.doc

33 tartalma alacsonyabb, mint az alap „háztartási” géneké (Kiss et al., 2001). Hasonlót már más, főleg

patogén

baktériumok

K-antigén

specifikus

génjeinél

is

feltételeztek.

Ezen

információkból kiindulva részletesebb elemzéseket végeztünk a fehérjén. Konzerválódott domén homológia (Marchler-Bauer et al., 2003) alapján az RkpM fehérje legnagyobb hasonlóságot a WecE fehérjével mutatott, mely prediktált PLP kötő, sejtfal bioszintézis regulációjában résztvevő fehérje (COG0399.1) A szekvencia szintű homológia vizsgálatnál feltűnt, hogy az RkpM fehérje magasfokú hasonlóságot mutat a Pseudomonas aeruginosa egyik O9 szerotípusba tartozó fehérjéjével (ORF_7, AC: AAM27873.1). A K-antigéneket alkotó pszeudaminsavat (Pse) először a Pseudomonas törzsekben fedezték fel. Az RkpL-Q fehérjék

BLASTP

elemzéséből kitűnt, hogy mindegyik fehérje homológ valamelyik O-antigén

biosztinézisben résztvevő P. aeruginosa fehérjével, melyek pontosan abban a sorrendben helyezkednek el (O9 szerotípus, AC: AF498420), mint az rkp-3 régióban lévő homológ fehérjék. Ezekből az adatokból gondolhattunk volna arra is, hogy a S. meliloti ettől a O9 szerotípusba tartozó P.aeruginosa törzstől kapta az rkpL-Q géneket, de Raymond és munkatársai kimutatták, hogy ezen O-antigén bioszintézisben résztvevő gének GC-tartalma alacsonyabb a Pseudomonas alap „háztartási” génjeinek GC-tartalmától (Raymond et al., 2002; www.genome.washington.edu/uwgc/O-Antigen). Ebben az esetben is horizontális transzferrel magyarázzák a jelenséget ugyanúgy, mint a szintén RkpM homológ P.aeruginosa WbpE fehérje, alapgénektől eltérő GC-tartalmát. (AC: AAG06543.1, [Pseudomonas aeruginosa PAO1]; Burrows et al., 1996). A kísérleti eredményeinkből következtetve az RkpM fehérje a fágreceptor alkotóeleme, tehát valószínű, hogy a sejtmembránban helyezkedik el, és transzmembrán doménekkel rendelkezik. Számítógépes elemzés szerint az RkpM fehérje három transzmembrán domént tartalmaz (50-70, 73-93, 123-143 aminosavak), tehát a belső membránba ágyazódva található. A domének lehetséges elhelyezkedését a 10. ábra (5.8.3. bekezdés) szemlélteti. A 243 aminosavból álló C terminális rész a periplazmatikus tér felé néz, az általunk meghatározott rkpM4046 mutáció ezen a szakaszon található. 5.8.1 PLP kötés a DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családnál A következőben a DegT/EryC/DnrJ/StrS piridoxál-foszfát függő amintranszferáz családról (a továbbiakban DegT család) gyűjtöttünk információkat. Léteznek más PLP függő aminotranszferáz fehérjék, melyeket már részletesebben elemeztek (aminotranszferáz I.-V. osztály). Ezekről tudjuk, hogy meghatározott PLP kötőhellyel rendelkeznek, melyek konzerválódott fehérje szekvencia motívumai ismertek (Pfam adatbázis, I. és II. osztály:

PA_DIP04.doc

34 PF00155, III. osztály: PF00202, IV. osztály: PF01063, V. osztály: PF00266). A PLP kötőhely szerkezetileg 2 " hélixből és a közöttük lévő $ lemezből áll. A kötőhelyet kialakító molekulák két rétegből álló struktúrát alkotnak. Az első réteg kapcsolódik a foszfát-csoport 3 oxigén atomjához. A fehérje és a kofaktor közötti kötésben kiemelt szerepe van a lizin aminosavnak, mely Schiff bázist képez a PLP molekulával (Denesyuk et al., 2002; Denesyuk et al., 2003). A DegT család, egy újonnan leírt osztályba tartozik, tagjai főleg pyridoxál/pyridoxamin-foszfát függő

aminotranszferázok,

melyek

szintén

rendelkeznek

erősen

konzerválódott

fehérjeszekvencia motívummal, de ez eltér az öt aminotranszferáz osztálynál leírt motívumoktól. A motívum képlete a következő: G-(D,V,T)-(E,V,Q)-x 76-84-(E,Q,R)-D-x10-12-(G,D,Q)-x3-5-G-x8-10-S-x4-K-x4-5-(G,A,L,F)-(E,D,Q)-G-G.

Itt feltételezhetően szintén a lizin (K) képez Schiff bázist a kofaktorral, emellett az aszparaginsav (D) hidrogénkötést alakít ki a PLP N1 atomjával (Ahlert et al., 1997; Pascarella and Bossa, 1994).

