Federaal Agentschap
Agence fédérale
voor de Veiligheid
pour la Sécurité de la
van de Voedselketen
Chaîne alimentaire
FLVVM
LFSAGx
I-MET MIC 036d-039
DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR Versie Datum van toepassing
04 2013-10-15
Version Date d’application
04 2013-10-15
Opgesteld door : Rédaction par :
R. Martens, QAM FLVVM; 2013-04-15
Nazicht door : Révision par :
A.Dubois, responsable qualité LFSAGx; 2013-10-01
Goedkeuring vrijgave door : Autorisation de publication par:
MC Wilem responsable de la section microbiologie LFSAGx ; 2013-10-02
Beheer & locatie geldende versie : Gestion et localisation de la version valide :
N:\QAM-EMAS-OHSAS\Microbiologie\I-MET
Bestemmelingen : Destinataires :
Sectie biologische analyses: microbiologie Section microbiologie
Trefwoorden : Mots clés
Detectie Salmonella spp, PCR Détection Salmonella spp, PCR
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DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR OVERZICHT WIJZIGINGEN – APERCU DES REVISIONS (*)
Herziening door/datum Révision par/date* 01/01/2008
Reden van herziening - Motif de la révision
Instruction originale rédigée par MC Wilem SV 2010/06/09 Wijziging van de productnamen, layout MCW Références documents 2010/11/01 EH 2011/10/11 Duidelijker schema + toevoegen opmerking TVDS Nieuwe layout MCW Nouveau mode d’élimination des déchets Modification réf. documents RM 2013/04/25 Aanpassen referenties documenten * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen.
Tekstdeel / draagwijdte van de herziening - Partie de texte / portée de la révision
4-5-8 13 Bijlage NL
7 13 13
* L’écart entre la date actuelle et la date de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.
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DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR INHOUDSTABEL - TABLE DES MATIÈRES 1
DOEL – OBJECTIF ............................................................................................................ 4
2
TOEPASSINGSGEBIED – DOMAINE D’APPLICATION ................................................. 4
3 WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN – DOCUMENTS LÉGAUX ET NORMATIFS ............................................................................................................................. 4 4
DEFINITIES EN AFKORTINGEN – DEFINITIONS ET ABREVIATIONS ......................... 4
5
PRINCIPE – PRINCIPE ..................................................................................................... 5
6
PRESTATIEKENMERKEN – INDICATEURS DE PRESTATION ..................................... 5
7 VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN – CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUES ......................................................................... 5 8
CULTUURMEDIA – MILIEUX DE CULTURE ................................................................... 6
9
TOESTELLEN – EQUIPEMENT ........................................................................................ 6
10 WERKWIJZE – MÉTHODE DE TRAVAIL ......................................................................... 6 11 KWALITEITSCONTROLE – CONTRÔLE QUALITÉ ........................................................ 6 12 BEREKENING EN RAPPORTERING – CALCUL ET RAPPORTAGE ............................ 6 12.1 12.2
BEREKENINGSWIJZE VAN DE RESULTATEN – CALCUL DES RÉSULTATS .................................... 6 UITDRUKKINGSWIJZE VAN DE RESULTATEN – EXPRESSION DES RÉSULTATS ............................ 7
13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURE, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN – RÉFÉRENCE AUX PROCÉDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES Y AFFÉRENTS ................................................. 7 13.1 13.2 13.3 13.4
PROCEDURES - PROCÉDURES ................................................................................................... 7 INSTRUCTIES - INSTRUCTIONS .................................................................................................. 7 FORMULIEREN - FORMULAIRES................................................................................................ 7 DOCUMENTEN - DOCUMENTS .................................................................................................. 7
14 BIJLAGEN – ANNEXES .................................................................................................... 7
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DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR 1
Doel – Objectif
Dit werkvoorschrift beschrijft een horizontale methode voor de detectie van Salmonella spp. met de PCR-methode.
2
Toepassingsgebied – Domaine d’application
De beschreven methode is van toepassing op : - Voedingswaren - Dierenvoeders - Swabs afkomstig van karkassen.
3
Cette instruction décrit une méthode pour la détection des Salmonella spp. selon la méthode PCR.
La méthode décrite est applicable aux : - Produits destinés à la consommation humaine. - Produits destinés à l’alimentation animale. - Prélèvements de carcasses par écouvillonnage.
Wettelijke en normatieve documenten – Documents légaux et normatifs
Detectie volgens het AFNOR gevalideerde iQ-Check Salmonella II protocol (BRD 07/06 – 07/04). De bevestiging is conform de ISO norm 6579 : 2002 “Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of Salmonella spp.”
4
Cette instruction est conforme au protocole validé AFNOR iQCheck Salmonella II (BRD 07/06 – 07/04). La confirmation est conforme à la norme ISO 6579 : 2002 “Microbiologie des aliments - Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp. “.
