ÁLLATÉLETTAN GYAKORLATOK I-II

DÉNES VIKTÓRIA-HERNÁDI ISTVÁN

ÁLLATÉLETTAN GYAKORLATOK I-II PRACTICUM

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM 2014

BEVEZETÉS

A laboratóriumi munka rendje A laboratóriumi helyiségben a gyakorlatok alatt csak a gyakorlatvezető, az asszisztens, illetve a gyakorlaton résztvevő hallgatók tartozkódhatnak. A teremben tartozkódó valamennyi személy köteles betartani a tűzvédelmi és munkavédelmi előírásokat. Valamennyi személy köteles betartani az állatkísérletekkel kapcsolatos etikai kódex előírásait. A gyakorlat megkezdése előtt a csoportvezető (a gyakorlatvezető jelöli ki) az asszisztenstől leltár alapján átveszi a gyakorlati termet. A gyakorlat végeztével a hallgatók rendbe teszik a termet, majd a csoportvezető átadja az asszisztensnek a gyakorlatos helyiséget. A hallgatók kizárólag ezek után hagyhatják el a termet. A laboratóriumot elhagyni csak bejelentés után lehet. Hallgató mobiltelefonálással nem zavarhatja a gyakorlat menetét. Nagy méretű táskák, nagyobb tárgyak tárolása a hallgatói laboratóriumban nem megengedett. A terembe legfeljebb egy kézitáska hozható be.

Munkavédelmi és tűzvédelmi előírások a hallgatói laboratóriumban Az alábbi előírások minden személyre vonatkoznak, akik a hallgatói laboratóriumban

és

az

előkészítő

helyiségben

tartózkodnak.

A

szabályok

tudomásulvételét aláírásukkal igazolják, az azok megszegéséből eredő balesetekért az illető személyt terheli felelősség. Valamennyi hallgatónak kötelező ismerni a következő eszközök tárolási helyét és működését: • •

Gázcsapok, vízcsapok, elektromos kapcsolók Porraloltó készülék, vészzuhany -2-

• • •

Elsősegélynyújtó felszerelés Elszívó berendezések Vegyszerek és segédanyagok

A gyakorlatokon kötelező egy kultúrált megjelenésű, begombolható, lehetőleg pamut laborköpeny viselése. Köpeny nélkül vagy elfogadhatatlan megjelenésű és kinézetű köpenyben a munka nem kezdhető el. A hosszú hajat, a baleset elkerülése végett össze kell fogni. Étkezni és dohányozni szigorúan tilos a laboratóriumban mindenki számára. Sebzett kézzel ne dolgozzunk. A laboratóriumi munka végeztével gondosan mossunk kezet, használjunk kézfertőtlenítőt. A gyakorlatvezetőnek jelentsük ha bármiféle rendkívüli esemény következik be (sérülés, károsodás). Bármilyen, számunkra jelentéktelen eseményt (karmolás, preparálás közben történt sérülés stb.), toxikus anyagokkal való érintkezést, balesetet, veszélyforrást (pl. meglazult foglalat, kilógó vezeték) szintén jelenteni kell a gyakorlatvezetőnek. A nagyobb műszerek ki/be kapcsolásához, vagy ha kérdések merülnek fel a gyakorlat kivitelezésével kapcsolatban, kérjük a gyakorlatvezető segítségét. A maró anyagok és tömény savak/lúgok kezelése kizárólag gumikesztyűben, védőszemüvegben történhet. Ha maró anyagok kerülnek a bőrünkre, azonnal töröljük le puha ruhával, majd mossuk le bő csapvízzel. Mérgező, maró folyadékok pipettázása csak dugattyús pipettával vagy pipettázó labdával történhet. A kísérleti hulladékokat elhelyezni csak megfelelő módon és az arra kijelölt helyen szabad. A veszélyes hulladékokat (savakat, lúgokat, szerves oldószereket stb.) gyüjtőedényben gyűjtsük. Vegyszermaradványt ne tegyünk vissza a tárolóedénybe. A gyakorlati órák alkalmával elkerülhetetlen a nyílt lánggal, melegítéssel való munka. •

A gázégő begyújtása: 1.) tűzveszélyes anyagok eltávolítása, 2.) a kivételi hely gázcsapjának elzárása, 3.) a fő gázcsap kinyitása, 4.) az égő levegőszelepének szűkítése, 5.) a gyufa meggyújtása, 6.) a kivételi hely gázcsapjának kinyitása és a gáz meggyújtása -3-

• A kémcsőveket szakaszosan melegítsük, az edény száját soha ne irányítsuk személyek felé. • Tűzveszélyes anyagokat ne tartsunk nyílt láng közelében. Az ilyen anyagokat tartalmazó üvegeket tartsuk lezárva, és egyszerre csak kis mennyiséget töltsünk ki. • Ne torlaszoljuk el a kijárati ajtót, és az asztalok közötti teret. • Az elektromos berendezéseket csak a gyakorlatvezető előzetes útmutatása alapján szabad használni. Ne nyúljunk elektromos berendezésekhez nedves kézzel, ne érintsünk elektromos berendezést és földelt tárgyat egyszerre. A padló, melyen elektromos tárgyakkal kísérletezünk, legyen mindig száraz. • Tilos bármely elektromos készülék belsejébe nyúlni. A meghibásodást jelentsük a gyakorlatvezetőnek, a készüléket pedig a hálózati csatlakozó kihúzásával áramtalanítsuk. Munkahelyünkön tartsunk rendet. Bármilyen rendellenességet tapasztalunk, azt jelentsük a gyakorlatvezetőnek. Rövid emlékeztető az elsősegélynyújtási teendőkről Vegyszerek használata mindig csak a vegyszer biztonsági adatlapja szerint történhet. Az elsősegélynyújtási eljárásokat a gyakorlatvezető felügyeli! Tűz vagy égési sebesülés esetén Az égő tárgy azonnal eloltandó alkalmas segédeszközökkel (víz, homok, porraloltó, pokróc, stb.). Elektromos tüzet vízzel nem szabad oltani. Az égési sebet ne mossuk, ne érintsük, ne kenjük be, hanem csak laza és száraz gézlappal fedjük be. Kisebb sérülésnél (zárt bőrfelületnél) használhatók az Irix vagy Naksol szerek. Mérgezés esetén Ha bőrre került: száraz ruhával leitatjuk, majd bő vízzel lemossuk. Ha szembe jutott: bő vízzel kimossuk, majd 2%-os bórsav oldattal (ha lúg került a szembe) vagy NaHCO3 oldattal (ha sav került a szembe) öblítünk és a szemöblögető készletet használjuk. Ha belélegezték: friss levegőre visszük a sérültet. Ha szájüregbe jutott: a vegyszert kiköpjük és bő vízzel öblögetünk. Ha lenyelték: hánytatás, kivéve ha a vegyszer maró vagy az illető sokkos/eszméletlen. Sebesülés esetén A sebet nem mossuk vízzel, hanem enyhén kivéreztetjük. A sebet körül fertőtlenítjük a baleseti szekrényből vett alkoholos jódoldattal, majd tiszta és laza gézkötést helyezünk rá. Kisebb sérüléseknél sebtapaszt alkalmazunk

-4-

Áramütés esetén Feszültségmentesítünk, illetve az áramütést elkerülve kiszabadítjuk az áramütöttet. A balesetest lefektetjük, pihentetjük és a sebeit laza gézkötéssel látjuk el. Amennyiben az áramütés a szívet leállítaná, azonnali újraélesztésre van szükség. Az állatkísérletek etikai szabályai 1. A kísérletre kijelölt állatokat fajuknak megfelelő körülmények között kell tartani, táplálni és szociális kapcsolataikat biztosítani. Beteg állatokat szakszerű orvosi ellátásban kell részesíteni. 2. A kísérletet tervező, illetve végző kutatónak rendelkeznie kell megfelelő szakmai képzettséggel, felkészültséggel az állatokon végzett kísérletek etikai problémáinak ismeretével 3. Csak annyi állatott használjunk fel, amennyi a gyakorlatokhoz feltétlenül szükséges! 4. Egy és ugyanazon állaton tartósan és ismételten csak akkor lehet kísérletet folytatni, ha azt az elfogadott kísérleti terv megköveteli. 5. Az állatokon végzett kísérleteknek a lehető legrövidebb ideig kell tartaniuk. 6. Tervezett kísérleteknél lehetőség szerint a fájdalom bármilyen formáját el kell kerülni. 7. Altatás nélkül nem szabad olyan beavatkozást végezni, amely fájdalmat okoz, vagy az állat nem képes a fájdalom, illetve a kellemetlen érzés elhárítására. 8. Az állatok altatásakor a gyakorlati jegyzet előírásai az irányadók. A beavatkozás előtt meg kell győződni az altatás mélységéről. A narkózis mélysége akkor megfelelő, ha a cornea reflex, illetve a fájdalomreflexek nem válthatók ki. 9. Állatkísérleteket csak megfelelő intézetben, és csak akkor szabad végezni, ha a tervezett ismeretanyag másképp nem megszerezhető. 10. Törekedni kell arra, hogy az állatot szövettenyészettel, mikrobiológiai anyagokkal helyettesítsük. 11. Állatot vásárolni csak tulajdonostól, vagy hivatalos szállítótól szabad. Emberen végzett vizsgálatok és megfigyelések etikai szabályai 1.

Emberen invaziv beavatkozást csak arra alkalmas egészségügyi helységben, steril

eszközökkel szabad végezni.

-5-

2.

