2 Iontové kanály a vedení signálů

2

Iontové kanály a vedení signálů

Elektrické signály, které jsou pro nervové funkce nezbytné, zprostředkovává iontový tok přes vodné (hydrofilní) póry v membráně nervové buňky. Tyto póry jsou tvořeny transmembránovými proteiny, nazývanými iontové kanály. Iontové proudy přes jednotlivé kanály je možné zaznamenávat a měřit. V této kapitole se zabýváme funkčními vlastnostmi iontových kanálů, např. jejich specificitou pro různé ionty, a pak tím, jak jsou regulovány, aby vytvářely požadované druhy signálů. Jednotlivé kanály jsou selektivní buď pro kationty, nebo anionty a některé kationtové kanály mohou být vysoce selektivní pro jediný typ iontů, např. sodné. Iontové kanály oscilují mezi stavem otevřeným a zavřeným, často s charakteristickou dobou, po kterou jsou otevřené. Jejich příspěvek k průtoku iontového proudu přes buněčnou membránu určuje relativní doba, po kterou setrvávají v otevřeném stavu. Otevírání těchto iontových kanálů je řízeno rozmanitými mechanismy. Některé z nich jsou fyzikální, např. změny v membránovém napětí čili membránovém potenciálu. Jiné faktory řídící kanály jsou chemické a zahrnují vazbu aktivačních molekul (tzv. ligandů) na extracelulární část molekuly iontového kanálu nebo vazbu specifických iontů či molekul na vnitrobuněčné ústí kanálu. Další významnou vlastností kanálů, kromě kinetiky otevírání a zavírání, je relativní schopnost otevřeného kanálu propouštět iontový proud. Prvním způsobem, kterým mohou ionty otevřeným kanálem procházet, je prostá difuze po koncentračním spádu (gradientu). Druhým je interakce s vnitřními vazebnými místy v hrdle kanálu, kdy ionty pórem přeskakují z jednoho místa na druhé. V obou případech je pohyb iontů kanálem pasivní a pohání jej koncentrační gradienty a gradient elektrického potenciálu napříč membránou. Množství proudu, které otevřeným kanálem protéká po spádu tohoto elektrochemického gradientu, závisí na propustnosti kanálu pro daný typ iontu. Velikost proudu záleží rovněž na koncentraci iontů na obou stranách kanálu. Uvedené dva faktory, propustnost a koncentrace iontů, určují vodivost kanálu.

26

Kapitola 2 V kapitole 1 jsme pojednávali o tom, jak přenos informací v nervovém systému zprostředkovávají dva typy elektrických signálů v nervových buňkách: místní stupňované potenciály, jež vznikají ve specifických oblastech membrány nervové buňky, a akční potenciály, které se šíří po celé délce určitého nervového vlákna. Tyto dynamické signály jsou „navrstveny“ na stabilní elektrický potenciál napříč buněčnou membránou, tzv. klidový membránový potenciál. V závislosti na typu neuronů mají nervové buňky v klidu stálý membránový potenciál, jenž se pohybuje od asi –30 mV do téměř –100 mV, přičemž záporné znaménko znamená, že je vnitřek buňky vzhledem k vnějšku nabitý záporně. Zprostředkovateli dráždivosti (excitability) v nervovém systému jsou změny v membránovém potenciálu: U smyslových receptorů vyvolávají jejich podněty, např. dotek, zvuk nebo světlo, místní depolarizaci (posun membránového potenciálu směrem k pozitivním hodnotám) nebo hyperpolarizaci (negativnější membránový potenciál). Podobně na synapsích způsobují neuropřenašeče depolarizaci nebo hyperpolarizaci postsynaptických nervových buněk. Akční potenciály, což jsou vlastně intenzivní krátké depolarizační pulzy, se šíří axony a přenášejí v nervovém systému informace z jednoho místa na jiné. Veškeré tyto změny  membránového potenciálu jsou způsobeny průtokem iontů membránou nervové buňky. Tak např. pohyb kladně nabitých sodných iontů směrem dovnitř neuronu snižuje záporný náboj na  vnitřní straně membrány neboli, jinými slovy, vyvolává depolarizaci. Naopak pohyb kladně nabitých draselných iontů směrem ven z buňky má za následek nárůst čistého záporného náboje uvnitř buňky: tento jev je označován jako hyperpolarizace. K obdobné hyperpolarizaci dochází při pohybu záporně nabitých chloridových iontů směrem dovnitř. Jak se ionty pohybují přes buněčnou membránu a jak se jejich pohyb reguluje? Hlavní cestou pro rychlý iontový pohyb do buňky a z ní se děje iontovými kanály. Jde o proteinové molekuly, které překlenují buněčnou membránu a vytvářejí otvory neboli póry, jimiž mohou ionty procházet. Regulace iontových proudů spočívá v řízeném otvírání a zavírání těchto kanálů. Znalosti o funkci jednotlivých iontových kanálů poskytují zásadní pokrok v našem chápání způsobu, jakým se v nervových buňkách vytvářejí elektrické signály.

Vlastnosti iontových kanálů Membrána nervové buňky

Obr. 2.1 Buněčná membrána a iontový kanál. (A) Buněčná membrána se skládá z lipidové dvojvrstvy, do které jsou vřazené proteiny. Některé z nich se do lipidové vrstvy zanořují a jiné, jež membránu úplně překlenují, vytvářejí membránové kanály. (B) Toto schéma znázorňuje membránový kanál v příčném řezu s centrálním pórem vyplněným vodou a s „brankou“ (G, gate). Branka se otevírá a zavírá nepravidelně. Pravděpodobnost otevření kanálu je regulována membránovým poten­ ciálem, vazbou ligandu na kanál, popř. dalšími biofyzikálními nebo biochemickými faktory. Sodný ka­ tiont, který je obklopen kompaktním obalem z vodních molekul, je v póru zobrazen kvůli srovnání velikosti.

Buněčné membrány sestávají z tekuté mozaiky lipidových a proteinových molekul. Jak je vidět na obr. 2.1A, lipidové molekuly jsou uspořádány v dvojvrstvě tlusté asi 6 nm tak, že jejich polární, hydrofilní konce směřují vně membrány a jejich hydrofobní konce jsou zanořeny do střední části této vrstvy. Lipidy (tuky) jsou pouze omezeně propustné pro vodu a pro samotné ionty vlastně nepropustné. Do lipidové dvojvrstvy jsou vsazeny proteinové molekuly – některé jsou na zevní straně buňky, jiné na vnitřní straně obrácené (A)

(B)

G

10 nm

Iontové kanály a vedení signálů směrem do cytoplazmy a některé membránu překlenují. Mnohé z těch, které membránu překlenují, vytvářejí iontové kanály. Ionty, jako třeba draselné, sodné, vápenaté nebo chloridové, procházejí takovými kanály přes membránu pasivně, poháněny koncentračními gradienty a elektrickým potenciálem. Jiné proteiny, pronikající celou membránou, fungují jako aktivní transportní molekuly (pumpy a transportéry), jež přenášejí ionty a určité látky přes membránu proti jejich elektrochemickým gradientům. Transportní molekuly udržují iontové složení cytoplazmy tím, že přes buněčnou membránu zpětně a aktivním procesem odčerpávají ionty, které se pohybují po spádu svých elektrochemických gradientů, do buňky nebo z ní. Uskutečňují také důležitou funkci, která spočívá v přenášení metabolitů, např. glukózy a aminokyselin, přes buněčné membrány. Vlastnosti transportních molekul budeme probírat v kapitole 4.

