34
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pengolahan Susu, Bagian Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Pasca Panen Pertanian Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pasca Panen, Bogor, dan Laboratorium Balai Besar Industri Agro (BBIA), Bogor. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai Oktober 2009.
Materi Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah kultur starter bakteri S. thermophilus (St RRM-01), L. bulgaricus (Lb RRM-01), L. plantarum (Lp RRM-01), L. acidophilus (La RRM-01), B. longum (Bl RRM-01) koleksi dari Laboratorium Pengolahan Susu, Bagian Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, inulin, laktosa, de-Man rogosa sharpe broth (MRSB), bacteriological agar (BA), plate count agar (PCA), violet red bile agar (VRBA), buffer pepton water (BPW), susu skim, MRS-IM maltosa, MRS-IM glukosa (dichloxallin, LiCl dan cystein hydrocloride) dan AnaeroGenTM Oxoid Ltd. Alat-alat yang digunakan adalah cawan Petri, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, pipet, pemanas, refrigerator, mikroskop, autoclave, incubator, stopwatch, sentrifus dingin, oven, pengaduk, ayakan 12 dan 20 mesh, spektrofotometer, panci, mortar, scanning electron microscope (SEM), kemasan aluminium foil berlapis low density polyethylene (LDPE), sealer vacuum dan timbangan digital.
Tahap I Pemeriksaan Kemurnian Kultur Starter dan Penentuan Kurva Pertumbuhan Penentuan Kemurnian Kultur Starter Pemeriksaan kultur starter menggunakan metode pewarnaan Gram dan uji katalase. Pemeriksaan kultur starter S. thermophilus (St RRM-01), L. bulgaricus (Lb RRM-01), L. plantarum (Lp RRM-01) dan bakteri probiotik L. acidophilus (La RRM-01) serta B. longum (Bl RRM-01) dilakukan dengan metode pewarnaan
35
Gram (Fardiaz 1989), jika terdapat kontaminasi maka dibuat goresan kuadran dan dimurnikan kembali, tetapi jika sudah murni, maka disegarkan dan diperbanyak dengan cara mengambil satu öse untuk ditumbuhkan dalam media MRS broth dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Uji katalase dilakukan menggunakan bahan kimia H2O2. Satu öse bakteri dioleskan pada gelas objek, kemudian ditetesi oleh satu tetes H2O2, jika dihasilkan gelembung gas, maka bakteri yang diuji termasuk kelompok bakteri katalase positif, sebaliknya bila bakteri yang diuji tidak menghasilkan gelembung maka bakteri tersebut termasuk bakteri katalase negatif. Bakteri asam laktat termasuk kelompok bakteri katalase negatif.
Penentuan Kurva Pertumbuhan Kultur Starter dan Bakteri Probiotik Kultur bakteri yang digunakan sebagai starter adalah S. thermophilus (St RRM-01), L. bulgaricus (Lb RRM-01), L. plantarum (Lp RRM-01), sedangkan L. acidophilus (La RRM-01) dan B. longum (Bl RRM-01) sebagai bakteri probiotik. Kurva pertumbuhan diperoleh dari pengamatan terhadap pertumbuhan kultur starter dan bakteri probiotik diinokulasikan pada media MRSB (deMan Rogosa Sharpe Broth) lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Pengamatan pertumbuhan dan perhitungan jumlah bakteri dimulai pada awal inkubasi (jam ke-0) dan setiap 1 jam sampai jam ke-24 dengan cara melakukan pengukuran OD (optical density) pada λ = 620 nm dengan menggunakan spektrofotometer (Apriyantono et al. 1989). Kultur bakteri yang digunakan dikondisikan pada viabilitas yang tinggi, sehingga diperoleh jumlah populasi setelah dalam bentuk granul dengan jumlah minimal 107 CFU/g. Kurva pertumbuhan tersebut digunakan untuk penentuan fase-fase pertumbuhan kultur starter sehingga dapat diperoleh kondisi kultur yang optimal untuk digunakan sebagai starter. Berdasarkan hasil penentuan waktu inkubasi yang optimum, kemudian dilakukan perbanyakan bakteri asam laktat dan bakteri probiotik, untuk dipanen sel-selnya sebagai bahan baku pembuatan kultur starter susu fermentasi dan probiotik.