A vizsgálatokat, megfigyeléseket csak önként jelentkezőkön, a megfigyelés

körülményeinek és várható eredményének ismertetése után végezhetjük. Kísérleti műtéttani alapismeretek A kísérleti állatok érzéstelenítése 1. Helyi érzéstelenítés. A helyi érzéstelenítés során az adott műtéti területen megszüntetjük a szinaptikus ingerületátvitelt vagy vezetést helyi érzéstelenítők (pl. Novokain, Lidokain, stb.) bőr alá, nyálkahártyafelületre, gerincvelőbe, stb. való fecskendezésével. Ennek eredményeképpen a fájdalmas ingert közvetítő impulzusok nem jutnak el az agyba. 2. Általános érzéstelenítés. Altatás, narkózis, megfelelő szerek (narkotikumok) alkalmazásával érhető el. A narkotikumok megszüntetik a fájdalomérzetet, de a többi idegrendszeri funkciót nem bénítják meg teljesen. A ma használatos altatók (narkotikumok) hatássorrendje általában a következő: agykéreg - subcortex - kisagy nyúltagy - gerincvelő. A hatást a dózis megfelelő megválasztásával lehet szabályozni, amit testtömegre számítva szokás megadni. A gyakran használt kísérleti állatok esetében testtömeg-dózis táblázatok segítik a dózis kiválasztását. Jellemző adat a hatásszélesség: a közepesen hatásos dózis (ED50) és a közepesen letális dózis (LD50) különbsége. Az előbbi azt jelenti, hogy adott dózis a kezelt állatok felében kivált hatást, az utóbbi dózis esetében annál veszélytelenebb a szer alkalmazása, annál kisebb a túladagolás veszélye. Megfelelő altatás esetén a keringési és légzési működés, az izmok tónusa megmarad. Ha ez utóbbit a beavatkozás érdekében csökkentetni kell, izombénítókat, általában kurare származékokat szoktak adagolni. Ilyenkor szükség lehet a kísérleti állat mesterséges lélegeztetésére. A túlságosan mély altatás esetén fellépő komplikációk többsége ugyancsak a légzési funkció bénulása miatt következik be. További fontos tudnivaló, hogy altatás alatt csökken a testhőmérséklet, ezért az állatokat - különösen hosszabb műtétek végzésekor - melegíteni kell. A sebészeti gyakorlatban általában gáznemű, esetleg párolgó narkotikumokat használnak, állatkísérletekben azonban inkább az oldatok alkalmazása gyakoribb. Ez utóbbiakat adhatjuk intraperitoneálisan (i.p.) vagy intravénásan (i.v.). Az előbbi egyszerűbb, az utóbbi viszont gyorsabban hat és jobban adagolható (lásd még: kezelési módok fejezetben). A narkózis szakaszai a dózis és az idő függvényében a következő sorrendben jelennek meg: A sebészeti műszerek és használatuk -6-

1. Vágó eszközök. A bőr felnyitására szikét, esetleg sebészeti ollót használunk. A szőr eltávolítását lapjára hajlított (Cooper-féle) ollóval végezzük. A belső szervek megsértésének elkerülésére célszerű az egyik végén tompa ollókat használni. Csontos részek vágására a csontolló való. A koponya felnyitásához koronafúrót (vagy trepánt), a koponyacsontok eltávolítására csontcsípőt alkalmazunk. A csontfelszíni hártyák lekaparására szolgál a raspatórium. A belső szervek (erek, idegek, szövetek) felnyitására, illetve vágására való a szemészeti (iris) olló. Fontos, hogy a vágó eszközök mindig élesek legyenek. 2. Fogó eszközök. Gyakorlatainkon többféle csipeszt használunk. A bőr megfogására alkalmazzuk a horgas, az egyéb szövetek felemelésére a sima végő anatómiai csipeszt. A belső szervekkel végzett munkában a fogászati, illetve a szemészeti csipeszeket használjuk; ez utóbbi horgas és sima változatban is készül. Használunk különböző érfogókat is. Ezeket az ujj felöli végen fogazott keresztlemezek segítségével rögzíteni lehet; így a helyükön hagyhatók anélkül, hogy tartani kellene őket. 3. Sebzáró eszközök. A műtéti sebek zárására kétféle mód kínálkozik: a varrás és a kapcsolás. Varráshoz tűfogót és sebészeti tűket használunk. Ez utóbbiak lehetnek háromszög keresztmetszetű éles vágótűk és kör keresztmetszetű serosa-tűk. Méretük, hosszuk és típusuk számozás szerint változik; a kisebb számok vékonyabb átmérőt jelölnek. A fonalat e tűkbe nem befűzzük, hanem a tű fokába bepattintjuk. A sebészeti gyakorlatban manapság fonallal előre ellátott, sima felszínű, ún. atraumatikus tűket használnak. A varráshoz használt fonalak is többfélék. A gyakorlaton legtöbbször varróselymet használunk. A sebészeti gyakorlatban pamut, selyem és műanyag alapú, különböző vastagságú fonalakat alkalmaznak; a belső szerveket pedig lassan felszívódó, bélből készült (ún. catgut) fonallal varrják. A sebészeti kapocs a bőrsebek zárására szolgál, mely később eltávolítható. Felhelyezésére és eltávolítására speciális szerszámot használnak. 4. Egyéb eszközök. Folyadékok bevitelére szolgálnak az injekciós fecskendők és tűk. A fecskendő kónuszának (kúpos rész, amire a tűket felhúzzuk) mérete alapján Record és Luer típusú fecskendőket és tűket különböztetünk meg. A fecskendő üvegből vagy műanyagból készül, 1 ml-es (tuberkulin), 2, 5, 10 és 20, stb. ml-es térfogatban. Nagyobb mennyiségű folyadékkal végzett átmosásra az 50-250 ml-es Farkas-fecskendőket használják. Az üreges szervekbe helyezhető kanülök üvegből vagy műanyagból (polietilén, szilikon, teflon) készülnek többféle átmérőben. Az üvegkanülök formálhatók

-7-

is, rajtuk kiöblösödéseket (bulbus) és horgokat is elhelyezhetnek. A trachea-kanülök T vagy Y alakúak, az artériás kanülöket oldalágakkal készítik. Különlegesen kiképzett, heggyel és horoggal ellátott eszköz a Straub-kanül. A szerveknek folyadékkal történő öntözését szolgálja a Pasteur-pipetta, amelyben a folyadékot az üveg vagy műanyag cső végére illesztett zárt gumicső hajlítgatásával tudjuk mozgatni. Preparátumok és az anyagbevitel alaptípusai Az élettan gyakorlatokon sokszor akut (heveny) beavatkozásokat végzünk, azaz a kísérlet végén az állatot feláldozzuk. Bizonyos kísérletek céljaira krónikus műtéteket végzünk, ami után az állat az altatásból felébred és felépül. Ahhoz, hogy a műtétet elvégezhessük, és a kísérlet közben is végezhessünk beavatkozásokat, az altatott állatokat is rögzíteni kell. Ennek módja az állat fajától és a műtét céljától függ. Békákon végzett preparálás céljára általában elegendő, ha az állatok végtagjait gombostűvel a békatál viaszához rögzítjük. Patkányokat a végtagokra helyezett zsineg segítségével kötözzünk a patkánypadra, és célszerő a felső metszőfogak révén a fejet is rögzíteni. Ha éber patkányon dolgozunk (pl. farokvénázás), kb. 5 cm átmérőjű, végén zárt csőbe helyezzük az állatot, így azután csak a farka lóg ki. Az agy vizsgálatához, a kísérleti állat fejének rögzítésén kívül biztosítani kell azt is, hogy a koponyán belüli struktúrákat a koponya külső, kísérleti állatfajonként különböző vonatkoztatási pontjaihoz (csontos hallójárat, felső állkapocs, szemgödör alsó csontos éle, stb.) képest tizedmilliméter pontossággal felkereshessük. Erre szolgál az úgy nevezett sztereotaxikus készülék. Az állat rögzítése után a műtéti terület előkészítése, tisztítása következik. Az emlős állatok szőrzete nehezíti a bőr megnyitását, szennyezi a műtéti területet, és krónikus műtétek esetében fertőzés forrása lehet. Ezért a műtéti területről a szőrzetet el kell távolítani. Patkány és egér esetében ujjal, esetleg csipesszel a szőr a műtéti terület környezetében könnyedén kicsipkedhető (krónikus műtétet követően a szőr néhány hét alatt visszanő). A kicsípett vagy a levágott szőrzetet vizes vattára nyomjuk, hogy elkerüljük a levegőbe kerülését, és esetleges belégzését. Krónikus műtét esetében a beavatkozás majdani területét jóddal vagy alkohollal alaposan át kell törölni; akut beavatkozás esetén erre nincs szükség. 1. Az „in situ" (helyén maradó) preparátum. Ilyenkor valamely szervet úgy figyelünk meg, hogy közben nem szüntetjük meg a kapcsolatát a test többi részével, és nem nyitjuk meg magát a szervet sem, de esetleges burkaiból kiszabadítjuk. Ilyen pl. az "in situ békaszív" preparátuma.

-8-

2. Az izolált szerv (in vitro). Ilyenkor a vizsgálni kívánt szervet a testből kiemeljük, és a működése közben számára megfelelő környezetet (fiziológiás összetételű átáramoltató, vagy fürdető folyadékot) biztosítva vizsgáljuk. Ilyen a "Straub-szív" vagy a "Magnusféle izolált bélkacs" preparátum. 3. Eltávolítás (exstirpatio), illetve a roncsolás (laesio). Valamely szervet vagy annak egy részét kiirtjuk vagy elroncsoljuk, és azt vizsgáljuk, hogy milyen változást okoz a hiány a vizsgált működésben. Ezzel a módszerrel tanulmányozhatjuk a belső elválasztású mirigyek funkcióit, illetve egyes agyi területek szerepét. 4. Az átmetszés (transsectio) során az idegeket vagy pályarendszereket vágjuk át. 4. Kanülözés. Üreges szervek belsejébe vékony csövet (kanült) vezetve oda anyagok bevihetők, illetve onnan folyadékok kinyerhetők. Kanült helyezve a légcsőbe biztosítjuk az altatott állat komplikációmentes légzését; az artériákba helyezett kanül segítségével vérnyomást mérhetünk, a vénás kanülön át folyadékokat adagolhatunk a szervezetbe; a bél és a gyomor kanülözése után emésztőnedveket, az uréter-kanülön át pedig vizeletmintákat nyerhetünk. 5. Ingerlő elektródok és érzékelők beépítése. Elektromos ingerlőket (elektródokat) elsősorban idegekre helyezünk fel, leggyakrabban a nervus vagusra (szív, tüdő és gyomorfunkciók vizsgálata esetén), illetve a nervus ischiadicusra (izomműködés, érzőés mozgatóműködés tanulmányozása). A regisztráláshoz részben kanülöket, részben elektródokat, részben mechanikai eszközöket (tűket, csíptetőket) helyezünk a vizsgálandó szervbe vagy szervre, és azokat a megfelelő mérő és adatrögzítő berendezéssel kötjük össze. E berendezések (különféle erősítők, a számítógép, oszcilloszkóp) ismertetésére a megfelelő fejezetben kerül sor . Anyagbevitel. Élettani kísérletek során gyakran előfordul, hogy a bélcsatorna megkerülésével kell valamilyen anyagot (gyógyszert = farmakont = drogot, altatót stb.) az állat testébe bejuttatni. Ilyenkor injekciót alkalmazunk. Az injekció beadásának többféle módja van: 1. Bőr alá (subcutan, s.c.): a bőrt kissé fölemeljük, és a tűt hegyes szögben tartva, erőteljes mozdulattal átszúrjuk. Miután meggyőződtünk arról, hogy a tű a bőr és az alatta lévő szövetek közötti térben van, a fecskendőből a folyadékot bejuttatjuk. Nagyobb térfogat adása esetén lassan kifelé mozgatjuk a tűt, hogy ne egy helyre kerüljön az összes folyadék. Békáknál a bőr alatt ún. limfazsákokat találunk, ezekből könnyen felszívódik a folyadék. A limfazsákokat egymástól sövények választják el.

