ANALISIS PROTEIN DARAH KERBAU LOKAL (Bubalus bubalis) DI WILAYAH MALANG DAN BANGKALAN SEBAGAI STUDI AWAL PENINGKATAN MUTU GENETIK Dian Sofi Anisa, Moh. Amin, Umie Lestari Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Malang Email:
[email protected] ABSTRAK Populasi kerbau di Indonesia menurun sejak tahun 1925, dengan laju penurunan yang makin meningkat. Dari total penurunan populasi di Indonesia, 40% terdapat di Pulau Jawa, khususnya di Jawa Timur. Penanganan awal yang dilakukan oleh peternak adalah dengan mengawinkan antar individu dalam satu daerah, tetapi anakan yang dihasilkan memiliki kualitas mutu genetik yang rendah. Oleh karena itu perlu dilakukan upaya untuk mencegah terjadinya penurunan populasi yang pada akhirnya berakibat hilangnya plasma nutfah endemik Indonesia ini dengan melihat hubungan kekerabatan setiap individu. Salah satu cara melihat hubungan kekerabatan adalah dengan pendekatan molekuler yang dapat dilihat melalui ekspresi protein spesifik pada darah. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeskripsikan profil protein darah kerbau lokal dari wilayah Malang dan Bangkalan, menunjukkan analisis keragaman atau variasi genetik sebagai penanda keragaman genetik dan estimasi hubungan kekerabatan. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif dengan observasi labolatorik yang dilakukan dengan memisahkan darah kerbau menjadi plasma dan eritrosit. Plasma yang telah dipurifikasi dan eritrosit darah kerbau kemudian dielektroforesis SDS-PAGE. Protein yang dibandingkan adalah protein spesifik darah yang merupakan hasil ekspresi gen dari plasma maupun eritrosit dengan berat molekul 63-66 kDa (haemoglobin), 79-85 kDa (transferrin) dan 90-110 kDa (post transferrin) yang selanjutnya dianalisis dengan menggunakan program MVSP 3.22 untuk memperoleh dendogram yang menggambarkan hubungan kekerabatan kerbau lokal dari populasi Malang dan Bangkalan. Berdasarkan hasil elektroforesis SDS-PAGE diketahui bahwa kerbau Bangkalan seluruhnya memilki protein Hb (63-66 kDa), protein Tf (79-85 kDa) pada individu Bangkalan 1 dan 4 dan protein Ptf (90-110 kDa) pada Bangkalan 2. Kerbau Malang seluruhnya tidak memiliki protein Hb (63-66 kDa), tapi memiliki protein Tf (79-85 kDa) pada individu Malang 2 dan protein Ptf (90-110 kDa) pada individu Malang1 dan 3. Berdasarkan hasil dendogram analisis filogenetik diperoleh dua kluster yang masing- masing ditempati oleh individu dari kedua populasi. Individu yang berkerabat jauh sebaiknya dikawinkan dengan individu dari populasi lain yang memiliki hubungan kekerabatan yang jauh pula. Estimasi sistem perkawinan dapat dilakukan pada individu Malang 1, Malang 3 dan Malang 4 dengan individu Bangkalan 3, Bangkalan 4 dan Malang 2. Kata Kunci: Analisis proteomik, protein darah, Hubungan Kekerabatan, sistem perkawinan kerbau lokal
Populasi ternak kerbau di Indonesia sebanyak 40% terdapat di Pulau Jawa, khususnya di Jawa Timur. Lukitasari (2011) berpendapat bahwa, populasi kerbau terus mengalami penurunan jumlah selama kurun waktu lima tahun terakhir. Penurunan jumlah kerbau disebabkan karena masyarakat lebih menyukai beternak sapi karena nilai jual yang lebih tinggi dibanding kerbau. Kabupaten Malang dan Kabupaten Bangkalan merupakan salah satu daerah yang terus mengalami penurunan jumlah ternak kerbau setiap tahunnya. Hal ini dapat ditinjau dari data statistik mengenai jumlah ternak kerbau di kedua daerah tersebut. Data statistik populasi ternak kerbau di kabupaten Malang menunjukkan penurunan jumlah ternak pada tahun 2009 sebesar 208 ekor, tahun 2010 adalah 198 ekor, tahun 2011 adalah 151 ekor dan tahun 2012 sebanyak 150 ekor. Data statistik populasi ternak kerbau di Kabupaten 1
