1627 UMU. Lampiran 4. 1 Draft Publikasi I

1627 UMU

36

Lampiran 4. 1 Draft Publikasi I

Transplantasi Sel Ponca .Mesenkimal Pada Lesi Spondilitis Tuberkulosis Kelinci : Telaah Pada Aktifitas Sel Osteoblas Melalui Biomarker CBFA-1, ALP dan OPN. *R ahyussal irn , **Tri Kumiawati, ***Nuryati Chairani, *** Sutjahyo,

*Ismail,

****Diah lskandriati, *****Ami

*Errol Diana Fitri

U.

Hutagalung,

*Departemen Orthopaedi dan Traumatolog i Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia **Kiaster Stem Cell and Tissue Engineering, MERC Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia ***Departernen Patologi Anatom ik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia * * **Pusat Studi Satwa Primata lnstitut Pettanian Bogor *****Rumah Sakit Hewan lnstitut Pertanian Bogor

ABSTRAK Latar Belakang : Debris bakteri JV!ycobacterium tuberculosis tidak memengaruhi pertumbuhan sel punca mesenkimal (SPM) secm·a in vitro. Penelitian ini ingin mengamati secara in vivo pengaruh bakteri Mycobacterium tuberculosis terhadap ekspresi marker osteoblas yaitu core binding factor alfa-1 (CBF A-1 ) , sekresi alkaline phosfatase (ALP) dan osteopontin (OPN). Metode : Enam ekor kelinci spondilitis tuberkulosis (ST) dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kultur, PCR, dan histopatologi (KPH) positif sebagai perlakuan (n 3) dan kelompok PCR dan histopatologi (PH) positif sebagai kontrol (n 3). Kedua kelompok ini menjalani prosedur intervensi penatalaksanaan, transplantasi SPM dan pemberian obat anti tuberkulosis (OAT). Setelah enam minggu dilakukan evaluasi terhadap marker CBFA-1 , ALP dan OPN. Hasil pemeriksaan diuji secm·a statistik dan dievaluasi total skor aktifitas osteoblas. Hasil : Hasil pemeriksaan Elisa ALP dan OPN darah kelinci keduanya nihil. Hasil pemeriksaan ·JHK ALP dan OPN seluruh sampel kelompok perlakuan dan kontrol seluruhnya posit if Hasil pemeriksaan IF CBF A-1 jaringan lesi kelompok perlakuan positif pada seluruh sampel (3/3), sedangkan pada kelompok kontrol hanya 2 dari 3 sampel yang positif (2/3). Rerata total skor kelompok perlakuan dan kontorl berturut-turut adalah 160 dan 145. Kesimpulan : Keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis memberikan pengaruh yang berbeda terhadap aktifitas sel osteoblas dalam mengekspresikan dan mensekresikan markernya. Pada kedua kelompok kelinci terlihat bahwa ekspresi marker CBFA-1 dan sekresi marker OPN tidak terhambat oleh keberadaan bakteri, tetapi sekresi marker ALP tampak mengalami hambatan. Hasil sko,ring memperlihatkan keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis justru mendukung aktifitas sel osteoblas. ==

==

Kata Kunci : Mycobacterium tuberkulosis; spond ilitis tuberkulosis, sel punca mesenkimal, aktifitas osteoblas, CBFA-1 , ALP, OPN.

U n iversitas Indonesia

..,

·

j

· -__________

37

Pendahuluan

Spondilitis tuberkulosis (ST) adalah penyakit infeksi pada tulang belakang yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis. Spondilitis tuberkulosis mengakibatkan kerusakan korpus (defek) yang menirnbulkan i nstabilitas tulang belakang dan gangguan struktur di sekitarnya. Penyembuhan inf:eksi bakteri pada spondilitis tuberkulosis d ipengaruhi oleh seberapa berat kerusakan korpus dan infeksi bakteri tersebut di tulang belakang. 1 Selama ini upaya penatalaksanaan kasus spondilitis tuberkulosis yang disertai kerusakan korpus dilakukan melalui pendekatan operatif: 1 ,3 tetapi pada beberapa kasus belum memberikan hasil yang memuaskan karena tidak tercapainya fusi, sehingga potensi sel punca mesenkimal dalam proses pembentukan tulang baru dan menclukung fusi tulang belakang terus 5 dikembangkan. 3•9• 14' 1 Sel punca mesenkimal dapat dikultur secara in vitro dan berdiferensiasi menjadi osteoblas, suatu sel pernbentuk tulang. 9•1 5 Pada lingkungan in vitro yang secm·a mikroskopis rnengandung debris bakteri Mycobacterium tuberculosis telah terbukti bahwa sel punca rnesenkimal tidak mengaiami gangguan pertumbuhan yang berarti. 21 Tujuan penelitian ini aclalah untuk melihat pengaruh keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis hidup terhadap diferensiasi sel punca mesenkimal menjadi osteoblas secara in vivo pada model kelinci sponc!ilitis tuberkulosis.

Aktifitas

mengekspresi dan

osteoblas

diamati

melalui

mensekresi marker-markernya

kemampuannya

dalam

yaitu

CBF A-1, Alkalin phosfatase dan Osteopontin baik eli darah maupun di jaringan lesi. 1 1•1 2•16•18

Metode

Penelitian ini rnerupakan penelitian intervensi pada kelinci, se)uruh protokol telah direview dan disetujui oleh Komisi Animal Care and Use Committee (ACUC) PT. Bimana Indomedical No. R.02-12-IR dan Komisi Pengawasan dan Kesejahteraan Penggunaan Hewan Percobaan (KPKPHP) Rumah Sakit Hewan (RSH) IPB No. 02-2 1 0 12 RSH IPB dan Komite Etik Penelitian Kesehatan FKUI-RSCM No. 521/PT02.FK/ETIK/2012. Sebagian besar peneJitian ini menggunakan fasihtas

Universitas Indonesia

38

hewan di RSH IPB, PT Bimana Indomedical, laboratorium Mikrobiologi Klinik FKUI dan laboratorium Patologi Anatomik FKUI. Sampel penelitian ini adalah kelinci spondilitis tuberkulosis yang dibuat langsung bakteri Mycobacterium tuberculosis 7 2 ke dalam korpus vertebranya. 2•6• •8•10• 0 Enam ekor kelinci spondilitis tuberkulosis mengikuti suatu prosedur inokulasi

(ST) dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kultur, PCR, dan histopatologi (KPH) positif sebagai kelompok perlakuan (n

=

3) dan kelompok PCR dan

histoptologi (PH) positif sebagai kelompok kontrol (n 3). Kedua kelompok kelinci mendapatkan perlakuan TTSSA6, 1 pemberian OAT,1 penempatan skafold =

hidroksi apatit dan transplantasi sel punca mesenkimal pada korpus vertebra yang terinfeksi. Selama vvaktu inkubasi dilakukan pemeriksaan klinis, sedangkan pengamatan aktifitas osteoblas dilakukan setelah kelinci di eutanasia pada minggu ke-6

pasca

transplantasi

sel

punca

mesenkimal

melalui

pemeriksaan

imunofluresens CBF A-1 jaringan lesi, pemeriksan imunohistokimia alkalin phosfatase (ALP) dan osteopontin (OPN) jaringan lesi serta pemeriksaan Elisa ALP·dan OPN darah. Pemeriksaan ALP dan OPN dari jaringan lesi korpus kelinci dilakukan secm·a imunohistokimia dengan metode Streptavidin-HRP. Slide diamati

di

bawah

mikroskop dengan pembesaran 400x dan hasilnya dibandingkan dengan kontrol positif Hasil pemeriksaan ALP dinyatakan positif jika terdapat gambaran berwarna kecoklatan yang sesuai dengan gambaran kontrol yang berasal dari jaringan sarcoma, sedangkan hasil pemeriksaan OPN dinyatakan positif jika terdapat gambaran berwarna kecoklatan yang sesuai dengan gambaran kontrol yang berasal dari jaringan breast cancer. Pemeriksaan CBF A-1 dari jaringan lesi korpus kelinci dilakukan secara imunofluoresens dengan cara melekatkan jaringan lesi spondilitis tuberkulosis segar di atas kaca objek, kemudian direaksikan dengan

antibodi

menggunakan

primer

dicuci

sebelum

diamati

antibodi

dan

fluoresens (goat anti rabbit lgG-CFL) dan diinkubasi kembali selanjutnya

ditambahkan

diinkubasi

berlabel

Slide

selanjutnya

(RUN X-12),

sekunder

dikeringkan.

PBS,

CBFA-1

dengan

mikroskop

fluoresens

menggunakan pembesaran 400x dan hasilnya dibandingkan dengan kontrol


39

positif. Hasil dinyatakan positif jika terdapat gambaran sel yang berpendar hijau yang sesuai dengan gambaran kontrol. Analisis hasil pemeriksaan marker-marker osteoblas diuji secara statistik dan ditentukan skor aktifitas osteoblas.

Hasil Hasil Pemeriksaan ALP dan OPN Darah Kelinci ST

Hasil pemeriksaan ALP dan OPN menggunakan metode Elisa dari darah kelinci spondilitis tuberkulosis pada semua kelompok kelinci tidak dapat terukur karena konsentrasinya lebih rendah dari konsentrasi standar terendah yang digunakan sehingga hasil ini secara statistik tidak dapat dianalisis. Tetapi nilai absorbansi yang terukm pada pengukuran optical density dan warna larutan menunjukan adanya reaksi, sehingga dilakukan analisis terhadap nilai absorbansi tersebut walaupun pada penghitungan kadar tidak terukur.

b

a

Gambar l .Hasil Pemeriksaan Elisa. a : Hasil pemeriksaan Elisa ALP : larutan benvarna biru menunjukkan adanya aktifitas enzim ALP dalam larutan. Panah merah dan biru memmjukkan wama larutan standar ALP, panah kuning menunjukkan warna larutan sampel yang mengandung ALP yang tidak terdeteksi oleh optical density meter. b : Hasil pemeriksaan Elisa OPN : Jarutan berwarna kuning menunjukkan keberadaan OPN dalam larutan. Panah merah dan biru menunjukkan wama larutan standar OPN, panah kuning menunjukkan warna larutan sampel yang mengandung OPN yang tidak terdeteksi oleh optical density meter.

Rerata nilai absorbansi ALP dari darah kelinci kelompok perlakuan adalah 0.062A (SD

=

0.0134) dan dari kelompok kontrol adalah 0 . 1 09A (SD

Secara statistik nilai asorbansi dua kelompok

Unrversitas Indonesia

ini

=

0.094).

tidak tidak dapat dibandingkan.

40

Rerata nilai absorbansi

OPN dari darah kelinci kelompok perlakuan adalah

0,051A (SD = 0.009) dan kelompok kontrol adalah 0.050A (SD 0.013). Secara statistik nilai asorbansi kedua kelompok inipun tidak tidak dapat dibandingkan.

Hasil Pemeriksaan ALP, OPN dan CBFA-1 Jaringan Lesf Kelinci ST

Gambar

2.

Hasil

Pemeriksaan Marker

tuberkulosis. Gambar

2a,

Osteoblas

pada Jaringan

b dan c adalah hasil pengamatan IHK

Lesi

Kelinci

Spondilitis

ALP kelompok PH positi f

(kontrol) dan gambar 2d, e dan f adalah hasil pengamatan IHK ALP kelompok KPH positif (perlakuan), sedangkan gambar 2g adalah hasil IHK ALP kontrol positifyang berasal dari jaringan sarcoma. Gam bar 2h, i dan j adalah hasil pengamatan IHK OPN kelompok PH positif (kontrol) dan gambar

2k, I

dan m adalah hasil pengamatan IHK OPN ke!ompok KPH positif (perlakuan),

sedangkan gambar 2n adalah hasil IHK OPN kontrol positif yang berasa! dari jaringan breast

cancer. Gam bar 2o, p dan

q adalah h asi l pengamatan IF CBFA-1

kelompok PH positif (kontrol)

dan gambar 2r, s dan t adalah hasil pengamatan IF CBFA-1 kelompok KPH positif, sedangkan gambar 2 u adalah hasil IF CBFA-1 kontrol positif . Tampak jejeran sel osteoblas ditunjukkan oleh panah biru yang dapat dilihat pada hasil pemeriksaan masing-masing kelompok kelinci ST. Skafol hidroksi apatit ditunjukkan oleh panah kuning yang dapat diamati pada hasil pemeriksaan masing

masing kelompok kelinci ST. Hasil pemeriksaan lHK positif ditunjukkan oleh panah hijau yang memberikan gambaran yang mirip pada hasil pemeriksaan Pendar hijau pada hasil pemeriksaan

IF ditunjukkan

JHK

kontrol (ALP maupun OPN).

oleh panah coklat yang menyerupai gambaran

pada hasil pemeriksaan IF kontrol.

Basil pemeriksaan imunohistokimia ALP jaringan lesi yang diambil dari kelinci kelompok perlakuan dan kelompok kontrol gambaran

berwarna

kecoklatan

yang

seluruhnya menunjukkan

menyerupai

kontrol

positif.

adanya Hasil

pemeriksaan imunohistokimia OPN jaringan lesi yang diambil dari kelinci kelompok perlakuan dan kelompok kontrol gambaran

berwarna

kecoklatan

pemeriksaan imunofluoresens

yang

seluruhnya menunjukkan

menyerupai

kontrol

positif.

adanya Hasil

CBF A-1 jaringan lesi yang diambil dari kelinci Universitas Indonesia

41

perlakuan seluruh sampel menunjukkan adanya pendar hijau pada sel osteo bias yang menyerupai kontrol positif: dan pada kelompok kontrol hanya 2 dari 3 sampel yang menunjukkan adanya pendar hijau pada sel osteoblas. Tabell. Evaluasi Marker Sel Osteoblas; ALl\ OPN dan CBFA-Idalam D
Kelompok

kontrol p

n=3

rerata =SO

n=J

rerata ± S O

Kadar ALP Oarah Kelinci

3

0

3

0

na

Nilai Abs ALP Oarah

3

0,062 ± 0,0134

3

0,109±

na

ALP Jaringan Tulang

3

3/3

3

3/3

na

Kadar OPN Oara h

3

0

3

0

na

Nilai Abs OPN Oarah

3

3

0,050 ± 0,013

na

OPN Jaringan Tu!ang

3

3/3

3

3/3

na

Cbfa-1 Jaringan Tulang

3

3/3

3

2/3

na

Skor total rata2

3

160

3

145

0,051

±

0,009

0,094

Pembahasan

Secara natural usaha penyembuhan defek melalui proses pembentukan tulang

baru

dimulai pada saat defek itu tetjadi, dimana te1jadi hannonisasi diferensiasi sel punca mesenkimal internal menjad i sel osteoblas. 9• 1 5 Istilah sel punca mesenkimal internal digunakan untuk membedakannya dengan sel punca mesenkimal (SPM) yang ditransplantasikan dari luar tubuh. Osteoblas melakukan aktifitas dengan mengekspresikan CBFA-1 , , . , ts Osteopontin. ' 1 1 2 1 6

mensekresikan

alkaline

phosphatase

dan

Pada tahap awal CBF A-1 dapat dideteksi didalam sel, sementara ALP dan OPN dapat ditemukan diluar sel. Aktifitas sel osteoblas kemudian menginduksi pembentukan tulang baru dan menginisiasi aktifitas sel osteoklas sehingga terjadi proses remodelling tulang. 7 Proses itu

berjalan sedemikian rupa sehingga

keseimbangan aktifitas osteoblas dan osteoklas menghasilkan pembentukan tulang baru.8 Namun keseimbangan ini kadangkala gaga! dipertahankan karena berbagai gangguan antara lain oleh bakteri dan respon

imun tubuh terhadap bakteri. 1 7

Keberadaan bakteri ummm1ya akan memutus rantai keseimbangan osteoblas dan


42

osteoklas. Beberapa bakteri dapat menyebabkan perubahan arab diferensiasi SPM menjadi osteoblas, mengakibatkan perlambatan proliferasi osteoblas dan produksi matriks tulang. Bakteri juga akan meningkatkan aktifitas osteoklas sehingga terjadi ketidak seimbangan pembentukan matriks dan proses remodelling tulang, akibatnya terjadi destruksi tulang yang ditandai dengan turunnya produksi matriks tulang dan kalsium. 7'8' 1 7 Pemberian OAT ditujukan untuk membunuh bakteri Mycobacterium tuberculosis dan menghambat proliferasinya, sedangkan intervensi TTSSA6 dilakukan untuk mengurangi debris dan jaringan nekrotik, 1 sehingga diharapkan dapat memberikan peluang bagi pembentukan sel osteoblas dalam rangka memperbaiki defek pada korpus vertebra. 14 Sementara penambahan skafold hidroksi apatit 1 9 dan SPM secara langsung ke dalam defek bertujuan untuk semakin membuka peluang diferensiasi SPM menjadi osteoblas dan meningkatkan aktifltasnya menUJ U pembentukan tulang baru yang akan mendukung perbaikan defek pada korpus vertebra. 3 •9· 1 4• 1 5 Hal ini sesuai dengan hasil penelitian secara in vitro yang telah dilakukan dimana keberadaan debris clan supernatan bakteri Mycobacterium tuberculosis terbukti tidak mempengaruhi pertumbuhan sel punca mesenkimal jika clikultur secara bersama-sama. 2 1 Hasil

pada

tabel

2

menunjukkan

bahwa

aktifitas

osteoblas

dalam

mengekspresikan CBFA-1 tidak mend apat hambatan o leh bakteri Mycobacterium tuberculosis, bahkan dibandingkan dengan kelompok kontrol terlihat bahwa keberadaan bakteri ini memberi dampak baik pada

sel osteoblas clalam

mengekspresikan CBFA-1 . Berbeda dengan aktifitas sel osteoblas dalam mensekresikan ALP dan OPN, keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis tampaknya menghambat aktifitas osteoblas dalam mensekresikan ALP, namun ticlak menghambat aktifitas osteoblas dalam mensekresikan OPN. Pemeriksaan kadar ALP dan OPN dari darah kelinci ST menggunakan metode elisa untuk semua grup kelinci yang diberikan SPM maupun yang tidak diberikan SPM memberikan hasil nihil. Hasil ini menunjukkan bahwa prosedur p TTSSA6 dan pemberian SPM secara lokal tidak memberikan efek sistemik, sehingga


43

peningkatan aktifitas osteoblas tidak dapat terdeteksi secara sistemik melalui pemeriksaan darah. Hasil skoring menunjukkan bahwa rerata total skor kelompok kontrol adalah 145, sementara rerata total skor kelompok perlakuan

adalah 160. ·Kedua kelompok

memperlihatkan aktifitas osteoblas yang sama-sama aktit: artinya tidak ada pengaruh keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis terhadap aktifitas osteoblas dalam mengekspresi dan mensekresi marker-markernya, dan jika dibandingkan hasil rerata total skor aktifitas osteob]as antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol terlihat bahv.'a keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis justru mendukung peningkatan aktifitas osteoblas d i dalam jaringan lesi.

Kesimpulan

Keberadaan bakteri A{ycobacterium tuberculosis tidak mempengaruhi diferensiasi sel punca mesenkimal menjadi osteoblas dan diferensiasi osteoblas menjadi osteosit pada jaringan lesi korpus vertebra. Belum tetjadi respon sistemik yang terdeteksi dalam darah yang menunjukkan aktitl.tas sel osteoblas dalam proses penyembuhan infeksi spondilitis tuberkulosis dan remodeling tulang baru dalam rangka perbaikan defek . Berdasarkan hasil evaluasi terhadap marker osteo bias (CBFA-1 , ALP dan OPN) dan evaluasi skoring aktifl.tas osteoblas diketahui bahwa bakteri lvfycobacterium tuberculosis memberikan dampak posit if terhadap peningkatan aktifitas sel osteoblas pada jaringan lesi.

Saran

Diperlukan penelitian Janjutan pada tingkat molekuler dan sel untuk melihat diferensiasi sel punca mesenkimal menjadi osteoblas pada lingkungan bakteri Mycobacterium tuberculosis berkaitan dengan aktifitasnya dalam mendukung proses pembentukan tulang baru dan fusi.


44

Daftar Pustaka I.

Sapardan, S. 2004. Total Treatment of Tuberculosis of The Spine. A Rational Problem Solving Approach. Pe1pu stakaan Unive rsitas Indonesia .

2.

Zhang G, Zhu B, Shi

\V,

Wang M, Da Z, Zhang Y. 2010. Evaluation of

Mycobacterial virulence using rabbit skin liquef�1ction model. Virulence, 1 (3); 156-163.

3.

Gottfried ON, Dailey AT. Mesenchymal Stem Cell and Gene therapies tor Spinal Fusion. Topic Review. Neu rosu rge1y 200 8;63-3.

4.

Orme I and Juarrero MG. Animal Models of Mycobacterium tuberculosis Intection. Current Protocol in Microbiology. John Wiley and Son Inc, 200 7.

5.

Poelstra KA, Barekzi NA, Grainger DW, Gristina AG, Schuler TC. A Novel Spinal Implant Infection Model in Rabbits. SPINE 2000 ;25(4); 40 6-410 .

6.

Bieny G, et al. Percutaneous Inoculated Rabbit Model o f lntervertebral disc space infection: Magnetic Resonance Imaging Features with Pathological Correlation. Joint Bone Spine 200 8; 75: 465-470.

7.

Chan JK. A Study of Osteocyte Apoptosis by Region and Quadrant i n Murine Cortical Bone. 20 11. Faculty o f Ca l�fornia Polytechnic State Unive rsity, San Lui:.,· Obispo.

8.

Arantzazu M, et al. Osteoclast Control Osteoblast Chemotaxis via PDGF BB/PDGF Receptor Beta Signaling. Plos One 200 8:3.

9.

Leonardi E, et al. Osteogenic properties of late adherent sub populations of human bone marrow stromal cells. Histochem Cell Bioi 200 9; 132: 547-557.

10 .

Zychowicz

ME.

Osteoarticular

Manifestations

of

Mycobacterium

Tuberculosis Infection. Orthopaedic Nu rsing 20 10 ;29(6). 11.

Kawakami T, Kimura A, Hasegavva H, Eda S. Immunohistochemical Determination of Osteopontin Expression in Neoplastic Cells. O ral 1l1ed Pathol 1998;3:7 5-7 8.

1 2.

Tigrani, DY and Weydert JA. Inummohistochemical Expression of Osteopontin

in Epithelioid Mesotheliomas and Reactive Mesothelial

Proliferations. Am J Clin Pathol 2007; 127 :580 -584.


45

13.

Nather A, David V, Teng J, Lee C, Pereira B. Effect of Autologous Mesenchymal Stem Cells on Biological Healing of Allografts in Critical sized Tibial Defects Simulated in Adult Rabbits. Ann Acad Med Singapo re 20 10;39:599-60 6.

14.

Vats A, To!Jey NS, Buttery DK, Polak JM. The Stem Cells in Orthopaedic Surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery (BR) 2004;86B(2): 1 59-1 64.

15.

B ilousova G, et al. Osteoblasts derived fi·om Induced Pluripotent Stem Cells form Calcified Structures in Scaffolds both in vitro and in vivo. Stem Cell��

16.

Thirunavukkarasu K, et a!. The Osteoblast-specific Transcription Factor Cbfal Contributes to the Expression of Osteoprotegerin, a Potent Inhibitor of Osteoclast Differentiation and Function. The Journal of Biological Chemistry. 2000 ;27 5(33):25163-25172.

1 7.

Nair SP, Meghji S, Wilson M, Reddi K, White P, Henderson B. Bacterially Induced Bone Destruction: Mechanism and Misconception. Infection and Immunity 1996;64(7):23 71-23 80 .

18.

Leung KS, Fung KP, Sher AH, L i CK, Lee KM. Plasma bone-spesific alkaline phosphatase as an indicator of osteoblastic activity. J Bone Joint Su rg B r 1993: 75(2); 288-292.

19.

Bozic K, et al. In Vivo Evaluation of Coralline Hydroxyapatite and Direct Cunent Electrical Stimulation in Lumbar Spinal Fusion. SPINE 19 99; 24 (20): 212 7 2133 -

20.

.

Rahyussalim, Kurniawati T, Rukmana A, Albar I, Fitri AD. The Potential Spread of Mycobacterium tuberculosis into the Environment in the Creation ofTB Spondylitis Rabbit Models.

21.

Mensyuknil

H,

Rahyussalim,

Yuyus K,

Kurniawati

T.

Effect

of

Mycobacterium tuberculosis debris and supernatant on bone marrow stromal cells growth.

U niversitas Indonesia

46

Lampiran Sistem Skoring Aktifitas Osteoblas

Sistem Penilaian Skor Variabel Aktifitas Osteoblas

OPN

ALP

CBFA-1

Hasil

Skor

lesi T l 2

5

Darah

5

lesi T l 2

5

Darah

5

lesi T l 2

5

Hasil

N

N

Skor .

20

20

Hasil

Skor

>N

50

>N

50

>N

50

>N

50

>N

50 250

Total Nilai skor < 100 tidak aktif; nilai skor 1 0 0 sd 175 aktif; nilai skor > 175 Jebih aktif


47

. Jesenchymal Stem Cell Transplantation on Rabbit Tuberculous Spondylitis Lesion: Analysis on Osteoblast Activity Via CBFA-1, ALP and OPN Biomarker *Rahyussalim,

**Tri Kurni awati , ***Nuryati Chairani, ***Sutjahyo, *Errol *Ismail, ****Diah lskandriati, ***** Arni Diana Fitri

U.

Hutagalung,

•

*Department of Orthopaedic and Traumatology Faculty of Medicine University of Indonesia **Stem Cell and Tissue Engineering Cluster, MERC Facu lty of Medicine University of Indonesia ***Department Patologi Anatomic Faculty of Medicine University of Indonesia *** *Primata Research Center Bogor Agricultural Institute *****Veterinary· Teaching Hospital Bogor Agricultural Institute

ABSTRACT Backgrounds: Mycobacterium tuberculosis' (MTb) debris does not affect Mesenchymal Stem Cell's (MSC) growth in vitro. This research observes .\1/ycobacterium tuberculosis' growth toward the expression of marker Core Binding Factor Alpha-1 (CBFA-1), secretion of Alkaline Phosphatase (ALP), and Osteopontin (OPN) in vivo. 1ethods: Six rabbits with Spondylitis Tuberculosis (ST) were divided into two groups: first group having positive Culture (C), PCR (P), and Histopathology (H) hence n 3; while the second group with only positive P ,H considered as the control group. Both groups underwent intervention of treatment, MSC transplantation and anti tuberculous drugs. After six weeks, CBFA-1 , ALP, and OPN were eva-luated. The result was tested statistically to obtain osteoblast's activity total score. Results: ELISA results for ALP and OPN of the rabbits' blood were nil. Immunohistochemistry, ALP, and OPN results for both treatment and control groups were all positive. CBF A-1 immunofluorescence results on the first group were all positive (3/3 ) while only 2 of 3 samples t!·om the control group gave positive results. The mean scores for first and second group respectively, are 160 and 145. Discussion: Existence of Mycobacterium tuberculosis gave different effects on osteoblasts' activities in expressing and secreting their markers. CBF A-1 expression and OPN secretion were not inhibited by Mycobacterium tuberculosis on both groups, while ALP secretion were somehow inhibited. Scoring results show that the existence of Mycobacterium tuberculosis seems to reinforce osteo blasts' activities. =

,

Keywords: Jvfycobacterium tuberculosis, spondylitis tuberculosis, mesenchymal stem cell, osteoblast activity, CBFA- 1 , ALP, OPN.


48

Introduction

Spondylitis tuberculosis is an infection o f Mycobacterium tuberculosis in the spine. Spondylitis tuberculosis causes corpus destruction (defect) which will induce spinal instability and structural disruption near tht:;, lesion. The healing of bacterial infection on spondylitis tuberculosis depends on the severity of the damaged corpus and the bacterial infection on the spine. 1 So far, the treatment for corpus destruction due to spondylitis tuberculosis has been done by surgery, J,3 but on several cases the results have not been satisfying enough because the fusion is not reached. Therefore, the mesenchymal stem cell potency in inducing the formation of nev.r bones and supporting the fusion o f 5 spine i s being developed. 3•9•14'1 Mesenchymal stem cell can be cultured in VIVO and will differentiates into 9 osteoblasts, a bone progenitor. ·15 Microscopically, Mycobacterium tuberculosis' debris in the in vitro enviroru11ent has been proven not to affect the mesenchymal stem cell's growth?1 The aim o f this research is to see the efiect of live Mycobacterium tuberculosis

to

the differentioation of mesenchymal stem cell

towards osteoblast in vivo in the rabbit spondylitis tuberculosis model. Osteoblast activity was observed in its ability to express and secrete its markers which are CBFA-1 , Alkaline Phosphatase and Osteopontin i n the blood and in the lesion tissue_JI,I2,16,18

Methods

This research is an interventional research on rabbit. All protocols have been reviewed and approved by the Animal Care and Use Committee (ACUC) PT. Bimana lndomedical No. R.02-12-IR and Komisi Pengawasan dan Kesejabteraan Penggunaan Hevvan Percobaan (KPKPHP) Rumah Sakit Hewan (RSH) IPB No. 02-2 1 0 1 2 RSH IPB and Health Research Ethic Committee FMUI-Cipto Mangunkusumo Hospital No. 521 /PT02.FK/ETIK/2012. Most of this research were conducted on the animal facility at Animal 1:I- ospital IPB, PT Bimana Indomedical,

Clinical

Microbiology

laboratorium

FMUI and Anatomical

Pathology laboratorium FMUI.


