30
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari sampai bulan Maret 2009 di kandang blok B (unggas) Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor, analisa bahan pakan dan ransum yang digunakan dilakukan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan Fakultas Peternakan IPB. Analisa darah dan serologi dilakukan di Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, sedangkan gambar mikroanatomi organ usus dianalisa di Laboratorium Patologi Klinik dan Bagian Patologi Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi FKH-IPB.
Materi Penelitian
Ayam Pedaging Penelitian menggunakan 200 ekor DOC (day old chick) ayam pedaging strain Ross. Jumlah ayam tersebut dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan dan 4 ulangan, masing-masing kelompok perlakuan ulangan terdiri atas 10 ekor.
Kandang dan Peralatan Kandang yang digunakan adalah dengan sistem litter, setiap petak kandang memiliki ukuran panjang x lebar x tinggi sebesar 1x1x1 meter. Kandang dilengkapi dengan tempat pakan berupa nampan yang digunakan sampai umur 1 minggu, selanjutnya sampai umur 35 hari menggunakan tempat pakan gantung dan tempat air minum ukuran 1 liter. Lampu bohlam dengan kekuatan 40 watt digunakan sebagai pemanas pada setiap petak kandang hingga ayam berumur 2 minggu, setelah itu lampu digunakan sebagai penerang pada malam hari. Peralatan lain yang digunakan adalah tirai plastik, tempat penampung air, ember, plastik tempat ransum, timbangan elektrik dan timbangan komersial skala 5 kg.
31
Ampas Buah Merah Ampas buah merah (ABM) berasal dari produk samping dari proses ekstraksi buah merah dalam pembuatan sari atau minyak buah merah. ABM diperoleh dari proses ekstraksi buah merah, yaitu buah merah matang dipisahkan dari empulurnya (bagian kayu di tengah buah) kemudian dipotong-potong dan dicuci sampai bersih. Daging buah dikukus di atas api sedang selama 1-2 jam, setelah itu dipisahkan dari biji buah dengan cara dikucek dan diperas. Air ditambahkan hingga ketinggian 5 cm di atas permukaan bahan dan diperoleh sari buah merah yang menyerupai santan, kemudian dimasak kembali dengan api sedang selama 5-6 jam sambil diaduk sampai muncul minyak berwarna kehitaman di permukaan bahan. Setelah didiamkan selama satu hari, akan terbentuk tiga lapisan, yaitu air di lapisan bawah, ampas di lapisan tengah dan minyak di lapisan atas. Hasil samping dari proses ekstraksi buah merah yaitu pada lapisan tengah inilah yang dinamakan ampas buah merah (Budi dan Paimin 2005). Hasil analisa ampas buah merah ditunjukkan pada Tabel 6. Tabel 6 Analisa kandungan nutrisi ampas buah merah Nilai nutrisi Bahan Kering (%) Abu (%) Protein Kasar (%) Serat Kasar (%) Lemak Kasar (%) Bahan Ekstrak Tanpa N (%) Kalsium (%) Fosfor (%) Energi Bruto (kkal/kg)
Jumlah 23.12 0.91 3.11 0.21 7.60 11.30 0.14 0.89 6 316
Sumber: Hasil Analisis Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan Fakultas Peternakan IPB, 2009
Ransum Percobaan Bahan penyusun ransum terdiri dari jagung, dedak, tepung ikan, bungkil kedelai, minyak, kalsium fosfat, CaCO3, asam amino, vitamin dan mineral. Ransum pada penelitian ini terdiri dari ransum basal ayam pedaging yang diproduksi oleh pabrik pakan ternak PT Shinta Prima Feeding ditambah dengan ampas buah merah (ABM) sebagai feed edditive pada beberapa konsentrasi, yaitu:
32
T0 = Ransum basal (kontrol) T1 = Ransum basal + ABM 0.5% T2 = Ransum basal + ABM 1.0% T3 = Ransum basal + ABM 1.5% T4 = Ransum basal + ABM 2.0% Ransum dianalisa di laboratorium. Hasil analisa kelima ransum percobaan ditunjukkan secara lengkap pada Tabel 7. Tabel 7 Analisa kandungan nutrisi ransum percobaan Nilai Nutrisi BK (%) Abu (%) PK (%) SK (%) LK (%) Beta-N (%) Ca (%) P (%) NaCl (%) EB (kkal/kg)
T0 85.59 4.62 20.65 4.65 5.46 52.21 0.53 0.90 0.10 3 917
Jenis Ransum Percobaan T1 T2 T3 85.27 85.93 85.83 4.78 4.58 4.66 20.36 20.70 20.81 4.03 4.62 4.14 6.07 6.23 6.75 52.03 51.80 51.47 0.55 0.60 0.63 0.89 0.87 0.90 0.07 0.15 0.14 3 880 3 892 3 917
