IPARI MIKROBIOLÓGIA Gyakorlatok III. éves élelmiszermérnök hallgatók számára
kézirat
Budapesti Corvinus Egyetem Élelmiszertudományi Kar Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszék Budapest 2007
Tartalom
Fertőtlenítőszerek hatékonyságának vizsgálata (Juhászné dr. Román Mariann) ............................. 3 Indirekt fizikai módszerek mikroorganizmusok szaporodásának kimutatására (Mohácsiné dr. Farkas Csilla) ............................................................................................................................. 5
Tejsav- és ecetsavbaktériumok kimutatása (Belák Ágnes) ............................................................ 7 A tej gátlóanyagainak kimutatása, nyers tej minősítése(Márta Dóra) ......................................... 9 Killertoxin, Bakteriocin (Dr. Pomázi Andrea) ................................................................................11 Törzsnemesítés- Mikroorganizmusok szkrínelése, auxotróf mutánsok, protoplaszt fúzió (Dr. Pomázi Andrea) ........................................................................................................................13
Tisztított β-galaktozidáz enzim aktivitásának meghatározása (Dr. Pomázi Andrea)....................... 15 Söripari mikrobiológia (vadélesztők kimutatása) (Kovács Mónika) ............................................17 Az antibiotikumok hatásosságának vizsgálata (Juhászné dr. Román Mariann) ..................................19 Szelektív tápközegek élelmiszeripari szempontból jelentős mikroorganizmusok számára (Belák Ágnes) .................................................................................................................................21
2
Fertőtlenítőszerek hatékonyságának vizsgálata A fertőtlenítőszer hatásosságát a hőpusztulási vizsgálatokhoz hasonlóan határozzuk meg. Adott vegyszer koncentrációnál és állandó hőmérsékleten meghatározzuk a túlélő sejteket. A logaritmikus túlélési görbe lineáris szakaszának egyenletéből a pusztulási sebességi együttható(k) és a tizedelési idő ( D) kiszámítható. A fertőtlenítőszerek hatásosságát egy hatványkitevő, a koncentrációexponens (n) jellemzi. A koncentrációexponens azt mutatja meg, hogy a fertőtlenítőszer koncentráció(c) változtatásával milyen hatvány szerint változik egy adott mértékű pusztuláshoz szükséges idő(D),(t). cⁿ∙D=állandó, illetve cⁿ∙t=állandó ahol c: a fertőtlenítőszer koncentrációja (mg/l) n: a kocentrációexponens D: a tizedelési idő(minutum) t: az adott, kívánt nagyságrendnyi mikróba pusztuláshoz szükséges behatási idő(minutum), pl: 5D, 6D, 8D, D. A gyakorlat során a Neomagnol fertőtlenítőszer hatásosságát vizsgáljuk Escherichia coli mikroorganizmusra vonatkozóan. A Neomagnol (benzol-klóramin „klorogén”), amely aktív klórtartalma révén a nátrium-hipoklorithoz hasonlóan fejti ki hatását. Igen elterjedten alkalmazzák orvosi laboratóriumokban és a mikrobiológiai gyakorlatban eszközök ill. kézfertőtlenítésre. Feladat: 1./ A logaritmikus pusztulási görbe felvétele 2./ A logaritmikus pusztulási görbe lineáris szakasza alapján a koncentráció exponens meghatározása Eszközök: 500ml-es főzőpohár, ultratermosztát (hőpusztulási vizsgálatokhoz használt berendezés; (Mikrobiológia gyakorlatok II., jegyzet 87. o., 25. ábra)), stopperóra kémcsövek, pipetták, mágneses keverő Anyagok: 24 órás Escherichia coli ferde agar tenyészet, 0,5%-os glükózoldat, TGE agar, 4g/l koncentrációjú Neomagnol törzsoldat, hígítási sor készítéséhez 9 ml hígító oldat kémcsőben A gyakorlat menete: A steril 500ml-es főzőpohárba bemérünk 400ml steril 0,5%-os glükóz oldatot és a hőmérsékletét beállítjuk 25°C-ra , ultratermosztáttal. Ezután kiveszünk belőle 20ml-t és lemossuk vele az Escherichia coli 4 kémcső ferde agarra leoltott tenyészetét, amelyet alapos homogenizálás után visszaöntünk a főzőpohárba. Mágneses keverővel a főzőpohár tartalmát alaposan kevertetjük és kiveszünk az E. coli szuszpenzióból 1 ml-t mintát, amelynek TGE agaros lemezöntéssel meghatározzuk az élőcsíra számát. (Ez a 0. időponthoz tartozó minta.) Ezután a mintavétel után a főzőpohárba lévő E. coli szuszpenzióhoz hozzáadjuk a vizsgálandó fertőtlenítőszert.
3
Mindegyik gyakorlati csoport más-más fertőtlenítőszer koncentrációt vizsgál. A 10mg/l-es koncentráció esetén 1, 20mg/l esetén 2, 40mg/l koncentráció esetén 4, 60mg/l esetén 6, 80mg/l koncentráció esetén 8ml-t pipettázunk a 4g/l-es Neomagnol törzsoldatból a kevertetett Escherichia coli szuszpenzióba és ezzel egyidejűleg elindítjuk az időmérő stoppert. A különböző koncentrációkhoz tartozó mintavételi időpontok a vegyszeres pusztulási vizsgálatoknál: Neomagnol konc.(mg/l) 10 20 40 60 80
Mintavételi idő(min) 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5
A megfelelő időpillanatban kivett mintákat azonnal a 10-es alapú hígítási sor első tagjába pipettázzuk. 5 tagú, hígítási sort készítünk és mindegyik hígításból lemezt öntünk. A lemezeket 37°C-on 48 órát inkubáljuk. Eredmények értékelése: 1. Minden hígítási tag esetén számoljuk meg a tápagaron kinőtt telepeket! Az eredményeket foglaljuk táblázatba (koncentráció (mg/l), idő (min), telepszám (N=túlélő sejt/ ml), lgN) 2. Szerkesszük meg a különböző Neomagnol koncentrációkhoz tartozó túlélési görbéket! 3. A túlélési görbék lineáris szakasza alapján számoljuk ki a tizedelési időket (D)! 4. Ábrázoljuk a tizedelési idők logaritmusát a koncentrációk logaritmusának függvényében! A lineáris szakasz alapján számoljuk ki a koncentráció exponens értékét! 5. Miért előnyös, ha meghatároztuk egy fertőtlenítőszer koncentrációexponens értékét egy adott mikróbára, adott közegben?