-9-

2. Izomba (intramuscularisan, i.m.): a folyadékok innen lassabban, de egyenletesebben szívódnak fel. Az injekciót határozottan és gyorsan kell beadni, így lényegesen kisebb a fájdalom. 3. Hasüregbe (intraperitonealisan, i.p.): főleg kis állatokon alkalmazzuk. Az injekciót a hasfal átszúrásával adjuk be. Ezt úgy kell elvégezni, hogy a belső szerveket ne sértsük meg. (Különösen veszélyes a máj megsértése, ami hosszan tartó és erős vérzéssel jár.) A belek általában kitérnek a tű elől. Az i.p. adott anyagok gyorsan szívódnak fel, de hatásuk erősen függ az állat beleiben levő tápanyag mennyiségétől. A táblázatokban megadott dózisok 24 órán át éheztetett állatokra vonatkoznak; a nem éheztetett állatok esetében a hatás kiszámíthatatlan. 4. Vénába (intravénásan, i.v.): gyors és pontos adagolást tesz lehetővé. Hátránya, hogy

nem mindig egyszerű a megfelelő vénát megtalálni. Egér és patkány esetében leggyakrabban a farokvénát használják, ezt a farok meleg vízbe mártásával kissé ki lehet tágítani. Csak igen vékony tűvel érhető el eredmény. Nyúlban a fül peremén futó vénák könnyen megtalálhatók; xilollal átitatott vattával a bőrt megdörzsölve megfelelően ki is tágíthatók. E művelethez a nyulat kalodába helyezzük. Macska és kutya i.v. injekciózása nagy rutint igényel, ám kezes állatokban éberen is elvégezhető (különösen kutyában), egyébként azonban célszerű rövid előaltatást végezni (pl. éterrel vagy i.v. narkotikummal). Az i.v. injekciónál ügyelni kell arra, hogy a tűt az érrel párhuzamosan vezessük be, meggátolva ezzel annak teljes átszúrását. A véna proximális (szív felöli) végének összenyomása vagy leszorítása révén vér halmozódik fel, ami nagymértékben megkönnyíti a célzást. Ha egy műtét során többször is szükséges vénás injekciót adni, akkor célszerű rövid előaltatásban vénás kanült bekötni.

- 10 -

1. LÉGZÉS ÉLETTANA Néhány prokarióta élőlénytől eltekintve a Földön kifejlődött szervezetek anyagcseréje oxigénen alapszik. Légzés folyamán a szervezet oxigént vesz fel, amelyet a sejtek felhasználnak a bennük zajló biológiai oxidációhoz, míg az anyagcsere termékként keletkező CO2 a légzőrendszeren keresztül eltávozik. A gázcsere az egysejtűeknél a sejthártyán, a légzőszerv nélküli állatoknál a bőrön keresztül diffúzióval megy végbe. A légzőszervvel rendelkező állatok trachearendszerrel, kopoltyúkkal, vagy tüdővel lélegeznek. Az első, légzőszervként funkcionáló trachearendszer az Artropodáknál figyelhető meg. A testfelszínre vezető nyílásokkal (stigma) kezdődően a légcsövek a test belsejében haladva egyre kisebb ágakra oszlanak, végül vakon végződnek közvetlenül a sejtek közelében. A trachearendszerrel rendelkező állatok esetében a légzési gázok szállításában a keringési rendszer nem vesz részt. Gerinces

állatoknál

megfigyelhetők

a

vízi

és

szárazföldi

életmódhoz

alkalmazkodott légzőszervek. Az evolúció során a vízből történő O2 felvételre alkalmas kopoltyúk több típusa kifejlődött. A csontos halakra jellemző lemezes kopoltyú a garat kitüremkedéséből kialakuló kopoltyúívekből fejlődik ki. A kopoltyúívek alkotják a kopoltyú vázát, melyeken fésűfog alakzatban sorakoznak a kopoltyúlemezek. A kopoltyúlemezek felületét tovább növelik a szintén fésűfogszerűen elhelyezkedő kettőzetek, a kopoltyúlemezkék (1. ábra). Ez utóbbiak egyrétegű köbhám rétegén keresztül történik meg a gázcsere.

- 11 -

1. ábra. A lemezes kopoltyú felépítése

A kopoltyúlégzés mellett, a halaknál jelentős O2 felvétel történik a testfelszínen keresztül (ide értve a szájüreg,-garat,-bélrendszer nyálkahártyáját), illetve a tüdős halak csoportjánál a garat ventrális kinövéséből kialakul egy primitív tüdő. Érdekes megjegyezni, hogy a nitrogéntartalmú anyagcsere végtermékek a kopoltyúkon keresztül szekretálódnak ezért a halak kopoltyúja fontos kiválasztószervként is funkcionál. A vízi és szárazföldi életmódot egyaránt folytató kétéltű fajoknál a gázcserét sokféle mechanizmus biztosíthatja. Találunk példát kopoltyú,- bőr,-szájüregi,- vagy/és tüdőlégzésre egyaránt. A kétéltű békáknak nincs zárt mellkasa, hiányoznak a bordaközti izmok és a rekeszizom. Ezeket ki,-és belégzéskor a torok,- és a testizmok helyettesítik. A szájfenék állandó gyenge mozgást (torokoszcillació) végez, ez a mozgás az orrnyíláson keresztül cseréli a levegőt a szájgaratüregben, úgy, hogy a gégerés zárva marad és a szájüreg nyálkahártyáján keresztül történik a gázcsere (2. ábra). Ritkábban, kb. percenként egyszer az orrnyílás bezárul, a gégerés kinyílik, a szájfenék felemelkedése és a szem behúzódása a szájgarat levegőjét a tüdőbe préseli. Kilégzésnél a hasizmok összehúzódása préseli ki a tüdőből az elhasznált levegőt a szájgaratüregbe. A CO2-ban dús levegőt a szájfenék felemelkedése a kinyíló orrnyílásokon keresztül a levegőbe juttatja.

- 12 -

2. ábra: A kecskebéka légzése (A) torokoszcilláció; (B) a gégerés nyitása és a tüdő feltöltése friss levegővel; (C) a gégerés nyitása, orrnyílás nyitása, a tüdő CO2-ban dús levegőjének kipréselése

Hüllők, madarak és emlősök lég,- illetve gázcseréje teljes mértékben tüdőlégzésen alapul. A tüdővel történő légzés az aktív izommunkával létrehozott negatív nyomáson alapuló belégzés és a passzívan kialakuló kilégzés ciklusos váltakozása. Hüllőknél a belégzést a bordaközi izmok és a hasfal izmainak kontrakciója hozza létre, míg madaraknál és emlősöknél a belégzéshez szükséges aktív izommunka kiegészül a rekeszizom összehúzódásával is. A tracheaból leágazó bronchus,- és alveolus rendszer kifejlődése nagy fokú kompartmentalizációt jelentett, mely a gázcserére alkalmas felület nagy mértékű növekedését vonta maga után (3. ábra).

3. ábra. (A) A madár és emlős légzőrendszerre jellemző trachea/bronchus/bronchiolus rendszer felépítése. (B, C) Emlős tüdőt felépítő alveolusok pásztázó elektromikroszkópos képe.

Emlősökben a rekeszizom és a külső bordaközti izmok összehúzódása biztosítja a mellüreg térfogatának növekedését, melyet a tüdők passzívan követnek. A levegő be- és - 13 -

kiáramlását az alveoláris és az atmoszférás nyomások között kialakuló különbségek hozzák létre. Légzésszünetben az intrapulmonális nyomás megegyezik a légköri nyomással. Nyugalmi légzés esetén belégzéskor az intrapulmonális nyomás 1-3 Hgmm-el alacsonyabb, kilégzéskor 1-3 Hgmm-el magasabb, mint a külső légnyomás. A tüdő felszínét a mellhártya (pleura) viszcerális lemeze, a mellkasfal belső felszínét a parietális lemeze fedi. A két pleura lemez közötti virtuális térben (intrapleurális tér) folyadékfilm található, így a két lemez egymáson könnyedén elcsúszik, de egymástól szét nem választható. A mellkas térfogatának változásai elsődlegesen az intrapleurális tér nyomásváltozásaiban tükröződnek. E nyomásváltozások megváltoztatva a tüdő térfogatát, másodlagosan az intrapulmonális tér nyomásértékeit is megváltoztatják (4. ábra). A tüdő retrakciós tendenciája miatt az intrapleurális (intratorakális) nyomás a kilégzés végén is a légköri nyomás alatt marad (-2-4 Hgmm). Belégzés végén a mellkas tágulásának hatására az intrapleurális nyomás értéke még jobban a légköri nyomás értéke alá csökken (-68 Hgmm).

4. ábra: Az intrapulmonális- (A) és az intrapleurális nyomásnak (B), valamint a kicserélt levegő térfogatának (C) változásai be- és kilégzés alatt

- 14 -

1.1. Csontos hal kopoltyúlégzésének vizsgálata Anyagok és eszközök: csontos hal, üvegkád, stopperóra, szobahőmérsékletű-, hideg-, meleg víz, hőmérő A kopoltyúk friss vízzel való ellátását a légzőmozgások biztosítják (5. ábra). Belégzéskor a szájüregbe víz áramlik. A kopoltyúfedő-készülék egyes csontjai egymástól elmozdulnak, így a kopoltyúfedők (operculum) a középvonaltól kifelé domborodnak és a kopoltyúfedő-hártyák (branchiostegális hártyák) zárják a kitágult kopoltyúüreg nyílását. A nyomáskülönbség hajtja be a vizet a szájüregből a kopolyúüregbe. Kilégzéskor az operculumok eredeti helyzetüket veszik fel, a branchiostegális hártyák felemelkednek és a víz a megkisebbedett üregből a kopoltyúfedők alatti nyíláson kipréselődik.