49

Samples are rabbits

v..

rith spondylitis tuberculosis v.ihich underw·ent certain direct

moculation involving Mycobacterium tuberculosis administration to the vertebral .. . . . . . ? 67 8 J o 2o s· IIAIU y .- · 1x spond y1 1t1s tubercu1 osJs rabb Jts were d IV!d ed mto two groups;

-� ·

'

'

·

·

ilaving the first group are the positive Culture (C), PCR (P), and histopathology lH) group as the tirst group (n second group (n the

=

==

3). Meanwhile the P,H positive rabbits are the

2). Both groups experienced the TTSA61 treatment, were given

anti tuberculosis drugs, 1 and transplantation of hydroxyappatite scaffold with

mesenchymal stem cell on the infected vertebral body. During incubation, clinical examination were done, meanwhile osteoblasts' activity observation were held after

the rabbits were euthanised on the 6th week after mesenchymal stem cell

transplantation

by

immunohistochemistry

exammmg

the

CBFA- 1

examination

o f alkaline

immunoflourescence,

phosphatase

(ALP)

and

osteopontin (OPN) on tissue lesion, along with ALP and OPN ELISA on blood. ALP

and

OPN

assay

on

the

rabbits'

tissue

lesion

\:vere

done

by

immunohistochemistry with Streptavidin-HRP method. Slides were observed under microscope \Vith 400x magnification to be compared with the positive controls. ALP examination result was condemned positive if there is a brownish image according to the control image \Vhich were taken from sarcoma tissue. While OPN was said positive when there is a brownish image according to the control image taken from the breast cancer tissue CBFA-1 examination fi·om the rabbit's tissue lesion were done using imrnunof1ourescence by attaching the fresh lesion tissue of spondylitis tuberculosis on the glass object, to be further interacted with primer antibody CBFA-1 (RUN X-1 2), then incubated and washed using PBS, to be further underwent addition with flourescence-labeled-secondary antibody (goat anti rabbit J gG-CFL) and incubated again before it was dried. The next slide was also examined with flourescence microscope using 400x magnification for then to be compared with positive control. The result was said positive w·hen there is green-glowing image according to the control image. The result of the osteoblast markers were analitically tested using statistic and osteoblast's acitivity score was determined.


50

Results ALP and OPN From Rabbit ST's Blood

The ALP and OPN result examination using ELISA method from rabbit with spondylitis tuberculosis' blood on all groups ware not able to be counted because rhe concentration was lower than the lowest standard conc�ntration used; hence this

result was statistically unable to be analysed. Whatsoever, absorbance score

which was measured on the optical densitry measurement and the mixture color show there is a reaction, and the absorbance score were counted even though the level was not able to be counted. Mean absorbance score from the first rabbit blood group are 0.062A (SD 0.0134) and from the second group is 0 . 1 09A (SD

=

=

0.094). Statistically both

scores can not be compared. Mean OPN absorbance score from the first group is 0.05 1 A (SD

=

0.009)

and

from the second group is 0.050A (SD

=

0.013).

Statistically both ofthe absorbance score also can not be compared.

Figure 1. ELISA examination assay. a, ALP examination on ELISA: the bluish liquid

of ALP in the mixture. Red and blue arrow show standard ALP arrow shows sample mixture that contains ALP which could not be detected by opt ic a l density meter. b, OPN examination on ELISA: yellowish liquid shows the existence of OPN inside the mixture. Red and blue arrow show standard liquid color of OPN, yellow color show sample mixture color that contains OPN which could not b e shows enzymatic activity color, yellow

detected b y optical density meter.

ALP, OPN, and CBFA-1 Examination Result on Rabbit ST Tissue Lesion

Immunohistochemistry examination of ALP from the tissue lesion taken from both group all showed brownish linage that is similar to the positive control OPN


51

=n::rmhmo istochemistry examination of the tissue lesion taken from both groups showed brownish image similar to the positive control too. CBF A- 1 :r=:=Jmoflourescence result taken from the tissue lesion of the first group all -:wed greenish glow on the osteoblast cell that is similar to the positive control, �while only 2 of 3 samples showed alike :fi:om the second group.

F�g��Te

2.

IHC observation of ALP and OPN and IF CBFA-1 on Tissue Lesion of Spondylitis

�it. Figure a, ALP result from ST rabbit underwent MSC transplantation, osteoblast cells are

g (blu e an·ow), surrounded by bony matrix stained brown (brown arrow) that looked like the �ve control image (Figure c). Figure b, Observation from rabbit group that were not MSC ·

=cnspl anted, osteoblast cells were also found (blue arrow) but not as much as figure a. Bony

:carix was also noted, coloured brown (brown arrow) that looked like the ALP positive control � image (brown anow). Figure c, Positive control of ALP from IHC of sarcoma tissue S!mple. F igure d, OPN observation from rabbit group that was tranpslanted with MSC, can be seen � lining osteoblasts (blue arrow) were surrounded by brown bony matrix (brown anow) that l:Jok.ed like the positive control image ( figure e), also noted the partial area of finished new bone -.mation (green arrow) that does not exist on the figure b. Figure b: OPN observation fiom ST

::!bb it group that was not treated with MSC, al though lining osteoblasts can not be seen (blue :s:row) but not as much as figu re a, brownish bone matrix (brown anow) is also seen similar to

!HC p os itive control. Figure e: positive control of OPN examination using IHC from breast cancer

rissue. Figure g: CBFA-1 from rabbit group that was transplanted with MSC, seen on the image

6e formation of bone (green anow), the scaffold (yellow arrow), lump of osteoblast (blue arrow) :md green glow that shows positive CBFA-1 (brown arrow). Figure h, CBFA-1 examination from

2hbit group that was not given MSC, the green glow shows positive CBFA-1 (brown arrow),

group of osteo blast cells (blue arrow) and scaffold (yellow arrow). F igure i, positive control of CBFA- 1 . From figure g and h can be seen that both ST rabbit group that were treated with MSC !:ld the group that were not treated with MSC show green flourescence.


52

Table I . Osteblast Marker Evaluation: ALP, OPN, ad CBfA-1 in the blood and tissue lesion with Osteoblast Activity Scoring Treatment group Control group p mean ± SD n=3 n=3 mean ± SD ALP blood level

3

0

3

0

na

ALP Abs blood level

3

0,062 ± 0,0134

3

0,109 ± 0,094

na

ALP tissue

3

3/3

3

313

na

OPN blood level

3

0

3

0

na

OPN Abs blood level

,.,

J

0,051 ± 0,009

3

0,050 ± 0,013

na

OPN lession

3

3/3

,.,

J

3/3

na

CBFA-1

,.,

J

313

3

2/3

na

3

160

3

1 45

lession

Total mean score

Discussion

Naturally, the attempt ofhealing defect went through new bone formation process stm1ed once the defect occured, where internal mesenchymal stem cell differentiates into osteoblasts. 9• 1 5 Internal mesenchymal stem cell term is used to differentiate with MSC that is transplanted from outside the body. Osteoblast expressed CBF A- 1 , secretes alkaline phosphatase and osteopontin. 1 1 • 1 2• 16' 1 8 In the early stage, CBF A-1 can be detected intracell, meanwhile ALP and OPN are found extracell. Osteoblast activity then induces the formation of nevv' bone and initiates osteoclast activity hence bone remodelling process takes place. 7 The process went at any rate so that osteoblast and osteoclast activity are balanced to be able to produce new· bone formation. 8 However, this balance sometimes fail to be maintained due to various factors such as bacterias and immune response to bacterias . 1 7 The existence of bacteria usually will cut the chain of osteoblast and osteoclast's balance. A few bacterias can cause the direction of differentiation of MSC into osteoblast, hence slowing osteoblast proliferation and bone matrix proliferation down. Bacterias can also increase osteoclast activity hence causing imbalance ofmatrix formation and bone remodelling proces, which is fo llowed by bone destruction marked by the decreasing production of bone matrix and calcium. 7•8•17


53

..

Anti tuberculosis drugs administration aimed to kill Mycobacterium tuberculosis 6 by inhibiting its proliferation while TTSSA intervention was done to reduce debris and necrotic tissue, 1 hence hoped to give chance of osteoblast formation in order to repair the defect on vertebral body. 14 Meanwhile, addition of hydroxyappatite scaffold 19 and MSC directly intralesion were aimed to increase l:he chance of MSC differentiation to osteoblast and increase its activity to create new bone formation which will support the repair of vertebral body defect. 3'9' 14 · 15 This result matches the previous in vitro research result where debris and supernatant of Mycobacterium tuberculosis are proven not to affect the growth of 21 mesenchymal stem cell when cultured together. The result on table 2 shows that osteoblast activity in expressing CBFA-1 was not inhibited by Mycobacterium tuberculosis, even when compared to the control group it seems that Mycobacterium tuberculosis 's existence gives good int1uence on osteoblast activity to express CBF A- 1 . On the other hand, osteoblast activity to secrete ALP and OPN, MTb's existence seems to inhibit osteoblast activity in secreting ALP, although it did not inhibit osteoblast's activity in inhibiting OPN. ALP and OPN level check from ST rabbit blood using ELISA on all rabbit group gave zero result. This shows that TTSSA6 procedure and MSC transplantation did not give sytemic effect locally, therefore the increase of osteoblast activity could not be detected systemically through blood examination. Scoring result shows that mean total score for the second group is 1 45, v-.rhile mean total score for the treatment group is 160. Both groups show positive osteoblast activity meaning is not aflected by Mycobacterium tuberculosis towards osteoblast activity i n expressing and secreting its markers, and when the lotal mean score of osteoblast activity of both groups are compared, it can be seen that Mycobacterium tuberculosis exsitence supports the increase of osteoblast activity intralesion.

Conclusion The existence of Mycobacterium tuberculosis does not affect mesenchymal stem cell differentiation to osteoblast then osteocyte on the lesion tissue of vertebral


54

body. Systemic response detected on blood has not happen which shows osteoblast's activity on the healing process of spondylitis tuberculosis infection and nevv bone remodeling during bone remodelling. Based on the evaluation of osteoblast markers (CBFA- 1 , ALP, and OPN) results and evaluation of osteoblast activity scoring, it can be understood that 1\1ycobacterium tuberculosis give positive influence on the increase osteoblast activity on the tissue lesion.

Suggestion

Further research needs to be done on the mollecular and cellular level to observe mesenchymal stem cell difTerentiation to osteoblast in the Mycobacterium tuberculosis environment related to its activity in supporting the new bone formation and fusion process.

References

1.

Sapardan, S. 2004. Total Treatment of Tuberculosis of The Spine. A Rational Problem Solving Approach. Perpustakaan Universitas Indonesia.

2.

Zhang G, Zhu B, Shi W, Wang M, Da Z, Zhang Y. 2010. Evaluation of Mycobacterial virulence using rabbit skin liquefaction model. Virulence, 1(3);156-163.

3.

Gott:fi:ied ON, Dailey AT. Mesenchymal Stem Cell and Gene therapies for Spinal Fusion. Topic Rev:iew. Neurosurgery 2008;63-3.

4.

Orme 1 and Juan·ero MG. Animal Models of 1\1ycobacterium tuberculosis Infection. Current Protocol in Microbiology. John Wiley and Son Inc, 2007.

5.

Poelstra KA, Barekzi NA, Grainger DW, Gristina AG, Schuler TC. A Novel Spinal Implant Infection Model in Rabbits. SPINE 2000;25(4);406-410.

6.

Bierry G, et al. Percutaneous Inoculated Rabbit Model ofl ntervertebral disc space infection: Magnetic Resonance Imaging features with Pathological Correlation. Joint Bone Spine 2008; 75:465-470.

7.

Chan JK. A Study of Osteocyte Apoptosis by Region and Quadrant in Murine Cortical Bone. 2011. Faculty of California Polytechnic State University, San Luis Obispo.


55

8.

Arantzazu M, et al. Osteoclast Control Osteoblast Chemotaxis via PDGF BB/PDGF Receptor Beta SignaJing. Plos One 200 8:3.

9.

Leonardi E , et al. Osteogenic properties of late adherent sub populations of human bone man-ow stromal cells. Histochem Cell Bioi 200 9; 132:547-557.

10.

Zychowicz

ME.

Osteoarticular

Manifestations

of

A1ycobacterium

Tuberculosis Infection. Orthopaedic Nursing 20 10 ; 29(6). 11.

Kawakami T, Kimura A, Hasegav.ra H, Eda S. I mmunohistochemical Determination of Osteopontin Expression in Neoplastic Cells. Oral lWed Pathol 1998;3:7 5-7 8.

1 2.

Tigrani, DY and Weydert JA.

Immunohistochemical Expression of

Osteopontin in Epithelioid Mesotheliomas and Reactive Mesothelial Proliferations. Am J Clin Path of 2007; 127 :580-584. 13.

Nather A, David V, Teng

J,

Lee C, Pereira B. Effect of Autologous

Mesenchymal Stem Cells on Biological I-Iealing of Allografts in Critical sized Tibial Defects Simulated in Adult Rabbits. Ann Acad Med Singapore 20 10;39: 599-60 6.

14.

Vats A, Tolley NS, Buttery DK, Polak JM. The Stem Cells i n Orthopaedic Surgery. The Joumal of Bone and Joint Surgery (BR) 2004;86B(2): 159-1 64.

15.

Bilousova G, e t al. Osteoblasts derived from Induced Pluripotent Stem Cells form Calcified Structmes in Scaffolds both in vitro and i n vivo. Stem Cells.

16.

Thirunavukkarasu K, et al. The Osteoblast-specific Transcription Factor Cbfa1 Contributes to the Expression of Osteoprotegerin, a Potent Inhibitor of Osteoclast Differentiation and Function. The Journal of Biological Chemistry. 2000; 27 5(33):25163-25172.

1 7.

Nair SP, Meghji S, Wilson M, Reddi K, White P, Henderson B. Bacterially Induced Bone Destruction: Jviechanism and Misconception. Infection and Immunity 1996; 64(7):23 71-2380 .

18.

Leung KS, Fung KP, Sher AH, L i CK, Lee KM. Plasma bone-spesific alkaline phosphatase as an indicator of osteoblastic activity. J Bone Joint Surg Br 1993: 75(2); 288-292.


56

19.

Bozic K, et al. In Vivo Evaluation of Coralline Hydroxyapatite and Direct Cunent Electrical Stimulation in Lumbar Spinal Fusion. SPINE 1999; 24(20):2127-2133.

20.

Rahyussalim, Kurniawati T, Rukmana A, Albar I,

�itri

AD. The Potential

Spread of Mycobacterium tuberculosis into the Environment in the Creation ofTB Spondylitis Rabbit Models. 21.

Iv1ensyuknil

H, Rahyussalim, Yuyus

K,

Kurniavvati

T.

Effect

of

Mycobacterium tuberculosis debris and supernatant o n bone marrow stromal cells growth.


57

Appendix Osteoblast Activiy Scoring System Table Osteoblast Activity Scoring System Variables

OPN

:.1.J>

CBFA-1

Hasil

Skor

T 1 2 lession

5

Blood

5

T l 2 Iession

5

Blood

5

T l 2 Jession

5

Hasil

N

N

Skor

20

20

Hasil

Skor

>N

50

>N

50

>N

50

>N

50

>N

50

Total Score < I 00 means inactive; score I 00-175 means active; score> 175 hyperactive

Un iversitas Indonesia

250

58

Lampiran 4. 2 Draft Publikasi II Transplantasi Sci Punca Mesenkimal Pada Lesi Spondilitis Tuber){ulosis Kelinci : Telaah Pada Proses Osifikasi Melalui Hitung Sel Osteoblas, Hitung Sel Osteosit dan Kadar Kalsium Lesi. *Rahyussalim, **Tri Kumiawati, ***N uryati Chairani, *Errol U. Hutagalung, * * * *Agus Syahrurachman, *Ismail, *****Diah Jskandriati, ******Ami Diana Fitri *Oepartemen Orthopaedi dan Traumatologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia **Klaster Stem Cell and Tissue Engineering, MERC Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia ***Departemen Patologi Anatomik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia ****Departemen Microbiologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia *****Pusat Studi Satwa Primata lnstitut Pertanian Bogor ******Rumah Sakit Hewan lnstitut Pertanian Bogor

ABSTRAK Latar Belakang : Sel punca mesenkimal (SPM) berdiferensiasi menjadi osteoblas kemudian menjadi osteosit, dua set yang terlibat proses penulangan (osifikasi). Debris bakteri Mycobacterium tuberculosis terbukti tidak memengaruhi pertumbuhan SPM secara in vitro. Penelitian ini bertujuan mengamati proses osifikasi pada Jingkungan mikroskopis yang mengandung bakteri Mycobacterium tuberculosis hidup yang ditransplantasi SPM secar·a in vivo pada kelinci. Metode : Enam ekor kelinci Spondilitis tuberkulosis (ST) dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kultur(K), PCR(P), dan histopato\ogi(l-1) positif sebagai perlakuan (n=3) dan kelompok PCR(P) dan histopatologi(H) positif sebagai kontrol (n=3). Kedua kelompok menjalani prosedur intervensi penatalaksanaan, transplantasi SPM dan pemberian obat anti tuberkulosis (OAT). Setelah enam minggu dilakukan evaluasi osifikasi dengan menghitung jumlah sel osteoblas, sel osteosit dan kadar kalsium lesi. Hasil pemeriksaan diuji secara statistik dan ditentukan nilai skor osifikasinya. Hasil : Rerata jumlah osteoblas kelompok perlakuan 207.00 sel (SD=3 1 .00) dan kelompok kontrol 220.33 sel (SD =73.46). Rerata jumlah osteosit kelompok perlakuan 18,33 sel (SD=30.04) dan kelompok kontrol 3 1 .00 sel (SD=26.87). Rerata kadar kalsium kelompok perlakuan 2.94% (SD =0.89) dankelompok kontrol 2 . 5 1 % (SD=0.13). Total skor osifikasi kelompok perlakuan 31 .00 dan kelompok kontrol 25.67. Kesimpulan : Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat menekan diferensiasi osteoblas menjadi osteosit sekaligus merangsang rnetabolisme kalsium di dalam lesi sehingga akan menghambat proses pembentukan tulang karena akan diperoleh tulang immature. Lingkungan mikroskopis dengan bakteri Mycobacterium tuberculosis hidup memberikan lingkungan yang lebih baik pada proses osifikasi. Keywords :Mycobacterium tuberculosis, hitung osteosit, hitung osteoblas, kadar kalsium, osifikasi, skoring osifikasi.


59

Prndabuluan

Spondilitis tuberkulosis (ST) adalah penyakit infeksi pada tulang belakang yang :Ssebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis. Spondilitis tuberkulosis mengak ibatkan kerusakan korpus (defek) yang menimbulkan �nstabilitas tulang :elakang dan gangguan struktur di sekitarnya. Penyembuhan infeksi bakteri pada SjJOndilitis tuberkulosis dipengaruhi oleh seberapa berat kerusakan korpus dan infeksi bakteri tersebut di tulang belakang. 1 Selama ini upaya penatalaksanaan kasus spondilitis tuberkulosis yang disertai kerusakan korpus dilakukan melalui �dekatan operatif,

u

tetapi pada beberapa kasus belum memberikan hasil yang

::nemuaskan karena tidak tercapainya fusi, sehingga potensi sel punca mesenkimal dalam proses pembentukan tulang baru dan mendukung fusi tu}ang belakang terus dike mbangkan. 3 ,9, 1 1,12,1 3 ,14,15 Osiflkasi adaJah suatu proses pembentukan tulang baru yang berkaitan erat dengan diferensiasi sel, aktifitas sel tulang dan deposit kalsium. 13 Bakteri J,Jycobacterium tuberkulosis hidup diperkirakan mempengaruhi diferensiasi SPM menjadi sel osteoblas, menghambat aktifitas osteoblas dan mengganggu deposit 14 kalsium ke area defek. Sehingga akan terjadi penurunan jumlah sel dan kadar kaJsium. Oleh karena hal tersebut maka pada penelitian ini d ilakukan evaluasi lerhadap proses osifikasi antara lain dengan menghitung jumlah sel osteoblas, sel osteosit dan kadar kalsium di dalam defek. Untuk mengamati proses osifikasi pada lingkungan mikroskopis Mycobacterium tuberkulosis, dilakukan evaluasi terhadap 3 variabe} osifikasi yaitu jumlah osteoblas, jumlah osteosit dan kadar kalsium. Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat secm·a invivo pengaruh bakteri Mtb hidup terhadap proses osifikasi. 13·14 Sel punca mesenkimal dapat dikultur secm·a in vitro dan berdiferensiasi menjadi osteoblas, kemudian menjadi osteoklas, dua sel yang terlibat dalam pembentukan tulang. 9• 1 1 Pada lingkungan in vitro yang secm·a mikroskopis mengandung debris bakteri Mycobacterium tuberculosis telah terbukti bahwa sel punca mesenkimal 7 tidak mengalami gangguan pertumbuhan yang berarti. 1 Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis hidup terhadap proses osifikasi (penulangan) secm·a in vivo pada model kelinci


60

spondilitis tuberkulosis. Osifikasi diamati melalui pemeriksaan hitung sel osteoblas, hitung sel osteosit dan kadar kalsium jaringan tulang.

Metode

Penelitian ini merupakan peneJjtian intervensi pada kelinci, seluruh protokol telah direview dan disetujui oleh Komisi Animal Care and Use Committee (ACUC) PT. Bimana Indomedical No. R.02 - 1 2-1R dan Komisi Pengav.,asan dan Kesejahteraan Penggunaan I-Iewan Percobaan (KPKPHP) Rumah Sakit Hewan (RSH) IPB No. 02-2 1 0 1 2 RSH IPB dan Komite Etik Penelitian Kesehatan FKUI-RSCM No. 521/PT02.FK/ETIK/20 1 2 . Sebagian besar penelitian ini menggunakan fasilitas hewan di RSH IPB, PT Bimana Inclomeclical, laboratorium Mikrobiologi Klinik FKUI dan laboratorium Patologi Anatomik FKUI. Sampel penelitian ini adalah kelinci spondilitis tuberkulosis yang dibuat mengikuti suatu prosedur inokulasi langsung bakteri Mycobacterium tuberculosis ke dalam korpus vertebranya_2·6·7•8• 1 0· 16 Enam ekor kelinci spondilitis tuberkulosis (ST)· dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kultur, PCR, dan histopatologi (KPH) positif sebagai kelompok perlakuan (n

=

3) dan kelompok PCR dan

histoptologi (PH) positif sebagai kelompok kontrol (n

3). Kedua kelompok kelinci mendapatkan perlakuan TTSSA6, 1 pemberian OAT, 1 penempatan skafold =

hidroksi apatit dan transplantasi sel punca mesenkimal pada korpus vertebra yang terinfeksi. Selama waktu inkubasi dilakukan pemeriksaan klinis, sedangkan pengamatan osifikasi dilakukan setelah kelinci eli eutanasia pada minggu ke-6 pasca transplantasi sel punca mesenkimal melalui pemeriksaan hitung sel osteoblas, hitung sel osteosit dan kadar kalsium tulang. Sel osteoblas dan sel Osteosit diamati dan dihitung jumlahnya pada lima lapang pandang oleh dua orang pengamat yang berbeda, kemudian hasil penghitungan tersebut dirata-ratakan. Kadar kalsium tulang ditentukan secara kimiawi clengan metode Atomic Emision Spektroskopi (AES) setelah sampel tulang didekstruksi. Analisis hasil pemeriksaan marker-marker osteoblas diuji secara statistik dan ditentukan skor aktifitas osteoblas.


61

- pengamatan terhadap pulasan HE menggunakan pembesaran 400x diperoleh �

jumlah sel osteoblast intra defek kelinci ST kelornpok perlakuan (n

�mpok kontrol (n SD

=

=

3) berturut turut adalah 207.00 sel (SD

=

=

3) dan

3 1 ) dan 220.33

73.46).

:l!ri pengarnatan terhadap pulasan H E menggunakan pembesaran 400x diperoleh � jumlah

sel osteosit intra defek kelinci ST kelompok perlakuan (n

mpok kontrol (n 5J 26.87). C!:l

=

(SD

Rerata kadar kalsium tulang kelinci ST

=

3) dan

3) berturut turut adalah 1 8.33 sel (SD 30.04) dan 3 1 sel

kelompok kontrol (n

3.51%

=

=

kelompok perlakuan (n

3 ) berturut turut adalah 2.94%

(SD

=

=

3)

0.89) dan

0.13)

a

b

Gmtbar I Pengamatan Terhadap Slide Pulasan HE Menggunakan Mikroskop Dengan Pembesaran -JOx. Jaringan dipersiapkan dari pemotongan sagittal melewati defek yang terbentuk dari arah sisi �1. a. Slide dari kelompok kelinci spondilitis yang diberikan sel punca mensenkimal ke dalam :7feknya, tampak area kosong yang terisi skafold, ada pula area berupa pulau-pulau tulang. Tanpak pula di beberapa area ditempati serbukan sel radang. Jelas terlihat sel-sel osteoblas yang ::DtiDbentuk formasi berjejer di sekeliling pulau tulang, demikian pula tampak sel-sel osteosit yang �unjukkan sudah terjadinya proses penulangan yang sempurna. b. Slide dari kelompok kelinci :.erinfeksi yang tidak diberikan sel punca mesenkimal, sebagian area tampak serbukan sel radang, :!lilpak pula area kosong yang terisis skafold. Tidak tampak area pulau-pulau tulang, tampak sel sel osteoblas berjejer mengelilingi skafold, tidak tampak gambaran sel osteosit.


62

Tabel

I.

Hasil Hitung Osteoblas, Hitung Osteosit dan Kadar Kalsium Jaringan Lesi pacta kelompok perlakuan dan kelompok kontrol Kelompok perlakuan Kelornpok konl1·ol Variabel p n=3 n=3 rerata ± SO rerata ± SO

Jumlah se1 Osteoblas

3

220,33 ± 73,46

.) .,

Jumlah Sel Osteosit

3

1 8,33 ± 30,04

3

Kadar Kalsium

3

2,94 ± 0,89

.,

.)

