13
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian IPB sejak bulan April 2010- Januari 2011. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan pembuat MOL yaitu bonggol pisang Apu (Mussa paradisica linn), keong mas (Pomacea canaliculata) dan urin kelinci, air sisa cucian beras, gula merah dari kelapa (gula Jawa). Media untuk pertumbuhan mikrob yaitu Nutrient Agar (NA), Potato Dextrosa Agar (PDA), Pikovskaya, Nitrogen Free Media (NFM), Nitrogen Free Bromthymol Blue (NFB), dan Carboxymethyl Cellulose
(CMC) serta bahan-
bahan kimia habis pakai untuk analisis kimia. Alat yang digunakan terdiri dari alat-alat laboratorium untuk analisis mikrob dan kimia.
Metode Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan satu faktor (waktu) dan
3 ulangan. Selanjutnya penyeleksian
berdasarkan nilai tengah tertinggi dari peubah menggunakan uji jarak berganda Duncan. Analisis data dilakukan dengan menggunakan Program SAS 9.1. Model matematisnya adalah: Yij
= µ + αi + εij
dimana: Yij
= pengamatan pada perlakuan ke-I dan ulangan ke-j
µ
= rataan umum
αi
= pengaruh perlakuan waktu ke-i
εij
= galat perlakuan waktu ke-i pada ulangan ke-j
14
Pelaksanaan Penelitian Pembuatan MOL 1. Persiapan Bahan yang digunakan masing-masing adalah bonggol pisang Apu (Musa paradisiaca Linn) yang diiris-iris dengan ukuran ± 0,5 – 1 cm sebanyak 5 kg, keong mas (Pomacea canaliculata) yang ditumbuk beserta cangkangnya sebanyak 5 kg, urin kelinci 5 l, air sisa cucian beras 10 l (didapat dari 5 l beras yang dicuci dengan 10 l air) dan gula merah dari kelapa (gula Jawa) 1 kg yang kemudian diiris halus. Alat yang diperlukan adalah penumbuk, pisau, kayu pengaduk dan drum ukuran 18 l. 2. Cara pembuatan MOL Air sisa cucian beras dicampur dengan gula merah (gula Jawa) yang telah diiris halus dimasukkan dalam drum kemudian diaduk sampai gula larut (air sisa cucian beras berubah warna menjadi coklat) kemudian dimasukkan keong mas, diaduk kembali sampai tercampur merata kemudian tutup drum dengan penutupnya. Begitu juga langkah-langkah untuk pembuatan MOL bonggol pisang dan MOL urin kelinci (NOSC, 2008).
Pengambilan sampel MOL 1. Pengambilan sampel MOL untuk analisis mikrob Pengambilan sampel dilakukan pada 1x24 jam( hari ke-1), 7x24 jam (hari ke7), 14x24 jam (hari ke-14) dan 21x24 jam (hari ke-21). Sampel MOL diambil dengan menggunakan pipet pada 3 kedalaman yang berbeda, yaitu 4 cm, 14 cm dan 23 cm. 2. Pengambilan sampel MOL untuk analisis kimia Pengambilan sampel dilakukan setelah pengambilan sampel yang digunakan untuk analisis mikrob. Pengambilan sampel dilakukan dengan terlebih dahulu MOL diaduk kemudian sampel diambil melalui kran yang ada dibagian bawah drum. Untuk pengukuran Eh dilakukan dengan alat Eh meter pada kedalaman 9 cm dari permukaan larutan MOL.
