ACTA MEDICA (HRADEC KRÁLOVÉ) SUPPLEMENTUM 2004, svazek 47, číslo 2 OBSAH

ACTA MEDICA (HRADEC KRÁLOVÉ) SUPPLEMENTUM 2004, svazek 47, číslo 2 OBSAH Yvona Mazurová, Ivan Látr, Jan Österreicher, Jaroslav Cerman Proliferace a diferenciace neurálních kmenových buněk v subependymové vrstvě postranních mozkových komor v reakci na neurodegenerativní proces ve striatu ................................................................................................63 Zuzana Čermáková, Lenka Plíšková, Petr Prášil, Olga Ryšková Metoda polymerázové řetězové reakce (PCR) v diagnostice toxoplazmózy ...............................................................71 Monika Hrudková, Zdeněk Fiala, Lenka Borská, Jakub Novosad, Lukáš Smolej Účinky polycyklických aromatických uhlovodíků na kostní dřeň ............................................................................75 Michal Pintér, Martina Kolesárová Genetické aspekty idiopatických střevních zánětů ..............................................................................................83 Martina Kolesárová, Michal Pintér Vzájemné ovlivnění fertility a idiopatických střevních zánětů: shrnutí současných poznatků ........................................89 Karin Boušová Profesionální bronchiální astma: současný stav problému ....................................................................................97 Valerie Hassmanová Onemocnění z azbestového prachu a trend jejich vývoje u exponovaných pracovníků v letech 1951–2003......................107

XXVII. DNY LÉKAŘSKÉ BIOFYZIKY 2004, Černý důl, 19.–21. května 2004 Josef Bukač Vlastní statistické programy v Excelu ............................................................................................................123 Tomáš Grézl, Josef Pešák Hodnocení autonomní reaktivity u balbuties při bronchodilatační terapii...............................................................125 Rita Chalupníková Multimediální výukový program (MVP) ve vzdělávání na vysokých školách ...........................................................127 Jiří Knížek, Michal Bergmann, Jan Šindelář, Hana Kovářová MIAPS – Programový systém pro odhadování pořadí vzájemné podobnosti/nepodobnosti chování proteinů v čase .........131 Jan P. Naidr, Pavel Kasal, Marie Hladíková, Jitka Feberová Volně dostupné zdroje pro výuku lékařské informatiky.......................................................................................137 Miroslav Novotný, Petr Krásný Využití elektronického podpisu na elektronické zdravotnické dokumentaci .............................................................141 Milan Vošmik, Karel Odrážka, Milan Zouhar, Jiří Petera, Josef Dvořák, Zdeněk Zoul Radioterapie s modulovanou intenzitou v léčbě karcinomu štítné žlázy ..................................................................151

PROLIFERACE A DIFERENCIACE NEURÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK V SUBEPENDYMOVÉ VRSTVĚ POSTRANNÍCH MOZKOVÝCH KOMOR V REAKCI NA NEURODEGENERATIVNÍ PROCES VE STRIATU Yvona Mazurová1, Ivan Látr2, Jan Österreicher3, Jaroslav Cerman4 Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové: Ústav histologie a embryologie1; Ústav lékařské biochemie4; Fakultní nemocnice v Hradci Králové: Neurochirurgická klinika2; Vojenská lékařská akademie J. E. Purkyně: Ústav radiobiologie a imunologie3 Summary: Proliferation and differentiation of neural stem cells within the subependymal layer of lateral brain ventricles in response to the neurodegenerative process in the striatum. It is known that the subependymal layer (SEL) of the lateral brain ventricles‘ wall is a source of neural stem cells (NSCs) of adult mammalian brain including the human brain. The NSCs in relation to the striatum differentiate only into glial phenotype. Therefore we focused on proliferative activity of NSCs and precursors in the SEL and on the course of their differentiation into the astrocytes in reaction to the neurodegenerative process in the striatum like in Huntington‘s disease. Increased gliogenesis, differentiation of newly generated cells and their ability to migrate into the striatum were evaluated in two groups of the rats surviving 1 and 3 months after the application of the neurotoxic (ibotenic) acid into the striatum. For evaluation of the proliferative activity we compared the results obtained using two proliferative markers – Bromodeoxyuridine (BrdU) and Ki-67. Characterization of newly generated cells and of their differentiation was based on the detection using the following antibodies: Nestin (a marker for NSCs and precursors), GFAP (detection of astrocytes), also the double-staining method with BrdU and GFAP.

