APLIKASI GEN CYTOCHROME B UNTUK MENDETEKSI PEMALSUAN DENDENG SAPI OLEH DAGING BABI MENGGUNAKAN TEKNIK MULTIPLEKS PCR
ASRI RAHMADIANI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aplikasi Gen Cytochrome b untuk Mendeteksi Pemalsuan Dendeng Sapi oleh Daging Babi Menggunakan Teknik Multipleks PCR adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2016
Asri Rahmadiani NIM D14120007
ABSTRAK ASRI RAHMADIANI. Aplikasi Gen Cytochrome b untuk Mendeteksi Pemalsuan Dendeng Sapi oleh Daging Babi Menggunakan Teknik Multipleks PCR. Dibimbing oleh ASEP GUNAWAN dan TUTI SURYATI. Tujuan penelitian ini untuk mengidentifikasi pemalsuan daging babi dalam produk dendeng sapi. Primer forward didesain dengan rangkaian DNA dalam mitokondria dalam gen Sitokrom b. Primer reverse untuk spesifik rangkaian DNA sapi dan babi. Total 10 sampel dendeng sapi dengan merk dagang yang berbeda digunakan untuk mendeteksi pemalsuan oleh daging babi. Sampel diperoleh dari pasar di beberapa daerah meliputi: Bogor (BO), Depok (DP), Jakarta Selatan (JS), Jakarta Pusat (JP), dan Tangerang Selatan (TS). Sampel DNA diisolasi, kemudian diamplifikasi menggunakan multipleks PCR, dan terakhir produk PCR diamati melalui elektroforesis. Target dari produk PCR sapi dan babi masing–masing memiliki panjang 274 bp dan 398 bp. Sampel dendeng yang berhasil teramplifikasi dengan baik dan mengandung DNA sapi yaitu sampel JS1, JS3, BO, DP, JP1, dan JP2. Sampel dendeng yang tidak berhasil teramplifikasi yaitu sampel TS, JS2, JS4, dan JS5. Rata-rata primer spesifik sapi mengamplifikasi sampel yang mengandung DNA sapi adalah 100%. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa seluruh sampel dendeng tidak mengindikasikan adanya pemalsuan oleh daging babi. Kata Kunci : daging dendeng, gen sitokrom b, keamanan pangan, multipleks PCR
ABSTRACT ASRI RAHMADIANI. Applications of Cytochrome b Gene to Detect Dendeng Beef Falsification by Pork in Market using Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR). Supervised by ASEP GUNAWAN and TUTI SURYATI. The aims of this study was to identify falsification of pork as raw materials on dendeng. A forward primers was designed on a conserved DNA sequence in the mithocondria Cytochrome b gene. Reverse primers on spesific DNA sequence for cattle and pig respectively. A total 10 samples of dendeng were used in this study to determine the contamination raw materials by pork in dendeng from market in the different product brand. The samples were collected from several market region including Bogor (BO), Depok (DP), Jakarta Selatan (JS), Jakarta Pusat (JP), dan Tangerang Selatan (TS). DNA were isolated, and then spesific DNA amplification using multiplex PCR, and finally the PCR product were visualized by electrophoresis. The target of PCR product for cattle and pig were 274 bp and 398 bp respectively. Dendeng samples were successfully amplified and detected contain bovine genom, namely JS1, JS3, BO, DP, JP1, dan JP2. The samples TS, JS2, JS4, and JS5 were not successfully amplified. The average percentage of successful beef specific primers to amplify DNA samples containing a beef was 100%. It could be concluded that there is no contamination of pork on all of beef dendeng samples. Key Words : dendeng, food safety, gene cytochrome b, multiplex PCR.
APLIKASI GEN CYTOCHROME B UNTUK MENDETEKSI PEMALSUAN DENDENG SAPI OLEH DAGING BABI MENGGUNAKAN TEKNIK MULTIPLEKS PCR
ASRI RAHMADIANI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan kemurahan-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Aplikasi Gen Cytochrome b untuk Mendeteksi Pemalsuan Dendeng Sapi oleh Daging Babi Menggunakan Teknik Multipleks PCR”. Shalawat serta salam senantiasa tercurahkan kepada junjungan Nabi Muhammad SAW, keluarga, para sahabat dan umatnya hingga akhir zaman. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Asep Gunawan, SPt MSc dan Dr Tuti Suryati, SPt MSi selaku dosen pembimbing, serta Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc yang banyak memberi ilmu baru dan membimbing penulis dari awal hingga akhir penelitian. Penulis juga ucapkan terima kasih kepada Dr Ir Sri Darwati, MSi selaku dosen pembahas dalam seminar proposal penelitian, Dr Ir Henny Nuraini, MSi dan M. Sriduresta S, SPt MSc selaku dosen penguji sidang skripsi atas segala nasihat dan motivasi yang telah diberikan. Penghargaan penulis sampaikan kepada keluarga besar ABGSCi khususnya Shelvi, SSi; Isyana Khaerunisa, SPt; dan Ahmad Furqon, SPt serta semua temanteman Kurcaci 49 dari Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak yang telah membantu selama proses penelitian. Terima kasih penulis sampaikan kepada seluruh teman-teman IPTP 49 yang telah memberikan motivasi dan semangatnya terutama kepada Ana Mustafidah, Farah Fadillah dan Fauzia Kartika. Terima kasih penulis sampaikan pula kepada sahabat-sahabat SMAN 8 Kota Tangerang Selatan terutama Ridho Januardi Tanjung, Fathi Irsyad Akram dan Kamila Nur Ihsana yang telah memberikan motivasi dan membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi. Terima kasih penulis ucapkan kepada Uswatun Hasanah yang telah memberikan motivasinya. Rasa terima kasih tak terhingga penulis ucapkan kepada beasiswa Bidik Misi IPB yang telah membantu penulis selama menempuh pendidikan sarjana. Ungkapan terima kasih setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada Ayah Asrizal, Ibu Sri Murniyati Setianingsih dan seluruh keluarga besar yang tidak henti memberikan doa, dukungan, moral, materil dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2016 Asri Rahmadiani
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Ruang Lingkup Penelitian METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Alat Prosedur Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Kualitas DNA Total Amplifikasi Fragmen DNA Cyt b Spesifik pada Dendeng SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA RIWAYAT HIDUP
vi vi 1 1 2 2 2 2 2 3 3 5 5 5 7 11 11 14
DAFTAR TABEL 1. Sekuen primer untuk mendeteksi pencemaran produk daging sapi dan babi 3 2. DNA hasil isolasi sampel dendeng secara kuantitatif 6 3. Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA pada produk olahan yaitu dendeng 9
DAFTAR GAMBAR 1.