4
Indirekt fizikai módszerek mikroorganizmusok szaporodásának kimutatására Az impedancia, vagy konduktancia mérésen alapuló módszerek (Bactometer, Malthus, RABIT, BacTrac) a mikrobák szaporodása során bekövetkező ellenállás- vagy vezetőképesség-változás mérésén alapulnak. Lehetővé teszik az élelmiszerekben lévő baktériumok és élesztőgombák közvetett minőségi és mennyiségi meghatározását. A berendezések teljesen automatizáltan működő, számítógéppel vezérelt rendszerek. A mérés elve az, hogy a táptalajban lévő nagy molekulájú töltetlen vagy kis mértékben töltött vegyületek a mikroorganizmusok anyagcsere-tevékenysége következtében töltéssel rendelkező kis molekulájú vegyületekké alakulnak, s ezáltal növelik a tápközeg vezetőképességét. A hőmérséklet szabályozása ezekben a berendezésekben nagyon fontos, mivel az impedancia vagy a vezetőképesség erősen függ a hőmérséklettől. A mérés során a berendezés automatikusan meghatározza az ún. detekciós időt (time to detection, TTD). A detekciós idő az az időtartam, ami alatt a mikrobaszaporodás okozta változás elér egy küszöbértéket. A detekciós idő fordítottan arányos a minta eredeti mikrobaszámával és függ a kezdeti mikrobaszámtól, a vizsgált mikroorganizmus szaporodási kinetikájától és a tápközeg tulajdonságaitól. Megfelelő kalibráció elkészítésével a detekciós idő alapján a mikrobaszámra következtethetünk. Csekély előkészítő műveletek után, hígítási sorozat készítése nélkül, a vizsgálandó mintával beoltjuk a táplevest. A táplevesbe merülő elektródokkal a berendezés meghatározott időközönként méri, majd regisztrálja az oldat vezetőképességét. Az induló sejtszámtól függően akár néhány órán belül eredményt kaphatunk.
Direkt impedimetriás görbék
A TTD és a sejtszám közötti összefüggés
Az ún. indirekt vizsgálati módszer esetén a készülék a mikrobák által termelt CO2-ot regisztrálja. A tápleves és a vizsgálandó minta egy kis kémcsőbe kerül, majd a mérőcellába az elektródok köré kálium-hidroxidot tartalmazó oldatot rétegeznek. A termelődő szén-dioxid elnyelődik a lúgban és kálium-karbonát képződik, mely viszont kisebb vezetőképességű, mint a kálium-hidroxid. Ebben az esetben a detekciós idő kritériuma a vezetőképesség meghatározott mérvű csökkenése. Ily módon bármilyen, a hagyományos tenyésztéses eljárásoknál használt szelektív táptalaj segítségével a lassan tenyészthető, vagy csekély impedancia változást okozó baktériumok és élesztőgombák is kimutathatók.
5
Saccharomyces cerevisiae indirekt impedimetriás szaporodási görbéje A műszerek kialakításuktól függően egyszerre legalább 32 minta vizsgálatát teszik lehetővé. A készülék beruházás igényes, viszont a működés és a táptalaj költsége igen alacsony. A módszert számos élelmiszer, többek között tej és tejtermékek, csokoládé, kakaó, friss saláta, szörpök, húsok és húskészítmények, valamint sterilitás ellenőrzésére és kozmetikumok vizsgálatára próbálták ki jó eredménnyel. Kórokozó és indikátor baktériumok (többek között Salmonella, L. monocytogenes, Campylobacter, Staph. aureus, koliformok, E. coli) mellett kimutathatók az üdítőitalok és szörpök romlását okozó élesztőgombák (Zygosaccharomyces, Brettanomyces). Antimikrobás anyagok (tartósítószerek, természetes illóolajok, fertőtlenítőszerek) gátló hatásának vizsgálatában, a hatékony koncentráció megállapításában, továbbá prediktív mikrobiológiai modellek alkotásához szükséges adatgyűjtésben is segítséget nyújtanak ezek a műszeres gyorsmódszerek. Az oldatok turbiditásának mérésén alapuló fotometriás automata berendezések (BIOSCREEN, MULTISCAN) használata is elterjedt. Tiszta oldatokban szaporodva a mikroorganizmusok zavarosodást okoznak, a fényáteresztő képesség csökkenése ilyenkor a szuszpendált mikrobák számával arányos. Tiszta tenyészetek esetén azonban egyszerre nagyon sok minta feldolgozása, számos, szaporodást befolyásoló paraméter egyidejű vizsgálata lehetséges, hátránya azonban, hogy élelmiszerminták vizsgálatára nem alkalmas.
A gyakorlat során bemutatásra kerül a RABIT impedimetriás és a MULTISCAN ASCENT turbidimetriás mérőkészülék. Feladat: 1. Figyelje meg a műszerek működését! 2. Rajzoljon le a jegyzőkönyvébe direkt és indirekt konduktometriás mérőcellát, jelölje részeit! 3. A bemutatott turbidimetriás görbéről állapítsa meg a maximális hozam eléréséhez szükséges minimális glükóz koncentrációt!