8. ábra: A DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családba tartozó fehérjék PLP-kötő motívumjainak többszörös illesztése (www.expasy.org). DegT (P15263), WbpE (AAG06543.1), DnrJ (P25048), MosB (AAA91313.1), ORF_7 (AAM27873), RkpM (AJ245666). Az RkpM és az ORF_7 fehérjék motívumtól való eltérését nyíllal jelöltük. A megengedett glutaminsav (E), valin (V) vagy glutamin (Q) helyett triptofán (W) áll.

Miután megvizsgáltuk az RkpM fehérjeszekvenciáját motívum kereső programmal, kiderült, hogy nem rendelkezik az említett motívummal, ugyanúgy ahogy a P.aeruginosa ORF_7 fehérje sem, ezzel ellentétben a P. aeruginosa WbpE fehérjéje igen. Ezután, hogy PA_DIP04.doc

35 kiderítsük pontosan milyen eltérés lehet az RkpM fehérje szekvenciája és a motívum között, többszörös illesztéseket végeztünk. Az RkpM fehérje és az előbb említett P.aeruginosa ORF_7 (AAM27873.1) fehérje szekvenciája egyetlen egy aminosavban különbözött a PLP kötő motívum képletében megadott konzerválódott aminosavakhoz képest, és mindkét fehérjénél ugyanaz az eltérő aminosav állt, ugyanabban a pozícióban (8. ábra). Más DegT családdal homológ fehérjénél is találkoztunk ugyanezzel a jelenséggel, de ott más eltérő aminosav állt az adott pozícióban. Az utóbbi fehérjék PLP kötését még nem bizonyították. Az eredmények alapján valószínűsíthető, hogy az RkpM fehérje a DegT aminotranszferáz családba tartozik és piridoxál-foszfát kötésre képes, hogy tényleges bizonyságot nyerjünk erről, biológiai kísérletekkel kell bizonyítanunk a funkciót. 5.8.2. Az RkpM fehérje DNS-kötő domént tartalmaz? Léteznek olyan DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családba tartozó fehérjék, melyeknél bizonyították, hogy regulátor szereppel rendelkeznek. Többek között ilyenek a DegT (Takagi et al., 1990), a DnrJ (Stutzman-Engwall et al., 1992) és a MosB (Murphy et al., 1993) fehérjék. Az eddigi eredmények alapján elképzelhető, hogy az RkpM fehérje is rendelkezhet regulátor szereppel (lsd. 5.7 bekezdés). Az aminotranszferáz családba tartozó fehérjéknél feltételeznek egy hélix-turn-hélix DNS kötő motívumot (Lacalle et al., 1992). Az előbb leírt, bizonyítottan regulátor funkcióval rendelkező feherjéknél ez a motívum megtalálható. Többszörös illesztéseket végeztek és az adott helyen fehérje szekvencia hasonlóság alapján feltételezik a kötőhelyet. Ezzel a módszerrel már más fehérjéknél is állapítottak meg valószínűsíthető hélix-turn-hélix (HTH) motívumot (Brennan and Matthews, 1989). Mivel a létező hélix-turn-hélix motívumot prediktáló számítógépes programokkal nem sikerült DNS-kötő helyet találnunk az RkpM fehérjén (a DegT, DnrJ, MosB fehérjéknél sem), ezért mi is ezt a homológián alapuló módszert használtuk fel a motívum keresésére. A DegT család fehérjéi meghatározott helyen rendelkeznek a kötőhellyel. A DNS kötő motívum 20 aminosavból álló fehérje részlet. A regulátor szereppel bíró fehérjék és más, nem ebbe a családból származó, hasonló kötőhellyel rendelkező fehérjék szekvenciáinak illesztése alapján megállapítható, hogy a motívum tartalmaz erősen és kevésbé erősen konzerválódott aminosavakat (Brennan and Matthews, 1989; Murphy et al., 1993). Ezek alapján készítettünk egy olyan szabályos kifejezésekből álló képletet, amelyet felhasználhattunk számítógépes motívum keresésre. Mivel a kötőhely igen rövid hosszúságú és csak néhány konzerválódott aminosavat tartalmaz, ezért egy fehérje szekvencián belül is több helyen előfordulhat. Szerencsénkre a DNS kötőhelyet pont a PLP kötő motívum által lefedett szekvencia részre

PA_DIP04.doc

36 valószínűsítik, ezért a PLP kötő motívum bizonyos elemeit is felhasználva, olyan DNS kötő motívumot prediktáló képletet készítettünk, melyet adott helyre pozícionálhattunk ([GA]-x(4)G-x(5)-[LI]-x(6)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G). Az általunk létrehozott képletet felhasználva végeztünk számítógépes keresést az RkpM fehérjén. A képlet túl szigorúnak bizonyult, mert nem illeszthető a fehérjére. Mivel a motívum tartalmazott kevésbé konzerválódott aminosavat is, ezért bizonyos változtatásokkal sikerült olyan motívumot szerkeszteni, mely már illett az RkpM és annak homológ fehérjéire is (9. ábra).

