I. MATERI DAN METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu pipet tetes, batang pengaduk, jarum inokulum, batang Drugalsky, pipet ukur, cotton plug, object glass, botol, pinset, gunting, tabung reaksi, cawan petri, labu Erlenmeyer, filler, beaker glass, gelas ukur, pembakar spirtus, sprayer, korek api,mikropipet dan tip, rak tabung,papan tabung miring, kompor gas, panci, timbangan analitik, centrifuge tube, spectrophotometer, centrifuge, vortex, pH meter, hotplate dan magnetic stirrer, autoklaf, incubator, refrigerator, mikroskop, statif dan buret, dan anaerobic jar. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Isolat B. bifidum hasil penelitian sebelumnya, kultur L. bulgaricus dan S. thermopillus (Koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fabio Unsoed), label, kapas, tissue, wrapper, allumunium foil, spirtus, alkohol 70%, susu sapi murni exfarm peternakan Unsoed, susu bubuk skim, sukrosa, ekstrak ragi, medium deMann Rogosa Sharpe Agar (MRSA), medium deMann Rogosa Sharpe Broth (MRSB), tetramethyl-Dphenylenediamine dihydrochloride, H2O2,crystal violet, lugol’s iodine, etanol 70%, safranin, methylene blue,Bromcresol purple (BCP), Starch Agar (SA), Skim Milk Agar (SMA), King’s B, akuades steril, buffer tris HCl 0,05 M, HCL 0,1 M , 2% kasein dalam 0,5 M, buffer fosfat pH 7, Tri Cloro Acetiacid (TCA) 10 % (b/v), Asam Oksalat 0,1 N, NaOH, Na2CO3 0.5 M, tirosin, pepton 0.1%, etanol 70%, indikator fenolftalin 0.1% (b/v), pereaksi Folin Ciocalteau, indikator anaerob jar.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Lingkungan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto. Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret – Agusutus 2014.
B. Metode Penelitian 1. Rancangan Percobaan Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimental dengan Rancangan Acak Lengkap pola faktorial. Faktor yang digunakan yaitu perbandingan konsentrasi starter dan lama penyimpanan. Faktor I yaitu perbandingan konsentrasi starter yang terdiri atas empat taraf sebagai berikut:
4
A0 : 3 % Starter S. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 0 % B. bifidum (1:1:0) A1 :3 % Starter S. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 1,5 % B. bifidum (1:1:0,5) A2: 3 % StarterS. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 3 % B. bifidum (1:1:1) A3: 3 % Starter S. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 4,5 % B. bifidum (1:1:1,5) Faktor II yaitu lama simpan selang 5 hari selama 30 hari penyimpanan yang terdiri atas tujuh taraf sebagai berikut : T0 : Hari ke-0 T1 : Hari ke-5 T2 : Hari ke-10 T3 : Hari ke-15 T4 : Hari ke-20 T5 : Hari ke-25 T6 : Hari ke-30 Penelitian diulang sebanyak 3 kali ulangan, sehingga didapatkan kombinasi dari kedua faktor (Tabel 1.1) yaitu : Tabel 1.1. Kombinasi antara kedua perlakuan Konsentrasi Yoghurt B.bifidum (%) A0
0 hari T0 A0T0
5 hari T1 A0T1
A1T0
A1T1
A1T2
A1T3
A2T0
A2T1
A2T2
A3T0
A3T1
A3T2
A1 A2 A3 2.
Lama Simpan (Hari) 10 hari 15 hari 20 hari T2 T3 T4 A0T2 A0T3 A0T4
25 hari T5 A0T5
30 hari T6 A0T6
A1T4
A1T5
A1T6
A2T3
A2T4
A2T5
A2T6
A3T3
A3T4
A3T5
A3T6
Variabel Penelitian Variabel yang digunakan adalah variabel bebas dan tergantung. Variabel bebas adalah konsentrasi B. bifidum dalam yoghurt dan lama simpan yoghurt. Variabel tergantungnya adalah aktivitas protease bakteri psikrotrofik pada yoghurt. Parameter utama yang diamati adalah banyaknya tirosin yang dihasilkan dalam U/ml. Adapun parameter pendukungnya adalah kadar asam laktat, jumlah bakteri asam laktat, jumlah bakteri psikrotrofik.