Visualisasi DNA hasil isolasi sampel dendeng secara kualitatif dari
elektroforesis gel 1% yang terdiri dari 8 sampel 5 2. Visualisasi hasil amplifikasi fragmen DNA Cyt b spesifik pada 10 sampel dendeng 8 3. Visualisasi hasil amplifikasi fragmen DNA sampel dendeng dari 4 sampel 10
PENDAHULUAN Latar Belakang Pemerintah telah berupaya melindungi konsumen dengan berbagai undangundang dan peraturan pemerintah, namun sampai saat ini pemalsuan produk pangan khususnya daging olahan masih sering terjadi. Pencampuran daging lain pada produk daging olahan biasanya bertujuan untuk menekan biaya produksi. Banyak kasus penipuan dengan penggunaan bahan-bahan yang tidak layak konsumsi dan tidak halal, sehingga dapat mengontaminasi produk. Permasalahan yang muncul adalah apabila pencampuran tersebut menggunakan jenis daging yang tidak boleh dikonsumsi oleh masyarakat tertentu terkait dengan agama dan budaya. Kehalalan makanan di Indonesia sangatlah penting karena mayoritas penduduknya beragama Islam sehingga perlu perhatian khusus. Masalah yang mendapat perhatian saat ini yaitu adanya kekhawatiran dengan tercemarnya produk makanan oleh daging babi. Contoh kasus tersebut adalah telah beredarnya isu dendeng sapi yang dicampur dengan daging babi. Hal ini mengakibatkan kekhawatiran dan keresahan masyarakat terkait dengan cemaran produk yang berasal dari daging babi dan tidak sesuai dengan PP no. 28 Tahun 2004 tentang keamanan pangan. Pada awal tahun 2009, terjadi pemalsuan dendeng sapi yang dicampur dengan daging babi di daerah Yogyakarta (BPOM 2009). Keterangan Pers no. KH.00.01.1.53.1674 tanggal 16 April 2009 menyebutkan bahwa Badan POM RI telah melakukan sampling dan pengujian terhadap 35 merk dendeng/abon sapi yang terdiri atas 15 sampel dendeng dan 20 sampel abon, yang menyatakan bahwa 5 sampel dendeng terindikasi positif mengandung DNA babi (BPOM 2009). Dendeng merupakan makanan tradisional yang cukup terkenal dan dapat juga dibuat dari jenis daging ayam, itik, kambing, babi dan sebagainya. Kandungan unsur babi dalam produk olahan daging seperti dendeng didasarkan pada pengujian jenis daging yang dijadikan bahan baku dalam pengolahannya. Hal ini mendapat perhatian utama dalam pengawasan makanan, baik pada daging segar maupun olahan. Dasar pengawasan tersebut lebih disebabkan karena adanya pertimbangan ekonomi, agama dan kepentingan nasional. Berbagai penelitian dikembangkan untuk menguji autentifikasi dalam produk pangan khususnya produk hasil ternak. Beberapa penelitian terkait uji autentifikasi terhadap produk pangan telah dilakukan untuk mengetahui cemaran dari daging selain sapi diantaranya yaitu Matsunaga et al. (1999), Maryatni (2000), Rahayu (2000), Faridah (2001), Primasari (2011), Dewi (2011), Irine (2013), dan Aryahiyyah (2014). Matsunaga et al. (1999) melaporkan metode cepat dan sederhana untuk mengidentifikasi spesies daging dan produk daging dengan menggunakan PCR. Maryatni (2000) melaporkan cara mendeteksi daging babi pada makanan dengan menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR) pada skala laboratorium. Primer yang digunakan yaitu P408 dan P131 yang keduanya dapat mengamplifikasi DNA pada lokus porcine repetitive element (PRE-1) pada babi, tetapi tidak pada daging sapi. Pada tahun yang sama Rahayu (2000) juga berhasil membuktikan potensi lokus PRE-1 sebagai penentu spesifik daging babi melalui analisis PCR. Hasil yang diperoleh yaitu lokus PRE-1 memang spesifik hanya dapat mengamplifikasi daging babi.