5. ábra: Csontos hal kopoltyúlégzése

(A) - belégzés (inspiratio); (B) – kilégzés (exspiratio); a – szájnyílás; b – maxillomandibularis szelep; c – szájüreg; d – opercularis készülék; e – branchiostegalis lemez; f – nyelőcső; g – kopoltyúk. A nyilak a víz áramlásának irányát jelzik (Wiedersheim nyomán)

Figyeljük meg akváriumban, vagy üvegkádban, közepes nagyságú halak (pl. aranykárász) légzőmozgásait! Mérjük meg szobahőmérsékleten a légzés percenkénti

- 15 -

frekvenciáját! Ismételjük meg a méréseket 10C-os, majd 30C-os vízben! A kapott adatokat táblázat (1. táblázat) segítségével értékeljük!

Légzésszám / perc +20 ºC víz 10 ºC víz +30ºC víz 1. táblázat: Víz hőmérsékletének hatása a hal légzésére

1.2. Halak oxigénfogyasztásának meghatározása Winkler-módszer segítségével Anyagok és eszközök: Deville palack, jódszámlombik, Erlenmeyer lombik, pipetta, pipettafeltét, cc.HCl, MnCl2 (1 g MnCl2 X 4 H2O + 2 g H2O), KI-os NaOH (1 g NaOH + 2 g H2O + 20 % elporított KI-ot), 0,01M Na2S2O3, büretta, főzőpohár, 1 % keményítő oldat, Hoffmann-szorító A Deville-palack széles szájú, alul nyílással ellátott palack, amelyet egyfuratú dugóval zárunk. Furatába üvegcsövet helyezünk, melyre egy szorítóval ellátott gumicsövet húzunk. Két db 2-3 l -es Deville-palackot a kísérlet előtt egy-két órával, vagy előző napon vízzel feltöltünk, hogy a víz felvegye a szoba hőmérsékletét. A kísérlet előtt a vizet akváriumi szellőztetővel 15 percig oxigenizáljuk. Az egyik palackot kontroll edénynek használhatjuk, a másikkal végezzük a kísérletet. A kísérleti állatokat (kéthárom nagyobb, vagy öt-hat kisebb hal) az edénybe helyezzük és az edény nyílását Petricsészével befedjük. Egy óra múlva mindkét edényből vízmintát veszünk és meghatározzuk a minták oxigéntartalmát. 100 ml-es mérőlombikba a Deville-palack gumicsövén lévő Hoffmann szorító oldásával lassan folyatni kezdjük a vizet. Az első részletet, amely a légtérrel érintkezik elöntjük. A vízzel színültig töltött edény aljára kétjelű pipettával, lassan 1 ml MnCl2 oldatot rétegzünk. Egy másik, kétjelű pipettával 1 ml KI-os tömény NaOH oldatot rétegzünk a víz alá. A lombikot buborékmentesen zárjuk. Az üvegből kiszorított 2 ml-t le kell vonnunk a térfogatból. Az oldatokat alaposan összerázzuk, 15 percig ülepítjük, majd a folyadék aljára 8-10 ml cc. HCl oldatot rétegzünk. A sav által kiszorított víz mennyisége nem fontos, mert már oxigénmentes. A víz oxigénje egy oxidációs sorozatot indít el, melynek végső eredménye jód molekula keletkezése. - 16 -

2 MnCl2 + 4 NaOH = 4 NaCl + 2 Mn (OH)2 4 Mn(OH)2 + O2 + 2 H2O = 4 Mn(OH)3 2 Mn(OH)3 + 4 HCl + 2 HI = 2 MnCl2 + 6 H2O + I2 A

I2 tartalmú

reakcióelegyet

300

ml-es

titráló

lombikba

öntjük

és

0,01 M-os nátrium-tioszulfát mérőoldattal megtitráljuk. 2 Na2S2O3 + I2= Na2S4O6+ 2 NaI Amikor a jód sárgás színe csaknem eltűnik, 5-6 csepp keményítő oldatot cseppentünk az elegyhez. A kék szín eltűnéséig titrálunk. Számítás: 1 ml 0,01 M Na2S2O3 mérőoldat 0,08 mg oxigénnek, illetve 0.056 ml normál állapotú O2 gáznak felel meg. Határozzuk meg az egyes vízminták oxigéntartalmát a fogyott nátrium-tioszulfát mennyisége ismeretében és számítsuk ki mennyi oxigént használtak fel a halak egy óra alatt. Pontosabb eredményt kapunk, ha korrekciót végzünk, azaz a kontroll edény kezdeti oxigén tartalmából levonjuk az egy óra múlva levett minta oxigéntartalmát. A különbséget levonjuk a halak behelyezése után egy órával mért oxigén tartalomból. Az állatokat lemérve, kifejezhetjük az állatok oxigén fogyasztását O2 ml/óra/kg értékben. 1.3. Kecskebéka légzésének vizsgálata Anyagok és eszközök: kecskebéka, üvegbúra, főzőpohár Számoljuk meg a kísérleti állat percenkénti torokoszcillációját és a percenkénti légvételek számát! Végeztessünk békánkkal 8-10 ugrást és ismételten mérjünk! Helyezzük a békát CO2-ban gazdag légtérbe! A béka vérének növekvő CO2 tartalma izgatja a légzőközpontot, nő a légzés frekvenciája és a légvételek mélysége (nehézlégzés, diszpnoe). Vegyük ki a békát és mérjük meg azt az időt, amennyi után a normál légzési frekvencia visszatér. 1.4. A tüdő működésének bemutatása (Donders tüdőmodell) Anyagok és eszközök: Donders tüdőmodell Az intrapleurális és intapulmonális nyomás és térfogatváltozások összefüggéseit a Donders-féle tüdőmodell-kísérlettel demonstrálhatjuk. A kísérletet egy olyan harang - 17 -

alakú üvegbúrában végezzük, amelyet alulról egy gumimembrán, felül pedig egy kétfuratú gumidugó zár el. Az egyik furatban egy elzárható üvegcső található, a másikban egy olyan méretű üvegcső, amelyre a kísérleti állat (patkány, nyúl, vagy macska) tracheája csatlakoztatható (6. ábra).

6. ábra: A Donders féle tüdőmodell

A kísérleti állatot narkotizáljuk, felnyitjuk a mellkast és a tracheát a két féloldali tüdővel óvatosan kipreparáljuk, majd a mellkasból kiemeljük. Nyitott csap mellett a tracheát az üvegcsőre erősítve, a tüdőt az üvegharangba helyezzük. Felhelyezzük a gumimembránt, a csapot elzárjuk és a gumimembránt, amelyre előzőleg gombot rögzítettünk, kicsit lefelé húzzuk, mely a kilégzés végi helyzetnek megfelelő negatív intrapleurális nyomást hozza létre (kb. -3 Hgmm). A Donders harang és a tüdő közötti tér az intrapleurális teret, a tüdő belső tere az intrapulmonális teret modellezi. A rekeszt modellező gumimembránt erősebben lehúzva a harang "intrapleurális" terében légritkulást, a légköri nyomásnál alacsonyabb nyomást hozunk létre, amelyet a tüdő rugalmas fala passzívan követ, a tüdő kitágul és levegő áramlik a tüdőbe. A gumilapot elengedve, az visszatérve eredeti helyzetébe fokozza a nyomást a harang belsejében, a tüdő összenyomódik és a levegő kiáramlik. A kísérlet szemléletesebb, ha a tracheába kötött üvegcsőhöz, illetve a csapos kanülhöz egy-egy higanyos manométert illesztünk, melyek jelzik az intrapulmonális, illetve az intrapleurális nyomás változásait.

- 18 -

A gumimembrán helyettesíthető vízfelszínnel, ha az üvegharangot vízzel telt üvegkádba merítjük. A belégzést a harang felemelésével, a kilégzést a süllyesztésével demonstráljuk. 1.5. A kilégzett levegő CO2 tartalmának kimutatása Müller-féle készülékkel Anyagok és eszközök: Müller-készülék, Ca(OH)2, fenolftalein A kísérlettel a kilégzett és belélegzett levegő CO2 tartalmának különbsége demonstrálható. Két gázmosó palackba egyforma mennyiségű meszes vizet (kalciumhidroxid telített, tiszta oldata) töltünk (7. ábra). Az oldatokat 1-2 csepp alkoholos fenolftaleinnel halványrózsaszínre festjük. Az egyik palack rövid csövét egy Y alakú cső közbeiktatásával összekötjük a másik palack hosszú csövével. Az Y alakú cső harmadik szárára gumicsövön keresztül egy fújókát illesztünk. Ha a fújókán keresztül be- és kilégzünk, akkor a két palack szelepként működik Az exspiráció a hosszú csövön, az inspiráció a rövid csövön keresztül történik. Így tehát a légzés folyamán az egyik palackba az alacsony CO2 koncentrációt tartalmazó légköri levegő kerül, míg a másik palackba történik a kilégzés. Rajzoljuk le a berendezést és figyeljük meg melyik palackban zavarosodik meg hamarabb, illetve halványodik el jobban a meszes víz! Írjuk fel a reakcióegyenletet! A tüdőből kilégzett levegő CO2 tartalmát a Ca(OH)2 megköti: így a kalciumhidroxid átalakulása következtében a fenolftalein elszíntelenedik. Ca (OH)2 + CO2 = CaCO3 + H2O

7. ábra: Müller-féle készülék - 19 -

1.6. A légzésszám meghatározása Anyagok és eszközök: stopperóra Számoljuk meg a légvételek számát percenként nyugodt állapotban. A respirációs levegő ismeretében határozzuk meg, hogy percenként hány liter levegőt veszünk fel! Végezzünk tíz térdhajlítást és rögzítsük, hogyan változik meg légvételünk mélysége és frekvenciája a fizikai munka végzése közben, közvetlenül utána, majd 5 perc múlva (2. táblázat)! légvételek száma/perc

légzési perctérfogat

nyugalomban fizikai munkavégzés közben munkavégzés után 5 perccel

2. táblázat: Izommunka hatása a légzési paraméterekre

1.7. Légzésszám, vitálkapacitás, erőltetett és időzített vitálkapacitás mérése emberen Anyagok és eszközök: spirométer A tüdő, légzés során bekövetkező térfogatváltozásai spirométerrel vizsgálhatók. Spirométer segítségével úgynevezett spirogrammot kaphatunk (8. ábra). A spirogramról leolvashatjuk a vitálkapacitást, ill. annak összetevőit és a légzésfrekvenciát. A gázok térfogata függ a hőmérséklettől, nyomástól, valamint a vízgőztartalomtól, ezért a gáz térfogatát testhőmérsékletre és környezeti nyomásra vonatkoztatjuk. Spirométerrel meghatározhatjuk a tüdő légtereinek térfogatát, valamint ennek segítségével végzett légzésfunkciós vizsgálatok korán felderítik a látens légzési elégtelenségeket.

