15
3 METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian dilaksanakan pada bulan November 2011 sampai Januari 2012 bertempat di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan (preparasi sampel dan analisis komposisi kimia) dan Laboratorium Preservasi dan Pengolahan Hasil Perairan (proses perlakuan pengolahan), Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Terpadu Fakultas Peternakan (analisis kolesterol), dan Laboratorium Terpadu Baranang Siang (analisis asam lemak).
3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi keong mas (Pomacea canaliculata), akuades, HCl, NaOH, katalis selenium, H2SO4, H3BO3, n-heksana, iso-oktan, larutan standar internal asam lemak dan kolesterol, larutan NaOH 0,5 N dalam metanol, larutan BF3 16%, larutan NaCl jenuh, isooktan, Na2SO4 anhidrat, etanol, petroleum eter, alkohol, asetat anhidrat, dan kloroform. Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain meja preparasi, pisau, timbangan analitik, cawan porselen, oven, desikator, tanur, tabung reaksi, erlenmeyer, tabung soxhlet, tabung Kjeldahl, destilator, buret, kromatografi gas SupelcoTM 37 Component FAME Mix, penangas, tabung bertutup teflon, pipet mikro, pipet tetes, bulb, spektrofotometer, sentrifuse, tabung sentrifuse, dan vorteks.
3.3 Tahap Penelitian Penelitian terdiri dari penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan terdiri dari pengukuran morfometrik dan rendemen keong mas, pengolahan, dan uji hedonik.
Penelitian utama terdiri dari pengujian
proksimat, asam lemak, dan kolesterol. Diagram alir penelitian disajikan pada Gambar 6.
16
Keong mas Identifikasi Pengukuran morfometrik Perhitungan rendemen
Daging keong mas segar
Perebusan dalam air garam 1 %; 1,5 %; 2 %; 2,5 %; dan 3 %, 35 menit
Perebusan, suhu 100 oC, 35 menit
Pengukusan, suhu 100 oC, 45 menit
Keong mas rebus
Keong mas kukus
Uji hedonik Perebusan 35 menit dan penambahan garam konsentrasi terpilih Keong mas rebus konsentrasi 2,5 %
• Uji proksimat • Uji asam lemak • Uji kolesterol Gambar 6 Diagram alir penelitian Proses pengolahan yang dilakukan meliputi perebusan, pengukusan, dan perebusan dalam air garam. Pengolahan dilakukan hingga daging keong mas matang.
Pengecekan dilakukan setiap 5 menit untuk mengetahui tingkat
kematangan daging keong mas. Daging keong mas dinyatakan matang apabila
17
sudah terasa empuk dan kenyal. Perebusan keong mas dilakukan selama 35 menit pada suhu 100 oC. Pengukusan dilakukan selama 45 menit pada suhu 100 oC. Perebusan dalam air garam dilakukan dengan penambahan konsentrasi garam terpilih selama 35 menit pada suhu 100 oC.
Daging keong mas yang telah
dimasak selanjutnya diangkat dan ditiriskan. Daging keong disimpan dalam botol kaca dan dilapisi alumunium foil untuk selanjutnya dilakukan pengujian komposisi kimia, asam lemak, dan kolesterol. Tahap ini juga bertujuan untuk menentukan konsentrasi garam terbaik yang akan digunakan dalam proses perebusan dalam air garam. Sampel yang diuji adalah daging keong mas yang telah direbus dalam air garam berkonsentrasi 1 %; 1,5 %; 2 %; 2,5 %; dan 3 %.
3.4 Pengukuran dan Analisis 3.4.1 Pengukuran morfometrik dan rendemen keong mas Keong mas (Pomacea canaliculata) diambil dari daerah persawahan Situ Gede, Bogor. Keong mas sebanyak 30 ekor diukur panjang, lebar, dan tingginya menggunakan penggaris.
Keong mas lalu dipisahkan cangkang, jeroan, dan
dagingnya kemudian dihitung rendemen masing-masing. Perhitungan rendemen daging keong mas adalah sebagai berikut: Rendemen daging %
Bobot daging gram Bobot total keong mas gram
100 %
3.4.2 Uji hedonik (SNI-01-234-2006) Uji hedonik dilakukan oleh 30 orang panelis semi terlatih menggunakan lembar penilaian uji hedonik berdasarkan SNI-01-234-2006. Panelis memberikan penilaian secara subjektif terhadap rasa keong mas yang telah direbus dengan konsentrasi garam berbeda-beda. Parameter yang dinilai memiliki rentang 1-9, dimana angka 1= amat sangat tidak suka, 2= sangat tidak suka, 3= tidak suka, 4= agak tidak suka, 5= netral, 6= agak suka, 7= suka, 8= sangat suka, dan 9= amat sangat suka.