Jak vypadá iontový kanál? Molekulární stavba iontových kanálů a jejich uspořádání v buněčné membráně jsou detailně rozebírány v kapitole 3, ale už teď je užitečné vytvořit si určitou představu o obecných fyzikálních rysech proteinového iontového kanálu. Buněčná membrána a iontový kanál jsou znázorněny na obr. 2.1B. Protein překlenuje membránu, centrální pór je vyplněný vodou a otevírá se jak do prostoru vnitrobuněčného (intracelulárního), tak i mimobuněčného (extracelulárního). Pór se na obou koncích rozšiřuje a vytváří jakýsi vestibul (ústí). Zúžená oblast kanálu na úrovni membrány má „branku“, jež se může otevírat a zavírat, a tím regulovat průtok iontů. Velikost proteinu značně kolísá podle typu kanálu a  některé mají ještě specifické strukturní znaky. Obrázek 2.1B představuje kanál středních rozměrů. Sodný iont, který je hydratován obalem z molekul vody, je v póru vyobrazen pro srovnání velikosti.

Selektivita kanálů Membránové kanály se značně liší svou selektivitou. Některé propouštějí kationty, jiné anionty. Některé kationtové kanály jsou selektivní pro jediný typ iontu. Některé např. umožňují téměř výlučně propustnost sodíku, jiné draslíku a ještě další vápníku. Jiné jsou relativně nespecifické a umožňují průchod dokonce i malým organickým kationtům. Aniontové kanály, zapojené při mechanismech dráždivosti, jsou poměrně málo specifické, ale zpravidla jsou označovány jako „chloridové kanály“, protože chloridový iont je v biologických roztocích hlavním propouštěným aniontem. Některé kanály (tzv. konexony) spojují přilehlé buňky a umožňují průchod většiny organických iontů a četných malých organických molekul. Konexony jsou probrány v kapitole 7.

Otevřený a uzavřený stav iontového kanálu Třebaže proteiny kvůli názornosti představujeme jako statické struktury, nikdy nezůstávají v absolutním klidu. Vzhledem ke své tepelné energii jsou všechny velké molekuly zákonitě značně dynamické. Při obyčejné teplotě se chemické vazby v těchto molekulách napínají a uvolňují, takže se molekuly kroutí a vlní kolem vlastních rovnovážných stavů. I když mají individuální pohyby velikost řádově jen 10–12 m, při frekvencích, jež se blíží hodnotě 1013 Hz, může takové atomární chvění vytvářet v konformaci dané molekuly základ mnohem větších a pozvolnějších změn. Výsledkem je, že početné rychlé atomární pohyby občas umožní, aby po  sobě aminokyselinové skupiny v  proteinu navzájem sklouzly, navzdory odpuzování, jež by je jinak uchovávalo na místě. Takový přechod, je-li ho jednou dosaženo, může přetrvávat mnoho milisekund nebo i sekund. Příkladem je krevní barvivo hemoglobin. Vazebná místa pro kyslík na hemových skupinách jsou zanořena uvnitř této molekuly, a tedy bezprostředně nedostupná. Vazby s kyslíkem a jejího následného uvolnění lze dosáhnout pouze dynamickým vytvářením přechodných přístupových cest do hemové „kapsy“. Aby tedy svou funkci molekula uskutečňovala, „dýchá“.1 V proteinech iontového kanálu dochází k rychlým molekulárním přechodům mezi stavem otevřeným a zavřeným, přičemž jsou přechody mezi těmito stavy vlastně okamžité. Zkoumáme-li chování nějakého iontového kanálu, zjišťujeme, že otevírací doby značně kolísají: někdy se kanál otevře na pouhou milisekundu či méně, jindy na podstatně delší dobu (viz obr. 2.4). Ale každý z kanálů má vlastní charakteristickou střední (průměrnou) dobu otevření (τ), kolem níž reálné doby, po které otevření trvá, kolísají.

1

Karplus, M. a Petsko, G. A. (1990): Nature 347: 631–639.

27

28

Kapitola 2 Některé kanály v klidové buněčné membráně se otevírají velmi často. Pravděpodobnost zjištění takových kanálů v jejich otevřeném stavu je relativně vysoká. Většinou jsou to draslíkové a chloridové kanály, podílející se na tvorbě klidového membránového potenciálu. Zbytek je převážně v uzavřeném stavu a pravděpodobnost, že se jednotlivý kanál otevře, je nízká. Jsou-li takové kanály aktivovány vhodným podnětem, pravděpodobnost otevření strmě vzrůstá. Na druhé straně kanály, které se v klidu otevírají často, lze deaktivovat určitým podnětem, tzn. že se jejich frekvence otevírání snižuje. Důležité je mít na paměti, že aktivace a deaktivace kanálu znamená vzrůst nebo pokles pravděpodob­ nosti otevírání kanálu, nikoliv vzrůst nebo pokles jeho střední (průměrné) doby otevření. Kromě mechanismů aktivace a deaktivace regulují tok proudu iontovými kanály dva další mechanismy. V prvním případě mohou určité kanály vstupovat do konformačního stavu, v němž už aktivace neprobíhá, třebaže je aktivační podnět stále přítomný. U kanálů, které reagují na depolarizaci buněčné membrány, se tento stav označuje jako inaktivace. U kanálů, které reagují na chemické podněty (ligandy), je uvedený stav známý jako desenzitizace. Druhým mechanismem je blokáda otevřeného kanálu. Ta nastává např. tehdy, naváže-li se na otevřený iontový kanál nějaká velká molekula (třeba toxin) a fyzicky pór uzavře. Jiným příkladem je blokáda některých kationtových kanálů ionty hořčíku, které samy o sobě kanálem nepronikají, ale navážou se pevně v jeho vnitřním ústí a brání propouštění jiných kationtů.