- 20 -

8. ábra: Spirogram

Az emberi tüdő esetében az következő térfogatokat és kapacitásokat különíthetjük el: Respirációs levegő (tidal volume, TV): a nyugalmi légzés alatt a be-, és a kilégzett levegő. Átlagos értéke: kb. 500 ml. Totál kapacitás (total lung capacity, TLC): a tüdő által maximálisan befogadható levegő mennyisége. Az a levegőmennyiség, amelyet tüdőnk maximális belégzés után tartalmaz. Átlagos értéke: kb. 5-5,5 liter. Belégzési tartalék, vagy inspiratory reserve volume (IRV): nyugalmi légzéssel felvett levegőn túl, maximálisan felvehető levegőmennyiség. Átlagos értéke: kb. 2500 ml. Belégzési kapacitás (inspiratory capacity, IC): nyugodt kilégzés végén végzett maximális belégzéssel felvehető levegőmennyiséget nevezzük. Értéke kb. 3 liter. IC=TV+IRV. Az IC és a TV jól mérhető, a kapott adatokból az IRV kiszámítható. Kilégzési rezerv (expiratory reserve volume, ERV): normális kilégzés végén, további erőltetett kilégzéssel kifújt levegő mennyiség. Átlagos értéke: kb. 1000 ml. Funkcionális reziduális kapacitás (FRC): a tüdőben nyugalmi kilégzési helyzetben a totálkapacitás kb. 40 %-ának megfelelő mennyiségű levegő. Reziduális levegő (residual volume, RV): maximális kilégzés után a tüdőben maradó levegő. Ezt a levegőmennyiséget akaratlagosan sem tudunk kifújni. Átlagos értéke: kb. 1500 ml.

- 21 -

Vitálkapacitás (vital capacity, VC): maximális belégzés után maximális kilégzést végezve mérhető. VC=IRV+TV+ERV=IC+ERV, melynek átlagértéke kb. 4 liter. (férfiaknál kb. 4600 ml, nőknél 3100 ml, sportolóknál 6-7 liter, fekvő embernél 300 mlel kevesebb, mint álló helyzetben, mert a hasüreg szervei felnyomják a rekeszizmot és a tüdő vérteltsége csökkenti a légteret. A légzésfunkciók dinamikus vizsgálatai a légutak áramlási viszonyairól tájékoztatnak. Ezeknél a vizsgálatoknál az egy perc alatt (20 mp alatt mért értékből számítják) maximális erőkifejtéssel és frekvenciával végzett maximális légzési kapacitást (70-200 liter/perc), vagy a maximális belégzés után maximális sebességgel végzett kilégzés levegőmennyiségét határozzák meg. Ez utóbbi levegőtérfogatot erőltetett vitálkapacitásnak nevezzük (forced vital capacity, FVC). Ennél használhatóbb értéket kapunk, ha maximális belégzés után rövid légzés szünetet tartunk és a gyors kilégzés első másodperce alatt kifújt levegőfrakciót mérjük. Ez az érték az időzített vitálkapacitás (forced expiratory volume, FEV(1)). A FEV(1) értékét a VC százalékában szokták megadni (Tiffeneau-index): FEV(1) % = 100 x FEV(1) / VC. Fontos paraméter az erőltetett belégzést követő erőltetett kilégzés egyes fázisaiban a kiáramló levegő sebessége is. Az áramlási sebességeket a VC % -ban ábrázolhatjuk. Az ábrából leolvasható, hogy a levegő áramlási sebessége a VC első 20 %ának kifújása után a leggyorsabb, majd lassan lecsökken. A csúcsáramlás (peak expiratory flow, PEF), amely kb. 10-20 ms-ig tart, elsősorban a kifejtett erőtől függ. A görbe lassú leszálló szakaszának alakulására a légutak keresztmetszete és a tüdő retrakciós ereje hat. A gyakorlat elvégzése során, a vizsgált személy befogja az orrát és maximális belégzést végez. A rövid benntartás után maximális erővel kifújja levegőt a kifúvócsőbe. Figyeljünk arra, hogy a kilégzés minimum 5-6 s-ig tartson! A spirométer kijelzőjén megjelenő légzésfrakciókat jegyezzük fel az alábbi táblázatnak megfelelően (3. táblázat)!

- 22 -

levegőfrakciók

értékek

FVC FEV1 FEV1% FEV0,5 FEV0,5% PEF (l/min) 3. táblázat: A tüdő légzési frakcióinak összefoglaló táblázata

- 23 -

2. KIVÁLASZTÁS ÉLETTANA A szervezet ozmo-, ion- és pH regulációja elsősorban a kiválasztószervek segítségével valósul meg. A kiválasztószervek járulnak hozzá a testfolyadékok térfogatállandóságához (izovolémia), az állandó ozmotikus környezet (izozmózis), a stabil ion koncentrációk (izoionia) fenntartásához, valamint a pH egyensúly megőrzéséhez (izohidria). Ezenkívül a kiválasztószervek végzik az anyagcsere káros végtermékeinek, a szervezetbe kívülről bekerült méreganyagoknak az eltávolítását is, ezért a vizelet fizikai, kémiai tulajdonságai jól tükrözik a szervezet fiziológiai állapotát. Mindezen funkciók három, precízen – többnyire hormonálisan - szabályozott folyamaton keresztül valósulnak meg: a testfolyadék átszűrése (ultrafiltráció), a filtrátumból való visszaszívás (reabszorpció) és a ionok/molekulák testfolyadékból történő kiválasztása (szekréció/exkréció). Az exkréciós szerveket két típusba sorolhatjuk: (1) hámeredetű kiválasztó felületek (pl.: kopoltyú, rectalis mirigy, klorid sejtek) és (2) tubuláris szerkezetű kiválasztó szervek (Malpighi-testek, nephronok) (9. ábra). Rovarokban, a közép,-és utóbél határán elhelyezkedő Malpighi-edények zárt vége a folyadékkal telt testüregbe nyúlik, míg a nyitott vége a bélcsatornába szájadzik. A testfolyadékból a csövekbe filtrálódó ionok, húgysav, aminosavak és egyéb tápanyagok nagy részt változatlan koncentrációban érik el a bélcsatornát. A vizelet összetétele az utóbélben módosul a reabszopciós folyamatok következtében. Az emlős vesét felépítő nefronokban, az ultrafiltráció glomerulusokat alkotó ablakos kapillárisokból a Bowman-tok üregébe történik. A filtráltrátum a kanyarulatos csatornák rendszerében elvezetődik, ahol összetétele nagy mértékű változáson megy keresztül. A tubulus sejtek által expresszált transzportereken keresztül a szervezet reabszorbeálja a számára nélkülözhetetlen ionokat glükózt, aminosavakat etc., illetve szekretálja a húgysavat, ureát és egyéb bomlástermékeket.

- 24 -

9. ábra: Tubuláris kiválasztó szervek. A – a rovarok Malpighi edényei; B – a nephron, az emlős vese anatómiai és funkcionális egysége

Külön kihívást jelent a nitrogén tartalmú vegyületek (fehérje, nukleinsav) anyagcseréjéből

keletkező

nitrogén

tartalmú

bomlástermékek

eltávolítása.

Az

aminosavak deaminálása vagy a nukleinsavak lebontása során egy erősen toxikus vegyület, ammónia keletkezik. A felszabadult ammónia ártalmatlanítására két lehetőség áll az állatok rendelkezésére. A vízi szervezetek (rovarok, halak) átalakítás nélkül képesek szekretálni az ammóniát (pl.: kopoltyún keresztül) a környező közegbe, míg a szárazföldi élőlények esetén az ammónia az ornitinciklusban alakul át ureává és a vizeleten keresztül távozik (10. ábra). A purin bázisok katabolizmusának másik végterméke, a húgysav (10. ábra) szintén a veséken keresztül választódik ki.

- 25 -

10. ábra Nitrogén tartalmú makromolekulák bomlástermékei (urea, húgysav)

A vizelet összetétele sokszor diagnosztikai jelentőséggel bír, mert a vesében vagy a szervezet más részein zajló patológiás folyamatok befolyásolják a vizelettel kiválasztott anyagok minőségét és/vagy mennyiségét. A három, leggyakrabban előforduló rendellenesség a glükozuria, albuminuria és ketonuria. A vizelet normális körülmények között glükózt nem tartalmaz, mert a proximális csatorna glükóz transzporterein keresztül maradék nélkül reabszorbeálódik. Ha a filtrátumba került glükóz koncentráció olyan nagy mértékű, hogy - elérve a tubuláris maximumot - meghaladja a glükóz transzporterek kapacitását, akkor a glükóz megjelenik vizeletben (11. ábra). Ebben az esetben glükozuriáról beszélünk, mely leggyakrabban a csökkent hasnyálmirigy funkciónak (diabetes mellitus) köszönhető. Előfordulhat a glükozuria egészséges embernél is, ha sok szénhidrát bevitelével túllépjük azt a határt, amit a máj még fel tud venni. Ebben az esetben alimentáris glükozuriáról beszélünk.

