2008/2.
Acta Pharmaceutica Hungarica
3
Acta Pharmaceutica Hungarica 78. 3-10. 2008.
A bezárási hatásfok növelésének lehetőségei liposzómába zárt lomefloxacinnál KASZÁS NÓRA1, BUDAI MARIANNA1,*, BUDAI LÍVIA2, GRÓF PÁL3, ANDREAS ZIMMER4, KLEBOVICH IMRE1 1
Semmelweis Egyetem, Gyógyszerészeti Intézet, Budapest, Hôgyes Endre utca 7. H-1092 MTA Kémiai Kutatóközpont, Tömegspektrometriai Osztály, Budapest, Pusztaszeri út 59-67. H-1025 3 Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet, Budapest, Puskin utca 9., H-1088 4 Karl-Franzens Universität, Institut für Pharmazeutische Technologie, Graz, Schubert Str. 6. A-8010 (*Budai Marianna: Semmelweis Egyetem, Gyógyszerészeti Intézet Budapest Hôgyes Endre u. 7. H-1092; Tel.: 06-1-266-2755/ 3056; Fax: 06-1-217-0914; E-mail:
[email protected]) 2
Summary
Összefoglalás
K a s z á s, N., B u d a i, M., B u d a i, L., G r ó f, P., Z i m m e r, A. a n d K l e b o v i c h , I.: Methods to increase the encapsulation efficiency for liposomal drugs
A liposzómák, mint gyógyszerszállító rendszerek a hagyományos gyógyszerformákkal összehasonlítva a bezárt hatóanyag irányított célba juttatását, a mellékhatások csökkenését, a terápiás index emelésének lehetôségét kínálják. A fluorokinolon típusú kemoterápiás szerek csoportjába tartozó lomefloxacin esetén a liposzómába zárás a hatóanyagnak az intracelluláris kórokozók elleni, antibakteriális hatékonyságában kulcsszerepet játszik. A liposzomális gyógyszerformák egyik legfontosabb paramétere a bezárási hatásfok, ami megadja, hogy a hatóanyag mekkora hányada zárható liposzómákba; ezért a bezárási hatásfok emelésére irányuló törekvések a gyógyszertechnológia fô célkitûzései közé tartoznak. Munkánk során vékonyréteg-hidratációs technikával lomefloxacint tartalmazó, különbözô lipidösszetételû, és ennek eredményeként különbözô fluiditású és felületi töltésû multilamelláris liposzómákat állítottunk elô. Vizsgáltuk, hogy milyen hatással van a hatóanyag bezárási hatásfokára a koleszterin, a többkomponensû, természetes eredetû, valamint egykomponensû, szintetikus lipidek alkalmazása, továbbá a pozitív, illetve negatív fejcsoportú lipidek jelenléte. A liposzómák készítéséhez ammónium-acetát, valamint glükóz oldatokat használtunk, és tanulmányoztuk az öszszefüggést az alkalmazott hidráló oldatok típusa és a képzôdött vezikulák felületi töltése között. A liposzómák zéta-potenciálja és a bezárási hatásfok között a lomefloxacin liposzómába zárása szempontjából fontos összefüggést találtunk.
Liposomes as drug delivery systems – in comparison to the traditional dosage forms – offer the advantage of the targeted drug delivery and as a consequence, reduction of the side effects. In case of fluoroquinolone antibiotics, such as lomefloxacin, the liposomal encapsulation of the active ingredient can result in an enhancement of its therapeutic efficacy against intracellular bacteria. The aim to improve the liposomal encapsulation efficiency of drugs – which is one of the main factors influencing the therapeutic effect of vesicular dosage forms – is one of the important challenges in the field of pharmaceutical technology. In our experiments we prepared lomefloxacin containing multilamellar vesicles from various lipids using different hydrating solutions. We intended to study the effect of lipid composition, cholesterol content and surface charge of liposomes on the encapsulation efficiency of lomefloxacin. Our results can contribute to the rational design of fluoroquinolone containing liposomal drugs.