Key words: Subependymal layer; Adult gliogenesis; Astrocytes; Animal model of Huntington‘s disease; Immunohistochemistry

Souhrn: Je známo, že subependymová vrstva (SEV) ve stěně postranních mozkových komor je zdrojem neurálních kmenových buněk (NKB) v mozku dospělých savců včetně člověka. Z těchto NKB se ve vztahu ke striatu však diferencují pouze gliové buňky. Zaměřili jsme se proto na hodnocení intenzity proliferace NKB a prekurzorů v SEV a na průběh jejich diferenciace v astrocyty v reakci na neurodegenerativní proces ve striatu, imitující degenerativní změny při Huntingtonově chorobě. Rozvoj gliogeneze, diferenciace novotvořených buněk a jejich schopnost migrace do striata byly hodnoceny u dvou skupin potkanů, přežívajících 1 a 3 měsíce po unilaterální aplikaci neurotoxické (ibotenové) kyseliny do striata. Při hodnocení proliferační aktivity jsme porovnávali výsledky získané použitím dvou proliferačních markerů – Bromodeoxyuridinu (BrdU) a Ki-67. K charakteristice nově generovaných buněk a jejich diferenciace jsme použili detekce pomocí následujících protilátek: Nestinu (marker NKB a prekurzorů), GFAP (detekce astrocytů) a dvojitou detekci pomocí BrdU a GFAP.

Úvod Neurální kmenové buňky (NKB), ať již edogenní či exogenní, jsou zejména v posledních 10–15 letech velmi podrobně studovány jako možný zdroj pro náhradu degenerovaných nebo i jinak poškozených buněk v CNS (např. 8,19). Jako první byly izolovány pluripotentní embryonální kmenové buňky (EKB) z embryoblastu blastocysty (např. 6). Vzhledem k etickým problémům, které se týkají získávání lidských EKB, a vzhledem k potencionálnímu nebezpečí zvrhnutí těchto buněk a vzniku teratomů, se řada autorů začala zabývat studiem „dospělých“ (adultních), tedy orgánově specifických, endogenních KB (např. 19). Tyto KB jsou ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):63–70

relativně klidové, přítomné v řadě orgánů (především v tkáních s malou proliferační aktivitou), avšak v případě nutnosti regenerace a reparace tkáně mohou začít proliferovat a do určité míry se i diferencovat v příslušné buněčné typy. Subependymová vrstva (SEV) nebo také subventrikulární vrstva/zóna (SVV/SVZ) v postranních mozkových komorách je definována jako sekundární proliferační oblast, to znamená místo, kde se nacházejí dospělé NKB (pro přehled viz např. 2). Je lokalizovaná pod ependymovou vrstvou v předním mozku všech dospělých savců včetně člověka. V embryonálním období se vyvíjí jako subventrikulární vrstva (proto by neměl být tento název používán u dospělých jedinců) delaminací z ventrikulární zóny při vývoji předního 63

mozku. Během embryonálního vývoje je SVV nejvíce vyvinuta v oblasti základu bazálních ganglií (např. 7). Ukázalo se, že je zdrojem buněk nejen pro vyvíjející se bazální ganglia (17), ale i pro struktury diencefala (13) a kortex (5). Pokračující neurogeneze byla v mozku dospělých jedinců jasně prokázána pouze ve dvou lokalitách: (a) v rostrální části SEV laterální stěny postranních komor, v níž dochází k proliferaci a migraci buněk (rostral migratory stream – RMS) (1) do bulbus olfactorius, kde se diferencují v nové interneurony (15), (b) v subgranulární zóně gyrus dentatus hipokampu, z níž proliferací, migrací a diferenciací vzniká jiný typ neuronů – granulární buňky gyrus dentatus (pro přehled viz např. 20). Ve vztahu ke striatu, tj. v SEV laterální stěny postranních komor, však byla především prokázána gliogeneze (např. 3). Předpokládá se, že v dospělém mozku NKB proliferují a částečně diferencují v prekurzorové buňky omezené na diferenciaci gliových buněk (glia restricted precursors – 18), z nichž se diferencují prekurzory pro astrocyty typu 1 (exprimující typicky GFAP) a O2A prekurzory (Oligodendrocyte type-2 astrocyte precursor cell) pro diferenciaci myelinizujících oligodendrocytů (a astrocytů typu 2, které se však diferencují pouze v buněčné kultuře) – (18). Vzhledem k tomu, že se zde nejedná o neurogenezi, je zájem o studium této oblasti podstatně menší než v případě reakce SEV na změny v bulbus olfactorius a v hipokampu. Neurotoxická léze striata, navozená např. injekcí kyseliny ibotenové (např. 10), je velmi dobrým modelem neurodegenerativního poškození striata při Huntingtonově chorobě. Deplece striatových neuronů a následná reaktivní glióza představují výrazné poškození této oblasti mozku. Zajímala nás proto reakce SEV, tj. intenzita proliferační aktivity v SEV, ve sledovaných časových intervalech po vytvoření striatové léze. Dále jsme, pomocí metody dvojité detekce, zjišťovali stupeň diferenciace nově vygenerovaných astrocytů a zda tyto gliové buňky migrují do neurodegenerativním procesem postiženého striata. V souvislosti s hodnocením proliferační aktivity v SEV jsme také porovnávali výsledky detekce dvěma proliferačními markery – Bromodeoxyuridinem (BrdU) a Ki-67.