207 ± 3 1

Na

• 3 I ,00 ± 26,87 2,51 ± 0,13

Na Na

HasH Skoring Osifikasi

Tabel 2 . menunjukkan hasil penghitungan skoring osifikasi pada kelinci yang diberikan

SPM

pada

masing-masing

kelompok

Iingkungan

mikroskopis

Mycobacterium tuberculosis. Berdasarkan penghitungan total skor osifikasi didapatkan bahwa seluruh kelinci ST dari kelompok perlakuan mengalami proses osifikasi yang berjalan baik, sedangkan pada kelompok kontrol terdapat 1 kelinci mengalarni proses osifikasi yang terhambat, 1 ekor kelinci mengalami proses osifikasi yang berjalan normal dan I ekor lai1mya mengalami proses osifikasi yang berjalan baik. Tabe1 2. Hasil Penghitungan skoring osifikasi setiap sampel kelinci ST yang diberikan SPM per sub kelompok lingkungan mikroskopis Mycobacteriun tuberculosis Hi tung osteoblas

Hi tung osteosit

Kadar kalsium

Sko r

Skor

Skor

kontrol

5

15

15

K0505

kontrol

5

5

K2964

kontrol

K0509

perlakuan

Kode kelinci

kelompok

K3164

K3264 K05 1 9

perlakuan

15 15

Total skor

Keterangan

35

Osifbaik

25

Osif normal

15

17

Osifterhambat

15

31

Osifbaik

15

31

Osifbaik

15

15 15 Osifbaik 31 perlakuan Total skor 1 8 clisebut osifikasi terhambat; Total skor 18 scl 30 disebut osifikasi normal, To1 clisebut osifikasi baik

Pcmbahasan

Hasil evaluasi osifikasi setelah prosedur transplantasi SPM ke dalam defek kelinci ST diperlihatkan pada tabel 1 . Rerata jurnlah sel osteoblas pada sub kelompok kelinci perlakuan lebih banyak dibandingkan dengan rerata jumlah sel osteoblas pada sub kelompok kontrol. Dilain pihak rerata jumlah sel osteosit pada sub kelompok perlakuan lebih sedikit dibandingkan rerata jumlah sel osteosit pada Universitas Indonesia

63

�lompok kelinci kontrol. Jika diamati proses diferensiasi sel berdasarkan hasil ..

osifikasi ini terlihat bahwa keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis cem

pengaruhi diferensiasi SPM menjadi sel osteoblas atau diferensiasi sel

ilSleoblas menjadi sel osteosit. Berbeda dengan basil rerata kadar kalsium lesi . '

� kelinci kelompok perlakuan

menunjukkan nilai

yang

lebih tinggi

d!""bandingkan dengan rerata kadar kalsium lesi kelinci kelompok kontrol. HaJ ini menunjukkan bahwa keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis berpengaruh yositifterhadap produksi atau deposit kalsium pada defek tulang. Dari

ketiga data ini dapat diambil pengertian bahwa bakteri A1ycobacterium

IZI.berculosis pada satu sisi dapat menekan proses diferensiasi sel osteo bias :nenjadi osteosit, tetapi di sisi lain dapat merangsang metabolisme kalsium d i c!alam lesi. Untuk jangka panjang bakteri Mycobacterium tuberculosis akan :menghambat proses pembentukan tulang sehingga akan diperoleh tulang i:'IJmature. Pada kasus osteom.ielitis tuberkulosis atau septic artlu·itis tuberculosis, lerbentuknya tulang immature ini sering dijumpai bahkan pada beberapa kasus dapat teljadi fibrous union. Skoring osifikasi terhadap kelompok perlakuan menunjukkan bahwa sernua kelinci memiliki skor Jebih dari 30 yang berarti bah\\'a proses osifikasi dapat berjalan dengan baik. Bandingkan dengan skoring osifikasi terhadap kelinci ·elompok kontrol yang hanya memiliki satu ekor kelinci yang memiliki skor lebih dari 30.

Dari hasil skoring

osifikasi ini didapat kesan bahwa bakteri

Jlycobacterium tuberculosis memberikan pengaruh yang baik terhadap proses osifikasi.

Kesimpulan

Berdasarkan evaluasi terhadap proses osifikasi yang berkaitan dengan jumlah sel osteoblas, jumlah sel osteosit dan kadar kalsium jaringan dan evaluasi terhadap lotal skoring osifikasi diketahui bah\va bakteri mtb memberikan dampak positif lerhadap peningkatan proses osifikasi pada lesi.


�

ifnf¥i&Wbi!49.;+444

"W"I!MW

awn¥

......

**'"

-·

64

Saran

Diperlukan penelitian untuk mengembangkan sistem skoring osifikasi yang berkatian erat dengan taktor prediksi keberhasilan osifikasi pada kasus spondilitis tuberkulosis. Diperlukan pula

penelitian lanjutan �ntuk mengamati dan

memahami bagai mana proses osifikasi berjalan pada lingkungan mikroskopis yang tercemar bakteri Mycobacterium tuberculosis sehingga didapat suatu gambaran yang utuh berkaitan dengan peranan lingkungan mikroskopis Mtb hannonisasi peranan osteoblas, osteosit dan deposit kalsium.

Daftar Pustaka 1.

Sapardan, S . 2004. Total Treatment of Tuberculosis of The Spine. A Rational Problem Solving Approach. Perpustakaan Universitas Indonesia.

2.

Zhang G, Zhu B, Shi W, Wang M, Da Z, Zhang

Y.

2010. Evaluation of

Mycobacterial virulence using rabbit skin liquefaction model. Virulence, 1(3); 156-163. 3.

Gottfried ON, Dailey AT. Mesenchymal Stem Cell and Gene therapies for Spinal Fusion. Topic Review. Neurosurgery 200 8;63-3.

4.

Orme I and JuaiTero MG. Animal Models of .Mycobacterium tuberculosis Infection. CmTent Protocol in Microbiology. John Wiley and Son Inc, 200 7.

5.

Poelstra KA, Barekzi NA, Grainger DW, Gristina AG, Schuler TC. A Novel Spinal Implant Infection Model in Rabbits. SPINE 2000;25(4);40 6-410 .

6.

Bierry G, et al. Percutaneous Inoculated Rabbit Model of Intervertebral disc space infection: Magnetic Resonance Imaging Features \\lith Pathological Correlation. Joint Bone Spine 200 8; 75:465-470 .

7.

Chan JK. A Study of Osteocyte Apoptosis by Region and Quadrant in Murine Cortical Bone. 201 1 . Faculty of California Polytechnic State University, San Luis Obispo.

8.

A.rantzazu M, et al. Osteoclast Control Osteoblast Chemotaxis via PDGF BB/PDGF Receptor Beta Signaling. Plos One 200 8:3.

9.

Leonardi E, et al. Osteogenic properties of late adherent sub populations of human bone marrow stromal cells. Histochem Cell Bio/ 200 9; 132: 547-55 7.


65

10.

Zychowicz

ME.

Osteoarticular

Manifestations

of

Mycobacterium

Tuberculosis Infection. Orthopaedic Nursing 2010;29(6). Jl.

Nather A, David V, Teng J, Lee C, Pereira B. Effect of Autologous Mesenchymal Stem Cells on Biological Healing of Allo ¥rafts in Critical sized Tibial Defects Simulated in Adult Rabbits. Ann Acad Med Singapore 201 0;39: 599-606.

12.

Vats A, Tolley NS, Buttery

OK,

Polak JM. The Stem Cells in Orthopaedic

Surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery (BR) 2004;86B(2):159164.

13.

Bilousova G , et al. Osteoblasts derived from Induced Pluripotent Stem Cells form Calcified Structures in Scaffolds both in vitro and in vivo. StemCells.

14.

Nair SP, Meghj i S, Wilson M, Reddi K, White P, Henderson B. Bacterially Induced Bone Destruction: Mechanism and Misconception. b�fection and Immunity 1996;64(7):23 71-2380.

15.

Bozic K, et al. In Vivo Evaluation of Coralline Hydroxyapatite and Direct Current Electrical Stimulation in Lumbar Spinal Fusion. SPINE 1999; 24(20):2127-2133.

16.

Rahyussalim, Kurniawati T, Rukmana A, Albar I, Fitri AD. The Potential Spread ofA1ycobacterium tuberculosis into the Environment in the Creation ofTB Spondylitis Rabbit Models.

1 7.

Mensyuknil H, Rahyussalim,

Yuyus K,

Kumiawati

T.

Effect

of

Afycobacterium tuberculosis debris and supernatant on bone marrow stromal cells gro\V1h.


66

Lampiran Sistem Skoring osifikasi Sistem Penilaian Skoring Osifikasi Hasil

Skor

Hasil

Skor

Hasil

Skor

Hitung Osteoblas

lesi T l 2

Negatif

Normal

5

positif

15

Hitung Osteosit

lesi T l 2

Negatif

Nom1al

5

positif

15

Kadar Kalsium

Vert T l 2

Negatif

Normal

5

positif

15

Total Keterangan : skor 18 = osifikasi terhambat; skor osifikasi baik

45 18

sd 30 = osifikasi normal; skor > 30 =

Negatif bila dibawah nilai minimal kontrol; normal bila antara nilai minimal dan maksimal; positifbila lebih besar dari nilai maksimal


67

.llesenchymal Stem Cell Transplantation on Rabbit Spondylitis Tuberculous Lesion: Analysis on Ossification Process Through Osteoblast Cell Count, Osteocyte Count and Calcium Level on Lesion *Rahyussalim, **Tri Kurniawati, ***N uryati Chairani, *En-ol U. Hutagalung, ****Agus Syahrurachman, *lsmail, * * * * * Diah Iskandriati, ***** *Arni Diana Fitri *Department ofOrthopaedic and Traumatology Faculty of Medicine University of Indonesia **Stem Cell and Tissue Engineering Cluster, MERC Faculty· ofMedicine University of Indonesia ***Department Patologi Anatomic Faculty or Medicine University of Indonesia ****Department Microbiologi Clinic Faculty of Medicine University of Indonesia *****Primata Research Center Bogar Agricultural Institute ******Veterinary Teaching Hospital Bogor Agricultural institute

ABSTRACT Background: Mesenchymal Stem Cell (MSC) difTerentiates into osteoblast then osteocyte during the process of o ssification. Mycobacterium tuberculosis is proven not to affect MSC grovv'th rn vitro. This research aims to observe the ossification o n micro environment containing live Mycobacterium tuberculosis v.fuch was transplanted with MSC in vivo rabbit. _ lethods: Six Spondylitis Tuberculosis (ST) rabbits were divided into two groups: the first group having positive Culture(C), PCR(P), and Histopathology(H) hence n=3; while only P, H were positive for the second group n 2). Both group underwent intervention of treatment, MSC transplantation, and anti tuberculous drugs. After six weeks, ossification process was evaluated by counting the number of osteoblast, o steoc;'te and level of calcium on lesion. The results were then tested statist ically and ossification score was obtained. Results: Mean number of osteoblast on the first group vvere 207.00 cells 'SD=3 1 .00) and for the second group were 220.33 cells (SD=73.46). Mean osteocyte number intra lesion on first group vvere 18.33 cells (SD=30.04) and 31 .00 cells for the second group (SD=26.87). Mean level of calcium on the first group was 2.94% (SD=0.89) while on the second group was 2 5 1 % (SD=O. l3). Total ossification score on the frrst and second group respectively were 3 1 .00 and 15.67. Conclusion: Mycobacterium tuberculosis is able to suppress osteoblast differentiation to osteocytes while stimulates calcium metabolism intra-lesion to inhibit the ossification process to produce immature bone. The microscopic environment containing live Mycobacterium tuberculosis yields better ossification process. =

.

Keywords: j\1ycobacterium tuberculosis, osteocyte count, osteoblast count, calcium level, ossification, ossification score


68

Background

Tuberculosis (TB) spondylitis is an infectious disease of the spine which is caused by Mycobacterium tuberculosis. TB spondylitis causes defect of the corpus which can lead to spinal instability and disturbance of surrouniing tissue. Healing of c; bacterial infection in TB spondylitis is determined by the severity of corpus defect and the bacterial infection i n the spine. 1 Up until novv, the mainstay therapy ofTB spondylitis is operative approach, but in several cases there were no satisfying results i n which no spinal fusion is seen. Based on this premise, we tried to elaborate the massive potential of mesenchymal stem cell (MSC) in restoring the structural abnormalities in TB spondylitis cases. 3•9• 1 1 • 1 2• 13"4• 1 5 Ossification is a part of bone formation inf1uenced by cellular differentiation, n osteocyte activity, and calcium deposit. Mycobacterium tuberculosis i s believed to af1ect the differentiation o f MSC into osteoblast, inhibit its activity, and decrease calcium deposit within the defect. 14 ln this research, we evaluate ossification in TB spondylitis bone by quantifying osteoblast, osteocyte, and calciam level of infected bone. To monitor the ossification in the microscopic environtment, vve identify 3 variables as described before (osteoblast count, osteocyte count, and calcium level). The purpose of this research is to evaluate the interaction betw·een M. tuberculosis and bone ossification. In this research, \ve used a rabbit model of TB spondylitis (in vivo) . 13 • 14 The surveillance o f ossification i s seen by osteoblast and osteocyte cell count, as well as calc-ium level of defect area. MSC, which can differentiate into osteoblast and ultimately osteocyte, can be 9 cultured in vitro. • 1 1 From the previous study, M. tuberculosis doesn't have a significant effect o n MSC inhibition. 1 7

Methods

This research is an interventional research using animal model. The research protocol has been reviewed and approved by: ( 1 ) Animal Care and Use Committee (ACUC) PT Bimana Indomedical No. R.02-1 2-IR, (2) "Komisi Pengawasan dan Kesejahteraan Penggunaan Hewan Percobaan" (KPKPHP) IPB


69

_1\nimal Hospital No. 02-2 1 0 1 2, (3) Medical Research Unit (MRU), Research Ethical Conunittee FMUI-RSCM No. 521 /PT02.FK/ETJK/20 1 2. The majority of che

research process lies in IPB Animal Hospital Lab,

PT

Bimana Indomedical,

Clinical Microbiology Lab FMUI, and Pathology Anatomy Lab FMUI. 1be

research samples are rabbits inoculated directly with Mycobacterium :uberculosis within its vertebral body (corpus) ?'6'7'8' 10' 1 6 The rabbits were :ategorized into 2 groups; Intervention group and control group. Each of this �up consists of 3 rabbits. Intervention group are rabbits with positive culture, :?CR, and histopathologic (KPH), vvhile the control group are rabbits with positive ?CR and histopathologic only (PI-I). Both groups receive intervention ofTTSSA6, amituberculosis regimen, 1 scaffold placement of hydroxyapatite, and MSC .:rnnsplantation into the defective corpus. During the incubation period, we exam

ined these rabbits clinically. After 6 weeks of follow up, an euthanasia was

�ormed -after MSC transplantation- to extract the information of ossification 1i\ithin

the corpus. The objective parameters were measured (osteoblast count,

osteocyte count, and calcium level). Osteoblast and osteocyte were measured within microscopic visual scope by 2 jjfferent evaluator. After that, the results were added and divided equally to btain mean value. Meanwhile, in measuring calcium level, we used the Atomic Emission Spectroscopy (AES) method to directly acquire the data.

Results

According to microscopic evaluation (HE stained) with 400 times magnification, re

found the mean value of osteoblast count of 207 cells in intervention group

SD=3 1 ) and 220.33 cells in control group (SD=73.46). In osteocyte,

we

fo und

·�t33 cells in intervention group (SD=30.04) and 3 1 cells in control group SD=26.87). The mean calcium levels are 2.94% (SD=0.89) in intervention group :md

2.5 1 % (SD=O. 1 3) in control group. The total samples are 6 rabbits; three

rabbits in each group.


70

'*

Table 1 . Osteoblast, Osteocyte Count and Calcium Level of Bone Defect in Both Groups Intervention Control Variables p n=3 mean ± SO mean ± SD n =3 Osteoblast

3

220,33 ± 73,46

3

207 ± 3 1

Osteocyte

3

1 8,33 ± 30,04

3

3 1 ,00 ± 26,87

Na

Calcium Level

3

2,94 ± 0,89

3

�,51 ± 0,13

Na

Na

b

Picture 1 . Evaluation of HE-stained defect tissue using microscope with 400 times magnification. Tissue were sliced sagitally through the defect. a. MSC-applied slide of TB spondylitis rabbit, there is inflammatory cells around the scaffold. Osteoblast rimming can be seen around the bony island, and a couple of osteocytes indicating a good ossification in this model. b. Preparate without MSC application, there is minimal osteoblast cell count and negative osteocyte. Ossification Scoring

Based on the results in this research, all subjects in the intervention group bas a good ossification. On the other hand, the control group has a variety of results including 1 rabbit with delayed ossification, I rabbit with normal ossification, and the last rabbit with good ossification. The tabulation can be seen in table 2 below.


71

Table 2. Calculation of Ossification Score Osteoblast Osteocyte Calcium Count Count Level Total Score Score Score Score

Subject Coding

Group

10164

Control

5

15

15

35

Good

KOSOS

Control

5

5

15

25

Normal

1<2964

Control

15

17

Delayed

K0509

Intervention

15

31

Good

15

15

31

Good

1

15

31

Good

K3264 K05 1 9

15

Intervention Intervention

15

Ossification Grade

NB: Total score -7 1 8 (delayed); 1 8-30 (normal), > 30 (good)

Discussion

Ossification of corpus defect after MSC transplantation can be seen in table 1 . �lean value of osteoblast i n intervention group is higher compared to control group. In contrast to the previous data, we found less osteocyte count in the intervention group compared to control group. We deduce that M. tuberculosis 3ffects the differentiation of MSC into osteoblast, and also osteoblast into oSieocyte. Then again, the calcium level in intervention group is higher than control group which explains that M. tuberculosis gives a positive eiTect in �cium deposition of the detected bone. In

a long run, M. tuberculosis will inhibit bone formation which causes an

immatur e bone structure. This immature bone structure can be found in some

cases of TB osteomyelitis and TB septic arthritis; may lead to fibrous union instead of bony union. From table 2, we can conclude that the intervention group gives a better scoring on ossification parameter compared to control group. Comprised fi·o m this scoring system, M. tuberculosis gives a positive eiTect to\vards ossification of bone defect.

Conclusion

From this research,

we

found that M. tuberculosis giVes a positive effect to

ossification of bone detect which is influenced by osteoblast count, osteocyte count, and local calcium level.


72

Suggestion

Further research to develop a more accurate ossification scoring system which can be a great help to predict the outcome in TB spondylitis cases.

References

1.

Sapardan, S. 2004. Total Treatment of Tuberculosis of The Spine. A Rational Problem Solving Approach. Perpustakaan Universitas Indonesia.

2.

Zhang G, Zhu B, Shi W, Wang M, Da Z, Zhang Y. 2 0 1 0. Evaluation of Mycobacterial virulence using rabbit skin liquefaction model. Virulence, 1(3);156-163.

3.

Gottfried ON, Dailey AT. Mesenchymal Stem Cell and Gene therapies for Spinal Fusion. Topic Revjew. Neurosurgery 2008;63-3.

4.

Orme I and Juarrero MG. Animal Models of Mycobacterium tuberculosis Infection. Current Protocol in Microbiology. John Wiley and Son Inc, 2007.

5.

Poelstra KA, Barekzi NA, Grainger DW, Gristina AG, Schuler TC. A Novel Spinal Implant Infection Model in Rabbits. SPINE 2000;25(4);406-410.

6.

Bierry G, et al. Percutaneous Inoculated Rabbit Model of Intervertebral disc space infection: Magnetic Resonance Imaging Features v,..-ith Pathological Correlation . .Joint Bone Spine 2008;75:465-470.

7.

Chan JK. A Study of Osteocyte Apoptosis by Region and Quadrant in Murine Cortical Bone. 201 1 . Faculty of Ca#fornia Polytechnic State University, San Luis Obispo.

8.

Arantzazu M, et al. Osteoclast Control Osteoblast Chemotaxis via PDGF BB/PDGF Receptor Beta Signaling. Plos One 2008:3.

9.

Leonardi E, et al. Osteogenic propetiies of late adherent sub populations of human bone marrow stromal cells. Histochem Cell Bioi 2009;132:547-557.

10.

Zychowicz

ME.

Osteomiicular

Manifestations

of

A1ycobacterium

Tuberculosis Infection. Orthopaedic Nursing 2010;29(6). 11.

Nather A, David V, Teng J, Lee C, Pereira B . Effect of Autologous Mesenchymal Stem Cells on Biological Healing of Allografts i n Critical-


73

sized Tibial Defects Simulated in Adult Rabbits. Ann Acad Med Singapore 2010;39:599-606.

Vats A, Tolley NS, Buttery DK, Polak .TM. The Stem Cells in Orthopaedic Surgery. The Journal of Bone ami Joint Surgery (BR) 2004;86B(2): 159164. 13.

Bilousova G, et al. Osteoblasts derived :fi·om I nduced Pluripotent Stem Cells form Calcified Structures in Scaffolds both in vitro and in vivo. Sten1Cells.

I_.

Nair SP, Meghji S, Wilson M, Reddi K, White P, Henderson B. Bacterially Induced Bone Destruction: Mechanism and Misconception. Infection and Immunity 1996;64(7):23 71-2380.

15..

Bozic K, et al. In Vivo Evaluation of Coralline Hydroxyapatite and Direct Current Electrical Stimulation in Lumbar Spinal Fusion. SPINE 1999; 24(2 0): 212 7-2133.

5.

Rahyussalim, Kurniawati

T,

Rukmana A, Albar 1 , Fitri AD. The Potential

Spread of lv!ycobacterium tuberculosis into the Environment in the Creation ofTB Spondylitis Rabbit Models. 1.

Mensyuknil

H,

Rahyussalim, Yuyus K, Kurniawati T.

Effect

of

Mycobacterium tuberculosis debris and supernatant on bone marrow stromal cells gro\\lth.


74

Appendix Table Ossitication Scoring Detem1ination Hasil

Skor

Hasil

Skor

Hasil

Skor

Hi tung Osteoblas

lesi T 1 2

Negatif

Normal

5

posit if

15

Hitung Osteosit

lesi T l 2

Negatif

Normal

5

positif

15

Kadar Kalsium

lesi T l 2

Negatif

Normal

5

positi f

15

Total

45


75

Lampiran 4. 3 Draft Publikasi III Penga.-uh Transplantasi Sel Punca Mesenkimal Ter·hadap Perubahan Parameter Mikrobiologis dan Histopatologis Kclinci Spondilitis Tubcrkulosis Menuju Proses Penyembuhan *Rahyussalim, * *Tri Kumiawati, *** A gus Syahrurachman, *** Andriansjah, *Errol U.

Hutagalung, *Jsmail, ****Diah lskandriati, *"'*** Ekowati Handharyani

*Departemen Orthopaedi dan Traumatologi Fakultas Kcdoktcran Universitas Indonesia * *Kiaster Stem Cell and Tissue Engineering, MERC Fakultas Kedokteran Un iversi tas Indonesia ***Departernen Mikrobiologi Kl inik Fakultas Kcdoktcran Universitas Indonesia *** *Pusat Studi Satwa Primata lnstitut Pertanian Bogor **** *Rumah Sakit Hewan lnstitut Pcrtan ian Bogor

ABSTRAK

Latar Belakang: Sel punca mesenkimal (SPM) memiliki potensi imunomodu]ator dan membantu memperbaiki jaringan yang rusak. Keberadaan SPM pada Jingkungan mik.roskopis baktcri Mycobacterium tuberculosis diharapkan mampu menekan aktifitas bakteri dalam berproliferasi. Penelitian ini bertujuan untuk melihat pengaruh transplantasi SPM secara langsung pada defck korpus vertebra kelinci spondilitis tuberkulosis terhadap perubahan parameter mikrobiologis dan histopatologis menuju proses penycmbuhan secara in vivo. Metode : Empat belas ekor kelinci spondilitis tuberkulosis (ST) dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok perlakuan (n=7) dan kelompok kontrol (n=7). Kelompok perlakuan menjalani prosedur intervensi TTSSA6, penempatan skafold, transplantasi SPM dan pemberian OAT, sedangkan kelompok kontrol mcnjalani prosedur yang sama tanpa tranplantasi SPM. Dilakukan pemeriksaan Thl dan Th2 dari darah, pemeriksaan mikrobiologi dan histopatologi terhadap jaringan lesi yang berasal dari kedua kelompok tersebut setelah waktu inkubasi 6 minggu. Hasil pemeriksaan diuji secara statistik dan digunakan untuk menentukan nilai skoring kesembuhan. Hasil : Sesudah 6 minggu dilakukan transplantasi SPM teijadi peningkatan populasi Thl darah dari 4,79% (SD = 2,35) menjadi 30,90% (SD = 30,23), dan penurunan populasi Th2 darah dari 42,74% (SD = 10,23) menjadi 29,26% (SD = 34,95). Terjadi pula peningkatan rasio populasi Th Iffh2 dari 0, 1 2 (SD = 0,08) menjadi 5,84 (SD = 7.80). Hasil pemeriksaan mikrobiologi menunjukkan 3 dari 7 ekor kelinci perlakuan mengalami kesembuhan (3/7, 42.9%), demikian pula 4 dari 7 ekor kelinci kontrol (4/7, 5 7 , 1 %), (p = 0,500). Hasil pemeriksaan histopatologi menunjukkan 2 dari 7 ekor kelinci perlakuan dan kontrol mengalami kesembuhan (2/7, 28,6%), (p=0,720). Hasil penghitungan skor kesembuhan menunjukkan bahwa kelompok kelinci perlakuan (n=7; rerata skor 268,57; SD 1 5 ,74) maupun kelompok kelinci kontrol (n=5; rerata skor 264,00; SD 16,73) memiliki nilai skor kesembuhan > 1 05 ( sembuh) (p=0,595). Diskusi : Hasil pemeriksaan terhadap jaringan lesi menunjukkan bahwa secara mikrobiologis didapatkan kesembuban kelinci ST baik pada kelompok perlakuan maupun kontrol, demikian pula secara histopatologis terbukti tidak ada pengaruh transplantasi SPM terhadap reaksi jaringan tubuh terkait proses infeksi bakteri


76

Mycobacterium tuberculosis, hal ini dibuktikan dari perubahan hasil positif menjadi negatif pada 2 dari 7 ekor kelinci (28,6%) baik pada kelompok perlakuan maupun kontrol. KesimpuJan ·: Transplantasi sel punca mesenkimal tidak memberikan pengaruh yang berarti terhadap proses penyembuhan kelinci ST secru·a mikrobiologi dan histopatologi, hasil ini didukung pula oleh hasil penghitungan total skor kesembuhan.

Keywords lvfycobacterium tuberculosis , sel punca mesenkimal, Th l , Th2, BTA, kultur, PCR, kesembuhan.


77

Pendahuluan

Spondilitis tuberkulosis (ST) adalah penyakit infeksi pada tulang belakang yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium

tuberculosis.

ST

mengakibatkan

kerusakan korpus (defek) yang menimbulkan instabilitas tulang belakang dan gangguan struktur eli sekitarnya.

Penyembuhan infeksi bakteri pada ST

d ipengaruhi oleh seberapa berat kerusakan korpus dan infeksi bakteri tersebut eli tulang belakang. 1 •2 Selain itu penyembuhan infeksi juga dipengaruhi oleh asupan gizi, nutrisi dan sistem imun tubuh. 3 Sel punca mesenkimal (SPM) diketahui memiliki potensi sebagai imunoregulator, 45 yaitu mampu meningkatkan sistem imun seluler (sel T) dalam tubuh. Saat ini penggunaan SPM tidak hanya terbatas pacla kasus degenerati.t: namun juga mulai digunakan untuk kasus infeksi sehingga memberi harapan penggunammya pada penatalaksanaan ST. 6 Penelitian m 1 bertujuan untuk melihat pengaruh transplantasi SPM secm·a langsung pada clefek korpus vertebra kelinci ST terhadap perubahan parameter mikrobiologis dan histopatologis menuju proses penyembuhan.

Metode

Penelitian ini merupakan penelitian intervensi pada kelinci, seluruh protokol telah direview clan disetujui oleh Komisi Animal Care and Use Committee (ACUC) PT. Bimana Indomedical No. R.02-12-IR clan Komisi Pengawasan dan Kesejabteraan Penggunaan Hewan Percobaan (KPKPHP) Rumah Sakit Hewan (RSH) lPB No. 02-2 1 0 1 2 RSH IPB dan Komite Etik Penelitian Kesehatan FKUI-RSCM No. 521 /PT02.FK/ETIK/20 l2. Sebagian besar penelitian ini menggunakan fasilitas hewan eli RSH IPB, PT Bimana lndomedical, laboratoriurn Mikrobiologi Klinik FKUI dan laboratorium Patologi Anatomik FKUI Sampel penelitian ini adalah kelinci ST yang telah dilakukan proseclur inokulasi langsung bakteri MTb ke dalam korpus vertebranya dan telah menjalani pemeriksaan diagnosis secma mikrobiologi clan histopatologi setelah 8 minggu waktu inkubasi. Empat belas ekor kelinci spondilitis tuberkulosis (ST) dibagi menjacli 2 kelompok yaitu kelompok perlakuan (n=7) dan kelompok kontrol


78

(n=7). Kelompok perlakuan menjalani prosedur intervensi TTSSA6, penempatan skafold, transplantasi SPM dan pemberian OAT, sedangkan kelompok kontrol menjalani prosedur yang sama tanpa tranplantasi SPM. Sebelum dan sesudah tranplantasi SPM dilakukan pemeriksaan Thl dan Th2 dari darah menggunakan metode flow cytometry. Selama 6 minggu waktu inkubasi dilakukan pemeriksaan klinis yaitu pengukuran berat badan, suhu badan dan tancla-tanda infeksi, sedangkan setelah 6 minggu waktu inkubasi dilakukan pewarnaan BTA, pemeriksaan PCR, kultur dan histopatologi terhadap jaringan lesi terhadap kedua kelompok kelinci ST tersebut. Hasil pemeriksaan diuji secm·a statistik dan digunakan untuk menentukan nilai skoring kesembuhan.