36
Tahap II Pembuatan Bakteri Probiotik Terenkapsulasi dan Granul Kultur Starter serta Aplikasinya Pembuatan Bakteri Probiotik Terenkapsulasi Tahapan enkapsulasi bakteri probiotik L. acidophilus (La RRM-01) atau B. longum (Bl RRM-01) ditunjukkan pada Gambar 5. Metode enkapsulasi yang digunakan berdasarkan hasil modifikasi dari Reyed (2007). Proses enkapsulasi probiotik diawali dengan penumbuhan L. acidophilus (La RRM-01) atau B. longum (Bl RRM-01) (5% v/v kultur kerja) dalam MRSB (deMan Rogosa Sharp Broth), diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam, dan dipanen pada fase log (fase pertumbuhan). Sel-sel bakteri dipisahkan melalui sentrifugasi dingin (pada suhu
4 C, 10 000 G selama 20 menit). Sel dari 50 ml broth dilarutkan pada 100
ml larutan 10% susu skim (w/v), 5% gliserol (v/v) dan 0.1% CaCO3 (w/v), inulin 2% (untuk L. acidophilus dan B. longum), kemudian diperangkap selama 45 menit di dalam 100 ml larutan alginat steril dengan konsentrasi 3%. Campuran tersebut diteteskan pada larutan CaCl2 0.1 M menggunakan spuit selama satu jam. Gel yang terbentuk dipindahkan ke dalam larutan NaCl fisiologis (0.85%) untuk mengompakkan struktur gel. Gel-gel yang terbentuk selanjutnya dimasukkan ke air destilasi dan diputar secara perlahan selama satu jam untuk menghilangkan residu CaCl2. Pengeringan butiran gel hasil enkapsulasi menggunakan alat freeze dry. Karakterisasi hasil enkapsulasi meliputi pengamatan terhadap morfologi dan ukuran partikel dengan menggunakan scanning electron microscope (SEM).
Pembuatan Kultur Starter dengan Probiotik Terenkapsulasi dalam Bentuk Granul (Ansel 1989; Fardiaz 1992) Pembuatan kultur starter dalam bentuk granul dengan probiotik terenkapsulasi diawali dengan inokulasi kultur starter yang digunakan, yaitu S. thermophilus (St RRM-01) dan L. bulgaricus (Lb RRM-01) sebagai kultur starter yogurt, serta L. plantarum (Lp RRM-01) sebagai kultur starter dadih sebanyak 5% v/v kedalam susu skim cair steril untuk menghasilkan kultur kerja. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C dengan lama inkubasi sesuai dengan fase logaritmik masing-masing kultur starter. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan jumlah dan kondisi kultur starter yang optimal dan juga untuk menghindari fase
37
lag atau fase adaptasi yang terlalu lama sebelum aktif memfermentasi susu. Waktu inkubasi S. thermophilus (St RRM-01) dan L. bulgarigus (Lb RRM-01) selama 10 jam dan L. plantarum (Lp RRM-01) diinkubasi selama 14 jam. Selanjutnya setelah waktu inkubasi berakhir, ditambahkan maltodekstrin 4% sebagai bahan pengisi dan laktosa 6% sebagai zat pelindung, kemudian dihomogenkan dengan cara pengadukan. Bubuk kultur starter kering diperoleh melalui proses pengeringan dengan metode spray dry (suhu inlet 180 C dan outlet 80 C). Bubuk kultur starter yang diperoleh kemudian diproses lanjut untuk menghasilkan granul dengan metode granulasi basah. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan formulasi granul kultur starter terdiri atas kultur starter dalam bentuk bubuk hasil spray dry, probiotik terenkapsulasi kering hasil freeze dry, laktosa, larutan sukrosa 60% (b/v) sebagai bahan pengikat dan digunakan hingga granul terasa lembab, sodium starch glycolate (SSG) dan susu skim. Tahapan proses granulasi basah terdiri atas penimbangan bahan-bahan yang digunakan, pencampuran hingga homogen, penambahan larutan sukrosa sebagai larutan pengikat, dan pengayakan tahap pertama dengan ayakan ukuran 12 mesh. Hasil ayakan dikeringkan dengan oven 40 C selama 2 jam. Setelah itu dilakukan pengayakan tahap kedua menggunakan ayakan ukuran 20 mesh. Tahapan pembuatan kultur starter yogurt dan dadih dalam bentuk granul berturut-turut ditunjukkan pada Gambar 6 dan 7. Tabel 3 dan 4 menunjukkan formulasi kultur starter dalam bentuk granul pada produk yogurt dan dadih. Tabel 3 Formulasi granul kultur starter yogurt Bahan Granul Bakteri kultur starter: S. thermophilus L. bulgaricus Bakteri probiotik: L. acidophilus B. longum Laktosa Susu skim Sodium starch glycolate Total
YL21S1
Formulasi (%) YL20S2
YL19S3
25 25
25 25
25 25
1 1 21 26 1 100
1 1 20 26 2 100
1 1 19 26 3 100
38
Tabel 4 Formulasi granul kultur starter dadih Bahan Granul Bakteri kultur starter: L. plantarum Bakteri probiotik: L. acidophilus B. longum Laktosa Susu skim Sodium starch glycolate Total
DL21S1
Formulasi (%) DL20S2
DL19S3
50
50
50
1 1 21 26 1 100
1 1 20 26 2 100
1 1 19 26 3 100
Isolat bakteri probiotik inokulasi pada MRSB inkubasi pada suhu 37 C sesuai dengan waktu yang diperoleh pada optimasi dipanen pada fase logaritmik pemisahan sel-sel bakteri melalui sentrifugasi dingin (suhu 4 C 10 000 G selama 20 menit) sel dari 50 ml broth dilarutkan pada 100 ml larutan (10% susu skim bubuk, 5% gliserol dan 0.1% CaCO3, inulin 2% sebagai prebiotik untuk L. acidophilus dan B. longum) diperangkap selama 45 menit dialam 100 ml larutan alginat steril dengan konsentrasi 3% campuran tersebut diteteskan pada pada larutan CaCl2 0.1 M dengan spuit hingga membentuk gel pengeringan (freeze dry) biokapsul Gambar 5 Tahapan proses enkapsulasi bakteri probiotik L. acidophilus (La RRM-01) atau B. longum (Bl RRM-01).
39
Susu + L. bulgaricus
Susu + S. thermophilus
Inkubasi (10 jam)
Inkubasi (10 jam)
Penepungan (metode spray dry)
Penepungan (metode spray dry)
Homogenisasi (pencampuran) Biokapsul L. acidophilus dan B. longum (inulin 2%)
Starter yogurt bubuk
Formulasi granul
Starter yogurt dalam bentuk granul
Gambar 6 Tahapan pembuatan kultur starter yogurt dalam bentuk granul. Susu + L. plantarum Inkubasi (14 jam) Penepungan (metode spray dry) Biokapsul L. acidophilus dan B. longum (inulin 2%)
Starter dadih bubuk Formulasi granul
Starter dadih dalam bentuk granul Gambar 7 Tahapan pembuatan kultur starter dadih dalam bentuk granul.