EryC1 DegT MosB DNRJ STRS PRG1 ΛCro 434REP

HHHHHHHHtttHHHHHHHHH QAVGARHRGHRVGAGSNAAA QAIGAKYNGKCVGELGTAAT QAHGALYKGQHVGLLSDIGC QAHGARRHGRLVGTQGHAAA QATGTEIGGRPIGGFGDLAC HAHGSRYKGKPVGTFGDAAV QTKTAKDLGVYQSAINKAIH QAELAQKVGTTQQSIEQLEN

ORF_7 RkpM

HAIGGRYLGEYIGNCRYSDITIFSFHPVKIITTAEGG HAVGGRYRGEPIGNCRYSDVTVFSFHPVKIVTTAEGG

Î G-x(4)-G-x(5)-[LI]

1. [GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G 2. [HQ]-x(2)-[GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G 9. ábra: Feltételezett DNS kötő motívumok a DegT családba tartozó és egyéb, már bizonyítottan DNS kötő, valamint az RkpM és ORF_7 (P. aeruginosa) fehérjéknél. Pirossal a konzerválódott, kékkel a PLP motívum konzerválódott aminosavait jelöltük. Az 1. számmal jelölt képlet illik az RkpM és ORF_7 fehérjékre. Az adatbázis keresés (7. táblázat) során újabb aminosavval bővítettük a képletet (2. motívum képlet), zölddel jelölve. A következőkben arra voltunk kíváncsiak, hogy az általunk készített képlet mennyire jellemző a DegT aminotranszferáz családra. Ennek megállapítására, a képlet segítségével keresést végeztünk fehérje szekvencia adatbázisokban. A vizsgálatok alapján a motívumot olyan fehérjék is tartalmazzák, melyek nem az aminotranszferáz, hanem főleg B típusú karboxilészteráz/lipáz családba tartozó fehérjék. A képlet újabb módosításával (9. ábra, 2. motívum) sikerült csak azokat a fehérjéket megtalálnuk, melyek mind a DegT családba tartoznak. A keresés eredménye tartalmazta mind az RkpM, WbpE, ORF_7 mind a DegT, EryC, StsC, DnrJ fehérjéket is (7. táblázat). Az első képlet alkalmazásával 66, DegT családdal homológ fehérjét találtunk a trembl adatbázisban, míg a bővített képlettel csak 52-t, ezen fehérjék többségénél még nem írtak le DNS kötő domént. A számokból következik, hogy 14

PA_DIP04.doc

37 fehérje adott szekvencia részlete nem hisztidin (H) vagy glutamin (Q) aminosavval kezdődik. Az utóbbi fehérjék nagy része perozamin szintáz enzim (RfbE, WbhD). Természetesen nem mondhatjuk, hogy ez a képlet konkrétan HTH motívumot prediktál, mivel nagyobb szekvenciarészletet fed le, mint maga a DNS kötő hely. Inkább lehetőséget ad arra, hogy egy DegT családdal homológiát mutató fehérjében megtaláljuk azokat a konzerválódott aminosavakat, melyek jellemzőek a már bizonyítottan regulátor szereppel rendelkező fehérjék DNS kötő motívumjaira.

7. táblázat: Fehérje szekvenciák keresése a kétféle képlet alapján (db). Motívum: [GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G Adatbázis

DegT/EryC/DnrJ/StrS családba tartozó fehérje

Nem DegT/EryC/DnrJ/StrS családba tartozó fehérje

Swissprot

5

1

trembl

66

18

Motívum: [HQ]-x(2)-[GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G Swissprot

5

--

trembl

52

--

5.8.3 A bioinformatikai elemzések eredményeinek értékelése A számítógépes elemzések alapján az RkpM a DegT/EryC/DnrJ/StrS fehérje családba tartozik, és valószínű, mint piridoxál-foszfát függő aminotranszferáz funkcionál. A fehérje kis eltéréssel, tartalmazza a fehérje családra jellemző PLP kötő motívumot, és ami fontos, rendelkezik a PLP molekulával kötést kialakító aszparagin és lizin aminosavakkal a megfelelő pozíciókban. Az RkpM fehérje homológ számos poliszacharid és sejtfal bioszintézisében szereplő regulátor fehérjével. Vizsgálataink alapján feltételezhető, hogy van egy DNS kötő HTH motívum a fehérjén, viszont érdekes, hogy mind az RkpM, mind a DegT család regulátor fehérjéinél a PLP kötésben fontos szerepet betöltő lizin és a DNS kötő hely igen közel találhatók egymáshoz. Ebből arra következtethetünk, hogy a két funkció nem működhet egyszerre. Mivel a KPS kialakításáért felelős az RkpM, tehát ez esetben az aminotranszferáz funkció érvényesül, de bizonyos esetekben előfordulhat, hogy szabályozó DNS-régió(k)hoz kötődhet, és a hasonló HTH motívummal rendelkező fehérjék (λcro, 434Rep, λRep) PA_DIP04.doc