Způsoby aktivace Obrázek 2.2 shrnuje způsoby aktivace kanálů. Některé kanály odpovídají na fyzikální změny v membráně nervové buňky specificky. V této skupině převládají kanály, které se aktivují napětím (změnou membránového potenciálu). Příkladem je sodíkový kanál řízený napětím. Odpovídá za regenerativní depolarizaci, která je základem narůstající fáze akčního potenciálu (kapitola 6). Do této skupiny patří také kanály aktivované mechanickým napínáním. Odpovídají na mechanickou deformaci buněčné membrány. Receptory napínání se vyskytují např. v mechanoreceptorech kůže (kapitola 17). Jiné iontové kanály se aktivují, navážou-li se chemické látky na vazebná místa na samotném proteinu. Tyto kanály aktivované ligandem se dále dělí na dvě podskupiny v závislosti na tom, odpovídají-li na vazbu ligandu vně nebo uvnitř buňky. Kanály, které reagují na aktivaci z vnější strany buňky, zahrnují např. kationtové kanály v postsynap-

(A) Kanály aktivované fyzikálními změnami vbuněčné membráně

+

+

Obr. 2.2 Způsoby aktivace kanálů. Pravděpodobnost otevření kanálů ovlivňují různé podněty. (A) Některé kanály reagují na změny ve fyzikálním stavu membrány, zvláště na změny v membránovém potenciálu (aktivace napětím) a na mechanickou deformaci (aktivace napínáním). (B) Kanály aktivované ligandem reagují na chemické látky, které se navážou k vazebným místům kanálového proteinu. Neuropřenašeče, např. glycin a acetylcholin, působí na extracelulární vazebná místa. Mezi širokou škálu intracelulárních ligandů patří vápenaté ionty, podjednotky G-proteinů a cyklické nukleotidy.

−

−

−

−

+

+ aktivace napínáním

aktivace napětím (B) Kanály aktivované ligandy ligand

ligand aktivace vně buňky

aktivace uvnitř buňky

Iontové kanály a vedení signálů

29

tických membránách kosterních svalů, jež aktivuje neuropřenašeč acetylcholin, uvolňovaný z presynaptických nervových zakončení (kapitola 9). Tato aktivace iontových kanálů acetylcholinem způsobuje vtok sodných kationtů do buňky, což vyvolá depolarizaci svalového vlákna. Mezi ligandem aktivovanými kanály, které reagují na vnitrobuněčné podněty, patří kanály, které jsou citlivé vůči lokálním změnám v intracelulární koncentraci specifických iontů. Tak např. draslíkové kanály aktivované vápníkem se aktivují lokálními zvýšeními koncentrace intracelulárního vápníku a u mnoha buněk hrají roli při repolarizaci membrány nervové buňky během zakončení akčního potenciálu. Jinými intracelulárními ligandy jsou cyklické nukleotidy: cGMP (cyklický guanosinmonofosfát) je např. odpovědný za aktivaci sodíkových kanálů v tyčinkách sítnice, čímž sehrává významnou úlohu při přenosu zrakové informace (kapitola 19). Tato klasifikace iontových kanálů nemá však zcela přísné hranice: např. draslíkové kanály aktivované vápníkem jsou rovněž citlivé vůči změnám napětí na membráně a některé kanály aktivované napětím jsou zase citlivé vůči specifickým intracelulárním ligandům.

Měření proudů jednotlivých kanálů Metoda terčíkového zámku K měření iontových toků přes membrány byly v minulosti navrhovány různé experimentální nástroje, zprvu se postupovalo nepřímo, analýzou membránového šumu,2,3 a později přímým pozorováním, pomocí metody terčíkového zámku.4,5 Tato metoda může poskytnout odpovědi na zvláště zajímavé otázky ohledně fyziologie iontových kanálů, např.: Kolik proudu jednotlivým iontovým kanálem protéká? Jak dlouho zůstává tento kanál otevřený? Jak jeho doby otevírání a zavírání závisejí na napětí? A jak na aktivační molekule, tedy ligandu? K našim poznatkům o funkcích iontových kanálů v membránách nesmírně přispěl dynamický rozvoj metody terčíkového zámku (patch clamp recording), na kterém se podíleli badatelé Erwin Neher a Bert Sakmann se svými spolupracovníky. Metoda terčíkového zámku spočívá v tom, že se otavený hrot malé mikropipety (o vnitřním průměru asi 1 μm) přisaje k buněčné membráně. Za ideálních podmínek, kdy se membrána skrz mikropipetu ještě slabě mechanicky nasaje, se mezi okrajem hrotu pipety a plazmatickou membránou (obr. 2.3A,B) vytváří velmi pevný spoj s odporem vyšším než 109 ohmů (odtud termín „gigaohmová zátka“). Jestliže se tato mikropipeta připojí k vhodnému zesilovači, lze přes membránový terčík uvnitř konce mikropipety zaznamenávat nepatrné elektrické proudy procházející membránou (obr. 2.3F). Zátka o vysokém odporu zajišťuje, že takové transmembránové proudy protékají spíše přes zesilovač, než aby unikaly okrajem terčíku. Děje zaznamenané pomocí terčíkového zámku sestávají z pravoúhlých proudových pulzů, které vznikají otevíráním a zavíráním jednotlivých iontových kanálů v terčíku. Jinými slovy, v reálném čase můžeme pozorovat aktivitu jednotlivých proteinových molekul v membráně. V nejjednodušší formě se tyto proudové pulzy objevují nepravidelně a mají téměř konstantní amplitudy, avšak proměnlivé doby trvání (obr. 2.4A). V některých případech jsou ale záznamy iontového proudu složitější: kanály mohou např. vykazovat stavy o více než jedné úrovni procházejícího proudu, jako na obr. 2.4B, kde otevřené kanály často zůstávají na nižších, „podstavových“ úrovních. Navíc mohou některé kanály často vykazovat komplikovanou kinetiku jejich aktivace otevírání. Otevírání může u kanálu probíhat v náhlých a rychlých salvách (obr. 2.4C). V souhrnu nabízí metoda terčíkového zámku ke studiu funkce iontových kanálů dvě hlavní výhody: První je, že nám izolace malého terčíku z membrány umožňuje pozorovat aktivitu pouze několika kanálů než jejich velkého počtu, jenž může být v klidovém stavu buňky aktivní. Druhou výhodou je, že nám vysoký odpor zátky dovoluje pozorovat nesmírně malé elektrické proudy. Můžeme tedy získávat přesná měření amplitud proudů jednotlivých iontových kanálů a analyzovat jejich kinetické chování.

Záznamové konfigurace metodou terčíkového zámku Metoda terčíkového zámku umožňuje ještě další uspořádání, ve kterých je možno provádět elektrické záznamy. Po vytvoření zátky a napojení buněčného terčíku můžeme terčík

Erwin Neher (vlevo) a Bert Sakmann (vpravo)

Katz, B. a Miledi, R. (1972): J. Physiol. 224: 665–699. 3 Anderson, C. R. a Stevens, C. F. (1973): J. Physiol. 235: 665–691. 4 Neher, E., Sakmann, B. a Steinbach, J. H. (1978): Pflügers Arch. 375: 219–228. 5 Hamill, O. P. et al. (1981): Pflügers Arch. 391: 85–100. 2

30

Kapitola 2 (A)