2
Dewi (2011) berhasil melaporkan aplikasi penggunaan gen Cytochrome b dengan teknik PCR sebagai pendeteksi campuran daging tikus pada produk bakso. Irine (2013) melaporkan aplikasi gen Cytochrome b dalam mengidentifikasi cemaran produk selain sapi diantaranya spesies anjing, kucing, dan harimau untuk menjamin keaslian produk pangan dan obat. Metode lain yang digunakan untuk mendeteksi produk cemaran pangan adalah dengan menggunakan multipleks PCR (Jain et al. 2007). Multipleks PCR telah berhasil digunakan sebagai metode yang rutin, dengan sensitivitas yang tinggi, cepat, sederhana dan tidak mahal untuk membedakan jenis hewan (Jain et al. 2007). Metode deteksi dan identifikasi jenis daging dan produk olahan terus dikembangkan sebagai salah satu upaya perlindungan konsumen dan pelaksanaan pelabelan pangan. Teknik amplifikasi DNA spesifik untuk setiap jenis hewan pada keamanan dan kehalalan pangan dapat digunakan untuk verifikasi, sertifikasi, maupun untuk monitoring. Penelitian ini dilakukan untuk mendeteksi cemaran produk dendeng sapi di pasaran dengan menggunakan PCR. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi adanya pemalsuan produk yang berasal dari daging babi pada beberapa sampel daging dendeng sapi di pasaran menggunakan teknik multipleks PCR. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang pemalsuan dendeng yang ada di pasaran. Ruang Lingkup Penelitian Penelitian ini mengidentifikasi pemalsuan produk yang berasal dari daging babi dengan menggunakan gen Cytochrome b. Lingkup penelitian ini mencakup pengumpulan sampel dari berbagai pasar tradisional dan modern, isolasi DNA, amplifikasi DNA dan elektroforesis.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan dari bulan Desember 2015 sampai bulan April 2016. Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Uji kemurnian DNA menggunakan spektrofotometer nanodrop dilakukan di Laboratorium Penelitian Institut Pertanian Bogor Culture Collection (IPBCC), Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor. Bahan Sampel DNA yang digunakan dalam penelitian ini adalah produk olahan daging yaitu dendeng. Dendeng yang digunakan diambil dari berbagai pasar diantaranya pasar tradisional dan pasar modern (swalayan). Sampel produk olahan dendeng diperoleh dari pasar di sekitar Jakarta Selatan (JS), Jakarta Pusat (JP),
3
Depok (DP), Bogor (BO) dan Tangerang Selatan (TS). Jumlah sampel DNA yang digunakan yaitu ada 10 sampel dengan nama dagang yang berbeda-beda. Pengambilan sampel dilakukan secara acak berdasarkan metode proportional random sampling (Soekartawi 2002). Bahan–bahan yang digunakan dalam penelitian adalah 1 x sodium tris EDTA (STE), sodium dodesil sulfat (SDS) 10% , 10 mg/µL proteinase-K, fenol, kloroform isoamil alkohol (CIAA), NaCl 5M, EtOH (etanol) absolut, EtOH 70%, tris EDTA (TE) 80%, agarose, larutan buffer (0.5 x TBE), ethidium bromide, loading dye, MgCl2, dNTP’s, EA 22 beef (Reverse), EA 24 pork (Reverse), EA 19 FU (Forward), enzim taq fermentas, nucleuse free water, 5 x buffer phire, taq phire dan DNA marker. Primer yang digunakan dalam amplifkasi fragmen DNA spesifik untuk sapi dan babi mengacu pada Matsunaga et al. (1999). Primer forward yang sama untuk semua jenis hewan yaitu 5’-GAC CTC CCA GCT CCA TCA AAC ATC TCA TCT TGA TGA AA-3’. Primer reverse untuk mengamplifikasi fragmen spesifik babi dan sapi dapat disajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Sekuen primer untuk mendeteksi pencemaran produk daging sapi dan babi Spesies Reverse (5’ 3’) Produk PCR Sapi CTA GAA AAG TGT AAG ACC CGT AAT ATA AG 274 bp Babi
GCT GAT AGT AGA TTT GTG ATG ACC GTA
398 bp
Sumber: Matsunaga et al. (1999)
Alat Alat-alat yang digunakan untuk penelitian adalah tabung eppendorf 1.5 mL dan 0.2 mL, rak tabung, alat penggerus, gunting, pinset, cawan petri, satu set micropippet beserta tipnya, vortex, sentrifuge, frezeer, mesin PCR eppendorf, satu set alat elektroforesis gel agarose, dan inkubator. Kemurnian DNA diukur menggunakan spektrofotometer nanodrop. Prosedur Isolasi dan Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan dengan acuan metode Sambrook et al. (1989) yang telah dimodifikasi dalam preparasi sampel dan degradasi protein oleh Andreas et al. (2010). Degradasi Protein. Sampel produk olahan dendeng diambil dengan cara dipotongpotong menggunakan gunting dan pinset kemudian masing-masing sampel di simpan dalam tabung eppendorf 1.5 mL. Sampel kemudian ditambahkan 350 µL STE dan digerus hingga halus dengan alat penggerus. Setelah itu ditambahkan 40 µL SDS 10% dan 20 µL proteinase K untuk menghancurkan membran sel dan mengeluarkan isi sel. Sampel kemudian dihomogenkan pada inkubator di suhu 55 oC selama dua jam.
