BAB III RANCANGAN PENELITIAN
Percobaan yang akan dilakukan adalah fermentasi minyak kelapa dengan bantuan mikroorganisme yang menghasilkan enzim protease dan menganalisis kualitas minyak yang dihasilkan. Rancangan penelitian ini mencakup metodologi yang digunakan dalam penelitian, prosedur kerja yang berisi tentang alat dan bahan yang digunakan serta variasi percobaan yang akan dilakukan. 3.1
Metodologi
Fokus penelitian ini adalah produksi minyak kelapa melalui proses fermentasi. Tahaptahap penelitian yang akan dilakukan adalah sebagai berikut: 1. Seleksi mikroorganisme Pada tahap ini, metode fermentasi yang akan dilaksanakan sesuai dengan metode yang telah dikemukakan oleh Sastramihardja (1984) seperti telah dijelaskan pada Bab II. Tahapan percobaan yang dilakukan adalah sebagai berikut : a) Pembuatan medium inokulum dari air kelapa dan skim santan, serta penyiapan santan kelapa b) Fermentasi
krim
santan
menggunakan
inokulum
masing-masing
mikroorganisme dengan menyeragamkan konsentrasi sel. c) Penentuan jenis mikroorganisme dengan perolehan minyak kelapa terbanyak. 2. Formulasi medium inokulum Formulasi
medium
inokulum
penting
untuk
menghasilkan
pertumbuhan
mikroorganisme yang maksimum. Pada tahap ini, diasumsikan bahwa produksi enzim protease maksimum pada pertumbuhan sel yang maksimum. Fermentasi dilakukan pada temperatur dan pH optimum mikroorganisme menurut Ghema (1992) dan Jong (1987). Tahapan percobaan yang dilakukan adalah sebagai berikut : a) Pengujian medium inokulum yang menghasilkan pertumbuhan optimal bagi mikroorganisme dengan basis volum sama b) Pembuatan kurva pertumbuhan mikroorganisme (kurva jumlah sel hidup terhadap waktu) untuk tiap variasi medium inokulum B.56.3.04
26
c) Penentuan jumlah sel hidup terbanyak melalui pengamatan tiap kurva pertumbuhan 3. Penentuan jumlah inokulum Penentuan perbandingan jumlah inokulum dengan krim santan penting dilakukan untuk menghasilkan minyak dengan produktivitas tertinggi. Komposisi medium inokulum yang digunakan adalah komposisi medium terbaik yang diperoleh pada tahap 2. Tahapan percobaan yang dilakukan adalah sebagai berikut : a) Pengujian jumlah inokulum dengan memvariasikan perbandingan krim terhadap medium inokulum dengan basis volum sama b) Penentuan variasi dengan yield / produktivitas terbaik 4. Penentuan temperatur, pH, dan kadar oksigen optimum kondisi fermentasi Setelah diketahui komposisi medium terbaik dari tahap 2 dan jumlah inokulum yang menghasilkan produktivitas tertinggi dari tahap 3, dilakukan variasi kondisi fermentasi yang meliputi temperatur, pH, dan kadar oksigen, sehingga diperoleh kondisi optimum fermentasi. Tahapan percobaan yang dilakukan adalah sebagai berikut : a) Variasi temperatur optimum pada kondisi pH dan kadar oksigen yang sama b) Variasi pH optimum pada kondisi temperatur dan kadar oksigen yang sama c) Variasi kadar oksigen optimum pada kondisi temperatur dan pH yang sama 5. Tahap analisis kualitas minyak kelapa Analisis yang dilakukan adalah analisis terhadap sifat fisik dan kimiawi minyak kelapa yang diperoleh. Sifat-sifat minyak kelapa yang akan dianalisis yaitu : a) Sifat fisik • densitas : ditentukan dengan menggunakan piknometer • indeks bias : ditentukan dengan menggunakan refraktometer b) Sifat kimia • angka asam : ditentukan dengan metode titrasi menggunakan NaOH/KOH • angka penyabunan : ditentukan melalui reaksi minyak dengan KOH berlebih • angka iodium : ditentukan dengan metode Wijs • angka peroksida : ditentukan dengan metode titrasi menggunakan Na2S2O3 • komposisi asam-asam lemak: ditentukan dengan menggunakan GCMS.