- 26 -

11. ábra A glükóz filtrációja és reabszorpciója a vérplazma glükóz koncentrációjának függvényében

Az egészséges emberi vizelet fehérjét sem tartalmazhat. Ha a vizeletben fehérjét találunk –albuminuria- , az a húgyutak gyulladási folyamatai során levált hámsejtekből és fehérvérsejtekből származhat (albuminuria vera) vagy a plazmaultrafiltráció során filtrálódhat át a glomerulusokban (albuminuria spuria). A szervezetben - elsősorban a májban – zajló lipid metabolizmus egyik részfolyamata a zsírsavak béta-oxidációja. A zsírsavak lebontása során keletkező ketontestek (aceton, béta-hidroxivajsav, acetecetsav) egészséges ember vizeletében csak nyomokban fordulhat elő. A ketonuria a kezeletlen, vagy rosszul beállított diabetes mellitus jellemző tünete. 2.1. A vizelet fizikai tulajdonságai 2.1.1. Vizelet színe Világos szalmasárgától a sötét borostyánsárgáig változik. A szín főleg a vizelet koncentrációjától függ: a koncentráltabb vizelet sötétebb színű. A koncentrált vizelet is lehet világos színű, ha sok glükózt tartalmaz (diabetes mellitus). A vizelet színét a pH is befolyásolja: a savanyú vizelet általában sötétebb, mint az alkalikus. A színt a vizelet természetes színanyagai adják: az urobilin, urobilinogén, urokróm, porfirin. A

- 27 -

szervezetbe bevitt idegen anyagok (gyógyszerek, indikátorfestékek, pl fenolftálein, kongóvörös, metilénkék) is megfestik a vizeletet. 2.1.2. A vizelet szaga A frissen ürített vizelet szagtalan, vagy enyhén aromás szagú, állás során változhat. A vizelet szagát befolyásolhatja a táplálék minősége: pl. spárgaevés (aszparaginsav), B vitamin készítmények (riboflavin), alkohol fogyasztás (alkohol szag) mérgezéseknél (pl benzol szag), ureáz aktív baktériumok akár a hólyagban, akár a külvilágban (ammónia szag). 2.1.3. A vizelet átlátszósága Az egészséges ember frissen gyűjtött vizelete tiszta, átlátszó. Állás közben felhőszerű zavarosodás figyelhető meg, ami fonalakban kivált mucinból és az ennek a hézagaiban fennakadt leukocitákból, valamint hámsejtekből áll. A vizelet lehűlésekor sárga vagy téglavörös üledék válhat ki, ami amorf húgysavas sókból (urátok) áll. A lúgos kémhatású vizelet a belőle kivált földfémfoszfátoktól vagy karbonátoktól is zavarossá válhat. 2.1.4. Vegyhatás A vizelet pH 5.5 és 7.0 között változik, de a pH 4.5 és 8.0 közötti értéket is elérheti. Húsevés után savanyú, növényi táplálkozás után alkalikus. A vizelet pH mérését indikátorpapírral vagy elektromos pH mérő készülékkel végezzük. 2.1.5. Fajsúly 1.003 – 1.040 között változhat, általában 1.015 – 1.025 közötti értéket mutat. Bőséges folyadékbevitelre a sűrűség jelentősen csökken, fokozott perspiráció esetén a sűrűsége nő. A vizelet fajsúlyát urométerrel határozzuk meg, ami tulajdonképpen egy speciális célra készített areométer. Egy mérőhengert töltsünk meg vizelettel. Helyezzük bele az urométert úgy, hogy az ne érjen a mérőhenger falához, és skálabeosztásán olvassuk le a fajsúlyértékeket. A fajsúlymérők általában 20 C -ra vannak kalibrálva. Ha a vizelet hőmérséklete ettől eltér, 3 C-onként 0.001-et adunk hozzá, vagy vonunk le a mért értékből. Proteinúria, valamint a glükozúria fajsúlyemelkedést okoz. 2.1.6. Szárazanyagtartalom

- 28 -

Vegyes táplálkozás mellett 4-5 %, 24 órai vizeletben (1500 ml) mintegy 60 g. A szárazanyagtartalom kiszámítható a vizelet fajsúlyából, ha a fajsúly két utolsó számjegyét megszorozzuk a Haeser-féle tényezővel (2.33). Ilyen módon megkapjuk az 1000 ml vizeletben oldott anyagok mennyiségét g-ban. 2.1.7. Vizeletüledék vizsgálata 10 ml vizeletet 1000-2000/perc fordulatszámmal 5 percig centrifugálunk. A felülúszót leöntjük, az üledékből Pasteur-pipettával kiveszünk egy cseppet, és tárgylemezre

tesszük,

majd

fedőlemezzel

lefedjük.

Mikroszkóppal,

szűkített

diafragmával, süllyesztett kondenzorral vizsgáljuk. Az üledékben különféle kristályokat (húgysav, ammónium urát, kalcium oxalát, ammónium magnézium foszfát) és sejtes elemeket (hámsejtek, leukociták) láthatunk (12. ábra). A sejtes elemek azonosítása diagnosztikai szempontból nagyon jelentős.

12 ábra: Emlős vizelet üledékének mikroszkópos képe a) ammónium-magnézium-foszfát lúgos vizeletben b) kalcium-foszfát kristályok lúgos vizeletben c) húgysav kristályok savanyú vizeletben d) kalcium-oxalát kristályok savanyú vizeletben

2.2. Szervetlen ionok kimutatása Anyagok és eszközök: 2 M HNO3, 0,1 M AgNO3, 0,5 M FeCl3, BaCl2 2.2.1. Klorid ionok (Cl-) kimutatása 2 ml vizeletet pár csepp 2 M HNO3 oldattal megsavanyítunk, és néhány csepp 0,1 M AgNO3 oldatot adunk hozzá. Fehér, túrós AgCl csapadék keletkezik. A salétromsavval történő savanyítás a karbonátok és foszfátok oldatban tartása miatt szükséges. 2.2.2. Foszfát ionok (PO4 3-) kimutatása A vizeletet ecetsavval megsavanyítjuk, majd néhány csepp 0,5 M FeCl3 oldatot cseppentünk hozzá. Fehér ferrifoszfát csapadék keletkezik. 2.2.3. Szulfát ionok (SO42-) kimutatása A vizeletet ecetsavval megsavanyítjuk, és néhány csepp telített BaCl2 oldatot adunk hozzá. Fehér BaSO4 csapadék képződik a vizeletben lévő anorganikus szulfátok hatására. A csapadékot leszűrjük, és a szűrletet koncentrált sósavval főzzük, majd ismét - 29 -

BaCl2 oldatot adunk az elegyhez. Az így képződő csapadék a vizeletben lévő éterkénsavak hidrolízise során felszabaduló szulfát ionok hatására képződik. Az éterkénsavak szerves kötésben tartalmazzák a szulfátot. A fontosabb éterkénsavak Na sói: fenol-kénsavas Na, krezol-kénsavas Na, indoxil-kénsavas Na és szkatoxil-kénsavas Na. A vizeletet azért savanyítjuk meg ecetsavval, hogy a karbonátok és foszfátok ne csapódjanak ki. 2.3. A vizelet szerves alkotórészeinek kimutatása Anyagok és eszközök: vizelet, 5% kálium-cianid, arzén-foszfor-wolframsav, telített pikrinsav, 10 % NaOH 2.3.1. Húgysav izolálása vizeletből Megsavanyított vizeletből hosszabb állás hatására húgysavkristályok válnak ki. 100 ml-es főzőpohárba kb. 50 ml hígítatlan vizeletet teszünk, és 15 ml tömény sósavat adunk hozzá. Hideg helyre téve, 24 óráig állni hagyjuk. Az edény falára és aljára húgysavkristályok válnak ki. A kristályokat tárgylemezen, mikroszkóp alatt vizsgálhatjuk (1. ábra). 2.3.2. Húgysav kimutatása a vizeletből Folin szerint: 1 : 20 arányban hígított vizeletből 4 ml-t kémcsőbe teszünk. 2 ml 5 %-os NaCN oldatot, majd 0,5 ml arzén-foszfor-wolframsav-reagenst adunk hozzá. Az elegyet összerázzuk, majd 5 perc után kétszeresére hígítjuk. A reakcióelegy intenzív kék színeződést mutat. A húgysav redukálja a foszfor-wolframsavat, miközben egy kék színű wolfram-oxid (WO2 x WO3) keletkezik. 2.3.3. Kreatinin kimutatása (Jaffe-reakció) 5 ml vizelethez 1 ml telített pikrinsav oldatot adunk, és pár csepp 10 %-os NaOH oldattal meglúgosítjuk az oldatot. Vörös elszíneződés keletkezik. A vörös elszíneződés hosszú ideig változatlan marad. 2.4. Kóros vizelet vizsgálata Anyagok és eszközök: vizelet, 20% szulfoszalicilsav, 30% KOH, Fehling I (7 %-os CuSO4 x 5H2O), Fehling II oldat (10 %-os NaOH-ban oldott 34 %-os Seignette só ( K-Na tartarát)), lugol oldat

- 30 -

2.4.1. Fehérje kimutatása A vizelethez 20 %-os szulfoszalicilsav oldatot adunk cseppenként. Fény felé tartva sötét háttér mellett azonnal értékeljük. Kevés fehérje jelenlétében is füstszerű zavarosodás keletkezik. 2.4.2. Genny kimutatása (Donné próba) A vizelethez 30% KOH oldatot adunk és alaposan összerázzuk. A keletkező buborékok a vizelet megnövekedett fajsúlya miatt lassan szállnak fel. Végezzük el a kisérletet egészséges, kontrol vizelettel is. 2.4.3. Glükóz kimutatása Fehling próbával A reakció a glükóz redukálóképességén alapul. A két reagens oldatból azonos mennyiséget keverünk össze. Körülbelül 2 ml reagens keverékhez ugyanannyi desztillált vizet adunk. Felforraljuk, és a forró oldathoz néhány csepp vizeletet adunk. Minden szabad glikozidos hidroxil csoporttal rendelkező cukor redukálja a két értékű réz iont, miközben cukorsavvá oxidálódik. Sárgásvörös Cu2O csapadék keletkezik. A Fehling próba nem specifikus, mivel más cukrok is pozitív eredményt adnak (pl. fruktóz, nagy mennyiségű gyümölcs fogyasztása után). 2.4.4. Ketontestek kimutatása: Kimutatása lúgos kémhatás mellett Lugol oldattal történik. A vizelethez pár csepp NaOH oldatot és ezt követően Lugol oldatot cseppentünk. Aceton jelenlétében a jód jodoformmá (CHI3) alakul és kristályok formájában kiválik valamint intenzív jodoform szag érezhető. 2.5. Húgysav kimutatása rovar Malpighi edényeiben Anyagok és eszközök: csótány, kloroform, papírvatta, gombostű, csipesz, kis olló, óraüveg, kálium cianid, arzén-foszfor-wolframsav (1000 ml-hez: 100g Na-wolfram, 50 g arzénpentoxid 955 ml desztillált víz, 25 ml 85 %-os foszforsav, 20 ml tömény sósav) Óriás csótányt (Blaberus giganteus) kloroformmal elkábítunk, majd Malpighiedényeit kipreparáljuk. Célszerű a bélcsővel együtt eltávolítani a vékony, csőszerű képleteket. Tárgylemezre, vagy óraüvegre helyezzük és egy-két csepp ammóniás 5 %-os NaCN-oldatot (erősen mérgező, pipettázni tilos!) és azonos mennyiségű arzén-foszfor-

- 31 -

wolframsav-reagenst viszünk a preparátumra. A húgysav tartalmú Malpighi edények kék színűre festődnek, mely fehér háttér előtt jól megfigyelhető. 2.5. Az ammónia, mint exkréciós termék kimutatása halaknál Anyagok és eszközök: 2 db hal, jég, kémcső, Nessler-reagens (K2HgI4), 5% kálium-cianid, arzén-foszfor-wolframsav Töltsünk egy fel egy megfelelő méretű műanyag tartályt vízzel. Vegyünk belőle 34 ml kontrolként szolgáló mintát (1. kémcső) és tegyük félre. Helyezzük a halakat a vízzel telt dobozba és lefedve, tegyük őket jégre. Harminc perc elteltével két kémcsőbe (2. és 3. kémcső) vegyünk újból 3-4 ml vízmintát. Az 1. és 2. számú kémcsőbe cseppentsünk 1-2 csepp Nessler-reagenst, a 3. számú kémcsőben végezzük el a húgysav kimutatását. Figyeljük meg és írjuk le a keletkezett színreakciókat!