3. Cara Kerja 3.1. Pembuatan Media Pertumbuhan (Lampiran 3) Media yang digunakan dalam penelitian adalah media deMann Rugosa Sharpe Broth (MRSB), deMann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) dan king’s B. 5
3.2. Peremajaan Kultur Isolat L. bulgaricus, S. thermopillus, B. bifidum (Kusnawati, 2004) Isolat L. bulgaricus, S. thermopillus dan B. bifidum diambil 1 ose kemudian digoreskan secara zig-zag ke dalam tabung reaksi yang berisi MRS agar miring, diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 2 hari. Peremajaan ini dilakukan setiap 1-2 minggu sekali.
3.3. Uji Mikrobiologi Sel S. thermophillus, L. bulgaricus dan B. bifidum (Kaster dan Brown, 1983). Uji mikrobiologi sel L. bulgaricus, S. thermopillus dan B. bifidum meliputi pewarnaan Gram, pewarnaan sederhana, uji katalase dan uji oksidase (Lampiran 3.). Khusus untuk B. bifidum dilakukan uji fermentasi karbohidrat.
3.4. Pembuatan Inokulum S. thermophillus, L. bulgaricus dan B. bifidum (Whardani, 2004) Kultur biakan murni S. thermophillus, L. bulgaricus dan B. bifidum pada media MRS agar miring diinokulasikan ke dalam 9 ml larutan pepton 1%, kemudian diinkubasi selama 1 x 24 jam. Setelah itu, dilakukan pengukuran OD menggunakan spektrofometer dengan panjang gelombang 600 nm sampai diperoleh nilai absorbansinya 0,5.
3.5. Pembuatan Kultur Starter (Koroleva, 1991 dalam Akmar, 2006). Pembuatan kultur starter S. thermophillus, L. bulgaricus, dan B. bifidum terdiri dari 3 tahapan yaitu pembuatan kultur induk, feed starter dan bulk starter. 3.5.1. Pembuatan Kultur Induk S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum Proses pembuatan kultur induk S. thermophillus, L. bulgaricus dan B. bifidum merujuk Lampiran 4, komposisi media yang digunakan untuk pembuatan kultur induk S. thermophillus berbeda dengan komposisi media kultur induk L. bulgaricus dan B. bifidum. Pembuatan media kultur induk S. thermophillus yaitu sebanyak 8,5 gr susu bubuk skim, 10 gr sukrosa, dan 0,1 gr ekstrak ragi dilarutkan kedalam 100 ml akuades kemudian disterilisasi dengan metode tindalisasi pada suhu 80oC, selama 30 menit. Media yang sudah steril dinamakan media tumbuh A, kemudian media ditambahkan dengan kultur S. thermophillus dalam pepton yang telah diukur OD±0,5 sebanyak 3 ml. Setelah itu diinkubasi selama 12 jam pada suhu 37oC. Pembuatan media kultur induk L. bulgaricus dan B. bifidum yaitu sebanyak 8,5 gr susu bubuk skim dilarutkan ke dalam 100 ml akuades, kemudian disterilisasi dengan metode tindalisasi pada suhu 80oC, selama 30 menit. Media yang sudah steril dinamakan media tumbuh B, kemudian media ditambahkan dengan kultur
vi