Definities en afkortingen – Définitions et abréviations
Salmonella spp. : Micro-organismen die typische of minder typische kolonies vormen op selectieve vaste media en de beschreven biochemische en serologische karakteristieken bezitten bij het uitvoeren van dit werkvoorschrift.
Salmonella spp.: Micro-organismes formant des colonies typiques ou moins typiques sur des milieux sélectifs solides et possédant les caractéristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque l’essai est effectué conformément à cette instruction.
Detectie van Salmonella spp. : Bepaling van de aan- of afwezigheid van Salmonella spp. in een welbepaalde hoeveelheid monster bij het uitvoeren van dit werkvoorschrift.
Recherche de Salmonella spp. : Détermination de la présence ou de l’absence de Salmonella spp., dans une quantité déterminée de produit, lorsque l’essai est exécuté conformément à cette instruction.
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DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR PCR: Polymerase Chain Reaction RVS: Rappaport Vassiliadis broth met soja MKTTn: Muller-Kauffman tetrathionate/novobiocin broth XLD: Xylose Lysine Deoxycholaat BPW : gebufferd peptoonwater
5
PCR: Polymerase Chain Reaction. RVS: Rappaport Vassiliadis avec soja. MKTTn: Muller-Kauffman au tetrathionate-novobiocine. XLD: Xylose Lysine Deoxycholate. EPT : Eau peptonée tamponnée.
Principe – Principe
De detectie van Salmonella spp. bestaat uit de volgende stappen: - Vooraanrijking in BPW - DNA extractie - Uitvoeren van PCR - Bevestiging van positieve stalen: - Aanrijking in MKTTn en RVS - Isolatie op de selectieve media XLD en Brilliance Salmonella - Bevestiging van verdachte kolonies via biochemische en serologische testen.
6
Prestatiekenmerken – Indicateurs de prestation
Detectielimiet: 10 cfu/25g (of ml). Voor details omtrent de berekeningen van de prestatiekenmerken: zie validatiedossier.
7
La recherche de Salmonella spp. nécessite les étapes suivantes : - Pré-enrichissement dans de l’eau peptonée tamponnée. - Extraction de l’ADN. - Réalisation de la PCR. - Confirmation des résultats positifs: - Enrichissement dans les milieux MKTTn et RVS. - Isolement sur milieux sélectifs XLD et Brilliance Salmonella. - Confirmation des colonies suspectes par tests biochimiques et sérologiques.
Limite de détection : 5 ufc/25g (ou ml). Pour les détails, voir le dossier de validation.
Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen – Consignes de sécurité et mesures spécifiques
Al het gebruikte materiaal en geënte media moeten verzameld worden in de gele containers voor selectieve ophaling. Werk steeds onder de laminaire flow.
Tout le matériel ayant servi à la manipulation, les cultures positives et les échantillons positifs placés dans les containers jaunes pour collecte sélective.
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DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR 8 -
-
Cultuurmedia – Milieux de culture
BPW IQ CHECK Salmonella II kit RVS MKTTn XLD Brilliance Salmonella Nutriënt-agar Salmonella Latex testkit Salmonella Omni –O API 20E API 20E reagentia API suspensiemedium 5 ml
-
9 Algemene apparatuur van het labo. Thermocycler.
Eau peptonée tamponnée. Kit iQ Check Salmonella II. Bouillon RVS. Bouillon MKTTn. Gélose XLD. Gélose Brilliance Salmonella. Nutrient Agar. Test d’agglutination. E Galeries api 20 . E Réactifs API 20 .
Toestellen – Equipement Matériel courant de laboratoire. Thermocycler.
10 Werkwijze – Méthode de travail Zie bijlage schema.
Voir le schéma en annexe.
11 Kwaliteitscontrole – Contrôle qualité Zie LAB 24 P 005 Kwaliteitscontrole.
Voir instruction « Contrôles qualité internes».
12 Berekening en rapportering – Calcul et rapportage Niet van toepassing.
12.1 Berekeningswijze van de resultaten – Calcul des résultats Pas d’application.
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DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR 12.2 Uitdrukkingswijze van de resultaten – Expression des résultats Volgens de interpretatie van de resultaten, noteer de aan- of Selon l’interprétation des résultats, indiquer la présence ou 2 afwezigheid van Salmonella spp. in x g of ml of op x cm monster. l’absence de Salmonella spp. dans une prise d’essai de x g ou Noteer in geval van een positief resultaat het resultaat van de ml ou sur x cm² de produit. En cas de présence, indiquer le résultat du sérotypage. serotypering.