Hasil dan Pembahasan Pemeriksaan lmunologi

Dari hasil pemeriksaan rerata populasi Thl darah kelinci ST kultur posit if tampak terjadi peningkatan dari 4,79% (SD

=

2,35) sebelum transplantasi SPM menjadi

30,90% (SD = 30,23) sesudah transplantasi SPM. Berbeda dengan hasil pemeriksaan rerata populasi Th2 darah pada kelinci ST kultur positif tampak terjadi penurunan dari 42,74% (SD 29,26% (SD

=

=

1 0,23) sebelum transplantasi SPM menjadi

34,95) sesudah transplantasi SPM.

Apabila hasil pengukuran populasi T h l dan Th2 dari kelinci yang sama dibandingkan, maka diperoleh nilai rasio Thl/Th2. Pada penelitian ini tampak te1jadi peningkatan rasio Th l /Th2 dari sebelum transplantasi SPM sebesar 0,12 (SD

=

0,08), menjadi 5,84 (SD

=

7.80) sesudah transplantasi SPM. Sayangnya

semua hasil pemeriksaan ini tidak dapat dibandingkan dan dihitung secara statistik karena jumlah sampel yang terlalu sedikit (n

=

2). Jumlah sampel yang sedikit ini

(hanya 2 dari 4 sampel yang seharusnya) disebabkan karena lisisnya darah kelinci yang akan dianalisis sehingga tidak dapat diukur populasinya dengan alat flow cytometer.


79

Tabel 1 . Rerata populasi Th I , Th2 dan rasio Th Ifrh2 darah kelinci sebelum dan sesudah transplantasi SPM Sebelum Transplantasi SPM Kadar so 2.35 4.79

Kadar Th I

Sesudah Transplantasi SPM Kadar so

p

30.90

30.23

Na

Kadar Th2

42.74

10.23

29.26

.34.95

Na

Rasio kadar Th I frh2

0.12

0.08

5.84

7.80

Na

Pcmeriksaan MikrobioJogi.

Berdasarkan basil pemeriksaan mikrobiologi terhadap material lesi setelah enam minggu transplantasi SPM diperoleh kesembuhan pada tiga ekor ketinci kelompok perlakuan (3/7, 42,9%) dan empat ekor kelinci kelompok kontrol (4/7, 57,1%). Uji Fisher terhadap hasil pemeriksaan ini menunjukkan bahwa secara statistik tidak ada perbedaan yang bermakna dari kesembuhan antar kedua kelompok kelinci ST tersebut (p

=

0.500).

Tabel 2. Hasil Pemcriksaan Oiagnostik Secara Mikrobiologi untuk Evaluasi Kesembuhan KeJ]nci ST PCR Kelompok Kriteria Kultur Kode kelinci BTA K0520

Negatif

Negatif

Negati f

tanpa SPM

Sembuh

K3364

Negatif

Negatif

Negatif

tanpa SPM

Sembuh

K2664

Negatif

Negatif

Negatif

tanpa SPM

Sembuh

K0525

Negatif

Negatif

Negatif

tanpa SPM

Sembuh

K0505

Negatif

Negatif

Negatif

dengan SPM

Sembuh

K0964

Negatif

Negatif

Negatif

dengan SPM

Sembuh

K2964

Negatif

Negatif

Negati f

dengan SPM

Sembuh

KOSO!

Negatif

Negatif

Positif

tanpa SPM

tidak sembuh

K05 1 7

Positif

Negatif

Negatif

tanpa SPM

tidak sembuh

K2764

Positif

Negatif

Positif

tanpa SPM

tidak sembuh

K3 1 64

Negatif

Negatif

Positif

dengan SPM

tidak sembuh

K0509

Negatif

Negatif

Positif

dengan SPM

tidak sembuh

K3264

Negati f

Negatif

Positif

dengan SPM

tidak sembuh

K0519

Negatif

Negatif

Positif

dengan SPM

tidak sembuh

Pemeriksaan Histopatologi.

Berdasarkan basil pemeriksaan histopatologi terhadap material lesi setelah enam minggu transplantasi SPM diperoleh kesembuhan yang sama pada kelinci ST kelompok perlakuan dan ketompok kontrol yaitu 2 dari 7 ekor kelinci (2/7, 28,6%). Uji Fisher terhadap hasit pemeriksaan ini menunjukkan bahwa secm·a


80

statistik tidak ada perbedaan yang bermakna dari kesembuhan antar kedua kelompok kelinci ST tersebut (p = 0, 720). Tabel 3 Hasil Evaluasi Kesembuhan Kelinci ST Berdasarkan Hasil Pemeriksaan MikJobiologi dan Histopatologi Modalitas Pemeriksaan

Prosentase kesem buhan Dengan SPM Tanpa SPM N % N

p %

Mikrobiologi

3 (317)

42,9

4 (417)

57,1

0,500

1-listopatolgi

2 (217)

28,6

2 (2/7)

28,6

0,720

Hasil Sko.-ing Kesembuhan Kelinci Spondilitis tube.-kulosis Tabel 4. 1-!asil penghitungan nilai SSK setiap kelinci terinteksi enam minggu pasca intervensi penatalaksanaan. Kode kelinci

Th I Darah skor

Th2 Darah Skor

Pewamaan BTA Skor

Kultur

PCR

Total skor

Keterangan

Skor

Histopatologi Mtb skor

Skor

KOSO!

50

30

50

50

30

30

240

sembuh

K0520

50

30

50

50

50

30

260

sem buh

K05 1 7

50

K3364

50

30

30

50

50

50

260

sembuh

50

50

50

50

30

280

sembuh

K2764

50

50

50

50

30

50

280

sembuh

K2664

50

50

50

50

50

30

280

sembuh

K0525

50

50

50

50

50

30

280

sembuh

K3 1 64

50

50

50

50

30

30

260

sembuh

K0509

na

na

50

50

30

30

na

K0505

50

50

50

50

50

30

280

K0964

na

Na

50

50

50

50

na

K2964

50

50

50

50

50

30

280

sembuh

10264

50

30

50

50

30

30

240

sembuh

K05 1 9

50

50

50

50

30

30

260

Sembuh

sembuh

Nilai skor = I05 sembuh

Tabel 4. memperlihatkan hasil penghitungan skor masing-masing kelinci. Terdapat 2 ekor kelinci (K0509 dan K0964) yang tidak memenuhi syarat dalam penghitungan skor karena tidak memiliki hasil pengukuran yang lengkap, akibatnya kelinci ST ke]ompok perlakuan yang ditransplantasikan SPM hanya memiliki 5 sampel (n=5), dan kelinci ST kelompok kontrol yang tidak ditransplantasikan SPM tetap memiliki 7 sampel (n=7). Nilai skor kesembuhan kelinci ST kelompok perlakuan maupun kontrol

>

1 05, artinya seluruh kelinci


81

(n= 12) menunjukkan kesembuhan setelah dilakukan intervensi penatalaksanaan baik ditransplantasikan SPM maupun tidak. Walaupun secm·a statistik hasil ini tidak menunjukan perbedaan yang bermakna (p=0,595), tetapi dapat dilihat bahwa nilai skor rata-rata kelinci ST kelompok kontrol ternyata lebih besar (n=7; rerata skor 268,57; SD 1 5, 74) dibandingkan dengan nilai skor rata-rata kelinci ST kelompok perlakuan (n=5; rerata skor 264,00; SD 16,73).

Pembahasan : Kesembuhan Kelinci Spondilitis tuberculosis (ST)

Kesembuhan

diartikan

sebagai

perbaikan kondisi

klinis,

perbaikan hasil

pemeriksaan imunologi serta perubahan basil pemeriksaan mikrobiologi dan histopatologi menjadi negatif Perbaikan kondisi klinis dapat diamati berdasarkan data perubahan berat dan suhu badan sebelum tranplantasi SPM dan sesudah tranplantasi SPM. Perbaikan basil pemeriksaan imunologi diamati dari perubahan jumlah populasi Th I dan

Th2

serta rasio populasi Thl/Th2 antara sebelum dan sesudah dilakukan transplantasi SPM. Perubahan basil pemeriksaan mikrobiologi 9

dan histopatologi diamati sekaligus berdasarkan perubahan hasil pewarnaan BTA, pemeriksaan kultur, PCR dan histopatologi 10 dari positif menjadi negatif Sayangnya pada penelitian ini terdapat 2 sampel darah yang beku dalam prosesnya pengukuran populasi Thl -Th2 sehingga tersisa sampe I hanya 2 ekor kelinci dari 4 yang seharusnya. Perubahan Berat Badan Kelinci.

Proses infeksi sistemik secara tidak langsung berpengaruh terhadap penambahan berat badan kelinci. Pengaruh ini berkaitan dengan nafsu makan, peningkatan kebutuhan nutrisi dalam mekanisme melawan proses infeksi, daya tahan tu buh dan virulensi bakteri. Pada gambar I diperlihatkan pola penambahan berat badan kelinci setiap 3 hari dimulai sejak prosedur inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis. Terjadi penambahan rerata berat badan kelinci ST pada kedua kelompok baik kelompok perlakuan yang ditransplantasi SPM (grafik warna hijau) maupun ke!ompok kontrol yang tidak ditransplantasikan SPM (warna kuning). Kedua grafik menunjukan garis lurus yang paralel dengan perbedaan yang secm·a statistik tidak bermakna (p=0,707). Hal ini memberikan kesan bahwa


82

SPM sesungguhnya tidak berperan baik langsung maupun tidak langsung dalam peningkatan berat badan. Bila dibandingkan dengan grafik peningkatan rerata berat badan sebelum intervensi dilakukan (sebelum hari ke-43) yang menunjukan bahwa inokulasi bakteri tidak memberikan pengarub terha?ap peningkatan rerata berat badan kelinci, maka sangat logis jika transplantasi SPM bersamaan dengan upaya mereduksi infeksi pada lesi ST kelinci juga tidak mempengaruhi penambahan berat badan kelinci.

:t'-l)r(l

-----·--------······

· ·····-------------------------

�w

7�lfl

LWO

�

1::.00

1000

""

()

---------- ··-- ---··-----··--

0

1

·1

7

10 H 1G

1� · 2l

i�

.......

l$

··-···-...............�···--- . . . .

3.1

�_,

·········-······--·-<>••···--·------····

37 1:0 •H -iG -1:;) 52 ��

�a G.!

��

...

..

..................._

f17 70 n . 7G 7� S.2 85

83 91 ?1 ?1

Gambar 1 . Grafik Perubahan Berat Badan Kelinci Selama Penelitian. Garis kuning menunjukan grafik perubahan berat badan kelompok kelinci ST yang pada minggu ke-8 ditatalaksana tanpa transplantasi SPM. Garis hijau menunjukan grafik perubahan berat badan kelompok kelinci ST yang pada minggu ke-8 ditatalaksana dengan transplantasi SPM. Panah merah menunjukan waktu intervensi tatalaksana yang dilakukan pada hari ke 43.

Perubahan Suhu Badan Kelinci.

Peningkatan atau penurunan suhu badan dari suhu nonnal merupakan informasi yang penting diketahui pada kasus infeksi, walaupun perubahan suhu ini tidak selalu berhubungan dengan proses infeksi dan dapat saja terjadi karena proses trauma, peradangan non infeksi ataupun proses peningkatan metabolisme lainnya. Pad a gambar 2 diperlihatkan po Ia perubahan suhu badan kelinci setiap 3 hari dimulai sejak prosedur inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis. Terjad i f1uktuasi perubahan rerata suhu badan kelinci ST pada kedua kelompok baik kelompok perlakuan yang ditransplantasi SPM (grafik warna hijau) maupun kelompok kontrol yang tidak ditransplantasikan SPM (warna kuning). Kedua grafik menunjukan adanya perbaikan suhu badan mendekati suhu badan sebelum


83

dilakukan inokulasi dan berada dalam kisaran suhu normal kelinci yaitu antara 39,0 derajat selsius dan 39,5 derajat selsius. Dari grafik ini dapat dilihat bahwa transplantasi SPM tidak memberikan dampak pada perubahan suhu badan kelinci, tetapi perubahan suhu badan tampaknya lebih didominasi oleh pemberian OAT yang berpengaruh langsung dalam menurunkan aktifitas bakteri didalam badan dan intervensi TTSSA6 yang berdampak langsung pada reduksi debris di dalam lesi korpus vertebra. Pada periode enam minggu setelah tranplantasi, SPM tidak nampak berperan secara sistemil( dalam mengantisipasi penurunan suhu, namun dalam jangka panjang SPM secm·a teoritis dapat mencegah rekurensi infeksi karena SPM memiliki kemampuan sebagai agen imunitas. ············-·-

��

.....

.

:r 33,5

�

')/,'>

.

.

..

_ _ __ -.. ....... ............... .. .._ ,

..

...........____ ____,

..........................................�

,

............_ _ .. . _ .................................................................... ,...._ .................................................... .. .......

..

�-

� �� l�'\l ¢� V'1l�7 ��

1q,;

39

.

.............................. ··········------ ·----------

....-..................................................................... .. , ..,_. ... ................................ ...... .....

. --_ 0). .

�

<)

r --4\ _L__ 'ff o

- --

D-

q

,

·

,. I

\1 c

'¢

�

_______ _

-�

·· -

---- --- --------- · . -----------. -

� _ B _ _ _ __ __ __ _

-

..

------- ----·-···----·

...

--- __________________ . .._ .....

____ ,._ _ _ _ _ ....... _ _ _ _ , ,_,...........-... .-- ·-----_

.'II II

1

�

I

111

1.1 1h I� J) '1.'> JH :11 :1�

.II �II �:1 �- A4 �I >� -,x hi

h< hi Iii il lh )q kl

X; HH '11 '!4

�/

Gambar 2 Grafik Perubahan Suhu Badan Kelinci Selama Penelitian. Garis kuning menunjukan grafik perubahan suhu badan kelompok kelinci ST yang pada minggu ke-8 ditatalaksana tanpa transplantasi SPM. Garis hijau menunjukan grafik perubahan suhu badan kelompok kelinci ST yang pada minggu ke-8 ditatalaksana dengan transplantasi SPM. Panah merah menunjukan waktu intervensi tatalaksana yang dilakukan pada hari ke 43.

Hasil Pemeriksaan Imunologi

Secm·a imunofenotipik sel T terdir i dari limfosit T helper, disebut juga clusters of differentiation 4 (CD4) karena mempunyai molekul CD4+ pada permukaannya, jumlahnya 65% dari limfosit T darah tepi. Sebagian kecil (35%) lainnya berupa limfosit

T

supresor atau

sitotoksik,

mempunym

molekul

CD8+

pada

permukaannya dan sering juga disebut CDS. Sel T helper (CD4) berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi sel T helper 1 (Th 1 ) dan sel T helper 2 (Th2). Subset sel T tidak dapat dibedakan secara morfologik tetapi dapat dibedakan dm·i perbedaan


84

sitokin yang diproduksinya. Sel Thl membuat dan membebaskan sitokin tipe 1 meliputi IL-2, IL- 1 2 , IFN-g dan tumor nekrosis faktor alfa (TNF-a). Sitokin yang dibebaskan oleh Th 1 adalah aktivator yang efektif untuk membangkitkan respons imun seluler melalui pola Thl . Sel Th2 membuat dan membebaskan sitokin tipe 2 antara lain IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, dan IL-l 0. Sitokin tipe 2 menghambat proliterasi sel Th 1, sebaliknya sitokin tipe 1 pembebasan

sitokin

tipe

2 . 1 0, 1 7 , 1 9.7•8

menghambat produksi dan

Jumlah

populasi

Thl

dan

Th2

mencerminkan respon imunitas tubuh terhadap perlawanan infeksi. Populasi Th 1 yang meningkat secm·a signifikan pada kelinci ST kelompok

perlakuan

menunjukkan bahwa proses peyembuhan sedang berlangsung. Data ini didukung oleh peningkatan yang tidak signifikan populasi Th2.

)0.00

:-

--- -··································-····-···---

uo

·····················································································-

�:� -[:-= -=--r � /��->-,!1m •• lllCll J,W

__/ _ � ,

------- - -

•"

----······

Ii �

Grafik Perubahan Populasi Thl, Th2 dan Rasio Thl/Th2 dari Keli nci ST Kelompok Perlakuan dan Kontrol . Popula si ini diukur dalam 4 periode waktu yaitu minggu ke-0 sebelum dilakukan inokulasi, minggu ke-5 setelah inokulasi, minggu ke- 1 1 setelah i n tervens i penatalaksanaan dan m inggu ke- 1 4 setelah intervensi penatalaksanaan menjelang eutanasia. Gambar 3.

Gambar 3 . memperlihatkan profil peningkatan populasi Thl , Th2 dan rasio Thl/Th2 dimana kelinci ST kelompok perlakuan menunjukan peningkatan yang lebih rendah daripada kelinci ST kelompok kontrol. Gambaran ini dapat memberikan beberapa asumsi bahwa: pertama transplantasi SPM memberikan perlindungan pada bakteri MTb dengan menekan proliferasi sel Thl sehingga jumlah populasi sel Thl kelinci ST kelompok perlakuan menurun, kondisi ini menimbulkan konsebvensi bahwa transplantasi SPM justm menghambat upaya pembunuhan bakteri MTb; kedua dapat pula bermii bahwa transplantasi SPM justru memberikan dampak kesembuhan lebih awal dimana SPM mampu menggantikan sebagaian peran dan fungsi sel Thl dalam memberikan perlawanan terhadap infeksi sehingga peningkatan populasi Thl yang tajam

tidak terjadi

pasca prosedur intervensi. Diperlukan data pendukung lain untuk memperkuat


85

asumsi mana yang lebih sesuai untuk menilai peranan T h l dan Th2 da]am meramalkan peranan SPM sebagai agen imunitas.

Hasil Pemeriksaan Mikrobiologi dan Histopatologi

Pcmeriksaan mikrobiologi dengan 3 modalitas pemeriksaan pcwarnaan BTA, kultur dan PCR

lebih mendukung asumsi

pertama dimana pada kelompok

perlakuan yang ditransplantasikan SPM jumlah kelinci ST yang sembuh hanya 3 dari 7 ekor kelinci ST (42,9%), sementara pada kclompok kontrol yang tidak ditransplantasikan SPM jumlah kelinci yang sembuh lebih banyak yaitu 4 dari 7 ekor kelinci ST (57,1%). Kesembuhan secara mikrobiologi cliartikan bila ketiga modalitas

pemeriksaan

pewarnaan

BT A,

kultur

dan

PCR

seluruhnya

menunjukkan hasil negatif pada satu kelinci setelah dilakukan intervensi penatalaksanaan. Pemeriksaan histopatologi terhadap lesi ST di lakukan dcngan cara mengamat i reaksi tcrhadap proses infeksi yang berlangsung di jaringan tulang korpus melalui pulasan hematoxilin-eosin. Kesembuhan secara histopatologi diartikan bila terjadi perubahan hasil dari positif menjadi negatif yang mcnunjukan hilangnya reaksi jaringan terhadap proses infeksi. Hasil pemeriksaan histopatologi jaringan lesi pada kelinci ST kelompok perlakuan yang ditransplantasikan SPM dan kelinci kelompok

kontrol

yang

tidak

ditransplantasikan

SPM,

masing-masing

menunjukkan perubahan 2 clari 7 sampel histopatologi yang positif menjadi negatif (28,6%), hal ini menunjukkan bahwa tidak ada pengaruh tranplantasi SPM terhadap penurunan reaksi jaringan terhadap proses infeksi MTb. Hasil kedua pemeriksaan ini dapat dilihat pada tabcl 3 . Skoring Kesembuhan

Untuk mencntukan secara objektif kesembuhan kelinci ST pasca tindakan penatalaksanaan berupa TTSSA6, pemberian OAT, penempatan skafold dan transplantasi SPM dikembangkan suatu sistem skoring yang disebut sebagai Sistem Skoring Kesembuhan (SSK). Sistem ini menganalisis kesembuhan dari beberapa faktor risiko yang digunakan dalam penegakan diagnosis dan evaluasi kemajuan capaian pengobatan yaitu pemeriksaan imunologi (populasi Thl dan


86

Th2);

pemeriksaan mikrobiologi (pewarnaan BTA, pemeriksaan ku!tur, dan

PCR); dan pemeriksaan histopatologi (pemeriksaan jaringan lesi dengan pulasan HE) seperti yang diper!ihatkan tabeJ 4. Dari tabel ini dapat dilihat pula nilai skor untuk masing-masing hasil pemeriksaan. Total skor penelitian ini adalah 300 dan nilai batas kesembuhan ditetapkan oleh peneliti dengan pengertian : tidak sembuh bila nilai skor kurang dari 1 05, sementara dikatakan sembuh bila nilai skor sama atau lebih daripada 1 05.

1-lasil penghitungan nilai SSK terhadap kelinci ST

kelompok perlakuan dan kontrol mendukung asumsi pertama dimana SPM justru memberikan dampak perlindungan terhadap bakteri MTb.

Kesimpulan

I ) Transplantasi sel punca mesenkimal pada defek kelinci spondilitis tuberkulosis memberikan dampak perbaikan secm·a imunologi dengan menurunnya respon Th2 dan peningkatan rasio Th 1 /Th2. 2) Transp]antasi set punca mesenkimal tidak mempengaruhi kesembuhan kelinci ST berdasarkan hasil pemeriksaan mikrobiologi, hal ini didukung oleh hasil penghitungan total skor kesembuhan. 3 ) Dengan dikembangkannya Sistem Skoring Kesembuhan maka peranan sel punca mesenkimal dalam mencapai kesembuhan dapat dinilai secara objektif.

Saran

Diperlukan penelitian untuk mengembangkan sistem skoring kesembuhan yang sangat berguna bagi penelitian selanjutnya dalam memberikan penilaian objektif terhadap

kumpulan

berbagai

faktor

yang

berkontribusi

pada

penilaian

kesembuhan spondilitis tuberkulosis.


87

Daftar Pustaka

I.

Schlossberg,

D.

Tuberculosis and Non tuberculous Mycobacterial

Infections. Fifth Edition, McGraw-Hill 2006. 2.

Sapardan, S. Total Treatment o.f Tuberculosis of The Spine. A Rational Problem Solving Approach, Perpustakaan Universitas Indonesia, 2004.

3.

Nair SP, Meghji S, Wilson M, Reddi K, White P, Henderson B. Bacterially Induced Bone Destruction: Mechanism and Misconception. Infection and Immunity 1 996;64(7):2371 -2380.

4.

Shirley H. J. M, et al. j\!Jesenchymal Stem Cells Reduce Inflammation while Enchanching Bacterial Clearance and Improving Survival in Sepsis. Am J Respir Crit Care Med Vol l 82. Pp 1 047-57, 2 0 1 0

5.

Ramesh Chandra Rai, Debapriya Bhattacharya and Gorbadan Das. Stem Cells in I nfection Diseases. Insight and Control of Infection Disease in Global Scenario. Intech ISBN 978-953-5 1 -03 1 9-6

6.

Kaufmann S. How Can Jrrununology Contribute to The Control of Tuberculosis? Nature Review [nununology 200 1 ; 1 .

7.

Dheda K, Schwander S, Zhu B , Richard N , Smit V, Zhang Y. The Immunology of Tuberculosis: From Bench to Bedside. Respirology 201 0; 15:433-450.

8.

Rook GA W, Seah G, Ustianmvski A.

.M.

tuberculosis: immunology and

vaccination. Eur Respir 2001 ; 1 7:537-557. 9.

Ordway D, et al. Animal model of Mycobacterium abscessus lung infection. Journal of Leucocyte Biology 2008;83.

1 0. Basaraba RJ. Experimental tuberculosis: the role of comparative pathology in the

discovery of improved tuberculosis treatment strategies.

Tuberculosis 2008;88.


88

Lampiran Sistem Skoring Kesembuhan

Sistem Skoring Kesembuhan Hasil

skor

Hasil

Skor

hasil

Thl Darah

M-14

N

Th2 Darah

M-14

Pewarnaan BTA

M-14

Positif3

Positif2

Kultur

M-14

Positif3

PCR

M-14

Histopatologi Mtb

Lesi Tl2

.

skor

basil

skor

30

>N

50

N

30

>N

50

15

Positif I

30

Negatif

50

Positif2

15

Positif I

30

Negatif

50

Positif3

Positif2

15

Positif l

30

Negatif

50

Positif3

Positif2

15

Posi ti f l

30

Negatif

50 300

Total Nilai skor <105 tidak sembuh, nilai skor >= 105 sembuh


89

Mesenchymal Stem Cell Effects on Microbiological and Histopathological Alterations in Spondylitis Tuberculosis Rabbit's Healing Process *Rahyussalim, **Tri Kurniawati, ***A gus Syahrurachman, *** Andriansjah, *Errol U. Hutagalung, *Ismail, ****Diah lskandriati, ***** Ekowati Handharyani

*Department of Orthopaedic and Tra umatology Faculty of Medicine University of Indonesia **Stem Cell and Tissue Engineering Cluster, MERC Faculty of Medicine University of Indonesia ***Department Microbiology Clinic f-aculty ofMedicine University of Indonesia ****Primata Research Center Bogor Agricultural Institute *****Veterinary Teaching Hospital Bogor Agricult ura l Institute

ABSTRACT Background: Mesenchymal Stem Cell (MSC) has the potency to modulate immune response and to repair tissues. The existence of MSC in Mycobacterium tuberculosis microscopical environment is hoped to reduce its proliferating activity. This research aims to observe the dr i ect MSC transplantation effect on the vertebral body defect in Spondylitis Tuberculosis (ST) rabbit on microbiological and histopathological aspects of bone healing in vivo. Methods: Fourteen ST rabbits were divided into two groups which are the treatnient (n=7) and the control group (n=7). The treatment group underwent TTSSA6 intervention procedure, scaffo ld and MSC transplantation and anti U1berculosis drugs administration, meanwhile control group underwent the same procedure as treatment group without MSC transplantation. Thl and Th2 along with microbiological and histopathological examination on the tissue lesion from both group were analysed from blood after 6 weeks of incubation. The results were tested statistically and the healing score was calculated. Results: Six weeks after MSC transplantation, Thl was increased from 4.79% (SD= 2.35) into 30.90% (SD = 30.23) and Th2 was decreased from 42.74% (SD = 1 0.23) into 29.26% (SD = 34.95). T h l /Th2 population was increased from 0.12 (SD = 0.08) into 5.84 (SD = 7.80). Microbiological examination showed healing of 3 out of 7 treatment rabbits group (3/7, 42.9%) and 4 out of 7 control rabbits group (4/7, 57.1%); (p 0.500). Histopathological examination showed healing of 2 from 7 treatment rabbits and also 2 fi·om 7 control rabbits group (2/7, 28.6%); (p = 0.720). Hence the healing score of both the treatment group (n=7; mean score 268.57; SO = 1 5.74) and the control group (n=5; mean score 264.00; SD = 1 6.73) were all above 105 (healed) (p = 0.59 5). Discussion: Microbiological and histopathological examination on tissues lesion shows a good healing process :fi·om both treatment and control group which show that there is no etiect of MSC transplantation to the immune response system on the infection of Mycobacterium tuberculosis which is shown on the alteration of positive into negative results :fi·om 2 out of7 rabbits on both groups. Conclusion: Mesenchymal stem cell transplantation does not have significant effect on ST rabbit's healing process micro biologically and histopathologically shown by the same total healing score. =

Keywords: Mycobacterium tuberculosis,

culture, PCR, healing


mesenchymal stem cell, Th 1, Th2, Acid fast bacilli,

90

Background

Tuberculosis (TB) spondylitis is an infectious disease of the spine which is caused by Mycobacterium tuberculosis. TB spondylitis causes defect ofthe corpus which can lead to spinal instabi lity and disturbance of surroun �ing tissue. Healing of bacterial infection in TB spondylitis is cleten11ined by the severity of corpus defect and the bacterial infection in the spine. 1 .2 Besides, infection healing is also influenced by food intake, nutrition, and immune system ofthe body. 3 Mesenchymal Stem Cell (MSC) has a well-known potention as immunoregulator that is able to increase cellular immune system of the body tlu·ough T cell enhancement.4·5 MSC application is not limited to degenerative cases, but also has 6 a role in acquired disease (infection) cases. The purpose of this research is to evaluate the effect of direct MSC transplantation onto a TB spondylitis rabbit on microbiological and histopathological aspects of bone healing in vivo.

