MATERI DAN METODE PENELITIAN Waktu dan tempat penelitian Penelitian ini dilaksakan di Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Perlakuan hewan percobaan dilaksanakan mulai tanggal 27 November 2010 sampai 31 Januari 2011. Bahan dan materi penelitian Hewan coba Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah 12 ekor mencit betina dalam periode bunting hingga melahirkan dengan berat badan rata-rata 3037 gram. Hewan coba dalam keadaan sehat fisik dan tidak pernah digunakan untuk penelitian lain. Bahan penelitian Bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri atas; vaksin S. agalactiae yang diradiasi berasal dari BATAN, Albendazole 5% (obat cacing dosis 10mg/kgBB), Clavamox® (antibiotik dosis 250mg/kgBB), Flagyl® (anti protozoa dosis 50mg/kgBB), pelet, air minum, bahan kaos sebagai alas kandang, xylazin dosis 8 mg/kgBB, Ketamin dosis 20 mg/kgBB untuk anestesi, Buffer Neutral Formalin 10% (BNF 10%) untuk fiksasi organ mencit serta bahan-bahan lain yang digunakan untuk membuat preparat histopatologi ginjal dan hati mencit yaitu etanol 70%, 80%, 90%, etanol absolut, xylol, zat warna HE (Hematoxylin Eosin), parafin. Alat penelitian Alat yang digunakan yaitu 12 box plastik berbentuk persegi panjang dengan ukuran panjang 40 cm, lebar 29 cm, tinggi 12 cm dengan tutup yang terbuat dari anyaman kawat untuk tempat pemeliharaan mencit selama penelitian, botol, sonde lambung, timbangan, spoit, alat bedah (gunting, skalpel, pinset, pin, alas bedah), pot plastik, alat-alat untuk membuat preparat histopatologi (alat dehidrasi yaitu automatic tissue processor, mikrotom, hot plate, inkubator, basket, gelas objek,
19
kaca penutup), digital eye piece camera, seperangkat komputer, software imageJ yang dapat di download pada Http://rsweb.nih.gov/ij/. Metode penelitian Persiapan hewan coba Setelah diperiksa kesehatannya secara fisik, mencit dimasukkan ke dalam kandang. Sebelum dikawinkan, seluruh mencit diberi albendazole 5% (obat cacing dosis 10mg/kgBB), antibiotik (Clavamox®) dosis 250mg/kgBB, dan antiprotozoa (Flagyl®) dosis 50mg/kgBB dengan waktu pemberian sebagai berikut : 2 hari
albendazole
5 hari
clavamox
2 hari
2 hari
albendazole
5 hari
flagyl
2 hari
kawin
Gambar 6 Jadwal pemberian pretreatment. Perlakuan hewan coba Setelah dilakukan pretreatment dan dikawinkan, mencit dibagi menjadi empat kelompok perlakuan, masing-masing kelompok terdiri dari 3 mencit betina. Keempat kelompok perlakuan tersebut adalah : Kontrol negatif (K) : mencit diberi pakan dan minuman ad libitum sampai partus. Kontrol positif (T) : mencit tidak divaksin, dan setelah partus langsung ditantang dengan bakteri S. agalactiae patogen dosis 108 cfu/ml/ekor sebanyak 500µl secara topikal (tetes) pada 5 pasang puting di abdomen. Vaksin (V)
: mencit divaksin dan dibooster dengan vaksin S. agalactiae LD50 dosis 108 cfu/ml/ekor secara intra peritoneal sebanyak 0,2 ml.
Vaksin tantang (VT): mencit divaksin dan dibooster dengan vaksin S. agalactiae LD50 dosis 108 cfu/ml/ekor secara intra peritoneal sebanyak 0,2 ml. Setelah partus ditantang dengan S. agalactiae patogen dosis 108 cfu/ml/ekor sebanyak 500µl secara topikal (tetes) pada 5 pasang puting di abdomen.