Obr. 2.3 Metoda terčíkového zámku (patch clamp recording). (A–E) „Terčíkové“ konfigurace schematicky. Elektroda vytváří na kontaktu s buněčnou membránou jakýsi uzávěr (A), který se jemným dosátím přemění v gigaohmovou zátku (B). Pak lze zaznamenávat proudy z membránového terčíku v kruhovém rozmezí hrotu elektrody (terčík na spoji s buňkou). Odtažením mikropipety od buňky vzniká váček uvolněný od zbytku neuronu, jehož membránu lze odtrhnout za vzniku terčíku vnitřkem ven (inside-out) (C). Jinou možností je, že lze protrhnout membránu nasátou v elektrodě silnějším nasátím, čímž získáme celobuněčný záznam (D), anebo se tahem získá terčík vnějškem ven (outside-out)(E). (F) Záznamová aparatura. „Terčíková“ elektroda se připojí k zesilovači, který proudy snímané z kanálů konvertuje v napěťové signály. Ty se pak zobrazují na osciloskopu či na obrazovce počítače, a je tedy možné přesně měřit amplitudy a doby trvání těchto proudů jednotlivých kanálů. (Obr. A–E podle Hamilla et al., 1981.)

hrot elektrody

buňka sání (B)

(gigaohmová zátka) SNÍMANÁ BUŇKA

sání (D) CELOBUNĚČNÝ ZÁZNAM tah (nízká koncentrace Ca2+)

tah

(C) TERČÍK VNITŘKEM VEN (F)

(E) TERČÍK VNĚJŠKEM VEN − + proudonapěťový převodník osciloskop

jemně odtrhnout od buňky a vzniká tzv. terčík vnitřkem ven (inside-out patch) (viz obr. 2.3C), tj. vnitřní strana cytoplazmatické membrány se ocitá v roztoku, jímž je preparát omýván. Nebo můžeme membránu uvnitř terčíku po slabém nasátí protrhnout a vytvořit spojení mezi vnitřkem elektrody a buněčnou cytoplazmou (obr. 2.3D). Za tohoto stavu se membránové proudy zaznamenávají z celé buňky (tzv. celobuněčný záznam, whole­ -cell recording). A konečně můžeme nejprve získat celobuněčný záznam a pak elektrodu od buňky pomalu odtáhnout. Tak se vytvoří tenké zúžení membrány, jakýsi krček, který se oddělí a uzavře, tj. vytvoří se terčík vnějškem ven (outside-out patch), tedy extracelulární stranou membrány obrácený proti promývacímu roztoku (viz obr. 2.3E). Každá z uvedených konfigurací má své specifické výhody, které závisejí na typu kanálu, jejž studujeme, a na druhu informací, jež se chceme v daném experimentu dozvědět. Chceme-li např. na vnější stranu terčíku membrány aplikovat rozmanité chemické látky, pak je metoda terčíku vnějškem ven nejvhodnější volbou. Typickým znakem celobuněčného záznamu pomocí „terčíkové“ mikropipety je, že může docházet k výměně látek mezi cytoplazmou a pipetou. Uvedená výměna (někdy označovaná jako dialýza) může být užitečná tím, že po naplnění mikropipety specific-

Iontové kanály a vedení signálů

31

(A) 20 pA

zavřeno (C) otevřeno (O) 0

(B) 4 pA

40

80

120

160

200

(C) (O1) (O2)

0 (C)

100

0

100

0

100

0

100

1200

1400

(O) 2 pA (C) 0

200

400

600

800

1000

čas (ms)

kým roztokem umožňuje pozměňovat iontové koncentrace uvnitř buňky na předem dané koncentrace. Na druhé straně, zejména jde-li o malou buňku, mohou důležité cytoplazmatické složky rychle unikat difuzí do roztoku v mikropipetě. Této ztrátě se lze vyhnout tak, že se využije tzv. perforovaný terčík (perforated patch).6 Terčíková mikropipeta se vyplní látkou vytvářející elektrické póry v membráně, např. antibiotikem nystatinem, a tak na buňce vzniká jakýsi nízkoodporový „cedníček“. Po jisté době se totiž v terčíku vytvoří póry, které umožní měření proudů v celé buňce, ale nepropustí do mikropipety molekuly z buněčné cytoplazmy.

Intracelulární záznam pomocí skleněných mikroelektrod Před vyvinutím metody terčíkového zámku se vlastnosti membránových kanálů studovaly z experimentů, při nichž se k záznamu membránového potenciálu nebo membránového elektrického proudu z celých buněk používaly skleněné mikroelektrody. Skleněné mikroelektrody pro vnitrobuněčný záznam z jednotlivých buněk, které zavedli Ling s Gerardem7 v roce 1949, byly přinejmenším stejně významné jako zavedení metody terčíkového zámku o tři desetiletí později. Tato technika poskytla přesná měření klidových membránových potenciálů, akčních potenciálů a reakcí na synaptickou aktivaci ve svalových vláknech a neuronech (kapitola 1). Technika intracelulárního záznamu je na obrázku 2.5A. Ostrá skleněná mikropipeta o průměru hrotu menším než 0,5 μm a vyplněná vodivým solným roztokem (tj. 3molárním roztokem KCl, elektrolytem) slouží jako elektroda a je spojena se zesilovačem k záznamu změn elektrického potenciálu v jejím hrotu. Přitlačí-li se mikropipeta na buněčnou membránu, průnik do cytoplazmy signalizuje přítomnost klidového membránového potenciálu. Je-li průnik úspěšný, membrána kolem vnějšího povrchu pipety se uzavře, takže cytoplazma zůstává izolovaná od extracelulární tekutiny.

Obr. 2.4 Příklady experimentů s vy­užitím metody terčíkového zámku. (A) Proudy v kanálech aktivovaných glutamátem zaznamenávané v terčíku přisátém ke svalové buňce kobylky probíhají nepravidelně s jedinou pevnou amplitudou a kolísavými dobami otevírání. Výchylky křivek směrem dolů naznačují vtok proudu do buňky. (B) Proudy aktivované acetylcholinem z jednotlivých kanálů v terčíku vnějškem ven (outside-out) z kultivovaného svalu potkaního embrya dosahují maximální amplitudy asi 3 pA a klesají na podstavový proud o hodnotě asi 1,5 pA. Výchylky křivky dolů indikují proud ve směru dovnitř buňky. (C) Proudové pulzy směrem vně buňky přes chloridové kanály aktivované glycinem v terčíku vnějškem ven (outside-out) z kultivovaných kuřecích míšních buněk sestávají z rychlých uzavření a opětovných otevření za vzniku jakéhosi „jiskření“. (Obr. A podle Cull-Candyho, Milediho a Parkera, 1980; obr. B podle Hamilla a Sakmanna, 1981; obr. C od A. I. McNivena a A. R. Martina, nepublikováno.)

