37
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2008 sampai Januari 2009, di Laboratorium Pendidikan Ilmu dan Teknologi Benih, Laboratorium RGCI Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB dan Laboratorium Ketahanan Pangan Dua di PAU IPB serta rumah kaca Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih Lewikopo IPB. Bahan dan Alat Benih yang digunakan dalam penelitian ini adalah benih jarak pagar IP-1P dari berbagai tingkat kemasakan yang di ambil dari kebun induk jarak pagar di Pakuwon, Parungkuda Sukabumi Jawa Barat. Pasir steril sebagai media perkecambahan, beberapa senyawa kimia untuk analisis karotenoid, klorofil, total lemak dan asam lemak bebas; heksana teknis, Indikator phennolftalein, Benzena: Alkohol(1:1), quartz sand, heksana, aseton, KOH 5% dalam Me-OH, air bebas ion, CH3 COOH 5%, Na2SO4 anhidrat, serta bahan penunjang lainnya. Peralatan yang di gunakan terdiri dari: centrifuge, oven, seperangkat alat soxhlet, vortex, water bath, spektrofotometer, serta peralatan Laboratorium Standar. Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari dua percobaan secara terpisah yaitu : Percobaan I : Indikasi Perubahan Fisiologi dan Biokimia Selama Pemasakan Benih dan Hubungannya Dengan Viabilitas dan Vigor Benih. Perubahan fisiologi dan biokimia pada lima tingkat kemasakan benih yang diamati selama proses pemasakan, berdasarkan ciri morfologi buah dan hari setelah antesis, merujuk pada Utomo (2007) yaitu: 1. K1 = warna buah hijau tua (42 HSA), 2. K2 = warna buah hijau kekuningan (47 HSA), 3. K3 = warna buah kuning merata (52 HSA), 4. K4 = warna buah kuning kecoklatan (57 HSA), 5. K5 = warna buah coklat kehitaman (62 HSA).
38
Lima tingkat kemasakan benih berdasarkan ciri morfologi kulit buah dapat dilihat pada Gambar 5.
K1
K2
K3
K4
K5
Keterangan: (K1); hijau tua, (K2); hijau kekuningan, (K3); kuning merata, (K4); kuning kecoklatan, (K5); coklat kehitaman. Gambar 5 Berbagai kemasakan buah jarak pagar IP-1P yang berbeda. Rancangan yang digunakan dalam percobaan ni i adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK), yang terdiri dari lima tingkat kemasakan buah sebagai faktor tunggal, setiap perlakuan diulang tiga kali sehingga terdapat 15 satuan percobaan. Analisis statistika yang digunakan adalah sidik ragam dengan model rancangan acak kelompok sebagai berikut:
Yij = µ + Ki +ßj + eij. Keterangan: Yij = Respon pengamatan pada tingkat kemasakan benih ke-i dan ulangan ke-j µ = Rataan umum Ki = Pengaruh tingkat kemasakan benih ke-i ?j = Pengaruh kelompok ke-j eij = Pengaruh acak pada tingkat kemasakan benih pada ke-i dan ulangan ke-j Data hasil penelitian dianalisis secara statistik menggunakan analisis ragam (ANOVA), apabila sidik ragam hasil pengolahan data menunjukkan adanya pengaruh perlakuan, akan dilakukan uji lanjut dengan metode Duncan Multiple Range Test (DRMT) pada taraf nyata 5%. Untuk melihat hubungan antara karotenoid dan klorofil dengan tolok ukur masak fisiologi benih dilakukan analisis regresi korelasi.
