i
APLIKASI REAL-TIME PCR UNTUK MENDETEKSI BAKTERI Salmonella sp. PADA HASIL PERIKANAN
PIPIT PRATAMA
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
ii
iii
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aplikasi Real-time PCR untuk Mendeteksi Bakteri Salmonella sp. pada Hasil Perikanan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Oktober 2015
Pipit Pratama NIM C34110019
*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait
iv
ABSTRAK PIPIT PRATAMA. Aplikasi Real-time PCR untuk Mendeteksi Bakteri Salmonella sp. pada Hasil Perikanan. Dibimbing oleh NURJANAH dan MALA NURILMALA. Salmonella termasuk ke dalam grup bakteri patogen yang menyebabkan foodborne ilness. Penyakit yang disebabkan oleh Salmonella diantara nya adalah gastrodermik, demam tipoid dan dapat menyebabkan kematian. Penelitian ini menggunakan sampel hasil perikanan segar dan olahan yang diperoleh dari pasar tradisional dan pasar modern di Bogor. Tujuan penelitian ini mengaplikasikan real- time PCR untuk mendeteksi bakteri Salmonella sp. pada hasil perikanan. Primer yang digunakan untuk mendeteksi gen target bakteri Salmonella sp.. memiliki panjang amplifikasi 204 bp. Hasil absorbansi dengan rasio 260/280 pada selang 1,6 dan 2,0. Sampel hasil perikanan yang berasal dari pasar tradisional dan pasar modern baik segar dan olahan tidak ditemukan produk yang terkontaminasi bakteri Salmonella, hal ini karena sampel tidak mencapai nilai Threshold Cycle (Ct), tidak mencapai nilai dari melting curve kontrol positif dan tidak menunjukan grafik yang sigmoid. Kata kunci : kontaminasi, produk perikanan, real-time PCR, Salmonella
ABSTRACT PIPIT PRATAMA. Application Real-Time PCR for Detection of Bacteria Salmonella sp. on Fisheries Product. Supervised by NURJANAH and MALA NURILMALA. Salmonella is classified in to bacteria group causing foodborne illness. In addition, Salmonella is the bacteria pathogen group causing gastrodermik, tipoid fever, which can lead to the death. The samples of fishery products were obtained from traditional and modern markets in Bogor. The purpose of this study was using real- time PCR to detect the Salmonella sp. on the fishery products. The primers to detect gene target of Salmonella sp. in fisheries products with 204 bp. The samples had absorbansi of 260/280 between 1,6 and 2,0. The result showed fishery products samples did not contain Salmonella. The samples was under threshold cycle value (Ct), did not reach the value of the melting curve of positive control. Keywords: contamination, fisheries products, real-time PCR, Salmonella
v
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
vi
vii
APLIKASI REAL-TIME PCR UNTUK MENDETEKSI BAKTERI Salmonella sp. PADA HASIL PERIKANAN
PIPIT PRATAMA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Departemen Teknologi Hasil Perairan
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
viii
x
xi
KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat serta hidayah-Nya sehingga penyusunan skripsi yang berjudul Aplikasi Real-time PCR untuk Mendeteksi Bakteri Salmonella sp. pada Hasil Perikanan ini dapat diselesaikan. Skripsi disusun dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan studi di Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini, terutama kepada: 1 Prof Dr Ir Nurjanah, MS dan Dr Mala Nurilmala, SPi MSi selaku dosen pembimbing. 2 Dr Asadatun Abdulah, SPi MSi selaku dosen penguji dan Dr Desniar, SPi MSi sebagai dosen perwakilan komisi pendidikan THP. 3 Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS selaku Ketua Program Studi Teknologi Hasil Perairan. 4 Prof Dr Ir Joko Santoso, MSi selaku Ketua Departemen Tekhnologi Hasil Perairan. 5 PT GeneCraft Labs, Ibu Wini Kania, Mas Ismail Fanani, Mba Diana Pasca, dan Mba Septya serta terima kasih untuk bantuan dan motivasinya sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan untuk perbaikan di masa depan. Demikian skripsi ini disusun, semoga bermanfaat.
Bogor, Oktober 2015
Pipit Pratama
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL............................................................................................. DAFTAR GAMBAR........................................................................................ DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... PENDAHULUAN............................................................................................ Latar Belakang.............................................................................................. Perumusan Masalah...................................................................................... Ruang Lingkup............................................................................................. Tujuan Penelitian.......................................................................................... METODE PENELITIAN.................................................................................. Bahan............................................................................................................. Alat................................................................................................................ Prosedur Penelitian........................................................................................ Koleksi Sampel............................................................................................. Preparasi Sampel…………………………………………………………... Isolasi DNA Ikan Segar……………………………………………………. Isolasi DNA Olahan Ikan………………………………………………….. Isolasi DNA Isolat Salmonella typhimurium (ATCC 25241)……………… Pengukuran Kualitas dan Kuantitas DNA…………………………………. Penentuan Spesifik Primer Salmonella………………………………………… Pengujian Salmonella sp. dengan real-time PCR.......................................... HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………………. Kemurnian DNA Sampel………………………………………………….. Penentuan Spesifik Primer Salmonella………………………………………… Pengujian Salmonella sp. dengan real-time PCR.......................................... DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ LAMPIRAN .................................................................................................... RIWAYAT HIDUP............................................................................................
xi xi xi 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 5 5 6 6 6 7 7 9 10 14 17 20
DAFTAR TABEL 1
Hasil pengukuran kualitas DNA hasil perikanan..........................................
9
DAFTAR GAMBAR 1 2 3a 3b
Pengukuran real- time PCR untuk mendeteksi Salmonella pada hasil perikanan………………………………………………………………... Kurva amplifikasi real- time PCR............................................................ Kurva amplifikasi real-time PCR sampel 1-6........................................... Kurva amplifikasi real-time PCR sampel 7-12.........................................
5 10 11 11
DAFTAR GAMBAR 3c Kurva amplifikasi real-time PCR sampel 13-19........................................ 12 3d Kurva amplifikasi real-time PCR sampel 20-25........................................ 13
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4
Sampel hasil perikanan segar dan olahan pasar tradisional....................... Sampel hasil perikanan segar dan olahan pasar modern............................ Sampel hasil perikanan yang telah dipreprarasi........................................ Penentuan spesifik primer Salmonella sp. menggunakan BLAST............