Intracelulární záznam proudového šumu iontových kanálů Počátkem 70. let minulého století uskutečnili Katz a Miledi2 průkopnické experimenty na svalových vláknech žab, při nichž využívali záznamové techniky ke zkoumání charakteristik „šumu“, který vytváří acetylcholin (Ach) na nervosvalovém spojení. Na této synapsi otevírá Ach uvolněný z presynaptického nervového zakončení kanály spouštěné

Horn, R. a Marty, A. (1988): J. Gen. Physiol. 92: 145–149. 7 Ling, G. a Gerard, R. W. (1949): J. Cell Comp. Physiol. 34: 383–396. 6

Kapitola 2

Obr. 2.5 Vnitrobuněčný záznam šumu iontových kanálů. (A) Systém pro záznam membránových potenciálů ze svalových vláken pomocí skleněné mikroelektrody. Elektroda je spojena s předzesilovačem a signály se zobrazují na osciloskopu nebo na obrazovce počítače. Průnik elektrody do buňky je indikován výskytem klidového membránového potenciálu (klesající výchylka na displeji). Po průniku elektrody lze měřit změny potenciálu vyvolané aktivací iontových kanálů. (B) Vnitrobuněčné záznamy účinku acetylcholinu (Ach). Při tomto experimentu byl využit snímací obvod pro záznam membránových proudů (spíše než membránového potenciálu). V klidu (horní křivka) přes membránu žádný proud neprochází. Aplikace Ach vyvolává směrem do buňky proud asi 130 nA (spodní křivka). (C) Křivky z obr. B vyobrazené při větším zesílení. Základní linie ukazuje velmi malé kolísání při klidovém potenciálu. Vtékající proud, který je vyvolán Ach, vykazuje relativně velké kolísání („šum“), jež je způsobováno nahodilým otevíráním a zavíráním kanálů aktivovaných tímto přenašečem. Následná analýza zvýšeného šumu poskytuje výchozí hodnoty pro zjištění proudu neseného jednotlivým kanálem a střední dobu otevření těchto kanálů. (Obr. B a C podle Andersona a Stevense, 1973).

(A)

mikroelektroda

předzesilovač

sval

komůrka s preparátem

osciloskop

(B) proud (nA)

32

v klidu

0 −100

Ach

−200 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

v klidu

(C)

Ach 1 nA

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

čas (s)

8

Gold, M. R. a Martin, A. R. (1983): J. Physiol. 342: 99–117.

ligandem v postsynaptické membráně, jež umožňují vstup kationtů s následnou depolarizací svalu (kapitola 9). Katz s Miledim aplikovali acetylcholin přímo do synaptické oblasti a pozorovali, že výsledná depolarizace vykazuje jakýsi „šum“, tj. že jsou výkyvy v elektrickém záznamu během depolarizace indukované touto látkou větší než běžná kolísání při klidovém membránovém potenciálu. Tento nárůst šumu způsobovalo nahodilé otevírání a zavírání iontových kanálů aktivovaných Ach. Jinak vyjádřeno, aplikace Ach měla za následek otevření velkého množství ligandem aktivovaných iontových kanálů a tento počet se měnil nahodile s tím, jak molekuly Ach „bombardovaly“ membránu. Použitím technik analýzy tohoto šumu dokázali Katz s  Miledim získat informace o chování jednotlivých iontových kanálů aktivovaných Ach. Posléze prováděli se stejným preparátem Anderson se Stevensem3 podobné experimenty, při nichž využívali k odvození velikosti a doby trvání iontových proudů v jednotlivých kanálech měření membránového proudu (obr. 2.5B). Třebaže technika analýzy šumu vyžaduje poměrně složité matematické postupy, její podstatné principy jsou zde zřetelné: zaprvé, jsou-li proudy jednotlivých kanálů relativně velké, bude rovněž větší i jejich šum. Zadruhé, kanály, jež se otevírají na relativně delší dobu, budou vytvářet šum jen o nízké frekvenci. Kanály, jež se otevírají jen krátce, budou vytvářet vyšší frekvenci šumu. Zkoumání amplitudy a frekvence složení tohoto šumu, který vytvářejí kanály aktivované Ach v nervosvalovém spojení, ukázalo, že otevřeným iontovým kanálem proteče za sekundu asi 10 milionů iontů a že střední doba otevření kanálu (τ) je 1–2 ms. Ačkoliv se dnes analýza šumu většinou nahrazuje metodou terčíkového zámku, je stále užitečná pro studium funkce membránových kanálů v buňkách, jež nejsou metodě terčíkového zámku dobře přístupné, např. v některých intaktních částech CNS.8 Kromě toho je analýza šumu relativně rychlou metodou, jak získat informace o vlastnostech určité množiny kanálů, a je užitečná pro interpretaci změřených proudů v celé buňce k ná-

Iontové kanály a vedení signálů

33

sledné identifikaci typů kanálů. Nemůže však poskytovat detailní informace o chování jediného kanálu, např. o komplikované kinetice nebo o vodivostních podstavech.

Vodivost kanálu Kinetické projevy kanálu, tj. doby jeho otevřených a uzavřených stavů, nám mohou poskytnout užitečné informace o procesech vedoucích k jeho otevírání a zavírání a o velikosti konstanty vyjadřující tyto kroky. Na druhé straně představuje iontový proud kanálu přímé měření toho, jak rychle jím procházejí nabité ionty. Proud nezávisí jen na vlastnostech kanálu, ale také na membránovém potenciálu. Uvažujme např. terčík vnějškem ven (outside-out) u membrány na obr. 2.6, který obsahuje jediný spontánně aktivní kanál propustný pro draslík. Jak roztok v „terčíkové“ mikropipetě, tak i roztok v lázni obsahuje 150 mmol/l draselných kationtů. Draselné ionty se otevřeným kanálem pohybují obousměrně, ale protože jsou jejich koncentrace na obou stranách membrány totožné, nedochází k čistému toku žádným směrem. Proto není na elektrodě měřitelný žádný elektrický proud (obr. 2.6B). Naštěstí má metoda terčíkového zámku významnou vlastnost, která zatím zmíněna nebyla. Na membránový terčík můžeme přes vodivý roztok v mikropipetě aplikovat napětí. Aplikuje-li se takto potenciál o hodnotě +20 mV (obr. 2.6C), vyvolá každé otevření Obr. 2.6 Vliv elektrického potenciálu na proudy v jediném spontánně aktivním draslíkovém kanálu v terčíku vnějškem ven (outside-out) při koncentraci draslíku 150 mmol/l v roztoku v elektrodě i v lázni. (A) Záznamová aparatura. Výstup ze zesilovače do PC je úměrný proudu přes terčík. Jak je patrné, potenciál přes terčík se rovná potenciálu (VC) předávanému na vstup zesilovače. Kladný náboj vytékající z elektrody se definuje jako pozitivní proud. (B) Neaplikuje-li se na terčík žádný potenciál, nejsou patrné ani membránové proudy, protože nedochází k žádnému čistému toku draselných iontů přes kanály. (C) Aplikace napěťového pulzu +20 mV na elektrodu vyvolá výtok proudu přes iontové kanály (výchylky vzhůru) o hodnotě asi 2 pA. (D) Aplikace potenciálu o velikosti –20 mV vyvolá vtok proudů přes kanály do elektrody (výchylky dolů) o stejné amplitudě jako v obr. C. (E) Kanálové proudy jako funkce aplikovaného napětí. Šikmá čára v grafu představuje vodivost kanálu (γ). V tomto případě γ = 110 pS (pikosiemensů).