Metodika K experimentu byli použiti dospělí samci potkanů kmene Long-Evans (o váze 250–270 g na počátku pokusu). Zvířata byla rozdělena do 2 skupin – skupina I přežívala jeden měsíc a skupina II tři měsíce po aplikaci kyseliny ibotenové (IA). V každé skupině byla 3 zvířata s IA lézí, 1 zvíře s kontrolní lézí a 1 zvíře intaktní (kontrola). Zvířata byla anestezována i.p. směsí ketaminu (Calypsol inj., Gedeon Richter, Maďarsko – 80 mg/kg) a xylazinu (Rometar 2% inj., Spofa, ČR – 12 mg/kg). Kyselina ibotenová (Sigma-Aldrich, ČR) byla aplikována stereotakticky (Koppf stereotaxic frame, PA, USA) v koncentraci 10 µg/µl v 0,1 M PBS do 3 míst (3x 0,25 µl) ve striatu v pravé hemi64

sféře. Koordináty (modifikované podle Isacsona a spol. –10) byly následující: (i) A: 0.4, L: 3.9, V: 5.3; (ii) A: 0.4, L: 3.1, V: 4.0; (iii) A: 1.3, L: 3.1, V: 4.4; A = anterior (tj. dopředu od bregma), L = laterálně od střední čáry, V = ventrálně (tj. do hloubky ve vertikální ose, měřeno od dura mater) – všechny koordináty jsou uvedeny v mm; linie vedená horními řezáky (tooth-bar) byla v úrovni interaurální linie. Jednotlivé dávky IA byly injikovány automatickým dávkovačem SP 310 (World Precision Instruments, SRN) rychlostí 0,1 µl/min; jehla byla vytahována rychlostí 1 mm/min a přestávka mezi jednotlivými injekcemi byla vždy 2 min. Zvířatům s kontrolní lézí byl stejnou technikou aplikován fyziologický roztok (3x 0,25 µl). Veškerá manipulace se zvířaty byla schválena Odbornou komisí pro ochranu zvířat proti týrání, UK v Praze, LF v Hradci Králové v souladu se zákonem č. 246/1992 Sb. a Vyhláškou Ministerstva zemědělství 311/1997. Po 1 a 3 měsících byla zvířata v hluboké narkóze (viz výše – Calypsol 100 mg/kg a Rometar 15 mg/kg) usmrcena transkardiální perfuzí roztokem 4% formaldehydu. Mozky byly přikrojeny v Brain Blockeru (Koppf model PA 001, Better Hospital Equipment Corp., NY, USA) na 5 mm silné transverzální bločky tkáně obsahující celé striatum a dofixovány imerzně ve 4% formaldehydu 5 dní. Sériové frontální parafínové řezy (6 µm silné) byly barveny (v sadách po 15 řezech) hematoxylinem-eosinem a ve vybraných sadách byla provedena imunohistochemická detekce pomocí následujících protilátek: anti-Ki-67 (Immunotech, ČR; ředění 1:50), anti-GFAP (Sigma-Aldrich, ČR; ředění 1:400), anti-Nestin (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, USA); BrdU (Sigma-Aldrich, 135 mg/kg ve 2 ml aqua pro inj.) byl potkanům aplikován i.p. 15 a 3 hodiny před usmrcením; k detekci bylo použito anti-BrdU (DAKO, ČR; ředění 1:50). Odparafínované a odvodněné řezy byly inkubovány ve vodném roztoku H2O2 (ředění 5:1) na 20 min k potlačení aktivity endogenní peroxidázy. Bylo provedeno ošetření řezů v mikrovlnné troubě v citrátovém pufru (pH 6,0) 3x5 min při 800 W s následným oplachem v 0,2 M Tris-HCL pufru s 0,5% Tritonem-X 100 (Sigma-Aldrich, ČR). Inkubace s primárními protilátkami (viz výše) byla provedena přes noc v lednici (při 4 °C). Řezy pak byly opláchnuty a inkubovány s biotinylovanou anti-myší sekundární protilátkou (Sigma-Aldrich, ČR) 45 min při pokojové teplotě a následně se streptavidinem konjugovaným s peroxidázou (BioGenex, San Ramon, CA) také 45 min při pokojové teplotě. Vizualizace byla provedena 3,3’-diaminobenzidin-tetrahydrochloridem (DAB; Sigma-Aldrich, ČR) a peroxidem vodíku. Při dvojitém barvení byla použita kombinace detekce BrdU (peroxidáza, DAB) a GFAP (alkalická fosfatáza, NBT/BCIP). Všechny řezy byly dobarveny 0,1% metylovou zelení. Odvodněné a xylolem projasněné řezy byly zamontovány do DPX (Sigma-Aldrich, ČR). Mikrofotografie byly pořízeny v programu Lucia G verze 4.51 (Lab Imaging, ČR) na Ústavu lékařské biologie a genetiky, UK v Praze, LF v Hradci Králové.