Methods

This l'esearch is an interventional research using rabbits as animal model The research protocol has been reviewed and approved by: (1) Animal Care and Use Committee (ACUC) PT Bimana Indomec!ica) No. R.02-12-JR, (2) "Komisi Pengmvasan dan Kesejahteraan Penggunaan 1-Iewan Percobaan" (KPKPHP) IPB Animal Hospital No. 02-2 1 0 1 2, (3) Medical Research Unit (MRU), Research Ethical Committee FMUI-RSCM No. 521 /PT02.FK/ETIK/2012. The majority of the research process lies in IPB Animal Hospital Lab, PT Bimana Indomedical, Clinical M icrobiology Lab FMUI, and Pathology Anatomy Lab FMUI. The research samples are rabbits inoculated directly with M. tuberculosis within its

vertebral

body

(corpus)

and

diagnosed

with

microbiological

histopathological examination after 8 weeks incubation period.

and

Fourteen ST

rabbits were divided into two groups which are the intervention group ( n=7) and control group (n=7). The intervention group underwent TTSSA6 procedure, scaffold and MSC transplantation, and also antituberculosis drugs regimen. Meanwhile, control group underwent TTSA6 procedure and antituberculosis drugs regimen without MSC transplantation. Th 1 and Th2 were analysed from


91

blood before and after MSC transplantation using flow cytometry. During 6 weeks of incubation, clinical examinations (body weight, body temperature, and infection signs) were conducted. After incubation, we analyze BTA stain, PCR, culture, and histopathologic feature tissue lesion from both group. The results were tested statistically and the healing score was calculated.

Results Immunologic

According to the results, the mean population of Th 1 in positive culture of ST rabbit rises fi·om 4.79% (SD=2.35) to

30.90% (SD=30.23) after MSC

transplantation. This result differs compared to Th2 mean population which decreases fi·om 42.74% (SD=1 0.23) into 29.26% (SD=34.95) after MSC transplant. From the acquired data, we can calculate the increment of Th 1 /Th2 ratio from 0.12

(SD=0.08) into

5.84

(SD=7.80) after MSC transplant.

Unfortunately, we cannot extrapolate this data statistically because the sample size is too little (n=2). This minimal sample is caused by specimen (blood) lysis of the ST rabbit that, in turn, cmmot be analyzed by the t1ow cytometer. Table l .Mean population ofTh l , Th2, and Th I/Th2 ratio before and after MSC transplant Before transplant Alter transplant p SO Level SD Level Thl

level

Th2 1evel Th i!Th2

ratio

4.79

2.35

30.90

30.23

Na

42.74

10.23

29.26

34.95

Na

0. 1 2

0.08

5.84

7.80

Na

Microbiologic

Statistically, there was no significant difference between intervention group and control group inspite of cure rate after 6 weeks of initial MSC transplant. I n control group, cure rate i s 4/7 rabbits (57.1%) while the intervention group gave 3/7 (42.9%) healed rabbit after MSC transplant This result was confirmed with Fisher exact test (p = 0.500).


92

Table 2. Evaluation of Cure Rate Based on Microbiologic Examination Subject Coding BTA PCR Culture Group Criteria K0520

Nega tive

N egative

Negative

Without SPM

Cured

K3364

Negative

Negative

Negative

Without SPM

Cured

Negative

Negative

Without SPM

Cw·ed

Without SPM

Cured

Negative

With SPM

Cured

Negative

With SPM

Cured

K2664

Negative

K0525

Negative

Negative

K0505

Negative

Negative

K0964

Negative

Negative

K2964

Negative

K0501

Negative

Negative

K05 1 7

Positive

K2764

Positive

Negative

N egative

Negative Positive

With SPM

Cured

Without SPM

Not Cured

Negative

Negative

\'-lithout SPM

Not Cured

Negative

Positive

Without SPM

Not Cured

K 3 1 64

Negative

Negative

Positive

With SPM

Not Cured

K0509

Negative

Negative

Positive

With SPM

Not Cured

K3264

Negative

Negative

Positive

With SPM

Not Cured

K05J9

Negative

Negative

Positive

With SPM

Not Cured

Histopathologic

There was no statistical significance of cure rate after 6 weeks of MSC transplant betw·een intervention and control group. The cure rate is identic in both groups, V·ihich is 2/7 rabbits (28,6%). This result has been confirmed with Fisher exact test (p = 0,720). Table 3. Comparison ofST Rabbits Cure Rate Between Microbiologic and Histopathologic Parameter Cure Rate With SPM Without SPM Parameter p n % n % Microbiology

3 (317)

42,9

4 (4/7)

57

1

0,500

Histopathology

2 (2/7)

28 6

2 (2/7)

28,6

0,720

,

,

Healing Score of ST Rabbits

Along the analysis process, there were 2 rabbits (K0509 and K0964) that must be excluded due to incomplete parametric measurement. Alas, intervention group only had five ST rabbits (n=5). The control group still got seven members (n=7). Total healing score in both groups are

>

1 05, which means all of the ST rabbits

(n=12) is cured with and without MSC transplant. Eventhough statistically insignificant (p=0,595), but the mean value of healing score in control group is


93

higher (n=7; mean 268,57; SD 1 5,74) compared to intervention group (n=5; mean 264,00; SD 16,73). Table 4. Healing Score ofST Rabbits Six Weeks Post MSC Transplant Subject Coding

Blood Thl

Blood Th2

Culture Score

PCR Score

30

BTA Staining Score 50

Total Score

Addendum

30

Mtb Histopathologic Score 30

KOSO I

50

50

240

Cured

K0520

50

30

50

50

50

30

260

Cured

K05 1 7

50

30

30

50

50

50

260

Cured

K3364

50

K2764

50

50

50

50

50

30

280

Cured

50

50

50

30

50

280

Cured

K2664

50

50

50

50

50

30

280

Cured

K0525

50

50

50

50

50

30

280

Cnred Cured

.

K3 1 64

50

50

50

50

30

30

260

K0509

NA

NA

50

50

30

30

NA

K0505

50

50

50

50

50

30

280

K0964

NA

NA

50

50

50

50

NA

K2964

50

so

50

50

50

30

280

Cured

K3264

50

30

so

50

30

30

240

Cured

K05 1 9

50

50

50

50

30

30

260

Cured

Cured

�13: Score
Discussion Cure Rate of ST Rabbits

Definition of cure in this research is improvement in clinical, immunologic status, and seronegative result of microbiologic and histopathologic parameters. The aforementioned parameters can be further classified as: Clinical status is represented by change in body weight and temperature before and after MSC transplant. Immunologic improvement is represented by increament of Thl and Th2 population, as well as Thl/Th2 ratio before and after MSC transplant. Microbiologic and histopathologic9 changes is based on negative changes on BTA staining, culture, PCR, and histopathologic examination (from positive to negative). 10


94

Body Weight Changes

Systemic infection affects rabbit body weight in an indirect manner. This infection decreases their appetite; increases their nutrient demand, immunologic state, and bacterial virulence. We can see the fluctuance in picture 1 , \vhich depict the pattern of weight gain of ST rabbits (per 3 days) since inoculation of M. tuberculosis. This weight gain can be seen in both groups, either the intervention group (green line) or control group (yellow line). These 2 lines is statistically insignificant (p=0,707) which implies that MSC doesn't invoke weight gain in these subjects. Bacterial inoculation didn't affect weight gain of rabbits, as does MSC transplant. ··· -·······--··· ········ ··········---------·---------

E " "'

I

I

.•em II \000

,W

u

Picture

I.

I

-------YWY·•

l·

·

····· ······· · ·

�- ---

·---·-

---------

············ ···························· ········· ··

··············· ----- ·--- -

- ----

-············

-- -

---

·

-

.. -· -- ····················..·· ---

. . ............

--·

· -·-"

···································

- -------- ------ ------- ----- -------------------- ········

Graphic of ST rabbits body weight during this research. Yellow line represents control

group, while the green line represents intervention t,rroup which was given MSC transplant on week eight. Red a1TOW represents the timing of intervention on day 43.

Body Temperature Changes

DifTerences of body temperature in ST rabbits can provide information regarding the severity of disease, eventhough this parameter is not specific to infection. We can see the fluctuance i n picture 2, which depict the pattern of body temperature of ST rabbits (per 3 days) since inoculation of M. tuberculosis. There was a fluctuance in both groups, either the intervention group (green line) or the control group (yellow line). Both groups demonstrate a relieve in body temperature into the baseline of rabbit temperature before inoculation of M.tubercu]osis (between 39.0 - 39.5°C). From this data, it is clear that MSC didn't affect body temperature. More to it, body temperature seems to be afiected by administration Universitas Indonesia

95

of antituberculosis regimen which decreases bacterial activity, and also TTSSA6 procedure which gives a direct decrement of debris within vertebrae corpus. After 6 \Veeks of transplant, MSC doesn't have systemic effect, but in a continous application it can prevent recurrent infection due to its natural immunologic activity, theoretically.

----··--·- ············-·-·-·------·-··-·· -· --- ---·--·---

37,5

,,

-·--·-

u

Picture

2.

···· ···················-·------·····-··----··········-·· -----

'·· 1

-'l

I

:!U

13

lb 1!.l n l� llS 31 �1 -��

tltJ 13 ..IJb -1� '>1 �� !>� bl b•l f)! iU

I � lb f'J )$l :S� �:5 �1 �l1

'JJ

Graphic of body temperature changes in ST rabbits during this research. Yellow line

represents control group, while the green line represents intervention group. Reel arrow represents timing ofinte!·vention on day 43.

Immunologic Examination

According to immunophenotypic classification, T cell consists of T helper comprises 65% of the total T cell lymphocyte. lt contains a surface receptor called clusters ofd(frerentiation 4 1 CD4.

T suppressor or cytotoxic comprises the remaining population (35%), vvhich carry CD8+ on its surface. T

helper (CD4) proliferate and differentiate into T helper 1 (Th l ) and T helper 2

(Th2). These T cell subsets cannot determined morphologically, but can be identified by its physiologic activity ( cytokine). Thl cells release type l cytokines such as IL-2, IL- 1 2, TFN-y, and tumor necrosis factor alfa (TNF-r.(). This cytokines is counted as cellular proinflammatory cytokines. Th2 cells release type 2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-6, I L-9, and IL- l 0. This type 2 cytokines inhibit Thl proliferation, and vice versa. 10• 17• 19•7•8 Population of Thl and Th2 reflects immune response towards infection. The significant increase of Th l , as well as insignificant increase ofTh2, indicate a good healing process i n ST rabbits.


96

Picture 3 shows a profile of Thl , Th2, and Thl /Th2 ratio whereas intervention group have a lower increment compared to control group. This result can make way to several opinions: ( 1 ) MSC transplant gave protection to M. tuberculosis because it suppress Th I proliferation, which i n turn delays � limination o f bacteria, (2) MSC transplant promote early bone healing in which MSC replaces some of Th I function as a protection so that Thl spiking didn't occur post transplant. Complementary data is needed to strictly determine the actual physiologic process ofhealing in this condition, and the role ofMSC as an immune agent.

:� �

"'"'

? �

:

�

------,

_ ___ •••••••••••••••• •••••••••••••••••••••--•-•••••••-•••-·-· �--�-- --· -··�"'''000'0'YO'''''''�''''Y�0'0 UU 0'''""'''" 'Y0'0'' Y' " � >�0'0 -----·.... ,,,,,,,,,,,,,,,_ -.- --� �

'5UJ

�·······

. .......

....._................. .

-----------···························

-

�

························

•

''"''

OiU

><<J

/

�/

,..-.,;.)'< "54

·--------· -- -·····-----· ·---·...····

;

i

)�.17 ·;_ll,ol.

------

'-"'

:

---- --� ---------·· .......................... ... ............. .

; Ii

\C:•, Ot) :·.ro

.,. -... -··---··-··-:-� A � · --- . (: . � . �.:.

1t

1�.00

..........................................____........

l

i

•

< >.ro � � � ..

.

K..-.rt�

�I" ,Jo..

...

.....

'"'

)';,tfo

lQ.O:.<::

11 �'i.

....

' ! !

-P�l.t� t...•t

0,1':

i'l.Xl

0,11

•1.17

f'l.�1

Picture 3. Graphic ofThl, Th2, and Thl frh2 ratio in ST rabbits during this research. Population were measured in a 4 times, which is before inoculation, week 5 after inoculation,week I I after intervention, and week 1 4 before euthanasia.

Microbiology and Histopathology Examination

Parameters included are BT A staining, culture, and PCR. Microbiologic healing is defined by negative result in all of3 parameters after intervention. Histopathologic exam is performed by observing infection process within HE stained vertebrae corpus. Histo pathologic healing is ddined by conversion from positive into negative result which implies absence of tissue reaction il:om lesion. According to the previous result, there is no effect fi·om MSC application towards tissue reaction of infected corpus, as can be seen in table 3 .

Healing Score

To objectively assess healing of ST rabbits post procedure (TTSSA6, antituberculosis regimen, scaffold placement, and MSC transplant) we develop a scoring system known as "Sistem Skoring Kesembuhan" (SSK). This system analyze healing according to several parameters which is immunologic (Thl and Th2

population),

microbiologic

(BTA

stain,

culture,

and

PCR),

and


97

histopathologic (HE-stained lesion) as depicted in table 4. The total score of this research is 300; threshold of cure is stated by researcher vvith consideration: not cured if score <1 05, cured if score

2:

1 05. SSK calculation of all ST rabbits

support the first opinion (MSC gives protection towards M . tuberculosis).

Conclusions

I ) MSC transplant into TB spondylitis bone defect g1ves reparative ilmnunologic effect by decreasing Th2 response and increasing Th1/Th2 ratio. 2) MSC

transplant doesn't effect

healing of ST

rabbits based

on

microbiologic examination as confirmed by SSK. 3) The role of MSC in healing process can be objectively assessed through

analysis of SSK. Suggestion

Further research in TB spondylitis is needed to apply the effectiveness ofSSK and obtain an objective measurement of healing score that can be applied into human phase. References 1 . Schlossberg, D .

Tuberculosis and Non tuberculous Mycobacterial

Infections. Fifth Edition, McGraw-Hill 2006. 2.

Sapardan, S. Total Treatment of Tuberculosis of The Spine. A Rational Problem Solving Approach, Perpustakaan Universitas Indonesia, 2004.

3.

Nair SP, Meghji S, Wilson M, Reddi K, White P, Henderson B. Bacterially Induced Bone Destruction: Mechanism and Misconception. Infection and lnm1unity 1996;64(7):2371-2380.

4.

Shirley H. J. M, et a!. Mesenchymal Stem Cells Reduce Inflammation while Enchanching Bacterial Clearance and Improving Survival in Sepsis. Am Respir Crit Care Med Vol 1 82. Pp 1 047-57, 2010


J

98

5.

Ramesh Chandra Rai, Debapriya Bhattacharya and Gorbadan Das. Stem Cells in Infection Diseases. Insight and Control of Infection Disease

111

Global Scenario. Intech ISBN 978-953-51 -03 19-6 6.

Kau fmann S. How Can Immunology Contribute to The Control of Tuberculosis? Nature Revievv Immunology 2001 ; 1 .

7.

Dheda K, Scl1\vander S, Zhu B , Richard N , Smit V, Zhang Y. The Immunology of Tuberculosis: From Bench to Bedside. Respirology 201 0;1 5:433-450.

8.

Rook GA W, Seah G, Ustianowski A M. tuberculosis: immunology and vaccination. Eur Respir 2001 ; 1 7:537-557.

9.

Ordway D, et al. Animal model of Mycobacterium abscessus lung infection. Journal of Leucocyte Biology 2008;83.

10. Basaraba RJ. E xperi me ntal tuberculosis: the role of comparative patholo gy in

the

discovery

of

improved

tuberculosis

treatment

strategies.

Tuberculosis 2008;88.


r

99

Appendix Table 5. "Sistem Skoring Kesembuhan'"

Result

-Jain

ology

Score

Result

Score

Score

Result

M-14

N

M-14

N

M-14

Positive 3

Positive 2

15

M-14

Positive 3

Positive 2

M-14

Positive 3

Lesi Tl2

Positive 3

Result

Score

30

>N

50

30

>N

50

Positive I

30

Negative

50

15

Positive I

30

Negative

50

Positive 2

15

Positive I

30

Negative

50

Positive 2

15

Positive I

30

Negative

50

.

300 NB: Score < I 05 not cured, Score 2: I 05 cured


-

1 00

Lampiran 4. 4. Draft Publikasi IV Capaian Keberhasilan Pembuatan Model Kelinci Spondilitis Tubet·lmlosis melalui Inokulasi Langsung Bakteri Mycobacterium Tuberculosis ke Dalam Korpus Vertebra Kelinci. *Rahyussalim, **Tri Kurniawati, *** Ekowati Handharyani, ****Andrianjah, Hutagalung

*Ismail, *Errol

U

*Department of Orthopaedic and Traumatology Faculty of Medicine University of Indonesia **Stem Cell and Tissue Engineering Cl uster, MERC Faculty of Medici n e Uni versity of Indonesia *** Veterinary Teaching Hospital Bogor Agric ul tural Institute ****Department Microbiology Cli ni c Faculty of Medicine University ofl nclonesia

ABSTRAK Pendahuluan : Model penelitian pada hewan diperlukan untuk memantapkan teori-teori yang dibangun sebelum diaplikasikan pada manusia. Kelinci dipilih menjadi model selain karena ukuran korpus vertebranya yang cukup besar, juga karena ultra struktur tulang korpus vertebra kelinci memiliki karakteristik yang mirip dengan tulang manusia. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan prosedur dan model kelinci spondilitis tuberkulosis yang diharapkan dapat menjadi dasar untuk penelitian berbasis model infeksi tulang belakang hev-.ran. Metode : Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental observasi intervensi secarft in vivo pada hewan kelinci. Dua puluh tujuh ekor kelinci diintervensi dengan prosedur inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis pada korpus vertebra T 1 2 . Pengukuran berat badan, suhu badan, pemeriksaan populasi Th1 dan Th2 dilakukan sebelum dan sesudah delapan minggu prosedur inokulasi bakteri lalu dibandingkan. Selain itu dilakukan pula empat pemeriksaan diagnostik yaitu pewarnaan BTA, pemeriksaan kultur dan PCR bakteri Mycobacterium tuberculosis serta pemeriksaan histopatologi. terhadap sampel jaringan lesi setelah delapan minggu prosedur inokulasi. Hasil penelitian dilaporkan secara deskriptif dan analitik. Hasil : Pasca prosedur inokulasi ditemukan kematian pada 2 kelinci (2/27) dan kelumpuhan pada tiga kelinci (3/27). Tetjadi peningkatan yang bermakna dari rerata berat badan kelinci dari 2342,86 gram (SD = 253,3) menjadi 2828,57 gram (SD 284,00) (p < 0.05), peningkatan rerata populasi Thl dari 1 ,23% (SD 0,90) menjadi 3,82% (SD 1 ,94) (p < 0,05) dan peningkatan rerata populasi Th2 dari 0,80% (SD 0,33) menjadi 2 1 ,01% (SD 1 3,34) (p<0,05). Terjadi pula perubahan yang tidak bermakna dari penurunan rerata suhu badan kelinci dari 39,31 °C (SD 0,47) menjadi 39, 1 1 °C (SD 0,46) (p 0,226) dan peningkatan rerata rasio populasi Th1/Th2 dari 0 , 1 7 (SD 0, 1 3) menjadi 0,26 (SD 0,20) (p = 0,417). Hasil pewarnaan BTA, pemeriksaan kultur dan PCR diperoleh hasil 3 sampel (3/14) positif BTA, 9 sam pel (9/14) positif kultur dan 1 3 sampel ( 1 311 4) positif PCR, sedangkan hasil pemeriksaan histopatologi meunjukan bahwa seluruh sampel (14/14) positif memberikan reaksi tuberkulosis. Keberhasilan inokulasi berdasarkan basil pewarnaan BTA 2 1 ,4%, kultur 64,3%, PCR 66,4% dan histopatologi 1 00%. Pembahasan Keberhasilan prosedur inoku!asi bakteri Mycobacterium tuberculosis tercermin dari hasil pemeriksaan diagnosik yang menggambarkan =

=

=

=

=

=

=

=

=

=


101

temuan pemeriksaan atas keberadaan bakteri mati, bakteri hidup dan reaksi jaringan. Diantara ke empat modalitas pemeriksaan diagnostik tersebut, pemeriksaan kultur dianggap lebih mencenninkan keberhasilan prosedur inokulasi karena hasil pemeriksaan ini menggambarkan eksistensi bakteri, kemampuan proliferasi, dan daya hiclup secara in vitro dalam medium, selain bahwa secara umum pemeriksaan kultur merupakan standar emas untuk cliagnostik penyakit infeksi bakteri. Pada penelitian ini angka keberhasilan prosedur inokulasi berdasarkan basil pemeriksaan kultur adalah 64.3%. Jika basil pemeriksaan cliagnostik dihubungkan dengan basil pemeriksaan imunologi akan terlihat bahwa rerata populasi T h l , Th2 dan rasio T h l /Th2 dari kelompok kelinci kultur negatif Jebih tinggi dibanclingkan clengan kelompok kelinci kultur positi±: artinya jika pada suatu kelompok kelinci memiliki rerata populasi Th1 dan Th2 yang rendah, maka peluang keberhasilan tumbuhnya bakteri Mycobacterium tuberculosis akan semakin besar. Kesimpulan : Terciptanya model kelinci ST dinyatakan dengan hasil pemeriksaan mikrobiologi bakteri Mycobacterium tuberculosis yaitu pewarnaan BTA, pemeriksaan kultur dan PCR serta pemeriksaan histopatologi. Minimal satu dari em pat moclalitas pemeriksaan ini memberikan basil positif maka sudah cukup untuk menetapkan keberbasilan pembuatan model kelinci ST. Kata kunci : Mycobacterium tuberculosis, spondilitis tuberkulosis, rabbit models, inoculation, BTA, culture, PCR, bistopatologi.


== = - --- �----

1 02

PENDAHULUAN

Model penelitian pada hewan diperlukan untuk memantapkan teori-teori yang dibangun sebelum diaplikasikan pada manusia. Penelitian peranan sel punca spondilitis tuberkulosis seperti yang saat m1 diteliti . memerlukan model penelitian hewan. Kelinci dipilih menjadi model selain mesenkimal pada kasus

karena ukuran korpus vertebranya yang cukup besar, ultra struktur tulang korpus vertebra kelinci juga memiliki karakteristik yang mirip dengan manusia. Bakteri Mycobacterium tuberculosis H3 7RVyang digunakan untuk penelitian ini adalah bakteri yang dikembangkan di laboratorirum mikrobiologi klinik FKUI. Bakteri ini memiliki sifat dan karakteristik yang teridentifikasi, berbeda dengan bakteri liar yang hidup di luar laboratorium dimana sifat dan karakternya tidak dapat ditentukan. Virulensi, kemampuan berproliferasi, lingkungan mikroskopis yang adaptif dan masa inkubasi adalah beberapa hal yang perlu menjadi perhatian dalam memperhitungkan tercapainya model kelinci spondilitis tuberkulosis pasca prosedur inokulasi. Spondilitis tuberkulosis adalah penyakit infeksi pada tulang belakang yang disebabkan oleh bakteri

Mycobacterium

tuberculosis. Spondilitis tuberkulosis

dapat rnenyebabkan masalah yang sederhana sampai kompleks. Pada beberapa kasus bahkan masalah yang kompleks ini belum berhasil diatasi sehingga penelitian yang berbasis pada hewan menjadi hal yang penting sebelum dilakukan penelitian translasional maupun klinis pada rnanusia. Penelitian ini bertujuan untuk mencari prosedur dan mendapatkan model kelinci spondilitis tuberkulosis yang menjadi dasar pada penelitian berbasis model infeksi tulang belakang hewan.

METODE

Penelitian ini merupakan penelitian observasi intervensi pada hewan kelinci yang telah memenuhi kaji etik dan mendapatkan persetujuan dari Rumah Sakit Hewan (RSH) IPB. Sebagian besar penelitian ini menggunakan fasilitas hewan di RSH IPB dan laboratorium Mikrobiologi Klinik FKUI.


1 03

Pemilihan sampel kelinci didasarkan pada bobot tubuh, maturitas tulang, jenis kelamin, pemeriksaan klinis, radiologis dan laboratorium dengan kriteria inklusi adalah kelinci putih galur Selandia Baru sehat berbobot 2500-3000 gram dan matur secm·a skeletal, sedangkan kriteria eksklusi adalah kelin� i yang memiliki kelainan bawaan tulang belakang dan atau mengalami kelainan di tulang belakang akibat infeksi, trauma, neoplasma dan sebagainya. Dua puluh tujuh ekor kelinci diintervensi dengan perlakuan inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis

suhu badan,

pada korpus vertebra T l 2. Pengukuran berat badan,

penghitungan populasi Thl , Th2 dan rasio populasi Thl /Th2

dilakukan sebelum dan sesudah dilakukan prosedur inokulasi Jalu dibandingkan. Setelah prosedur inokulasi bakteri, kelinci diinkubasi dalam kandang individual dan dievaluasi selama 8 minggu, setelah itu sete!ah dilakukan pevvarnaan BTA, pemeriksaan kultur, PCR dan histopato)ogi terhadap jaringan lesi untuk menilai keberhasilan inokulasi. Hasil penelitian dilaporkan secm·a deskriptif dan analitik

HASIL Selama 8 mmggu masa inkubasi, nafsu makan kelinci tidak berkurang, kelinci dapat buang air besar dan buang air kecil secara normal, tetap aktif beraktifitas dan dapat merespon lingkungan dengan baik. Mortalitas dan Morbiditas Kelinci

Pasca prosedur inokulasi ditemukan kematian pada 2 ekor kelinci (2/27), yaitu satu ekor mati pada minggu ke-4 dan I ekor mati pada minggu ke-7. Selain kematian ditemukan pula kelumpuhan pada tiga ekor kelinci (3/27), yaitu satu ekor Jumpuh pada minggu ke-2 dan dua ekor pada minggu ke-4 (tabel 1 )

.

Tabel I. Persentase Mortalitas dan Morbiditas % n Mortal i tas/kematian

2 (27)

7,4

Morbiditas/kelumpuhan

3 (27)

11,1

Kondisi Umum dan Imunologi

Terdapat peningkatan rerata berat badan kelinci dari 2342,86 gram (SD sebelum prosedur inokulasi bakteri, menjadi 2828,57 gram (SD Universitas Indonesia

=

=

253,3)

284,00) sesudah

1 04

8

mmggu prosedur inokulasi bakteri (p <

0,05).

sebelum dilakukan prosedur inokulasi adalah sesudahnya menjadi

39, I I °C

(SD

=

0,46)

(p =

Rerata suhu badan kelinci

39,3I °C

=

(SD

0,4 7)

dan

0,226).

Tabel 2. Pemeriksaan berat badan, suhu badan dan im unologi sebelum dan sesudah inokulasi Sebel um inokulasi rerata ± SO

n

n

sesudah inokulasi rerata ± SO

p

Berat Badan

14

2342,86 ± 253,33

14

2828,57

Suhu Badan Populasi Th 1

14

3 9 , 3 1 ± 0,47

14

39, 1 1

0,46

< 0,01 0,226

14

J ,23

± 0,90

14

3,82 ± 1,94

< 0,05

Populasi Th2

14

0,80 ± 0,33

14

2 1 ,0 1 ± 1 3 ,24

< 0,05

Rasio populasi Th lffh2

14

0, 1 7 ± 0, 1 3

14

0,26 ± 0,20

0,4 1 7

Diperoleh rerata populasi Th l sebelum inokulasi sebesar sesudah prosedur inokulasi menjadi

3 , 82%

(SD

=

I , 94 ),

±

±

284,00

1 ,23%

(SD

=

0,90)

clan

yaitu te1jadi peningkatan

rerata populasi Thl yang bermakna secara statistik (p <

0,05).

Hal yang sama

ditemukan pada hasil pengukuran Th2, yaitu te1jadi peningkatan rerata populasi Th2 dari I 3 ,34)

0,80%

(SD

=

0,33)

sebelum prosedur inokulasi, menjadi 2 I , O I cvo (SD

sesudah prosedur inokulasi, yaitu te1jadi peningkatan rerata populasi Th2

yang bermakna secara statistik (p <

0,05).

Sedangkan rasio populasi Thl/Th2

menunjukkan peningkatan yang tidak bermakna secara statistik (p dari

=

0 , 1 7 (SD

=

0,13)

se belum prosedur inokulasi menjadi

=

0,26

0,417),

yaitu

= 0, 2 0)

(SD

sesudah prosedur inokulasi. Pemeriksaan Mikrobiologi dan Histopatologi

Dari hasil pewarnaan BTA diperoleh

3

sampel

(3/14)

jaringan lesi tu)ang korpus

vertebra kelinci teridentifikasi mengandung bakteri tahan asam tuberculosis) .