38 természetéből kiindulva valószínű, hogy represszáló hatású. Az elemzések alapján a fehérje a belső membránban helyezkedik el, három transzmembrán doménnel rendelkezik (10. ábra). A mutáció a periplazmatikus tér felé néz, a PLP kötésért felelős aszparginsav (D157) és lizin (K188) aminosavak, valamint a prediktált DNS kötő motívum is a periplazmatikus tér felé néző szekvenciarészre esik. Hasonló tulajdonságokkal rendelkezik a Xanthomonas campestris pv. campestris LPS bioszintézisben résztvevő WxcK fehérjéje, mely szintén a DegT családdal homológ és tartalmaz egy transzmembrán domént (Vorhölter et al., 2001).

10. ábra: Az RkpM fehérje feltételezett transzmembrán doménjeinek elhelyezkedése Az ábrán kékkel jelöltük a PLP motívum által lefedett szekvenciarészt, valamint nyillal az rkpM4046 mutációt.

A következőkben a különböző funkciók bizonyítására, biológiai kísérletek elvégzésére van szükség, legfőképpen azt kell tisztázni, hogy az említett lehetséges funkciók milyen feltételek esetén érvényesülnek.

PA_DIP04.doc

39

6. ÖSSZEFOGLALÁS Munkánk kezdetekor rendelkezésünkre állt egy olyan Sinorhizobium meliloti baktérium mutáns (GH4046), melyet a host-range jelenség segítségével izoláltak, rezisztens a vadtípusú 16-3 bakteriofággal szemben, emellett gyanítottuk, hogy módosult szerkezetű KPS-el rendelkezik. Feltételeztük, hogy a KPS receptorként szolgál a 16-3 bakteriofág számára, mivel a KPS hiánya befolyásolja a fágrezisztenciát. Bizonyítani szerettük volna, hogy a KPS valóban fágreceptor szerepet is tölthet be, vagy más struktúra felelős ezért, valamint a poliszacharid bioszintézisben résztvevő gének természetének megismerését tűztük ki célul. Komplementációs kísérlettel megállapítottuk, hogy a GH4046 törzs mutációja az rkpM génben található és a gén bázissorrendjének meghatározásával kiderült, a változást egy missens mutáció okozta a fehérje C-terminális részén. A vad típusú allél leucint (Leu252) meghatározó kodonjának (TTG) egyik bázisa megváltozott (TTC), mely fenilalanin (Phe252) beépülését okozza az aminosavlánc adott pozíciójába. Ugyanezt az eredményt találtuk a függetlenül izolált GH4178 törzs vizsgálatánál is. Megtudtuk, hogy a GH4046 baktérium törzs egyáltalán nem termel KPS-t. Ezek alapján arra következtettünk, hogy a feltételezéseinkkel ellentétben a fágreceptor nem ez, hanem egy olyan sejtfelszíni struktúra, melynek kialakításában az RkpM fehérje, ezen kívül a GH4180 tözs előzetes vizsgálata szerint más fehérje is részt vesz. A továbbiakban klónozási és újabb komplementációs kísérleteket végeztünk a fágreceptor felépülésének pontosabb megismerése érdekében. A kísérletekben nem sikerült igazán tisztázni a folyamatot, de rávilágítottak arra, hogy az RkpM több funkcióval rendelkező fehérje, a receptor kialakulásában több tényező is szerepet játszhat, mint azt gondoltuk. A

számítógépes

elemzések

szerint,

az

RkpM

fehérje

feltételezhetően

a

DegT/EryC/DnrJ/StrS piridoxál-foszfát kötő aminotranszferázok családjába tartozik, hasonló több poliszacharid és sejtfal bioszintézisében résztvevő regulátor fehérjével. Valószínűleg a belső sejtmembránban helyezkedik el és három transzmembrán doménnel rendelkezik. Homológia alapján DNS kötő helix-turn-helix (HTH) motívum prediktálható a fehérjén, illetve tartalmazza azokat a konzerválódott aminosavakat, melyek jellemzőek a bizonyítottan regulátor funkcióval rendelkező fehérjék DNS kötő motívumjaira. A biológia kísérletekből és a bioinformatikai analízisből kitűnik, hogy az RkpM fehérje több funkcióval is rendelkezhet, melyek különböző feltételek mellett érvényesülhetnek. A különböző fehérje funkciók bizonyítására és azok összefüggéseinek tisztázására további, főleg biológiai kísérleteket kell elvégezni a jövőben.