39
Percobaan II: Pengaruh Tingkat Kemasakan dan Periode Simpan Terhadap Viabilitas dan Vigor Benih Jarak Pagar. Rancangan percobaan yang digunakan dalam percobaan ini adalah Rancangan Petak Terbagi (Split-plot Design) yang terdiri atas dua faktor. Faktor pertama sebagai petak utama adalah periode simpan benih (P). Faktor kedua sebagai anak petak adalah tingkat kemasakan benih (K), seperti yang terlihat pada Gambar 6. Faktor pertama sebagai petak utama adalah periode simpan benih (P) terdiri atas lima taraf ,yaitu: 1. P0 = periode simpan 0 bulan, 2. P1 = periode simpan 1 bulan, 3. P2 = periode simpan 2 bulan, 4. P3 = periode simpan 3 bulan, 5. P4 = periode simpan 4 bulan. Faktor kedua sebagai anak petak adalah tingkat kemasakan benih (K) terdiri atas tiga taraf yaitu : 1. K2 = warna buah hijau kekuningan (47 HSA), 2. K3 = warna buah kuning merata (52 HSA), 3. K4 = warna buah kuning kecoklatan (57 HSA),
( K2)
(K3)
(K4)
Keterangan: K2 ( 47 HSA), K3 (52 HSA), K4 (57 HSA) Gambar 6 Tiga tingkat kemasakan buah jarak pagar IP-1P.
40
Secara keseluruhan terdapat 15 kombinasi perlakuan. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak tiga kali, sehingga diperoleh 45 satuan percobaan, setiap satuan percobaan terdiri atas 25 butir benih. Model matematika dari rancangan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah:
Yijk = µ + Pi + KK( Pi ) +GI + Aj + (PA)ij + GII.
Keterangan: Yijk
= nilai pengamatan pada perlakuan penyimpanan ke-i, tingkat kemasakan ke-j, dan ulangan ke-k.
µ
= nilai rataan umum hasil pengamatan.
Pi
= pengaruh perlakuan periode simpan ke-i.
Kk(Pi) = pengaruh ulangan ke-k dan periode simpan taraf ke-i. GI
= galat interaksi antara periode simpan dan ulangan.
Aj
= pengarugh perlakuan tingkat kemasakan ke-k
(PA)ij = pengaruh interaksi perlakuan periode simpan taraf ke-i dan faktor tingkat kemasakan taraf ke-j. GII
= pengaruh galat percobaan.. Jika dalam analisis ragam ternyata perlakuan yang diberikan menunjukkan
pengaruh yang nyata, maka dilanjutkan uji nilai tengah nilai tengah dengan menggunakan metode Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5%. Untuk melihat hubungan antara karotenoid dan klorofil dengan tolok ukur periode simpan benih dilakukan analisis regresi korelasi.
Pelaksanaan Penelitian Pelaksanaan penelitian dilakukan di lapang, laboratorium dan rumah kaca. Percobaan di lapang menyangkut pemanenan buah, sortasi dan ekstraksi buah sebagai materi dalam penelitian. Kegiatan di laboratorium meliputi pengujian kadar air benih, bobot kering benih, penyimpanan benih, uji total klorofil, total karotenoid, kandungan lemak total dan kandungan asam lemak bebas. Pengecambahan serta pengamatan daya berkecambah, kecepatan tumbuh, T50, First Count Germination (FCG) dilakukan di rumah kaca Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih IPB, Lewikopo, Bogor. Secara skematis tahapan pelaksanaan penelitian dapat dilihat pada Gambar 7.
41
Percobaan I Penentuan lima taraf kemasakan buah berdasarkan warna Buah (Utomo, 2007) Pemanenan buah Ekstraksi, pembersihan, pengeringan
Sortasi Benih Benih Homo gen Indikasi Tingkat Kemasakan Buah (Percobaan I) Indikasi Fisiologi Pengujian KA,DB, KCT, FCG dan Berat Kering benih.
Indikasi Biokimia Analisis Klorofil, Karoten, KLT dan ALB
Analisis Data
Percobaan II
Hasil Pengamatan tingkat kemasakan buah dari percobaan I. Digunakan 3 tingkat kemasakan pada percobaan II
Benih disimpan ( 0, 1, 2, 3, dan 4 bln) Indikasi Fisiologi, Pengujian KA, DB, KC T, T5 0, FCG dan Berat Kering benih
Indikasi Biokimia, Analisis Klorofil, Karoten, KLT dan ALB Analisis Data
Hasil yang diperoleh informasi tentang daya simpan benih jarak pagar dari ketiga tingkat kemasakan benih.