(A)

2

0 mV

vně

(E)

4

0 −2

2

uvnitř

+20 mV

vně

0 −2

proud vkanálu (pA)

(C)

proud (pA)

(B)

proud (pA)

VC

2

− 40

− 20

20

−2

uvnitř

(D)

proud (pA)

−4 2

−20 mV

vně

0 −2

uvnitř 0

20

40

60 čas (ms)

80

100

terčíkový potenciál (mV)

40

34

Kapitola 2 kanálu proudový pulz vně elektrody, protože kladně nabité draselné ionty pohání ven kanálem elektrický gradient mezi roztokem v mikropipetě a roztokem v lázni. Je-li však vnitřek mikropipety záporný o 20 mV (obr. 2.6D), draselné kationty naopak vtékají otevřeným kanálem do mikropipety. Účinek aplikovaného napětí na  velikost proudu je vynesen na  obr. 2.6E. Vztah je lineár­ní: proud I přes kanál je úměrný napětí V, které se na něj aplikuje: I = γV . Mnozí čtenáři poznají v uvedeném vztahu mírně pozměněný Ohmův zákon (Dodatek A). Ti, kteří jej nepoznali, se obávat nemusejí. Konstanta úměrnosti γ se označuje jako vodivost kanálu. Při daném aplikovaném napětí povede kanál s vysokou vodivostí hodně proudu, kanál s nízkou vodivostí jen málo proudu. Jednotkou vodivosti je siemens (S). V nervových buňkách se potenciály přes membránové kanály obvykle vyjadřují v milivoltech (1 mV = 10–3 V), proudy v jednotlivých kanálech v pikoampérech (1 pA = 10–12 A) a vodivost jednotlivých kanálů v pikosiemensech (1 pS = 10–12 S). Na obr. 2.6E vyvolal potenciál o hodnotě +20 mV proud asi o 2,2 pA, vodivost kanálu (γ = I/V) tedy byla 2,2 pA/20 mV = 110 pS.

Vodivost a propustnost Vodivost kanálu závisí na dvou faktorech: Prvním je účinnost, s níž mohou ionty procházet otevřenými kanály. Jde o specifickou vlastnost kanálu, která je známá pod ­označením propustnost (permeabilita) kanálu. Druhým faktorem je koncentrace iontů v oblasti kanálu. Je zřejmé, že nejsou-li ve vnitřním ani ve vnějším roztoku žádné draselné ionty, nemůže přes otevřený draslíkový kanál protékat žádný proud, bez ohledu na to, jak velká je propustnost nebo jak velký je aplikovaný potenciál. Jsou-li draselné ionty přítomné jen v malém množství, pak bude proud kanálu pro danou propustnost a pro daný potenciál menší než za stavu, kdy je draselných iontů hodně. Uvedené stavy lze znázornit takto:

otevřený kanál → propustnost propustnost + ionty → vodivost

Rovnovážný potenciál V příkladech o proudu v iontovém kanálu, které jsme právě uvažovali, byly koncentrace draselných iontů na obou stranách membránového terčíku stejné. Co nastane, když budou tyto koncentrace odlišné? Představte si, že si vytvoříme terčík vnějškem ven, jako na obr. 2.7A, a že koncentrace draselných iontů v roztoku lázně činí 3 mmol/l (podobná koncentraci vně mnohých buněk v těle) a v elektrodě 90 mmol/l (podobná cytoplazmatické koncentraci v mnohých buňkách). Když se pak kanál otevře, dojde přes něj k čistému pohybu draselných iontů z mikropipety do lázně, i když se do elektrody žádné napětí neaplikuje (obr. 2.7B). Draselné ionty se prostě pohybují po spádu svého koncentračního gradientu. Pokud zajistíme, aby byla mikropipeta kladně nabitá, gradient elektrického potenciálu přes membránu bude urychlovat výtok draselných iontů z mikropipety a proud kanálem bude vzrůstat (obr. 2.7C). Pokud ale mikropipetu nabijeme záporně, bude se pohyb draselných iontů vně zvolňovat a proud kanálem se bude snižovat (obr. 2.7D). Při dostatečně velké negativitě vnitřku mikropipety budou draselné ionty přes membránu do pipety vtékat proti vlastnímu koncentračnímu gradientu (obr. 2.7E). Provedeme-li mnoho takových pozorování a vyneseme proud kanálem jako funkci aplikovaného napětí, získáme výsledek jako na obr. 2.7F. Obrázek 2.7F ukazuje, že tok draslíku kanálem závisí na elektrickém potenciálu přes membránu i na koncentračním gradientu draselných kationtů, tj. na elektrochemickém gradientu pro draslík. Na rozdíl od uvedeného výsledku, kdy byly koncentrace draslíku na obou stranách membrány stejné (viz obr. 2.6), je proud kanálu nulový, je-li potenciál aplikovaný do mikropipety asi –85 mV. Za tohoto stavu je koncentrační gradient, jenž by jinak měl za následek výlev draslíku kanálem, přesně vyvážen gradientem elektrického potenciálu, který má tendenci přesouvat ionty kanálem v opačném směru. Rozdíl

Iontové kanály a vedení signálů

35

(A)

VC

(B) 0 mV

otevřeno

(F)

6

otevřeno

(C) 20 mV

zavřeno 5 pA (D) −50 mV

otevřeno zavřeno

(E) −100 mV

zavřeno otevřeno

proud vkanálu (pA)

zavřeno 4

2

−100 −75 −50

v elektrickém potenciálu, který přesně vyvažuje rozdíl koncentrace iontů, se nazývá rovnovážný potenciál draslíku (EK). Je třeba zdůraznit, že rovnovážný potenciál závisí pouze na iontových koncentracích na obou stranách membrány, ne na vlastnostech kanálu či na mechanismu propustnosti iontu kanálem.

Nernstova rovnice Jak je přesně velký elektrický potenciál požadovaný k vyvážení daného rozdílu koncentrace draselných iontů přes membránu, aby byl čistý tok iontů nulový? Dalo by se např. odhadnout, že by hodnota EK mohla být přímo úměrná rozdílu mezi vnitřní ­koncentrací [K]i a vnější koncentrací [K]o. Není to tak úplně pravda. Rovnovážný potenciál závisí spíše na rozdílu mezi logaritmy těchto koncentrací a dá se vyjádřit vztahem: .

Konstanta k je dána vztahem RT/zF, kde R je termodynamická plynová konstanta (8,31 J/K.mol), T teplota v kelvinech, z iontová valence (v tomto případě +1, ale např. u chloridových aniontů je rovna –1) a  F je Faradayův náboj (velikost elektrického náboje v 1 molu jednomocného iontu: 96 000 C/mol). Odpověď je tedy:

RT zF

(ln [K ]o −

)

ln [K ] i ,

což se dá vyjádřit jako: EK =

RT ln zF

25

50

−2 terčíkový potenciál (mV)

čas

EK =

−25

[K ] o [K ] i

.