20
3 hari
4 hari
kawin vaksin
1 mggu
booster I
1 mggu
booster II
1 mggu
booster III
1 mggu
partus
1 hari
tantang
nekropsi
Gambar 7 Jadwal booster dan vaksinasi pada kelompok hewan coba. Setelah dipelihara hingga partus, kemudian ditantang bagi kelompok T dan VT, satu minggu kemudian mencit betina partus dianestesi untuk dinekropsi. Mencit dianestesi dengan xylazin dosis 8 mg/kgBB dan Ketamin dosis 20 mg/kgBB. Setelah teranesthesi, mencit diletakkan pada sebuah alas bedah dalam keadaan terlentang. Selanjutnya dilakukan pembedahan pada bagian abdomennya untuk melakukan pengambilan organ hati dan ginjal. Patologi anatomi mencit diamati. Organ dalam mencit kemudian dimasukkan dalam pot plastik berisi BNF 10% dan siap untuk dilakukan proses pembuatan preparat histopatologi. Pembuatan preparat histopatologi Organ hati dan ginjal yang telah difiksasi kurang lebih dua hari kemudian dipotong tipis. Potongan hati dan ginjal dengan ketebalan kurang lebih 3mm dimasukkan ke dalam tissue cassette dan di dehidrasi dengan merendam sediaan secara berturut-turut pada alkohol 70%, 80%, 90%, alkohol absolut I, alkohol absolut II, lalu dijernihkan dalam xilol I, xilol II, dan diinfiltrasi pada parafin parafin I, dan parafin II. Masing-masing proses perendaman dilakukan selama 2 jam dalam mesin automatic tissue processor, Sakura (Japan). Jaringan dimasukkan ke dalam pencetak berisi parafin cair dengan bentuk blok dan disusun di tengah parafin. Setelah mulai membeku, parafin ditambah kembali hingga alat pencetak penuh dan dibiarkan hingga parafin mengeras. Selanjutnya, parafin yang berisi jaringan, dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5 mikron. Hasil pemotongan yang berbentuk pita diletakkan diatas permukaan air hangat bersuhu 450celcius dengan tujuan menghilangkan lipatan-lipatan. Sediaan diangkat dari permukaan air dengan gelas obyek yang telah diolesi larutan albumin yang berguna untuk merekatkan sediaan. Setelah itu, preparat dikeringkan dalam inkubator bersuhu 600celcius semalam. Sediaan yang telah kering dimasukkan ke dalam xilol dua kali selama 2 menit. Kemudian sediaan direhidrasi yang dimulai dari alkohol absolut sampai
21
alkohol 80% dengan waktu masing-masing 2 menit. Selanjutnya sediaan dicuci pada air mengalir dan dikeringkan. Sediaan yang telah siap, diwarnai dengan pewarnaan Mayer’s Hematoksilin selama 8 menit, kemudian dibilas dengan air mengalir dan dicuci dengan lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan air lagi, dan akhirnya diwarnai dengan pewarna Eosin selama 2 menit. Untuk menghilangkan warna Eosin yang berlebihan, sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian sediaan dicelup ke dalam alkohol 90% sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut I 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, xilol I selama 1 menit, dan xylol II selama 2 menit. Sediaan dikeringkan dahulu, lalu ditetesi dengan perekat Permount dan kemudian ditutup dengan cover glass dan dibiarkan selama beberapa menit hingga melekat sempurna. Setelah itu, preparat siap untuk diamati dan diambil gambar menggunakan kamera mikroskop. Identifikasi dan pengambilan gambar preparat dilakukan di Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Pemeriksaan preparat histopatologis Pengamatan secara mikroskopik preparat histopatologis hati dan ginjal mencit betina menggunakan kamera mikroskop dengan perbesaran 40x10. Perubahan histopatologis yang diamati adalah adanya berbagai tipe degenerasi sel dan jumlah sel radang. Perhitungan dilakukan menggunakan program software imageJ. Pengamatan pada hati dilakukan dengan menghitung jumlah sel radang, jumlah sel degenerasi hidropis, degenerasi lemak dan nekrosa pada vena porta dan vena sentralis. Pengamatan dilakukan pada lima lapang pandang vena centalis dan lima lapang pandang vena porta dengan luas lapang pandang 15,106,6 um2. Sedangkan pengamatan pada ginjal dilakukan dengan memperhatikan aspek glomerulus dan tubulus ginjal. Pada glomerulus ginjal diamati jarak kapsulaglomerulus, jumlah sel radang dan jumlah glomerulus pada lima lapang pandang. Sementara pada tubulus ginjal diamati jumlah tubulus degenerasi, jumlah tubulus normal dan jumlah total tubulus pada lima lapang pandang mikroskop. Selanjutnya perhitungan berulang pada mencit yang berbeda.
22
Analisis data Data histopatologis yang didapatkan akan dianalisis secara deskriptif dengan menghitung persentase sel yang mengalami degenerasi dan kematian sel yang kemudian dilanjutkan dengan uji ANOVA.