4
Degradasi Bahan Organik. Setelah dihomogenkan selama dua jam sampel ditambahkan 400 µL larutan fenol, 400 µL CIAA, dan 40 µL NaCl 5M untuk memisahkan bahan organik dari asam nukleat. Sampel kemudian dihomogenkan kembali pada suhu ruang selama satu jam. Presipitasi DNA. Sampel disentrifuge dengan kecepatan 12 000 rpm pada suhu 20 oC selama lima menit. Bagian DNA (supernatant yang bening) dipindahkan menggunakan pipet sebanyak 400 µL ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL yang baru dan telah diberi label. Setelah itu ditambahkan 800 µL larutan EtOH absolut dan 40 µL NaCl 5M, kemudian dimasukkan ke dalam frezeer pada suhu -20 oC over night untuk memaksimalkan proses presipitasi DNA. Sampel larutan yang telah didiamkan over night kemudian disentrifuge pada kecepatan 12 000 rpm di suhu 20 oC selama lima menit. Sampel larutan kemudian dipisahkan kembali bagian supernatannya dan ditambahkan 800 µL EtOH 70%. Setelah itu disentrifuge kembali pada kecepatan 12 000 rpm di suhu 20 oC selama lima menit. Sampel larutan kemudian dipisahkan kembali bagian supernatannya. Langkah selanjutnya diamkan dalam keadaan terbuka sampai alkohol hilang dan sampel mengering. Setelah kering kemudian ditambahkan 100 µL TE 80% atau Elution Buffer. Sampel larutan kemudian disimpan di dalam frezeer sampai DNA akan digunakan. Pengujian DNA Total Pengujian DNA hasil ekstraksi secara kualitatif dilakukan dengan elektroforesis pada gel 1%. Gel dibuat dari 0.4 g agarose dan 30 mL larutan buffer (0.5 x TBE) yang dipanaskan. Larutan agarose dibiarkan agak dingin sambil diaduk dengan magnet stirrer , kemudian ditambahkan 2.5 µL pewarna ethidium bromide. Sebanyak 5 µL sampel DNA dilarutkan dalam 1 µL loading dye. Elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan konstan 100 volt sampai pewarna bromtimol blue mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pemotretan dengan bantuan sinar UV. Pengujian DNA hasil ekstraksi secara kuantitatif dilakukan dengan spektrofotometer nanodrop untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA. Amplifikasi Fragmen DNA Spesifik Amplifikasi ruas gen Cytochrome b dilakukan dengan metode multipleks PCR dengan mesin thermocycler. Komponen PCR yang digunakan terdiri dari 50 ng sampel DNA (termasuk DNA total genom). Sementara pereaksi PCR terdiri dari 9.95 µL nucleuse free water, 3 µL 5 x buffer, 0.2 µL EA 22 beef (reverse), 0.2 µL EA 24 pork (reverse), 0.2 µL EA 19 FU (forward), 0.4 µL d’NTPs, dan 0.05 µL Taq PHIRE. Setelah itu premix dimasukkan ke dalam tabung eppendorf kemudian dihomogenkan. Amplifikasi PCR dilakukan dengan kondisi denaturasi awal pada suhu 95 oC selama 5 detik dengan 35 siklus. Denaturasi pada suhu 95 oC selama 10 menit. Proses annealing pada suhu 60 oC selama 20 menit dan proses extension pada suhu 72 oC selama 30 menit. Langkah terakhir final extension pada suhu 72 oC selama 5 menit. Elektroforesis dan Visualisasi Produk PCR Produk PCR divisualisasi dengan teknik elektroforesis gel agarose 1%. Gel dibuat dari 0.4 g agarose dan 30 mL larutan buffer (0.5 x TBE) yang dipanaskan.