6
Tejsav- és ecetsavbaktériumok kimutatása Az élelmiszerek tartósítása során kétféle mikrobás erjesztési folyamatnak van szerepe, mejyek közül az egyik a tejasvbaktériumok által végzett tejsavas erjedés (a másik az élesztőgombák alkoholos erjesztése). A tejsavas erjedésen alapul a savanyúságok, a tejtermékek, illetve bizonyos húskészítmények gyártása, de egyéb iparágakban is előfordul a tejsavbaktériumok erjesztési tulajdonságának felhasználása. Az ecetsavbaktériumok alkalmazása az ecetgyártásban nélkülözhetetlen, de a gyógyszeriparban nagy mennyiségben felhasznált alapanyagok előállítására is használják az ecetsavbaktériumokat. Ezek az aerob baktériumok az alkoholtartalmú folyadékok felületén hártyát képezve igen lassan alakítják át az alkoholt ecetsavvá. A gyakorlat során olyan módosított MRS táptalajt használunk, amely a tejsavbaktériumok észlelését és telepszámlálását előnyösebbé teszi. A tejsavbaktériumok savtermelése következtében a telepek körül a CaCO3 feloldódik, a brómkrezolzöld indikátor pedig sárgára változik. A tápközeg aktidion tartalma az élesztőgombák szaporodását gátolja, a Na-azid a spórás bakériumok szaporodását szorítja vissza. Feladat: 1. A gyakorlat során négy különböző élelmiszerminta tejsavbaktérium számának meghatározása lesz a feladat. 2. Az ecetsavbaktériumok vizsgálata során figyelje meg a kiadott demonstrációs üvegben lévő ecetsavbaktériumok által képzett hártyát! Eszközök: Kémcsövek, pipetták, petri-csészék. Anyagok: Ecetsavbaktériumokkal beoltott etanolos tápleves táptalaj üvegben, hígítási sor készítéséhez 9 ml-es hígító oldatok kémcsőben, MRS agar, módosított MRS agar (CaC03-tal, brómkrezolzöld indikátorral, actidionnal és Na-azid-dal kiegészítve), négy különböző élelmiszerminta: - káposztalé - joghurt - kefir - romlott üdítőital/bor A gyakorlat menete: A négy különböző élelmiszermintából 8 tagú hígítási sort készítünk, amelynek az utolsó 5 tagjából kell lemezönteni hagyományos (egyik asztalfél) és módosított MRS agarral (másik asztalfél). -1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
lemezöntés MRS és m-MRS agarral
7
A gyakorlat értékelése: Az inkubációs idő letelte után az egyes hígítási tagokhoz tartozó lemezeken megszámoljuk a kinőtt telepeket. Hígítás foka
Telepszám agaron
MRS Telepszám módosított MRS agaron
104 105 106 107 108 1. A kapott telepszámok alapján adja meg a vizsgált élelmiszerminta tejsavbaktérium számát! A tejsavbaktériumok koncentrációja a vizsgált ………….……… élelmiszermintában:__________________
2. Jegyezze fel és hasonlítsa össze a vizsgált különböző élelmiszerminták tejsavbaktérium számát! További lehetőség a tejsavbaktériumok kimutatására: kínakék agarral tötrénő lemezöntés. A kinőtt tejsavbaktérium telepek sötétkékek lesznek (és viszonylag kis méretűek), míg a nem tejsavbaktériumok fehér színű telepeket képeznek. A gyakorlaton ezt a fajta kimutatást nem végezzük el. 3. A kiadott demonstrációs csészéken figyelje meg a tejsavbaktériumok jellegzetes telepeit!
8
A tej gátlóanyagainak kimutatása, nyers tej minősítése A tej biológiailag tekintve az emlősállatok tejmirigyei által kiválasztott bonyolult összetételű biológiai folyadék. Kémiailag tekintve tejcukor és különböző sók oldata, amelyben a tejfehérje kolloidálisan oldott, míg a tejzsír emulgeált állapotban található A tej az emlős állatok emlőjében/tőgyében sterilen termelődik, a környezetbe kerülve, fejés ill. tejkezelés során azonban szennyeződhet. A fejést követően a fejőhelyiségből az átvevő ill. feldolgozó üzembe kerülve a tej mikrobiológiai vizsgálaton esik át, ami a minőségi átvétel alapja. A tejben meghatározott magas csíraszám elsősorban a tej beszállítását megelőző rossz higiéniás körülményekre utal. Ez esetben a tej átvétele nem történik meg. A magas csíraszámnak több oka is lehet, mint például a tőgyről bekerülő szennyeződések, fejőberendezés, ill. fejés körülményeinek nem higiénikus volta. Továbbá a nem megfelelő hőmérsékleten való tárolás és szállítás alapvetően elősegíti a csíraszám növekedését. Emiatt fontos a tej átvételét megelőző vizsgálat, amely egy egyszerű redukciós próbán alapszik.
Nyers tej minősítése metilénkékes redukciós próbával: A tejhez hozzáadott metilénkék a tejben levő mikrobák dehidrogenáz enzimjeinek segítségével leukometilénkékké redukálódik, vagyis színtelen lesz. Minél rövidebb idő alatt játszódik le a redukció, annál nagyobb az élőcsíraszám az adott tejmintában. A csírászámot a redukcióhoz szükséges idő alapján becsüljük. A nem megfelelő értékkel rendelkező tejmintát elutasítják. Elszíntelenedési idő (perc) 330 percnél több 120-330
Becsült élőcsíraszám /cm3 tej 5*105 élősejt/cm3- nél kisebb 5*105 – 4*106
15-120 15 percnél kevesebb
4*106 – 2*107 2*107 élősejt/cm3- nél több
Anyagok és eszközök: Metilélkék indikátor oldata, kémcső, termosztát A gyakorlat menete: 20 cm3 nyers tejhez 0,5cm3 metilénkék redox indikátor hozzáadása, majd 37 °C-on való inkubálás. Mérjük az elszíntelenedési időt. A gyakorlat értékelése: 1./ A mért elszítelenedési idő alapján becsülje meg a tejminta élőcsíraszámát és minősítse a mintát!