40
Penentuan Jumlah Koloni Kultur Starter dan Bakteri Probiotik Jumlah koloni kultur starter dan bakteri probiotik ditentukan dengan metode hitungan cawan, untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standard Plate Count (SPC). Pengambilan data populasi dilakukan saat awal akan dilakukan proses pengeringan (bakteri probiotik menggunakan freeze dry dan kultur starter menggunakan spray dry) dan setelah pengeringan dengan proses pemupukan. Pemupukan dilakukan dengan media deMan Rogosa Sharpe Agar (MRSA) dengan cara 1 ml inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan selanjutnya medium MRSA yang telah dingin (suhu kira kira 37 C) dituangkan ke dalam cawan Petri steril tersebut sebanyak 12–15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan Petri digerakkan dengan arah membentuk angka delapan. Cawan Petri diinkubasikan setelah agar mengeras, dengan posisi terbalik pada suhu 37 C selama 24–48 jam. Pengujian populasi bakteri probiotik sebelum dan sesudah dikeringbekukan serta bakteri kultur starter sebelum dan sesudah dikeringkan dengan metode semprot dihitung dan dianalisis dengan menggunakan t-test. Jumlah koloni per gram dihitung dengan rumus : Jumlah koloni/g = Jumlah koloni per cawan ×
1 faktor pengenceran
Total Plate Count (Dewan Standardisasi Nasional 1992) Pemupukan dilakukan dengan media Plate Count Agar (PCA) dengan cara 1 ml inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan selanjutnya medium PCA yang telah dingin (suhu kira kira 40–50 C) dituangkan ke dalam cawan Petri steril tersebut sebanyak 12–15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan Petri digerakkan membentuk angka delapan. Cawan Petri diinkubasikan setelah agar mengeras dengan posisi terbalik pada suhu 37 C selama 24–48 jam. Jumlah bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standard Plate Count (SPC).
Jumlah Bakteri Koliform (Dewan Standardisasi Nasional 1992) Penentuan jumlah koliform dilakukan dengan cara sebanyak 1 ml dari inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan dipupukkan sebanyak 10–15 ml
41
media VRBA (suhu antara 45–48 C). Cawan Petri dihomogenkan dengan cara digerakkan membentuk angka delapan, setelah memadat sebanyak 3–4 ml media VRBA cair dituangkan kembali (overlay) di atas permukaan agar. Setelah media mengeras cawan Petri diinkubasikan pada posisi terbalik pada suhu 37 C selama 24–48 jam. Jumlah mikroba ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standart Plate Count (SPC).
Prosedur Pengujian Kualitas Fisik Granul Kultur Starter serta Aplikasinya
Waktu Larut (Wells 1987) Sampel granul sebanyak 10 g diukur waktu larutnya dengan cara memasukkan sampel ke dalam 60 ml air dalam gelas ukur bersamaan dengan dimulainya perhitungan waktu dengan menggunakan stopwatch. Kelarutan dinyatakan dalam menit.
Indeks Kompresibilitas (Wells 1987) Sampel granul sebanyak 50 g dimasukkan dalam gelas ukur 100 ml, lalu diukur volumenya (V1). Berat jenis bulk = m/V1. Massa dalam gelas ukur diketuk-ketukkan dari ketinggian 2.5 cm sampai volume tetap (V2). Berat jenis mampat = m/V2. Kriteria indeks kompresibilitas diperlihatkan pada Tabel 5. Persamaan yang digunakan untuk menentukan indeks kompresibilitas adalah: Indeks kompresibilitas (%) =
berat jenis mampat - berat jenis bulk 100% berat jenis mampat
Tabel 5 Kriteria indeks kompresibilitas Indeks kompresibilitas (%) < 10 10 – 15 16 – 20 21 – 25 26 – 31 32 – 37 >38 Sumber : United State Pharmacopeia (2005)
Kategori laju alir Istimewa Baik Sedang Cukup baik Jelek Sangat Jelek Sangat-sangat jelek
42
Nilai pH (Apriyantono et al. 1989) Pengukuran pH menggunakan pH meter yang distandardisasi dengan larutan buffer pH 4 dan 7 sebelum digunakan. Sampel sebanyak 10 ml diambil, kemudian elektroda dibilas dengan air aquades. Elektroda dikeringkan dengan kertas tisue kemudian dicelupkan ke dalam sampel. Elektroda dibiarkan tercelup beberapa saat. Nilai yang dibaca adalah nilai saat pH meter telah stabil.