5
Larutan agarose dibiarkan agak dingin sambil diaduk dengan stirrer, kemudian ditambahkan 2.5 µL pewarna ethidium bromide. Sebanyak 5 µL produk PCR dilarutkan dalam 1 µL loading dye. Elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan konstan 100 volt atau sampai pewarna bromtimol blue mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pemotretan dengan bantuan sinar UV. Analisis Data Rataan pengulangan pengujian primer pada masing-masing sampel DNA dilakukan sebanyak dua kali dan pengulangan PCR sebanyak dua kali. Perhitungan persentase keberhasilan amplifikasi sampel yang diuji mengacu pada Nuraini (2004). Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dan dihitung persentase keberhasilan sampel DNA yang teramplifikasi dengan rumus: Persentase Keberhasilan (%) =
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝐷𝑁𝐴 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑒𝑟𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑓𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝐷𝑁𝐴 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑢𝑗𝑖
𝑥 100%
HASIL DAN PEMBAHASAN Kualitas DNA Total Sampel produk pangan dendeng telah berhasil diisolasi atau ekstraksi DNA menggunakan metode Sambrook et al. (1989). Setelah DNA berhasil diisolasi kemudian dilakukan pengujian DNA total secara kualitatif dan kuantitatif. Ekstraksi sampel dendeng ini dilakukan sebanyak dua kali ulangan. DNA sampel dendeng yang berhasil diisolasi secara kualitatif disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Visualisasi DNA hasil isolasi sampel dendeng secara kualitatif dari elektroforesis gel 1%. M: marker 100 bp; 1-6 : sampel dendeng pasaran. Karakteristik DNA hasil isolasi sampel dendeng secara kualitatif yang diperoleh dari 10 sampel menghasilkan intensitas yang berbeda-beda satu dengan yang lainnya. Metode ekstraksi menentukan kualitas DNA yang dihasilkan baik
6
secara kualitatif maupun kuantitatif. Pita DNA yang memiliki intensitas tinggi pada bagian atas menunjukkan konsentrasi DNA tinggi, begitu pula sebaliknya. Namun demikian, intensitas yang tinggi ini tidak selamanya menunjukkan konsentrasi DNA yang tinggi. Hal ini juga dapat disebabkan sampel yang telah diekstraksi kotor atau adanya kontaminasi bahan lainnya. Bumbu-bumbu yang digunakan dalam pembuatan dendeng, dapat dinyatakan bahwa bumbu-bumbu tersebut tidak terbaca sebagai DNA. Hal ini disebabkan bumbu-bumbu yang ada pada produk dendeng hanya berada pada permukaan dendeng. Menurut Nuraini (2004) bahan dan bumbu-bumbu yang ditambahkan dalam produk olahan (bakso) menyebabkan DNA yang diekstraksi masih tercampur dengan senyawa kontaminan seperti oligopeptide, polisakarida, protein, dan bahan-bahan organik lainnya. Umumnya, jaringan atau sampel mentah lebih mudah diekstraksi dibandingkan dengan jaringan atau sampel yang telah dimasak (Nuraini et al. 2012). Proses ekstraksi DNA dilakukan untuk mendegradasi protein, bahan organik dan presipitasi DNA yang terdapat dalam produk olahan. Proses ekstraksi ini dapat dilakukan dengan adanya penambahan fenol dan kloroform isoamil alkohol (CIAA) pada larutan. Menurut Muladno (2010) pemberian fenol bertujuan untuk menghilangkan protein dari larutan dengan cara mengikat protein dan sebagian kecil RNA. Kloroform diberikan untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan. Pengujian DNA total hasil ekstraksi sampel dendeng secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer nanodrop disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 DNA hasil isolasi sampel dendeng secara kuantitatif Sampel A 260 A 280 A 260/280 Konsentrasi (nm) (nm) (nm) (µg/mL) Dendeng TS 1 6.082 3.426 1.78 304.1 Dendeng TS 2 13.466 7.973 1.69 673.3 Dendeng JS 1. 1 8.467 4.487 1.89 423.4 Dendeng JS 1.2 15.196 7.797 1.95 759.8 Dendeng JS 2.1 3.897 2.275 1.71 194.9 Dendeng JS 2.2 7.866 4.911 1.60 393.3 Dendeng JS 3.1 5.760 3.287 1.75 288.0 Dendeng JS 3.2 4.897 3.069 1.60 244.9 Dendeng BO.1 4.977 3.044 1.63 248.9 Dendeng BO.2 5.244 3.101 1.69 262.2 Dendeng DP 1 8.009 4.241 1.89 400.4 Dendeng DP 2 17.644 9.359 1.89 882.2 Dendeng JP 1.1 4.980 3.009 1.65 249.0 Dendeng JP 1.2 6.085 3.646 1.67 304.3 Dendeng JS 4. 1 4.968 2.792 1.78 248.4 Dendeng JS 4.2 6.752 3.781 1.79 337.6 Dendeng JP 2.1 5.473 3.079 1.78 273.6 Dendeng JP 2.2 4.738 2.723 1.74 236.9 Dendeng JS 5.1 4.053 2.322 1.75 202.6 Dendeng JS 5.2 3.817 2.219 1.72 190.9
7