Uvedený vztah se označuje jako Nernstova rovnice pro rovnovážný potenciál draselných iontů. Část výrazu RT/zF má jednotky ve voltech a rovná se asi 25 mV při obyčejné teplotě (20 °C). Někdy je vhodnější použít pro základ koncentračního poměru

Obr. 2.7 Reverzní (rovnovážný) potenciál pro draslíkové proudy v hypotetickém experimentu, v němž se měří proudy v terčíku vnějškem ven při koncentraci draselných iontů v roztoku v mikropipetě (intracelulární koncentrace) 90 mmol/l a v roztoku lázně 3 mmol/l (extracelulární koncentrace). (A) Záznamová aparatura jako na  obr. 2.6. (B) Pokud se na mikropipetu neaplikuje žádný elektrický potenciál, vyvolává průchod draselných iontů z elektrody do lázně preparátu po svém koncentračním gradientu proudy draslíkovými kanály směrem ven. (C) Aplikuje-li se na mikropipetu potenciál +20 mV, amplituda draslíkových proudů ven z mikropipety vzrůstá. (D) Aplikace potenciálu –50 mV na pipetu draslíkové proudy ven snižuje. (E) Při potenciálu –100 mV jsou proudy obrácené, draselné ionty tedy proudí do mikropipety proti svému koncentračnímu spádu. (F) Vztah proud–napětí naznačuje nulový proud draselných iontů při –85 mV, což je rovnovážný potenciál draslíku (EK).

36

Kapitola 2 spíše než přirozený logaritmus (ln) logaritmus dekadický (log). Výraz RT/zF se pak musí vynásobit ln (10) neboli hodnotou 2,31, takže RT/zF má hodnotu 58 mV. To lze shrnout takto: E K = 25 ln

[ K] o [ K]i

= 58 log

[ K ]o [K ] i

.

Při tělesné teplotě savců (37 °C) se hodnota 58 mV zvyšuje asi na 61 mV. U buňky na obr. 2.7 odpovídá hodnota EK (–85 mV) danému koncentračnímu poměru draselných iontů (1  :  30). Zde je na místě rovněž poznamenat, že se míra difuze iontu podél koncentračního gradientu nevztahuje pouze k jeho koncentraci samotné. Ve všech roztocích, kromě těch zcela nejslabších, jsou ionty ve vzájemných interakcích (např. díky vzájemné elektrostatické přitažlivosti či odpudivosti). Výsledkem takových interakcí je, že se účinná koncentrace iontu snižuje. Tato účinná koncentrace se nazývá aktivitou iontu. Nernstova rovnice by se měla zapisovat spíše poměrem aktivit iontu než poměrem koncentračním. Protože jsou ale celkové koncentrace všech iontů uvnitř a vně buňky podobné (kapitola 5), poměr aktivit pro kterýkoliv konkrétní iont se nikterak neliší od jeho koncentračního poměru.

Hnací síla iontů přes membránu Obrázek 2.7F naznačuje významnou vlastnost průtoku proudu iontovými kanály: bez aplikace potenciálu má iontový proud směrem ven hodnotu téměř 4 pA a při napětí –85 mV aplikovaném na mikropipetu je proud nulový. Iontový proud tedy není poháněn absolutním membránovým potenciálem, ale spíše rozdílem mezi membránovým potenciálem (Vm) a rovnovážným potenciálem pro daný iont, v tomto případě draslík (EK). Tento rozdíl Vm – EK představuje hnací sílu (driving force) pro pohyb iontů kanálem. Opět s odkazem na obr. 2.7F, je-li membránový potenciál nulový, hnací síla je +85 mV.

Nelineární vztah mezi proudem a napětím Druhou vlastností vztahu proud–napětí na obr. 2.7F je, že na rozdíl od vztahu na obr. 2.6E není lineární. Jak se od rovnovážného potenciálu vzdalujeme směrem k depolarizaci (tj. k nule), mění se proud rychleji, než kdybychom se pohybovali v hyperpolarizačním směru. Je tomu tak především kvůli závislosti vodivosti na koncentraci iontů. Koncentrace draselných iontů uvnitř pipety je mnohem vyšší než ve vnějším roztoku. Proto je pro přenos proudu směrem ven dostupných více iontů než pro jeho přenos dovnitř. Čím více se od rovnovážného potenciálu vzdalujeme, tím je tento efekt výraznější, a proto se vztah proud–napětí vyznačuje stále strmější křivkou dokonce i tehdy, jako u tohoto příkladu, je-li propustnost kanálu na napětí zcela nezávislá. Nelineární vztahy mezi proudem a napětím existují také v některých iontových kanálech z toho důvodu, že tyto kanály samy usměrňují tok proudů, tzn. že jejich propustnost závisí na napětí. Takové kanály buňkám umožňují, aby ionty procházely jedním směrem mnohem snadněji než druhým. Příkladem je draslíkový kanál citlivý k napětí, který se označuje jako kanál usměrňující (tok draselných iontů) dovniř (buňky) (dovnitř usměrňující kanál; inward rectifier channel). Tento kanál umožňuje, aby ionty snadno vstupovaly do buňky za podmínek, kdy je membránový potenciál negativní vzhledem k rovnovážnému potenciálu draslíku, ale pokud je rozdíl v potenciálu obrácený, dovoluje jejich výstup ven z buňky jen velmi málo nebo vůbec ne. Proudonapěťový vztah u tohoto kanálu se podobá případu zachycenému na obrázku v boxu 2.1.

Průchod iontů přes iontové kanály Jak vlastně ionty přes iontové kanály procházejí? Jedním způsobem, jakým by k tomu mohlo docházet, je prostá difuze iontu pórem kanálu vyplněným vodou. Difuze sice vytvořila základy prvních představ o průchodu iontů, ale u většiny kanálů pro tento proces dostatečný popis neposkytuje. Je tomu tak proto, že samotné kanály jsou s ionty ve vzájemných interakcích. Například protože jsou ionty nabité, jsou v roztoku vždy obklopeny molekulami vody (viz obr. 2.1). V případě kationtů jsou molekuly vody orientovány tak, že jejich atomy kyslíku, které nesou záporný náboj, těsně přiléhají k iontům. Pokud je

