21
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, dengan mengambil tempat di Bagian Bedah dan Radiologi sebagai tempat pengambilan dan pemeriksaan darah serta pemaparan radiasi dan kandang hewan percobaan di fasilitas kandang/hewan coba Bagian Patologi sebagai tempat pemeliharaan mencit, Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret 2011 sampai Juni 2011. Tabel 3 Jadwal penelitian No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Kegiatan Proposal Persiapan penelitian Pengadaan bahan dan ekstrak Pelaksanaan penelitian Penghitungan mikroskopis differensiasi leukosit sel darah perifer Pengumpulan data Analisis data Laporan penelitian Publikasi Ilmiah
Bulan ke1 2 3 4 5 6 7 8 9 √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
Bahan dan Alat Persiapan dan Pemeliharaan Mencit Bahan yang diperlukan untuk persiapan dan pemeliharaan mencit adalah 48 ekor mencit jantan yang berumur sekitar 6-8 minggu dengan berat badan 2025 g yang diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka IPB, pakan mencit komersil, serbuk kayu dan air minum ad libitum. Alat yang digunakan yaitu kandang plastik (30x20x15 cm) yang dilengkapi dengan tutup kawat, tempat pakan, tempat air minum mencit, alat penanda, dan alat cekok berupa stomatch tube.
Pembuatan dan Pemberian Ekstrak Rosela (Hibiscus sabdariffa L) Bahan yang diperlukan untuk pemberian ekstrak rosela adalah bunga rosela kering (simplisia), etanol 96%, ekstrak rosela, dan aquades untuk pengenceran, sedangkan alat yang diperlukan adalah syringe 1 cc dan alat cekok (stomach tube) dan kain untuk handling mencit.
22
Paparan Radiasi sinar-X Bahan yang diperlukan untuk melakukan paparan radiasi sinar-X adalah mencit, sedangkan alat yang diperlukan adalah mesin radiodiagnostik portabel sinar-X (VR-1020, MA medical corp, Japan), apron Pb, pelindung mata, pelindung tiroid, dosimeter merk ALOKA CO.,LTD Tokyo Japan, dan kandang mencit. Pengambilan Darah Perifer Mencit Bahan yang diperlukan untuk pengambilan darah perifer mencit adalah kapas, alkohol 70%, ketamine, xylazine, reverzin (yohimbin), dan Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA) 10%. Sedangkan alat yang diperlukan adalah mikrokapiler hematokrit, tabung efendorf, timbangan, syringe 1 cc, syringe 3 cc, dan syringe 5 cc. Pembuatan Preparat Ulas Darah Perifer Bahan yang diperlukan untuk pembuatan preparat ulas darah perifer adalah sampel darah, methanol, giemsa 10%, dan air kran yang mengalir. Sedangkan alat yang diperlukan adalah object glass. Penghitungan dan Pemeriksaan Darah Perifer (Differensiasi Leukosit Sel Darah Perifer) Bahan yang diperlukan untuk penghitungan morfologi jenis masingmasing sel leukosit adalah sampel darah, minyak imersi, xylol, dan kertas tisu. Sedangkan Alat yang diperlukan adalah mikroskop cahaya dan counter.