Gátlóanyagok kimutatása tejben A tejben jelen lévő gátló anyagok akadályozzák az egyes tejtermékek elkészítésénél használt ún. starterkultúrák érvényre jutását, mivel a starterkultúra képtelen lesz a szaporodásra. Ilyen gátló anyagok lehetnek például az antibiotikumok, (amelyek a tejet adó állat szervezetéből kerülhetnek a tejbe, ha az állat tőgygyulladáson esett át és antibiotikumos kezelésben részesült), peszticidek és a tejbe bekerült fertőtlenítőszerek, amelyek a tejtároló kannában maradtak.
9
A) A tej gátlóanyag tartalmának meghatározásának menete a savfok mérésével: Anyagok és eszközök: Joghurt kultúra, fenolftalein indikátor, 0,1n NaOH oldat Lombikok, büretta, vízfürdő A vizsgálat menete: A 45 °C -ra termosztált 200 cm3 tejet 10 cm3 joghurttal beoltjuk. A tejes lombikot a beoltást követően a 45 °C-os vízfürdőben inkubáljuk. A mintavételek időpontjai a következő: 1. mintavétel: közvetlenül beoltás után (0, perc) 2 párhuzamos mintavétel 10 -10cm3 a kikészített titráló lombikokba 2. mintavétel: 15 perc elteltével, 2 párhuzamos mintavétel 10 -10cm3 3. mintavétel: 30 perc elteltével, 2 párhuzamos mintavétel 10 -10cm3 4. mintavétel: 45 perc elteltével. 2 párhuzamos mintavétel 10 -10cm3 A mintavételeket követően 2-3 csepp fenolftalein indikátort cseppentünk a mintához, majd 0,1n NaOH-dal halvány rózsaszínig titráljuk a 2 párhuzamosan vett mintát. Minden minta esetében a két párhuzamos minta fogyásából számoljuk a savfokot (Soxhlet Henkel fok, SH°) a következő képlet alapján: SH°= 4 x V 0,1n NaOH fogyás átlaga x NaOH faktor A kapott savfokokváltozásából megállapítható, hogy a tej tartalmazott-e gátló anyagot vagy sem. Ha a savfok az utolsó mintavétel után sem növekszik, a tejben volt gátlóanyag. B) A tej gátlóanyag tartalmának meghatározása Brillant fekete teszttel (demonstráció): A teszt alapja, egy 1 cm3 tápközeget tartalmazó zárt tesztcső. A tápközeg brillant fekete indikártort ill. 106 sejt/cm3 Bacillus stearothermophylus varietas calidolactis spóra szuszpenziót tartalmaz, mely utóbbi a tesztmikroba, egy nemzetközi standard alapján. Anyagok és eszközök: Készen kapható brillant fekete tesztcső, pipetta, termosztát A vizsgálat menete: 0,1 cm3 tejmintát pipettázunk a tesztcsőbe, amelyet 2 órán át 65 °C-on inkubálunk. Ha a táptalaj lila színe sárgára változik, akkor az a teszt mikroba szaporodását ill. savtermelését jelzi. Ha a lila szín változatlan marad, akkor a teszt mikroba szaporodása gátolt, mivel a tej gátló anyagot tartalmaz. A vizsgálatok kiértékelése: 1./ A párhuzamos mérések adatait átlagolja és számolja ki az egyes időpillanathoz tartozó savfokokat! 2./ A savfokokat ábrázolja az idő függvényében! Állapítsa meg, hogy volt-e a tejmintában gátló anyag.
10
Killertoxin, Bakteriocin Számos mikroba termel más mikroba szaporodását gátló, vagy azok pusztulását okozó antimikrobás anyagot. Az antimikrobás vegyületek között vannak olyanok, amelyek a sejt egész működését befolyásolják (pl. savak), és olyanok is, amelyek csak egy meghatározott folyamot gátlása révén fejtik ki hatásukat (specifikusak, pl. antibiotikumok). Azon mikrobáknak, amelyek ilyen anyagok termelésére képesek, nagy jelentőségük lehet az élelmiszeripari gyakorlatban is, mivel általuk a káros mikrobák szaporodását gátolni lehet. A tejsavbaktériumok számos gátló hatású anyagot termelnek, úgymint szerves savak (tejsav, ecetsav), hidrogén- peroxid és bakteriocinek. A bakteriocinek olyan antibiotikum jellegű vegyületek, amelyeknek bakteriosztatikus vagy baktericid hatása van, azaz a baktériumok szaporodását gátolják, vagy azokat elpusztítják. Számos Gram-pozitív és Gramnegatív baktérium termel bakteriocineket, amelyek kémiai felépítésüket tekintve fehérjék, vagy peptidek. A termelő törzs visszaszorítja a nem termelő és az adott bakteriocinre érzékeny baktériumokat, azaz számára a bakteriocin termelése előnyt biztosít. Élelmiszeripari jelentősége a Lactococcus lactis által termelt bakteriocinnek, a nizinnek van. Ez egy a Gram pozitív baktériumok széles körét gátló bakteriocin. Felhasználása számos országban engedélyezett. A gombák közül nem csak a fonalas, hanem az élesztőgombák is képesek lehetnek specifikus hatású gátló anyagok termelésére. Elsőként a S. cerevisiae esetében mutatták ki olyan anyag termelődését, amely más élesztőgombák szaporodását gátolta. Az élesztők által termelt gátló anyagot killer toxinnak nevezték el. Mivel a killer toxinok felépítésüket (fehérjék) és hatásukat tekintve a bakteriocinekhez nagyon hasonló vegyületek, a későbbiekben a bakteriocin megnevezés analógiájára a zimocin (zimo= élesztő) megjelölés is elterjedtté vált. A killer élesztők által termelt toxin csak élesztőkre hat, az arra érzékeny élesztő törzsekre letális hatású. A bakeriocin ill. zimocin (killer toxin) termelő képesség kimutatása, más gátló anyagok kimutatásához hasonlóan, indikátor (érzékeny) mikroba segítségével, a képződött feltisztulási zóna alapján lehetséges. Feladat: 1./ A gyakorlat során killer toxin termelését mutatjuk ki indikátor mikroba alkalmazásával Anyagok: Metilén kékes komplett tápagar (pH 4,5), S6 killer toxinra érzékeny élesztő, Uvaferm PM borászati starter élesztő, steril desztillált víz Eszközök: Kémcsövek, pipetták, petri-csészék. A gyakorlat menete: Az S6 érzékeny élesztő törzsből 2-3 kacsnyit steril desztillált vízben szuszpendálunk. Az így kapott sejtszuszpenzióból 1 ml-t a metilén-kékes tápagar felületére pipettázunk és egyenletesen eloszlatjuk. A szuszpenzió feleslegét leszívjuk és kis ideig várunk, míg az agar megszárad. A borászati starter kultúrából oltókaccsal az S6 élesztővel leoltott tápagar felszínére vonalat húzunk. A tenyészetet 25°C-on inkubáljuk.