18 18 18 19
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Polymerase chain reation (PCR) merupakan metode pengujian berbasis biomolekuler berupa reaksi enzimatis untuk melipat gandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Pengembangan metoda PCR yang dapat mengkuantifikasi salinan produk amplifikasi dikenal dengan real-time PCR atau qPCR. Real-time PCR adalah PCR kuantitatif dengan mendeteksi fluorescence reporter yang dihasilkan selama reaksi PCR. Peningkatan signal fluorescent merupakan indikator amplifikasi produk PCR disetiap siklus real-time PCR (Dorak 2006). Real-time PCR dapat diaplikasikan untuk mendeteksi mutasi, menganalisa ekspresi gen, viral kuantifikasi dan mendeteksi patogen. Aplikasi metode deteksi mempunyai peran penting dalam mengurangi penyebaran produk terkontaminasi patogen. Salah satu bakteri pagoten pada produk perikanan adalah Salmonella. Mendeteksi bakteri Salmonella dapat dilakukan dengan berbagai metode, diantaranya metode konvensional melalui metode agar. Penentuan ada tidaknya Salmonella pada sampel membutuhkan waktu 4 hari dan jika positif maka membutuhkan 3 hari untuk mengetahui jenis bakteri Salmonella. Oleh karena itu sangat penting dalam menentukan metode yang lebih sensitif dan cepat untuk mendeteksi Salmonella (Mercanoglu et al. 2009). Salah satu metode alternatif yang cepat untuk mendeteksi bakteri Salmonella yaitu menggunakan metode real-time PCR. Pengujian sampel dengan real-time PCR dapat dilakukan dalam waktu kurang dari 12 jam, serta menyediakan data kualitatif dan kuantitatif patogen yang ditargetkan dalam sampel (Ellingson et al. 2003). Salmonella termasuk salah satu bakteri patogen yang menyebabkan gastrodermik dan demam tipoid bahkan dapat menyebabkan kematian, sehingga Salmonella menjadi perhatian kesehatan di seluruh dunia. Salmonella termasuk ke dalam grup bakteri yang menyebabkan foodborne ilness, menurut perkiraan Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 48 juta kasus foodborne illness di Amerika Serikat sebanyak 128.000 kasus memerlukan perawatan di rumah sakit dan 3.000 diantaranya meninggal dunia (FoodNet 2012) dan pada produk perikanan Salmonella ditemukan sebanyak 374 kasus dari tahun 19732006 (Iwamoto et al. 2010). Kasus Salmonella di Eropa terjadi sebanyak 26.247 dengan 1.515 membutuhkan perawatan di rumah sakit dan 24 meninggal dunia (EFSA 2014), sedangkan pada hasil perikanan Salmonella ditemukan pada berbagai jenis udang, kerang, dan moluska di Eropa (EFSA 2010). Bakteri Salmonella di negara Cina dilaporkan sebagai penyebab kasus foodborne terbesar kedua dan ditemukan mengkontaminasi pada sampel produk perikanan sebesar 20,8% (Yan et al. 2010). Kasus Salmonella di Indonesia terjadi sebanyak 500 kasus per 100.000 penduduk dan menyebabkan angka kematian sebanyak 0,6-5% (Aung dan Agus 2008), oleh karena itu pengembangan metode deteksi bakteri Salmonella pada hasil perikanan dapat menjadi solusi alternatif dalam pencegahan dan penyebaran kontaminan.
2
Perumusan Masalah Mendeteksi bakteri Salmonella pada hasil perikanan dapat dilakukan dengan berbagai metode, diantaranya metode konvensional melalui metode agar, namun metode konvensional membutuhkan banyak waktu sehingga dibutuhkan alternatif metode yang lebih sensitif dan cepat untuk mendeteksi Salmonella pada hasil perikanan, yaitu menggunakan metode Real-time PCR.
Ruang Lingkup Ruang lingkup penelitian ini yakni meliputi koleksi sampel, preparasi sampel, isolasi DNA sampel, pengukuran konsentrasi dan kualitas DNA, penentuan spesifik primer, pengujian kontrol positif dan negatif, deteksi isolat DNA mengunakan real-time PCR dan penulisan laporan ilmiah.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengaplikasikan real- time PCR untuk mendeteksi bakteri Salmonella sp. pada hasil perikanan.
METODE PENELITIAN Waktu dan tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret sampai Mei 2015. Pengambilan sampel dilakukan di pasar sekitar Bogor, preparasi sampel dilakukan pada Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Isolasi DNA sampel, pengukuran konsentrasi dan kualitas DNA, penentuan spesifik primer, pengujian kontrol positif dan negatif, deteksi isolat DNA mengunakan real-time PCR, dilakukan di laboratorium PT Gene Craft Labs, Jakarta.
Bahan Bahan yang digunakan adalah sampel hasil perikanan segar dan olahan, yang diperoleh dari pasar tradisional dan modern, spesifikasi sampel dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2. Sampel hasil perikanan segar yang dikumpulkan dari pasar tradisional antara lain; cumi-cumi bangka, udang vanamei, ikan teri, dan kembung banjar. Sampel olahan; ikan gabus asin, ikan teri asin, teri asin cue, udang rebon, ikan pindang bandeng, pindang tongkol, pindang besek dan terasi. Sampel hasil perikanan segar yang diambil dari pasar modern antara lain; filet ikan salmon, cumi-cumi bangka, udang vanamei, kembung banjar dan ikan mujair. Sampel perikanan olahan; teri tawar padang, terasi higenis, crab claw,
3
squid roll, otak-otak, chikuwa, dan salmon ball. Kontrol positif Salmonella typhimurium (ATCC 25241), kontrol negatif no template control (NTC), alkohol absolut (96%), kloroform, sepasang primer forward dan reverse. Primer forward (5` ATC GCT GAC TTA TGC AAT CG 3`), primer reverse (5`CGG GTT GCG TTA TAG GTC TG 3`) Alvarez et al. (2004), Sybr green (QuantatiTect SYBR Green PCR kit Qiagen). Bahan-bahan yang digunakan untuk mengisolasi DNA bakteri dengan menggunkan kit komersial Qiamp DNA minikit, isolasi DNA dari hasil perikanan olahan menggunakan Dneasy Mericon Foodkit dan untuk mengisolasi DNA ikan segar menggunakan Dneasy Blood and Tissue kit.