Metode Penelitian Desain Penelitian dan Hewan Coba Sebanyak 12 ekor mencit dalam setiap subkelompok dimasukkan ke dalam kandang plastik yang telah disediakan. Semua mencit diaklimatisasi untuk menyesuaikan kondisi laboratorium penelitian selama 2 minggu sebelum penelitian dilaksanakan, yaitu mencit diberi anthelmintik (albendazole®) sediaan 5% dengan dosis 10 mg/kg peroral, antibiotik (clavamox®) 25 mg/kg berat badan peroral, dan anti fungal (Flagyl®) 30 mg/kg berat badan per oral (Hrapkiewicz
23
dan Medina 2007). Pakan yang diberikan merupakan pakan komersial sesuai dengan kebutuhan harian mencit dan minum diberikan secara ad libitum air aqua. Desain penelitian merupakan hasil modifikasi prosedur penelitian yang telah dilakukan oleh Fidan et al. (2008). Mencit dibagi menjadi 2 grup radiasi, yaitu; (1) Grup radiasi rendah yaitu pemaparan radiasi dilakukan setiap 2 hari sekali selama 4 minggu dan (2) Grup radiasi tinggi yaitu pemaparan radiasi dilakukan setiap 2 hari sekali selama 8 minggu. Setelah pemaparan radiasi rendah dan tinggi dilakukan recovery (pemulihan) selama 4 minggu dengan pemberian ekstrak rosela tanpa dilakukan paparan radiasi seperti pada tabel 4. Hewan coba dibagi dalam 4 kelompok perlakuan secara acak sebagai berikut: 1. Kelompok Kontrol (K-): mencit menerima perlakuan peroral 2 mL NaCl fisiologis setiap 2 hari sekali selama 4 minggu untuk mencit grup 1 (n=6) dan selama 8 minggu untuk mencit grup 2 (n=6). 2. Kelompok Primer (K+): Mencit menerima perlakuan peroral 2 mL NaCl fisiologis dan radiasi berkas sinar utama dosis 0,2 mSv setiap 2 hari sekali selama 4 minggu untuk mencit grup 1 (n=6) dan selama 8 minggu untuk mencit grup 2 (n=6) dengan waktu paparan + 1 detik. 3. Kelompok Rosela (R-): Mencit diberi ekstrak rosela dosis 50 mg/kg berat badan secara peroral setiap 2 hari sekali selama 8 minggu untuk mencit grup 1 (n=6) dan selama 12 minggu untuk mencit grup 2 (n=6). 4. Kelompok Rosela Primer (R+): Mencit diberi Ekstrak rosela dosis 50 mg/kg berat badan secara peroral dan radiasi berkas utama dosis 0,2 mSv setiap 2 hari sekali selama 8 minggu untuk mencit grup 1 (n=6) dan selama 12 minggu untuk mencit grup 2 (n=6) dengan waktu paparan + 1 detik. Tabel 4 Kelompok perlakuan hewan dalam penelitian Radiasi dosis rendah (2.9 mSv) Radiasi dosis tinggi (5.3 mSv) Kelompok N Ra minggu Ro minggu Ra minggu Ro minggu ke-4 ke-8 ke-8 ke-12 K12 3 3 3 3 K+ 12 3 3 3 3 R12 3 3 3 3 R+ 12 3 3 3 3 Total 48 12 12 12 12 Keterangan: K- (Kontrol dengan pemberian NaCl fisiologis tanpa radiasi); K+ (Pemberian NaCl fisiologis dengan radiasi); R- (Pemberian ekstrak rosela tanpa radiasi); R+ (Pemberian rosela dengan radiasi); n (Jumlah mencit); Ra (Radiasi); Ro (Pemulihan selama 30 hari setelah radiasi dengan pemberian ekstrak rosela tanpa radiasi).
24
Berik kut gambar yang y menjellaskan alur penelitian: p Pembuatann dan Persiapann Ekstrak rosela
Perlakuan
Penngambilan Daraah
Pembuataan Preparat Ulaas Darah
Penghitunngan Differenssiasi Sel Leukkosit Darah Perrifer Gambaar 9 Alur Penelitian
P Pembuatan n dan Pembeerian Ekstraak Rosela (H Hibiscus sabbdariffa L) Pembbuatan ekstrrak tanaman rosela melipputi proses maserasi m dann evaporasi. M Maserasi ad dalah prosees perendam man simplisia mengguunakan pelaarut untuk m memperoleh h zak aktiff dari simpplisia tersebut. Prosess maserasi dilakukan m menggunaka an pelarut etanol 96% %. Maserat yang telah diperoleh dipisahkan k kemudian d dievaporasi. Evaporasi merupakan proses pem mekatan deengan cara m menguapkan n pelarut tanpa t menjadi kering. Maserasi dilakukan di Badan P Penelitian Tanaman T Obaat dan Arom matik (Balittrro) Bogor daan evaporasii dilakukan d Laboratorrium Biotekknologi (Biootek) di Fak di kultas Perikaanan IPB. Selanjutnya, d dilakukan u fitokimiaa yang dilaakukan di Pusat Studdi Biofarmaaka Bogor. uji S Sebelum diggunakan, ekkstrak roselaa diencerkan n dengan akkuadest kom mposisi 1,5 g gram ekstrakk dalam 200 ml akuadest. Mencit yang ditterapi dengaan ekstrak ro osela adalahh mencit kellompok Rd R+. Seebelum pem dan mberian ekstrrak rosela, mencit dipeegang terlebbih dahulu s secara manu ual mulai dari d belakanng telinga sampai s denggan dorsal punggung. L Larutan ekkstrak roselaa
diberikkan dengan dosis 50 mg/kg beerat badan
( (Akindahuns si dan Olaleye 2003; A Ali et al. 2005). 2 Pembberian NaCll fisiologis s sebanyak 0.22 ml pada mencit m kelom mpok K- dann K+ dengaan menggunaakan sonde l lambung. So onde lambunng digunakaan secara haati-hati agar larutan eksstrak rosela
25
tidak masuk ke dalam saluran pernapasan. Pemberian ekstrak rosela dilakukan setiap dua hari sebelum diradiasi dengan sinar-X.