15
Pengamatan
Analisis mikrob Analisis mikrob dilakukan untuk mengetahui populasi mikrob total, fungi, Azotobacter-like, Azospirillum-like, MPF dan Mikrob Selulolitik. Parameter penelitian, metode dan media tumbuh mikrob disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Parameter penelitian, metode dan media tumbuh mikrob Parameter
Metode
Media
Mikrob total
Cawan hitung
Nutrient Agar (NA) (Rao, 1982)
Fungi
Cawan hitung
Potato Dextrosa Agar (PDA) (Anas, 1989)
Azotobacter-like
Cawan hitung
Nitrogen Free Media (NFM) (Rao, 1982)
Azospirillum-like
MPN
Nitrogen Free Bromthymol Blue (NFB) (Okon et al. 1977)
MPF
Cawan hitung
Pikovskaya (Rao, 1982)
Mikrob Selulolitik
Cawan hitung
Carboxymethyl Cellulose (CMC) (Coronel dan Joson, 1986)
Seri pengenceran dibuat dengan terlebih dahulu menyiapkan erlenmeyer 250 ml yang berisi 90 ml larutan garam fisiologis (8,5 g NaCl per liter) dan tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan garam fisiologis. Semua erlenmeyer dan tabung reaksi ditutup dengan kapas, penutupan ini dilakukan dengan hati-hati agar jangan sampai basah sewaktu diautoklaf. Erlenmeyer dan tabung reaksi yang berisi larutan garam fisiologis diautoklaf selama 20 menit pada suhu 121oC dan didinginkan sebelum digunakan lebih lanjut. Setelah dingin, 10 ml sampel larutan MOL dimasukkan ke dalam 90 ml larutan garam fisiologis steril tersebut, selanjutnya dibuat seri pengenceran sampai
10-7. Seri pengenceran yang
digunakan untuk menetapkan populasi masing-masing parameter berbeda. Untuk mikrob total digunakan seri pengenceran 10 -5,
10-6,
10-7, Azotobacter-like,
Azospirillum-like dan Mikrob Selulolitik digunakan seri pengenceran 10 -3, 10-4,
16
10-5, fungi dan MPF digunakan pengenceran 10-4, 10-5, 10-6. Sebanyak 1 ml larutan dari masing-masing seri pengenceran dipindahkan ke cawan petri yang kemudian dituang ke media biak sesuai dengan mikrob yang akan ditumbuhkan. Bahan dan komposisi media tumbuh mikrob yang digunakan disajikan pada Tabel Lampiran 1. Setelah itu cawan petri digoyang secara perlahan-lahan agar media dan suspensi tercampur sempurna, lalu diinkubasi pada suhu 25-30oC. Populasi mikrob total, MPF, Azotobacter-like dan Mikrob Selulolitik dihitung setelah 3-5 hari, sedangkan untuk Azospirillum-like inkubasi dilakukan selama 7 hari. Keseluruhan proses dilakukan secara steril untuk menghindari kontaminasi yang dapat mengganggu parameter yang ditetapkan.
Pemurnian Pemurnian dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh biakan murni yang diinginkan tanpa ada kontaminan dari mikrob lain. Pada tahap pemurnian untuk Azotobacter-like dipilih koloni tunggal yang mempunyai bentuk paling besar, moist dan bening. Untuk Azospirillum-like koloni yang dipilih berasal dari pelikel yang paling jelas sedangkan untuk MPF dan Mikrob Selulolitik dipilih koloni yang mempunyai zona bening paling luas. Koloni yang terpisah tersebut dipisahkan dengan cara pengoresan kuadran ke media yang baru.
Identifikasi Identifikasi mikrob terpilih dilakukan berdasarkan ciri-ciri morfologi koloni seperti elevasi, pinggiran, warna, bentuk dan jenis Gram. Identifikasi secara fisiologis dilakukan dengan menggunakan alat KIT API NE 20 yaitu sistem standar untuk identifikasi mikrob non-enterik. Untuk fungi identifikasi berdasarkan karakter morfologi koloni secara makroskopi dan mikroskopi.
Analisis kimia Analisis kimia dilakukan untuk mengetahui kandungan unsur hara, pH, EC dan Eh pada larutan MOL. Pengamatan untuk pH, EC dan Eh dilakukan pada
17
hari ke-1, 7, 14 dan 21 sedangkan untuk unsur hara pada hari ke-14. Parameter dan metode untuk analisis kimia disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Parameter dan metode/alat untuk analisis kimia Parameter
Metode/Alat
pH
pH meter/Fisher accumet® model 230A
Eh
Eh meter/TOA
EC
EC meter/wtw inolab cond level 1
N-NO3-, N-NH4+
Kjeldahl
C organik
Walkey & Black
P2O5
Bray-1/Spektrofotometer Spectonic 20 Bausch & Lomb
K2O
Ekstrak HCl 25%/Flamefotometer Corning 405
Ca.Mg,
NH4OAC pH 7/AAS Shimadzu AA-6300
Fe,Zn,Cu,Mn
Ekstrak HCl 0,05 N/AAS Shimadzu AA-6300
Analisis Data Data yang terkumpul dianalisis dengan menggunakan analisis sidik ragam untuk mengetahui pengaruh perlakuan dan dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan taraf 0,05 untuk mengetahui beda nyata antar perlakuan (Mattjik dan Sumertajaya, 2006).
18
Tahapan kegiatan penelitian Pembuatan MOL MOL bonggol pisang MOL keong mas MOL urin kelinci
Isolasi mikrob Mikrob total, fungi, Azotobacter-like, Azospirillum-like, MPF dan Mikrob Selulolitik
Kajian sifat kimia pH, EC, Eh, Analisis unsur hara
Pengukuran
Pembuatan seri pengenceran
pH, EC, Eh dan unsur hara makro dan mikro
Pembuatan media Isolasi mikroba
Perhitungan populasi mikrob, pemurnian dan identifikasi mikrob
Analisis data Gambar 1 Diagram alir penelitian.