Gambar 7 Bagan alir pelaksanaan penelitian
42
Percobaan I. Kegiatan di lapang. Kegiatan awal yang dilakukan di lapang adalah pemanenan buah pada lima tingkat kemasakan berdasarkan ciri morfologi buah dari hasil penelitian Utomo (2007). Pemanenan buah dilakukan di kebun induk jarak pagar Pakuwon Sukabumi Jawa Barat. Buah yang diambil dari pohon yang sehat dan kuat dengan umur tanaman ± 4 tahun. Buah yang dipanen langsung dipisahkan menurut tingkat kemasakan yaitu ; K1 = warna buah hijau tua (42 HSA), K2 = warna buah hijau kekuningan (47 HSA), K3 = warna buah kuning merata (52 HSA), K4 = warna buah kuning kecoklatan (57 HSA), K5 = warna buah coklat kehitaman (62 HSA). Selanjutnya buah diekstraksi dengan cara manual dan dikeringanginkan pada tempat yang teduh sampai kadar air mencapai 9 – 10 %. Benih dari hasil ekstraksi dan dipisahkan secara fisik antara bagus dengan yang jelek dan benih yang tergores atau pecah kulitnya tidak digunakan dalam penelitian ini.
Kegiatan di Laboratorium. Analisis kadar klorofil dan karotenoid benih dilaksanakan di Laboratorium RGCI (Research Group on Crop Improvement) Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dan Analisis kandungan total lemak serta asam lemak bebas dilaksanakan di Laboratorium Ketahanan Pangan Dua (PAU) Institut Pertanian Bogor.
Percobaan II. Tingkat kemasakan benih jarak yang digunakan pada percobaan ini berdasarkan hasil analisis data pada percobaan satu yaitu tiga tingkat kemasakan K2; 47 HSA, K3; 52 HSA dan K4; 57 HSA untuk selanjutnya disimpan selama 4 bulan. Benih disimpan dengan cara dimasukkan dalam plastik sealer dan diletakkan dalam wadah penyimpanan dari bok plastik yang dialasi dengan kertas merang dan diatasnya ditutup lagi dengan keranjang plastik, wadah yang diperlukan sebanyak tiga wadah simpan (Gambar 8). Kadar air benih pada saat
43
awal penyimpanan berkisar 9.50 – 11.31%, penyimpanan benih dilakukan pada suhu ruang
Laboratorium Pendidikan Ilmu dan Teknologi Benih IPB dengan o
suhu 25-28 C dan RH 46- 80 %. Periode simpan ditentukan dari; 0, 1, 2, 3 dan 4 bulan. Kisaran suhu dan kelembaban relatif ruang simpan selama penyimpanan disajikan pada Tabel 1.
Tabel
1 Kisaran dan rata-rata suhu serta kelembaban relatif ruang simpan selama penyimpanan benih.
Periode simpan ( Bulan) 0–1 1–2 2–3 3–4
Suhu (0C) Kisaran 25.0 – 28,1 25.1 – 27.9 25.1 – 28.0 25.1 – 28.7
A
Keterangan:
Rata-rata 26.3 26.3 26.1 26.7
Kelembaban relatif (%) Kisaran Rata-rata 61.7 – 80.7 72.6 60.0 – 80.7 71.2 58.7 – 80.0 71.4 46.0 – 82.4 72.8
B
(A) Benih dalam plastik sealer yang diletakkan dalam bok plastik. (B) Penyimpanan benih dalam bok plastik.
Gambar 8 Penyimpanan benih jarak pagar pada suhu kamar. Pada setiap periode simpan yang telah ditentukan, kegiatan di Laboratorium selanjutnya sama pada percobaan I kecuali bobot kering benih tidak dilakukan lagi pada percobaan II ini.
