!HU000004101T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 101
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 700319 (22) A bejelentés napja: 2004. 01. 06. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040700319 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1581812 A2 2004. 07. 22. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1581812 B1 2008. 07. 16.
(51) Int. Cl.: G01N 33/574 (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04061423 PCT/US 04/000035
(30) Elsõbbségi adatok: 20030438000P 2003. 01. 06.
(73) Jogosult: Wyeth, Madison, New Jersey 07940 (US)
US
(72) Feltalálók: MARTINEZ, Robert, Vincent, Roslindale, MA 02131 (US); BROWN, Eugene, Newton Highlands, MA 02461 (US); LIU, Wei, Sudbury, MA 01776 (US) (54)
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Készítmények és eljárások vastagbélrák diagnózisára és kezelésére
(57) Kivonat
HU 004 101 T2
Készítmények, berendezés és eljárások vastagbélrák elõrejelzésére, diagnózisára, megelõzésére vagy kezelésére. A vastagbélrákszövetekben a betegségmentes szövetekhez képest differenciálisan expresszálódó vastagbélrákgéneket azonosítottunk. Ezen gének pél-
dáit mutatjuk be az 1–5. táblázatokban. A találmány szerint vastagbélrákgének és az általuk kódolt fehérjék alkalmazhatóak markerként, profilaktikus vagy terapeutikus anyagként vastagbélrák detektálására vagy kezelésére.
A leírás terjedelme 8 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 101 T2
A találmány tárgya általánosan vastagbélrák diagnózisa. A találmány tárgyát képezik különösen vastagbélrákgének, amelyek differenciáltan expresszálódnak vastagbélrákszövetekben a betegségmentes szövetekhez képest. Ezek a gének alkalmazhatóak vastagbélrák elõrejelzésére vagy diagnózisára. A találmány háttere A rák egy jelentõs egészségprobléma az egész világon. Habár sokat fejlõdött a rák detektálása és kezelése, de nincs oltóanyag vagy egyéb univerzálisan sikeres eljárás a megelõzésre vagy a kezelésre, amely jelenleg elérhetõ lenne. A jelenlegi terápiák, amelyek általánosan kemoterápia vagy sebészet és sugárkezelés kombinációján alapulnak, számos páciens esetében nem megfelelõnek bizonyulnak. A vastagbélrák a második leggyakrabban diagnosztizált malignancia az Amerikai Egyesült Államokban, valamint a második leggyakoribb rákos halálok. Becslések szerint 135400 új vastagbélrák esetet diagnosztizáltak 2001-ben, becslések szerint 56700 elhalálozással. Az ötéves túlélési arány azon páciensek esetében, akiknél a vastagbélrákot a korai lokalizált fázisban detektálták 92%; sajnos a vastagbélrákoknak csupán 37%¹a kerül diagnosztizálásra ebben a fázisban. A túlélési arány 64%¹ra esik, ha a rákot engedik elterjedni a környezõ szervekbe vagy nyirokcsomókba, és 7%¹ra azon páciensek esetében, akiknél távoli metasztázisok vannak. A vastagbélrák prognózisa közvetlen kapcsolatban áll a tumor penetrációjával a bélfalon keresztül és a nyirokcsomó-érintettség meglétével vagy hiányával; emiatt különösen fontos a korai detektálás és kezelés. A vastagbélrák jellemzõen a vastagbél-epitéliumból ered és nem extenzíven vaszkularizált (és emiatt nem invazív) a fejlõdésének korai szakaszaiban. A nagyon vaszkularizált, invazív és végül metasztatikus rákká történõ átalakulás gyakran tíz évig vagy tovább tart. Korai detektálással vagy diagnózissal a vastagbélrák hatásosan kezelhetõ például a rákos vagy a rákos stádiumot megelõzõ szövet sebészeti eltávolítással. Azonban a vastagbélrákot gyakran csak a klinikai tünetek megjelenésekor detektálják, mint amilyen tünet a fájdalom és a fekete kátrányos széklet. Általánosan az ilyen tünetek csak akkor vannak