L. bulgaricus atau B. bifidum dalam pepton yang telah diukur OD±0,5 sebanyak 3 ml. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. 3.5.2. Pembuatan Feed Starter S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum Proses pembuatan feed starter S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum merujuk Lampiran 4, sebanyak 3 ml kultur induk ditambahkan ke dalam 97 ml media tumbuh baru. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC untuk kultur S. thermophillus diinkubasi selama 6 jam, sedangkan L. bulgaricus dan B. bifidum diinkubasi selama 12 jam sampai terkoagulasi. 3.5.3. Pembuatan Bulk Starter S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum Proses pembuatan bulk starter S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum merujuk Lampiran 4, sebanyak 3 ml feed starter ditambahkan ke dalam 97 ml media tumbuh baru lalu diinkubasi pada suhu 37oC. bulk starter S. thermopillus diinkubasi selama 6 jam, sedangkan bulk starter L. bulgaricus dan B. bifidum diinkubasi selama 12 jam. 3.5.4. Pembuatan Kombinasi Starter S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum dengan Berbagai Konsentrasi. Susu murni sebanyak 500 dalam empat botol bening steril masing-masing ditambahkan gula sebanyak 50 gr (10%), selanjutnya dipanaskan pada suhu 900C selama 30 menit, kemudian didinginkan sampai suhunya 450C. Masing-masing botol diinokulasikan bulk starter dengan perbandingan konsentrasi yang berbeda. a. Ditambahkan bulk strarter S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum dengan perbandingan konsentrasi 1:1:0 yaitu 3 % bulk strarter S. thermophilus, 3 % L. bulgaricus, 0 % B. Bifidum. b. Ditambahkan bulk strarter S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum dengan perbandingan konsentrasi 1:1:0,5 yaitu 3 % bulk strarter S. thermophilus, 3 % L. bulgaricus, 1.5 % B. Bifidum. c. Ditambahkan bulk strarter S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum dengan perbandingan konsentrasi 1:1:1 yaitu 3 % bulk strarter S. thermophilus, 3 % L. bulgaricus, 3 % B. Bifidum. d. Ditambahkan bulk strarter S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum dengan perbandingan konsentrasi 1:1:1,5 yaitu 3 % bulk strarter S. thermophilus, 3 % L. bulgaricus, 4.5 % B. Bifidum. Masing-masing starter dengan berbagai konsentrasi dikocok beberapa kali, kemudian diinkubasi pada suhu 450C selama 6 jam.
vii
3.6. Pembuatan Yoghurt (Modifikasi Kosokowski, 1985 dalam Ramadzanti, 2006) Pembuatan yoghurt dilakukan dengan cara memasukkan susu murni sebanyak 500 ml ke dalam botol bening ukuran 600 mL, kemudian ditambahkan gula sebanyak 50 gr (10%) dan dipanaskan hingga suhu 90oC selama 30 menit. Setelah itu, didinginkan hingga suhunya mencapai 45oC. starter dengan berbagai konsentasi ditambahkan kedalam susu yang sudah dipasteurisasi dengan perbandingan konsentrasi starter yang berbeda yaitu 1:1:0, 1:1:0.5, 1:1:1, 1:1:1.5 sebanyak 3 %, kemudian dikocok beberapa kali. Susu yang sudah diberi starter diinkubasi pada suhu 45oC selama 6 jam sampai terbentuk yoghurt. Yoghurt disimpan pada suhu 4oC di refrigerator selama 30 hari.