11
Az eredmények értékelése: A killer toxin termelést a vizsgált törzs körül megjelenő feltisztulási zóna (S6 sejtek lízise), és a zóna szélét jelző sötétkék perem (elhalt S6 sejtek) mutatja. 1./ Állapítsuk meg, hogy a vizsgált borászati starter törzs termelt-e killer toxint! 2./ Rajzoljuk le a csészén látottakat!
12
TörzsnemesítésMikroorganizmusok szkrínelése, auxotróf mutánsok, protoplaszt fúzió Számos iparág, köztük az élelmiszeripar is alkalmaz mikroorganizmusokat végtermék előállítás céljából. A biotechnológia tágabb értelmezése szerint ezek az iparágakat a biotechnológiai iparok közé tartoznak. A mikroorganizmusok ipari felhasználásának számos feltétele van. A természetben megtalálható törzsek csak ritkán, kivételes esetben hordozzák mindazon tulajdonságokat, amelyek szükségesek az ipari méretű termeléshez. A mikroorganizmusok tulajdonságai azonban törzsnemesítés révén megváltoztathatóak. A mikroorganizmusok nemesítésére három lehetőség kínálkozik: a szkrínelés, a mutációs törzsnemesítés, és a rekombinációs törzsnemesítés. A szkrínelés (szelekció, szűrés) során a természetben előforduló mikroba populációkban keressük a kedvező tulajdonságú törzset. Ehhez olyan szelekciós módszert kell kidolgozni, amely lehetővé teszi azt, hogy nagyszámú mikroorganizmus között felismerjük és közülük kiemeljük azokat, amelyek számunkra érdekesek, értékesek. A mutációs törzsnemesítés során a kiválasztott törzs genomjában mutagén kezelés révén mutációkat indukálunk. A létrehozott mutációk különbözőek lehetnek. A mutáció érinthet fontos anyagcsere utakat, így a mikroba elvesztheti azon képességét, hogy saját maga állítson elő bizonyos, a sejt felépítéséhez és működéséhez fontos vegyületeket. Ezeket a mutánsokat hiány (auxotróf) mutánsoknak, míg a termelő vad törzset prototrófnak nevezzük. Az auxotrófok csak abban az esetben képesek növekedni, ha a környezetből fel tudják venni a hiányzó komponenst. A megváltozott tulajdonságú, mutáns törzsek közül szelekció segítségével választjuk ki a megfelelőt. A rekombináció lényege, hogy a szülői törzsek tulajdonságai keveredve, azaz kombinálódva jelennek meg az utódokban. Természetes rekombinációs folyamatok mind a prokarióták, mind az eukarióták körében lejátszódnak. Némely esetben olyan törzsek tulajdonságait szeretnénk egyesíteni, amelyek természetes úton nem keresztezhetőek. Ilyen esetben mesterséges rekombinációt alkalmazunk. Elsősorban a gombák mesterséges úton való keresztezésekor alkalmazzák a protoplaszt fúziót. Ennek lényege, hogy a szülői törzsek sejtjeiből protoplasztokat (sejtfal nélküli sejtek) hoznak létre, majd ezeket kémiai vagy fizikai behatással egyesítik. Az utód sejtek vagy azok szegregánsai közül szelekciós eljárással választják ki a megfelelő rekombinációs tulajdonsággal rendelkezőket. Feladat: 1. Biológiai polimer molekulák bontására képes mikroorganizmusok kiválasztása 2. A különböző komponensekkel kiegészített minimál táptalajra (MM) oltott hiány mutánsok auxotrófiájának meghatározása 3. Protoplasztok mikroszkópos megfigyelése, és tulajdonságaik vizsgálata 4. A protoplaszt fúzió bemutatása videofilm segítségével Anyagok: Bacillus subtilis, Saccharomyces diastaticus, Schizosaccharomyces pombe prototróf és auxotróf mutáns törzsek tenyészetei, S. cerevisiae protoplasztok Keményítős agarlemez, 0,6M KCl oldat, steril desztillált víz Eszközök: Oltókacs, pipetták, tárgylemez, fedőlemez, mikroszkóp 13
A gyakorlat menete: 1. A Bacillus subtilis és Saccharomyces diastaticus ferdeagaros tenyészeteiből oltókaccsal húzzunk egy vonalat a keményítős agarlemez felszínére. A csészéket 25°C-on inkubáljuk. Az inkubációs idő elteltével lúgol oldatot cseppentünk a tenyészetre. A feltisztulási zóna jelzi a keményítő lebomlását. 2. A vizsgálandó Schizosaccharomyces pombe prototróf és auxotróf mutáns törzseket minimál és különböző kiegészítéseket tartalmazó táptalajokra oltottuk. A mutáns törzs csak azon a tápagaron nő, ami tartalmazza azt a komponenst, amit nem képes előállítani. Figyeljük meg az egyes törzsek növekedését a különböző tápagarokon! 3. Mikroszkóp alatt figyeljük meg a S. cerevisiae protoplasztokat! A protoplaszt szuszpenzióból adjunk egy cseppet a 0,6M KCl oldathoz, ill. steril desztillált vízhez. Vizsgáljuk meg újra a protoplasztokat mikroszkóp alatt! Az eredmények értékelése: 1. A keményítős tápagarra oltott törzsek közül melyik volt képes bontani a polimert (keményítőt)? 2. Jegyezze fel, hogy mely törzs a prototróf (nem igényel kiegészítést)! Határozza meg, hogy a kiadott auxotróf törzsek milyen mutációt hordoznak! 3. Rajzolja le a protoplasztokat! Jegyezze fel miképpen viselkedtek a protoplasztok a 0,6M KCl oldatban, ill. a desztillált vízbe! Magyarázza megfigyeléseit! 4. A videofilmen figyelje meg a protoplasztok egyesülését! Jegyezze fel, hogy milyen módszert alkalmaztak a protoplasztok egyesítéséhez!
