ISOLASI DAN KARAKTERISASI Salmonella spp. DI LINGKUNGAN RUMAH POTONG AYAM DI KOTA MALANG ISOLATION AND CHARACTERISATION OF Salmonella spp. IN MALANG SLAUGHTERHOUSE Silvia A. Kusuma, Masdiana C. Padaga, Dyah K. Wuragil Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya Email :
[email protected] ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya cemaran dan keragaman Salmonella spp., di Lingkungan RPA. Sampel yang diteliti meliputi bulu ayam pasca pemotongan, air limbah cucian karkas, dan air minum ayam di RPA. Isolasi dan karakterisasi dilakukan berdasarkan sifat fenotipe serta profil pita protein menggunakan metode SDS-PAGE. Hasil penelitian menunjukkan adanya cemaran Salmonella spp. yang tinggi yaitu lebih dari 106 cfu/ml. Pada penanaman di media XLD secara duplo dihasilkan 96 koloni dugaan Salmonella. Berdasarkan kemampuan tumbuh dan pengamatan morfologi koloni dihasilkan 25 isolat dugaan Salmonella, kemudian dilanjutkan uji biokimia dan uji serologi, dari uji tersebut dihasilkan 9 isolat yang menunjukan karakter Salmonella spp. Analisis pita protein dengan metode SDS-PAGE dapat terdeteksi pita protein dengan berat molekul 20,19 kDa, merupakan protein SefA yang dimiliki Salmonella enteriditis yaitu isolat L2A1, dan D1A2, pita protein dengan berat molekul 36,3 kDa yang merupakan protein adhesion fimbrae yang dimiliki Salmonella typhimurium yaitu isolat L2C2,B2A2, L1A2, dan L1B2, dan pita protein dengan berat molekul 25 kDa merupakan Salmonella arizonae adalah isolat B2A1, D2C2, dan D1C2. Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini yaitu terdapat cemaran Salmonella spp. dan keragaman Salmonella spp. di lingkungan RPA.
Kata kunci : Salmonella spp., rumah potong ayam, cemaran, keragaman.
This study was aimed to discover distribution and diversity of Salmonella spp. from samples in slaughterhouse. Samples taken from feathers after slaughtering, wasted water, and drink water in slaughterhouse. Isolation and characterization is started based on phenotype character of protein profile using SDS-PAGE method. This study showed that contamination of Salmonella spp. more than 106 cfu/ml. Bacterial growth in Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD) has resulted 96 colony assumptive of Salmonella spp, after morphology observation resulted 25 assumptive Salmonella spp. The process had been continued by biochemistry test and serology test, resulted 9 isolates shown as Salmonella spp. Analized of protein profile using SDS-PAGE showed that band with 20,19 kDa weight molecules was SefA protein from Salmonella enteriditis were isolates L2A1, and D1A2, and band with 36,3 kDa weight molecules was adhesion fimbrae protein of Salmonella typhimurium were found in L2C2, B2A2, L1A2, and L1B2. The last, 25 kDa of weight molecules protein to be Salmonella arizonae were found in B2A1, D2C2 and D1C2. This study concluded that there were Salmonella spp. of contamination and variety of Salmonella taken from poultry slaughterhouse.
Key words: Salmonella spp., slaughterhouse, contamination, diversity.
PENDAHULUAN Dewasa ini kebutuhan daging ayam meningkat, seiring meningkatnya kebutuhan daging ayam di masyarakat maka perlu adanya jaminan keamanan pangan (food safety) disetiap tahapan dari mata rantai penyediaan daging ayam. Tahapan mata rantai berasal dari peternakan sampai meja makan (from farm to the table) perlu dilakukan untuk mewujudkan kesehatan masyarakat. Daging ayam selain sebagai sumber nutrisi bagi tubuh, juga merupakan media pertumbuhan yang baik bagi mikroorganisme patogen. Salah satu mikroorganisme patogen yang penting dari aspek kesehatan masyarakat dan keamanan pangan adalah Salmonella. Cemaran Salmonella pada daging ayam salah satunya dapat disebabkan oleh kondisi di lingkungan RPA. Dalam tahapan pemotongan ayam, mikroorganisme dapat dengan mudah mengkontaminasi daging ayam. Hal ini dikarenakan mikroorganisme dapat dengan mudah tumbuh di lingkungan RPA yang kotor (Purnawijayanti, 2001). Ada banyak mikroorganisme yang terdapat di RPA, diantaranya Salmonella spp. Daging ayam merupakan salah satu sumber penularan Salmonella. Infeksi bisa terjadi ketika adanya kontaminasi dari air yang digunakan saat pembersihan karkas dan eviserasi yang dilakukan di RPA. Tingkat cemaran Salmonella di rumah potong tergantung pada kebersihan pemotongan (Lawrie & Ledward, 2006; Humphrey, 2006). Selama tiga tahun berturutturut Salmonella dijumpai sebagai penyebab keracunan pangan di Indonesia dan kemungkinan terjadinya berkisar antara 12,5% hingga 25% dari cemaran mikroba (Anonymous, 2010). Penelitian terkait cemaran Salmonella perlu dilakukan pada spesifik area di antaranya di lingkungan RPA. Hal ini dibutuhkan dalam rangka pencegahan dan pengendalian pencemaran sehingga dapat memberikan jaminan keamanan pangan (food safety) bagi kesehatan masyarakat.