Alat Alat-alat yang digunakan, pinset, gunting, microsmash (MS-100, Tomy Tokyo, Japan), vortex (V-1 plus, Biosan, Rīgas pilsēta, Latvia), microsentrifuge (micro one, Tomy, Tokyo, Japan), classic micro pipet 1000 µL , 200 µL, 100 µL, 20 µL dan 10 µL (Rainin,Oakland, USA), mesin Real-time PCR (Rotor-gene Q, qiagene, Hilden, German), nanophotometer (implen, p360, Munchen, German), microsentrifuge (kitman, kitman-T24, Tokyo, Japan), dry block thermostat (Biosan, TDB100, Rīgas pilsēta, Latvia), drying oven (Yamato SH 62, Tokyo, Japan) dan disposable powder free gloves.
Prosedur Penelitian Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap, meliputi koleksi sampel, preparasi sampel isolasi DNA sampel, pengukuran konsentrasi dan kualitas DNA, penentuan spesifik primer, pengujian kontrol positif dan negatif, deteksi isolat DNA mengunakan real-time PCR. Diagram penggunaan real-time PCR untuk mendeteksi Salmonella pada hasil perikanan dapat dilihat pada Gambar 1. Koleksi Sampel Koleksi sampel dilakukan dari berbagai pasar di Bogor, yaitu dari pasar tradisional dan pasar modern baik sampel segar maupun olahan. Sampel yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 1. Preparasi Sampel Sampel yang telah dikumpulkan, lalu dipreparasi menggunakan pisau steril dan homogenisasi menggunakan mortar steril. Alat yang digunakan terlebih dahulu dilakukan proses sterilisasi menggunakan oven suhu 121 oC. Sampel yang sudah dipreparasi lalu ditimbang dan disimpan pada freezer suhu -20oC. Isolasi DNA ikan segar dengan kit komersial (Dneasy Blood and Tissue kit cat 69504) Sampel ikan segar sebanyak 30 mg ditambahkan 200 μL buffer ATL, digerus dengan microsmash, ditambahkan 20 µL proteinase K dan divortex, kemudian diinkubasi pada suhu 56oC selama 1 jam, setiap 10 menit divortex. Buffer AL sebanyak 200 µL dan 200 µL ethanol (96%) ditambahkan dan
4
dicampurkan, divortex dan kemudian dipipet larutannya dan dimasukan pada QiaAmp Mini Spin Coloumn dalam 2 mL collection tube, disentrifugasi pada 6000 xg (8000 rpm) selama 1 menit, kemudian supernatan nya dibuang. Buffer AW1 sebanyak 500 µL ditambahkan dan disentrifugasi selama 1 menit pada 6000 xg (8000 rpm), kemudian supernatan nya dibuang. Buffer AW2 sebanyak 500 µL ditambahkan dan disentrifugasi selama 3 menit pada 6000 xg (8000 rpm), kemudian collection tube nya dibuang. QiaAmp Mini Spin Column dimasukan ke dalam 2 mL collection tube yang baru, tanpa penambahan apapun lalu disenrtifugasi selama 1 menit pada 20,000 xg (14,000 rpm) untuk mengeringkan QiaAmp Mini Spin Coloumn membran dari ethanol dan dibuang collection tube nya. Koleksi sampel Sampel Preparasi sampel
Preparat Isolasi DNA sampel DNA
Pengukuran konsentrasi dan kualitas DNA Menggunakan real- time PCR untuk mendeteksi bakteri Salmonella sp. pada hasil perikanan
Data kemurnian DNA
Data dari real-time PCR Gambar 1. Penggunaan real-time PCR untuk mendeteksi Salmonella pada hasil perikanan
5
Buffer AE sebanyak 100 µL ditambahkan ke dalam QiaAmp Mini Spin Coloumn yang baru, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 7 menit, disentrifugasi selama 1 menit pada 6000 xg (8000 rpm) untuk proses elusi. Langkah terakhir DNA hasil elusi dapat langsung digunakan untuk proses PCR atau disimpan pada suhu -20oC untuk penyimpanan lama. Isolasi DNA olahan ikan dengan kit komersial (Dneasy Mericon Foodkit (50) cat 69514 Handbook) Sampel olahan ikan sebanyak 250 mg disiapkan dalam 1 mL food lysis buffer, yang digerus menggunakan microsmash, 2,5 µL protenase K ditambahkan, divortex, kemudian diinkubasi pada suhu 60oC selama 30 menit. Setiap 10 menit divortex selama masa inkubasi, sampel lalu didinginkan pada suhu ruang selama beberapa detik. Sampel selanjutnya dimasukan ke dalam ice block setelah inkubasi. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 2500 xg selama 5 menit. Supernatan diambil dan dipindahkan pada tube 2 mL yang baru dan ditambahkan 500 µL chloroform, selama 15 detik divortex lalu disentrifugasi dalam kecepatan 14.000 xg selama 15 menit. Supernatan diambil dan dihitung volumenya, setelah itu ditambahkan 1:1 volume buffer PB dan divortex selama 15 detik. Seluruh cairan tersebut dimasukan ke dalam Qiaquick spin coloumn yang disentrifugasi 17.900 xg selama 1 menit. Cairan yang tertampung pada collection tube dibuang. Buffer AW2 sebanyak 500 µL ditambahkan dan disentrifuge 17.900 xg selama 1 menit, kemudian supernatan nya dibuang, setelah itu dimasukan pada Qiaquick spin column yang baru, lalu disentrifugasi ulang pada 17.900 xg selama 1 menit, disiapkan Qiaquick spin coloumn dan ditambahkan sebanyak 150 µL buffer EB yang didiamkan selama 1 menit pada suhu ruang lalu disentrifugasi pada kecepatan 17900 xg selama 1 menit. Langkah terakhir DNA hasil elusi dapat langsung digunakan untuk proses PCR atau disimpan pada suhu -20oC untuk penyimpanan lama. Isolasi DNA bakteri dengan kit komersial (Qiamp DNA minikit 51306) Sampel isolat bakteri sebanyak 2 ose ditambahkan dengan 500 µL PBS dan divortex, kemudian disentrifugasi 7500 rpm selama 10 menit. Pellet nya diambil dan ditambahkan 180 µL ATL dan 20 µL l proteinase K, divortex, lalu diinkubasi pada suhu 56oC selama 1 jam dan divortex setiap 10 menit, lalu ditambahkan 200 µL buffer AL. Ethanol (96%) sebanyak 200 µL ditambahkan pada sampel yang sudah disiapkan sebelumnya dan dicampurkan dengan cara divortex, kemudian larutan dipipet dan dimasukan pada QiaAmp Mini Spin Coloumn 2 mL collection tube, lalu disentrifugasi pada 6000 xg (8000 rpm) selama 1 menit. Supernatan yang berada di dalam collection tube dibuang dan digunakan kembali collection tube nya. 500 µL buffer AW1 ditambahkan dan disentrifugasi selama 1 menit pada 6000 xg (8000 rpm) kemudian dibuang supernatan nya di dalam collection tube. QiaAmp Mini Spin Column 2 mL collection tube yang baru disiapkan, tanpa penambahan apapun lalu senrtifugasi selama 1 menit pada 20,000 xg (14,000 rpm) untuk mengeringkan QiaAmp Mini Spin Coloumn membran dari ethanol dan dibuang collection tube nya.