PA_DIP04.doc

40

7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK Ahlert, J., J. Distler, K. Mansouri, and W. Piepersberg. 1997. Identification of stsC, the gene encoding the L- glutamine:scyllo-inosose Streptomycetes. Arch Microbiol. 168:102113. Allen, O.N., and E.K. Allen. 1981. The Leguminosae: A source book of characteristics, uses, and nodulation The University of Wisconsin Press, Madison. Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, and D.J. Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/. Becking, T.H. 1992. The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia. Chapman & Hall, New York. Becquart-de Kozak, I., B.L. Reuhs, D. Buffard, C. Breda, J.S. Kim, R. Esnault, and A. Kondorosi. 1997. Role of the K-antigen subgrup of capsular polysaccharides in the early recognition process between Rhizobium meliloti and alfalfa leaves. Mol. PlantMicrobe Interact. 10:114-123. Bladergroen, M.R., and H.P. Spaink. 1998. Genes and signal molecules involved in the rhizobia-Leguminosae symbiosis. Current Opinion Plant Bio. 1:353-359. Brennan, R.G., and B.W. Matthews. 1989. The Helix-Turn-Helix DNA Binding Motif. J Biological Chemistry. 264:1903-1906. Brzoska, P.M., and E.R. Signer. 1991. lpsZ, a lipopolysaccharide gene involved in symbiosis of Rhizobium meliloti. J. Bacteriol. 173:3235-3237. Bullock, W.O., J.M. Fernandez, and J.M. Short. 1987. Xl1-blue: A High Efficiency Plasmid Transforming RecA Es. Biotechniques. 5:376-379. Burns, R.C., and R.W.F. Hardy. 1975. Nitrogen fixation in bacteria and higher plants. Springer Verlag, New York. Burrows, L.L., D.F. Charter, and L.J. S. 1996. Molecular characterization of the Pseudomonas aeruginosa serotype O5 (PA01) B-band lipopolysaccharide gene cluster. Mol Biol. 22:481-495. Catoira, R., C. Galera, F. de Billy, R. Penmetsa, E. Journet, F. Maillet, C. Rosenberg, D. Cook, C. Gough, and J. Denarie. 2000. Four genes of Medicago truncatula controlling components of a nod factor transduction pathway. Plant Cell. 12:1647-1666. Cheng, H.P., and G.C. Walker. 1998. Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti. J Bacteriol. 180:5183-5191. Claros, M.G., and G.v. Heijne. 1994. TopPred II: an improved software for membrane protein structure predictions. Comput. Applic. Biosci. 10:685-686. Currier, W.M., and G.A. Strobel. 1974. Chemotaxis of a Rhizobium spp to a glucoprotein produced by birdsfoot trefoil roots. Science. 196: 434-436. David, M., M.-L. Daveran, J. Batut, A. Dedien, O. Domergue, J. Ghai, C. Hertig, P. Boistard, and D. Kahn. 1988. Cascade regulation of nif gene expression in Rhizobium meliloti. Cell. 54:671-683. Dean, D.R., J.T. Bolin, and L. Zheng. 1993. Nitrogenase metalloclusters : structures, organisation and synthesis. J. Bacteriol. 175:6737-6744. Dénairé, J., F. Dabellé, and C. Rosenberg. 1992. Signaling and host range variation in nodulation. Annu Rev Microbiol. 46:497-531. Denarie, J., and F. Debelle. 1996. Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: Signaling molecules mediating recognition and morphogenesis. Annu. Rev. Biochem. 65:503-535.