T4 84.75 5.50 19.32 3.51 7.34 51.08 0.55 0.88 0.10 3 891
Sumber : Hasil analisa Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan Fakultas Peternakan IPB, 2009
Metode Penelitian
Pelaksanaan Penelitian Sebanyak 200 ekor anak ayam umur sehari (DOC) strain Ross dibagi secara acak dalam 5 perlakuan. Masing-masing perlakuan terdiri dari 4 ulangan, dan setiap unit percobaan (perlakuan-ulangan) terdiri dari 10 ekor yang telah ditimbang untuk mengetahui bobot badan awal dan ditempatkan pada satu petak kandang ukuran 1x1x1 meter. Selama penelitian, ayam pedaging dipelihara dalam kandang litter selama 35 hari. Vaksinasi yang digunakan selama penelitian ini adalah vaksinasi ND strain La-Sota, vaksin ND I diberikan pada umur 4 hari (tetes mata) dan vaksin ND II diberikan pada umur 21 hari (injeksi intra-muskular). Pada umur 14 hari dilakukan pula vaksin IBD melalui tetes mata. Setiap
minggu
dilakukan
penimbangan
ayam
untuk
mengukur
pertambahan bobot badan. Pakan dan air minum diberikan secara ad libitum dan
33
dilakukan penimbangan sisa pakan untuk mengukur pakan yang dikonsumsi. Pada akhir penelitian ayam dipotong untuk mengetahui persentase karkas dan pengamatan organ dalam. Peubah yang diamati meliputi konsumsi ransum, pertambahan bobot badan, konversi ransum, bobot badan akhir, persentase karkas, tingkat kematian, indeks performa, luas permukaan villi usus halus, jumlah butir darah merah, kadar hemoglobin, kadar hematokrit, jumlah butir darah putih dan diferensiasinya (heterofil, limfosit dan rasio herofil/limfosit), serta titer kekebalan terhadap ND. Pengambilan darah untuk mengukur titer kekebalan dan gambaran darah awal dilakukan sebelum ayam di vaksinasi ND I, selanjutnya dilakukan setiap minggu.
Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 (lima) perlakuan dan 4 (empat) ulangan, sehingga model matematis yang digunakan adalah Yij = μ + τi + εij i
= 1, 2, 3, 4, 5
;
j = 1,2,3,4
Yij = Respon pengamatan satuan percobaan yang memperoleh perlakuan ke-i dan ulangan ke-j μ
= Rataan umum
τi
= Pengaruh perlakuan ke-i
εij
= Perlakuan galat Data yang diperoleh dianalisis sidik ragam dan apabila ada perbedaan
diantara perlakuan, diuji lanjut dengan uji Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) (Steel dan Torrie 1993).
Peubah dan Prosedur Pengukuran Peubah yang diukur pada penelitian ini adalah performa ayam yang meliputi konsumsi ransum, pertambahan bobot badan, konversi ransum, bobot badan akhir, persentase karkas, tingkat kematian dan indeks performa, sedangkan status kesehatan meliputi jumlah butir darah merah, kadar hemoglobin, kadar hematokrit, jumlah butir darah putih dan diferensiasinya (heterofil, limfosit dan
34
rasio herofil/limfosit), serta titer kekebalan terhadap ND. Diamati pula luas permukaan villi usus. Tahap-tahap pengumpulan data yang dilakukan pada saat penelitian seperti terdapat pada Tabel 8. Tingkat kematian diketahui dengan melakukan pengamatan dan dicatat jumlah kematian yang terjadi setiap hari. Tabel 8 Tahap pengumpulan data selama penelitian Data yang diambil Penimbangan bobot badan DOC
Jumlah ayam per ulangan (ekor) 10
Hari ke1
3
7
10
14
17
21
24
28
31
35
√ √
√
√
√
√
Penimbangan bobot badan dan sisa pakan
10
Pengambilan sampel darah ayam untuk pengukuran titer ND (khusus pada hari ke-3 diambil sampel 20 ekor secara keseluruhan)
3
√
√
√
√
√
Pengambilan sampel darah ayam untuk pengukuran eritrosit, leukosit dan diferensiasinya, hemoglobin dan hematokrit
3
√
√
√
√
√
Pemotongan ayam untuk mengambil organ usus untuk kemudian dibuat preparat histopatologinya
1
√
Pemotongan ayam untuk penimbangan persentase karkas
5
√
1 Konsumsi Ransum Kumulatif Rataan konsumsi ransum setiap ayam pedaging diukur berdasarkan selisih pakan yang diberikan dengan sisa pakan yang diukur setiap minggu pada setiap unit percobaan. Konsumsi ransum kumulatif dihitung dari penjumlahan konsumsi ransum selama 5 minggu pemeliharaan.