6
QiaAmp Mini Spin Column 2 mL collection tube yang baru disiapkan, ditambahkan 100 µL buffer EB dipipet dan dimasukan ke dalam QiaAmp Mini Spin Colmn membran, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit, disentrifugasi selama 1 menit pada 17.900 x g untuk proses elusi. Langkah terakhir DNA hasil elusi dapat langsung digunakan untuk proses PCR atau disimpan pada suhu -20oC untuk penyimpanan lama. Pengukuran kualitas dan kuantitas DNA (NanoPhotometer® P-Class User Manual) Hasil isolasi DNA dari sampel diukur konsentrasinya menggunakan NanoPhotometer. Langkah awal dimulai dengan tombol power ditekan untuk ON, tampilan control panel akan menyala, kemudian NanoPhotometerTM Pearl submicroliter cell dimasukan ke dalam cell holder, dimana cell windows menghadap kearah sinar inframerah. Submicroliter cell diposisikan dalam posisi yang sama di dalam cell hoder. Pipet dapat digunakan untuk meneteskan sampel yang akan diukur di tengah jendela cell pengukur, kemudian submicroliter cell yang telah berisi sampel, ditutup dengan rapat. Pilih NanoVolume atau Cuvette Aplications lalu pilih folder Nucleic Acid, pilih metode yang akan digunakan, kemudian tentukan parameter pengukuran untuk Lid factor atau pathlength, dilution factor, background, units, factor nucleic acids lalu OK ditekan, tombol Blank untuk referensi pengukuran dan tekan tombol untuk melakukan pengukuran, kemudian diulangi untuk semua sampel. Penentuan spesifik primer Salmonella sp. Penentuan spesifik primer Salmonella sp. diuji menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pada website National Center for Biotechnology Information (NCBI) dan untuk lebih meyakinkan bahwa primer tersebut spesifik terhadap Salmonella sp. maka dilakukan pengujian Salmonella typhimurium (ATCC 25241) sebagai kontrol positif dan NTC sebagai kontrol negatif dengan menggunakan real-time PCR. Kontrol positif Salmonella typhimurium (ATCC 25241) yang digunakan terlebih dahulu diekstrak DNA nya menggunkan kit komersial Qiamp DNA minikit 51306. Pengujian Salmonella sp. dengan real-time PCR (Manual Handbook Quantifast Sybr Green PCR) Penggunaan real-time PCR dilakukan dengan membuat master mix terlebih dahulu kemudian diamplifikasi dan dimasukan kedalam mesin real-time PCR. Kemudian dihitung komposisi untuk membuat PCR mix sesuai dengan jumlah sampel yang digunakan dan kontrol positif disiapkan. Quantifast Mix, primer mix, RNAse Free water dan template DNA dicairkan sebanyak 2x, lalu spin down selama 15 detik, PCR mix dalam tabung LifeTouch Microcentrifuge steril 1,7 mL disiapkan. Bahan untuk satu kali reaksi yang terdiri dari 12,5 µL Q fast sbyr green, 2,5 µL primer forwad (10uM), 2,5 µL primer reverse (10 µM), 5,5 µL RNAse free water dan tempelate DNA 2 µL. PCR mix sesuai jumlah sampel dicampur kecuali template, kemudian distribusikan ke dalam tabung reaksi 0.2 mL masing-masing 22,5 μL. Template DNA sebanyak 2 μL ditambahkan ke dalam tabung PCR yang sudah berisi PCR mix. Masing-masing sampel dimasukan kedalam setiap well pada plate 96 well reaction. Kemudian well ditutup dengan
7
PCR sealer TM Microseal. Well dimasukkan ke dalam real-time PCR yang telah diatur dengan protokol. Protokol PCR yang digunakan yaitu PCR initial activation enzim selama 5 menit dengan pada suhu 95°C, denaturasi 10 detik pada suhu 95°C, anealing 30 detik pada suhu 54oC, jumlah cycle 35 dan melt on green 60 sampai dengan suhu 95°C, kemudian dilakukan running dengan real-time PCR.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kemurnian DNA Sampel Metode isolasi DNA berperan penting untuk mendapatkan DNA murni. DNA murni harus bebas dari protein dan oligopeptida. Konsentrasi dan kemurniaan DNA dapat diketahui dengan mengukurnya pada nano implen photometer. Isolat DNA dikatakan murni jika rasio antara nilai absorbansi pada panjang gelombang 260/280 berada pada selang 1,8 hingga 2,0 (Sahiri 2011). Panjang gelombang rasio 260/280 memberikan indikasi kemurnian dari DNA (Pestana et al. 2010). Kemurnian DNA berperan dalam sensitifitas dari pengujian real-time PCR, menurut Dauphin et al. (2009) faktor yang berpengaruh terhadap sensitifitas dari pengujian real-time PCR, adalah kemurnian DNA dari inhibitor, rendemen DNA, dan kerusakan DNA. Hasil dari pengukuran kemurnian DNA sampel dan kontrol positif menggunakan nano implen photometer pada panjang gelombang 260/280 memiliki nilai absorbansi yang berbeda-beda. Kontrol positif Salmonella typhimurium (ATCC 25241) yang menggunakan kit komersial Qiamp DNA minikit untuk mengisolasi DNA memiliki konsentrasi 204 ng/µL dan nilai absorbansi sebesar 1,9. Sampel segar yang berasal dari pasar