13 Verwijzing naar bijhorende procedure, instructies, documenten, formulieren of lijsten – Référence aux procédures, instructions, documents, formulaires ou listes y afférents 13.1
Procedures - Procédures
- LAB 24 P 005 Kwaliteitscontrole 13.2 Instructies - Instructions - LAB 24 P 007 Algemene handleiding Microbiologie - « Préparation des échantillons, de la suspension mère et - LAB 24 P 007 I 002 Voorbereiding van monsters en aanmaken des dilutions décimales suivantes en vue de l’examen van verdunningen voor microbiologisch onderzoek microbiologique » (LAB-21-I-MIC-001). - « Contrôles qualité internes» (LAB-21-I-QUAL-001-CQI). 13.3 Formulieren - Formulaires - LAB 24 I-MET 039 F 001 F 349 Werkblad (1) Detectie van - « Cahier des prélèvements » (LAB-21-F-MIC-001). Salmonella spp. (PCR methode) - « Recherche des Salmonelles suivant la méthode PCR » - LAB 24 I-MET 039 F 002 F 351 Werkblad PCR plaat (LAB-21-F-MIC-36d #1). (Salmonella spp.). - « Confirmation Salmonella PCR» (LAB-21-F-MIC-36d #2). - LAB 24 I-MET 039 F 350 Werkblad (2) Detectie van - « Confirmation de la présence de Salmonella spp. » (LABSalmonella spp. (PCR methode) 21-F-MIC-36-2). 13.4 Documenten - Documents Document : LAB-21-D-MIC-36d.
14 Bijlagen – Annexes Schema werkwijze.
Schéma du mode opératoire.
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DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR Bijlage : Schema werkwijze – Detectie van Salmonella spp. (PCR methode) Monstername x g of ml + 9x ml BPW * Incubatie 21±1h; 37±1ºC
100 µl + 100 µl lyse reagens Voorzie een blanco staal (100 µl steriel water) Vortex Incubeer 10 min bij 95-100 °C Vortex Centrifugeer 2’ bij 10000-12800 rpm ***
45 µl PCR mix per well ** + 5 µl supernatans Sluit de wells af Centrifugeer 1 min bij 4000 rpm Screening met PCR
0.1ml cultuur + 10ml RVS broth Incubatie 24±3h; 41.5±1ºC
XLD Incubatie 24±3h; 37±1ºC
Brilliance Salmonella Incubatie 24±3h; 37±1ºC
***
1ml cultuur + 10ml MKTTn broth Incubatie 24±3h; 37±1ºC
XLD Incubatie 24±3h; 37±1ºC
Brilliance Salmonella Incubatie 24±3h; 37±1ºC
**** Als API 20E en de agglutinatietest positief is
Nutriënt-agar Incubatie 24±2h; 37±1ºC
API 20E Incubatie 18±3h; 37±1ºC
Agglutinatietesten
Bepalen van het serotype en indien van toepassing faagtypering en bepaling van antibioticaresistentie bij het W.I.V. * Voor swabs : + 100ml BPW ** Voorbereiding PCR mix: reagens C (amplificatiemix) + reagens B (fluorescente probes). Aan te maken in functie van het aantal stalen en controles (1 positieve controle en 1 negatieve controle per reeks) *** Indien PCR positief **** 1 typische kolonie van één medium en als deze niet bevestigd wordt, 4 bijkomende kolonies bevestigen
Opmerking : Voor meer details in verband met de uitvoering zie LAB 24 P 007 Algemene handleiding microbiologie’
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DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR DÉTECTION DES SALMONELLA SPP. SUIVANT LA MÉTHODE PCR
Prise d’essai
Prise d’essai x g ou ml + 9x ml d’eau peptonée tamponnée * Incubation 21±1h; 37±1°C
Extraction de l’ADN
Annexe : Schéma d’analyse – Détection des Salmonella spp. (méthode PCR)
100 µl + 100 µl de réactif de lyse Prévoir un éch. blanco (100 µl d’eau stérile) Vortexer Incubation 10 min.à 95-100°C Vortexer Centrifuger 2’ à 10000-12000 rpm ***
***
Isolement
Enrichissement
PCR
45 µl de Mix PCR par puits ** + 5 µl du surnageant Sceller les puits Screening par PCR
0,1ml de culture + 10ml de bouillon RVS Incubation 24 ±3h; 41,5±1°C
XLD Incubation 24 ±3h; 37 ±1°C
Confirmation
Si galerie API 20E et tests d’agglutination positifs
Brilliance Salmonella Incubation 24 ±3h; 37 ±1°C
1ml de culture + 10ml de bouillon MKTTn Incubation 24 ±3h; 37±1°C
XLD Incubation 24 ±3h; 37 ±1°C
Brilliance Salmonella Incubation 24 ±3h; 37 ±1°C
****
Nutrient agar Incubation 24 ±2h; 37 ±1°C
Galerie API 20E Incubation 18 ±3h; 37 ±1°C
Tests d’agglutination
Détermination du sérotype et si d’application du phagetype et de l’antibiorésistance à l’ISP * Pour les swabs : + 100 ml d’eau peptonée tamponnée ** Préparation du Mix PCR : réactif C (solution d’amplification) + réactif B (sondes fluorescentes). À préparer en fonction du nombre d’échantillons à analyser et des contrôles à effectuer (1 contrôle positif et 1 contrôle négatif par série) *** Si PCR positive **** 1 colonie typique d’un des milieux et si celle-ci n’est pas confirmée, confirmation sur 4 colonies supplémentaires
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