Iontové kanály a vedení signálů

Měření vodivosti kanálů

V

ědci často tvrdí, že určitý kanál má svoji charakteristickou vodivost, řekněme 100 pS. Protože vodivost závisí na  koncentraci, neposkytuje nám takové tvrzení dostatek informace, neznáme-li iontové podmínky, za  kterých se dané měření provádělo. Uvažujeme-li např. draslíkový kanál při koncentraci draslíku 150 mmol/l na obou stranách membrány, pak lze ve  fyziologických podmínkách, tedy při pouhých 5 mmol/l na  extracelulární straně, očekávat vodivost 5–10× menší. Druhá potíž vzniká, jestliže vztah mezi proudem a napětím není lineární, jako např. na  obr. 2.7, kdy iontové koncentrace na  obou stranách kanálu nejsou symetrické, nebo jako na obrázku zde, kdy je kanál výrazně usměrňující. Vodivost kanálu γ sice definujeme jako sklon křivky vztahu proud–napětí, γ = I/V, ale uvedená definice se za těchto podmínek stává nejednoznačnou, protože sklon této křivky není konstantní. Experimentátoři zpravidla volí dva způsoby, jak v  takových případech vodivost specifikovat. První spočívá v  tom, že se udržuje napětí přes membránu terčíku na  určité hodnotě a  měří se výsledný průtok kanálem. Na  obrázku 2.7 má rovnovážný potenciál hodnotu –75 mV. Je-li terčík udržován pod napětím –25 mV, rovná se elektrický proud kanálem 0,6 pA. Hnací síla o  hodnotě 50 mV tedy generuje iontový proud o velikosti 0,6 pA a vodivost kanálu je 0,6 pA/50 mV = 12 pS. Tento výpočet představuje sklon hnědé čáry na obrázku, která se označuje jako tětivová vodivost (chord conductance). Všimněte si, že je nezbytné uvádět, při jakém membránovém potenciálu se měření provádělo. Tětivová vodivost při poten­ ciálu –25 mV není stejná jako tětivová vodivost při 0 mV. Druhý způsob specifikace vodivosti spočívá v měření sklonu křivky dané vztahem proud–napětí, a to v intervalu, který

1 proud vkanálu (pA)

Box 2.1

37

−100

−75

−50

−25

25 −1 −2 −3

terčíkový potenciál (mV)

nás konkrétně zajímá. Je to přímka vyznačená na  obrázku přerušovanou čárou, tzv. směrnicová vodivost (slope conduc­ tance), jež u tohoto příkladu činí asi 3 pS při napětí –25 mV. Měření zachycené v  grafu nám ukazuje, že i  když kanál pro­pouští při napětí –25 mV proud o určité intenzitě, nepropouští úměrně více proudu, pokud vzrůstá hnací síla. Souhrnně lze říci, že vodivostní charakteristiky určitého typu kanálu můžeme v  úplnosti specifikovat pouze tak, že ukážeme úplný vztah mezi proudem a napětím a zároveň iontové podmínky, za nichž byl vztah získán. Obecně lze říci, že jednotlivá čísla uváděná v literatuře pro vodivost kanálu obvykle ukazují tětivovou vodivost. Asi nejužitečnější konvencí pro srovnávání vlastností jednotlivých typů kanálů v  literatuře by bylo uvádět směrnicovou vodivost při rovnovážném potenciálu za specifikovaných iontových koncentrací.

pór kanálu relativně úzký, musí iont získat určité množství energie, aby unikl z tohoto sevření molekulami vody a protlačil se hrdlem kanálu (kapitola 3). Je-li iont už v kanálu, mohou jej přitahovat nebo odpuzovat elektrostatické náboje zbytků aminokyselin lemujících stěnu kanálu anebo může být vázán do míst, z nichž se posléze musí vymanit, aby mohl v cestě kanálem pokračovat. Takové interakce ovlivňují iontovou selektivitu a rychlost průniku iontu kanálem. Teoretické modely popisující tímto způsobem prostup iontů kanálem se označují jako modely Eyringovy teorie reakčních rychlostí.9 Tyto teorie jsou při popisu selektivity a vodivosti kanálů obecně úspěšnější než matematické modely založené na prosté difuzi iontů.

Význam iontových kanálů Řada typů kanálů popsaná v této kapitole umožňuje nervovým buňkám získávat signály z vnějšího světa nebo z jiných neuronů, přenášet je na dlouhé vzdálenosti, modulovat aktivitu dalších neuronů a cílových orgánů a měnit vlastní signální vlastnosti v reakci na vnitřní metabolické změny. Veškeré procesy vnímání a analýzy signálů, stejně jako vytváření motorických výstupů z nervového systému jsou určovány aktivitou iontových kanálů. Důležité je zapamatovat si, že všechny toky iontů přes membrány, které jsou podkladem dráždivosti, probíhají díky iontům, které se otevřenými kanály pohybují pasivně ve směru svých koncentračních a potenciálových gradientů. Jinými slovy, neuron vy­užívá k  vytváření iontového pohybu přes membrány, a  tedy k  tvorbě elektrických

9

Johnson, F. H., Eyring, H. a Polissar, M. J. (1954): The Kinetic Basis of Molecular Biology. Wiley, New York.

38

Kapitola 2 signálů stávajících elektrochemických gradientů na těchto membránách. Takové pasivní toky iontů přes membrány by se měly nakonec teoreticky vyplýtvat (dissipovat), ale k tomu v živých systémech nedochází, protože buňky využívají pro aktivní údržbu a obnovu iontového složení cytoplazmy energii získanou metabolickými procesy. O specializovaných mechanismech, které zajišťují aktivní transport iontů přes buněčné membrány, pojednáváme v kapitole 4.

S ouhrn ■

Elektrické signály v  nervovém systému jsou vytvářeny prostřednictvím pohybu iontů přes membrány nervových buněk. Tyto iontové proudy protékají hydrofilními póry membránových proteinů, které známe pod označením iontové kanály.

■ Kanály lze třídit podle způsobu aktivace: aktivované mechanickým napínáním, napětím nebo ligandem.

■ Ionty se kanály pohybují pasivně podél svých koncentračních a elektrických gradientů napříč membránou.

■ Kanály se různí ve své selektivitě. Některé kationtové kanály umožňují, aby jimi procházely jen sodné, draselné nebo vápenaté ionty; jiné jsou méně selektivní. Aniontové kanály jsou relativně neselektivní pro menší anionty, ale propouštějí hlavně ionty chloridové, protože ty jsou velmi hojné v extracelulárních i intracelulárních tekutinách.

■ Čistý průtok iontů kanálem daný koncentračním gradientem

■ Kanály kolísají mezi otevřeným a uzavřeným stavem. Každý

lem mezi rovnovážným potenciálem tohoto iontu a membránovým potenciálem. Iontový průtok proudu jediným kanálem závisí na hnací síle a vodivosti tohoto kanálu pro daný iont. Vodivost zase závisí na skutečné iontové propustnosti kanálu a na vnitřní a vnější koncentraci iontu na membráně.

kanál má svoji typickou střední (průměrnou) dobu otevření. Po aktivaci kanálu pravděpodobnost otevření prudce vzrůstá. Kanály mohou být také inaktivovány či blokovány rozličnými mechanismy.

se může snižovat opačným elektrickým gradientem. Elektrický potenciál, který čistý průtok snižuje na nulu, se nazývá rovnovážný potenciál pro daný iont. Vztah mezi rovnovážným potenciálem a koncentračním gradientem je dán Nernstovou rovnicí.

■ Hnací síla pro pohyb iontu přes membránu je dána rozdí-

Doporučená literatura Hille, B. (1992): Ion Channels in Excitable Membranes. 2nd ed. Sinauer, Sunderland, MA, pp. 291–314. Pun, R. Y. K., a Lecar, H. (1998): Patch clamp techniques and analysis. In N. Sperelakis (ed.), Cell Physiology Source Book, 2nd ed. Academic Press, San Diego, CA, pp. 391–405.