tradisional diisolasi menggunakan kit komersial Dneasy Blood and Tissue kit memiliki konsentrasi DNA, yaitu cumi-cumi 14,00 ng/µL, kembung banjar 29,00 ng/µL, dan teri segar 9,00 ng/µL serta memiliki nilai absorbansi cumi-cumi 2,33, kembung banjar 2,71, dan teri segar 2,00. Sampel olahan yang berasal dari pasar tradisional diisolasi menggunakan kit komersial Dneasy Mericon Foodkit memiliki konsentrasi DNA, yaitu ikan gabus asin 12,50 ng/µL, teri asin cue 282 ng/µL, cumi asin 131 ng/µL, selar asin 29 ng/µL, udang rebon 209 ng/µL, terasi tradisional ≤ 10 ng/µL, pindang besek 49 ng/µL, pindang bandeng satu 54 ng/µL, pindang bandeng dua 38 ng/µL, pindang tongkol 17 ng/µL serta memiliki nilai absorbansi ikan gabus asin 1,66 teri asin cue 1,81, cumi asin 1,82, selar asin 1,87, udang rebon 2,19, terasi tradisional 1,83, pindang besek 1,84, pindang bandeng satu 1,83, pindang bandeng dua 1,85, pindang tongkol 1,78. Sampel segar yang berasal dari pasar modern diisolasi menggunakan kit komersial Dneasy Blood and Tissue kit memiliki konsentrasi DNA, yaitu cumicumi bangka 127 ng/µL, ikan mujair 22,50 ng/µL, filet ikan salmon 103 ng/µL, udang vanamei 41,50 ng/µL, dan kembung banjar 20,50 ng/µL serta memiliki nilai absorbansi cumi-cumi bangka 2,08, ikan mujair 2,04, filet ikan salmon 2,01,
8
udang vanamei 2,02, dan kembung banjar 2,05. Sampel olahan yang berasal dari pasar modern diisolasi menggunakan kit komersial Dneasy Mericon Foodkit memiliki konsentrasi DNA, yaitu teri tawar padang 91,5 ng/µL, terasi higienis ≤ 10 ng/µL, crab claw ≤ 10 ng/µL, otak-otak ≤ 10 ng/µL, squid roll ≤ 10 ng/µL, chikuwa ≤ 10 ng/µL, salmon ball ≤ 10 ng/µL serta memiliki nilai absorbansi teri tawar padang 1,84, terasi higienis 1,70, crab claw 1,65, otak-otak 1,44, squid roll 1,67, chikuwa 1,75, salmon ball 1,76. Pengukuran kualitas dan kuantitas dari DNA kontrol positif Salmonella typhimurium (ATCC 25241) dan sampel segar yang berasal dari pasar tradisional menurut Sahiri (2011) maka kontrol positif dan teri segar sesuai dengan standar nilai absorbansi sedangkan sampel kembung banjar dan cumi-cumi tidak sesuai dengan standar. Sampel olahan yang berasal dari pasar tradisional menurut Sahiri (2011) maka gabus asin, teri asin cue, cumi asin, selar asin, teri tradisional, pindang besek, pindang bandeng satu, pindang bandeng dua dan pindang tongkol sesuai dengan nilai absorbansi sedangkan sampel udang rebon tidak sesuai dengan standar. Pengukuran kualitas dan kuantitas dari DNA sampel segar yang berasal dari pasar modern menurut Sahiri (2011) maka cumi-cumi bangka, ikan mujair, filet ikan salmon, udang vanamei, dan kembung banjar tidak sesuai dengan standar nilai absorbansi. Sampel olahan yang berasal dari pasar modern menurut Sahiri (2011) maka teri tawar padang sesuai dengan nilai absorbansi sedangkan terasi higienis, crab claw, otak-otak, squid roll, chikuwa dan salmon ball tidak sesuai dengan standar. Ketidaksempurnaan saat proses isoasi DNA menyebabkan masih terkandungnya berbagai jenis pengotor yang mempengaruhi kemurnian DNA hasil dari isoasi, menurut Bellard et al. (1973) pada rasio A260/280 yang lebih rendah dari 1,8, mengindikasikan adanya kontaminasi dari protein atau fenol, sedangkan pada absorbansi 230 nm menunjukan kontaminasi dari ikatan peptida. Kontaminasi oleh protein dapat berasal dari komponen sel yang tidak lisis selama proses isolasi atau berasal dari fenol sebagai bahan yang ditambahkan pada proses isolasi untuk mempresipitasi DNA. Hasil dari pengukuran konsentrasi DNA sampel dan kontrol positif menggunakan nano implen photometer pada panjang gelombang 260/280 memiliki nilai konsentrasi DNA yang berbeda-beda. Konsentrasi DNA menunjukan banyaknya DNA dalam suatu sampel, setiap sampel memiliki konsentrasi yang berbeda-beda sehingga tidak ada standar dalam penentuan konsentrasi DNA, menurut CBS fungal biodeversity center (2015) konsentrasi DNA 10 ng/µL hingga lebih dari 100 ng/µL cukup digunakan untuk proses pengujian pada PCR dan konsentrasi DNA kurang dari 10 ng/µL seringkali sukses untuk pengujian pada PCR. Penelitian ini menggunakan primer berdasarkan Alvarez et al. (2004) untuk mendeteksi gen target bakteri Salmonella sp. pada 25 produk hasil perikanan. Primer yang digunakan adalah primer forward (5` ATC GCT GAC TTA TGC AAT CG 3`), primer reverse (5`CGG GTT GCG TTA TAG GTC TG 3`) dengan panjang amplifikasi 204 pasangan basa. Menurut Pestana et al. (2010), panjang amplifikasi primer yang baik jika menggunakan real-time PCR dan pewarna flourescence SYBR® green dalam rentang antara 100-400 pasangan basa. Primer tersebut, kemudian dianalisis menggunakan Software BLAST.