14
Tisztított β-galaktozidáz enzim aktivitásának meghatározása A mikroorganizmusok anyagcseréje igen változatos, ezért kitűnő forrásai a különböző speciális aktivitású enzimeknek. Egy-egy mikroorganizmus több ezer enzimet termel. A termelt enzimek nagyrészt sejten belül fejtik ki aktivitásukat (intracelluláris enzimek), míg kisebb részük kiválasztódik a környezetbe (extracelluláris enzimek). Az enzimek iparban történő alkalmazásához az adott enzimet tisztítani kell, és meg kell határozni aktivitását. Az enzimaktivitást enzim egységben fejezik ki (jele U (unit)), amit vonatkoztathatnak pl. enzim oldat térfogatára vagy a tisztított enzim tömegére. Az intracelluláris enzimek csak a sejt feltárásával nyerhetők ki, míg az extracelluláris enzimek közvetlenül a fermentléből tisztíthatóak. A β-galaktozidáz enzim tipikus intracelluláris enzim, amelynek szubsztrátja a sejt által felvett laktóz. Ezt a diszacharidot egy D-glükóz és egy D-galaktóz alkotja. A két cukor között lévő glikozidos kötés felbontása révén a β-galaktozidáz enzim a laktózból glükózt és galaktózt szabadít fel. Az enzim aktivitása a termék mennyiségével jellemezhető. Az enzimaktivitás méréséhez olyan mesterséges szubsztrátot is lehet alkalmazni, amelynek bontásakor színes termék keletkezik. Az oldat színintenzitása alapján lehet következtetni a termék mennyigére, így egyszerű spektrofotometriás méréssel meg tudjuk határozni az enzimaktivitást. A β-galaktozidáz enzim számára megfelelő mesterséges szubsztrát az Onitrofenil-D galaktozid (ONPG, színtelen), amelynek hidrolízisekor egy sárga színű termék, az O-nitrofenol (ONP) szabadul fel. Ez a reakció is sztöchiometrikus. Egy egység az aktivitása annak a β-galaktozidáz enzimnek, amely az ONPG-ből egy perc alatt 1μmól terméket képez a reakció körülményei között. Feladat: 1./ Kalibrációs egyenes készítése a keletkező ONP mennyiségének meghatározására 2./ Egy ismeretlen aktivitású tisztított β-galaktozidáz enzim aktivitásának meghatározása Eszközök: Kémcsövek, pipetták, termosztát, spektrofotométer (420 nm), stopperóra Anyagok: 1,25 mMólos ONPG törzsoldat, 0,5 μmól/ml ONP törzsoldat, 50 mMólos foszfát puffer (pH 6,5), 0,5 M nátrium-karbonát oldat, β-galaktozidáz enzim oldata A gyakorlat menete: A: Kalibrációs egyenes felvétele Az orto-nitrofenol oldatból hígítási sort készítünk, amelynek tagjai a következő koncentrációjú ONP oldatok lesznek: 0.05 μmól/ml, 0,1 μmól/ml, 0,15 μmól/ml, 0,2 μmól/ml, 0,25 μmól/ml, 0,5 μmól/ml.
15
Koncentráció [μmol/ml] (x tengely)
Abszorbancia Bemérendő foszfát Bemérendő ONP 420nm-en puffer [ml] törzsoldat [ml] (y tengely)
0,5 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 (vak)
0 3 3,6 4,2 4,8 5,4 6
6 3 2,4 1,8 1,2 0,6 0
A sor abszorbanciáját 420 nm-en mérjük, vak minta a foszfát puffer. A mért adatok alapján felvesszük a kalibrációs egyenest. B./ A β-galaktozidáz enzim aktivitásának meghatározása Az 1ml ismeretlen aktivitású enzim oldathoz 3 ml ONPG törzsoldatot mérünk, majd 37 oC-on inkubáljuk 10 percig. Az idő leteltével az enzimreakció leállítása végett 1 ml 0,5 mólos natrium-karbonát oldatot adunk a mintához. Foszfát pufferrel szemben mérjük a képződött termék mennyiséget 420 nm-en.
A gyakorlat értékelése: 1. A leolvasott érték alapján a kalibrációs egyenes felhasználásával határozza meg a képződött termék mennyiségét! 2. Számítsa ki az enzim aktivitását az enzim 1 mg mennyiségére vonatkoztatva!