18
3.4.3 Analisis kimia 1) Analisis kadar air (AOAC 2005) Cawan porselen dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam
desikator (kurang lebih 15 menit) dan
dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan. Sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 oC selama 5 jam, kemudian cawan dimasukkan ke dalam desikator sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali. Perhitungan kadar air: % kadar air
B B
C A
100 %
Keterangan: A = Berat cawan kosong (gram) B = Berat cawan dengan sampel (gram) C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram) 2) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu o
600 C, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC selama 1 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Perhitungan kadar abu: % kadar abu
C B
A A
100 %
Keterangan: A = Berat cawan abu porselen kosong (gram) B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram) C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan (gram)
19
3) Analisis kadar protein (AOAC 2005) Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan satu butir kjeltab dan 3 ml H2SO4 pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410 oC selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu Kjeldahl ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40 %, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H3BO3) 2 % dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut : %N
ml HCl
ml Blanko N HCl 14 mg sampel
% kadar protein
%N
fp
100 %
fk
Keterangan: fp = Faktor pengenceran = 10 fk = Faktor konversi = 6,25
4) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) Contoh seberat 5 gram dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya dan disambungkan dengan tabung Soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung Soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (n-heksana), kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan
20
sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan. Kadar lemak dihitung dengan rumus sebagai berikut : % Kadar lemak
W
W W
100%
Keterangan : W1 = Bobot sampel (gram) W2 = Bobot labu lemak kosong (gram) W3 = Bobot labu lemak dengan lemak (gram) 5) Analisis asam lemak (AOAC 2005) Metode analisis yang digunakan memiliki prinsip mengubah asam lemak menjadi turunannya, yaitu metil ester sehingga dapat terdeteksi oleh alat kromatografi.
Gas Chromatography (GC) memiliki prinsip kerja pemisahan
antara gas dan lapisan tipis cairan berdasarkan perbedaan jenis bahan (Fardiaz 1989). Jenis alat kromatografi yang digunakan dalam penelitian ini adalah SupelcoTM 37 Component FAME Mix. Hasil analisis akan terekam dalam suatu lembaran yang terhubung dengan rekorder dan ditunjukkan melalui beberapa puncak pada waktu retensi tertentu sesuai dengan karakter masingmasing asam lemak. Sebelum melakukan injeksi metil ester, terlebih dahulu lemak diekstraksi dari bahan lalu melakukan metilasi sehingga terbentuk metil ester dari masing-masing asam lemak yang didapat. a. Tahap ekstraksi Tahap pertama dilakukan ekstraksi soxhlet untuk memperoleh asam lemak, dan ditimbang sebanyak 20-30 mg lemak dalam bentuk minyak. b. Tahap metilasi Tahap metilasi dimaksudkan untuk membentuk senyawa turunan dari asam lemak menjadi metil esternya. Asam-asam lemak diubah menjadi ester-ester metil atau alkali yang lainnya sebelum disuntikkan ke dalam kromatografi gas (Fardiaz 1989). Tahap metilasi diawali dengan hidrolisis, yaitu dengan merefluks lemak di atas penangas air dengan menambahkan 1 ml NaOH 0,5 N dalam metanol dan
21
dipanaskan selama 20 menit. Tahap selanjutnya adalah proses metilasi dengan menambahkan 2 ml BF3 16 % dalam metanol kemudian dipanaskan kembali selama 20 menit dan didinginkan. Sampel yang telah didinginkan selanjutnya ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan 1 ml isooktan, kemudian dihomogenkan dan bagian atas lapisan isooktan dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,1 gram Na2SO4 anhidrat lalu dibiarkan 15 menit. Larutan disaring dengan mikrofilter untuk memisahkan fase cairnya sebelum diinjeksikan ke dalam kromatografi gas.