9
Tabel 1. Hasil pengukuran kualitas DNA hasil perikanan Sampel *
Pasar tradisional Segar Cumi-cumi Kembung Banjar Teri Segar Olahan Ikan gabus asin Teri asin cue Cumi asin Selar asin Udang rebon Terasi (Tradisional) Pindang besek Pindang bandeng 1 Pindang bandeng 2 Pindang tongkol Pasar modern segar Cumi-cumi Bangka Ikan Mujair Filet Ikan Salmon Udang Vanamei Kembung Banjar olahan Teri tawar padang Terasi (higeinis) Crab Claw Otak-otak Squid roll Chikuwa Salmon ball *total sampel 25
Waktu sampling
Konsentrasi DNA (ng/µL)
Kemurnian DNA dari Protein A260/A280
Kemurnian DNA dari pengotor A260/A230
Senin, 16-3-2015, 06.30 WIB Senin, 16-3-2015, 06.30 WIB Senin, 16-3-2015, 06.30 WIB
14,00 29,00 9,00
2,33 2,071 2,00
0,56 0,61 0,33
Sabtu, 14-3-2015, 17.30 WIB Sabtu, 14-3-2015, 17.30 WIB Minggu, 15-3-2015, 11.30 WIB Minggu, 15-3-2015, 11.30 WIB Minggu, 15-3-2015, 11.30 WIB Minggu, 15-3-2015, 11.30 WIB Senin, 16-3-2015, 07.30 WIB Sabtu, 14-3-2015, 17.00 WIB Senin, 16-3-2015, 07.30 WIB Sabtu, 14-3-2015, 17.00 WIB
12,50 282 131 29,00 209 ≤ 10 49,00 54,00 38,00 17,00
1,66 1,81 1,82 1,87 2,19 1,83 1,84 1,83 1,85 1,78
0,18 2,16 2,13 1,56 1,52 0,57 1,36 1,71 1,46 0,89
Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB
127 22,50 103 41,50 20,50
2,08 2,04 2,01 2,02 2,05
1,64 0,75 1,62 0,76 0,73
Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB Jumat, 13-3-2015, 19.00 WIB
91,5 ≤ 10 ≤ 10 ≤ 10 ≤ 10 ≤ 10 ≤ 10
1,84 1,70 1,65 1,44 1,67 1,75 1,76
1,79 0,70 0,35 0,76 1,67 0,45 0,44
Penentuan Spesifik Primer Salmonella sp. Hasil pengujian BLAST dapat dilihat pada Lampiran 4 dan untuk lebih meyakinkan bahwa primer tersebut spesifik terhadap Salmonella sp. maka dilakukan pengujian Salmonella typhimurium (ATCC 25241) sebagai kontrol positif dan NTC sebagai kontrol negatif dengan menggunakan real-time PCR. Hasil penentuan spesifik primer dengan menggunakan real-time PCR dapat dilihat pada kurva amplifikasi dan kurva puncak pelelehan (melting curve) pada Gambar 2. Kurva amplifikasi terbentuk sejak proses amplifikasi dimulai. Kurva ini berfungsi untuk menentukan apakah dalam thermal cycler terjadi amplifikasi atau tidak. Amplifikasi ditetapkan berdasarkan intensitas fluorescent, semakin banyak produk amplifikasi yang dihasilkan, semakin besar akumulasi fluorescent yang terbaca. Peningkatan fluorescent tersebut ditandai dengan terbentuknya grafik
10
sigmoid. Grafik sigmoid akan berpotongan dengan baseline threshold yang telah ditentukan secara otomatis oleh program.
Gambar 2. Kurva amplifikasi real-time PCR, ( kontrol negatif
) kontrol positif dan (
)
Titik perpotongan antara grafik sigmoid dan baseline threshold jika direfleksikan pada sumbu-x (Cycle) adalah threshold cycle (Ct) bagi sampel yang diamplifikasi (Pestana et al. 2010). Pengujian spesifik primer juga dilakukan dengan menganalisis kurva puncak pelelehan (melt peak curve) dengan melihat titik puncak pelelehan (melt peak) dan nilai Tm (melting temperature) yang dihasilkan pada kurva tersebut (Pestana et al. 2010). Kurva puncak pelelehan menunjukkan bahwa kontrol positif Salmonella typhimurium (ATCC 25241) hanya menghasilkan satu puncak. Hal tersebut menunjukkan bahwa pada pengujian tersebut tidak terjadi mispriming yang artinya primer yang digunakan spesifik dan tidak mengamplifikasi gen lain selain gen target. Nilai Tm yang dihasilkan sebesar 86,60oC. Nilai tersebut dapat menjadi ciri khusus pada pengujian selanjutnya.
Pengujian Salmonella sp. dengan real-time PCR Prinsip kerja real-time PCR adalah mendeteksi dan mengkuantifikasi fluorescence reporter. Sinyal fluorescent akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR yang teramplifikasi dalam reaksi. Sinyal fluorescent pada setiap siklus, reaksi selama fase eksponensial dapat dipantau secara realtime. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi gen target. Makin tinggi tingkat ekspresi gen target maka deteksi emisi fluorescent makin terbaca (Dorak 2006). Hasil pengujian sampel produk perikanan yang menggunakan real-time PCR (Gambar 3a, 3b, 3c, dan 3d) yang berasal dari pasar tradisional dan modern baik segar dan olahan tidak menunjukan adanya grafik melting yang sigmoid dan dari seluruh sampel tidak mencapai nilai threshold cycle (Ct).
11
Gambar 3a. Kurva amplifikasi real-time PCR sampel 1-6, ( ) kontrol positif dan ( ) kontrol negatif, ( ) teri padang, ( ) gabus asin, ( ) ikan asin japu, ( ) pindang bandeng, ( ) pindang tongkol, ( ) teri asin cue.
Gambar 3b. Kurva amplifikasi real-time PCR sampel 7-12, ( ) kontrol positif dan ( ) kontrol negatif, ( ) terasi higienis, ( ) udang rebon, ( ) selar asin, ( ) creb claw, ( ) terasi tradisional, ( ) cumi asin. Pengujian real-time PCR pada penelitian ini menggunakan analisis dengan kurva puncak pelelehan (melt peak curve) dengan melihat titik puncak pelelehan (melt peak) dan nilai Tm (melting temperature), hal ini dikarenakan mengunakan pewarna DNA sbyr green, menurut quantitect sybr green RT PCR handbook (2011) prinsip dari sbyr green adalah mengikat setiap DNA utas ganda sehingga menghasilkan peak yang dibaca sedangkan nilai Tm sangat spesifik dan sebagai penanda pengujian. Nilai Tm tergantung pada panjang skuen DNA dan GC konten sehingga sangat penting dalam melakukan pengukuran menggunakan nilai Tm
12
dan peak melting curve.