B.56.3.04
27
Tahap 2
Air kelapa
Skim
satu bagian
lima bagian
Tahap 1 Metode fermentasi dari literatur
Seleksi 9 spesies mikroba yang digunakan
Medium (air bibit) Percobaan fermentasi pembuatan minyak kelapa
Variasikan komposisi
Inokulasi
skim
Pemilihan mikroba yang menghasilkan minyak terbanyak
Penentuan jumlah sel pada selang waktu tertentu
Mikroba terpilih
Krim santan
Tahap 3
Jumlah sel tertinggi
tidak
ya
Komposisi air kelapa & skim terbaik Dua bagian
Satu bagian
Fermentasi selama 12 jam (T, pH, kadar O2) Variasikan komposisi krim
Tahap 4
Fermentasi selama 12 jam (T, pH, kadar O2)
Variasikan temperatur, pH, dan kadar oksigen
Pemisahan minyak dari blondo + air
tidak
Perolehan minyak terbanyak
Kondisi operasi optimum
tidak
ya ya
Tahap 5 Komposisi inokulum & krim terbaik
Minyak kelapa
Analisis kualitas hasil
Gambar 3.1. Diagram Alir Metodologi Penelitian
B.56.3.04
28
3.2
Percobaan
Percobaan dilakukan dengan terlebih dahulu menyiapkan bahan dan alat yang akan digunakan. Bahan dan alat yang digunakan dalam percobaan ini dapat dilihat pada Subbab 3.2.1 dan 3.2.2. Prosedur percobaan yang akan dilakukan meliputi persiapan dan percobaan utama.
3.2.1 Bahan Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut : 1.
Daging kelapa tua
2.
Air kelapa tua
3.
Biakan mikroorganisme pada medium agar miring
4.
Glucose yeast extract
5.
Potato dextrose agar
6.
Aquadest
3.2.2
Alat
Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut : 1.
Fermentor berupa labu erlenmeyer bervolum 1 L
2.
Tabung reaksi 100 mL dan 200 mL
3.
Labu Erlenmeyer 250 mL dan 500 mL
4.
Gelas kimia 250 mL, 500 mL, dan 1 L
5.
Gelas ukur 50 mL, 100 mL, dan 250 mL
6.
Corong pisah 1 L
7.
Penyaring santan
8.
Jarum penanam
9.
Pembakar spiritus
10. Pipet volum 5 mL dan 10 mL 11. Pipet tetes 12. Mikroskop 13. Satu set peralatan Counting Chamber B.56.3.04
29
3.2.3
Prosedur
Prosedur percobaan meliputi tahap persiapan dan percobaan utama. Tahap persiapan bertujuan untuk menentukan jenis mikroorganisme yang akan digunakan dalam percobaan utama. Percobaan utama bertujuan menghasilkan minyak kelapa melalui proses fermentasi dengan variasi penentuan formulasi medium inokulum, penentuan jumlah inokulum, serta penentuan temperatur, pH, dan kadar oksigen optimum. Selain itu, dilakukan analisis untuk menentukan kualitas minyak kelapa yang dihasilkan.
3.2.3.1 Persiapan Pemilihan mikroorganisme didasarkan pada kemampuannya untuk memecah ikatan lipoprotein pada santan, yaitu mikroorganisme yang dapat memproduksi enzim protease. Pada penelitian ini, jenis mikroorganisme yang digunakan masing-masing tiga untuk tiga kelas yang berbeda yaitu dari bakteri, fungi, dan ragi. Seperti yang dapat dilihat pada Tabel 3.1, kesembilan spesies mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini, telah diketahui dapat menghasilkan enzim protease yang dapat memecah ikatan lipoprotein pada santan (Ghema,1992 dan Jong,1987). Tabel 3.1. Mikroorganisme yang diseleksi pada tahap persiapan Kelas Fungi
Ragi (Yeast)
Bakteri
Spesies Rhizopus oligosporus Aspergillus oryzae Beauveria bassiana Saccharomyces cerevisiae Candida tropicalis Torulopsis famata Lactobacillus plantarum Streptococcus lactis Acetobacter aceti
Penelitian ini bertujuan menghasilkan minyak kelapa melalui fermentasi. Minyak kelapa terdiri atas asam lemak jenuh dan tak jenuh. Lemak terikat pada protein melalui ikatan lipoprotein. Untuk memecah ikatan lipoprotein digunakan enzim protease yang akan menghidrolisis ikatan peptida dalam protein sehingga protein dan lemak dapat terpisah. Protein berfungsi sebagai emulsifier dalam santan. Molekul-molekul minyak dan air yang berdekatan dihubungkan oleh protein sehingga membentuk emulsi. Enzim protease ini bertujuan untuk menghidrolisis protein sehingga kestabilan emulsi pada B.56.3.04
30
santan terganggu. Terganggunya stabilitas enzim protease ini akan membuat batas antara minyak dan air menjadi terlihat sehingga minyak kelapa dapat dipisahkan.