(Afycobacterium

Dengan melakukan kultur dalam medium MGIT dan Lowenstein

Jeensen terhadap sampel jaringan lesi tulang korpus kelinci d idapatkan (9114)

teridentifikasi mengandung bakteri

Hasil pemeriksaan

PCR

menunjukan

13

9

sampel

Mycobacterium tuberculosis

hidup.

sam pel ( 1 3/14) memberikan gambaran

pita DNA yang sesuai dengan gambaran pita DNA bakteri tuberculosis H37RV,

A1ycobacterium

yaitu bakteri yang sama yang dinokulasikan kedalam korpus

vertebra kelinci. Sementara berdasarkan hasil pemeriksaan histopatologi diperoleh


105

gambaran adanya sel datia langhans, sel radang kronik dan adanya turberkel pada . seluruh

sampel kelinc1 1 4 ( 1 4114).

Gambar 1 . Hasil Pemeriksaan Mikrobiologi. a . Hasil Pewarnaan BTA positif menggunakan pembesaran lOOOx, tampak adanya bakteri tahan asam berwarna merah berbentuk batang yang didapat setelah sampel difiksasi dan diwarnai dengan pulasan ZiehI Neelsen. b. Hasil pemeriksaan kultur positif. Tampak adanya pertumbuhan koloni bakteri berwama putih yang berpendar pada permukaan medium padat yang ada dalam tabung MGIT setelah tabung diinkubasi dalam inkubator Bactec MGIT 980. c. Hasil pem eriksaan PCR positif ditunjukkan oleh sampel 10625 dan 1 0627, hasil negatif ditunjukkan oleh sampel I 0612. (K-) adalah kontrol negatif yaitu air steril, (K+) adalah kontrol positif yaitu DNA bakteri M tuberculosis H37RV, sedangkan M adalah pelarut.

Gambar

2.

Hasil Pemeriksaan Histopatologi Infeksi Bakteri lvf ycobacterium pengamatan terhadap slide yang berasal dari jaringan lesi setelah dilakukan deklasifikasi dengan larutan asam nitrat dan dilakukan pulasan Hematoksilin Eosin tampak adanya granuloma dan giant sel yang menunjukan te1jadinya infeksi oleh bakteri M. tuberculosis (pemeriksaan di lakukan di laboratorium Patologi Anatomi RSH dan menggunakan asam nitrat sebagai larutan dekalsifikasi) tuberculosis,


106

Selanjutnya berdasarkan hasil pemeriksaan mikrobiologi dan histopatologi ini, sampel kelinci dikelompokkan menjadi 4 kelompok yaitu kelompok KPH positif, PH posit if, BKPH posit if dan

KH

posit if

Tabel 3. Kombinasi Hasil Pemeriksaan Diagnostik Pewamaan BTA, Peme1iksaan Kultur, PCR dan l-listopatologi l-lasil Pemeriksaan Kode kelinci Grup Kelinci BTA PCR Histopatologi Kultur KOSO!

Neg

Pos

Pos

Pos

K0525

Neg

Pos

Pos

Pos

K0509

Neg

Pos

Pos

Pos

K3264

Neg

Pos

Pos

Pos

K0519

Neg

Pos

Pos

Pos

K3364

Neg

Neg

Pos

Pos

K2764

Neg

Neg

Pos

Pos

K2964

Neg

Neg

Pos

Pos

K 3 1 64

Neg

Neg

Pos

Pos

K0505

Neg

Neg

Pos

Pos

K0964

Pos

Pos

Pos

Pos

1(0520

Pos

Pos

Pos

Pos

K0517

Pos

Pos

Pos

Pos

K2664

Neg

Pos

Neg

Pos

KPH positif

PH positif

BKP!-1 positif Kl-1 positif

Pos : Positif, Neg : Negatif

Keberhasilan Inokulasi

Keberhasilan inokulasi berdasarkan basi I pewarnaan BTA adalah 21 ,4%, pemeriksaan kultur sebesar 64,3%, pemeriksaan PCR sebesar 66,4% dan berdasarkan pemeriksaan histopatologi sebesar 100%.

Tabel 4. Persentase Keberhasilan Prosedur lnokulasi Berdasarkan Hasil Pewamaan BTA, Kultur, PCR dan Histopatologi keberhasilan inokulasi IK 95% % 11 7 . 1 - 42.9

BTA

3

Kultur

9

2 1 .4

64.3

35.7 - 92.9

PCR

13

92.9

78.6 - 1 0 0

Histopatologi

14

100

100 - 1 0 0


1 07

PEMBAHASAN Teknik Inokulasi Bakteri

Bakteri


secara mikroskopis berhasil diinokulasikan

ke dalam korpus vertebra kelinci. Keberhasilan inokulasi ini mencapai angka •

1 00% jika diar·tikan cukup satu dari nilai pemeriksaan diagnostik menunjukkan hasil positif dari 4 modalitas pemeriksaan diagnostik yang dilakukan setelah delapan minggu prosedur inokulasi. Keberhasilan inokulasi dipengaruhi oleh kuantitas bakteri yang diinokulasikan,

tuberculosis

Mycobacterium

ukuran diameter lubang inokulasi dan

pemaparan lubang inokulasi dengan udara luar. Selain itu waktu inkubasi selama delapan minggu sebelum dilakukan pemeriksaan peluang pada bakteri


diagnostik juga memberi

untuk tumbuh di dalam korpus

vertebra dan menunjukkan eksistensinya. Jumlah populasi bakteri


merupakan. kuantitas bakteri

sebanyak 1 08 cfu/mL


tertinggi yang dapat

dibuat di laboratorium Mikrobiologi Klinik FKUI berdasarkan Nephelometer Standard.

Mc-Farland

Kuantitas sebesar ini menjadi pilihan terakhir yang dapat

digunakan pada penelitian ini dengan tujuan meningkatkan jumlah bakteri yang dapat bertahan

hidup menghadapi

sistem imun kelinci sekaligus dapat

berkembang biak dalam korpus vertebra kelinci. Lubang inokulasi pada penelitian 1 ,5 mm dengan tujuan agar Juas permukaan tempat

ini dibuat berukuran

bakteri MTB tumbuh mencukupi untuk jumlah yang ditanamkan. Demikian pula pemaparan lubang inokulasi dengan udara luar selama 1 5 sampai 20 menit dilakukan dengan tujuan memberikan kesempatan pada bakteri tuberculosis

Afycobacterium

untuk dapat memanfaatkan oksigen sebanyak mungkin dari luar.

Sejumlah faktor diatas mendukung bakteri dapat hidup

dalam

lingkungan

korpus vertebra

keberhasilan inoku lasi mencapai I 00%.



sehingga

untuk

meningkatkan

1 08

Morbiditas dan Mortalitas Pada prosedur inokulasi bakteri

Mycobacterium tuberculosis,

risiko cidera saraf

yang mengakibatkan penurunan kekuatan motorik dapat disebabkan oleh cidera langsung maupun cidera tidak langsung. Yang dimaksud dengan cidera Jangsung adalah cidera yang diakibatkan oleh keteledoran prosedur yang mengakibatkan gangguan mekanik pada saraf dapat berupa Juka, penekanan atau robekan. Cidera Jangsung ini akan mengakibatkan penurunan kekuatan motorik yang diketahui segera setelah kelinci bebas dari pengaruh obat bius. Sedangkan yang dimaksud dengan cidera tidak langsung adalah cidera saraf akibat proses Mycobacterium tuberculosis.

infeksi

Cidera jenis ini tidak diketahui selama prosedur

dikerjakan sampai pada masa inkubasi bakte1i Mycobacterium tuberculosis terlewati. Kelinci yang mengalami cidera tidak langsung akan segera beraktifitas kembali sesaat setelah terbebas dari pengaruh obat bius pada prosedur inokulasi. Cidera tidak langsung pada saraf ini dapat terjadi akibat invasi bakteri Mycobacterium tuberculosis

ke dalam saraf, akibat destruksi pada struktur tulang

yang mengakibatkan munculnya ketidakstabilan tulang sehingga menggangu sara±� ataupun

akibat terbentuknya pus dan jaringan nekrotik akibat proses

infeksi, yang menumpuk di dalam kanalis spinalis kemudian menekan saraf Dua puluh ekor kelinci yang digunakan sebagai sampel pada penelitian ini tidak mengalami penurunan kekuatan motorik segera setelah prosedur inokulasi bakteri Mycobacterium

tuberculosis

d i korpus vertebra sclesai dilakukan, m·tinya

kesalahan akibat prosedur inokulasi dapat diantisipasi dengan baik melalui ·

penyempurnaan prosedur dan Jatihan yang memadai bagi pm·a operator yang terlibat prosedur inokulasi bakteri Mycobacterium

tuberculosis.

Evaluasi selama 8 minggu sejak prosedur inokulasi dilakukan memperlihatkan 3 dari 27 ekor kelinci mengalami penurunan kekuatan motorik, 1 kelinci mengalami kejadian tersebut pada minggu kc-2 pasca prosedur inokulasi bakteri, sementara pada 2 kelinci Jainnya mengalami kejadian tersebut pada minggu ke-4. Kejadian ini menunjukkan bahwa selama 8 mingu waktu inkubasi, berlangsung proses invasi bakteri yang dapat menimbulkan gangguan saraf dan penurunan kekuatan motorik. Pemeriksaan nekropsj pada ketiga kelinci ini menunjukkan tet:iadinya


109

invasi bakteri ke medula spinalis, tidak terdapat kerusakan yang mengakibatkan destruksi luas pada tulang belakang. Demikian pula tidak ditemukan tumpukan . pus dan jaringan nekrotik didalam kanal yang mengganggu hantaran saraf. Dari hasil ini 4 minggu pertama merupakan masa yang rawan terjadinya invasi bakteri ke daerah sekitarnya.

Gambar 5. 1 Kelumpuhan pada Kelinci Setelah Prosedur Inokulasi Bakteri Mycobacterium tuberculosis

Selain terjadi penurunan kekuatan motorik pada tiga ekor kelinci, tetjadi pula kematian pada dua ekor kelinci dari dua puluh tujuh ekor kelinci yang dilakukan prosedur inokulasi. Kematian kelinci ini terjadi pada minggu ke-4 dan minggu ke-

7 setelah prosedur inokulasi, dan kedua kelinci mengalami kelumpuhan sebelum akhirnya mati. Nampaknya kejadian kelumpuhan ini berhubungan erat dengan kejadian kematian kelinci selama observasi karena kelumpuhan menyebabkan

penurunan kualitas hidup kelinci. Observasi pada kedua kelinci ini menunjukkan bahwa pada awalnya kelinci tersebut mengalami gangguan buang air besar, gangguan buang air kecil, dan gangguan mobilitas. Ketiga gangguan mengakibatkan

gangguan

higienis

kelinci

dan

penurunan

nafsu

uu

makan

dibandingkan kelinci lainnya. Bulu-bulu di daerah ekor setinggi tulang panggul tampak mengalami kerontokan. Pada pemeriksaan nekropsi tidak terdapat tanda-tanda infeksi selain di daerah lesi sesuai lokasi inokulasi bakteri. Diperkirakan kematian kelinci ini disebabkan oleh gangguan kualitas hidup karena perburukan nutrisi bukan karena proses infeksi yang merusak organ vital.


1 10

Gambar 5. I Nekropsi Kelinci yang Mati Setelah Prosedur lnokulasi Bakteri Mycobacterium

tuberculosis

Terciptanya Model Kelinci Spondilitis tuberkulosis

Terciptanya model kelinci spondilitis tuberkulosis ditentukan oleh keberhasilan inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis pada korpus vertebra kelinci yang diamati dengan melihat tanda-tanda aktifitas bakteri tersebut secara mikrobiologi pada jaringan yang diinokulasi dan melihat respon jaringan terhadap eksjstensi bakteri secara histopatologi. Terdapat empat modalitas pemeriksaan yang digunakan untuk kepentingan pengamatan ini yaitu pewarnaan BTA, pemeriksaan kultur, pemeriksaan PCR dan pemeriksaan histopatologi. Pada penyakit infeksi bakteri, sifat dan perilaku bakteri penyebab infeksi menjadi hal yang sangat menentukan terkait dengan gejala penyakit itu sendiri ataupun keluhan pasien, sehingga upaya d iagnostik dalam mencari jenis bakteri penyebab atau yang terlibat dalam proses infeksi sangat penting untuk diketahui. Untuk kepentingan pelayanan pasien, diagnosis spondilitis tuberkulosis ditegakkan jika salah satu dari ke empat modalitas pemeriksaan ini memberikan hasil positif yang akan menjadi acuan penatalaksanaan selanjutnya. Pendekatan yang sama juga digunakan pada penelitian ini sehingga diagnosis keli.nci spondilitis tuberkulis ditegakkan berdasarkan ditemukan.nya hasil positif pada mjnimal satu modalitas pemeriksaan diagnosis tersebut. Dengan demikian diperoleh 14 ekor kelinci spondilitis tuberkulosis sebagai model pada penelitian ini. Secara metodologi terdapat perbedaan yang nyata antara keempat modalitas pemeriksaan yang digunakan. Pada pewarnaan BTA substansi yang menjadi target pewarnaan adalah dinding sel bakteri Mycobacterium tuberculosis yang telah mati


III

pada saat proses fiksasi. Sementara pada pemeriksaan kultur target yang diper1ksa adalah bakteri

Afycobacterium tuberculosis

yang masih hidup. Demikian pula

pada pemeriksaan PCR dimana target yang diperiksa adalah materi genetik (DNA) bakteri


yang diperoleh dari proses ekstraksi.

Sementara pemeriksaan histopatologi ditujukan untuk melihat reaksi spesifik pada j aringan akibat keberadaan bakteri

Mycobacterium

tuberculosis.

Perbedaan

metodologi ini mendasari perbedaan capaian keberhasilan inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis

seperti yang terlihat pada tabel 4.

Keberhasilan proseclur inokulasi pada penelitian ini tercermin dari hasil pemeriksaan diagnosik (tabel 4) yang menggambarkan temuan pemerik saan atas keberadaan bakteri mati, bakteri hid u p dan reaksi jaringan. Hasil pemeriksaan pewarnaan BTA mencerminkan temuan bakteri hid up Vialaupun pada prosesnya bakteri tersebut 'dimatikan' pada proses fiksasi dan pewamaan. Bakteri yang sejak awal telah mati, tidak clapat diwarnai clengan pewarnaan BTA. Pemeriksaan PCR mencerminkan temuan bakteri hidup dan atau bakteri mati, karena pemeriksaan PCR mampu mendeteksi keberadaan DNA bakteri baik yang berasal dari bakteri hidup maupun bakteri mati. Hasil pemeriksaan kultur mencerminkan temuan bakteri hidup dan kemampuannya untuk dapat hidup dalam medium secara in vitro. Ketiga modalitas pemeriksaan mikrobiologi ini memiliki sensitivitas dan kemampuan deteksi yang berbeda-beda. Sementara hasil pemeriksaan histopatologi mencennink.an terjadinya reaksi jaringan akibat interaksi

Jarmgan

tersebut

dengan

bakteri.

Pemeriksaan

histopatologi

memperlihatkan bahwa jaringan tidak hanya memberikan reaksi terhadap bakteri hid up tetapi juga memberikan reaksi terhadap bakteri yang sudah mati termasuk materi genetiknya. Diantara ke empat modalitas pemeriksaan diagnostik tersebut, pemeriksaan kultur dianggap lebih mencerminkan keberhasilan prosedur inokulasi karena hasil pemeriksaan ini menggambarkan eksistensi bakteri, kemamp uan proliferasi, dan daya hidup secm·a in vitro dalam medium, seJain bahwa secara umum pemeriksaan kultm merupakan standar emas untuk diagnostik penyakit infeksi bakteri. Pada penelitian ini angka keberhasilan prosedur inokulasi berdasarkan hasil pemeriksaan kultur adalah 64.3%.


1 12

Hasi.l

pemeriksaan

kultur

memperlihatkan bahv-.ra bakteri

pasca

prosedur

inokulasi


di

mmggu

ke-8

berhasil tumbuh pada

korpus vertebra sembilan ekor kelinci, sementara pada lima ekor kelinci lainnya bakteri Mycobacterium

tuberculosis

tidak berhasil tumbuh Jika hasil pemeriksaan .•

kultur ini dihubungkan dengan hasil pemeriksaan imunologi akan terlihat bahwa jumlah popu.lasi Thl , Th2 dan rasio Thl /Th2 dari kelompok kelinci kultur negatif lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah populasi Thl , Th2 dan rasio T h l !Th2 kelompok kelinci kultur posit if Tampaknya jumlah populasi Th I dan Th2 darah berhubungan dengan keberhasilan prosedur inokulasi bakteri. Artinya jika pada suatu kelompok kelinci memihki jumlah populasi Th1 dan Th2 yang rendah, maka peluang keberhasilan tumbuhnya bakteri


akan

semakin besar, sayangnya pada penelitian ini tidak diketahui pada kisaran nilai berapa populasi Th 1 dan Th2 yang memberikan peluang bakteri tuberculosis

Mycobacterium

dapat tumbub Jebih baik dan hidup pada korpus vertebra kelinci.

Analisis terhadap lima ekor kelinci yang mengalami kegagalan inokulasi berdasarkan hasil pemeriksaan kultur di minggu ke-8 memperlihatkan basil pemeriksaan PCR posit if dengan teramatinya pita DNA yang menyerupai ON A bakteri


tuberculosis

artinya meskipun bakteri

Mycobacterium

tidak berhasil tumbuh pada kelima ekor kelinci ini, namun materi

genetik DNA-nya masih dapat ditemukan. Hal ini dapat menjelaskan bahwa sesungguhnya bakteri J'vfycobacterium

tuberculosis

dapat tumbuh dan berkembang

d i dalam detek korpus vertebra. kelinci yang dibuktikan dengan munculnya reaksi jaringan dan ditemukmmya se] radang, sel datia Ianghans serta proses perkijuan pada kelima ekor kelinci tersebut (hasil pemeriksaan histopatologi memberikan hasil positif). Reaksi imun tubuh kelinci terlihat dari keberadaan populasi Th 1 dan Th2 yang tinggi di dalam darah yang mampu mematikan sebagian besar bakteri atau paling tidak melemahkan bakteri


sehingga

ketika bakteri ditumbuhkan d i media kultur, maka bakteri tersebut tidak berhasil tumbuh. Terciptanya model kelinci ST dinyatakan dengan hasil pemeriksaan mikrobiologi bakteri Afycobacterium

tuberculosis

yaitu pewarnaan BTA, pemeriksaan kultur


1 13

serta PCR dan atau pemeriksaan histopatologi lesi. Minimal satu dari empat modalitas pemeriksaan

ini memberikan basil positif sudah cukup untuk

menetapkan terciptanya model kelinci ST.

Evaluasi l munologi

Respon imun tubuh kelinci akibat prosedur inokulasi bakteri tuberculosis

Mycobacterium

dapat cliamati dengan mengukur jumlah populasi Thl dan Th2 dari

darah kelinci. Monitoring terhadap jumlah populasi Th 1 , Th2 dan rasio populasi Thl /Th2 clarah kelinci menunjukkan tetjadinya peningkatan populasi Thl

(p <

0.05) dan Th2 (p < 0,05) yang bermakna secara statistik setelah dilakukan prosedur inokulasi bakteri

Mycobacterium tuberculosis.

Demikian pula dengan

rasio populasi Th 1 /Th2 yang juga meningkat walaupun secm·a statistik tidak berrnakna (p

0,417).

=

Profil peningkatan

rasio

populasi T h l /Th2

ini

memperlihatkan terjadinya dominasi peningkatan populasi Thl yang sangat mungkin disebabkan oleh respon imun tubuh kelinci terhadap keberadaan bakteri Mycobacterium

tuberculosis,

membunuh bakteri

yaitu

sistem

imun

A1ycobacterium tuberculosis

tubuh

kelinci

berusaha

dengan meningkatkan jumlah

populasi T h l yang terdeteksi dalam darah. Di pihak lain terjadi juga peningkatan jumlah populasi Th2 yang cukup signifikan walaupun

tidak sedominan

peningkatan jumlah populasi Th l . Th2 cliketahui terlibat dalam sistem imun humoral dan berperan dalam menghadapai paras it ekstra selu ler. Hasil pemeriksaan jumlah populasi T h l dan Th2 ini menunjukkan adanya respon imun yang bermakna sehingga dapat menjadi indikator keberhasilan proses inokulasi bakteri


(Tabel 4. 1 2).


eli dalam korpus vertebra kelinci

114

Kesimpulan

Prosedur inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis H37RV langsung kedalam korpus vertebra kelinci dapat dilakukan melalui pendekatan operasi terbuka dikamar operasi aseptik. I nokulasi

Mycobacterium

tuberculosis

H37RV

menyebabkan

peningkatan

populasi Thl dan Th2 (p < 0.05), tetapi tidak menyebabkan peningkatan rasio Th l /Th2 (p

=

0. 1 47) . Keberhasilan inokulasi bakteri Mycobacterium tuberculosis

I-B7RV mencapai

1 00% bila diagnosis spondilitis tuberkulosis ditegakkan

berdasarkan salah satu pemeriksaan diagnostik.

Saran

Teknik dan prosedur inokulasi bakteri


H37RV perlu

disempurnakan sehingga cliperoleh cara yang mudah dengan cidera yang kecil serta

keberhasilan tumbulmya bakteri

Mycobacterium

tuberculosis

yang

sempurna.

Daftar Pustaka

1 . Schlossberg, D. 2006. Tuberculosis and Non tuberculous Mycobacterial Infections. Fifth Edition, 1l1cGraw-Hill. 2. Sapardan, S. 2004. Total Treatment of Tuberculosis ofThe Spine. A Rational Problem Solving Approach. Perpustakaan Universitas Indonesia.

3. Poelstra KA, Barekzi NA, Grainger DW, Gristina AG, Schuler TC. 2000. A Novel Spinal Implant Infection Model in Rabbits. SPINE, 25(4);406410.

4. Zhang G, Zhu B, Shi W, Wang M, Da Z, Zhang Y. 2010. Evaluation of

Mycobacterial virulence using rabbit skin liquefaction model Virulence, 1 (3);156-163.

5. Orme 1 and Juarrero MG. Animal Models ofM. tuberculosis Infection. Current Protocol in Microbiology. Jolm Wiley and Son Inc, 2007. 6. Zychowicz ME. Osteoarticular Manifestations of Mycobacterium Tuberculosis Infection. Orthopaedic Nursing 201 0;29(6). Universitas Indonesia

115

7. Bierry G, et aJ. Percutaneous Inoculated Rabbit Model oflntervertebral disc space infection: Magnetic Resonance Imaging Features with Pathological Correlation. Joint Bone Spine 2008;75 :465-470. 8. Dheda K, Schwander S, Zhu B, Richard N, Smit V, Zhang.Y. Immunology of Tuberculosis: From 20 1 0 ; 1 5:433-450.


Bench to Bedside.

The

Respi.rology

1 16

The Success of Rabbit Spondylitis Tuberculosis Model Creation by Mycobacterium Tuberculosis Direct Inoculation into the Rabbit Vertebral

Body *Rahyussalim. **Tri Kurniawati, ***Ekowati Handharyani, ****Andrianjah, *Ismail, *Errol U Hutagalung *Department of Orthopaedic and Traumatology Faculty of Medicine University oflndonesia **Stem Cell and Tissue Engineering Cluster, MERC Faculty of Medicine University of Indonesia *** Veterinary Teaching Hospital Bogor Agricultural Institute ****Department Microbiology Clinic Faculty of Medicine University of Indonesia

ABSTRACT Introduction : Animal models for experimental research are needed to stabilize the theories built before applying it to human. Rabbits are chosen beside due to its adequate size of vertebral body, but also due to its vertebral body ultra-structure that has the similar characteristics to human bone. This research aims to derive a procedure and rabbit Spondylitrs Tuberculosis (ST) model which is hoped to be the basis for animal model based experimental studies for spinal infection. Methods : This research is an observational-interventional experiment in vivo rabbit's body. Twenty seven rabbits underwent Mycobacterium tuberculosis (MTb) inoculation on T 1 2 vertebral body. Weight, temperatures, Th1 and Th2 population examination were done before and after 8 weeks of MTb inoculation for comparison. Four diagnostic tests which were acid fast bacilli staining, culture ' MTb PCR, and histopathology examination were done to the tissue lesion after 8 weeks of inoculation procedure. Research results were reported descriptively and analytically. Results : Post inoculation procedure, 2 rabbits were died (2/27) and 3 were limped (3/27). There vvas significant increase on mean weight from 2342.86 gram (SD = 253.3) into 2828.57 gram (SD = 284.00) (p < 0.05), increase on mean Th1 population fi-om 1 .23% (SO = 0.9) into 3.82% (SD = 1 .94) (p < 0.05) and increase on mean Th2 population from 0.80% (SD = 0.33) into 2 1 .0 1 % (SD = 1 3.34) ° (p<0.05). There was insignificant alteration on temperature decrease from 39.31 C (SD = 0.47) into 39.1 °C (SD = 0.46) (p = 0.226) and increase of mean population ratio ofThl /Th2 from 0. 1 7 (SD = 0 . 1 3 ) into 0.26 (SD = 0.20) (p = 0 . 4 17). Acid fast bacilli staining, culture examination and PCR were positive for 3 samples (3114), while 9 positive (9/14) for culture only and 1 3 positive ( 1 3/14) for PCR. Histopathology showed positive for tuberculosis reaction in all samples ( 1 4/14). The success of inoculation for acid fast bacilli is 2 1 .4%, 64.3% for culture, 66.4% for PCR and I 00% for histopathology examination. Discussion : The success of Mycobacterium tuberculosis inoculation procedure i s J the diagnostic tests results that showed positive findings o f live or reflected iom dead bacteria along with the tissue reaction. Between the four diagnostic modalities, culture examination is considered as the best test showing not only bacterium existence, proliferation, and Jiving capabilities in vitro medium, but also is the gold standard test for diagnosing bacterial infection diseases. 1 n this research the success rate of inoculation procedure based on the cu lture examination is 64.3%. ,


117

If diagnostic tests were correlated v'ith immunologic examination it can be derived that mean population of Thl , Th2 and Thl/Th2 ratio from negative culture rabbit group is higher than the positive-culture rabbit group which means when the mean population ofThl and Th2 is low, then the rabbit group has higher chance of Mycobacterium tuberculosis growth. Conclusion : The success of ST rabbit model creation is de-termined by the positive acid fast bacilli microbiological examination, culture examination, PCR, and histopathology examination. A minimum of one from four modalities ts needed to be positive to state the success of rabbit ST model creation. ...

Keywords: Mycobacterium tuberculosis, spondylitis tuberculosis, rabbit model, inoculation, BTA, culture, PCR, histopathology.


118

Background

Animal-based research is mandatory to obtain theories before applying it into human-based research. This concept is ultimately needed in applying MSC for tuberculosis (TB) spondylitis patients. The reason for nbbit model lies in the � anatomical structure of its corpus that is nearly identic to human. lvfycobacterium

tuberculosis

(H37RY) is used in this research which v.1as

developed in microbiologic lab FMUI. This strain is different than the wild strains; their characteristics can be identified. The factors need to be addressed to create TB spondylitis rabbit model are: ( 1 ) virulence, (2) proliferative potent, (3) adaptive microscopic environtment, and (4) incubation. TB spondylitis is an infection of a vertebrae corpus due to tuberculosis

lvfycobacterium

strain that has a serious impact to the patient. To study this disease,

animal-based research should be conducted to fu\Jy understand its pathologic pathways before doing a translational research to human. This research is cond�1cted to find the most suitable procedure to create TB spondylitis rabbit model for the sake of effectivity of treatment and future research regarding TB spondylitis.

Methods .

This is an observation-interventional research in rabbit model fulfilling ethical aspect and approved by IPB Animal Hospital. The majority of this research uses the facilities in IPB Animal Hospital and Microbiology lab FMUI. The selection of rabbit model is determined by body weight, bone maturity, sex, clinical, radiologic, and laboratory exam which :fulfill the inclusion criteria (healthy New Zealand strain weighted 2500-3000 g and skeletally mature). Rabbits with abnormality of spine because of ongoing infection, trauma, or neoplasm will be excluded. Twenty seven rabbits is inoculated with


i n its T l 2

vertebrae corpus. Measurement of weight, temperature, Thl, Th2, and Th1/Th2 ratio is executed before and after inoculation. After



119

inoculation, the rabbits are secured in its cage and evaluated for 8 weeks. After that, we did examination tor BTA stain, culture, PCR, and histopathologic to assess the inoculation process. Results were reported using a descriptive-analytic approach.