A

IA – 1 měs. Ki-67

B

IA – 1 měs. BrdU

C

KONTROLA – 1 měs. Ki-67

D

IA – 3 měs. Ki-67

Obr. 1: Intenzita proliferace v SEV byla hodnocena pomocí proliferačních markerů Ki-67 (obr. a,b,d) a BrdU (obr. b). Neurodegenerativní proces ve striatu vyvolává zvýšenou proliferační aktivitu v SEV. Počet novotvořených buněk je jen o málo vyšší 1 měsíc po aplikaci IA (a,b) v porovnání se stavem u 3 měsíce přežívajících zvířat (d), avšak zřetelně zvýšená v porovnání s kontrolním intaktním zvířetem (c). U všech zvířat s IA-lézí je SEV zřetelně rozšířena (a,d) v porovnání s kontrolou (c). Na paralelních řezech (a,b) vidíme expresi Ki-67 u většího počtu jader nově generovaných buněk (a) než v případě značení pomocí BrdU, které je však při přežití zvířat 1 měsíc po IA-lézi daleko výraznější (b). Anti-Ki-67, antiBrdU; měřítko 5 µm. 65

A

KONTROLA – 1 měs. NESTIN

C

IA – 1 měs. NESTIN

B

IA – 1 měs. NESTIN

Obr. 2: Detekce NKB, a v této části SEV především gliových prekurzorů, pomocí Nestinu. Počet těchto nediferencovaných buněk se nápadněji neliší u zvířat přežívajících 1 měsíc (b) a 3 měsíce (c) po IA-lézi, je však výrazně zvýšený v porovnání s kontrolním zvířetem (a). Anti-Nestin; měřítko 5 µm.

66

A

KONTROLA – 1 měs. GFAP

B

IA – 1 měs. GFAP

C

IA – 3 měs. GFAP

D

KONTROL-L – 3 měs. GFAP

Obr. 3: GFAP-pozitivní astrocyty vyplňují celou SEV v laterální stěně postranních mozkových komor. V porovnání s kontrolním zvířetem (a) je počet GFAP+ astrocytů v SEV výrazně zvýšen v reakci na neurodegenerativní proces ve striatu jak při přežívání zvířat 1 měsíc (b), tak jen o něco méně při 3měsíčním přežívání (c). Naproti tomu v důsledku (v podstatě mechanické) kontrolní léze (KONTROL-L) je počet GFAP+ astrocytů v SEV zvýšen jen velmi málo (d). Anti-GFAP; měřítko 5 µm. 67