44
Penanaman (Percobaan I dan II). Perlakuan praperkecambahan dilakukan dengan merendam benih dengan air biasa selama 12 jam, setelah 6 jam pertama air diganti selanjutnya setelah 12 jam benih ditiriskan ± 1jam. Pengecambahan dilakukan di rumah kaca dalam boks plastik dengan media pasir dan dilakukan pengamatan dengan tolok ukur yang telah ditentukan.
Pengamatan 1. Pengujian Ka dar Air. Pengujian kadar air benih dihitung dengan metode langsung menggunakan oven 103 ± 2 0C selama 17 ± 1 jam. Jumlah benih yang diuji sebanyak 5 butir. Pengukuran kadar air benih menggunakan rumus sebagai berikut (ISTA. 2004).
KA= (M 2 − M3)X
100 (M2 − M1)
Dimana : KA M1 M2 M3
= kadar air benih = berat wadah kosong dalam gram = berat wadah dan benih sebelum pengovenan = berat wadah dan benih setelah pengovenan
2. Daya Berkecambah Sebanyak 25 butir dari setiap satuan percobaan ditanam dalam boks plastik dengan media pasir. Pengamatan daya berkecambah dihitung berdasarkan pengamatan kecambah normal yang diamati pada 9 dan 14 HST (Gambar 9). Tipe perkecambahan jarak pagar adalah epigeal, maka perkecambahan normalnya adalah : kecambah tumbuh sehat, hipokotil tumbuh normal dengan panjang 2-4 kali dari panjang benih, akar adventif minimal ada 4 dan akar primer berkembang baik dengan bulu-bulu akar yang banyak serta minimal sudah tumbuh satu plumula (Wulandari, 2008). Daya berkecambah dapat dihitung dengan rumus :
45
? KN hitungan I + KN hitungan II DB = ------------------------------------------ X 100% ? benih yang ditanam A B E
C D
Sumber Wulandari (2008) Keterangan: (A) kotiledon, (B) plumula, (C) hipokotil,(D) akar adventif, (E) endosperm membungkus kotiledon.
Gambar 9 Struktur kecambah normal benih jarak pagar
3. Bobot Kering Benih. Bobot kering benih diukur dengan mengeringkan benih sebanyak 25 butir benih dalam oven 60 0 C selama 3 x 24 jam kemudian ditimbang bobotnya. Pengukuran dilakukan tiga ulangan untuk setiap satuan percobaan.
4. Kecepatan tumbuh Kecepatan tumbuh (KCT) dihitung berdasarkan total pertambahan persentase kecambah normal (Sadjad et al. 1999), dengan menggunakan rumus: tn
KCT = ∑ 0
N t
Keterangan : t = Waktu pengamatan N = Pertambahan %KN setiap waktu pengamatan tn = Jumlah hari pengamatan terakhir.