PA_DIP04.doc

41 Denesyuk, A.I., K.A. Denessiouk, T. Korpela, and M.S. Johnson. 2002. Functional Attributes of the Phosphate Group Binding Cup of Pyridoxal Phosphate-dependent Enzymes. J Mol Biol. 316:155-172. Denesyuk, A.I., K.A. Denessiouk, T. Korpela, and M.S. Johnson. 2003. Phosphate group binding "cup" of PLP-dependent and non-PLP-dependent enzymes: leitmotif and variations. Biochimica et Biophysica Acta. 1647:234-238. Diaz, C.L., L.S. Melchers, P.J.J. Hooykaas, B.J.J. Lugtenberg, and J.W. Kijne. 1989. Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhizobium legume symbiosis. Nature. 338:579-581. Ditta, G., S. Stanfield, D. Corbin, and D.R. Helinski. 1980. Broad host- range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 7347-7351. Dudley, M.E., T.W. Jacobs, and S.R. Long. 1987. Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti. Planta. 171:289-301. Earl, C.D., C.W. Ronson, and F.M. Ausubel. 1987. Genetic and structural analysis of the Rhizobium meliloti fixA fixB fixC and fixX genes. J. Bacteriol. 169:1127-1136. Ehrhardt, D.W., R. Wais, and S.R. Long. 1996. Calcium spiking in plant root hairs responding to Rhizobium nodulaton signals. Cell. 85:673-681. Falquet, L., M. Pagni, P. Bucher, N. Hulo, C.J.A. Sigrist, K. Hofmann, and A. Bairoch. 2002. The PROSITE database, its status in 2002. Nucleic Acids Research. 30:235-238. Fischer, H.-M. 1994. Genetic regulation of nitrogen fixation in rhizobia. Microbiol Rev. 58:352-386. Forsberg, L.S., and B.L. Reuhs. 1997. Structural characterization of the K antigens from Rhizobium fredii USDA257: evidence for a common srtuctural motif, with strainspecific variation, in the capsular polysaccharides of Rhizobium spp. J. Bacteriol. 179:5366-5371. Fraysse, N., F. Couderc, and V. Poinsot. 2003. Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis. Eur. J. Biochem. 270:1365-1380. Gage, D.J., and W. Margolin. 2000. Hanging by thread: invasion of legume plants by rhizobia. Current Opinion Microbio. 3:613-617. Gasteiger, E., A. Gattiker, C. Hoogland, I. Ivanyi, R.D. Appel, and A. Bairoch. 2003. ExPASy: the proteomics server for indepht protein knowledge and analysis. Nucleic Acid Research. 31:3784-3788. Geurts, R., and T. Bisseling. 2002. Rhizobium Nod factor perception and signalling. Plant Cell:s239-s249. Gonzáles, J.E., C.E. Semino, L.X. Wang, L.E. Castellano-Torres, and G.C. Walker. 1998. Biosynthetic control of molecular weigth in the polymerization of the octasaccharide subunits of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci USA. 95:13377-13482. Haapa, S., S. Suomalainen, S. Eerikäinen, M. Airaksinen, L. Paulin, and H. Savilahti. 1999. An efficient DNA sequencing strategy based on the bacteriophage Mu in vitro DNA transposition reaction. Genome Res. 9:308-315. Hentschel, U., M. Steinert, and J. Hacker. 2000. Common molecular mechanism of symbiosis and pathogenesis. Trends Microbiol. 8:226-231. Hirsch, A.M. 1992. Developmental biology of legume nodulation. New Phytol. 122:211-237. Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96:23-28. Ish-Horovicz, D., and J.F. Burke. 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9:2989-2998. Kannenberg, E.L., and N.J. Brewin. 1994. Host-plant invasion by Rhizobium : the role of cellsurface components. Trends Microbiol. 2:277-283. PA_DIP04.doc

42 Kereszt, A., E. Kiss, B. Reuhs, R.W. Carlson, A. Kondorosi, and P. Putnoky. 1998. Novel rkp gene clusters of Sinorhizobium meliloti involved in capsular polysaccharide production and the invasion of the symbiotic nodule: rkpK gene encodes for a UDP-glucose dehydrogenase. J. Bacteriol. 180:5426-5431. Kiss, E., A. Kereszt, F. Barta, S. Stephens, B. Reuhs, L., A. Kondorosi, and P. Putnoky. 2001. The rkp-3 gene region of Sinorhizobium meliloti Rm41 contains strain-specific genes that determine K antigen structure. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14:13951403. Kiss, E., and A. Kondorosi. 1997. Complete sequence of a Rhizobium plasmid carrying genes necessary for symbiotic association with the plant host. BioEssays. 19:843-846. Kiss, G.B., E. Vincze, Z. Kalman, T. Forrai, and A. Kondorosi. 1979. Genetic and biochemical analysis of mutants affected in nitrate reduction in Rhizobium meliloti. J. Gen. Microbiol. 113:105-118. Kovach, M.E., R.W. Phillips, P.H. Elzer, R.M. Roop, and K.M. Peterson. 1994. pBBR1MCS: A broad-host-range cloning vector. BioTechniques. 16:800-802. Lacalle, R.A., J.A. Tercero, and A. Jiménez. 1992. Cloning of the complete biosynthetic gene cluster for an aminonucleoside antibiotic, puromycin, and its regulated expression in heterologous hosts. EMBO J. 11:785-792. Lagares, A., G. Caetano-Anolles, K. Niehaus, J. Lorenzen, H.D. Ljunggren, A. Puhler, and G. Favelukes. 1992. A Rhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in competitiveness for nodulation in alfalfa. J Bacteriol. 174:5941-5952. Leigh, J.A., E.R. Signer, and G.C. Walker. 1985. Exopolysaccharide deficient mutants of Rhizobium meliloti that form inefficient nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:62316235. Leigh, J.A., and G.C. Walker. 1994. Exopolysaccharides of Rhizobium: Synthesis, regulation and symbiotic function. Trends Genet. 10:63-67. Luyten, E., and J. Vanderleyden. 2000. Survey of identified in Shinorhizobium meliloti spp., necessary for the development of an efficient symbiosis. Eur. J Soil Biol. 36:1-26. Marchler-Bauer, A., J.B. Anderson, C. DeWeese-Scott, N.D. Federova, L.Y. Geer, S. He, D.I. Hurwitz, J.D. Jackson, A.R. Jacobs, C.H. Lanczycki, C.A. Leibert, C. Liu, T. Madej, G.H. Marchler, R. Mazumder, A.N. Nikolskaya, A.R. Panchenko, B.S. Rao, B.A. Shoemaker, V. Simonyan, J.S. Song, P.A. Thiessen, S. Vasudevan, Y. Wang, R.A. Yamashita, J.J. Yin, and S.H. Bryant. 2003. CDD: a curated Entrez database of conserved domain alignments. Nucleic Acids Research. 31:383-387. Meade, H.M., S.K. Long, G.B. Ruvkun, S.E. Brown, and F.M. Ausubel. 1982 Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis. J. Bacteriol. 149:114-122 Mellor, R., and D. Werner. 1987 Peribacteroid membrane biogenesis in mature legume root nodules. Symbiosis. 3:75-100 Mergaert, P., M. Van Montagu, and M. Holsters. 1997. Molecular mechanism of Nod factor diversity. Mol Microbiol. 25:811-817. Mills, K.K., and W.D. Bauer. 1985. Rhizobium attachment to clover roots. J Cell Sci Suppl. 2:333-345. Murphy, P.J., S.P. Trenz, W. Grzemski, F.J. De Bruijn, and J. Schell. 1993. The Rhizobium meliloti Rhizopine mos Locus Is a Mosaic Structure Facilitating Its Symbiotic Regulation. J Bacteriol. 175:5193-5204. Müller, P., M. Hynes, D. Kapp, K. Niehaus, and A. Puhler. 1988. Two classes of Rhizobium meliloti inf ection mutants differ in exopolysaccharide production and in coinoculation properties with nodulation mutants. Mol. Gen. Genet. 211:17-26.