jelen, ha a betegség már elõrehaladott, és csak a metasztázis megtörténte után. A vastagbélrák korai detektálása ezért fontos a morbiditásának szignifikáns csökkentéséhez. Jelenleg a legjobb eszköz a vastagbélrák megelõzésére a preneopláziás sérülések korai detektálása a bélben különbözõ invazív és nem invazív szkrínelõeljárásokkal. A legtöbb vastagbélrák szûrési eljárás invazív. Az invazív szûrési eljárások, mint amilyen az endoszkópos vizsgálat, közvetlen vizuális vizsgálatot, eltávolítást és a potenciálisan rákos szövet biopsziáját teszi lehetõvé. Azonban az invazív rákszûrési eljárások gyakran drágák, inherens kockázattal bírnak, és súlyos orvosi komplikációkat eredményezhetnek. Az invazív szûrési eljárások gyakran eredményeznek a pácienseknek je-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
lentõs kellemetlenséget. A jellemzõ invazív szûrési eljárásokhoz kapcsolódó kellemetlen érzés csökkenti a betegek együttmûködését a rutinszerû szûrési eljárásokkal. Például a flexibilis szigmoidoszkópia egy invazív eljárás a vastagbélrák diagnózisára, amely lehetõvé teszi az összes vastagbélrák 55%-nak a detektálását és becslések szerint a szenzitivitása 85% közel 100%¹os specifikusság mellett. Azonban az eljárás komplikációs aránya 10 000 szûrt személy esetén körülbelül 4,5. Továbbá alacsony a páciensek együttmûködése az orvosi ajánlásokkal, hogy alávessék magukat a szigmoidoszkópiának, beszámolók szerint 30–75%, a kellemetlen érzés következtében és az ezen eljáráshoz társított átélt szégyenérzet következtében. A nem invazív vastagbélrák-szûrési eljárások közé tartozik minták vizsgálata olyan anyagok jelenlétére, amelyek jelzik a rákot vagy a rákot megelõzõ állapotot. Az eddigi nem invazív vastagbélrák-szûrési eljárások a rák extracelluláris jeleire fókuszálnak, mint amilyen a fekáliában lévõ alvadt vér vagy a karcinoembrionikus antigén megemelkedett szintje, amelyek mindegyike a vastagbélrák jelenlétét sugallja. Azonban az ilyen extracelluláris jelek jellemzõen csak azt követõen fordulnak elõ, ha a rák már invazívvá vált, és ezért nehezebb kezelni. Ennek eredményeként számos nem invazív szûrési eljárás értéke korlátozott a rák korai diagnózisában. Például a fekáliában lévõ alvadt vér vizsgálata („fecal occult blood testing”, FOBT) egy nem invazív szûrési eljárás a vastagbélrák vizsgálatára, amelynek nagyon változó 28%–93% a pontossága az alany hidratációs állapotától függõen, a specifikussága pedig 96%. Egy vizsgálat azt becsüli azonban, hogy az összes vastagbélrák 50–60%¹át nem veszik észre, ha az FOBT az egyetlen alkalmazott szûrési eljárás (Allison és mtsai., Ann. Intern. Med., 112:328–333, 1990). A molekuláris biológiában nemrégiben bekövetkezett fejlõdés nagyon hatásos az onkogenezisre indikatív DNS-mutációk detektálására. A p53 tumorszuppresszornál bekövetkezõ mutációkról vagy heterozigotikusság elvesztésérõl kimutatták, hogy korrelál különbözõ ráktípusokkal. Az APC és a DCC tumorszuppresszor gének elvesztését vagy egyéb mutációját szintén kapcsolatba hozták a tumorfejlõdéssel. Javasolták már, hogy specifikus mutációk alapjai lehetnek bizonyos ráktípusok korai állapotainak molekuláris szkrínelési eljárásainak. Ennek megfelelõen kifejlesztettek olyan nem invazív szûrési eljárásokat, amelyek nagyon érzékenyek és nagyon specifikusak DNS-mutációk egy csoportja jelenlétének detektálására, amelyek indikatívak a rákra. Például ilyen mutációk jelenléte detektálható székletmintákban található DNS-ben a vastagbélrák különbözõ szakaszai során. A kezelési eljárásokat a rák típusa és elõrehaladottsága határozza meg, és tartalmazzák a sebészeti beavatkozást, radioterápiát vagy kemoterápiát. A sebészeti beavatkozást (a leggyakoribb formája a terápiának) követõ újra megjelenés egy nagy probléma és gyakran az elhalálozás végsõ oka. A jelenlegi eljárások a vastagbélrák elõrejelzésére, detektálására és kezelé-