Garis besar percobaan fermentasi minyak kelapa dapat dilihat pada Gambar 3.2 di bawah ini. Daging kelapa tua
Minyak Kelapa
Penyiapan bahan baku
santan
Proses Utama
inokulum
Lapisan minyak, blondo, dan air
Pemisahan
Fermentor (T, pH)
Penyiapan air bibit
Blondo + air Mikroba
Gambar 3.2. Proses inti pembuatan minyak kelapa dengan fermentasi
Kelapa dibersihkan dari sabut dan tempurung. Airnya diambil untuk pembuatan inokulum. Ke dalam air kelapa kemudian ditambahkan skim santan untuk dijadikan medium tempat mikroorganisme tumbuh. Daging kelapa tersebut kemudian diparut sebelum diambil santannya. Cara menyiapkan krim santan untuk fermentasi dapat dilihat pada Gambar 3.3.
Kesembilan mikroorganisme yang akan diseleksi tersebut ditumbuhkan dalam air bibit (air kelapa dan skim santan). Caranya ialah dengan menginokulasikan mikroorganisme tersebut dari biakan medium agar miring ke dalam air bibit dengan konsentrasi sel tertentu. Perhitungan konsentrasi sel (jumlah sel/mL) dilakukan dengan menggunakan metode counting chamber.
Santan yang telah diinokulasi diinkubasi pada temperatur optimum selama 1-3 hari. Fermentasi
dilakukan
dalam
waktu
yang
cukup
lama
karena
kemampuan
mikroorganisme untuk memecah enzim protease berbeda-beda. Pada tahap ini diasumsikan bahwa sesudah 3 hari mikroorganisme tidak mampu lagi memecah enzim protease dan diharapkan perolehan minyak kelapa setelah jangka waktu 3 hari sudah konstan. Setelah itu, dilakukan pengamatan terhadap perolehan minyak kelapa dari B.56.3.04
31
masing-masing mikroorganisme. Dua mikroorganisme dengan perolehan tertinggi akan diteliti lebih lanjut.
Daging kelapa tua segar
Pemarutan
Kelapa parut
Air hangat (40-500C)
Pengadukan (10-15 menit)
Pemerasan
Ampas
Santan
Diamkan 30 menit – 1 jam
Dekantasi
Skim
Krim santan Gambar 3.3. Blok diagram penyiapan krim santan
3.2.3.2 Percobaan utama Mikroorganisme dengan perolehan minyak terbanyak akan mengalami perlakuan yang sama seperti halnya pada tahap persiapan. Proses fermentasi yang dilakukan sama seperti yang dilakukan pada tahap persiapan, yang membedakan hanyalah volum kerjanya. Volume fermentor yang digunakan adalah 1 liter dengan volume kerja 800 mL.
B.56.3.04
32
Pada percobaan utama, tahap yang dilakukan pertama kali adalah menentukan formulasi medium inokulum. Percobaan dilakukan dengan memvariasikan formulasi vilume skim terhadap volume air kelapa dengan 5, 7, 9, dan 11 berbanding 1. Asumsi yang diambil pada tahap ini adalah basis volum yang digunakan sama, pH dan temperatur optimum yang digunakan menurut Ghema (1992) dan Jong (1987). Pada tahap ini yang dilakukan adalah membuat kurva pertumbuhan sel dan kurva pH terhadap waktu selama pertumbuhan sel. Pembuatan kurva ini dilakukan untuk setiap variasi.
Komposisi medium yang menghasilkan pertumbuhan sel terbanyak akan digunakan sebagai inokulum untuk fermentasi. Fermentasi dilakukan dengan mencampurkan krim santan dan inokulum dengan perbandingan tertentu. Variasi perbandingan krim terhadap inokulum juga dilakukan pada tahap ini. Menurut Sastramihardja (1984), perbandingan jumlah krim terhadap inokulum adalah 3 berbanding 1. Pada penelitian ini, dilakukan variasi jumlah krim santan terhadap inokulum dengan perbandingan 2, 3, 4, dan 5 bagian krim terhadap 1 bagian inokulum. Produktivitas terbaik pada variasi ini kemudian akan digunakan untuk penentuan variasi berikutnya.