MATERI DAN METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara magnetic stirer, pengocok tabung (vortex) (Barnstead thermolyne), inkubator (MMM Medcenter), penangas air (Maspion), autoklaf (Model 25x), refrigerator, mikroskop, LAF (Laminar Air Flow) (Nuaire labgard class II), foto digital mikroskopik (olympus CX41), object glass, cover glass, eppendorf,seperangkat alat elektroforesis. Sedangkan bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu larutan pengencer Peptone Water (PW), aquades, Selenite cysteine broth, Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) (Oxoid CM0469), Nutrient agar (Oxoid CM0003), urea (oxoid 40), sukrosa (Merck K19271151), maltosa (Merck K201889), methyl red (CM0043), beef exstract (Hiebdia), manitol, maltosa (K20188911), yeast exstract (LP0021), laktosa, gliserol (Merck K20663194), Na2HPO4 (Merck M.I. 06586500), alkohol 70 %, H2O2, KOH, oksidase kit, media MR-VP (CM 0043), TSIA (Oxoid CM02573), NaCl (Merck 34022504448). Larutan normal saline (0.85% sodium chloride), Salmonella polyvalent somatic O antiserum (Pro Labs Diagnostics), Acrylamide Bis (30% T, 2,67% C), 1,5 M Tris HCl pH 8.8, 0.5 M Tris-HCl pH 6,8, 10 % SDS, Ammonium persulfate, 0.1% SDS pH 8.3, inhibitor protease 1 mM PSMF, 0,3 % Tris, 1,44% glycine, 0,1% SDS, Coomassie blue R250 (MP001), β-merkaptoetanol, 10 % acetic acid glacial, Page Ruler TM Prestained Protein Ladder Plus (SM1811). Prosedur Penelitian Preparasi Sampel Penelitian ini menggunakan tiga sampel yaitu bulu ayam pasca pemotongan, air limbah cucian karkas, dan air minum ayam yang diambil di 2 lokasi RPA. Pengambilan sampel dilakukan dengan 3 ulangan dan pada setiap sampel dilakukan duplo. Sampel tersebut masing-masing dimasukkan ke dalam wadah steril pada suhu 5ºC untuk menghentikan aktivitas mikroba.