1
HU 004 101 T2
sére nem nyújtanak kielégítõ eredményeket a betegséghez kapcsolt morbiditás csökkentésében. A WO 2004/005457 számú nemzetközi közzétételi irat a GPR47 erõs expresszióját ismerteti vastagbélráksejtekben. A találmány összefoglalása A találmány tárgya eljárás vastagbélrák detektálására, amely tartalmazza a következõ lépéseket: a GPR49 polipeptidszintjének vagy a GPR49 gén expressziós profiljának meghatározása alany biológiai mintájában; ahol a biológiai minta vastagbélszövetminta és a kontrollszint a polipeptid átlagos szintje a betegségmentes alanyok kontrollmintáiban; és ahol a GPR49 differenciális expressziója kerül alkalmazásra a vastagbélrák jelenlétének indikációjára. Egy megvalósítási mód szerint a vastagbélrákgének differenciáltan expresszáltak nemcsak a vastagbélrákszövetek között és a betegségmentes vastagbélszövet között, hanem a vastagbélrákszövetek és egy vagy több további betegségmentes szövet között is. Ezen további betegségmentes szövetek közé tartozik nem korlátozó módon a méhnyak, vese, bal pitvar, bal kamra, jobb pitvar, jobb kamra, tüdõ, petefészek, prosztata, végbél, bõr és gyomor. A differenciális expresszió lehet megemelkedett („over”) expresszió vagy lecsökkent („under”) expresszió. Egy további megvalósítási mód szerint a vastagbélrákgének expressziója megemelkedett a vastagbélrákszövetekben a betegségmentes vastagbélszövetekhez képest. Ezen gének átlagos expressziós szintje a vastagbélrákszövetekben lehet például legalább 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20¹szoros, vagy többszörös a betegségmentes vastagbél-szövetekbelihez képest. Számos esetben a kiválasztott vastagbélrákgének mindegyikére a differenciális expresszió p értéke nem több, mint 0,1, 0,05, 0,001, 0,0005, 0,0001, vagy kevesebb. A találmány alkalmas vastagbélrák diagnózisára vagy megfigyelésére adott alanyban. Az eljárás tartalmazza a GPR49 polipeptidszintjének vagy a GPR49 gén expressziós profiljának meghatározását és a detektált szinteknek kontrollszintekkel történõ összehasonlítását. A biológiai minta vastagbélszövet-minta. A kontrollszintek a GPR49 polipeptid átlagos szintjei vagy a GPR49 gén expressziós profilja betegségmentes alanyok kontrollmintáiban. Egy további megvalósítási mód szerint a biológiai minta és a kontrollminták ugyanazon eljárás alkalmazásával vannak elõállítva. Egy még további megvalósítási mód szerint a GPR49 polipeptidszintjei vagy a GPR49 gén expressziós szintje a polipeptidre specifikus antitestekkel van meghatározva. Az adott alanynak van vagy nincs vastagbélrákja. Egy megvalósítási mód szerint az alanynak vastagbélrákja van és a rák terápiás kezelésének az alanya. Egy további megvalósítási mód szerint az alany ember, kutya vagy egyéb emlõs. A találmány alkalmas adott alanyban a vastagbélrák diagnózisára vagy megfigyelésére. Az eljárások tartalmazzák egy vagy több rákgén expressziós profiljának a meghatározását alany biológiai mintájában és
5
2
az expressziós profilok kontroll expressziós profilokkal történõ összehasonlítását. Az expressziós profil és a kontroll expressziós profil meghatározható az egy vagy több vastagbélrákgén által kódolt polipeptidek vagy polinukleotidok szintjeinek a mérésével. Egy megvalósítási mód szerint a kontroll expressziós profil az egy vagy több vastagbélrákgén átlagos expressziós profilja a betegségmentes alanyok kontroll mintáiban.