2
Bangkalan juga menunjukkan penurunan yang signifikan dari tahun 2009 adalah 49.699 ekor, tahun 2010 adalah 49.638, tahun 2011 adalah 32.675, tahun 2012 adalah sebanyak 33.498 ekor kerbau (Disnak Jatim, 2013). Untuk mencegah penurunan populasi, perlu dilakukan usaha pengembangan populasi kerbau lokal, sebagai langkah awal peningkatan mutu genetik hewan tersebut untuk mencegah terjadinya kepunahan (Faruque, 2007). Peningkatan mutu genetik dapat dilakukan dengan melihat hubungan kekerabatan dari setiap individu yang digunakan sebagai estimasi sistem perkawinan. Salah satu cara melihat hubungan kekerabatan setiap individu adalah dengan pendekatan molekuler. Hubungan kekerabatan tersebut dapat diteliti melalui ekspresi protein spesifik pada darah kerbau. Salah satu tolak ukur keberhasilan perkawinan untuk peningkatan mutu genetik dapat dilihat dari keanekaragaman genetik individu yang ada, sehingga keberadaan organisme tertentu secara alami dapat dipertahankan. Keanekaragaman genetik sebagai penelitian awal, akan memberikan konstribusi besar bagi peningkatan produktivitas hewan ternak seperti kerbau, sekaligus berperan penting dalam menentukan kualitas keanekaragaman hayati. Berdasarkan permasalahan yang telah dikemukakan, dan untuk menunjang keberhasilan upaya konservasi serta pembibitan kerbau lokal, maka perlu dilakukan identifikasi variasi genetik. Identifikasi variasi genetik melalui pendekatan molekuler, dapat diketahui berdasarkan pola profil protein yang terdapat dalam darah. Proses ini dapat dilakukan, karena protein dalam darah adalah protein fungsional produk ekspresi gen (Guyton & Hall, 2008). Identifikasi variasi genetik, dapat dimanfaatkan untuk mengetahui filogenetik antara kerbau satu dengan kerbau lainnya pada daerah tertentu. Protein darah spesifik yang terdapat pada darah terutama hasil ekspresi gen dari sel darah merah seperti Haemoglobin serta dari serum darah seperti Transferrin dan Posttransferrin dapat menunjang identifikasi tersebut. Nei et al., (2007) menambahkan bahwa pada tingkat molekuler, gen merupakan segmen DNA yang mengkode atau menyandi sintesis protein tertentu yang dapat menjadi ciri pada organisme. Lukitasari (2011) mengatakan bahwa karakteristik genetik hewan dapat ditentukan berdasarkan karakteristik protein plasma, dan sel darah merah melalui teknik elektroforesis sehingga dapat diperoleh informasi kesamaan genetik, dan variabilitas genetik antara hewan tersebut. Penggunaan teknik elektroforesis pada molekul protein untuk mengetahui keragaman genetik dan jarak genetik individu dalam populasi kerbau, merupakan cara yang dilakukan berdasarkan pendekatan secara molekuler. Dengan demikian, data genetis yang dihasilkan dapat membantu untuk menentukan kebijakan dalam pemuliaan ternak. Teknik elektroforesis SDS PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis), merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk proses analisis protein. Elektroforesis pada prinsipnya, berfungsi sebagai saringan molekul, dimana
3