Isolasi Salmonella Isolasi Salmonella dengan menggunakan uji mikrobiologi yang berdasarkan pada SNI 2897 : 2008. Sampel yang di ambil dimasukkan ke dalam botol steril pada suhu 5°C. Sampel yang telah dikoleksi dilakukan pengenceran secara berseri (10-1, 10-2, 10-3, 10-4,10-5, 10-6, 10-7) menggunakan pepton water steril. Hasil pengenceran 10-3,10-5, 10-7ditanam pada media pengayaan Selenite cysteine broth (SCB) dan diinkubasi selama 20 jam kemudian diambil 1 ml dan diinokulasikan pada media XLD (xylose-lysine-deoxycholate) secara spread dan duplo. Kemudian diinkubasi pada temperatur 37º C selama 24-48 jam. Pada media XLD koloni terlihat hitam mengkilap, dan pingir transparan. Setelah itu dilakukan pemurnian untuk mendapat koloni tunggal. Target pemurnian adalah setiap koloni yang diduga merupakan Salmonella spp. Karakterisasi Salmonella Karakterisasi isolat Salmonella berpedoman pada Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria (Barrow & Feltham, 1993). Sifat yang diamati meliputi morfologi koloni dan morfologi sel. Karakterisasi biokimiawi dilakukan dengan
menggunakan uji biokimia diantaranya uji urease, Methyl Red (MR), Simmon Citrate Agar (SCA), Katalase, TSIA (Triple sugar iron agar), uji gula-gula (manitol, maltosa, laktosa, sukrosa), oksidase dan uji serologi. Hasil karakterisasi yang diperoleh digunakan dalam metode UPGMA (Unwighted pair group method using arithmetic averages) untuk mengetahui nilai similaritas. Analisa Profil Protein BAL menggunakan SDSPAGE (Rantam, 2003. Analisis profil pita protein menggunakan 9 isolat yang dipilih berdasarkan uji sebelumnya. Langkah awal dalam metode SDS-PAGE yaitu isolasi protein, pembuatan gel dan elektroforesis. setelah tahapan pewarnaan dan dilakukan pengukuran berat molekul protein. HASIL DAN PEMBAHASAN Cemaran Salmonella spp. di Lingkungan Rumah Potong Ayam Rerata jumlah koloni bakteri dugaan Salmonella spp. pada penelitian ini disajikan dalam Tabel 1.
Tabel 1. Perhitungan jumlah koloni Salmonella spp. pada Lingkungan RPA Tempat Mertojoyo Sawojajar
B (Bulu) 1,4 ± 0,8 1,2 ± 0,9
Tabel 1 menunjukkan bahwa sampel yang diambil dari ke dua lokasi RPA terdapat cemaran Salmonella. Cemaran Salmonella tertinggi pada air limbah cucian karkas dan terendah pada bulu pasca pemotongan. Banyaknya jumlah Salmonella pada penelitian ini tidak sesuai dengan syarat yang telah ditetapkan oleh SNI 7388 : 2009 yang menyatakan bahwa batas maksimum cemaran mikroba dengan jumlah Salmonella yaitu negatif koloni/25 g. Cemaran Salmonella di RPA Mertojoyo lebih tinggi daripada RPA Sawojajar.
Jumlah koloni (106 cfu/ml)* L (air limbah) 6,9 ± 2,5 5,5 ± 2,7
D (air minum ) 3,3 ± 0,6 5,1 ± 2,7
Tingginya cemaran dapat dikarenakan beberapa faktor, yaitu perbedaan proses pencucian karkas, dimana RPA Sawojajar memiliki ketersediaan air yang cukup baik, jarak penampungan ayam sebelum dipotong dengan tempat pemotongan ayam cukup jauh sehingga penyebaran Salmonella dapat ditekan. Proses eviserasi di RPA Mertojoyo dan RPA Sawojajar dilakukan secara manual sehingga dapat berpotensi menimbulkan pencemaran pada karkas. Kontaminasi Salmonella pada daging ayam tidak hanya terjadi saat proses pemotongan ayam, tetapi juga dapat terjadi
pencemaran dari lingkungan pemotongan yang tercemar (Hulankova, 2010). Cemaran Salmonella pada bulu ayam berasal dari feses yang menempel pada kaki dan bulu ayam. Kondisi alat pencabut bulu yang hangat dan lembab menjadi salah satu faktor meningkatnya pertumbuhan Salmonella (Nde et al., 2007). Pada air limbah cucian karkas terdapat cemaran Salmonella yang cukup tinggi, dikarenakan pemakaian air dari sanitasi yang kurang baik dalam proses pemotongan dan eviserasi, sehingga dapat meningkatkan jumlah cemaran Salmonella di dalam daging ayam. Salmonella dapat dengan mudah mengkontaminasi dari satu karkas ke karkas lain melalui tangan pekerja. Menurut pendapat Sophie et al., (2010) bahwa umumnya sumber cemaran Salmonella di lingkungan RPA berasal dari proses pemotongan, kotoran yang dikeluarkan dari organ digestive, dan peralatan yang digunakan oleh pekerja. Pada air minum ayam terdapat cemaran Salmonella, cemaran ini berasal dari feses dan serangga yang mencemari
air minum ayam. Hal ini sesuai dengan pendapat Brands (2006) bahwa lingkungan yang dapat menjadi tempat menetap Salmonella adalah tanah, air dan serangga. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tingginya cemaran Salmonella pada lingkungan RPA dapat disebabkan karena kontaminasi silang. kontaminasi silang adalah pencemaran pada bahan makanan melalui perantara (Purnawijayanti, 2001). Perantara utama meliputi peralatan, serangga, atau manusia yang menangani bahan pangan tersebut dan proses eviserasi. Isolasi dan Karakterisasi Salmonella spp. Karakterisasi isolat dilakukan berdasarkan sifat morfologi dan biokimia yang mengacu pada Manual for the Identification of Medical Bacteria (Barrow dan Feltham, 1993) dan SNI 2897:2008. Berdasarkan hasil uji biokimia dan uji serologi dari 25 isolat yang telah diisolasi ada 9 isolat yang menunjukkan karakter Salmonella spp.