Total Asam Tertitrasi (Fardiaz 1992) Pengukuran total asam tertitrasi menggunakan prinsip asam basa. Sampel sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer kemudian ditambahkan 2– 3 tetes indikator phenolphtalein 1%. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N sampai terbentuk warna merah muda dan tidak hilang dalam waktu 30 detik. V NaOH N NaOH ( Total Asam Tertitrasi (%) =
V sampel
90 ) 1000 100%
Viskositas (Rahman et al. 1992) Pengukuran viskositas menggunakan alat rotational viscometer (Rion Viscotester VT-04F). Sampel sebanyak 100 ml dimasukkan ke dalam tempat yang tersedia. Rotor dicelupkan ke dalam sampel dan dibiarkan berputar sampai jarum skala penunjuk berhenti pada skala tertentu. Skala yang terbaca menunjukkan viskositas dari sampel dengan satuan viskositas adalah dPa.s.
Rancangan Penelitian dan Analisis Data Rancangan penelitian yang digunakan untuk menganalisis penentuan formula terbaik masing-masing produk susu fermentasi adalah rancangan acak lengkap dengan 3 ulangan. Penentuan formula terbaik berdasarkan imbangan laktosa : sodium starch glycolate (SSG) dinotasikan sebagai berikut: L21S1, L20S2 dan L19S3 dan evaluasi granul (kompresibilitas dan daya larut). Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam atau analysis of variance (ANOVA) (Steel dan Torrie 1993) dan bila perlakuan berpengaruh nyata terhadap peubah yang diukur, maka dilanjutkan dengan Duncan Multiple Range Test (uji Duncan) untuk mengetahui perbedaan diantara perlakuan tersebut. Data pH, total asam
43
tertitrasi dan viskositas dianalisis menggunakan uji non-parametrik KruskalWallis. Penentuan formula terbaik dilakukan dengan pemberian nilai (skoring) terhadap peubah yang dianalisis. Pemberian nilai meliputi aspek mikrobiologis granul dan aplikasi produk (populasi BAL, LA dan BL tertinggi); evalusi granul (kompresibilitas sesuai standar yang ada dan waktu larut) serta nilai pH, total asam tertitrasi sesuai standar yang ada dan viskositas. Jika diperoleh hasil yang berada dalam kisaran standar, maka diberi nilai yang sama yaitu 5. Apabila hasil yang diperoleh tidak berada dalam kisaran standar, maka pemberian nilai berdasarkan peringkat hasil terbaik. Formula terbaik imbangan laktosa : sodium starch
glycolate
(SSG)
yang
dihasilkan
selanjutnya
digunakan
untuk
penyimpanan granul kultur starter. Penentuan nilai (skoring) berdasarkan standar produk ditunjukkan pada Tabel 6. Tabel 6 Penentuan nilai berdasarkan standar produk Kriteria penilaian Kualitas mikrobiologis: - Populasi BAL granul dan aplikasi produk - Populasi LA granul dan aplikasi produk - Populasi BL granul dan aplikasi produk Evaluasi granul: - Kompresibilitas - Waktu larut Aplikasi produk: - pH - Total asam tertitrasi - Viskositas
Standar produk 10 7 CFU/g* 10 7 CFU/g* 10 7 CFU/g*
Sesuai kriteria** Belum ada
Penentuan nilai 1. Berada dalam kisaran standar diberi nilai 5 2. Jika tidak ada yang berada dalam kisaran standar, penilaian berdasarkan peringkat hasil terbaik (nilai tertinggi 5 dan nilai terendah 1)
4.2–4.6*** 0.5–2.0%**** Belum ada
Ket : * = Sultana et al. (2000) ** = United State Pharmacopeia (2005) *** = Sudarmadji et al. (1989) **** = Dewan Standardisasi Nasional (1992)
Tahap III Penyimpanan dan Evaluasi Kualitas Granul Kultur Starter serta Aplikasinya Granul kultur starter yang dihasilkan dikemas secara vakum menggunakan kemasan aluminium foil berlapis plastik low density polyethylene (LDPE). Produk yang telah dikemas selanjutnya disimpan selama 10 minggu pada suhu 4±1 C
44
(suhu refrigerator). Kondisi ruangan penyimpanan memiliki kelembaban 65% dengan suhu berkisar antara 27–29 C. Pengujian viabilitas kultur starter dalam granul yaitu meliputi penghitungan populasi bakteri asam laktat (BAL), L. acidophilus (La RRM-01) dan B. longum (Bl RRM-01). Pengamatan hasil aplikasi granul meliputi aspek mikrobiologis (BAL, LA dan BL) serta pengujian pH, total asam tertitrasi (TAT) dan viskositas produk.