mobilitas relatif dari SDS-polipetida-kompleks. Dengan adanya SDS, maka memungkinkan pemisahan polipeptida hanya berdasarkan atas berat molekulnya. Pertimbangan proses breeding yang dilakukan kemudian tidak hanya didasarkan pada bentuk fenotip saja, tetapi juga mempertimbangkan faktor genetisnya. Dengan pertimbangan tersebut, diharapkan akan turut meningkatkan keragaman genetis kerbau sehingga sekaligus menjaga keseimbangan populasi dan mampu meningkatkan biodiversitas serta memperkaya plasma nutfah yang sudah ada (Lukitasari, 2011). METODE PENELITIAN Objek penelitian dalam penelitian ini adalah 4 ekor kerbau lokal yang ada di wilayah Wagir kabupaten Malang dan 4 ekor kerbau Burneh Desa Grunggungan dan Du’ur Kabupaten Bangkalan, yang tersebar di berbagai peternak wilayah tersebut. Masing- masing kerbau diambil darahnya kurang lebih sebanyak 3- 5 ml. Pengambilan sampel darah dilakukan dengan teknik manual menggunakan jarum venoject dan tabung vakum, dengan dibantu oleh teknisi dari Dinas Peternakan setempat. Prosedur Penelitian meliputi ; 1) memisahkan plasma darah dengan sel darah merah. Sampel darah disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC. Pencucian sel darah merah dilakukan dengan menambahkan larutan Natrium Chloride 0,9% dengan perbandingan 1:2. Sel darah merah selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit pada suhu 4oC dan pencucian sel darah merah dilakukan 3 kali. 2) Plasma darah kemudian dipurifikasi dengan menggunakan SAS (Sodium Amonium Sulfat) 50% (1:1). 3) Plasma darah dan sel darah merah kemudian dianalisis menggunakan sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) yang dipasang secara vertikal menurut Ogita and Marker (1968). Data yang diambil untuk dianalisis adalah 1) Profil pola pita protein dan frekuensi ekspresi protein yang dianalisis menggunakan program GENEPOP versi 4.2. serta 2) Profil protein yang nampak juga dihitung berat molekulnya berdasarkan marker. Berat molekul protein standart yang dipergunakan sebagai marker dihitung nilai retention factor untuk acuan. Hasil perhitungan berat molekul protein dapat digunakan sebagai data untuk analisis hubungan kekerabatan dengan program MPSV 3.22 untuk mengetahui keanekaragaman genetik dan jarak genetik individu dalam populasi. Hasil analisis berupa dendogram sehingga dapat diketahui persentase similaritas antar individu dalam populasi. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Profil Protein Populasi Kerbau di Wilayah Malang dan Bangkalan Hasil penelitian profil protein pada populasi kerbau di wilayah Malang dan Bangkalan menunjukkan perbedaan pada profil pita protein. Profil pita protein yang berbeda dapat dilihat dari ada dan tidak adanya pita protein serta tebal tipisnya protein
4
yang nampak setelah proses SDS PAGE. Hasil elektroforesis plasma darah dan eritrosit darah kerbau dari populasi Malang dan Bangkalan dengan SDS PAGE dan hasil Zimogram dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2 di bawah ini. A M1 M2 M3
M4 M 4
B B1 B2
B3
B4
M1
M2
M3
M4
M
B1
B2
B3
B4
Gambar 1. Separasi Profil Protein pada Sampel Plasma Darah Kerbau dari Populasi Malang (Sampel M1-M4) serta Bangkalan (Sampel B1-B4) dan Marker (M) (A) Gambar Gel Hasil Elektroforesis SDS-PAGE (B) Gambar Zimogram Hasil Elektroforesis SDSPAGE A B
Gambar 2. Separasi Profil Protein pada Sampel Eritrosit Kerbau dari Populasi Malang (Sampel M1M4) serta Bangkalan (Sampel B1-B4) dan Marker (M) (A) Gambar Gel Hasil Elektro-Foresis SDS-PAGE (B) Gambar Zimogram Hasil Elektroforesis SDSPAGE
5
B. Berat Molekul 3 Protein Spesifik Tabel 1. Tabel Hasil Perhitungan Berat Molekul 3 Protein yang Terbentuk pada Masing-masing Individu
Populasi Malang
Bangkalan
Individu
Haemoglobin (Hb)
Transferrin (Tf)
63-66 kDa
79-85 kDa
Post Transferrin (Ptf) 90-110 kDa
~ ~ ~ ~ 63.4 65.7 63.4 65.7