Tabel 2 Hasil Uji Biokimia dan Serologi Polyvalent Somatic (O) Salmonella spp. Uji Biokimia
TSIA Katalase Oksidase Sukrosa Laktosa Manitol Maltosa Simmon citrate Urease Metyl red Uji Serologi
L2C2 (1) + + + + + + +
L1A2 (2) + + + + + + +
L1B2 (3) + + + + + + +
B2A2 (4) + + + + + + +
Kode Isolat B2A1 L2A1 (5) (6) + + + + + + + + + + + + + +
D1C2 (7) + + + + + +
D1A2 (8) + + + + + +
D2C2 (9) + + + + + +
Keterangan : (+) : Reaksi positif ; (-) : Reaksi negatif Nama isolat (1-9), notasi ke-1 : jenis sampel : L (Limbah), B (Bulu), D (air minum); notasi ke-2: tempat 1 ( RPA Mertojoyo), 2 ( RPA Sawojajar); notasi ke-3 : jenis koloni; notasi ke-4 : nomor koloni.
Hasil uji biokimia menunjukkan bahwa Salmonella spp. bersifat fakultatif anaerob, katalase positif, oksidase negatif, tidak mampu memfermentasi sukrosa dan laktosa, terjadi reaksi fermentasi terhadap manitol dan maltosa positif, simmon citrate positif, menghasilkan H2S pada media TSIA dan urease negatif. Konfirmasi pendugaan Salmonella spp. dengan menggunakan uji serologi yaitu uji polyvalent somatic (O) dengan mengemulsikan biakan dari media TSIA miring. Hasil positif
ditunjukkan dengan adanya aglutinasi antara biakan isolat Salmonella dengan antiserum polyvalent somatic (O) (FDA, 2011). Hasil karakterisasi dapat dilakukan pendugaan isolat Salmonella spp. berdasarkan nilai uji similaritas masing-masing isolat yang disajikan dalam bentuk fenogram untuk mengetahui jarak kedekatan antara isolat Salmonella hasil isolasi dengan isolat Salmonella acuan.
Tabel 3. Pengelompokan isolat Salmonella spp. hasil karakterisasi berdasarkan nilai uji similaritas. Kode Isolat L2C2 B2A2 L2A1 L1A2 D1A2 L1B2 B2A1 D1C2 D2C2
Sumber Isolat Air limbah 2 Bulu 2 Air limbah 2 Limbah 1 Air minum 1 Air limbah 1 Bulu 2 Air minum 1 Air minum 2
Nilai Similaritas 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,930 0,930 0,930
Tabel 3 menunjukkan nilai similaritas yaitu isolat yang termasuk dalam dugaan Salmonella sub genus I (S. kauffinannii; S. enterica), Salmonella sub genus II (S. salamae; S. dar-es-salaam), dan Salmonella sub genus IV (S. houtenae) adalah L2C2, B2A2, L2A1, L1A2, D1A2, L1B2 dengan nilai similaritas 1. Hal ini menunjukkan bahwa isolat tersebut mempunyai tingkat kesamaan yang tinggi terhadap isolat acuan. Nilai similaritas mendekati 1 menunjukan bahwa ada kemungkinan isolat tersebut dari genus dan spesies yang sama. Kelompok ke dua terdiri dari isolat D2C2, D1C2, B2A1 termasuk dalam kategori Salmonella sub genus III (S. Arizona arizonae, S. hinshawii; S. arizonae) mempunyai nilai similaritas 0,930, dimana mempunyai tingkat kesamaan lebih rendah dari isolat acuan. Hal ini didukung dari penelitian yang dilakukan
Dugaan Isolat Salmonella spp. (sub genus I, sub genus II, sub genus IV)
Salmonella spp. (Salmonella sub genus III)
Kim et al., (2007) yang mengemukakan bahwa jenis S. heidelberg, S. virchow, S. enteritidis, dan S. blockley merupakan jenis Salmonella spp. yang banyak di temukan di RPA. Analisis profil pita protein Salmonella spp. Analisis profil pita protein nmenggunakan 9 isolat yang dipilih berdasarkan uji sebelumnya. Karakterisasi profil pita protein dari 9 isolat Salmonella spp. dapat dibedakan menjadi 2 kelompok dapat dilihat pada Gambar 1. Hasil elektroforesis terdeteksi pita protein dengan nilai berat molekul tertinggi yaitu 111,918 kDa dan terendah yaitu 9,05 kDa. Berdasarkan Gambar 1. menunjukkan bahwa isolat Salmonella spp. hasil isolasi mempunyai karakteristik pita protein yang sama.