Az ábrák rövid ismertetése A bejelentés szerinti találmányok jobban érthetõek a következõ ábrákkal. Az ábrák jellemzésre szolgálnak, nem korlátozásra. Az 1. ábra mutatja a 84. azonosító számú (SEQ ID NO: 84) aminosavszekvenciából álló po15 lipeptid hidrofobicitási profilját. 10
A találmány részletes ismertetése A találmány különbözõ szempontjait ismertetjük 20 részletesebben a következõ részekben. Ebben a bejelentésben a „vagy” jelentése „és/vagy”, hacsak ezt máshogy nem jelöltük.
25
30
35
40
45
50
55
60 3
Vastagbélrákgének („Colon Cancer Genes”, CCGs) A találmány tárgyát képezik eljárások vastagbélrákgének (CCGs) alkalmazása vastagbélrák elõrejelzésére vagy diagnosztizálására. A vastagbélrákgén olyan gén, amely különbözõ módon van expresszálva vastagbélráksejtekben a betegségmentes vastagbélsejtekhez képest. Különösen a találmány tárgya eljárás vastagbélrák detektálására, amely eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: GPR49 polipeptidszintjének vagy a GPR49 gén expressziós profiljának a detektálása alany biológiai mintájában; és a szint összehasonlítása a GPR49 polipeptid kontrollszintjével vagy kontroll expressziós profiljával; ahol a biológiai minta vastagbélszövet minta és a kontrollszint a polipeptid betegségmentes alanyok kontrollmintáiban lévõ átlagos szintje; és ahol a GPR49 gén differenciális expressziója van alkalmazva a vastagbélrák jelenlétének kimutatására. Egy további megvalósítási mód szerint az alany vastagbélrák terápiás kezelésének volt kitéve. Egy megvalósítási mód szerint a vastagbélrákgén nemcsak a vastagbélrákszövetek és a betegség mentes szövetek között van különbözõ módon expresszálva, hanem a vastagbélrákszövetek és egy vagy több további betegségmentes szövet között is. Ezen további szövetek közé tartozik a méhnyak, vese, bal pitvar, bal kamra, jobb pitvar, jobb kamra, tüdõ, petefészek, prosztata, végbél, bõr és gyomor. Számos esetben a kiválasztott vastagbélrákgének mindegyikére a differenciális expresszió p értéke nem több, mint 0,1, 0,05, 0,001, 0,0005, 0,0001, vagy kevesebb. Egy további megvalósítási mód szerint a vastagbélrákgének expressziója megemelkedett a vastagbélrákszövetekben az egy vagy több betegségmentes szövetekhez képest. Bizonyos esetekben a vastagbélrákgén átlagos expressziós szintje a vastagbélráksejtekben lehet például legalább 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20¹szoros,
1
HU 004 101 T2
vagy többszörös a betegségmentes szövetekbelihez képest. A GPR49 legalább kétszeresen overexpresszált vastagbélráksejtekben a betegségmentes vastagbélsejtekhez képest. A találmány megvalósítása során alkalmazott GPR49 polipeptidreceptor, amelyet az 1. táblázatban jellemzünk. 1. táblázat III. csoport gének: Receptorok Gén jelölés
Lókusz kapcsolat
Nukleinsavszekvencia
Aminosavszekvencia
GPR49
8549
SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:84