3.7. Pengukuran Aktivitas Protease Yoghurt dengan Metode Lowry (Akmar, 2006). Pengukuran aktivitas protease
dilakukan setiap 5 hari sekali selama 30 hari
penyimpanan. Uji aktivitas protease dilakukan dengan cara mengambil 10 ml yoghurt yang sudah diberi perlakuan berbagai konsentrasi, dimasukkan ke dalam eppendorf, kemudian dicentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan (ekstrak kasar enzim protease) diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, disimpan pada suhu 20 oC. Supernatan diambil sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan dengan 0,5 ml buffer tris-HCl 0.05 M pH 7 dan divorteks kemudian di inkubasi pada suhu 37oC selama 5 menit. 0,5 ml subtrat berupa 2% kasein dalam 0.05 M buffer fosfat pH 7 ditambahkan ke dalam supernatan dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC, kemudian ditambahkan TCA 0.4 M sebanyak 1 ml. Larutan divorteks dan disentifuge, diambil 0,5 ml supernatan kemudian ditambahkan 2,5 ml Na2CO3 0,5 M, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 5 menit. Ditambahkan 0,5 ml reagen folin ciocalteu, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit, selanjutnya diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 660 nm. Penggunaan blanko dari setiap pengujian menggunakan prosedur yang sama, tetapi penambahan TCA 0.4 M dilakukan sebelum penambahan substrat kasein. Larutan tirosin digunakan sebagai standard yang dilarutkan dalam HCl 0.1M pada berbagai konsentrasi. Konsentrasi standar yang digunakan yaitu 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 mM. Setiap konsentrasi standar diambil 0,5 ml dan ditambahkan 0,5 ml Na2CO3 lalu diinkubasi selama 5 menit, kemudian ditambahkan Folin Ciocalteau sebanyak 0,5 ml dan diinkubasi lagi selama 30 menit pada suhu 37oC. Diukur kerapatan optiknya menggunakan spektrofotometri dengan panjang gelombang 660 nm. Hasil serapan dari viii
larutan standar digunakan untuk mencari persamaan linear, yang selanjutnya dibuat kurva standar untuk mencari banyaknya tirosin yang dihasilkan. Perhitungan aktivitas enzim sebagai berikut: Aktivitas Protease (U/ml) = ( X x 1000 x V) (p x q)x fp Keterangan : X = Konsentrasi sampel dari persamaan regresi dengan nilai absorban sebagai Y Fp = Faktor Pengenceran V = Volume total sampel pada tiap tabung 1000 = Faktor konversi (mM ke µM) q = Waktu inkubasi p = Volume enzim (ml) 3.8. Pengukuran Kadar Asam Laktat (AOAC, 1995). Pengukuran kadar asam laktat diukur setiap 5 hari sekali selama 30 hari penyimpanan. Yoghurt dari masing-masing sampel diambil sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 250 ml, kemudian ditambahkan akuades sebanyak 90 ml untuk dititrasi dengan menggunakan NaOH 1 N. Indikator warna yang digunakan adalah fenolptalein 1% dengan perubahan warna menjadi merah muda. Menurut syarat mutu yoghurt pada SNI 01-2981-1992, jumlah asam laktat adalah 0,5-2,0%. Konsentrasi total asam tertitrasi dihitung sebagai persen asam laktat. Kadar asam laktat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Kadar asam laktat = Vol NaOH (ml) x N NaOH x Mr As. Laktat Volume Sampel (ml) x 1000 Keterangan : Vol NaOH N NaOH Mr. As. Laktat V sampel 3.9.
: Volume NaOH yang terpakai (mL) : Konsentrasi NaOH (N) : 90g/ekivalen : Volume sampel yang dianalisis (mL)
Perhitungan Jumlah Bakteri Asam Laktat dan Bakteri Psikrotrofik ( Hidayat et al., 2013) Perhitungan jumlah bakteri asam laktat diawali dengan sampel yoghurt diencerkan ke dalam akuades steril dengan perbandingan 1:9. Sampel yoghurt diambil sebanyak 1 ml dan diencerkan ke dalam 9 ml akuades steril sampai pengenceran 10-6. Pada pengenceran 10-5 dan 10-6 diplating duplo secara pour plate (PP) ke media MRSA dan diplatting mono secara PP ke media King’s B. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Untuk menghitung jumlah BAL dan bakteri psikrotrofik yang tumbuh digunakan metode Total Plate Count (TPC) dengan rumus: ix
CFU’s/ml = jumlah koloni x 1/faktor pengenceran x PP 4. Metode Analisis Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) pada tingkat kesalahan 5% menggunakan software Microsoft Excel, karena hasil penelitian menunjukkan tidak berbeda nyata, maka tidak dilanjutkan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) (Yusnandar, 2002).
x