35
2 Pertambahan Bobot Badan Pertambahan bobot badan setiap ayam pedaging dihitung dari bobot badan pada akhir pemeliharaan dikurangi bobot badan awal. 3 Feed Conversion Ratio (FCR) FCR dihitung berdasarkan perbandingan antara konsumsi ransum dengan pertambahan bobot badan. 4 Bobot Badan Akhir Bobot badan akhir dihitung berdasarkan bobot badan pada akhir pemeliharaan. 5 Persentase Karkas Persentase karkas dihitung berdasarkan perbandingan antara bobot karkas dengan bobot hidup ayam pedaging pada akhir penelitian dikalikan 100%. Bobot karkas diperoleh berdasarkan bobot potong pada akhir penelitian dikurangi bulu, kepala, kaki (shank), darah, alat pencernaan dan organ-organ tubuh bagian dalam kecuali ginjal dan paru-paru. 6 Persentase Kematian Persentase kematian diperoleh berdasarkan perbandingan antara jumlah ayam yang mati dengan jumlah ayam semula. 7 Indeks Performa Indeks performa untuk ayam pedaging diperoleh dari rumus (North dan Bell 1990): IP =
bobot hidup rata-rata (kg) x % ayam hidup FCR x umur panen rata-rata (hari)
x 100%
8 Profil Darah Sampel darah diambil melalui vena sayap dengan menggunakan spuit yang mengandung antikoagulan untuk memperoleh whole blood, dan tanpa antikoagulan untuk memperoleh serum.
36
Pemeriksaan sel darah merah dan leukosit menggunakan hemasitometer, kadar hemoglobin dengan metode Sahli. Pengukuran jumlah leukosit dan diferensiasinya melalui pembuatan preparat ulas darah tipis dengan pewarnaan May Grunwald-Giemsa dengan metode Benjamin (1980). Pembuatan ulas darah adalah sebagai berikut, setetes darah diteteskan pada gelas objek pertama dengan posisi mendatar, gelas objek yang lainnya ditempatkan pada darah yang pertama dengan membentuk sudut 30-45o sehingga darah menyebar sepanjang garis kontak antar gelas objek. Selanjutnya, gelas objek di dorong kearah depan sehingga terbentuk usapan darah tipis diatas gelas objek. Ulasan darah tersebut dikering udarakan kemudian di fiksasi. Fiksasi dilakukan dengan menggunakan metanol. Supaya ulas darah melekat pada gelas objek, gelas objek direndam dalam metanol selama 2-5 menit. Setelah dilakukan fiksasi, langsung dilakukan pewarnaan dengan menggunakan giemsa. Gelas objek yang telah difiksasi direndam dalam larutan giemsa selama 15-30 menit. Hasil rendaman dialiri dengan air sampai berwarna pink lalu dikeringkan di udara atau dengan kertas tisu, kemudian dilakukan penghitungan jenis leukosit di bawah mikroskop. Nilai hematokrit diukur menggunakan metode mikrohematokrit. Pengisian pipa mikrokapiler dilakukan dengan memiringkan tabung yang berisi sampel darah dengan menempatkan ujung mikrokapiler yang bertanda merah. Pipa diisi sampai mencapai 3/5 bagian, kemudian ujung pipa disumbat dengan crestaseal, selanjutnya pipa mikrokapiler tersebut disentrifuse selama 5 menit. Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur persentase volume eritrosit dari darah dengan menggunakan alat baca micro-hematocrit tube reader. Uji ini dilakukan secara duplo. 9 Respon Kebal terhadap ND dengan Uji Penghambatan Aglutinasi (HI-test) Uji HI dalam penelitian ini ditujukan untuk mengukur banyaknya antibodi yang terkandung dalam serum untuk menggambarkan tingkat kekebalan ayam percobaan (Villegas 1987) setelah divaksinasi dengan vaksin ND-La Sota. Metode yang digunakan adalah uji HI mikrotitrasi metode β, dengan diawali uji aglutinasi (Hemagglutination Test) untuk menentukan titer virus dalam satuan