Komposisi medium inokulum dan medium fermentasi yang menghasilkan produktivitas terbaik akan digunakan untuk menentukan kondisi optimum fermentasi minyak kelapa ini. Kondisi operasi yang divariasikan adalah temperatur, pH, dan kadar oksigen. Penentuan temperatur optimum dilakukan dengan memvariasikan 4 nilai temperatur pada rentang temperatur antara 25-400C. Variasi yang menghasilkan minyak kelapa dengan perolehan tertinggi menunjukkan temperatur optimum percobaan yang dilakukan.
Penentuan pH optimum hampir sama dengan penentuan temperatur optimum. Variasi pH yang akan diujicobakan berkisar antara rentang 5-7,36 dilakukan sebanyak 4 nilai. Penelitian umumnya dilakukan pada kondisi pH netral yaitu sekitar 6,68. Pada penelitian ini, penambahan asam dan basa dilakukan untuk mengatur pH medium. Perolehan minyak kelapa terbanyak diperoleh pada nilai pH optimum.
B.56.3.04
33
Penentuan kadar oksigen optimum ditentukan dengan memvariasikan volume kerja pada fermentor. Fermentasi ini dilakukan pada kondisi mikroaerofilik yaitu kondisi yang membutuhkan udara selama proses fermentasi tetapi jumlahnya hanya sedikit. Udara yang digunakan di sini berasal dari oksigen terlarut yang terdapat dalam medium fermentasi, dan ruang kosong yang terdapat fermentor. Variasi yang dilakukan untuk menentukan kadar oksigen optimum pada proses fermentasi ini sebanyak 4 nilai dengan rentang volume kerja adalah 60-90 % volum kerja/volum fermentor. Penentuan kadar oksigen optimum dilakukan dengan menghitung yield terhadap volum kerja. Yield terhadap volum kerja tertinggi akan menunjukkan kondisi yang memiliki kadar oksigen optimum.
Tahap percobaan yang dilakukan selanjutnya adalah melakukan fermentasi minyak kelapa dengan mikroorganisme terpilih dengan komposisi medium inokulum terbaik, perbandingan krim santan dengan inokulum terbaik, serta kondisi operasi (temperatur, pH, dan kadar oksigen) optimum. Minyak kelapa yang dihasilkan dianalisis sifat fisik dan kimianya. Sifat-sifat fisik dan kimia yang dianalisis yaitu densitas, indeks bias, komposisi asam lemak, angka asam, angka iodium, angka peroksida, dan angka penyabunan.
Analisis sifat fisik meliputi densitas dan indeks bias. Analisis densitas menggunakan piknometer pada temperatur ruang. Analisis indeks bias menggunakan refraktometer yang terdapat di Lab.Teknik Kimia ITB, seperti yang ditunjukkan Gambar 3.4.
Gambar 3.4 Alat refraktometer di Lab.Teknologi Kimia ITB
B.56.3.04
34
Analisis sifat kimia meliputi analisis angka asam, angka iodium, angka penyabunan, angka peroksida, dan komposisi asam-asam lemak. Analisis angka asam, angka penyabunan, dan angka peroksida menggunakan metode titrasi, sedangkan angka iodium menggunakan metode Wijs. Komposisi asam-asam lemak ditentukan dengan Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS).
3.2.4
Variasi
Variasi yang dilakukan pada percobaan ini adalah sebagai berikut : 1. Variasi temperatur Nilai temperatur yang akan divariasikan adalah sebanyak 4 nilai temperatur yang berada pada rentang 25-400C, seperti yang tercantum dalam Tabel 3.2. Nilai ini dipilih karena sebagian besar mikroorganisme hidup pada nilai temperatur yang tidak terlalu tinggi. 2. Variasi pH Nilai pH yang akan divariasikan adalah sebanyak 4 nilai yang berada pada rentang pH 4-8, seperti yang tercantum dalam Tabel 3.2. 3. Variasi kadar oksigen pada fermentor Variasi kadar oksigen dilakukan dengan memvariasikan volume kerja pada fermentor. Kadar oksigen yang dimaksudkan di sini adalah kadar oksigen terlarut dan oksigen yang terdapat pada ruang kosong di fermentor yang berisi udara. Kadar oksigen diasumsikan sebanding dengan fraksi ruang kosong pada fermentor. Nilai fraksi volume kerja yang divariasikan adalah sebanyak 4 nilai yang berada pada rentang 60-90% volume fermentor, seperti yang tercantum dalam Tabel 3.2.
Tabel 3.2. Variasi-variasi percobaan
Variasi Percobaan ke1 2 3
Temperatur (0C)
pH
Fraksi volume kerja fermentor (dalam %-v)
25 30 35
5 5,8 6,6
60 70 80
4
40
7,36
90
B.56.3.04
35