Gambar 3c. Kurva amplifikasi real-time PCR sampel 13-19, ( ) kontrol positif dan ( ) kontrol negatif, ( ) chikuwa, ( ) pindang bandeng 2, ( ) otak-otak, ( ) pindang besek, ( ) salmon ball, ( ) squid roll. Pembacaan melting curve memperlihatkan jika sampel positif, maka akan teramplifikasi pada nilai Tm tidak jauh berbeda dengan kontrol positif atau perbedaan nya 1o- 2oC (Mangold et al. 2005) dari nilai Tm kontrol positif (86.60oC). Kontrol negatif NTC juga teramplifikasi dan tidak melebihi nilai threshold cycle (Ct), sehingga hasilnya dari pembacaan real-time PCR tidak menunjukan adanya sampel terdeteksi. Pembacaan amplifikasi DNA pada penelitian ini menggunakan real-time PCR untuk semua sampel disertakan kontrol positif dan negatif yang berfungsi untuk mengetahui apakah saat mencampurkan mix reagen ke dalam sampel terdapat kontaminasi atau tidak. Kontrol negatif tidak akan teramplifikasi setelah pembacaan jika tidak terdapat kontaminasi atau dalam pengerjaan berhasil dan hasil real-time PCR dianggap layak dan dapat dipercaya (Kartikasari 2008). Pada penelitian ini telah melalui proses yang benar, dimana hasil kontrol negatif tidak teramplifikasi sehingga hasil pembacaan real-time PCR dapat dipercaya. Pada penelitian ini tidak menggunakan metode pre-enrichment untuk mendeteksi sampel hasil perikanan. Metode deteteksi Salmonella sp. (viable dan non viable) dengan metode real-time PCR dapat menggunakan pre-enrichment dan tanpa metode pre-enrichment. Metode deteteksi Salmonella sp. dengan real-time PCR tanpa menggunakan metode pre-enrichment diantaranya dilakukan oleh Xiao et al. (2015), D’Urso et al. (2009), Elizaquivel dan Rosa (2008), Miller et al. (2010), sedangkan metode deteteksi Salmonella sp. yang menggunakan metode preenrichment diantara nya dilakukan oleh Perelle et al. (2004) dan McGuinness et al. (2009). Metode deteksi Salmonella sp. menurut Xiao et al. (2015) dilakukan dengan pengujian sensitifitas dan kuantitas limit dari kontrol positif yang digunakan dengan menggunakan real-time PCR.
13
Gambar 3d. Kurva amplifikasi real-time PCR sampel 20-25, ( ) kontrol positif dan ( ) kontrol negatif, ( ) cumi-cumi bangka, ( ) ikan mujair, ( ) cumi-cumi pasar modern, ( ) teri segar, ( ) teri segar 1, ( ) fillet salmon, ( ) kembung banjar 2. Setiap pengujian deteksi Salmonella sp. memiliki batas limit yang berbeda-beda, pada penelitian Xiao et al. (2015) memiliki limit deteksi sebesar 102 CFU/ml, penelitian Elizaquivel et al. (2012) memiliki limit deteksi sebesar 105 CFU/ml, dan penelitian Elizaquivel dan Rosa (2008) memiliki limit deteksi sebesar 104 CFU/ml. Pada penelitian ini tidak melakukan analisis sensitifitas dan penentuan limit dari kontrol positif sehingga diduga bakteri Salmonella pada sampel tidak terdeteksi karena memiliki batas limit yang rendah dari kontrol positif yang digunakan.
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Aplikasi real-time PCR menggunakan metode tanpa pre-enrichment dari total 25 sampel hasil perikanan yang digunakan adalah negatif.
Saran Adapun saran berdasarkan penelitian ini adalah membandingkan pengujian metode deteksi konvensional menggunakan enrichment dan metode real-time PCR, disarankan melakukan pengujian batas limit sensitifitas dan deteksi dari kontrol positif yang digunakan, serta untuk penelitian selanjutnya Salmonella hidup untuk keamanan pangan dilakukan pre-kondisi di sampel sehingga hanya Salmonella hidup yang terhitung.
14
DAFTAR PUSTAKA Alvarez J, Mertxe S, Ana BV, Ildefonso P, Ramon C, Aitor R dan Javier G. 2004. Development of a multiplex PCR technique for detection and epidemiological typing of Salmonella in human clinical samples. Journal of Clinical Microbiology 42(4):1734-1738. Aung Myint dan Agus Supriadi. 2008 Juni. Pentingnya intervensi terpadu dengan sanitasi total. Mediakom 8(49):17-18. Bellard MG, Outdet P, Chambon P. 1973. Isolation of high molecular weight DNA from mammalian cells. Eur J Biochem 36(1):32-38. [CBS] Fungal Biodeversity Center Institut of Royal Netherands. Quantification of Nuceic Acid, RNA and Oligonucleotides. www. cbs.knaw.nl [16 Desember 2015] D’Urso O F, Palmiro P, Santo, Carlo S, Marta, David R. 2009. A filtration-based real-time PCR method for the quantitative detection of viable Salmonella enterica and Listeria monocytogenes in food samples. Journal of Microbiology 26(3): 311-316. Dauphin LA, Hutchins RJ, Bost LA, Bowen MD. 2009. Evaluation of automated and manual commercial DNA extraction methods for recovery of Brucella DNA from suspensions and spiked swabs. J of Clinical Microbiology 47(12): 3920-3926. Dorak T M. 2006. Real time PCR. Newcastle (GB): Taylor and Francis group. [EFSA] European Food Safety Authority. 2010. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in the European Union in 2008. EFSA Journal 8(45): 1496. [EFSA] European Food Safety Authority. 2014. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2012. EFSA Journal 2014 12(2): 3547. Elizaquivel P dan Rosa A. 2008. A multiplex RTi-PCR reaction for simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. and Staphylococcus aureus on fresh, minimally processed vegetables. Journal of Food Microbiology 25(5): 705-713. Elizaquivel P, Gloria S, Rosa A. 2012. Quantitative detection of viable foodborne E. Coli O157: H7, Lesteria monocytogenes and Salmonella in fresh-cut vetetables combining propidium monoazide and real-time PCR. Journal of Food Control 25(2014): 704-708. Ellingson JLE, Jennifer LA, Steve AC, Vijay KS. 2003. Twelve hour real-time PCR technique for the sensitive and specific detection of Salmonella in raw and ready-to-eat meat products. Journal Molecular and Cellular Probe 18(1): 51-57. [FoodNet] Foodborne Diseases Active Surveillance Network. 2012. Trends in Foodborne Illness in the United States, 2012. www. FoodNet.org [19 April 2014]