A GPR49 (G¹fehérjekapcsolt 49¹es receptor, „G protein-coupled receptor 49”) egy árva G¹fehérjekapcsolt receptor ismeretlen liganddal. A GPR49 gén expressziójáról beszámoltak az agyban, vázizomban, placentában és a gerincvelõben. A GPR49 hidrofobicitási profilját mutatjuk be az 1. ábrán. A CCG¹k és a CCG termékek, mint vastagbélrák markerek A CCG¹k, az õket kódoló polinukleotidok (CCPN¹ek), és polipeptidek (CCPP¹k) alkalmazhatóak vastagbélrák markereként. A találmány szerinti CCG a GPR47. A CCGs¹ek expressziós szintjei korrelálnak a vastagbélrák jelenlétével. Bizonyos megvalósítási módok esetén a találmány gyakorlatba vehetõ a CCPN¹ek vagy CCPP¹k detektálásával a szakterületen ismert bármely megfelelõ módszer alkalmazásával. Egy további szempont szerint a CCG¹k expressziós szintje meg van határozva egy adott alany biológiai mintájában, amely alanyra az 1. igénypont szerinti diagnózis, vagy elõrejelzés információt szeretnénk kapni. Az egy vagy több CCG¹k expressziós profilja alkalmazható ujjlenyomatként a sejt betegségi állapotának a jellemzésére. Néhány esetben a relatív expressziós szint a vastagbélrák súlyosságát jelöli és ily módon alkalmazható diagnosztikus vagy elõrejelzõ vizsgálatokban. Továbbá a CCG¹ke relatív expressziós profiljainak következõ idõpontokban vett szövetmintákban, pl. terápia elõtt és után vagy egy terápia során különbözõ idõpontokban vagy a vastagbélrák kifejlõdése során, összehasonlításával információt nyerhetünk arról, hogy melyik gén fontos ezen szakaszok mindegyikében. Egy példa szerint a tumorprogresszió különbözõ szakaszaiban a CCG¹k expressziós profiljainak az összehasonlítása eljárást ad a hosszú távú prognózisra, ideértve a túlélést is. Egy másik példa szerint egy adott kezelési rend értékelhetõ a CCG expressziós profilok alapján, amely tartalmazza, hogy egy adott gyógyszer egy adott páciensben hat e javító módon a hosszú távú prognózisra. Az egyedi vagy panel CCG¹k különbözõ expressziós profiljainak a felismerése lehetõvé teszi az expressziós mintázatot moduláló tesztvegyületek szkrínelését. Például a szkrínelés elvégezhetõ olyan vegyületekre, amelyek az expressziós profilt átalakítják egy
2
rossz prognózisról egy jobb prognózisra. Ez elvégezhetõ bipochipek elõállításával, amelyek tartalmazzák a jelentõs CCG¹k készleteit, amely ezt követõen alkalmazható ezekben a szkrínelésekben. Ezek az eljárá5 sok elvégezhetõek e fehérje szintjén is. A CCG¹k fehérjeexpressziós szintjei meghatározhatóak diagnosztikai és elõrehaladottsági célból vagy alkalmazható tesztvegyületek szkrínelésére. Például jelentõs CCG¹k tartalmazhatnak olyan CCG-ket, amelyekrõl meg van 10 határozva, hogy az aktivitásuk vagy az expressziójuk modulált egy terápiás rendre válaszul. Adott esetben egy CCG aktivitásának vagy expressziójának a modulálása korreláltatható a vastagbélrák diagnosztizálásával vagy elõrehaladottságával. 15 A CCG termékek forrása A CCG¹k által kódolt polipeptidek és polinukleotidok (pl., rendre CCPN¹ek és CCPP¹k) izolálhatóak bármilyen megfelelõ szövetbõl vagy vizsgált alany sejtjébõl. 20 A találmány biológiai példája a vastagbélszövet. Továbbá CCPN¹ek vagy CCPP¹k elõállíthatóak korlátozás nélkül a következõ eljárások alkalmazásával: nukleinsavamplifikáció, CCG-ket kódoló rekombináns vektorok, kémiai szintézis vagy további eljárások, ahogy 25 ezt a területen jártas szakemberek tudják.