~ 83.8 ~ ~ ~ ~ 82.0,84.8 84.8
105 ~ 102 ~ ~ 98.9,102 ~ ~
1 2 3 4 1 2 3 4
Berdasarkan Tabel 1 di atas, maka diperoleh data bahwa protein spesifik yang terekspresi pada Populasi Malang adalah transferrin dan post transferrin. Sedangkan pada populasi Bangkalan, ketiga protein spesifik terekspresi seluruhnya. Hal tersebut dapat dilihat sesuai dengan ada tidaknya berat molekul yang muncul dari setiap protein. Dari data tersebut kemudian dapat digunakan sebagai input data untuk analisis frekuensi ekspresi protein menggunakan GENEPOP. Tabel 2. Frekuensi Ekspresi Protein Spesifik Darah Kerbau pada Populasi Malang dan Bangkalan Frekuensi Ekspresi Protein pada Berat Molekul (kDa) Populasi di Malang
Bangkalan
Macam Protein Haemoglobin Transferrin Post transferrin Haemoglobin Transferrin Post transferrin
63,4
65,7
82,0
83,8
84,8
98,9
102
105
-
-
-
1 -
-
-
0.5
0.5
0.5 -
0.5 -
0.25 -
-
0.75 -
0.5
0.5
-
Dari paparan tabel di atas, variasi genetik ditunjukkan dengan melihat nilai frekuensi protein yang terekspresi. Populasi Bangkalan lebih bervariatif karena menunjukkan frekuensi ekspresi protein pada ketiga lokusnya. Selain itu, ketiga protein spesifik (haemoglobin, transferrin, dan post transferrin) terekspresi seluruhnya hanya pada populasi Bangkalan. Berarti tiga protein spesifik tersebut, dapat dijadikan sebagai protein penanda pada populasi tersebut, karena pada populasi Malang hanya dua protein yang muncul yaitu transferrin, dan post transferrin. Nilai frekuensi ekspresi protein dan
6
persentase heterozigositas yang tinggi dimiliki oleh populasi Bangkalan. Ekspresi protein pada lokus transferrin, dan post transferrin lebih bervariasi jika dibandingkan dengan haemoglobin. C. Estimasi Hubungan Kekerabatan Berdasarkan Profil Protein Spesifik pada Darah Kerbau Perbandingan profil protein darah berdasarkan ada tidaknya protein spesifik pada populasi kerbau Malang dan Bangkalan seperti pada Tabel 1di atas, selanjutnya dapat dianalisis lebih lanjut berdasarkan profil protein dan keberadaan protein penanda di dalam eritrosit maupun plasma darah kerbau, dengan menggunakan program Multivariate Statistical Package (MVSP) 3.22. untuk memperkirakan hubungan kedekatan serta jarak genetik antar individu satu dengan individu lainnya, baik dalam satu populasi maupun berbeda populasi. Analisis kluster yang dilakukan menggunakan program MVSP 3.22 akan menghasilkan dendogram dan nilai indeks similiaritas dimana dari gambaran dendogram serta nilai indeks similiaritas dapat diketahui seberapa besar kedekatan hubungan antar individu. Gambar di bawah ini merupakan gambar dendogram hasil analisa kluster menggunakan MVSP 3.22. Kluster 1
Kluster 2
Gambar 3. Dendogram Pola Pita Tiga Protein Spesifik pada Darah Kerbau Populasi Malang dan Bangkalan.
Berdasarkan hasil analisis dendogram dengan menggunakan Cluster Analysis pada populasi Malang dan Bangkalan berdasarkan pada keberadaan protein penanda (Haemoglobin, transferrin dan post transferrin), menunjukkan percabangan yang berbeda- beda. Pecabangan-percabangan tersebut dikelompokkan menjadi dua kluster yaitu kluster 1 dan kluster 2. Hasil penelitian menggambarkan hubungan tiap individu dalam populasi yang dihubungkan oleh dua kluster yang berbeda. pada kluster 1 ditempati oleh tiga individu dari dua populasi yang berbeda yaitu individu dua Bangkalan dan satu Malang. Hal serupa juga terjadi pada kluster 2 yang ditempati oleh lima individu dari dua populasi yang berbeda. Dalam satu kluster terdapat dua populasi yang berbeda.