M
K (1) K (2) Gambar 1. Profil pita protein berdasarkan kelompok nilai similaritas Keterangan : K (1) = kelompok isolat bakteri 1 K (2) = kelompok isolat bakteri 2
Secara umum hasil analisis profil pita protein dengan menggunakan SDS-PAGE, menunjukkan isolat Salmonella spp. banyak memiliki kemiripan pita protein. Aksakal (2010) menjelaskan bahwa jika dibandingkan antara pita protein S. enteridis dengan S. agona, S. virchow, S. anatum, S. typimurium, maka tidak ada perbedaan pita profil protein yang terlalu signifikan. Mengacu pada pengelompokan berdasarkan nilai similaritas (Tabel 3), kelompok 1 yaitu isolat L2C2, L2A1, B2A2, L1A2 dan L1B2 memiliki karakteristik yang sama ditunjukkan dengan adanya 3 pita protein dengan berat molekul yang sama yaitu 36,37 kDa, 26,38 kDa, 22,47 kDa (Gambar 1). Antara isolat L2C2 dan B2A2 memiliki kemiripan yang lebih tinggi yang ditunjukkan dengan adanya 8 pita protein dengan berat molekul yang sama. Berdasarkan Gambar 1, menunjukkan bahwa isolat L2C2, B2A2, L1A2 dan L1B2 merupakan isolat kelompok 1 memiliki pita protein dengan berat molekul yang sama yaitu
36,37 kDa, dimana profil pita protein tersebut merupakan pita protein S. typimurium. Menurut penelitian Kundera (2012) hasil perhitungan berat molekul pada S. typhimurium terdeteksi protein adhesion fimbriae pada berat molekul 36,3 kDa. Berdasarkan hasil analisis profil pita protein isolat L2A1 dan D1A2 mempunyai berat molekul 20,19 kDa, dimana dari pita protein tersebut merupakan jenis protein dari S.enteriditis. Kisiela et al., (2003) melaporkan bahwa pada S. enteriditis ditemukan protein spesifik SefA pada berat molekul 20 kDa. Hal ini sesuai dengan nilai similaritas yang menunjukkan bahwa kelompok 1 meliputi Salmonella sub genus I, Salmonella sub genus II, dan Salmonella sub genus IV, dimana S. typhimurium dan S. enteriditis termasuk dalam Salmonella sub genus I yaitu S. enterica serovar typhimurium dan S. enterica serovar enteriditis. Isolat B2A1, D2C2, D1C2 yang merupakan isolat kelompok 2 memiliki 3 pita protein dengan berat molekul yang sama yaitu 106,68 kDa, 62,12 kDa,25 kDa. Berdasarkan nilai similaritas, isolat B2A1, D2C2, D1C2
memiliki protein dengan berat molekul yang sama yaitu 25 kDa, dimana termasuk dalam Salmonella sub genus III (S. arizonae). Acik et al., (2005) melaporkan bahwa S. arizonae memiliki berat molekul 25 kDa. KESIMPULAN Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini yaitu sampel yang diambil dari lingkungan RPA yang terdiri dari air minum, air limbah cucian karkas pasca pemotongan, dan bulu ayam pasca pemotongan terdapat cemaran Salmonella yang cukup tinggi yaitu lebih dari 106. Hasil pengamatan morfologi koloni, uji biokimia, uji serologi, nilai similaritas dan profil pita protein ditemukan keragaman Salmonella spp., isolat L2C2, B2A2, L1A2 dan L1B2 merupakan S. typimurium, isolat L2A1, D1A2 yaitu S. enteriditis, dan isolat B2A1, D2C2 dan D1C2 adalah S. arizonae. UCAPAN TERIMAKASIH Penulis mengucapkan terimakasih kepada Program Kedokteran Hewan UB atas bantuan dana penelitian DPP-SPP anggaran tahun 2012.