Bevezetés A liposzómákat a ’60-as évektôl a biológiai membránok modelljeként alkalmazták, majd a ’70-es években, mint lehetséges gyógyszerszállító rendszereket írták le a lipidvezikulákat [1, 2]. Ma a legkorszerûbb gyógyszerformák közé sorolják az egy vagy több lipid kettôsréteggel határolt vezikulákat, és a beléjük zárt legkülönfélébb hatóanyagokkal (daganatellenes szerek, antibiotikumok stb.) egyre több területen nyernek felhasználást, ami a liposzómák szerkezeti és összetételbeli sokféleségének, és az ebbôl eredô elônyös tulajdonságaiknak kö-
szönhetô. A liposzómák felületének alkalmas módosításával, a liposzómába zárt hatóanyag esetén irányítható a célba jutás, és a hatóanyag a célszövetben halmozódik fel. A lomefloxacin (LMFX) egy széles spektrumú, fluorokinolon típusú kemoterápiás szer (1. ábra). Számos országban használják, fôleg Gram-negatív baktériumok által okozott fertôzések kezelésében. Magyarországon a közelmúltban került törzskönyvezésre lomefloxacin tartalmú gyógyszerkészítmény. Klinikai vizsgálatok bizonyították, hogy a krónikus bakteriális prostatitis terápiájában hatása ösz-
4
Acta Pharmaceutica Hungarica
1. ábra: A lomefloxacin konstitúciós képlete
szemérhetô a ciprofloxacinéval (CPFX), azonban annál kedvezôbb farmakokinetikai tulajdonságokkal rendelkezik (az LMFX napi egyszeri 400 mg-os dózisa a CPFX napi kétszeri 500 mg-os dózisával összemérhetô hatású) [3]. Az LMFX a CPFX alternatívájaként szerepelhet más bakteriális kórképek terápiájában is. A fluorokinolonok fototoxicitása, azaz UV sugárzás hatására a jelenlétükben végbemenô toxikus és karcinogén reaktív gyökök képzôdése [4, 5], LMFX szedésekor a hatóanyagcsoport más tagjaihoz képest nagyobb gyakorisággal jelentkezik [3]. Az említett mellékhatás kiküszöbölésére is megoldást nyújthat az LMFX liposzómába zárása. Emellett a liposzómába zárt fluorokinolonok antimikróbás aktivitásának in vitro vizsgálata során kiderült, hogy a hatóanyag minimális gátló koncentrációja (MIC érték) legalább 50%-kal csökken a szabad formában alkalmazott fluorokinolonhoz képest [6, 7], ami a szükséges dózis és a toxicitás csökkenéséhez vezethet. A liposzómák által szállított hatóanyag molekulái elhelyezkedhetnek a membrán(ok) által közrezárt vizes térben, beékelôdhetnek a bilayer szerkezetébe, illetve másodlagos kötôerôk révén a membrán felszínéhez kötôdhetnek. Az, hogy az elôbbi, a lipid—hatóanyag közötti molekuláris kölcsönhatások közül melyik és milyen mértékben valósul meg, jelentôsen függ a hatóanyag lipofilitásától és a membránalkotóktól: azaz a foszfolipid fejcsoportok esetleges töltésétôl, az észteresítô zsírsavláncok lánchosszától, valamint az abban jelenlévô kettôs kötések számától. A koleszterin jelenléte is hatással lehet a hatóanyag és a szállító rendszer közötti kölcsönhatásra, mivel az a liposzómák fázisátalakulási hômérséklete fölötti hômérsékleteken a fluid membránokat rigidebbé, míg a fázisátalakulási hômérsékletnél alacsonyabb hômérsékleteken a liposzómákat „folyékonyabbá” (fluidabbá) teszi. A hatóanyag liposzómába való bezárásának hatásfokát, mint a liposzomális gyógyszerformák egyik fontos paraméterét, jelentôsen befolyásolják a hatóanyag
2008/2.