37
HA-Unit. Pengukuran titer antibodi dilakukan setiap minggu setelah diberi vaksin ND pertama (primer) umur 4 hari dan vaksin ND kedua (sekunder) umur 21 hari. Masing-masing unit percobaan diambil tiga ekor ayam setiap minggu untuk diambil sampel darahnya sebanyak 1 ml melalui pembuluh darah vena untuk diukur titer antibodi dengan metode HI. Metode HA-test adalah sebagai berikut, PBS dengan volume 0.025 ml dimasukkan dalam semua sumur piring mikrotitrasi dasar V. Suspensi virus ditambahkan sebanyak 0.025 ml pada sumur pertama, ini akan membuat larutan dengan konsentrasi pengenceran 1:5. Suspensi virus dengan volume 0.025 ml diencerkan secara serial kelipatan dua, kemudian 0.025 ml PBS dimasukkan ke dalam setiap sumur. Sel darah merah ayam dengan volume 0.025 ml 1% dimasukkan ke dalam semua sumur, kemudian piring digoyangkan dengan perlahan dan dibiarkan selama 40 menit pada suhu ruang. Kontrol yang digunakan adalah 0.05 ml 1% sel darah merah dan 0.05 ml PBS, larutan ini akan membentuk endapan utuh seperti kancing di dasar sumur yang menunjukkan tidak terjadinya aglutinasi. Titer HA dibaca dengan cara piring ditegakkan dan diamati ada tidaknya aliran (tear drop) SDM. Titer HA dibaca berdasarkan pengenceran tertinggi yang memberikan HA sempurna (tidak ada streaming). Nilai ini menunjukkan nilai 1 HA unit (HAU) dan dapat dihitung secara tepat berdasarkan pengenceran awal (OIE 2000). Metode uji penghambatan aglutinasi (HI-test) adalah sebagai berikut, PBS dengan volume 0.025 ml dimasukkan ke dalam setiap sumur piring mikrotitrasi dasar V, kemudian 0.025 ml serum dimasukkan ke dalam sumur pertama, lalu dibuat pengenceran seri kelipatan dua dari volume 0.025 ml serum ke sumur sebelahnya. Virus atau antigen 4 HAU dengan volume 0.025 ml ditambahkan ke dalam setiap sumur dan didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Ditambahkan 0.025 ml SDM 1% ke dalam setiap sumur dan digoyangkan secara perlahan, kemudian diinkubasi selama 40 menit pada suhu ruang. Titer HI adalah angka pengenceran tertinggi dimana hambatan aglutinasi terjadi secara sempurna terhadap antigen 4 HAU. Aglutinasi dibaca dengan menegakkan piring, hanya sumur yang mengalami stream pada waktu yang sama dapat dinilai sebagai hambatan aglutinasi. Validasi hasil harus dinilai dengan
38
menyertakan serum kontrol negatif, yang tidak boleh memberikan titer lebih besar dari 4 (22 atau log 2) dan serum kontrol positif harus menunjukkan titer yang tidak berbeda satu kali pengenceran dari titer yang diketahui (OIE 2000). 10 Luas Permukaan Villi Usus Perhitungan luas permukaan per villi usus halus dilakukan dengan membuat preparat histopatologi usus dan diwarnai dengan hematoksilin dan eosin (HE). Perhitungan luas permukaan per villi dihitung menggunakan mikroskop dengan pembesaran objektif 4 kali dan video mikrometer pada 8 lapang pandang dari setiap preparat histopatologi dan setiap lapang pandang dihitung 2 villi, kemudian dihitung luas permukaan villi dengan menggunakan perhitungan menurut metode Iji et al. (2001). Luas permukaan per villi = Dimana :
(c + b) (b x a)
a = tinggi villi b = lebar apikal villi c = lebar basal villi b
a
c
Gambar
1
Gambaran villi permukaan usus ayam; lebar apikal villi (b), lebar basal villi (c).
tinggi
villi
(a),