Kemurnian DNA sampel produk dendeng dapat diamati dengan menggunakan alat spektrofotometer nanodrop dengan cukup baik yang dapat dilihat pada rasio serapan A260/280 yang berkisar dari 1.60 sampai 1.95. Tingkat kemurnian DNA yang dihasilkan pada setiap sampel juga berbeda-beda dipengaruhi oleh keberadaan lemak, protein, polisakarida dan bahan organik lainnya. Keberadaan bahan kontaminan ini yang mempengaruhi tingkat kemurnian DNA yang kurang dari 1.8. Hasil kemurnian DNA yang tergolong baik dengan rasio DNA murni A260/280 adalah 1.8 (Muladno 2010). Rasio A260/280 yang kurang dari 1.8 menunjukkan bahwa DNA masih mengandung protein atau fenol (Sambrook dan Russel 2001; Clark dan Christopher 2001). Rasio A260/280 yang diatas 1.8 mengindikasikan kontaminasi RNA. RNA biasanya didegradasi dengan menambahkan RNAse, sementara protein dirusak dengan denaturasi (Siun dan Beow 2009). Beberapa sampel dendeng diatas masih memiliki tingkat kemurnian DNA kurang dari 1.8. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh sampel masih mengandung protein. Pemurnian DNA merupakan proses untuk memisahkan DNA dari lisat sel (protein, karbohidrat, lipida) dan kontaminasi bahan lainnya (Peccia et al 2006). Lisis merupakan perusakan dinding dan melepaskan DNA. Diperkuat menurut (Nuraini 2004) sel yang berasal dari kulit dan produk dendeng memerlukan waktu lisis relatif lama dibandingkan sel yang berasal dari jaringan yang lebih halus. Konsentrasi dari DNA hasil ekstraksi bervariasi dari 190.9 - 882.2 µg mL-1. Konsentrasi DNA yang diperoleh berbeda-beda pada setiap sampelnya. Perbedaan ini dimungkinkan perlakuan selama proses ekstraksi DNA yang dilakukan secara manual dan juga perbedaan faktor bahan/sampel yang diteliti. Adanya bahan campuran dalam suatu produk mempengaruhi konsentrasi DNA yang dihasilkan. Konsentrasi DNA yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 50 µg mL-1. Sampel yang memiliki konsentrasi DNA diatas 50 µg mL-1 dilakukan pengenceran dengan menambahkan air destilata (Nuraini et al. 2012). Penggunaan sampel dengan konsentrasi DNA yang sama dilakukan agar keberhasilan amplifikasi seragam. Produk olahan daging seperti dendeng terbuat dari bahan utama berupa daging dan bahan tambahan sebagai campuran seperti tepung, pewarna makanan dan bumbu-bumbu. Hal ini pula yang menyebabkan perbedaan konsentrasi DNA yang terekstraksi. Perlakuan dalam pembuatan produk olahan tersebut dapat menjadi penyebab kesulitan pada saat isolasi dan ekstraksi DNA (Primasari 2011). Pengambilan sampel pada produk olahan dilakukan secara acak sebagai upaya agar didapatkan sampel campuran produk olahan yang seragam. Jumlah sampel yang diambil yaitu sebanyak 0.075 g yang disimpan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL. Bobot sampel yang terlalu besar akan mempersulit proses penghancuran sampel di dalam tabung eppendorf. Apabila bobot sampel yang digunakan terlalu sedikit maka akan sedikit konsentrasi DNA yang dihasilkan (Aryahiyyah 2014). Amplifikasi Fragmen DNA Cyt b Spesifik pada Dendeng Amplifikasi fragmen DNA Cyt b spesifik pada dendeng berhasil diamplifikasi dengan suhu annealing 60oC selama 20 menit. Hasil amplifikasi fragmen DNA Cyt b spesifik sampel dendeng yang dapat teramplifikasi menggunakan teknik multipleks PCR disajikan pada Gambar 2.
8
Gambar 2 Visualisasi hasil amplifikasi fragmen DNA Cyt b spesifik pada 10 sampel dendeng. M: marker 100 bp; S: kontrol DNA sapi; B: kontrol DNA babi; SB: kontrol DNA campuran sapi:babi; TS: sampel asal Tangerang Selatan, JS: sampel asal Jakarta Selatan; BO: sampel asal Bogor; DP: sampel asal Depok; JP: sampel asal Jakarta Pusat; DW: Kontrol negatif (-). Ada beberapa metode untuk mendeteksi adanya cemaran produk pangan diantaranya melalui metode yang didasarkan pada pemisahan fraksi protein (elektroforesis, kromatografi, teknik immunologi), multipleks PCR, dan marker spesifik penciri cemaran produk seperti gen sitokrom b (Cyt b). Cytochrome b (Cyt b) adalah salah satu bagian dari sitokrom yang terlibat dalam tranportasi elektron dalam mitokondria. Cyt b berisi delapan transmembran heliks yang dihubungkan oleh intermembran atau dominan ekstramembran. Gen Cyt b dikodekan oleh DNA mitokondria (Widayanti 2006). Sampel TS, JS2, JS4 dan JS5 menunjukkan tidak dapat teramplifikasi melalui proses multipleks PCR. Hal ini kemungkinan disebabkan sampel yang ada tidak terbuat dari daging sapi atau babi, sehingga tidak teridentifikasi menggunakan marker/penanda spesies. Hasil penampakan dari keempat sampel tersebut memiliki tekstur yang lembut bukan seperti serat daging, warna yang lebih cerah dan juga dapat diperoleh dengan harga yang relatif murah. Pemalsuan atau penipuan daging dan produk olahan dapat dikategorikan ke dalam beberapa kelompok pemalsuan. Pemalsuan yang mungkin terjadi dapat disebabkan dari asal daging, substitusi daging, perlakuan pada saat pengolahan daging dan penambahan bahan lain. Pengelompokan tersebut didasarkan pada substitusi daging diantaranya yaitu substitusi sumber daging lain, lemak dan protein (Ballin 2010). Pemalsuan produk olahan daging ini dilakukan kemungkinan untuk mendapatkan laba yang tinggi dan menekan biaya produksi. Produk olahan yang tidak berhasil teramplifikasi memiliki harga yang relatif murah yang berkisar dari Rp10 000 hingga Rp25 000 per 200 gram. Amplifikasi daerah gen Cyt b DNA mitokondria telah berhasil dilakukan oleh Matsunaga et al (1999) pada kambing, ayam, sapi, domba, babi dan kuda.