30
35
40
45
50
55
60 4
Detektálási eljárások Ahogy korábban tárgyaltuk a CCG¹k expressziós szintje alkalmazható a vastagbélrák markereként. A találmány szerinti CCG termékek (polinukleotid vagy polipeptid) relatív mennyiségének detektálása és mérése bármilyen a szakterületen ismert eljárással elvégezhetõ. Az átírt polinukleotid detektálására szolgáló jellemzõ eljárások közé tartozik a sejtbõl vagy szövetmintából történõ RNS-extrakciót követõ jelzett próba hibridizáció (pl., komplementer polinukleotidmolekula), amely próbaspecifikus a cél RNS¹re az extrahált RNS¹re és a próba detektálása (pl., Northern-blotolás). A peptid detektálásra szolgáló jellemzõ eljárások közé tartozik a sejtbõl vagy szövetmintából történõ fehérje extrakciót követõen a fehérjemintában lévõ célfehérjéhez specifikus antitest kötõdése és az antitest detektálása. Antitestek detektálhatóak jelölt másodlagos antitesttel. A jelölés lehet radioizotóp, fluoreszcens vegyület, enzim, enzim kofaktora vagy ligand. Az ilyen eljárások jól ismertek a szakterületen. Egyes megvalósítási módokban a CCG¹k saját maguk szolgálhatnak vastagbélrák markerként. Például a CCG genomi kópiáinak a száma, mint a génduplikáció, szintén korreláltatható a vastagbélrákkal. Specifikus polinukleotid molekulák detektálása elvégezhetõ gélelektroforézissel, oszlopkromatográfiával, vagy közvetlen szekvenálással, kvantitatív PCR-rel (polinukleotidmolekulák esetében), RT¹PCR-rel, vagy fészkelt PCR-rel a szakember számára ismert számos további eljárás közül. A találmány szerinti CCG összes kópiájának vagy csak közülük néhánynak a detektálása elvégezhetõ a szakterületen ismert bármilyen eljárással. Jellemzõen elõnyös a DNS vagy a cDNS mennyiségének a meg-
1
HU 004 101 T2
határozása Southern-vizsgálattal, amelyben egy sejtvagy szövetmintából az összes DNS¹t extraháljuk, hibridizáljuk jelölt próbával (pl. komplementer DNS-molekulával), és a próba detektálva van. A jelölõcsoport lehet radioizotóp, fluoreszcens vegyület, enzim vagy enzim kofaktor. További alkalmas DNS-detektálási és mennyiségi meghatározási módszerek közé tartozik a gélelektroforézis, az oszlopkromatográfia, és a kvantitatív PCR, ahogy ez szakember számára ismert. Bizonyos megvalósítási módokban a CCPP¹k szolgálhatnak a vastagbélrák markereként. A specifikus polipeptidmolekulák detektálása történhet gélelektroforézissel, Western-blotolással, oszlopkromatográfiával, vagy közvetlen szekvenálással, a számos további szakember által jól ismert eljárás mellett. A vastagbélrák súlyosságának megállapítása A diagnosztikai vizsgálatok területén a találmány alkalmas vastagbélrák súlyosságának meghatározására alanyból minta izolálása révén (pl. vastagbél biopsziával), a találmány szerinti CCG-nek a mintában lévõ mennyiségének vagy aktivitásának detektálásával és összehasonlításával egy második normál mintából vagy kontrollmintából származó mintáéval. Egy megvalósítási mód szerint a két mintában a CCG¹k expressziója van összehasonlítva, és az egy vagy több CCG modulációja a teszt mintában vastagbélrákot indikál. Másik megvalósítási módok esetén 2, 3, 4 vagy több CCG modulációja súlyos vastagbélrákot indikál. Egy példa vegyület a CCPP detektálására egy a CCPP-hez kötõdni képes