- 32 -

3. AZ EMÉSZTÉS ÉLETTANA Az állati szervezetek testük felépítéséhez szükséges anyagokat és energiát táplálék formájában veszik fel. Táplálékuk minősége szerint lehetnek húsevők, növényevők és mindenevők. A táplálék megszerzésére kialakult módszerek és a feldolgozására szolgáló emésztő szervrendszerek rendkivül nagy változatosságot mutatnak az állatvilágban. Mindazonáltal

testfelépítéstől

és

életmódtól

függetlenül

a

szövetes

állatok

emésztőrendszerének működése hat részfolyamatra bontható: (1) táplálék felvétele, (2) raktározás, (3) előemésztés, (4) végleges emésztés, (5) felszívás, (6) salakanyag eltávolítása. Kísérleti célokra leggyakrabban használt gerinctelen modellállatok a különböző Lumbricus fajok közül kerülnek ki. A földigiliszták táplálékát - hasonlóan más talajban élő férgekhez- a lenyelt földben lévő szerves törmelékek és apró élőlények alkotják. Emésztőrendszerük tagozódását a 12. ábra mutatja be. A szájnyílással kezdődő tápcsatorna a következő szakaszokra tagolható: szájnyílás, garat (pharynx), nyelőcső (esophagus), begy (ingluvies), gyomor (gaster), középbél, utóbél. A szájnyílás és a kiölthető garat a táplálék felvételét, a begy és a gyomor a táplálék mechanikai feldolgozását végzi, míg a táplálék megemésztéséhez szükséges enzimeket a középbél szakaszán található egysejtű mirigyei termelik.

- 33 -

12. ábra: A földigiliszta emésztőrendszere

A gerinctelen fauna számottevő és egyben leggazdagabb csoportját alkotó ízeltlábúak közül a Blaberus sp., Blatta sp., és Periplaneta csótány fajokat használják széleskörben laboratóriumi modellállatokként. A csótányok emésztőrendszerének általános felépítése megegyezik a gyűrűsférgeknél leírtakkal, mindazonáltal tükrözi az állatok eltérő életmódját és táplálékát (13. ábra). A komplex szájszervek egy valódi szájnyílást vesznek körül, melyhez hatalmas, páros nyálmirigyek csatlakoznak. A nyálmirigyek váladéka amilázban gazdag szekrétum. A szájüreg folytatásában találjuk a garatot, nyelőcsövet és a tág üregű begyet. A begy mögött helyezkedik el a rágógyomor majd a középbél szakasza, ahol a táplálék kémiai emésztése, felszívása történik. A gerinctelen állatok középbelében lévő emésztőnedvben megtalálhatók mindazon enzimek, melyek a szénhidrátok, zsírok és fehérjék lebontását végzik. A lebontott tápanyagok felszívása is túlnyomórészt a középbélben történik. A tápcsatorna a vastagbél és utóbél szakaszával zárul.

- 34 -

13. ábra: Az óriás csótány emésztőkészüléke

Az ember emésztésre szakosodott szervrendszerénel első emésztőmirigyei a 3 pár nyálmirigy, melyek színtelen, enyhén savanyú vegyhatású folyadékot termelnek - pH-ja 6,2 és 7,4 között változik. Napi mennyisége mintegy 1-1,5 liter. A primer nyálban a kálium és bikarbonát ionok koncentrációja nagyobb mint a vérplazmában, a nátrium és klorid ionoké alacsonyabb. A nyálban megtalálható – számos egyéb komponens mellettegy mucin nevű fehérje, mely a nyál viszkozitásáért felelős és a klasszikus szénhidrátbontó enzim, az amiláz (4. táblázat). Ezen kívül - főleg dohányosoknál - a nyál tartalmazhat rodanid ionokat is, melyek feltehetően a cianidnyomok méregtelenítésekor keletkeznek a májban és a nyállal ürülnek ki. Emésztőrendszerünk következő állomása a gyomor (14. ábra), mely a táplálék mechanikai aprítása mellett, kémiai emésztést is végez.

- 35 -

14. ábra: Az emlős gyomor anatómiai és funkcionális felosztása

Az összetett gyomormotorika három izomréteg (hosszanti,- körkörös,- ferde simaizom

réteg)

összerendezett

működésének

köszönhető.

Az

intenzív

gyomorperisztaltika a táplálékfelvétel után csak percek múlva indul meg. Így csak a legelőször lenyelt táplálékrészek kerülnek érintkezésbe a gyomor nyálkahártyájával és a sósavas pepszinnel. A további táplálékrészek egy ideig még nem jutnak érintkezésbe a gyomornedvvel, ezért azokban zavartalanul folytatódik tovább a nyálemésztés mindaddig, amíg a meginduló perisztaltika következtében a gyomornedv nem inaktiválja az amilázt. A gyomornedv fehérjebontó pepszin enzimet tartalmaz. A pepszin inaktív pepszinogén formájában termelődik a gyomornyálkahártya fősejtjeiben és a gyomornedv sósavtartalma hatására aktiválódik. A pepszin a fehérjéket peptonokra és rövidebb polipeptidekre hasítja (4. táblázat). A vékonybél első szakaszában, a duodenumban, két mirigy szekrétuma keveredik, az epe és a hasnyál. A máj sejtjei folyamatosan termelik az epét, mely az étkezési szünetekben az epehólyagban raktározódik, ahol nagy mértékben bekoncentrálódik. Elektrolitösszetétele nagy mértékben hasonlít a vérplazma összetételéhez. Szerves anyagai nagy részét az epesavak (glikokolsav, taurokolsav) illetve azok nátrium sói, az epefestékek (bilirubin, biliverdin) és a koleszterin alkotják. Elsődleges fiziológiai feladata a táplálék zsírtartalmának emulgeálása. A hasnyál valamennyi tápanyag bontásához szükséges enzimet tartalmazza (4. táblázat). A hasnyálmirigy enzimjei a - 36 -

duodenumban kerülnek érintkezésbe a béltartalommal, ahol optimális kémhatás (pH 8) és hőmérséklet mellett (37°C) a tápanyagok bontását elkezdik. A hasnyál fehérjebontó enzimei a tripszin, kimotripszin, karboxipeptidáz. Szénhidrátbontó enzime az amiláz, a lipideket pedig a lipáz bontja az epe segítségével. A nukleinsavak (RNS, DNS) bontását ribo,- és dezoxiribonukleázok végzik. Exokrin mirigy

Enzim

Szubsztrát

Termék

Nyálmirigy

α-amiláz

keményítő

maltóz, dextrinek

Gyomor

pepszin

fehérjék

különböző hosszúságú peptidek

Hasnyálmirigy

lipáz

trigliceridek

monoglicerin és zsírsavak

α-amiláz

keményítő

maltóz, dextrinek

tripszin

fehérjék

különböző hosszúságú peptidek

kimotripszin

fehérjék

különböző hosszúságú peptidek

elasztáz

elasztin

különböző hosszúságú peptidek

karbopeptidázok

fehérjék

különböző hosszúságú peptidek

észterázok

koleszterinészterek

koleszterin

ribonukleáz,

RNS, DNS

nukleotidok

dezoxiribonukleáz 4. táblázat: Az emberi tápcsatorna legfontosabb emésztőenzimei és szerepük.

3.1. Fehérjeemésztés kimutatása földigiliszta tápcsatornájában Anyagok és eszközök: földigiliszta, szódavíz, bonctű, kisolló, csipeszek, filmnegatív, termosztát Az állatokat telített szénsavas közegben elaltatjuk. Bonctálba helyezve a háti oldalt megnyitjuk, a bőrizomtömlőt széthajtjuk és tűkkel rögzítjük. Megkeressük a tápcsatorna egyes szakaszait és megnyitjuk a gyomrot, középbelet. A szerveket egy-egy kis filmkocka zselatinos (matt) oldalára helyezzük. A filmkockákat nedves szűrőpapírt