9
Primer forward yang digunakan dalam penelitian ini adalah EA 19 FU (Forward), sedangkan primer reverse yang digunakan adalah EA 22 Beef (Reverse) dan EA 24 Pork (Reverse). Primer adalah oligonukleotida berukuran pendek (18-24 pb) yang menempel di tempat spesifik pada DNA template (cetakan). Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA yang berasal dari produk olahan yaitu dendeng sapi pada penelitian ini disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA pada produk olahan yaitu dendeng Keberhasilan Sampel PCR ke-1 PCR ke-2 amplifikasi/sampel (%) Sapi Babi Sapi Babi Sapi Babi Sapi + + 100 Babi + + 100 Sapi+Babi + + + + 100 100 TS 1 TS 2 JS 1.1 + + 100 JS 1.2 + + 100 JS 2.1 JS 2.2 JS 3.1 + + 100 JS 3.2 + + 100 BO 1 + + 100 BO 2 + + 100 DP 1 + + 100 DP 2 + + 100 JP 1.1 + + 100 JP 1.2 + + 100 JS 4.1 JS 4.2 JP 2.1 + + 100 JP 2.2 + + 100 JS 5.1 JS 5.2 Kontrol Negatif (Air) Keterangan : + DNA teramplifikasi; - DNA tidak teramplifikasi
Amplifikasi fragmen DNA Cyt b pada dendeng ini menggunakan kontrol positif yaitu kontrol DNA sapi, kontrol DNA babi, dan kontrol DNA campuran sapi dan babi. Kontrol positif diperoleh dari sumber darah sapi dan babi. Kontrol positif (+) dan kontrol negatif (-) diperlukan untuk memastikan bahwa pereaksi PCR (premix) atau primer yang digunakan dalam proses PCR berfungsi dengan baik. Selain itu kontrol negatif diperlukan untuk memastikan bahwa seluruh sampel yang telah di premix tidak mengalami kontaminasi. Persentase keberhasilan rata-rata primer spesifik sapi mengamplifikasi sampel yang mengandung DNA sapi yaitu 100%, artinya pita muncul pada semua
10
sampel yang mengandung DNA sapi dengan dua kali ulangan PCR. Persentase keberhasilan rata-rata primer spesifik babi mengamplifikasi sampel yang mengandung DNA babi yaitu 100%, artinya pita muncul pada sampel yang mengandung DNA babi dengan dua kali ulangan PCR. Persentase keberhasilan rata-rata primer spesifik sapi dan babi mengamplifikasi sampel yang mangandung DNA sapi dan babi yaitu 100%. Hasil amplifikasi fragmen DNA sampel dendeng TS, JS2, JS4 dan JS5 menunjukkan bahwa sampel dendeng tersebut smear atau tidak teramplifikasi dengan baik (Gambar 3). Hasil smear atau tidak teramplifikasi ini kemungkinan juga disebabkan DNA sampel dari hasil isolasi memiliki tingkat kemurnian yang rendah dan jumlah sampel yang digunakan kemungkinan terlalu banyak. Kandungan DNA yang terdapat pada dendeng tersebut mungkin berasal dari tepung, bahan tambahan lain atau hewan lain (selain sapi dan babi). Hal ini merupakan suatu bentuk pemalsuan informasi terhadap konsumen, seiring dengan permintaan pasar yang pesat dengan harga yang tinggi (Wetton et al. 2004). Sampel dendeng TS, JS2, JS4 dan JS5 ini telah dilakukan proses PCR secara berulang-ulang namun hasil yang diperoleh tetap menunjukkan tidak teramplifikasi dengan baik, dibandingkan dengan sampel JS3 yang tetap teramplifikasi.
Gambar 3
Visualisasi hasil amplifikasi fragmen DNA Cyt b spesifik pada 5 sampel dendeng. M: marker 100 bp; S: kontrol DNA sapi; B: kontrol DNA babi; SB: kontrol DNA campuran sapi:babi; TS: sampel asal Tangerang Selatan, JS: sampel asal Jakarta Selatan; DW: Kontrol negatif (-).
11
Berdasarkan hasil amplifikasi DNA sampel dendeng yang diperoleh terdapat 6 sampel dendeng yang berhasil diamplifikasi. Keberhasilan amplifikasi tersebut mengidentifikasikan bahwa sampel yang diuji mengandung DNA sapi. Namun demikian, terdapat 4 sampel dendeng yang tidak berhasil teramplifikasi. Berdasarkan data tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut tidak mengindikasikan adanya pemalsuan produk pangan yang berasal dari daging babi. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Sampel dendeng yang berhasil teramplifikasi dengan baik dan mengandung DNA sapi yaitu sampel JS1, JS3, BO, DP, JP1, dan JP2. Total sampel dendeng yang tidak berhasil teramplifikasi mengindikasikan tidak mengandung daging sapi ataupun babi yaitu sampel TS, JS2, JS4, dan JS5. Dengan demikian dapat dipastikan bahwa seluruh sampel yang diamati tidak mengindikasikan adanya pemalsuan dengan menggunakan daging babi. Saran Penentuan spesifikasi sampel produk olahan untuk mendeteksi pencemaran produk olahan yang belum dapat teramplifikasi perlu dideteksi dengan menggunakan primer selain sapi dan babi. Identifikasi pencemaran produk pangan dapat dilakukan dengan sampel produk olahan daging sapi lainnya yang ada di pasaran. DAFTAR PUSTAKA [BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2009. Dendeng sapi diisi oleh daging babi. Jakarta (ID): BPOM Indonesia. Ali ME, Hashim U, Mustafa S, Che Man YB, Dhani TS, Kashif M, Uddin MK, Abd Hamid SB. 2012. Analysis of pork adulteration in commercial meatballs targeting porcine-specific mitochondrial Cytochrome b gene by Taqman probe real-time polymerase chain reaction. Meat Sci. 91: 454-459. doi: 10. 1016/j.meatsci.2012.02.031. Andreas E, Sumantri C, Nuraini H, Farajallah A, Anggraeni A. 2010. Identification of GH| AluI genes polymorphisms in indonesia buffalo. Indonesian Trop Anim Agric. 35:25-221. Aryahiyyah, I. 2014. Verifikasi metode ekstraksi fenol kloroform untuk isolasi DNA pada daging dan produk olahan [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Ballin NZ. 2010. Authentificaton of meat and meat product. Meat Sci. 86: 577-587. Budi, J., T. Lebang dan A.S. Riyanto. 2000. Celeng oplosan masuk pasar. Tempo. 20 Agustus 2000. Clark W, Christopher K. 2001. Spectrophotometry, Degradation, and the ‘Frankengel’ Experiment. Canada (CA): University of Alberta.