Sampel sebanyak 1 µl selanjutnya diinjeksikan ke dalam
kromatografi gas. Asam lemak yang ada dalam metil ester akan diidentifikasi oleh flame ionization detector (FID) atau detektor ionisasi nyala dan respon yang ada akan tercatat melalui kromatogram (peak). c. Identifikasi asam lemak Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester pada kromatografi gas SupelcoTM 37 Component Fame Mix dengan kondisi sebagai berikut: gas yang digunakan sebagai fase bergerak adalah gas nitrogen dengan aliran bertekanan 20 ml/menit, sebagai bahan pembakar adalah hidrogen dengan aliran bertekanan 30 ml/menit, dan oksigen dengan aliran 200-300 ml/menit, kolom yang digunakan adalah kolom kapiler (capillary column) dB-23 berisi cyanopropil methylsil sepanjang 60 m dengan diameter dalam 0,25 mm, dengan tebal lapisan film 0,25 µm. Temperatur terprogram sebesar 125 oC, kemudian suhu dinaikkan 5 oC per menit hingga suhu akhir 225 oC, suhu injektor 220 oC, dan suhu detektor 240 oC. Alat kromatografi gas yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Gambar 7. a
Gambar 7 (a) Kromatografi gas (b) Recorder
b
22
d. Perhitungan jumlah asam lemak Prinsip analisis komposisi asam lemak dengan kromatografi gas adalah dengan mengubah komponen asam lemak pada lemak/minyak menjadi senyawa volatil metil ester lemak yang akan dideteksi oleh detektor ionisasi nyala api dalam bentuk respon berupa peak kromatogram. Jenis dan jumlah asam lemak yang ada pada contoh dapat diidentifikasi dengan membandingkan peak kromatogram contoh dengan peak kromoatogram asam lemak standar yang telah diketahui jenis dan konsentrasinya, kemudian dihitung kadar asam lemaknya. Pengujian asam lemak ini menggunakan metode eksternal standar dimana pengukuran contoh dan standar dilakukan secara terpisah dan tanpa adanya penambahan larutan standar ke dalam contoh. Kadar asam lemak sampel dengan metode eksternal standar dapat dihitung sebagai berikut:
% asam lemak b/b
Area sampel Area standar
C
V
100 gram contoh lemak
100 %
6) Analisis kolesterol (Liebermann Burchard 1974) Analisis kadar kolesterol dilakukan menggunakan spektrofotometer. Sampel keong mas sebanyak + 0,1 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse ditambah 8 ml campuran etanol dan potreleum eter dengan perbandingan 3:1 dan diaduk sampai homogen. Pengaduk dibilas dengan larutan yang sama sebanyak 2 ml, kemudian disentrifuse 4.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dituang ke dalam beaker glass 100 ml dan diuapkan di penangas air. Residu dilarutkan dengan kloroform sedikit demi sedikit sambil dituangkan ke dalam tabung berskala hingga mencapai volume 5 ml. Selanjutnya ditambahkan 2 ml asetat anhidrat dan 0,2 ml H2SO4 pekat, lalu dihomogenkan dengan vorteks dan dibiarkan di tempat gelap selama 15 menit.
Absorbansi
dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm yang ditunjukkan dengan warna hijau tua. Kadar kolesterol dihitung dengan rumus: Kadar kolesterol
Absorbansi contoh Absorbansi standar
Konsentrasi standar Bobot contoh
23
3.5 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan dilakukan untuk mengamati dan mengidentifikasi perubahan yang disebabkan variabel atau perlakuan. Rancangan percobaan yang
digunakan pada penelitian ini dibedakan atas rancangan percobaan untuk uji hedonik dan rancangan percobaan untuk analisis kimia. 3.5.1 Rancangan Percobaan uji hedonik Rancangan percobaan uji hedonik menggunakan uji Kruskal Wallis untuk mengetahui pengaruh perbedaan konsentrasi garam terhadap rasa daging keong mas.
Uji Multiple Comparison selanjutnya dilakukan untuk mengetahui
perlakuan yang memberikan pengaruh nyata terhadap rasa keong mas. 1) Uji Kruskal Wallis Pengujian organoleptik rasa pada penelitian ini dilakukan oleh 30 orang panelis semi terlatih. Cara penilaian organoleptik rasa dapat dilihat pada Lampiran 3.