46
5. First Count Germination (FCG) First Count Germination ditentukan dengan menghitung persentase
jumlah
kecambah normal pada pengamatan pertama perkecambahan yaitu 9 HST. Pengukuran First Count berdasarkan Copeland dan McDonald (2001) dengan rumus : ? benih berkecambah pada hitungan pertama FCG = -------------------------------------------------------X 100% ? benih yang ditanam 6. T50 T50 merupakan waktu yang dibutuhkan untuk mencapai 50% total permunculan kecambah. Pengamatan dilakukan sejak hari pertama hingga hari terakhir terhadap kecambah yang mulai muncul kepermukaan media tanam.Satuan yang digunakan adalah hari. Pengukuran nilai T50 berdasarkan Khan (1992) dengan rumus :
T50 (hari) =
∑ TiXi ∑ Xi
Keterangan: Ti
= Waktu ke-i yang dibutuhkan untuk perkecambahan
Xi
= Jumlah kecambah waktu ke-i
7. Analisis kandungan klorofil dan Karotenoid. Penetapan kandungan klorofil dan karotenoid dilakukan berdasarkan metoda Sims and Gemon (2002), dengan prosedur sebagai berikut : Benih jarak pagar sebanyak 0.2 – 0.5 g yang sudah dihaluskan menggunakan mortar dengan quartz sand. Klorofil kemudian diekstrak dengan menambahkan 4 ml aceton 85% : Tris 1% pH 8 (85:15). Selanjutnya dikocok dengan vortex dan dicentrifuge pada 6000 rpm selama 5 menit, langkah ini diulang 2 – 3 kali. Kemudian ambil 1 ml dari supernatan dan ditera hingga 3 ml aceton : Tris. Absorban larutan tersebut diukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang masing – masing pigment dengan spektro fotometer ( lampiran 2). Penghitungan kandungan klorofil dan karotenoid dapat di cari dengan rumus Sims dan Gamon (2002) :
47
{[0.01373×A663] –[0.000897×A537]–[0.003046×A647] } 12 ×100 Chl a(µmol/g) = -----------------------------------------------------------------------------Berat sampel (g) { [0.02405×A647] – [0.004305×A537] –[ 0.005507×A663] }12 ×100 Chl b(µmol/g)= -----------------------------------------------------------------------------Berat sampel (g)
{ A470 – [( 17.1 × Tot.Chl) – (9.479 ×Anth)]} ×12 / 119.26 Total karoten (µmol/g) = ------------------------------------------------------------ ×100 Berat sampel (g) Keterangan : A470, 537, 647, 663 Tot. Chl Anth
= Nilai serapan sampel pada pembacaan panjang gelombang 470, 537, 647, 663 nm = Total klorofil = Nilai anthosianin.
9. Penetapan kadar lemak dan asam lemak bebas. Penentuan kadar lemak Penetapan
kandungan
lemak
kasar
menggunakan
alat
Soxhlet
(Apriyantono et al.1989). Prosedurnya adalah sebagai berikut: Labu lemak yang ukurannya sesuai dengan alat ekstraksi Soxhlet yang digunakan, dikeringkan dalam oven, kemudian didinginkan dalam desikator. Selanjutnya di dalamnya di masukkan batu didih dan ditimbang (X g). Contoh sebanyak 5 g benih dalam bentuk tepung dibungkus dengan kertas saring rangkap dua. Contoh tersebut di masukkan dalam alat ekstraksi Soxhlet, kemudian di pasang kondensor di atasnya, sedangkan labu lemak berada di atasnya. Pelarut petroleum eter dituangkan ke dalam labu lemak sebanyak 50 ml, sesuai dengan ukuran Soxhlet. Refluks dilakukan selama enam jam sampai pelarutnya yang turun kembali ke labu lemak berwarna putih. Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi dan pelarutnya ditampung. Kemudian labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105
0
C selama dua jam. Setelah dikeringkan sampai
beratnya konstan, selanjutnya didinginkan dalam desikator, dan labu lemak berikut batu didihnya di timbang (Y g). Berat lemak kasar dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
48
(Y- X) g lemak Kadar Lemak Total = ----------------------- X 100% Berat contoh Penentuan Asam lemak bebas. Kandungan asam lemak bebas (ALB) dilakukan dengan cara titrasi. Lemak hasil ekstraksi, di timbang 1 g kemudian di masukkan kedalam labu erlenmeyer dan di tambahkan 25 ml larutan alkohol : benzen (1:1). Selanjutnya di tambah satu tetes indikator phennolftalein dan dititrasi dengan KOH 0.1 N. Titrasi dihentikan jika terjadi perubahan warna menjadi merah muda. Kandungan asam lemak bebas dapat di hitung dengan rumus :
V.KOH x N.KOH x BM as.lemak ALB (%) = ------------------------------------------ x 100% Bobot sampel (g) x 1000 Keterangan: V.KOH
= Volume KOH yang dibutuhkan
N.KOH
= Normalitas KOH
BM asam oleat = 282 Metode dan rangkaian soxhlet dapat dilihat pada Lampiran 2 dan 3.