- 37 -

tartalmazó Petri csészébe rakjuk és kb. fél óra hosszat szobahőmérsékelten vagy 37˚C-on inkubáljuk. Az inkubációs idő elteltével figyelük meg és hasonlítsuk össze a film felületén bekövetkező változást a gyomor illetve középbél esetében! 3.2. Amiláz kimutatása óriás csótány nyálából Anyagok és eszközök: csótány, éter, bonctű, kisolló, csipeszek, dörzsmozsár, 0.6% NaCl oldat, 0.1% keményítő oldat, Lugol oldat A csótány páros nyálmirigye az egész toron végighúzódva a potrohig lenyúlik (10. ábra). Közel semleges kémhatású (pH 6.9) áttetsző folyadék, melynek amilázaktivitása jelentős. Az amiláz kimutatásához a csótányt éterrel elbódítjuk, dekapitáljuk (éles borotvával levágjuk a fejét) és háti részével felfelé rögzítjük a bonctálon. A tor kitinlemezeit ollóval körbevágjuk és eltávolítjuk. Preparációs mikroszkóp alatt megkeressük a nyelőcső két oldalán elhelyezkedő nyálmirigyeket és a gyűjtőhólyagokat. Ezeket kivágjuk és 1 ml 0,6 % NaCl oldattal eldörzsöljük. Az így nyert szuszpenziót 1 ml fiziológiás sóoldattal kémcsőbe mossuk át, adjunk hozzá 1 ml 0,1% keményítő oldatot és néhány csepp Lugol oldatot, mely a keményítővel kék színreakciót ad. Alaposan rázással keverjük össze a kémcső tartalmát. Figyeljük meg a nyál szuszpenzió hatására bekövetkező változást! Ha a reakció nem következtik be azonnal, helyezzük a kémcsövet vízfürdőbe és inkubáljuk 37˚C-on. Mérjük meg a változás bekövetkeztéig eltelt időt! 3.3. Szénhidrátok, zsírok és fehérjék emésztése óriás csótány középbelében Anyagok és eszközök: csótány, éter, bonctű, kisolló, csipeszek, 0,6% NaCl oldat, 0.1% keményítő oldat, Lugol oldat, Fehling I és II oldat, olaj, 1% NaHCO3, 1% NaOH, filmnegatív 3.3.1. Szénhidrátemésztés vizsgálata Kémcsőbe 2 ml felfőzött 0,1%-os keményítőoldatot pipettázunk és néhány csepp Lugol-oldatot adunk hozzá. Az így előkészített elegybe beleteszünk egy csótány hosszában felvágott középbelét. A kémcsövet 37˚C-os termosztátba helyezzük, és 30 perc múlva megfigyeljük az oldat színváltozását. A szőlőcukor jelenlétét Fehling próbával mutatjuk ki. - 38 -

3.3.2. Zsírok emésztésének vizsgálata Két kémcsőbe 3-4 ml 0,6 % NaCl oldatot, egy csepp növényi olajat, egy-két csepp fenolftalein és annyi 1% NaHCO3 oldatot teszünk, hogy rózsaszínű elszíneződést kapjunk. Az egyik kémcsőbe a csótány felvágott középbelét tesszük, a másik kémcső összehasonlításul szolgál. Az elegyeket 37˚C -on 30 percig inkubáljuk. Hasonlítsuk össze a két reakcióelegy színét! 3.3.3. Fehérjeemésztés vizsgálata Preparáljunk ki a csótányból egy rövid középbél és utóbél szakaszt. Vágjuk fel hosszában és helyezzük filmnegatív zselatinnal fedett (matt) oldalára. A folyamat gyorsítása érdekében helyezzük a filmkockákat 37˚C-os termosztátba, majd 30 perc elteltével távolítsuk el a filmkocka felszínéről a béldarabokat. Figyeljük meg és rajzoljuk le a béldarabok által okozott elváltozást! 3.4. Az emberi nyál összetételenek és enzimatikus aktivitásának vizsgálata Anyagok és eszközök: emberi nyál, pH papír, 1% ecetsav, 0,1M HCl, 0,1M FeCl3, 1% keményítő oldat, Lugol oldat, főzőpohár, termosztát A vizsgálathoz szükséges nyálat úgy nyerünk, hogy a szájüreget 10 ml desztillált vízzel kétszer kiöblítjük. 3.4.1. A nyál kémhatásának mérése Mérését indikátorpapírral vagy pH mérő készülékkel végezzük. Csipesz segítségével mártsunk egy darab pH papírt a mintába és színskála segítségével állapítsuk meg a kémhatást. Az eredmény értékelésénél figyelembe kell venni, hogy állás közben a nyálból CO2 távozik, ezért gyengén lúgossá válhat. 3.4.2. Mucin tartalom kimutatása A nyál viszkozitását egy glikoprotein, a mucin okozza. A mucin már gyenge sav hatására is kicsapódik. 5-6 ml nyálhoz 1-2 ml 1% ecetsavat adunk, melynek hatására pelyhes csapadék keletkezik. Szűrjük le szűrőpapíron kerezstül a mintát és figyeljük meg, hogy változik annak viszkozitása! 3.4.3. Rodanid ionok kimutatása A fenti (2.4.2) gyakorlat elvégzése során leszűrt nyálhoz pár csepp 0.1 M sósavat és 0.1 M ferriklorid oldatot adunk. Vörös színű ferrirodanid képződik.

- 39 -

3.4.4. Nyálamiláz kimutatása A keményítőbontó amiláz a nyál legfontosabb alkotórésze. Kimutatása úgy történik, hogy 2 ml 0,3% NaCl-ot tartalmazó 1% keményítőoldatot pipettázunk egy kémcsőbe, amelyhez 1 ml nyálat adunk. Az elegyet 37 C˚-os vízfürdőbe rakjuk és 5 percenként mintát veszünk belőle. A mintákat fehér csempelapra visszük és Lugololdattal színreakciót végzünk. 3.5. A táplálék rétegződése a gyomorban Anyagok és eszközök: patkány, ételfestékkel megszínezett patkánytáp, boncolló, cérna 48 óráig éheztetett patkánnyal fekete, fehér és piros színű táplálékot etetünk (ételfestékkel megfestett). A táplálék elfogyasztása után a patkányt üvegbúra alatt éterrel túlaltatjuk, a hasüreget megnyitjuk, a gyomrot a cardianál és a pylorusnál lekötjük és kivágjuk. Mélyhűtőben lefagyasztjuk, majd hosszirányban kettévágjuk. 3.6. Pepszin oldat fehérjebontó hatásának kimutatása Anyagok és eszközök: 5% pepszin, 0.5% HCl, pépesített főtt tojásfehérje, termosztát A pepszin működés vizsgálatához négy számozott kémcsőbe az alábbi ábrán látható módon összeállítjuk a reakció elegyeket (15. ábra).

15. ábra: A pepszin fehérjebontó hatásának vizsgálata

- 40 -

Tegyünk mindegyik kémcsőbe kis mennyiségű tojásfehérjét. A 1., 2., 3. kémcsöveket 30 percre 37°C-os vízfürdőbe helyezzük, a 4. kémcsövet azonban szobahőmérsékleten hagyjuk állni. Hasonlítsuk össze a tojásfehérje darabok állapotát a négy különböző kísérleti felállásban. 3.7. Az epe összetételének vizsgálata Anyagok és eszközök: epe, 1% szacharóz oldat, szűrőpapír, cc. salétromsav, cc kénsav, üvegbot, Petri csésze 3.7.1. Epesavak kimutatása 3 ml hígított epéhez néhány csepp szacharóz oldatot öntünk, és koncentrált kénsavat rétegzünk alá. Az érintkezés határán piros gyűrű keletkezik. Szacharózból a kénsav hatására ugyanis oximetilfurfural keletkezik, amely a kolsavval piros színű reakciót ad. 3.7.2. Epefestékek kimutatása 1. Gmelin reakcióval: hígított epe alá salétromsavat rétegzünk. Az érintkezés határán színes, felülről lefelé nézve: zöld, kék, viola, piros és sárga gyűrűk keletkeznek. Bizonyos idő eltelte után az egész oldat megsárgul. A salétromsav a bilirubint először biliverdinné (zöld), majd bilicianinná (kék) és biliprazinná (viola-piros), végül koletelinné (sárga) oxidálja. 2. Rosenbach reakcióval (a Gmelin reakció érzékenyebb módosítása): híg epét szűrőpapíron többször átszűrünk és üvegbottal salétromsavat cseppentünk rá. Mivel a szűrőpapír az epefestékeket adszorbeálja, a rácseppentett salétromsav körül színes gyűrűk keletkeznek. 3.8. A hasnyál enzimatikus funkcióinak vizsgálata 2.8.1. Zsírbontás pankreas lipázzal Anyagok és eszközök: pankreas extraktum (készítése: sertés hasnyálmirigyet megtisztítunk és kvarchomokkal dörzsmozsárban homogenizáljuk. Az így nyert pépet kétszeres térfogatú 45%-os alkohollal szobahőmérsékleten három napig extraháljuk. Végül a pépet többszörös gézrétegen átszűrjük és a szűrlethez néhány csepp toluolt adunk.), epe, olajemulzió (készítése: 5 ml olajhoz ml-ként 6 csepp NaOH oldatot hozzáadunk és jól összerázzuk), fenolftalein, 0,1M NaOH

- 41 -

Négy számozott kémcsőbe az alábbi ábra alapján állítsuk össze a reakció elegyeket (16. ábra).

16. ábra: A hasnyál zsírbontó hatásának vizsgálata

A kémcsövek tartalmát alaposan összerázzuk és az 1., 2., 3. számú kémcsöveket 37 C˚-os vízfürdőbe tesszük egy óra hosszára. A 4. számú kémcső szobahőmérsékleten marad az inkubáció teljes ideje alatt. Az elegyeket 10 percenként összerázzuk és a 60 perc után a kémcsövek tartalmát titrálólombikba visszük át. Az üres csöveket 2 ml alkohollal átöblítjük, amit szintén a titrálólombikokba öntünk. A reakció elegyeket 5 csepp fenolftalein hozzáadása után 0,1M NaOH oldattal maradó rózsaszínig titráljuk. Jegyezzük fel a szín megjelenéséhez szükséges NaOH mennyiségét és hasonlítsuk össze az értékeket! 3.8.2. Keményítőbontás pankreas amilázzal Anyagok és eszközök: 1% keményítőoldat, pankreas extraktum, Lugol oldat, termosztát Kémcsőbe 3 ml 1%-os keményítőoldatot és 2 ml pankreas extraktumot pipettázunk. A kémcső tartalmát összerázzuk és 37 C˚-os vízfürdőbe helyezzük. A keményítőtartalmú oldatok a Lugol-oldat hatására kékre színeződnek. A pankreas extraktummal inkubált keményítő oldatban néhány perc múlva a színreakció csökken, jelezve a pankreas amiláz aktivitását. 3.8.3. A pankreasnedv fehérjebontó hatása - 42 -

Anyagok és eszközök: pankreas extraktum, pépesített főtt tojásfehérje, 0,01M Na2CO3, termosztát Három számozott kémcsőbe a következő anyagokat készítsük össze: az elsőbe 3 ml pankreaskivonat és 3 ml 0,01M Na2CO3 oldat, a másodikba 3 ml desztillált víz és 3 ml 0,01M Na2CO3 oldat, a harmadik kémcsőbe 3 ml pankreaskivonatot és 3 ml H2O, valamint 2 ml 0,5% HCl oldatot. Mindhárom kémcsőbe főtt tojásfehérjét helyezünk és a kémcsöveket 37˚C-on inkubáljuk min. 30 percig. Állapítsuk meg a fehérjebontás intenzitását a három kémcső esetében.

- 43 -