Bhunia, A. K. 2008. Foodborne Microbial Pathogen: Mechanisms and Pathogenesis. New York: Springer. Brands, D.A. 2006. Deadly Diseases and Epidemics: Salmonella. Philadelphia: Chelsea House Pub. Barrow, G. I. and R. Feltham. 1993. Cowan and Steel’s Manual For Identification Of Medical Bacteria. 3rd Ed. Cambridge University Press, Great Britain. Begum, F., Y. Adachi., and M.S.R. Khan., 2008. Characterization of Salmonella serovars in comporison with some Enterobacteria by SDS-PAGE analysis. Bangladesh J. of Veterinary Medicine, 6: 169-174. Hulankova, R., G. Borilova, and I. Steinhauserova. 2010. Influence Of Modified Atmosphere Packaging On The Survival Of Salmonella Enteritidis PT 8 On The Surface Of Chilled Chicken Legs. Acta Veterinaria Brno 79:S127.
DAFTAR PUSTAKA Acik, L., T. Ayhan., C. Ayten., A. Sevim., and Y. Remziye. 2005. Protein Patterns and Plasmid Profiles of the Bacterial Strains Isolated from a Poultry Slaughterhouse in Ankara, Turkey. J Biotechnol,43 (3): 255–262. Aksakal, A. 2010. Analysis of Whole Cell Protein Profiles of Salmonella Serovars Isolated From Chicken, Turkey and Sheep Faeces by SDS-PAGE. Veterinarni Medicina, (6): 259-263. Anonymous. 2010. Laporan KLB Keracunan Pangan Tahun 2010. Direktorat Surveilan dan Penyuluhan Keamanan Pangan-Badan POM RI. Jakarta.
Kim, A., Y.J. Lee, M.S. Kang, S.I. Kwag, and J.K. Cho. 2007. Dissemination and Tracking of Salmonella spp. In Integrated Broiler Operation. J. Of Veterinary Science. 8(2):155–161 Kisiela, D., M. Kuczkowski., A. Wieliczko., I. Sambor., M. Mazurkiewicz., and M. Ugorski. 2003. Comparison of SefA, FimA and AgFa Fimbrial Proteins of Salmonella enteritidis In Their Abilities To Elicit Humoral Immune Response in Hens. Bull. Vet. Inst. Pulawy. (47) 95105. Kundera, I. N., S. Santoso., Aulanni’am dan S. Winarsih. 2012. Ekspresi Protein Adhf36 Pada Perubahan Osmolaritas Serta pH Lingkungan Hidup Salmonella
typhi Secara In Vitro. Jurnal Kedokteran Hewan, ISSN : 1978-225. Nakamura, A., Y. Ota., A. Ito., Y.B., and Y. Adachi. 2002. Evaluation of Aviguard, A Commercial Competitive Exclution Product For Efficacy And After Effect On The Antibody Response Of Chickes Of Salmonella. Poultry Science 81: 1653-1660. Ngwai, Y.B., K. Ochi., Y. Ogawa., and Y. Adachi. 2005. Analysis Of The Protein Profiles of The Antibiotic Resistant Salmonella typhimurium Definitive Phage Type. African J. of Biotechnology, 4 (104): 727-737. Purnawijayanti, H.A. 2001. Sanitasi, Higiene, dan Keselamatan Kerja Dalam Pengolahan Makanan. Yogyakarta: Kanisius. Rantam, F.A. 2003. Metodologi Imunologi. Airlangga University Press : Surabaya Sophie, E. Jacoby., and W. Mauner. 2010. Europe and the management of globalization. Journal of European Public Policy. 17: 3.299 – 317. Wonderling, D., D. Marks., M. Thorogood., and H. A. Neil. 2003. Comparing costs and benefits over a 10 year period of strategies for familial hypercholesterolaemia screening. Journal of Public Health Medicine, 25(1):47-52.