Results

During 8 weeks caging, appetite didn't decrease, rabbits can still defecate urinate normally, maintain its activity, and respond well to its environtment. Rabbit Mortality and Morbidity

We found mortality of 2 rabbits (2/27); one of which died on week four and one died on week seven. Aside fro m death, we also found morbidity (paraplegia) on 3 rabbits (3/27); one on week two, and two on week tour (table 1). Table I . Mortality and Morbidity Percentage n

%

Mortality

2

(27)

7,4

Morbidity

3 (27)

I1,1

Gene..al Status and Immunology

There i s an increase in mean value o f rabbit weight from 2342.86 g (SD before bacteria inoculation, to 2828.57 g (SD

=

253 .3)

284.00) 8 weeks after inoculation (p < 0.05). Mean value of rabbit body temperature before inoculation is 39,31 °C (SD 0.47) and 39, 1 1 °C (SD 0.46) after inoculation (p 0.226). =

=

=

=

Table 2. Weight, Temperature, and Immunologic Examination ofST Rabbits After Inoculation

Before lnocul ation n

Mean ± SD

253,33

n

Mean ± SD

14

2828,57 ± 284,00

p

<0,01

Weight

14

Temperature

14

39,31 ± 0,47

14

Th I population

14

1,23 ± 0,90

14

Th2 population

14

0,80 ± 0,33

14

2 1 , 0 1 ± 1 3,24

< 0,05

Tb 1 /Th2 ratio

14

0, 1 7 ± 0, 1 3

14

0,26 ± 0,20

0,4 1 7

2342,86 ±

39, 1

1 ± 0,46

3,82 ±

1,94


_;a..:..li:.-.:; .

0,226

< 0,05

120

Mean value population of Thl before inoculation is 1 .23% (SO increased to 3.82% (SD significant (p

<

0.05).

=

=

0.90)

and

1.94) after inoculation. This result is statistically

Observation on Th2 population is 0.80% (SD

before inoculation, into 2 1 .01% (SD

=

=

0.33)

13.34) after inoculation. Then again, was

i Th2 mean value which is statistically significant (p<0.05). spotted an increase n

Meanwhile, the ratio of Thl/Th2 doesn't reveal a statistical significance increase (p

=

0.417).

Microbiologic and Histopathologic

From BTA staining, we obtain

3

samples (3114) t issue lesion from vertebrae

corpus identified for Mycobacterium tuberculosis. From culture of MGIT and Lowenstein Jensen, we found

9 samples (9/14) identified for a living

Mycobacterium tuberculosis. Superiorly, on PCR, we fo und almost all sample (13/14) described as having DNA chain similar to J\1ycobacterium tuberculosis (H37RV strain) DNA -7 the same strain used in this research. Last, on histopathologic examination, we fOlmd Datia Langhans cell, chronic inflammatory cells, and tubercle in all samples ( 1 4114).

c

Microbiologic Examination. a. Positive BTA staining with 1000 times magnification, a red acid-fast bacil can be seen with rod configuration under Ziehi-Neelsen stain. b. Positive cu1ture. There is a white-colored colonization of bacteria on the medium within MGIT tube after n i cubation in Bactec MGIT 980. c. Positive PCR shown by sample 1 0625 and 1 0627, while a negative result is seen on sample 10612. (K-) means sterile water (negative control), (K+) means bacterial DNA M uberculosis t H37RV (positive control), and M means solvent.


121

Picture 2. Histopathologic Result of lvfycobacteriwn tuberculosis intection, observation

on slides from lesion after decalsification with nitrate acid and HE-stain. Granuloma and giant cell can be clearly identified, pathognom onic to M. tuberculosis infection (examination is underwent in Pathology Anatomy lab, IPB Animal Hospital)

According to microbiologic and histopathologic exam, rabbit models were classified into 4 subgroups which is KPH positive, PH positive, BKPH positive, and

KH

positive.

Table 3 . Combination ofBTA Stain, Culture, PCR, and Histopathologic Examination Result Results Subject Subject Coding BTA PCR Culture Histopathology Grouping KOSO I

Neg

Pos

Pos

Pos

K0525

Neg

Pos

Pos

Pos

K0509

Neg

Pos

Pos

Pos

K3264

Neg

Pos

Pos

Pos

K05 1 9

Neg

Pos

Pos

Pos

K3364

Neg

Neg

Pos

Pos

K2764

Neg

Neg

Pos

Pos

K2964

Neg

Neg

Pos

Pos

K3164

Neg

Neg

Pos

Pos

K0505

Neg

Neg

Pos

Pos

K0964

Pos

Pos

Pos

Pos

K0520

Pos

Pos

Pos

Pos

K05 1 7

Pos

Pos

Pos

Pos

K2664

Neg

Pos

Neg

Pos


KPI-1 positive

PH positive

BKPH positive KH positive

122

Inoculation Succession

Success of inoculation according to BTA is 21 .4%, culture 64.3%,

PCR

66.4%,

and histopathologic 100%. Table 4. Percentage of S uccessfu l Inoculatioi1

lK 95%

Successful Inoculation

n

%

3

2 1 .4

9

64.3

35.7 - 92.9

PCR

13

92.9

78.6 - 1 0 0

1- listopatholooy

14

100

l 00 - I 00

BTA

Culture

7 . 1 - 42.9

Discussion Inoculation Technique

Microscopically, the inoculation of Mycobacterium

tuberculosis reached

a success

rate of 100% if \Ve me to use only 1 of 4 modality. This rate is determined by quantity of inoculated bacteria, size of inoculation hole (diameter ), and contact with outside environtment particulmly air. Aside from that, we must take into account the incubation period of 8 weeks prior to diagnostic approach as the period ofM. tuberculosis proliferation. The maximum threshold for


population is 1 08

cfu/mL in Microbiology lab FMUI based on McFarland Nephelometer Standard. This amount i s the choice for inoculation to prevent elimination of bacteria by the innate immune response of the rabbits in this research. Inoculation hole is tailor made ( 1 ,5 rnm) to assist the proliferation of Mycobacterium

tuberculosis.

Lastly,

contact with outside air tor 1 5-20 minutes is granted to aid the bacteria's metabolism. If these factors are met, the success rate of inoculation can reach 1 00%.

Morbidity and Mortality

During inoculation of Mycobacterium

tuberculosis,

there i s an associated risk of

nerve damage that results in decreased motoric function (direct and indirect). Direct damage can occur due to operator's clumsiness that causes nerve tear. The effect can be seen as soon as the anesthesia has ceased. An indirect damage is a


123

nerve lesion due to infection process. Usuall.y, the effect cannot be seen even after incubation process has cleared. Soon after anesthesia has ceased, rabbits with indirect lesion still can move around. The accumulation of necrotic tissue and pus can compress the nerve root or spinal canal and therefore, the rabbits had paraplegia. Twenty rabbits in this research didn't had direct lesion of the nerve, which means the skill of the operator as well as the research protocol for inoculation procedure is safe. Evaluation for 8 weeks post inoculation shows 3 out of 27 rabbits had motoric decrease; 1 rabbit on week two, and 2 rabbits on week four. This sentinel event shows that during 8 weeks of incubation, there was an invation of bacteria into the spinal canal or nerve root. Necropsy (animal autopsy) from those 3 rabbits shows an invation of M.tuberculosis into the medulla spinalis without extensive destruction of the spine. Moreover, there was no pus formation and necrotic tissue inside the spinal canal. We conclude that during the first 4 weeks, researches must anticipate a bacterial invasion to the son·atmding tissue.

Picture 3 . Paraplegic incidence after inoculation ofMycobacterium tuberculo sis

Mortality was noted on 2 rabbits fi:om 27 of total sample, which occurs on week four and week seven after inoculation. These 2 rabbits became paraplegic prior to their demise. From this incidence, and expert opinion, we deduce that paraplegia causes deterioration

in

quality of life (QoL). These rabbits can't defecate nor

urinate aside from mobility problem. Combination of this factors decrease the


124

hygiene and appetite of these rabbits. Phenotypically, we can see a breakdown of their pelvic skin. In necropsy, there were no signs of infection aside fro m lesion

I

inoculation

defect. The cause of death is predicted from the deterioratipn of QoL and bad nutritional status.

Picture 4.

Necropsy after inoculation ofM. tuberculosis

Creation of TB Spondylitis Rabbit Model

Four modalities used to assess the creation ofTB spondylitis rabbit model are: ( 1 ) BTA stain, (2) culture, (3) PCR, and (4) histopathologic. The minimum diagnosis ofTB spondylitis is confirmed if one of these parameters is positive. According to this theory, we had a 14 viable TB spondylitis rabbit model. Methodologically, the difference between these parameters can is distinguishable: - In BTA stain, the target is dead Mycobacterium tuberculosis cell wall during slide fix ation process. - In culture, the target is a living Mycobacterium tuberculosis. - In PCR, the target is genetic material, or DNA, of living Mycobacterium tuberculosis after extraction. -

In histopathologic exam, specific reaction in tissue is observed due to the presence of J.\1ycobacterium tuberculosis.

The success of inoculation in this research is reflected in table 4, which depict the presence of living bacteria, dead bacteria, and tissue reaction. BTA results depict living bacteria despite their 'death' during fixation and staining process -7 a dead bacteria cannot be stained with BTA PCR exam reflects either living or dead bacteria, because the DNA content of dead bacteria can still be detected through Universitas Indonesia

125

PCR. Meanwhile, culture exam shows the bacterial ability to surv1ve m the medium

in vitro.

H istopathologic · exam can expose tissue reaction due to

interaction with bacteria and its genetic content (when it is dead). From those four most acclaimed and accurate inoculation information IS . histopathology because this parameter can depict bacterial existence, its parameters, the

proliferative ability, and survival

in vitro .

Not to forget, culture exam is still the

gold standar for bacterial infection diagnosis. In this research, success rate of inoculation through cuhure is only 64.3%. 8

Culture exam post inoculation vveek

shO\vs that Mycobacterium

tuberculosis

can

grow in vertebrae corpus of 9 rabbits, but failed to do so in 5 of the other rabbits. In relation to immunologic marker, we can see a high count of T h l , Th2, and Thl/Th2 ratio in negative culture rabbits compared to positive culture rabbits. Population of blood Thl and Th2 has a negative association with the success rate of bacteria inoculation. Even so, the quantitative value ofThl and Th2 population cannot be described in this research. Analysis of 5 rabbits with negative inoculation on week 8 shows a positive PCR vvith observed DNA chain that resembles finding suggest that lvfycobacterium


tuberculosis

This

failed to grow, but their genetic

material can still be found. Truthfully, lvfycobacterium

tuberculosis can

proliferate

in the defective corpus based on tissue reaction and spotting of inflammatory cells, Datia Langhans, and caseous process from these 5 rabbit models. Immune response is represented by Thl and Th2 population in blood that inactivates and eliminate most of lvfycobacterium

tuberculosis.

Because of this immune respone,

bacteria cannot grow inside the culture media.

Immunologic Evaluation

Monitor ofTh l , Th2, and Th 1/Th2 ratio within rabbits blood shows an increase of Th1 (p < 0.05) and Th2 (p < 0.05) which is statistically significant after inoculation of Mycobacterium

tuberculosis.

was statistically insignificant (p

=

The Thl /Th2 ratio also increases, but

0.417). This increase is due to immunologic

response from the rabbit to counteract the invasion of bacteria. Th2 is involved in


1 26

humoral immune system and plays a role i n neutralizing extracellular parasite. This parameter contribute to the success rate of inoculation in rabbits vertebrae corpus (table 4.1 2).

Conclusion

Direct inoculation of

Mycobacterium

tuberculosis

H37RV strain into rabbit

vertebrae corpus can be done in through operative approach in an aseptic operating theatre. Inoculation of

lvfycobacterium tuberculosis

H37RV strain

causes an increase in Th1 and Th2 population (p < 0.05), but did not increase the Thl /Th2 ratio (p

0.147). The success rate of

=


H37RV strain inoculation reaches 100% if TB spondylitis diagnosis has been confrrmed through one of the parameters I modalities as described i n this research.

Suggestion

Teclmique of

Mycobacterium

tuberculosis

H37RV strain inoculation needs

perfection to achieve a more accurate and safe procedure, with as little collateral damage as possible.

References

1 . Schlossberg, D. 2006. Tuberculosis and Non tuberculous Mycobacterial Infections. Fifth Edition, McGraw-Hill. 2. Sapardan, S. 2004. Total Treatment of Tuberculosis of The Spin e. A Rational

Problem

Solving

Approach.

Peqmstakaan

Universitas

Indonesia.

3. Poelstra

KA,

Barekzi N A, Grainger DW, Gristina AG, Schuler TC. 2000.

A Novel Spinal Implant Infection Model in Rabbits. SPINE, 25(4);406410.

4. Zhang G, Zhu B, Shi W, Wang M, Da Z, Zhang Y. 2010. Evaluation of Mycobacterial virulence using rabbit skin liquefaction model Virulence, 1(3);156-163.

5. Orme I and Juanero MG. Animal Models of M. tuberculosis Infection. Current Protocol in Microbio logy. John Wiley and Son Inc, 2007.


127

6. Zychowicz

ME.Osteoar1icu1ar

Manifestations

of

Mycobacterium

Tuberculosis Infection. Orthopaedic Nursing 2010;29(6). 7. Bieny G, et al. Percutaneous Inoculated Rabbit Model of Intervertebral disc space infection: Magnetic Resonance Imaging Features v-.rith Pathological Correlation. Joint Bone Spine 2008;75:465-470. 8. Dheda K, Schwander S, Zhu B, Richard N, Smit V, Zhang Immunology of Tuberculosis:

20] 0; 1 5:433-450.


From Bench

to

Bedside.

Y.

The

Respirology

1 28

Lampiran 4. 5 Draft Publikasi V Pengaruh Paparan Bakteri Jl1ycobacterium tuberculosis Hidup Terhadap Pembentukan Jembatan Tulang Pada Tata laksana Transplantasi Sel Punca Mesenkimal terhadap Defck Spondilitis Tuberkulosis Kelinci *Rahyussalim, '-'*Tri Kumiawati, ***R. Susworo, ****Andrianjah: * * * * * Arn i Diana Fitri, *Ismail, *Errol U Hutagalung, *Department of Orthopaedi c and Traumatology Faculty of Medicine

University of Indonesia Faculty of Medicine Un iversity of Indonesia ***Department Radiology Faculty of Medicine U ni versi ty of Indonesia ****Department Microbiology Clinic Faculty of Medicine Uni vers ity of Indonesia *****Veterinary Teaching H os pi ta l l3ogo r Agricultural Institute

**Stem Cell and Tissue Engineering Cluster, MERC

ABSTRAK Pendahuluan : Fusi adalah terjadinya pcnyatuan antar tulang, atau dapat pula antar bagian tulang satu dengan lainnya. Pada lingkungan mikroskopis terpapar debris bakteri MTB secara in vitro diferensiasi SPM menjadi osteoblas dan pertumbuhan osteoblas tidak mengalami gangguan berarti. Penelitian ini bertujuan untuk mengamati pengaruh paparan bakteri MTB hidup terhadap pembentukan jembatan tulang pada defek ST kelinci yang ditransplantasikan SPM. Metode : Enam ekor kelinci ST dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan hasil pemeriksaan diagnosis mikrobiologis dan histopatologis, yaitu kelompok paparan (KPH positif) (n=3) dan kelompok kontrol (PH positif) (n=J). Kelompok paparan adalah kelompok kelinci yang tercemar bakteri Mycobacterium tuberculosis hidup yang dibuktikan dengan pemeriksaan kultur positif. Kelompok kontrol adalah kelompok kelinci yang tidak tercemar oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis hidup yang dibuktikan dengan pemeriksaan kultur negatif Kelompok kontrol dapat saja tercermar oleh debris.

Kedua kelompok kelinci ST mendapatkan pcrlakuan TTSSA6, pemberian OAT dan analgetika, penambahan skafold dan SPM. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan klinis yaitu pengamatan aktifitas harian, nafsu makan, kelumpuhan, tanda-tanda infeksi (adanya sinus, abses) dan pengukuran berat badan setiap tiga hari terhadap semua kelinci kelompok paparan dan kontrol. Dilakukan pengamatan terhadap terbentuknya jembatan tulang dengan melakukan pemeriksaan palpasi manual (PM), penghitungan prosentase luas tulang intra defek (PLTID), penghitungan luas tulang perlapang pandang (LTPLP), penghitungan Juas tulang sisi lateral defek (LTSLD), penghitungan luas kalus proyeksi antero-posterior (LKAP) dan penghitungan luas kalus proyeksi lateral (LKL). Analisis hasil pemeriksaan aktifitas osteoblas diuji secara statistic dan menghitung skor aktifitas osteoblas. Hasil : Hasil PM dari kelompok paparan sama dengan kelompok kontrol yaitu masing-masing terdapat 1 kelinci dengan palpasi manual positif Rerata PLTID kelompok paparan 30% (SD = 1 4,00) dan kelompok kontrol 40,67% (SD = 12,50). Rerata L TPLP yang tcrbcntuk intra de£ek kelompok paparan 0,05% (SD 0,02) dan kelompok kontrol 0,07 mnl (SD = 0,02). Rerata LTSLD kelompok =


1 29

paparan 0, 155 mm2 (SD 0,067) dan kelompok kontro1 0,230 mm2 (SD 0,07). Rerata LKAP kelompok paparan 34,30 mm 2 ( SD 56,1) dan kelompok kontrol 2 25,77 n1J112 (SD 9,79). Rerata LKL kelompok paparan 25,87 nm1 (SD 56,1) dan kelompok kontrol 23,71 nm12 (SD 8.34). Rerata skor fusi ke1ompok paparan 77,67 dan kelompok kontrol 120,67. Berdasarkan skoring ini pad a kelompok paparan terdapat 2 dari 3 ekor kelinci yang mengalami gangguan fusi dan 1 kelinci mengalami fusi yang lebih baik. Pada kelompok kontrol terdapat 1 dari 3 ekor kelinci yang mengalami proses nisi yang terhambat, l dari 3 ekor kelinci yang mengalami proses fusi yang normal dan 1 dari 3 ekor lainnya mengalami proses fhsi yang berjalan lebih baik. Pembahasan Keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis tidak berpengaruh terhadap kekakuan tulang secm·a palpasi manual. Hasil ini berbeda dengan basil yang diperoleh berdasarkan tiga parameter histopatologi yang memperlihatkan bahwa bakteri j\1ycobacterium tuberculosis memberi kesan menghambat pembentukan tulang baru di dalam defek dibandingkan kontrol yang dibuktikan dengan lebih kecilnya Juas tulang yang terbentuk pada kelompok kelinci yang terpapar Mycobacterium tuberculosis hidup dibandingkan dengan kelompok kelinci kontrol. Terjadinya gangguan fus i oleh bakteri bakteri Mycobacterium tuberculosis sejalan dengan beberapa literatur yang mengatakan bahvva bakteri menyebabkan gangguan keseimbangan aktifitas osteoblast yang berdampak nyata pada pembentukan tulang baru yang diperlukan untuk mencapai fusi atau terbentuknya jembatan tulang. Kesimpulan Secara histopatologi dan radiologi keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis terbukti mengganggu pembentukan tulang baru di dalam detek kelinci spondilitis TB, namun secm·a manual palpasi hubungan antar tulang masih menunjukkan tetjadinya fusi. =

=

=

=

=

=

Key,'vords

spread, model kelinci spondilitis tuberkulosis, inokulasi, BTA kultur, PCR, fusi, jembatan tulang.

Mycobacterium

tuberculosis


130

PENDAHULUAN

Fusi adalah terjadinya penyatuan antar tulang, atau dapat pula antar bag1an tulang satu dengan lainnya. Penyatuan ini terjadi karena suatu proses pembentukan jembatan tulang antar bagian tulang yang sebeh.II1111�'a teryisah. Jembatan tulang yang adekuat dapat menghilangkan defek dan menyatukan dua bagian yang terpisah. Hasil penyatuan yang dihasilkan dapat bervariasi mulai dari sangat kaku sampai sangat rapuh, tergantung pada kualitas jembatan tulang yang terbentuk. Kualitas jembatan tulang ini sangat menentukan stabilitas hubungan antar tulang. Spondilitis tuberkulosis adalah penyakit infeksi pada tulang belakang yang disebabkan oleh bakteri


Spondilitis tuberkulosis

clapat mengakibatkan kerusakan korpus (defek) yang menimbulkan instabilitas tulang belakang dan gangguan struktur eli sekitarnya. Penyembuhan inteksi bakteri pada kasus spondilitis tuberkulosis dipengaruhi oleh virulensi bakteri, sistem imun, gizi, dan lama paparan bakteri, sementara penyembuhan kerusakan korpus tergantung pacla kemampuan proliferasi sel osteoblas clalam memproduksi matrik.s tulang, deposit kalsium di daerah lesi dan aktifitas sel osteoklas dalam mendukung proses remodeling. Sel punca mesenkimal secm·a m vitro telah terbukti dapat dikultur clan berdiferensiasi menjadi sel osteoblas. Demikian pula pada lingkungan in vitro yang secm·a mikroskopis terpapar debris bakteri


diferensiasi sel punca mesenkimal menjadi osteoblas serta pertumbuhannya tidak mengalami gangguan yang berarti. Penelitian ini bertujuan untuk mengamati pengaruh

paparan

bakteri

Mycobacterium

tubeculosis

hidup

terhadap

pembentukan jembatan tulang pada defek spondilitis tuberkulosis kelinci yang ditransplantasikan sel punca mesenkimal.

METODE

Penelitian ini merupakan penelitian intervensi pada hewan kelinci yang telah memenuhi kaji etik dan mendapatkan persetujuan dari Komite Animal Care and Use Committee (ACUC) PT. Bimana Indomedical dan Rumah Sakit Hewan (RSH) JPB. Sebagian besar penelitian ini menggunakan fasilitas hewan d i RSH


131

JPB, PT Bimana I ndomedical, laboratorium Mikrobiologi Klinik FKUI dan laboratorium Patologi Anatomik FKUI. Sampel penelitian ini adalah kelinci spondilitis tuberkulosis yang dibuat mengikuti suatu prosedur inokulasi langsung bakteri Mycobacterium tuberculosis kedalam korpus

vertebranya. P emilih an

kelinci didasarkan pada bobot tubuh,

maturitas tulang, jenis kelamin, pemeriksaan klinis, radiologis dan Iaboratorium dengan kriteria inklusi adalah kelinci putih Selandia baru sehat berbobot 3000

2500-

gram dan matur secm·a skeletal, sedangkan kriteria eksklusi adalah kelinci

yang memiliki kelainan bmvaan tulang belakang dan atau mengalami kelainan d i tulang belakang akibat infeksi, trauma, neoplasma dan sebagainya. Enam ekor

kelinci spondilitis tuberculosis dibagi menjacli clua kelompok

berdasarkan hasil pemeriksaan diagnosis mikrobiologis dan histopatologis, yaitu kelompok paparan (KPI-l positif) (n=J) dan kelompok kontrol (PH positif) (n=3). Kelompok

paparan

adalah

kelompok

kelinci

yang

terinfeksi

bakteri

Mycobacterium tuberculosis hidup yang dibuktikan dengan hasil pemeriksaan kultur posi9f, sedangkan kelompok kontrol aclalah kelompok kelinci yang tidak terinfeksi oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis hidup yang dibuktikan dengan hasil pemeriksaan kultm negatif� walaupun kelompok kontrol dapat saja tercerrnar oleh debris bakteri 1\{vcobacterium tuberculosis. Kedua

kelompok

kelinci

spondilitis tuberkulosis mendapatkan

perlakuan

TTSSA6, pemberian OAT serta penempatan skafold dan transplantasi sel punca mesenkimal. Selanjutnya kelinci dipelihara dalam kandang individual dan setiap

3

hari dilakukan pemeriksaan klinis, yaitu pengamatan aktifitas harian, nafsu makan, kelumpuhan, tanda-tanda infeksi (adanya sinus, abses) dan pengukuran berat serta suhu badan. Pengamatan terhadap terbentuknya jembatan tulang dilakukan dengan melakukan pemeriksaan palpasi manual (PM) saat kelinci dinekropsi setelah dieutanasia, penghitungan prosentase luas tulang intra clefek (PL TID),

penghitungan

penghitungan luas tu lang

luas sisi

tulang lateral

perlapang defek

pandang

(LTPLP)

dan

(LTSLD) berdasarkan hasil

pemeriksaan histopatologi terhadap jaringan tulang eli area defek, serta penghitungan luas kalus proyeksi antero-posterior (LKAP) dan penghitungan Juas


132

kalus proyeksi lateral (LKL) berdasarkan hasil foto roentgen. A.nalisis hasil pemeriksaan diuji secara statistik dan dilakukan penghitungan skor fusi.

HASJL Pengamatan Proses Fusi

pada Lingkungan Mikroskopis Mycobacterium

tuberculosis

Berdasarkan lingkungan mikroskopis dan histopatologis kelinci spondilitis tuberkulosis dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok paparan (KPH positif) dan kelompok kontrol (PH positif). Untuk mengamati fusi atau pembentukan jembatan

tulang

pada lingkungan mikroskopis


dilakukan evaluasi terhadap variabel ihsi yaitu palpasi manual (kaku atau tidak kaku), Juas tulang yang terbentuk (prosentase

LTID,

LTPLP, LTSLD), serta luas

kalus (A.P dan lateral). Tabel I Evaluasi variabel fusi pada lingkungan mikroskopis Mycobacterium tuberculosis Kelompok kontrol Kelompok paparan p Variabel n=3 rerara ..L SD rerata = SD n=3 ..,

.)

1/3

3

1/3

Na

3

30.00 ± 1 4,00

3

40,67 ± 12,50

Na

LTPLP

3

0,047 ± 0,021

3

0,067 ± 0,021

Na

LTSLD

.)

0, 1 5 5 ± 0,067

3

0,230 ± 0,07

Na

LKAP

3

34,297 ± 7,422

3

25,77 ± 9,79

Pa l pasi m anual

PLTID

LKL

..,

3

25, 1 8 7 1 : · 5,607

.)..,

Na

Na

23 ,7 1 ± 8,34

Ket untuk palpasi manual: angka yang ditunjukkan adalah angka yang lebih kaku. Jacli angka mcnunjukkan ada I kelinci yang menunj ukkan hasil lebih kaku diantara 3 kelinci

1/3

Hasil Palpasi Manual

Hasil palpasi manual dari kelompok paparan menunjukkan terdapat 1 kelinci dengan hasil palpasi manual positif sementa.ra 2 kclinci lainnya menunjukan hasil manual palpasi negatif Demikian pula hasil palpasi manual pada kelompok kontrol yang menunjukkan terdapat I kelinci dengan palpasi manual positif sementara 2 kelinci Jainnya menunjukan basil manual palpasi negatif

Basil Penghitungan Proscntase Luas Tulang yang Terbentuk Intra Defe){


1 33

Rerata

prosentase luas tulang yang terbentuk intra defek pada kelinci ST

kelompok KPH positif (n

= 3)

adalah 30,00% (SD

= 14,00).

Rerata prosentase

luas tulang yang terbentuk intra defek pada kelinci ST kelompok PH positif ( n 3)

adalah 40,67% (SD

=

= 1 2,50).

Gambar I. Pengamatan terhadap slide pulasan HE menggunakan mikroskop dengan pembesaran Jaringan dipersiapkan dari pemotongan sagittal melewati defek yang terbentuk dari arah sisi lateral. a. Slide dari kelompok kelinci spondilitis yang diberikan sel punca mensenkimal ke dalam defeknya. Pada· gam bar tampak pulau pulau tulang yang terbentuk d i antara skafold. b. Slide dari kelompok kelinci terin feksi yang tidak diberikan sel punca mesenkimal. Tampak area tulang berupa pulau pulau diantara skafol d. Dibandingkan dengan slide dari kelompok kelinci yang diberikan sel punca mesenk.imal, pulau pulau tulang yang terbentuk pada slide kelompok yang diberikan sel punca mesenkimal lebih dominan

400x.

Luas Area Tulang yang Terbentuk Per Lapang Pandang

Rerata luas tulang perlapang pandang yang terbentuk intra defek pada kelompok paparan adalah 0,05% (SD

= 0,02).

Rerata luas tulang perlapang pandang yang

terbentuk intra defek pada kelompok kontrol adalah 0,07 mm2 (SD = 0,02).

Luas Area Tulang Sisi Lateral yang Terbentuk per luas Defek

2 Rerata luas tulang sisi lateral defek pada kelompok paparan adalah 0,155 mm (SD = 0,067). 0,230

Rerata luas tulang sisi lateral defek pada kelompok kontrol adalah

mnl (SD = 0,07).