Apabila nilai asymp. sig < 0,05 maka dinyatakan tolak H0
(perbedaan konsentrasi garam memberikan pengaruh nyata pada rasa keong mas). Pengujian Kruskal Wallis menggunakan rumus berikut (Steel & Torrie 1993):
∑
(1) H =
Keterangan
3 n
1
∑T
(2) FK = (3) H’ =
R
H FK
ni N Ri T H’ FK
= = = = =
banyaknya pengamatan tiap perlakuan atau jumlah panelis banyaknya data jumlah rata-rata tiap perlakuan ke-i banyaknya pengamatan yang seri dalam tiap ulangan H terkoreksi faktor terkoreksi
2) Uji Multiple Comparison Apabila hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan bahwa perlakuan memberikan pengaruh nyata terhadap rasa keong mas, maka pengujian dilanjutkan dengan uji Multiple Comparison dengan rumus sebagai berikut (Steel & Torrie 1993).
24
R'i − R' j >< Z a / k(k−1)
N(N +1) ⎡ 1 1 ⎤ ⎢ + ⎥ 12 ⎣ ni nj ⎦
Keterangan: R’i = Rata-rata rangking perlakuan ke-i R’j = Rata-rata rangking perlakuan ke-j N = Banyaknya data K = Banyaknya perlakuan ni = Jumlah data perlakuan ke-i nj = Jumlah data perlakuan ke-j 3.5.2 Rancangan percobaan analisis kimia Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh metode pengolahan terhadap komposisi proksimat, asam lemak, dan kolesterol adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan satu faktor dan 4 taraf (sampel segar, perebusan, perebusan dalam air garam, dan pengukusan). Data dianalisis dengan ANOVA (Analysis Of Variant) menggunakan uji F, sebelum dilakukan uji F terlebih dahulu diuji kenormalan data. 1) Uji kenormalan Anderson-Darling Uji kenormalan adalah pengujian untuk mengetahui apakah galat data yang digunakan menyebar normal, sehingga dapat digunakan dalam statistika parametrik. Uji kenormalan data yang digunakan dalam penelitian ini adalah uji Anderson-Darling. Uji Anderson-darling berdasarkan pada fungsi distribusi empirik.
Model statistik uji Anderson-Darling adalah sebagai berikut
(Anderson & Darling 1952):
Keterangan: A = Nilai uji statistik Anderson-Darling N = Jumlah data F = Fungsi distributif kumulatif Y = Data yang telah diurutkan Penghitungan menghasilkan nilai A2 hitung dan Pvalue.
Bila nilai
Pvalue > α(0,05), maka data berdistribusi normal. Nilai rata-rata menggambarkan
25
posisi kurva sumbu X, sedangkan standar deviasi menggambarkan sebaran varian (Anderson & Darling 1952). 2) Uji ANOVA Data yang telah dinyatakan berdistribusi secara normal, dapat dinyatakan dalam selang sebagai berikut:
Keterangan: x = Rata-rata z = 1,96 µ = (1-α) 100 % = Simpangan baku n = Banyak data Data selanjutnya dianalisis menggunakan model rancangan ANOVA (Analysis Of Variant) atau uji F dengan formulasi (Steel & Torrie 1993): Yij = μ + τi + εij Keterangan : Yij μ τi εij
= Nilai pengamatan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j (j=1,2) = Nilai tengah atau rataan umum pengamatan = Pengaruh metode pengolahan pada taraf ke-i (i=1,2,3) = Galat atau sisa pengamatan taraf ke-i dengan ulangan ke-j Hipotesa terhadap data hasil uji komposisi kimia pada berbagai metode
pengolahan adalah sebagai berikut: H0 = H1 =
Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh terhadap komposisi kimia. Metode pengolahan memberikan pengaruh terhadap komposisi kimia. Hipotesa terhadap data hasil analisis kandungan asam lemak pada berbagai
metode pengolahan adalah sebagai berikut: H0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh terhadap kandungan asam lemak. H1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh terhadap kandungan asam lemak.
26
Hipotesa terhadap data hasil analisis kadar kolesterol pada berbagai metode pengolahan adalah sebagai berikut: H0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh terhadap kadar kolesterol. H1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh terhadap kadar kolesterol. 3) Uji lanjut Duncan Jika uji F pada ANOVA memberikan pengaruh yang berbeda terhadap komposisi kimia, kandungan asam lemak, dan kadar kolesterol, maka dilanjutkan dengan uji Duncan, dengan rumus sebagai berikut:
Duncan
Keterangan : KTS = Kuadrat tengah sisa dbs = Derajat bebas sisa r = Banyaknya ulangan
t
/ ;
2KTS r