Gambar 10 pemberian ekstrak rosela dan NaCl fisiologis pada mencit.
Paparan Radiasi Sinar-X Pemaparan radiasi ionisasi dosis rendah (2.9 mSv) dan tinggi (5.3 mSv) dilakukan dengan menggunakan mesin Roentgent dengan dosis 0,2 mSv/2 hari pada berkas sinar utama dengan pengaturan kVp 80, mAs 12, dan waktu paparan + 1 detik. Jarak sumber target (dasar kandang mencit) adalah 100 cm pada berkas sinar utama. Pemaparan dilakukan di ruang Roentgent pada setiap kelompok K+ dan R+ secara bergantian. Setiap kelompok mencit di letakkan di atas meja Roentgent dan akan dilakukan pemaparan oleh operator.
Gambar 11 pemaparan radiasi sinar-X
Pengambilan dan Pengoleksian Darah Perifer Pengambilan darah perifer dilakukan pada setiap kelompok secara acak pada minggu ke-0, 2, 4, 6, 8, dan 12 sebanyak 3 ekor setiap kelompok perlakuan.
26
Sebelum pengambilan darah dilakukan, mencit terlebih dahulu dibius dengan kombinasi ketamin dosis 30 mg/kg berat badan dan xylazin dengan dosis 5 mg/kg berat badan secara intra peritoneal. Pengambilan darah dilakukan dengan mikrokapiler hematokrit dengan EDTA 10% melalui vena retro orbitale pada bagian mata (Hrapkiewicz & Medina 2007). Sebanyak 0,5 ml darah yang di peroleh di masukan ke tabung Ependorf yang telah diberi EDTA sebanyak 0,1 ml. Darah tersebut disimpan di dalam box yang diisi dengan es batu tidak lebih dari 24 jam.
Gambar 12 pengambilan dan pengoleksian darah.
Pembuatan dan Pemeriksaan Preparat Ulas Darah (Differensiasi Leukosit Sel Darah Perifer) Menurut Weiss dan Tvedten (2004), metode membuat ulas darah pada slide adalah darah yang telah ditetes ke slide di sentuh menggunakan slide pelebar dengan cara menarik pelan-pelan kebelakang. Setelah kontak terjadi, slide pelebar tadi digerakkan ke depan dengan gerakan yang lembut. Ulas darah yang sudah terbentuk dikeringkan terlebih dahulu, kemudian direndam ke dalam metil alkohol selama 3-5 menit dan dikeringkan. Ulas darah yang sudah kering kemudian dimasukkan ke dalam larutan giemsa 10% selama 30 menit. Setelah 30 menit, cuci slide menggunakan air kran yang mengalir selama 30 detik dan dikeringkan dari air. Untuk pemeriksaan ulas darah dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 x dengan bantuan minyak imersi dengan arah pengamatan zigzag dan xylol sebagai larutan pembersih. Penghitungan differensiasi leukosit dilakukan dengan menghitung setiap jenis sel leukosit
27
(Limfosit, monosit, netrofil band, netrofil adult, basofil, eosinofil, limfoblas, dan mieloblas) hingga mencapai jumlah 100 sel leukosit.
Gambar 13 cara pembuatan dan pewarnaan preparat ulas darah.
Perhitungan perubahan persentase sel leukosit darah perifer akibat pemaparan radiasi dan pemberian ekstrak rosela adalah sebagai berikut: -
Perubahan persentase sel leukosit akibat pemaparan radiasi = (b-a)/(a+b)*100%
-
Perubahan persentase sel leukosit akibat pemberian ekstrak rosela = (d-c)/(c+d)*100% Keterangan : a= Persentase sel Leukosit sebelum perlakuan b= Persentase pada dosis radiasi tertentu c= Persentase sel pada dosis X d= Persentase sel leukosit setelah recovery dosis X X= Jumlah dosis paparan radiasi (mSv)
Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan menggunakan software SPSS versi 13 untuk Microsoft® Windows® uji ANOVA dilanjutkan uji DUNCAN untuk melihat berbeda nyata atau tidaknya data.