Aplikasi Granul Kultur Starter untuk Menghasilkan Yogurt dan Dadih Sinbiotik Granul kultur starter yang diproduksi dan disimpan dingin (4 ± 1 ºC) selanjutnya diaplikasikan untuk menghasilkan produk susu fermentasi. Tahapan aplikasi granul sebagai kultur starter untuk menghasilkan yogurt dan dadih ditunjukkan pada Gambar 8 dan 9. Parameter yang diamati dalam pengujian kualitas mikrobiologis produk susu fermentasi (yogurt dan dadih) adalah populasi BAL, LA dan BL.
Susu skim cair Pasteurisasi pada suhu 85 C selama 30 menit (SNF 16%) Homogenisasi dan pendinginan suhu sampai 45 C Penuangan dalam wadah Inokulasi granul kultur starter yogurt Inkubasi (suhu 37 C ; waktu 10 jam)
Yogurt
Gambar 8 Tahapan pembuatan yogurt menggunakan granul kultur starter.
45
Susu cair
Evaporasi susu (50% ; 80-85 C selama 30 menit)
Homogenisasi dan pendinginan suhu sampai 45 C
Penuangan dalam wadah
Inokulasi granul starter kering dadih
Inkubasi (suhu 37 C ; waktu 14 jam) Dadih
Gambar 9 Tahapan pembuatan dadih menggunakan granul kultur starter.
Jumlah Bakteri Lactobacillus acidophilus dan Bifidobacterium longum (Dave & Shah 1996; Roy 2001) Perhitungan jumlah bakteri probiotik didalam produk susu fermentasi yang dihasilkan menggunakan media MRS-IM maltosa dan MRS-IM glukosa. L. acidophilus dipupukkan pada medium agar MRS-IM yaitu MRS dengan penambahan maltosa sedangkan B. longum dipupukkan pada medium agar MRSIM yaitu MRS dengan penambahan glukosa dan solusi dichloxallin, LiCl dan cystein hydrocloride. Teknik pemupukan dilakukan secara aseptik dengan cara memipet sampel yang telah diencerkan dan dipupuk sebanyak satu milliliter ke dalam cawan Petri steril. Media agar dituang ke dalam cawan Petri lalu dihomogenkan sehingga merata, setelah agar mengeras diinkubasi pada suhu 37 C selama 72 jam pada kondisi anaerob. Koloni yang tumbuh berwarna putih dan kekuningan merupakan koloni bakteri asam laktat yang ditumbuhkan.
46
Rancangan Penelitian dan Analisis Data selama Penyimpanan Rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan acak lengkap yang terdiri atas 5 perlakuan (lama penyimpanan 0, 1, 2, 5 dan 10 minggu) dengan 3 ulangan. Data dianalisis dengan sidik ragam atau analysis of variance (ANOVA) dan bila berbeda nyata diuji dengan Duncan (Steel dan Torrie 1993).