7
Hal ini tidak sesuai dengan penyataan Lartillot & Philippe (2008), yang berpendapat bahwa individu dalam satu populasi yang sama akan memungkinkan memiliki hubungan kekerabatan yang lebih dekat. Epperson (1989) menambahkan, bahwa pada jarak geografis yang pendek, aliran gen mempengaruhi struktur genetik di dalam populasi, sehingga tingkat variasi gen di dalam satu populasi adalah rendah. KESIMPULAN Hasil elektroforesis SDS-PAGE pada isolat protein darah diketahui bahwa secara umum profil protein pada dua populasi tidak jauh berbeda. Hasil elekroforesis eritrosit dan serum darah kerbau dari Malang dan Bangkalan menunjukkan bahwa protein dengan berat molekul 63-66 kDa hanya dimiliki oleh kerbau dari populasi Bangkalan saja. Sedangkan protein dengan berat molekul 79- 85 kDa hanya dimiliki oleh kerbau individu 2 populasi Malang dan populasi Bangkalan pada individu 3 dan 4. Protein dengan berat molekul 90-110 kDa hanya dimiliki oleh individu Malang 1 dan Malang 3 serta Bangkalan 2. Nilai frekuensi ekspresi protein yang lebih bervariatif ditunjukkan oleh populasi Bangkalan. Semakin bervariatif frekuensi ekspresi protein, maka semakin tinggi pula variasi genetic yang dimiliki oleh suatu populasi. Berdasarkan hasil analisis kluster dengan dendogram menunjukkan Kluster 1 ditempati oleh individu dari Bangkalan 4, Bangkalan 3 dan Bangkalan 2. Kluster 2 ditempati individu Malang 1, malang 3, Malang 4, Bangkalan 1 dan Bangkalan 2. Setiap individu yang berada pada satu kluster maka dianggap memiliki hubungan kekerabatan yang dekat. Semakin rendah indeks similaritas maka hubungan kekerabatan semakin jauh, dan sebaliknya semakin tinggi indeks similaritas maka hubungan kekerabatan suatu individu semakin dekat. SARAN Dilakukan penelitian serupa dengan menambah jumlah individu kerbau dalam setiap populasi yang di analisa polimorfisme proteinnya agar dapat diketahui variasi genetik antar individu dalam populasi. Estimasi teknik perkawinan yang efektif untuk dilakukan bahwa seluruh individu pada kluster 1 dapat dikawinkan dengan individu pada kluster 2 tetapi hanya Malang1, Malang3 dan Malang4. DAFTAR RUJUKAN Clark.,D. 2005. Molecular Biology Understanding. Elsevier Academic Press Publications. California Faruque,M.O., 2007. The Genetic Diversity of Bangladesh Buffaloes. Italian Jounal Animal Science. Volume 6, 349-352. Gardner, E.J.,1991. Principles of Genetics. John Wiley and Sons, Inc.
8
Guyton, A.C., Hall, J.E. 2006. Textbook of Medical Physiology. 11th edition. Philadelphia: Elsevier Saunders. p. 990-997, 1038-1050 Lukitasari, Marheny. 2011. Variasi genetik kerbau lokal (Bubalus bubalis) di wilayah Madiun dan Malang Berdasarkan Profil dan Polimorfisme Protein Darah sebagai Bahan Ajar Teknik Analisis Biologi Molekuler. Tesis. Universitas Negeri Malang. Nei, M., 1978. The Theory of Genetic Distance and Evolution of Human Races. Japan Society of Human Genetic. 23, 341-369. Ogita, Z.I. and Markert, C.L., 1979. A Miniaturized System for Electroforesis on Polyacrilamide Gels. Analytical Biochemestry, 99. 233-241.