és a liposzóma-membrán közötti kölcsönhatások [8]. Munkánk során vékonyréteg-hidratációs technikával LMFX-et tartalmazó, különbözô lipidösszetételû, és ennek eredményeként különbözô fluiditású és felületi töltésû multilamelláris liposzómákat állítottunk elô. Vizsgáltuk, hogy milyen hatással van az LMFX bezárási hatásfokára a koleszterin; a telített, valamint telítetlen zsírsavláncú lipidek alkalmazása és a pozitív, illetve negatív fejcsoportú lipidek jelenléte. Összefüggést kerestünk az alkalmazott hidráló oldatok (ammónium-acetát ill. glükóz oldat) és a vezikulák felületi töltése között, továbbá vizsgáltuk a liposzómák töltése és a bezárási hatásfok közötti kapcsolatot. Anyagok, módszerek Liposzómák elôállítása Az LMFX (Sigma Chem. Co.) bezárására vékonyréteg-hidratációs technikával elôállított multilamelláris liposzómákat (MLV) alkalmaztunk. A liposzómák készítéséhez lecitint (LEC) (Sigma Chem. Co.), α-L-dipalmitoil-foszfatidilkolint (DPPC) (Sigma Chem. Co.), koleszterint (CHOL) (Sigma Chem. Co.), pozitív töltésû szintetikus lipidet, 1,2-dioleoyl3-trimetil-ammónium-propán kloridot (DOTAP) (Sigma Chem. Co.) és negatív töltéssel rendelkezô foszfatidsavat (PA) (Sigma Chem. Co.) használtunk az 1. táblázatban megadott mólarányokban. Minden esetben 10,0 mg lipidet, illetve liposzóma-alkotó komponenst 300 µl abszolút alkoholban oldottunk fel. A szerves oldószert nitrogénárammal távolítottuk el, a keletkezett lipidfilmeket egy éjszakán át exszikkátorban szárítottuk. A minták hidrálása a lipidek fázisátalakulási hômérséklete fölötti hômérsékleten, 50 °C-os vízfürdôben történt. A hidráló oldat 1,0 ml 0,1 M-os ammónium-acetát oldat (AmmAc) (pH = 6,8) vagy 5 m/m%-os glükóz oldat (Glu) (pH=5,5) volt, amihez 0,5 mg/ml koncentrációban lomefloxacint (LMFX) (Sigma Chem. Co.) adtunk. A kontroll liposzómáknál a hidráló oldat nem tartalmazott LMFX-et. A hidráló oldatok HPLC-tisztaságú vízbôl készültek, azokat 0,22 µm pórusátmérôjû filteren (Osmonics Filter, Herba Chemosan) használat elôtt szûrtük. Az elkészült liposzóma-emulziókban a lipid:LMFX-mólarány ~ 10:1-hez volt. Bezárási hatásfok meghatározása Az LMFX-re vonatkozó bezárási hatásfokot, vagyis azt, hogy a hozzáadott LMFX hány százaléka záródik be a liposzóma belsô vizes üregébe vagy a kettôs li-
2008/2.
Acta Pharmaceutica Hungarica
5 1. táblázat
A vizsgált liposzómák lipidösszetétele, az alkalmazott hidráló oldatok típusa, a kontroll preparátumok felületi potenciáljai és az LMFX-re vonatkozó bezárási hatásfok értékek. Az adatok három párhuzamos mérés eredményei Liposzóma típusa LipidHidráló Felületi Bezárási hatásfok összetétel (mol %) oldat potenciál (mV) (%) (átlag ± S. D.) 100 Glu -39,52 44,8 ± 5,7 LEC 100 AmmAc -15,82 20,7 ± 0,2 100 Glu 1,75 19,9 ± 2,3 DPPC 100 AmmAc 14,60 15,2 ± 3,4 50 : 50 Glu -33,15 32,8 ± 0,2 LEC:DPPC AmmAc -5,85 29,3 ± 3,1 50 : 50 Glu -33,7 39,2 ± 1,5 70 : 30 LEC:CHOL AmmAc -14,9 27,5 ± 6,2 70 : 30 Koleszterines Glu -1,83 15,7 ± 1,5 70 : 30 DPPC:CHOL 70 : 30 AmmAc 14,2 9,7 ± 1,5 99 : 1 Glu 38,85 26,3 ± 3,8 99 : 1 AmmAc 16,65 15,2 ± 3,4 „Kationos” DPPC:DOTAP 96 : 4 Glu 65,7 22,9 ± 5,8 96 : 4 AmmAc 24,95 15,8 ± 2,3 99 : 1 Glu 14,2 5,6 ± 3,3 „Anionos” DPPC:PA 96 : 4 Glu -7,58 14,7 ± 4,2