antitest. Egy példában az antitest konjugálva van detektálható jelöléssel. Az antitestek lehetnek poliklonálisak vagy monoklonálisak. Egy intakt antitest vagy egy fragmense (pl. Fab vagy F(ab’)2) alkalmazható. A „jelölt” kifejezés a próba vagy az antitest tekintetében szándékaink szerint magában foglalja a próba vagy antitest közvetlen jelölését a próbának vagy antitestnek egy detektálható anyaghoz történõ közvetlen kapcsolásával (azaz fizikai kapcsolódással), valamint próba vagy antitest indirekt jelölését egy közvetlenül jelölt reagenssel történõ reagáltatással. Az indirekt jelölés példái közé tartozik az elsõdleges antitest detektálása fluoreszcensen jelölt másodlagos antitesttel és a DNS-próba vég jelölése biotinnal, hogy detektálható legyen fluoreszcensen jelölt streptavidinnel. Tehát a találmány szerinti detektálási eljárás alkalmazható CCG mRNS, fehérje vagy genomikus DNS detektálására biológiai mintában in vitro, valamint in vivo. Például a CCG mRNS detektálására szolgáló in vitro technikák közé tartozik a Northern-hibridizáció és az in situ hibridizáció. A CCPP detektálására szolgáló in vitro technikák közé tartozik az enzimkapcsoltimmunoszorbens vizsgálat („enzyme linked immunosorbent assays”, ELISA), Western-blot, immunoprecipitáció és immunofluoreszcencia. A CCG genomikus DNS detektálására szolgáló in vitro technikák közé tartozik a Southern-hibridizáció. Továbbá, a CCPP detektálására szolgáló in vivo technikák közé tartozik alanyba jelölt anti-CCPP antitest bevitele. Például az antitest lehet radioaktívan jelölt marker, amelynek a jelenléte
2
és lokalizációja egy páciensben detektálható standard képalkotó technikákkal. Egy megvalósítási módban a biológiai minta a vizsgált alanyból származó fehérjemolekulákat tartalmaz. 5 Adott esetben a biológiai minta tartalmazhat a vizsgált alanyból mRNS-molekulákat vagy genomikus DNSmolekulákat. Egy másik megvalósítási mód szerint az eljárások tartalmazzák továbbá alanytól kontroll biológiai minta 10 levételét, a kontrollminta érintkeztetését CCG fehérje, mRNS, vagy genomikus DNS detektálására képes anyaggal, hogy ezáltal a CCG fehérje, mRNS, vagy genomikus DNS detektálható legyen a biológiai mintában és a kontrollmintában jelen lévõ CCG fehérje, mRNS, 15 vagy genomikus DNS összehasonlítása a vizsgált mintában lévõ CCG fehérjével, mRNS-sel, vagy genomikus DNS-sel Értelemszerûen a fent ismertetett megvalósítási módok és az alábbi példák csak illusztrációs célt szol20 gálnak és nem korlátozóak. Példák
25
30
35
40
45
50
55
1. példa: vastagbélrákgének azonosítása Kutatást végeztünk olyan gének azonosítására, amelyek egyedileg overexpresszáltak vastagbél adenokarcinóma szövetben a közeli normál szövetekhez képest a GeneExpress Oncology DataSuite™ alkalmazásával és a GX2000 analitikai program változás mérték (fold change) vizsgálati funkciójával (Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD). A GeneExpress Oncology DataSuite™ egy interaktív információs rendszer, amely humán rákgénekrõl szolgáltat globális génexpressziós profilokat. A GeneExpress rendszer rákos és normális szövetminták gyûjteményén, nagy sûrûségû mikromátrix („microarray”) alkalmazásával globális génexpressziós adatok létrehozásán, és