12
Dewi, C. 2011. Aplikasi penggunaan gen sitokrom b dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) sebegai pendeteksi campuran daging tikus pada produk bakso [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Faridah, I. 2001. Aplikasi teknik polymerase chain reaction (PCR) untuk mendeteksi pencemaran bakso oleh daging babi di wilayah bogor [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH, Vogt PH. 1997. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. BioTech. 23: 504-511. Irine. 2013. Penggunaan gen sitokrom b (cyt b) dalam identifikasi spesies anjing, kucing, dan harimau untuk menjamin keaslian produk pangan dan obat [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Jain S, Brahmbhait MN, Rank DN, Joshi CG, Solank JV . 2007 . Use of cytochrome b gene variability in detecting meat species by multiplex PCR assay. Indian J Anim Sci. 77:649-653. Jain S, Brahmbhati MN, Rank DN, Joshi CG, Solank JV. 2007. Use of cytochrome b gene variability in detecting meat species by multipleks PCR assay. Indian J Anim Sci. 77: 880-881. Maryatni, D. 2000. Deteksi daging babi dalam makanan jadi melalui uji DNA [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Matsunaga, T., Chikuni, K., Tanabe, R., Moruya, S., Shibata, K., Yamada, J., Shinmura,Y. 1999. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51: 143-148. Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor (ID). IPB Pr. Nuraini H. 2004. Pengembangan sekuen porcine repetitive element (PRE-1) sebagai penanda molekuler untuk mendeteksi material babi pada produk daging olahan. [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Nuraini H, Primasari A, Andreas E, Sumantri C. 2012. The use of cytochrome b gene as a specific marker of the rat meat (Rattus norvegicus) on meat and meat product. Media Petern. 35: 15-20. doi: 10.5398/medpet. 2012.35.1.15. Peccia, J., Hernadez, M. 2006. Identification population characterization and quantification of microorganism into aerosol. Atmospheric Environment. 40: 3941-3961. Primasari, A. 2011. Sensitivitas gen sitokrom b (Cyt b) sebagai marka spesifik pada genus Rattus dan Mus untuk menjamin keamanan pangan produk asal daging [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Rahayu, I. P. 2000. Potensi lokus PRE – 1 sebagai penentu spesifik daging babi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Rompler et al. 2006. Protocol multiplex amplification of ancient DNA. Nature. 2 (1): 720-728. Sahillah AM, Norhayati Y, Norrakiah AS, Aminah A, Wan Aida WM. 2011. Halal autentification of raw meats using PCR amplification mitochondrial DNA. Int Food Res J. 18(4): 1489-1491. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Ed ke-2. New York (USA): Cold Spring Harbour Laboratory Pr. Sambrook J, Russel D. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke-3. United State (US): CSH Laboratory Pr. Siun CT, Beow CY. 2009. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J. Biomed Bioltechnol. doi: 10.1155/2009/574398.
13
Wetton JH, Tsang CSF, Roney CA, Spriggs AC. 2004. An extremely sensitive species-specific ARMS PCR test for the presence of tiger bone DNA. Forensic Sci Int. 126: 137-144. doi: 10.1016/S0379-0738(02)00045-2. Widayanti R. 2006. Kajian penanda genetik gen cytochrome b dan daerah D-Loop pada Tarsius sp [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
RIWAYAT HIDUP Penulis bernama Asri Rahmadiani dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 Februari 1994 dari pasangan ayah Asrizal dan ibu Sri Murniyati. Penulis merupakan anak tunggal dari pasangan ini. Penulis menyelesaikan pendidikan di SDN Pamulang Timur 2 tahun 2006, SMPN 2 Kota Tangerang Selatan tahun 2009, SMAN 8 Kota Tangerang Selatan tahun 2012. Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN undangan pada program studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (IPTP). Selama menjadi mahasiswi penulis memperoleh beasiswa Bidik Misi IPB selama 8 semester. Kegiatan penulis di luar akademik yaitu menjadi asisten praktikum Teknik Pengolahan Limbah tahun ajaran 2014/2015, asisten praktikum Teknik Pengolahan Telur dan Daging Unggas tahun jaran 2015/2016, anggota Himpunan Produksi Ternak 2013/2014, Badan Pengurus Harian Bidik Misi Turun Desa pada tahun 2012/2013 dan tahun 2013/2014, Koordinator Fakultas Peternakan BidikMisi IPB, bendahara kelas P01 tahun 2012/2013 serta serangkaian kepanitiaan kegiatan di dalam dan di luar kampus. Prestasi yang pernah diraih oleh penulis selama kuliah yakni, PKM Kewirausahaan didanai DIKTI tahun 2015/2016.