pidmembránjába, 10000 Da molekulatömegnél elválasztó filteren (Microcon Amicon Filter, Millipore Inc.) történô centrifugálást (HERMLE Z 300K univerzális centrifuga) követô spektrofotometriás méréssel (U2001, Hitachi) határoztuk meg. 250 µl liposzóma-mintát 13000 1/perc fordulatszámon 2x10 percig centrifugáltunk. A szûrlet – azaz a liposzómába be nem zárt LMFX oldat – abszorbanciáját az LMFX abszorpciós maximumához tartozó hullámhosszon mértük (λ = 281 nm). Az LMFX-et tartalmazó hidráló oldat koncentrációját 100%-nak tekintve, abból a szûrlet %-ban kifejezett LMFX-koncentrációját levonva a bezárási hatásfok %-os értéke meghatározható. A megadott bezárási hatásfok értékek minden esetben legalább három párhuzamos mérés eredményei. Felületi töltés mérése Az elôállított LMFX-et tartalmazó és kontroll multilamelláris vezikulák felületi potenciálját Zetasizer 3000 HSA, Malvern Instruments, segítségével határoztuk meg. A mérésekhez 0,05 mg/ml-es lipidkoncentrációjú mintákat használtunk, a liposzóma szuszpenziókat a megfelelô, szûrt hidráló oldattal hígítottuk. Eredmények A hatóanyagok liposzómába zárása minden esetben a hatóanyag molekula és a membránalkotó lipidek közötti kölcsönhatásoktól függ. A liposzómába bezárni kívánt LMFX pH-tól függô protonálódásának az ismerete, tehát a molekulának az alkalmazott hidráló oldatok pH-ján jelenlévô pozitív, negatív, ikerionos és semleges formáinak az aránya,
elengedhetetlen a bezárási folyamat molekuláris mechanizmusának a megértéséhez. Az LMFX két protonálódásra, illetve deprotonálódásra képes csoporttal rendelkezik, amelyek pKa értéke 5,49 és 8,78 [9] (1. ábra). Az általunk alkalmazott 6,8 pH-jú AmmAc és 5,5-ös pH-jú Glu oldatok pH-ját a 0,5 mg/ml koncentrációban jelenlévô LMFX 6,5-re, illetve 4,9-re csökkentette. A lipidek és a koleszterin jelenléte egyetlen esetben sem változtatta meg a hidráló oldatok pH-értékét szignifikánsan. A lomefloxacin mikrospeciációs formáinak százalékos arányát a liposzomális preparátumok 6,5 és 4,9 pHértékein kell meghatároznunk. 6,5-ös pH értéken az LMFX több mint 90%-a semleges vagy ikerionos formában van jelen, szemben a 4,9-es pH-jú oldattal, ahol a semleges, illetve ikerionos formák összesen alig 30%-ot tesznek ki, és 70%-os részarányban a pozitív töltésû forma a domináns. A töltésviszonyok ismerete elôrevetíti annak a lehetôségét, hogy az elektrosztatikus kölcsönhatások eredményeként az LMFX negatív felületi töltéssel rendelkezô liposzómákba zárható be magas hatásfokkal. Ez egybeesik a Sortino és mtsai [4] által közölt eredménnyel, miszerint az LMFX negatív töltésû micellákba jobb eredménnyel bezárható, mint pozitívakba. A bezárási hatásfok szempontjából vizsgáltuk a kettôs kötéseket tartalmazó lipidek szerepét; a vegyes zsírsavláncú lecitinbôl felépülô liposzómák bezárási hatásfokát hasonlítottuk a 100%-ban DPPC-t tartalmazókéhoz (1. táblázat). A természetes eredetû, az egy vagy több kettôs kötést a zsírsavláncok különbözô helyein tartalmazó, ezáltal fluid membránszerkezetet kialakító lecitinnel szem-
6
Acta Pharmaceutica Hungarica
Glu
Glu
Ac-
Glu
Glu
Ac-
Ac-
Glu Glu
2008/2.