PA_DIP04.doc

43 Newcomb, W. 1981 Nodule morphogenesis and differentiation. In Biology of the Rhizobiaceae. Vol. 13. K.L. Giles and A.G. Atherly, editors. Academic Press, New York. 247-298. Orosz, L., and T. Sik. 1970. Genetic mapping of rhizobiophage 16-3. Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 17:185-194. Orosz, L., Z. Svab, A. Kondorosi, and T. Sik. 1973. Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3. Genes and functions on the chromosome. Mol. Gen. Genet. 125:341- 350. Pascarella, S., and F. Bossa. 1994. Similarity between pyridoxal/pyridoxamine phosphatedependent enzymes involved in dideoxy and deoxyaminosugar biosynthesis ang other pyridoxal enzymes. Prot Science. 3:701-705. Petrovics, G., P. Putnoky, B. Reuhs, J. Kim, T.A. Thorp, K.D. Noel, R.W. Carlson, and A. Kondorosi. 1993. The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development. Mol. Microbiol. 8:1083-1094. Postgate, J.R. 1972. The Chemistry and Biochemistry of Nitrogen Fixation. Plenum Press, London. Preisig, O., D. Anthamatten, and H. Hennecke. 1993. Genes for a microaerobically induced oxidase complex in Bradyrhizobium japonicum are essential for a nitrogen-fixing endosymbiosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:3309-3313. Putnoky, P., E. Grosskopf, D.T.C. Ha, G.B. Kiss, and A. Kondorosi. 1988. Rhizobium fix genes mediate at least two communication steps in symbiotic nodule development. J. Cell Biol. 106:597-607. Putnoky, P., G. Petrovics, A. Kereszt, E. Grosskopf, D.T.C. Ha, Z. Banfalvi, and A. Kondorosi. 1990. Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction. J. Bacteriol. 172:5450-5458. Raymond, C.K., E.H. Sims, A. Kas, D.H. Spencer, T.V. Kutyavin, R.G. Ivey, Y. Zhou, R. Kaul, J.B. Clendenning, and M.V. Olson. 2002. Genetic variation at the O-antigen biosynthetic locus in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184:3614-3622. Redmond, J.W., M. Batley, M.A. Djordjevic, R.W. Innes, P.L. Kuempell, and B.G. Rolfe. 1986. Flavons induce expression of nodulation genes in Rhizobium. Nature. 323:632635. Reuber, T.L., and G.C. Walker. 1993. The acetyl substituent of succinoglycan is not necessary for alfalfa nodule invasion by Rhizobium meliloti Rm1021. J. Bacteriol. 175:36533655. Reuhs, B.L. 1997. Acidic capsular polysaccharides (K antigens) of Rhizobium. In Biology of Plant-Microbe Interactions. G. Stacey, B. Mullin, and P.M. Gresshoff, editors. International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions, St. Paul. 331-336. Reuhs, B.L., R.W. Carlson, and J.S. Kim. 1993. Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigens (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175:3570-3580. Reuhs, B.L., D.P. Geller, J.S. Kim, J.E. Fox, and S.G. Pueppke. 1998. Sinorhizobium fredii, and Sinorhizobium meliloti produce structurally conserved lipopolysaccharides and strain-specific K antigens. Appl. Environ. Microbiol. 64:4930-4938. Reuhs, B.L., M.N. Williams, J.S. Kim, R.W. Carlson, and F. Cote. 1995. Suppression of the Fix- phenotype of Rhizobium meliloti exoB mutants by lpsZ is correlated to a modified expression of the K polysaccharide. J. Bacteriol. 177:4289-4296. Rippka, R., J. Deruelles, J.B. Watersbury, M. Herdman, and R.Y. Starnier. 1979. Generic assingments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111:1-61.