15
Iwamoto M, Ayers T, Mahon, dan Swerdlow. 2010. Epidemiology of seafoodassociated infections in the United States. Clinical Microbiology Reviews 23(2): 399–411. Kartikasari DS. 2008. Perbandingan tingkat sensitivitas dan spesifisitas pada pemeriksaan Influenza A dengan menggunakan rapid test dan real timereverse transcriptase PCR (rRT-PCR) [tesis]. Semarang (ID): Universitas Diponegoro. Mangold AK, Rebecca UM, Evelyn SCK, Lindsey S, Mary AR, Richard BT, Lance RP dan Karen LK. 2005. Real-Time PCR for detection and identification of Plasmodium spp. J of Clinical Microbiology 43(5): 2435– 2440. McGuinness S, McCabe E, O’Regan E, Dolan A. Duffy G, Burgess C. 2009. Development and validation of a rapid real-time PCR based method for the specific detection of Salmonella on fresh meat. Journal of Meat Science 8(3): 555-562. Mercanoglu T, Ben U. Aytac SA. 2009. Rapid detection of Salmonella in milk by combined immunomagnetic separation-polymerase chain reaction assay. Journal Dairy Science 92(6): 2382-2388. Miller DN, Davison dan Doris HD. 2010. Real-time reverse-transcriptase PCR for Salmonella typhimurium detection from lettuce and tomatoes. Journal of Food Science and Technology 44(4) 1088-1097. Nur’utami D A. 2011. Metode analisis isolasi dan identifikasi Salmonella tyhimurium pada susu dengan metode real-time PCR [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Perelle S, Dilasser F, Malorny B, Grout J, Hoorfar J, Fach P. 2004. Comparison of PCR-ELISA and LightCycler real-time PCR assays for detecting Salmonella spp. in milk and meat samples. Journal of Molecular and Cellular Probes 18(6): 409-420. Pestana EA, Belak S, Diallo A, Crowther JR, Viljoen GJ. 2010. Early, Rapid, and Sensitive Veterinary Molecular Diagnostics Real-Time PCR Application. Dordrecht (NL): Springer. [QIAGEN] QuantiTect Sybr Green RT-PCR Handbook. Quantitatif, Real-Time One-Step RT-PCR using Sbyr Green. www. sabioscience.com [16 Desember 2015] Sahiri T. 2011. NanoPhotometer® P-Class User Manual P 300 / P 330 / P 360 Version 2.1. Schatzbogen (DE): Implen GmbH Singh G, Poornima V, Saurabh B, Nirmala R, Nimish S, Peter M, Rishi S. 2013. Determination of viable Salmonella from potable and source water through PMA assisted qPCR. Journal of Ecotoxicology and Enviromental safety 93(1): 121-127. Xiao L, Zhaohuan Z, Xiaohong S, Yingjie P, Yong Zhao. 2015. Development of a quantitatif real-time PCR assay for viable Salmonella spp. without enrichment. Journal of Food Control 57(3): 185-189. Yan H, Lin L, Jahangir A, Sumio S, Shin-ichi M, Lei S. 2010. Prevalence and
16
antimicrobial resistance of Salmonella in retail foods in northern China. Journal of food Microbiology 143(3): 230-234.
LAMPIRAN
18
Lampiran 1. Sampel hasil perikanan segar dan olahan pasar tradisional
sampel segar
sampel olahan
Lampiran 2. Sampel hasil perikanan segar dan olahan pasar modern
sampel udang segar
sampel olahan
Lampiran 3. Sampel hasil perikanan yang telah dipreprarasi
25 sampel hasil perikanan
19
Lampiran 4. Penentuan spesifik primer Salmonella sp. menggunakan BLAST
hasil pengujian primer salmonella sp.
20
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Indramayu pada tanggal 10 Maret 1993. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Pendidikan formal yang ditempuh penulis dimulai di SDN Panyindangan Wetan I pada tahun 1999 hingga tahun 2005. Penulis melanjutkan pendidikan pada tahun yang sama di SMPN Unggulan Sindang hingga tahun 2008. Pendidikan formal selanjutnya ditempuh di SMAN 1 Sindang Indramayu pada tahun 2008 dan lulus pada tahun 2011. Penulis diterima sebagai mahasiswa di Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPT Undangan pada tahun 2011. Selama perkuliahan, penulis juga aktif sebagai asisten seperti asisten praktikum pada mata kuliah Penanganan Hasil Perairan 2013-2014, asisten praktikum mata kuliah Pengetahuan Bahan Baku Hasil Perairan tahun 2014 dan wakil koordinator asisten praktikum mata kuliah Penanganan Hasil Perairan 2014-2015. Selama studi di Institut Pertanian Bogor Penulis aktif dalam kegiatan kemahasiswaan seperti: menjadi Ketua kelas P09, ketua IPB Political School (IPS) (2012), Staf kebijakan publik BEM KM IPB (2012), Wakil ketua BEM FPIK IPB (2013), Badan Harian Pusat Himpunan Mahasiswa Perikanan Indonesia (HIMAPIKANI), Ketua BEM FPIK IPB (2014) dan pada tahun (2015) aktif di organisasi kepemudaan ekstra kampus sebagai Ketua Bidang Data dan Media SDM Asosiasi Pemuda Maritim Indonesia (APMI). Selain itu penulis aktif mengikuti kegitan sosial seperti KKN Nusantara di Wakatobi (2014), bina desa sekitar kampus IPB, green belt conversation (2013) dan melakukan pengabdian penilaian dan pengembangan mutu UMKM perikanan (2014), serta inisiasi pengembangan koperasi syariah pada Desa Tenjolaya, Bogor. Penulis menerima beasiswa pendidikan (Bidik Misi) dari Pemerintah Indonesia (2011-2015). Selama aktif berorganisasi di kampus, organisasi yang penulis pimpin berhasil mendapatkan penghargaan dari Musium Rekor Muri Indonesia dan penulis pernah menjadi juara lomba orasi BEM se-jabotabek pada tahun 2012.