az eredmények elemzésén alapul, amelyet számos szofisztikáit szoftvereszköz, mint amilyen a GX2000, alkalmazásával végzünk. A normális szövetek közé tartozik a humán vastagbél, méhnyak, vese, bal pitvar, bal kamra, jobb pitvar, jobb kamra, tüdõ, petefészek, prosztata, végbél, bõr és gyomor. Kezdetben összesen 495 gént találtunk, amelynek kétszeres differenciális expressziója volt a normális és a rákos szövet között. Kontraszt analízist végeztünk ezt követõen ezen a 495 génen azon gének azonosítására, amelyeknek a p¹értéke 0,05 vagy ennél kisebb volt. A kontraszt analízis 429 gént adott. Ezen 429 gén enorthems alkalmazásával végzett vizuális megfigyelésével 63¹at azonosítottunk, mint amelyek egyedileg overexpresszáltak vastagbélrákszövetben a fent ismertetett normál szövetek paneljéhez képest. Ezt a 63 gént neveztük el vastagbélrákgénnek („colon cancer genes” CCG¹k). Ezek közül egyet a GPR47¹et mutatjuk be a 9. táblázatban.
2. példa: Hidorofobicitási vizsgálat A CCG¹k által kódolt polipeptidek hidrofobicitási 60 profiljait állítottuk elõ a TopPred II program alkalmazá5
1
HU 004 101 T2
sával (Claros és mtsai., TopPred II: An Improved Software For Membráné Protein Structure Predictions., CABIOS, 10, 685–686, 1994) a Pasteur Institute (Paris, Franciaország) nevû intézetben fenntartott Bioweb helyen. A hidrofobicitási profilt bemutatjuk mind KD¹skálával (Kyte és Doolittle) mind GES-skálával (Goldman, Engelman és Steitz). Röviden, a KD¹skála egy hidropátia skála, amely hozzá van kapcsolva minden egyes aminosav hidropátia értékéhez. Mozgó ablak megközelítés van alkalmazva, amelyben a hidrofobicitási skála a natív szekvencia néhány szomszédos aminosavára össze van adva a membránrégiók azonosítására. Egy T küszöbérték van definiálva egy szegmens „membrán hélix”ként történõ megjelölésére. Amennyiben a hidrofobicitás meghaladja ezt a T értéket, akkor a szegmens valószínûleg membrán hélix. A GES-skálát is alkalmazzák a nem poláris kettõsréteget átszelõ hélixek azonosítására. A görbe egy 20 aminosavas ablak átlagos aminosavspecifikus hidrofobicitási skáláját mutatja. Amennyiben a vonal a keret felsõ felében van (pozitív), akkor ez hidrofób régiót
5
2
jelez, és amennyiben az alsó félben van (negatív), akkor hidrofil régiót jelez. Egy jellemzõ hidrofobicitási profilban az X tengelyen a fehérje hosszúsága van aminosavakban (as), míg az Y tengely a KD¹ vagy GES-értékeket mutatja. A görbe vonal mutatja a teljes fehérje KD vagy GES mintázatát, míg az egyenes vonal mutatja a vélt levágásokat a potenciális membránt átszelõ doménekre.
10 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás vastagbélrák detektálására, amely tartalmazza a következõ lépéseket: GPR49 polipeptid vagy 15 polinukleotid szintjének mérésével a GPR49 gén expressziós profiljának meghatározása alany vastagbélszövet mintájában, és a mért szint összehasonlítása egy kontrollszinttel, ahol a GPR49 differenciális expressziója van alkalmazva a vastagbélrák jelenlétének 20 indikációjára. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az alany vastagbélrák-kezelésnek volt kitéve.
6
HU 004 101 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
7
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