134

Luas Kalus Intra Defek Proyeksi Antero Posterior

Rerata

luas area kalus intra defek proyeksi anteroposterior pada kelompok 2 paparan adalah 34,30 mm (SD 5 , 6 1 ). Rerata luas area kalus intra defek proyeksi anteroposterior pada kelompok kontrol adalah 25,77 mm2 (SD 9,79). =

b

d Gambar 2. Memperlihatkan gam bar foto rontgen dan arsiran kalus a. Foto rontgen anteroposterior daerah thorakolumbal kelinci pada enam minggu setelah prosedur TTSSA6, pembuatan defek, penambahan skafold dan sel punca mesenkimal. a. Pada lesi T l 2 tampak pertumbuhan kalus intra defek dan ekstra defek. b. Hasil arsiran korpus vertebra T 1 2 proyeksi anteroposterior (gambar 4. I 1 a). Arsiran berwarna merah menunjukkan area kalus inh·a defek Tl2. Arsiran berwarna biru menunjukkan area kalus ekstra defek. c. Foto rontgen anteroposterior daerah thorakolumbal kelinci pada enam minggu setelah prosedur TTSSA6, pem buatan defek, penambahan skafold tanpa pemberian sel punca mesenkimai.Pada Iesi T l 2 tampak pertumbuhan kalus intra defek dan ekstra defek. d. Hasil arsiran korpus vertebra T l 2 proyeksi anteroposterior ( gambar 4. 1 1 c). Arsiran berwarna merah menunjukkan area kalus intra defek Tl2. Arsiran benvarna biru menunjukkan area kalus eksh·a defek.

Luas Kalus Intra Defek Proyeksi Lateral

Rerata luas area kalus intra defek proyeksi lateral pada kelompok paparan adalah 25,87 mm2 (SD 5,61). Rerata luas area kalus intra defek proyeksi lateral =

kelompok kontrol adalah 23,71

mm2

(SD

=

8,34). Universitas Indonesia

135

b

d

Gambar 3. Memperlihatkan gambar foto rontgen dan arsiran kalus, a. Foto rontgen lateral daerah thorakolumbal kelinci pada enam minggu setelah prosedur TTSSA6, pembuatan defek, penambahan skafold dan sel punca mesenkimal. Pada lesi T 1 2 tampak pertumbuhan kalus intra defek dan ekstra defek. b. Hasil arsiran korpus vertebra T l 2 proyeksi lateral (gambar 4 . 1 2 a). Arsiran benvarna merah menunjukkan area kalus intra defek T12. Arsiran berwama biru menunjukkan area kalus ekstra defek. c. Foto rontgen lateral daerah thorakolumbal kelinci pada enam minggu setelah prosedur TTSSA6, pembuatan defek, penambahan skafold tanpa pemberian sel punca mesenkimai.Pada lesi T12 tampak pertumbuhan kalus intra defek dan ekstra defek. d. Hasil arsiran korpus vertebra T12 proyeksi lateral ( gambar 4.12 c). Arsiran benvarna merah menunjukkan area kalus intra detek Tl2. Arsi.ran berwarna biru menunjukkan area kalus ekstra defek.

Penghitungan skoring fusi pada kedua kelompok kelinci dapat dilihat pada tabel 2. Berdasarkan skoring ini terlihat bahwa pada kelompok paparan terdapat 2 dari 3 ekor kelinci (2/3) mengalami gangguan fusi dan 1 dari 3 ekor kelinci (113) mengalami fusi yang lebih baik. Pada kelompok kontrol terdapat 1 dari 3 ekor kelinci (1/3) yang mengalami proses fusi yang terhambat, 1 dari 3 ekor kelinci (1/3) yang mengalami proses fusi yang normal dan 1 dari 3 ekor kelinci (1/3) lainnya mengalami proses fusi yang berjalan lebih baik. Rerata skor fusi kelompok paparan dan kontrol berturut-turut adalah 77,67 dan 120,67. Universitas Indonesia

136

Tabel 2. J-lasil Kode

pengh it ungan

total

PLTID

PM

kel i nc i

Kelompok

K0509

K3264

skoring fusi setiap sampel keli nci

spondilitis tuberkul osis

LTPLP

LTSLD

L K/\ P

LKL

kor

Skor

Skor

skor

Tota l

s kor

Skor

Paparan

30

3

3

5

5

3

49

Fusi terhambat

Paparan

135

3

10

10

3

3

164

Fusi lcbih baik

3

3

5

3

.)

20

Fusi terhambat

10

10

20

5

108

Fusi normal

3

76

Fusi terhambat

10

178

r-usi lebih baik

K05 1 9

Paparan

K3164

Konh·ol

..,.)

30

s

1<0505

Kontrol

30

10

10

20

1<2964

Kontrol

1 35

5

5

20

Skor kurang dari 94 artinya fus i

artinya fusi tcrcapai lebih baik

terhambat; skor 94 sd

..,

.., .)

3

.., .)

1 4 1 artinya fusi dalam

kor

s

Kcterangan

batas normal; skor diatas 1 4 1

Pcmbahasan

Tercapainya fusi atau terbentuknya jembatan tulang pada kasus infeksi dengan kelainan defek merupakan tujuan utama dari penatalaksanaan yang d ilakukan. Tancla-tanda fusi yang paling signifikan adalah tidak Jagi ditemukan pergerakan pada daerah yang sebelum penatalaksanaan terdapat pergerakan. Tanda lainnya dapat diamati dengan berbagai pemeriksaan antara Jain pemeriksaan rontgen dan pemeriksaan histopatologi. Pada pemeriksaan rontgen fusi ditunjukkan oleh seberapa Juas kalus yang

terbentuk baik pada proyeksi anteroposterior maupun lateral. Pada pemeriksaan histopatologi fusi ditunjukkan dengan melakukan pewarnaan

HE

dan pengamatan

hasil pewarnaan tersebut di bawah mikroskop dengan pembcsaran 400x. Hasil pemeriksaan palpasi manual pada kelinci kelompok paparan dan kelinci kelompok kontrol adalah sama, artinya keberadaan bakteri Mycobacterium tuberculosis

tidak berpengaruh terhadap kekakuan tulang. Hasil ini berbeda

dengan basil yang diperoleh berdasarkan tiga parameter histopatologi yang mcmperlihatkan bahw·a bakteri

Mycobacterium

tuberculosis

memberi kesan

menghambat pembentukan tulang baru di dalam defek kelinci kelompok paparan dibandingkan kelompok kontrol yang dibukt ikan dengan lebih kecilnya luas tulang yang terbentuk pada kelinci kelompok paparan dibandingkan dengan

kelinci kelompok kontrol.


137

Hasil

pemeriksaan radiologi menunjukkan bahwa

tuberculosis

bakteri

Mycobacterium

hidup justru membcrikan dampak positif terhadap pembentukan

kalus, artinya pada kelinci kelompok paparan yang terdapat bakteri hidup di dalam korpus vertebranya justru menunjukkan pembentukan kalus yang lebih Juas (proyeksi antero posterior maupun lateral) dibandingkan ke linci kelompok kontrol. Dari hasil skoring diperoleh kcsan bahwa keberadaan bakteri tuberculosis

Mycobacterium

hidup menghambat proses fusi. Hal ini clapat clilihat dari basil skor

total kelinci kelompok paparan yaitu terdapat 2 clari 3 ekor kelinci (2/3) yang mengalami hambatan fusi, sementara pada kelinci kelompok kontrol hanya 1 dari 3 ekor kelinci ( 1 /3) yang mengalami hambatan fusi. Dari rerata skor total masing masing kelompok kelinci juga menunjukkan hal yang sama dimana diperoleh rerata skor fusi kelompok paparan lebih rendah daripada kelompok kontrol. Terjadinya gangguan fusi oleh bakteri


sejalan clengan

banyak literatur yang mengatakan bahwa bakteri menyebabkan gangguan keseimbangan aktifitas osteoblast yang berdampak nyata pacta pembentukan tulang baru yang diperlukan untuk mencapai fusi atau terbentuknya jembatan tulang. Kesimpulan

Berdasarkan evaluasi

terhadap proses fusi

yang berkaitan dengan kekakuan

hubungan atar tulang yang dibuktikan dengan pemeriksaan palpasi manual, pemeriksaan pembentukan tulang baru secara histopatologi, pembentukan kalus pada foto rontgen dan evaluasi terhadap total skoring fhsi untuk tiap sampel kelinci dikctahui bahwa bakteri


memberikan dampak

negatif terhadap capain fusi.

Saran

Diperlukan penerapan pencitraan sinar-X digital, CT scan mik.ro, dan MRJ yang dapat memberikan data kontinyu agar dapat digunakan

untuk mengevaluasi

proses pcmbentukan tulang baru dan fusi secara lebih baik dan terukur.


1 38

Daftar Pustaka

1 . Schlossberg, D. 2006. Tuberculosis and Non tuberculous Mycobacterial Infections. Fifth Etlition, McGraw-Hill. 2 . Sapardan, S. 2004. Total Treatment of Tuberculosis of The Spine. A Rational

Problem

Solving

Approach.

Perpustakaan

Universitas

Indonesia.

3. Poelstra KA, Barekzi NA, Grainger DW, Gristina AG, Schuler TC. 2000.

A Novel Spinal I mplant Infection Model in Rabbits. SPINE, 15(4);406410. 4.

Zhang G, Zhu B, Shi W, Wang M, Da Z, Zhang Y. 20 1 0. Evaluation of Mycobacterial virulence using rabbit skin liquefaction model. Virulence, 1(3);156-163.

5. Gottfi·ied

0

and Dailey

A

2008. Mesenchymal Stem Cell and Gene

therapies tor Spinal Fusjon, Neurosurgery 63. 6.

Orme I and Juanero M. 2007. Animal Models ofM. tuberculosis Infection, John Wiley and Son In c.

7. Bierry G, et al.

2008.

Percutaneous Inoculated Rabbit Model of

Intervertebral disc space infection: Magnetic Resonance Imaging Features with Pathological Correlation. Joint Bone Spine 75:465-470. 8. Zychowicz ME. 2010. Osteoarticular Manifestations of Mycobacteriu m Tuberculosis Infection. Orthopaedic Nursing 29(6). 9. Nather A, David

V,

Teng J, Lee C, Pereira B. 2010. Effect of Autologous

Mesenchymal Stem Cells on Biological Healing of Allografts in Critical sized Tibial Defects Simulated in Adult Rabbits. Ann Acad Med Singapore 39:599-606.

10. Vats A, Tolley NS, Buttery DK, Polak JM. 2004. The Stem Cells in Orthopaedic Surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery (BR) 868(2):159-164.


1 39

Lampiran Sistem Skoring fusi Tabel Sistem Penilaian Skoring Fusi. Variabel

Hasil

Skor

l lasil

Skor

Hasil

Skor

Hasil

skor

Palpasi manual

Vert T l 2 Sesuai nekropsi

tidak kaku

3

Kaku

30

lebih kaku

45

Sangat kaku

1 35

PLTID

Lesi T l 2

"

N

5

>N

10

>>N

20

LTPLP

Lesi T ! 2

"

.)

N

5

>N

10

>> N

20

LTSLD

Lesi T l 2

3

N

5

>N

10

>> N

20

LKAP

Vert T l 2

3

N

5

>N

10

>> N

20

LKL

Vert T l 2

3

N

5

>N

10

>> N

20

.)

Total

235

< N adalah nilai dibawah nilai minimum kontrol positif; N adalah dari nilai minimum sampai dengan nilai maksimum kontrol positif; > N adalah diatas nilai maksimum kontrol positif; >> N

adalah nilai berada jauh dari nilai rnaksimurn kontrol positif(lebih dari dua kali nilai maksimum); Skor kurang dari 94 artinya fusi terhambat; skor 94 sd J 4 J artinya fusi dalam batas normal; skor diatas 1 4 1 artinya fusi tercapai lebih baik.


140

Influences of Mycobacterium tuberculosis Exposures in the Bony Bridge Formation of Mesenchymal Stem Cell Transplantation to Rabbit Spondylitis Tuberculosis Rahyussalim, **Tri Kumiawati, ***R. Susworo, ****Andrianjah, *****Ami Diana Fitri, *Ismail, *Errol U Hutagalung, *Department of Orthopaedic and Traumatology Faculty of Medicine University of Indonesia **Stem Cell and Tissue Engineering Cluster, MERC Faculty ofMedicine University of Indonesia ***Department Radiology Faculty of Medicine University of Indonesia ****Department Microbiology Clinic Faculty of Medicine University o f lndonesia *****Veterinary Teaching Hospital Bogor Agricultural institute

ABSTRACT

Introduction: Fusion is defined by the incorporation of bone-to-bone or between the pa11s of bones. Mesenchymal Stem Cell (MSC) differentiation into osteoblast is not disturbed in relation to Mycobacterium tuberculosis's debris exposure in the microscopic environment in vitro. This research aims to observe the influences o f live Mycobacterium tuberculosis o n bony bridge formation on Spondylitis Tuberculosis (ST) rabbit's defect which is transplanted with MSC. Methods: Six ST rabbits were divided into two groups which were culture (C), PCR (P), and histopathologic (H) positive as the exposed group (n=3) and PCR and histopathologic (PH) positive as the control group (n=3). Both groups underwent TTSSA6 treatment, anti tuberculosis diUgs administration, scaffo ld and MSC transplantation. Clinical examination was carried alter 6 weeks incubation time and bony bridge through the manual palpation (MP) method was examined. Bone intra defect area percentage (BIDAP) was calculated, bone area per field view (BAFV), and lateral bone defect area (LB DA) were measured based on microscopic examination from histopathology preparation while antero-posterior projection callus area (APPCA) and lateral projection callus area (LPCA) were measured based on x-ray image using I mage J software. The results vvere tested statistically and used to determine the fusion score. Results: MP fi·om both control and exposed group showed 1 positive MP rabbit. Mean BIDAP score for exposed group was 30.00% (SD = 14.00) and control group was 40.67% (SD 1 2 .50), mean BAFV score for exposed group 0.05mm2 (SD = 0.02) and control group 0.07mm2 (SD 0.02), mean LBDA score for exposed group 0 . 1 55 mm2 (SD = 0.067) and control group 0.230 mm2 (SD = 0.07). Mean APPCA score for exposed group 34.30 mm2 (SD = 5.61) and control group 25.77 mm2 (SD 9.79), mean LPCA score for exposed group 25.87 mm2 (SD = 5.6 1 ) and control group 23.71 mm2 (SD = 8.34). Mean fusion score for exposed group 77.67 and 1 20.6 for control group. These results showed that there were 2 of3 rabbits (2/3) in the exposed group had fusion disturbances and I out of 3 rabbit ( I /3) had better fusion; while in the control group there was I of3 rabbits ( 1 /3) had delayed fusion, I of3 ( 1 /3) had normal fusion and 1 of3 ( 113) had better fusion. Discussion: Mycobacterium tuberculosis existence does not affect bone rigidity manually. This result differs fi·om the result obtained based on the three histopathologic aspects showing the impression of Mycobacterium tuberculosis 's =

=

=


141

existence that suppresses formation of new bone intra-defect proven by the smaller bone area formed in the exposed group compared with the control group. Fusion disturbance by M:vcobacterium tuberculosis exposure was also stated in several literatures emphasizing the suppressing effects of Mycobactreium tuberculosis to osteoblast's activity which inhibit the format ion of new bone necessary in the bony bridge formation hence, fusion. Conslusion The presence of Mycobacterium tuberculosis bacteria histopathologically and radiologically interfere with the formation of new bone in the infection defect of spondylitis tuberculosis rabbit, but manually palpation of the relationship between bone shows that it is still in the fusion. Keywords: Mycobacterium tuberculosis,

bony bridge


spondylitis tuberculosis rabbit, fusion score, fusion,

1 42

Background

Fusion is a bony union between bones, or v,;ithin certain segment ofthe bone. This process can occur through bone bridging. An adequate bone bridge can eliminate defect and conjoin 2 separate segments. The result ofbony bridge varies between very rigid and very fragile, depends on the quality of the bone bridge that defines the stability of the bone. Tuberculosis (TB) spondylitis A1ycobacterium tuberculosis.

IS

an infection of vertebrae corpus clue to

This disease can cause instability of the spine

because of corporal detect and the sorrouncling tissue. Healing is ini1uencecl by bacterial virulence, immune status, nutrition, and incubation, meanwhile the cellular component responsible for healing are osteoblast deposition of nev•i bone matrix, calcium deposition of defect, and osteoclast activity on bone remodeling. Mesenchymal stem cell (MSC) can be cultured and harvested into osteoblast. The same rule can be applied in the presence of M. tuberculosis; differentiation of MSC into osteoblast didn't attenuate. This research is meant to evaluate the effect of a living


towards the formation of bony bridge in

the defective corpus ofTB spondylitis rabbits which was transplanted with MSC.

Methods

This resem·ch is an interventional research using animal model. The research protocol has been reviewed and approved by: ( 1 ) Animal Care and Use Committee (ACUC) PT Bimana Indomedical No. R.02-12-IR, (2) "Komisi Pengawasan dan Kesejahteraan Penggunaan He\·van Percobaan" (KPKPHP) JPB Animal Hospital No. 02-2 1 0 1 2, (3) Medical Research Unit (MRU), Research Ethical Committee FMUI-RSCM No. 5 2 1 /PT02.FK/ETIK/2012. The majority of the research process lies in IPB Animal Hospital Lab, PT Bimana Indomedical, Clinical Microbiology Lab FMUI, and Pathology Anatomy Lab FMUI. The selection of rabbit model is determined by body w·eight, bone maturity, sex, clinical, radiologic, and laboratory exam which fulfill the inclusion criteria (healthy New Zealand strain weighted 2500-3000 g m1d skeletally mature).


1-B

Rabbits with abnormality of spine because of ongoing infection, trauma.

or

neoplasm will be excluded. Six rabbits with TB spondylitis are divided into 2 groups based on microbiologic and histopathologic examination, which is intervention group (K:PH positive, n=3)

and control group (PH positive, n=3). Intervention group are rabbits infected with living

Nfvcobacterium tuberculosis

pro ven with positive culture, whereas control

group arc rabbits not infected by liv i ng


negative culture even when contaminated with debris of

proven with

Mycobacterium

tuberculosis.

Both groups receive TTSSA6 procedure, antituberculosis reg im en, scaffold

placement, and MSC transplant. All samples are caged indiv id ually and a 3-day period follow up is conducted, which is daily activites, appetite, paraplegia, infection

signs

(sinus,

abscess),

weight and

temperature

measurement.

Observation of bony bridge is done by "palpasi manual" (PM) after euthanasia and necropsy, "penghitungan prosentase Juas tulang intra defek" (PLTID), "penghitungan Juas tulang perlapang pandang" (LTPLP), "penghittmgan Juas tulang sisi lateral defek" (LTSLD) based on histopathologic examination in the defect area, as well as measurement of "luas kalus proyeksi antero-posterior" (LKAP), dan measurement of "luas kalus proyeksi lateral" (LKL) based on x-ray. Analysis was performed statistically and through fusion scor ing

.

Results Fusion Process in Jlfycobacterium tuberculosis Environtment

To evaluate fusion/bony bridge in this microenvirontment, we tabulate the associated variables which is PM, PLTID, LTPLP, LTSLD, LKAP, and LKL.


144

Table 1 . Evaluation of fusion variables in M. Intervention Group Variables n=3 Mean ± SD

tuberculosis microenvirontment

Control Group

p

n=3

Mean ± SD

3

1/3

Na

3

l/3

3

30,00 ± 14,00

,., .)

40,67 ± 1 2,50

Na

.)

0,047 ± 0,021

3

0,067 ± 0,02 1

Na

LTSLD

3

0,155 ± 0,067

3

0,230 ± 0,07

Na

LKAP

3

34,297 ± 7,422

3

25,77 ± 9,79

Na

LKL

3

25,187 ± 5,607

3

23,71 ± 8,34

Na

PM PLTID LTPLP

,.,

NB: for PM -7 the value assorted are the more rigid one. In other words, the value of l/3 indicates that there is I rabbit that exhibit a more rigid result compared to the other 2. PM Result

For both group, there is 1 rabbit that exhibit positive PM while the other 2 is negative.

PLTID Result

Mean PLTID on intervention group is 30.00% (n group is 40.67% (n = 3, SD

=

=

3, SD

=

1 4.00), and control

12.50).

Picture 1 . M i croscopic HE-stained slides with 400 times magnification. The tissue is prepared through sagital slice through the defect. a. Intervention group slide, which was given MSC. As we can see there is bony islands between the scaffold placement. b. Control group slide, not given MSC. There i s also bony islands between the scaffold on this sli de, but is less prominent compared to the intervention group.

LTPLP Result

The intervention group shows a result of0.05 group shows a result of 0,07 mm2 (SD

=

mm2

(SD

=

0.02), while the control

0,02). Universitas Indonesia

1 -.:

LTSLD Result

Mean intervention group LTSLD is

0.155

mm2

(SD = 0.067), and the mean

control group LTSLD is 0.230 mnl (SD = 0.07). LKAP Result

Mean intervention group LKAP is 34.30 25.77

mm2

mnl

(SD

=

5.61 ), and control group is

(SD = 9. 79).

b

c

d

Picture 2. X-ray photo and callus illustration a. AP projection of thoracolumbal 6 weeks after ITSSA6 procedure, defect synthesis, scaffold placement, and MSC transplant. We can see callus formation intra and extra defect. b. Illustration from picture a; red sketch showing intradefect callus, while blue sketch shows extradefect callus. c. AP projection of rabbit thoracolumbal 6 weeks after TTSSA6 procedure, defect synthesis, scaffold placement without MSC transplant. We can also see callus formation intra and extra defect. d. Illustration on picture c shows an intradefect callus (red) and extradefect callus (blue).


146

LKL Result

Mean intervention group LKL is 25.87 LKL is 23.71

nun2

(SD

=

mm2

(SD

=

5.61), and mean control group

8.34).

b

d Picture 3. X-ray photo and callus illustration a. Lateral projection ofthoracolumbal 6 weeks after TTSSA6 procedure, defect synthesis, scaffold placement, and MSC tran splant We can see callus formation intra and extra defect. b. Illustration from picture a; red sketch showing intradefect callus, while blue sketch shows extradefect callus. c. Lateral projection of rabbit thoracolumbal 6 weeks after TTSSA6 procedure, defect synthesis, scaffold placement without MSC transplant. We can also see callus formation intra and extra defect. d. Illustration on picture c shows an intradefect callus (red) and extradefect callus (blue). .

Fusion score calculation of both groups can be seen on table 2. Based

on

this

scoring system, it is visible that from intervention group, there was 2 rabbit with delayed fusion (2/3) and 1 of them three (1/3) has a good fusion. The result in control group varies, with 1 rabbit has a delayed fusion (1/3), 1 rabbit with normal fusion ( 1 /3), and the last rabbit has a good fusion (1/3). Mean value of fusion score, respectively, are 77.67 and 120.67.


I-ll

Table 2. fusion Scoring ofTB Spondylitis Rabbits Subject Coding

PM

PLTID

LTPLP

LTSLD

LKAP

LKL

Group

Score

Score

Sc{)re

Score

Score

Score

Total Score

Addendum

K0509

Intervention

30

3

3

5

5

3

K3264

Intervention

1 35

3

10

10

K05 1 9

Intervention

3

3

3

K3 1 64

Control

30

10

K0505

Control

30

K2964

Control

135

49

Delayed

3

" . .)

164

Good

5

3

3

20

Delayed

10

20

3

5

1 08

Normal

10

10

20

76

Delayed

5

5

20

1 78

Good

NB: Score < 94 means delayed fusion; 94- 1 4 1

" .)

" .)

" .)

means normal fusion ; >

10

1 4 1 means good fusion

Discussion

The accomplishment of fusion in this case ( infection) v-.-'ith corpus defect is the main goal of therapy. The ultimate sign of fusion is no movement in the previously

defective/mobile

area.

The

other

signs

include

x-ray

and

histopathologic examination. On x-ray, fusion is indicated by how far the callus extend on AP and lateral projection. By histopathologic means, fusion is described by scrutinizing the

HE

stained lesion under microscopic magnification (400 times). Manual palpation measurement on both group is similar, which means Mycobacterium tuberculosis

did not effect the fragility of the bone. This result is

contrast with histopathologic results, in which

Mycobacterium

tuberculosis

inhibits new bone formation of intervention group rabbits compared to control group. This hypothesis is supported by evidence-based result, where intervention group specimen has a little bone formation than control group. Aside from that evidence, another radiological evidence shows that a living tuberculosis promotes

Mycobacterium

callus formation rather than inhibiting it.

Inpart of fusion scoring, living

Mycobacterium tubercuLosis

does obstruct fusion

process as seen in the previous result. On intervention group, 2/3 rabbits exhibit delayed fusion, while in control group only 1 /3 rabbits has a delayed fusion. Mean fusion score of intervention group is also lower compared to control group.


1�8

fusion disturbance by Mycobacterium tuberculosis is confirmed by another study /literature which implies that bacteria causes imbalance of osteoblast that and hence the deposition of new bone needed in bony bridging ofthe defect. Conclusion

From the aforementioned parameters of fusion. described in this research as fusion scoring parameters, it is known that Mycobacterium tuberculosis gave a negative effect on fusion of bone defect. Suggestion

Additional examination including digital x-ray, micro CT scan, and MRI can give a better continual data for the sake of evaluation of new bone formation and fusion I bony bridging mor accurately and objectively.

References 1 . Schlo ssberg, D. 2006. Tuberculosis and Non tuberculous Mycobacterial Infections. Fifth Edition, McGraw-Hill. 2. Sapardan, S. 2004. Total Treatment of Tuberculosis of The Spine. A Rational

Problem

Solving

Approach.

Perpustakaan

Universitas

Indonesia.

3. Poelstra KA, Barekzi NA, Grainger DW, Gristina AG, Schuler TC. 2000. A Novel Spinal Implant Infection Model in Rabbits. SPINE, 25(4);406410.

4. Zhang G , Zhu B, Shi W, Wang M, Da Z, Zhang Y. 20 10. Evaluation of Mycobacterial virulence using rabbit skin liquefaction model. Virulence, 1 (3) ; 156-163.

5. Gottfried

0

and Dailey A. 2008. Mesenchymal Stem Cell and Gene

therapies tor Spinal Fusion, Neurosurgery 63. 6.

Orme I and Juarrero

M.

2007. Animal Models ofM. tuberculosis Infection,

John Wiley and Son Inc.


P9

7. Bicrry G, et a!. 2008.

Percutaneous Inoculated Rabbit Model of

Intervertebral disc space infection: Magnetic Resonance Imaging Features with Pathological Correlation. Joint Bone Spine 75:465-470. 8. Zychowicz ME. 20 I 0. Osteoarticular Manifestations of Mycobacterium Tuberculosis Infection. 0 11/w paedic Nursing 29(6). 9. Nather A, David V, Teng J. Lee C, Pereira B. 2010. Effect of Autologous

Mesenchymal Stem Cells on Biological Healing of Allografts in Critical sized Tibial Defects Simulated

in

Adult Rabbits. Ann Acad j�ed

Singa po re 3 9:599-606. 1 0.

Vats A, Tolley NS, Buttery OK. Polak JM. 2004. The Stem Cells in Orthopaedic Surgery. The .Jouma/ of Bone and Joint Su rge ry (BR) 868(2): 159-164.


1 50

Appendix

Fusion Scoring System Table of Fusion Scoring System Variable

Result

Score

Result

Score

Result

Score

Result

Score

Rigid

30

more rigid

45

very rigid

135

Manual palpation

Vert Tl2

not rigid

... .)

PLTID

Lession Tl2

3

N

5

>N

10

>> N

20

LTPLP

Lession Tl2

3

N

5

>N

10

>> N

20

LTSLD

Lession TJ2

3

N

5

>N

10

>> N

20

LKAP

Vert Tl2

3

N

5

>N

10

>> N

20

LKL

Vert

3

N

5

>N

10

>> N

20

Tl2

Total

235

< N is the value below the mm1mum value of the pos1t1ve control; N is of minimum value to the maximum value of the pos1t1ve control; N > is above the maximum value of the positive control; >> N is the value of being away fi·om the maximum value ofthe positive control (more than twice the maximum value); Score of less than 94 means that inhibited fusion; scores 94 sd 1 4 1 means fusion within normal limits; score above 1 4 1 means achieved better fusion.


1627 UMU. Lampiran 4. 1 Draft Publikasi I

Recommend Documents