16
Söripari mikrobiológia (vadélesztők kimutatása) A sör erjesztését a Saccharomyces cerevisiae élesztőgomba speciális törzseivel („sörélesztő”, fajélesztő) végzik. A S. cerevisiae fajélesztők fiziológiai tulajdonságai alapvetően meghatározzák az erjedést, ezért a sörgyártás során csak kitűnő életképességű starter kultúra használható. A beoltott starter fajélesztő mellett, más élesztőgombák („vadélesztők”) is előfordulhatnak a sörlében, amelyek az erjedést rossz irányba vihetik, ezért a sör vadélesztős szennyezettségét minden esetben szükséges vizsgálni. Feladat: 1. Idegen (vad) élesztők kimutatása sörléből lemeztenyésztéses módszerrel. 2. Fajélesztők életképességének valamint tartalék tápanyag tartalmának vizsgálata mikroszkóposan Eszközök: Pipetták, szélesztő üvegbot, tárgylemez, fedőlemez, mikroszkóp. Anyagok: Vadélesztőket illetve fajélesztőt tartalmazó sörlé, LIN1-es és LIN2-es táptalaj, hígítási sor készítéséhez 9 ml hígító oldat kémcsőben, metilénkék festék, lugol-oldat. A gyakorlat menete: 1. Idegen élesztők kimutatása sörléből lemeztenyésztéses módszerrel: A vadélesztőket tartalmazó sörlevet 50 °C-on 20 percig hőkezeljük, majd 4-tagú 10x-es hígítási sort készítünk. Minden egyes hígítási tagból 0,1 ml mennyiséget mind a LIN1-es, mind a LIN2-es táptalajra kiszélesztünk. Az elkészült leoltásokat 28-30 °C-on 1 hétig inkubáljuk. 2.a Fajélesztők életképességének vizsgálata: A fajélesztőket tartalmazó sörléből 1 cseppet tárgylemezre felviszünk, majd 1 csepp metilénkék festéket adunk hozzá. A preparátumot fedőlemezzel lefedjük és 40x-es objektívvel vizsgáljuk 10 látómezőben az élő (színtelen) és holt (kék) sejtek számát, az adatokat feljegyezzük. 2.b Fajélesztők tartalék tápanyag tartalmának vizsgálata: A fajélesztőket tartalmazó sörléből 1 cseppet tárgylemezre felviszünk, majd 1 csepp lugol-oldatot adunk hozzá. A preparátumot fedőlemezzel lefedjük és 40x-es objektívvel vizsgáljuk 10 látómezőben a tartalék tápanyagot nem tartalmazó (színtelen) és a tartalék tápanyagot tartalmazó (sárga, barna) sejtek számát, az adatokat feljegyezzük. Az eredmények értékelése: 1. Idegen élesztők kimutatása sörléből lemeztenyésztéses módszerrel: Az 1 hetes inkubáció után a táptalajokon kinőtt telepeket leszámoljuk és megadjuk az eredeti sörlé vadélesztő számát sejt/ml-ben. 2.a Fajélesztők életképességének vizsgálata: A látómezőnkénti holt és élő sejtszámokat átlagoljuk és megadjuk a holtsejtek arányát %-ban. Ha a kapott érték: holt sejtek száma <15%, akkor a fajélesztő egészséges × 100 élő sejtek száma 15-20%, akkor a fajélesztő fiziológiai állapota romlott >20%, akkor a fajélesztő sörgyártásra nem alkalmas
17
2.b Fajélesztők tartalék tápanyag tartalmának vizsgálata: A látómezőnkénti tápanyagot tartalmazó és nem tartalmazó sejtszámokat átlagoljuk és megadjuk a tartalék tápanyagot tartalmazó sejtek arányát %-ban. Ha a kapott érték: tartalék tápanyagot tartalamzó sejtek száma >70%, akkor jó élettani állapotú a × 100 fajélesztő. összes sejtszám
18
Az antibiotikumok hatásosságának vizsgálata Az antagonizmus jelensége régóta ismert a mikroorganizmusok világában. Okára először Fleming (1929) felfedezése szolgált magyarázatul, aki megállapította, hogy a Penicillium notatum nevű penészgomba egy olyan hatóanyagot termel, amely gátolja egyes baktériumok szaporodását. Azóta számos antibiotikumot fedeztek fel, amelyek között nemcsak penészgombák által, hanem a Streptomyces nemzetség fonalas baktériumai által termelt hatóanyagok is nagy jelentőségre tettek szert. A másik legjelentősebb antibiotikum a Streptomyces griseus által termelt sztreptomicin volt, amelyet Waksman fedezett fel 1945-ben. Az antibiotikum rezisztens törzsek kialakulása újabb és újabb antibiotikumok felfedezésére készteti a kutatókat. Ma a világ gyógyszertermelésének 2/3-át az antibiotikumok teszik ki. Hatásuk alapján ismertetünk néhány szűk , illetve széles sávban ható antibiotikumot: Penicillin: a Gram-pozitív baktériumok sejtfalszintézisét gátolja. A napjainkban előállított félszintetikus penicillin-származékok, amelyek a penicillin alapvázhoz kapcsolt, csak az oldalláncokban módosított származékok (oxacillin, meticillin, ampicillin) szintén a Grampozitív baktériumok sejtfalszintézisét gátolják. Cefalosporinok: A Cefalosporium penészgomba nemzetség által termelt hatóanyagok, amelyek már a Gram-pozitív és a Gram-negatív baktériumok sejtfalszintézisét is gátolják. Bacitracin: Szűk hatásspektrumú, csak néhány Gram-pozitív baktérium sejtfalszintézisét gátolja, a Bacillus licheniformis nevű baktérium termeli. Streptomicin: A Streptomyces griseus nevű fonalas baktérium termeli, a Gram-pozitív és a Gram-negatív baktériumok fehérjeszintézisét gátolja. Ugyanilyen hatású a Streptomyces fraidie által termelt neomycin és egyéb, más Streptomyces fajok által termelt kanamycin is. Tetránszármazékok (klórtetraciklin, oxitetraciklin): szintén a Streptomyces fajok által termelt antibiotikumok. Megakadályozzák a Gram-pozitív és a Gram-negatív baktériumok fehérjeszintézisét, a transzfer RNS riboszómához való kötődését. Kloramfenikol és erythromicin : más Streptomyces fajok termékei, amelyek a baktériumok 50S riboszóma alegységéhez kapcsolódva a fehérjeszintézist gátolják, Gram pozitív és negatív baktériumoknál egyaránt. A polimixinek (B és E) hatására a Gram-negatív baktériumok citoplazma membránja válik áteresztővé.(Gyenge antibiotikumok.) Az amfotericin-B és a nystatin gombák ellen hatásos antibiotikumok. Az actidion (cikloheximid) az élesztőgombák ellen hatásos antibiotikum jellegű vegyület. A gyakorlat során a streptomicin antibiotikum ismeretlen koncentrációjának meghatározását végezzük el, agardiffúziós lyuk módszer és Bacillus subtilis teszt-baktérium alkalmazásával. Feladat: 1./ Kalibrációs görbe készítése ismert koncentrációjú streptomicin oldatok segítségével. 2./ Ismeretlen töménységű streptomycin oldat koncentrációjának meghatározása a kalibrációs görbe felhasználásával, garafikus úton. Anyagok: Bacillus subtilis 48órás, ferde agaros tenyészete, Petri csészébe 20ml-ként kiadagolt és megszilárdított tápagarlemezek, 9ml-es higítóoldat a Bacillus subtilis ferde agaros tenyészetének lemosásához, 1000mg/ml streptomycin antibiotikum törzsoldat, pH=7 értékű foszfátpuffer a streptomicin törzsoldat készítéséhez és hígításához.