Glu Glu
Amm+ Amm+
Amm+
Amm+ Ac-
Ac-
Amm+
Amm+
Amm+
Ac-
Amm+ Ac-
Ac-
2. ábra: A negatív töltésû liposzómák felületi töltésviszonyai 5 m/m%-os glükóz oldatban (Glu) és 0,1 M-os ammónium-acetát oldatban (AmmAc). Amm+ és Ac- jelöli az ammónium- és acetát ionokat
ben a telített zsírsavláncú DPPC rigid struktúrát biztosít. A fluid membrán elôsegítheti az LMFX lipid fejcsoportok közé történô beékelôdését, és ezt eredményeink is alátámasztották: LEC-minták esetén a bezárási hatásfok Glu oldatban 44,8 ± 5,7 %, AmmAc oldatban 20,7 ± 0,2 % volt, míg DPPC esetén Glu-ban 19,9 ± 2,3 %-ot, AmmAc-ban 15,2 ± 3,4 %-ot mértünk. A DPPC-t és lecitint 1:1 mólarányban tartalmazó liposzómák bezárási hatásfokaként az egykomponensû liposzómák bezárási hatásfokainak köztes értékeit kaptuk: Glu-ban 32,8 ± 0,2 %, AmmAc-ban 29,3 ± 3,1 %. Az elôbb vizsgált liposzómák zéta-potenciálját megmérve azt tapasztaltuk, hogy a lecitin-vezikulák negatív, míg a DPPC-liposzómák pozitív felületi töltéssel rendelkeznek (1. táblázat). A pozitív LMFX molekulák és a negatív töltésû lecitin-membrán között fellépô elektrosztatikus kölcsönhatás lehetôvé teszi, hogy a hatóanyag nagyobb bezárási hatásfokot eredményezve kötôdjön meg a membránfelszínen. Az eredmények értékelésénél tekintettel kell lenni arra, hogy a lecitin-liposzómák alkalmazása esetén tapasztalt magas LMFX-bezárási hatásfok nem kizárólag a kettôs kötések jelenlétének tulajdonítható, hanem abban a felületi töltésviszonyok is szerepet játszanak. Felmerülhet a kérdés, hogy mi okozhatja a zéta-potenciál különbségeket az azonos fejcsoporttal (foszfatidilkolin) rendelkezô LEC és DPPC liposzómák esetén. A mérési eredmények magyarázatául szolgálhat, hogy adott pH-n a lazított membránszerkezetû LEC-minták esetén az ikerionos fejcsoportok rendezetlen elhelyezkedése azok negatív töltésû részének felszíni felhalmozódásához vezethet; míg a DPPC-nél kismértékû pozitív töltés-túlsúly alakulhat ki a kifelé „mutató” töltések tekintetében. A két alkalmazott hidráló oldat esetén, azonos lipidösszetételeknél megfigyelhetô, hogy a Glu ma-
gasabb bezárási hatásfokhoz vezet, mint az AmmAc (1. táblázat). A tapasztalt különbség annak tulajdonítható, hogy Glu oldatban a vezikulák felületi töltése mindig negatívabb, vagy kevésbé pozitív, mint az AmmAc oldatban mért értékek. A negatív felületi potenciálú liposzómák Glu oldatban képesek megtartani eredeti töltésüket, ezáltal létrejöhet a pozitív töltésû LMFX membránhoz kötôdése (2. ábra). Ugyanezen liposzómákat AmmAc oldatban vizsgálva a pozitív töltésû ammónium-ionok réteget képeznek a negatív membrán körül, elfedve ezzel annak eredeti töltését. A koleszterin bezárási hatásfokra kifejtett hatását koleszterint 30 mol%-ban tartalmazó LEC-, illetve DPPC-liposzómák esetén vizsgáltuk. A LEC/ CHOL rendszerben Glu-ban a hozzáadott LMFX 39,2 ± 1,5%-a, AmmAc-ban 27,5 ± 6,2%-a záródott be. Az eredményeket a koleszterinmentes LEC-liposzómák bezárási hatásfokával összevetve a koleszterin jelenléte nem vezet azok szignifikáns változásához. A DPPC/CHOL-rendszerben a 100%-os DPPC-hez képest kevesebb LMFX záródott be a liposzómákba: Glu-ban 15,7 ± 1,5 %, AmmAc-ban 9,7 ± 1,5%. Az eredmények alapján a koleszterin nem segíti az LMFX LEC-, illetve DPPC-membránba történô beépülését, ugyanakkor a hidráló oldatok közül a Glu egyértelmûen magasabb LMFX-bezáráshoz vezet, mint az AmmAc, ami a töltésviszonyokkal magyarázható. Az LMFX pozitívan töltött fejcsoportú lipideket (DOTAP) is tartalmazó liposzómákba történô bezárása nem vezetett a bezárási hatásfokok szignifikáns változásához a kontroll, DPPC-liposzómákhoz viszonyítva. Fontos kiemelni, hogy a DOTAP 1 illetve 4 mol%-os jelenléte nem csökkentette a bezárás hatásfokát – egy esetleges pozitív fejcsoportpozitív LMFX közötti taszítás révén (1. táblázat). A 3. ábra alapján nyilvánvaló, hogy a nagyobb
2008/2.