PA_DIP04.doc

44 Robertson, J.G., and P. Lyttleton. 1982. Coated and smooth vesicles in the biogenesis of cell walls, plasma membranes, infection threads and peribacteroid membrane in root hairs and nodules of white clover. J Cell Sci. 58:63-78. Rosenow, C., F. Esumch, I.S. Roberts, and K. Jann. 1995. Characterization and Localization of the KpsE Protein of Escherichia coli K5, Which Is Involved in Polysaccharide Export. J Bacteriol. 177:1137-1143. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Schenk, H.E.A. 1992. Cyanobacterial symbioses. Springer-Verlog, New York. Schultze, M., E. Kondorosi, P. Ratet, M. Buire, and A. Kondorosi. 1994. Cell and molecular biology of Rhizobium-plant interactions. Int. Rev. of Cytol. 156:1-75. Semsey, S., I. Papp, Z. Buzas, A. Patthy, L. Orosz, and P. Papp. 1999. Identification of sitespecific recombination genes int and xis of the Rhizobium temperate phage 16-3. J Bacteriol. 181:4185-4192. Stutzman-Engwall, K.J., S.L. Otten, and C.R. Hutchinson. 1992. Regulation of secondary metabolism in Streptomyces spp. and overproduction of daunorubicin in Streptomyces peucetius. J.Bacteriol. 174:144-154. Takagi, M., H. Takada, and T. Imanaka. 1990. Nucleotide sequence and cloning in Bacillus subtilis of the Bacillus stearothermophilus pleiotropic regulatory gene degT. J Bacteriol. 172:411-418. Vorhölter, F.-J., K. Niehaus, and A. Pühler. 2001. Lipopolisaccharide biosynthesis in Xanthomonas campestris pv. campestris: a cluster of 15 genes is involved in the biosynthesis of the LPS O-antogene and the LPS core. Mol Genet Genomics. 266:7995. Walker, G.C. 1992. Role of exopolysaccharides in nodulation. In Nodulation and Nitrogen Fixation in Rice. G.S. Khush and J. E-Bennett, editors. Int Rice Research Inst, Manila. 55-60. Wang, J., V. Michel, M. Hofnung, and A. Charbit. 1998. Cloning of the J gene of bacteriophage lambda, expression and solubilization of the J protein: first in vitro studies on the interactions between J and LamB, its cell surface receptor. Res Microbiol. 149:611-624. Werts, C., V. Michel, M. Hofnung, and A. Charbit. 1994. Adsorption of bacteriophage lambda on the LamB protein of Escherichia coli K-12: point mutations in gene J of lambda responsible for extended host range. J. Bacteriol. 176:941-947. West, N.J., and D.G. Adams. 1997. Phenotypic and Genotypic Comparison of Symbiotic and Free-Living Cyanobacteria from a Single Field Site. Applied Environ Microbiol. 63:4479-4484. Wolk, C.P., A. Erust, and J. Elhai. 1994. Heterocyst and metabolism and development. Kluwer Academic Publisher, Boston. Yanisch-Perron, C., J. Viera, and J. Messing. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains : nucleotid sequence of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene. 33:103119.

PA_DIP04.doc

45

8. RÖVIDÍTÉSEK KPS EPS LPS Amp Tc Km Cam EDTA SDS Tris DTT DNS PCR kb PLP HTH

PA_DIP04.doc

kapszuláris poliszacharid exopoliszacharid lipopoliszacharid ampicillin tetraciklin kanamicin kloramfenikol etilén-diamino-tetra-acetát nátrium-lauril-szulfát tris-(hidroxi-metil)-amino-metán dithiotreitol dezoxi-ribonukleinsav polimeráz láncreakció kilobázis piridoxál-foszfát hélix-turn-hélix

46

KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Munkámat a PTE Természettudományi Kar, Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem. Hálás vagyok a tanszék összes dolgozójának, hogy megfelelő hátteret biztosítottak terveim megvalósításához. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek munkám irányításáért önzetlen segítségéért, tanácsaiért. Köszönöm Deák Veronikának, − akivel a közös témánk kísérleteit együtt végeztem − kitartását és ötleteit, Hoffman Gyulának, hogy rendelkezésünkre bocsájtotta az izolált baktérium mutánsokat, valamint Nagy Tibornak a bioinformatikai elemzésekben adott hasznos segítségét.

PA_DIP04.doc