19
Eszközök:Petri csészék, kémcsövek, pipetták, dugófúró(7mm-es), szélesztőbot, 80°C-os vízfürdő a spóraszuszpenzió elkészítéséhez
kémcső-keverő,
A gyakorlat menete: A streptomycin törzsoldatból (1000mg/ml) elkészítjük a következő hígítású oldatokat: 100 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml, 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml. A Bacillus subtilis ferde agaros tenyészetéből 5ml hígító oldattal szuszpenziót készítünk, amelyet 80°C-on 15 percig hőkezelünk, így csak a spórák maradnak életképesek. A TGE agarlemezekre 0,1ml-nyi spóraszuszpenziókat szélesztünk. Ezután alkohollal lelángolt , 7mmes átmérőjű dugófúróval lyukakat fúrunk a tápagar lemezekbe. Egy tápagar lemezre 3, ill. 4 lyukat fúrunk. Az elkészített lyukakba azok jelölése után az ismert streptomicin koncentrációjú oldatokatból 0,1ml-t pipettázunk. 37°C-on, 48órás inkubáció után lemérjük a lyukak körül kialakult gátlási zónák átmérőjét. A streptomicin ismeretlen koncentrációjú oldatából szintén mérjünk be 0,1ml. Legalább 3 párhuzamos lemezt készítsünk. A lyukak körül lemért gátlási zóna átmérőjét az agarba diffundáló antibiotikum koncentrációja szabja meg, amely a Bacillus subtilis tesztmikroba kalibrációs görbéje segítségével meghatározható. A gyakorlat értékelés: 1. Készítsük el a Bacillus subtilis tesztmikroba kalibrációs görbéjét miliméterpapíron (A vízszintes tengelyen a streptomicin koncentrációk, a függőleges tengelyen a gátlási zónák átmérői szerepeljenek.) 2. Határozzuk meg a lemért gátlási zóna átmérője alapján az ismeretlen töménységű streptomicin oldat koncentrációját!
20
Szelektív tápközegek élelmiszeripari szempontból jelentős mikroorganizmusok számára A mikrobiológiai munka során a mikroorganizmusok kimutatásához, megfelelő koncentrációban történő elszaporításához különböző tápközegeket alkalmazunk. Ezek fontos alkotóelemei a szénforrások, a különböző nitrogénforrások, ásványi anyagok, vitaminok és a víz. A táptalajok hatásuk, halmazállapotuk és eredetük szerint több csoportba sorolhatók. Felhasználási céljuk, hatásuk szerint a következő csoportokat különböztetjük meg: alap, elektív, szelektív, differenciáló és speciális hatású tápközegek. A szelektív táptalajok összetétele kedvez az izolálandó vagy kimutatandó mikroorganizmusok növekedésének azáltal, hogy egyes mikroorganizmusok ill. mikroorganizmus-csoportok növekedését másokhoz viszonyítva lassítják, vagy teljesen megakadályozzák különböző gátlószerek segítségével. Ezeket a táptalajokat tiszta tenyészetek készítésénél is alkalmazzuk. A differenciáló táptalajok összetételüknél fogva különböző mikroorganizmusok differenciálására és azonosítására alkalmasak. Jellemzőjük, hogy indikátort tartalmaznak, így szabad szemmel is látható reakciót adnak a növekvő mikrobák anyagcseretermékeivel. Hagyományos szelektív tápközegek • pH csökkentés (pl. élesztők, penészgombák, tejsavbaktériumok) • gátló festékek (pl. bengálrózsa) • antibiotikumok (pl. kloramfenikol, oxitetraciklin) Kromogén tápközegek • kromogén szubsztrátokat tartalmaznak → különböző színű telepek képződnek • egy lépésben több mikrobacsoportot is el tud különíteni egyetlen táptalajon • folyadék tenyészetben is lehetséges → a tenyészet színe változik Fluorocult tápközegek: olyan komponenst tartalmaz, amely a mikoba bizonyos enzimeivel reakcióba lépve fluoreszkáló festékanyagot képez. Ilyen például az E. coli kimutatására alkalmas lauril-szulfátos tápleves. NaOH
MUG + E. coli (enzim)
fluoreszkáló anyag
(4-methylumbelliferyl-D-glucuronide)
Feladat: A gyakorlatra demonstrációs céllal elkészített szelektív táptalajokon figyelje meg és hasonlítsa össze a különböző mikrobacsoportok szaporodását, gátlását! Jegyezze fel a látottakat a gyakorlati jegyzőkönyvébe!
21