Acta Pharmaceutica Hungarica
3. ábra: A 0; 1 és 4 mol %-ban DOTAP-ot tartalmazó DPPC liposzómák felületi potenciáljai 0,1 M-os ammónium-acetát oldatban (AmmAc), illetve 5 m/m %-os glükóz oldatban (Glu). A „Kontroll” minták LMFX-mentes liposzómákra vonatkoznak, az „LMFX” jelölés hatóanyagot tartalmazó liposzómát jelent
4. ábra: A lomefloxacinra vonatkozó bezárási hatásfokok a kontroll liposzómák felületi potenciálja függvényében. Az ábrán valamennyi – általunk vizsgált – lomefloxacint tartalmazó liposzomális preparátummal kapott eredmény látható
7
8
Acta Pharmaceutica Hungarica
mennyiségû DOTAP pozitívabb membránfelület kialakulásához vezet, és a DOTAP pozitív töltése Glu hidráló oldatban kifejezettebb, mint AmmAcban. Az LMFX jelenléte egyes esetekben nem szignikáns, más esetekben minimális hatással van a liposzómák felületi töltésére. A csekély felületi töltésbeli változás magyarázható az alkalmazott ~10:1 lipid:LMFX mólaránnyal, valamint azzal, hogy a hatóanyag liposzómákban való feldúsulása nem kizárólag felületi felhalmozódás révén valósul meg, hanem abban kiemelkedô szerepe lehet a membránba való besüllyedésnek és a belsô vagy lamellák közötti vizes rétegekbe történô bezárásnak is. A negatív fejcsoportú lipidek alkalmazása nehezen megoldható feladat, mivel a dipalmitoil-foszfatidsav (PA) az általunk vizsgált pH-értékeken szinte kizárólag semleges, protonált formában van jelen. Ezzel is magyarázhatók a bezárási hatásfokok tekintetében elért alacsony értékek 1 illetve 4 mol%ban PA-t tartalmazó DPPC liposzómák esetén (1. táblázat). Következtetések A hatóanyagok liposzomális formulálása során kiemelt jelentôsége van a hatóanyag és a lipidmembrán közötti molekuláris kölcsönhatások vizsgálatának. Egyes esetekben a hatóanyag és szállítórendszer közötti elektrosztatikus vonzás jelentôs növekedést idézhet elô a bezárási hatásfokban. A töltés-
2008/2.
viszonyok nyújtotta lehetôség optimális kihasználásához a bezárni kívánt molekula protonálódási/deprotonálódási sajátosságainak az ismerete szükséges, továbbá a szállítórendszer zéta-potenciálját befolyásoló faktorok vizsgálata. A lomefloxacin esetén, az általunk vizsgált pHértékeken, a negatív töltésû vezikulák vezetnek a bezárási hatásfok növekedéséhez, és járulnak hozzá egy várhatóan terápiásan hatékony nano-szállítórendszer kialakításához (4. ábra).
IRODALOM
1. Lasic, D. D., Martin, F.: Stealth® liposomes, Fate of liposomes in vivo and its controll: a historical perspective. CRC Press, London, 1995, 7-12 2. Scharma, A., Scharma, U. S.: Int. J. Pharm. 154, 123-140 (1997) 3. Naber, K. G. C.: Int. J. of Antimicrob. Agents 20, 18-27 (2002)
4. Sortino, S., De Guidi, G., Giuffrida, S.: New Journal of Chemistry 25, 197-199 (2001) 5. Ball, P., Mandell, L., Niki, Y., Tillotson, G.: Drug Saf. 21, 407421 (1999) 6. Puglisi, G., Fresta, M., Mazzone, G., Furneri, M. P., Tempera, G.: Int. J. Pharm. 118, 65-76 (1995) 7. Pinto-Alphandary, H., Andremont, A., Couvreur, P.: Int. J. Antimicrob. Agents 13, 155-168 (2000) 8. Budai, M.: Acta Pharm. Hung. 75, 205-212 (2005) 9. Takács-Novák, K., Noszál, B., Hermecz, I., Keresztúri, G., Podányi, B., Szász, Gy.: J. Pharm. Sci. 79, 1023-1028 (1990)
[Érkezett: 2007. december 17.]