IA – 1 měs. BrdU a GFAP

A

▼

▼

B

IA – 1 měs. BrdU a GFAP

➔

▼

▼

Obr. 4: Při dvojité detekci pomocí BrdU a GFAP je patrno, že za 1 měsíc po IA-lézi (a) je v SEV přítomen značný počet nově generovaných (BrdU+) buněk, v této lokalizaci především nediferencovaných gliových prekurzorů. BrdU+ buňky v SEV vytvářejí typické shluky (šipka), ze kterých vycestovávají ojedinělé buňky na krátkou vzdálenost do striata (hlavička šipky). Teprve za 3 měsíce po IA-lézi (b) dochází v blízkosti výrazného neurodegenerativního procesu ve striatu k postupné diferenciaci těchto novotvořených buněk v typické GFAP+ astrocyty (šipky). Některé z těchto buněk již dokonce vytvářely vaskulární nožky (bílá šipka) kolem cév v SEV. Anti-BrdU + anti-GFAP; měřítko 3 µm.

Výsledky Neurodegenerativní proces ve striatu, navozený aplikací IA, vyvolává zvýšenou proliferaci buněk v laterální stěně SEV. Tyto nově generované buňky jsou BrdU a Ki-67 pozitivní, přičemž počet Ki-67+ buněk je vždy o něco vyšší než BrdU+ buněk (obr. 1a a 1b). Proliferace v SEV byla u skupiny zvířat přežívajících 1 měsíc (skupina I) výrazně zvýšená po IA-lézi (obr. 1a, b) v porovnání s kontrolním zvířetem (obr. 1c). Proliferační aktivita však byla mírně zvýšená i v SEV v hemisféře kontralaterální k IA-lézi, kde bylo striatum zcela intaktní. Rovněž u zvířat s kontrolní sham-lézí byl v SEV mírně zvýšený počet nově vyprodukovaných buněk. Pokles počtu Ki-67+ i BrdU+ buněk, tedy nově generovaných, byl po 3 měsících (skupina II) poměrně malý u všech operovaných zvířat v této skupině (obr. 1d). U kontrolních zvířat ze skupiny I a II nebyl zaznamenán rozdíl. Počet Nestin-pozitivních NKB a, v případě SEV v laterální stěně postranní komory, především gliových prekurzorů v obou hodnocených skupinách korespondoval s nálezy při detekci proliferačními markery (Ki-67 a BrdU), přičemž spíše odpovídal počtu buněk značených Ki-67. Tento nález dokládá, že nově produkované buňky jsou skutečně NKB, resp. především z nich se diferencující prekur68

zory. Nejvyšší počet Nestin+ buněk byl u zvířat s IA-lézi ve skupině I (obr. 2b), avšak ve skupině II vykazoval jen velmi mírný pokles (obr. 2c). Výrazný rozdíl však byl při porovnání s kontrolním zvířetem (obr. 2a), kde byl nejen zřetelně nižší počet Nestin+ buněk, ale i intenzita jeho exprese zde byla výrazně slabší. Nárůst počtu GFAP-pozitivních astrocytů byl nejnápadnějším projevem reakce SEV u obou sledovaných skupin zvířat. Nejvýraznější navýšení počtu buněk (v porovnání s kontrolou – obr. 3a) vykazovala opět skupina s neurodegenerativními změnami ve striatu za 1 měsíc po IA-lézi (obr. 3b). Ani v tomto případě však nedošlo po 3 měsících přežívání k nápadnějšímu poklesu buněk (obr. 3c). Naproti tomu kontrolní léze vyprovokovala jen velmi malé zvýšení počtu GFAP+ astrocytů v SEV na straně léze (obr. 3d). Kombinací detekce proliferačního markeru BrdU a markeru astrocytů GFAP jsme prokazovali, zda se nově generované buňky v SEV diferencují v astrocyty a také, zda alespoň některé z těchto buněk migrují do přilehlého denervovaného striata. Zjistili jsme, že naprostá většina BrdU+ buněk, vyprodukovaná v SEV v reakci na neurodegenerativní proces ve striatu za 1 měsíc po IA-lézi, se (alespoň prozatím) dále nediferencovala. To znamená, že zůstává v podobě nediferencovaných NKB a v této části SEV ze-

jména gliových progenitorových buněk (obr. 4a). BrdU+ buňky zde vytvářejí typické shluky (šipky), z nichž vycestovávají ojedinělé buňky na krátkou vzdálenost do striata (hlavička šipky). I tyto elementy jsou zatím nediferencované, resp. nevykazují ani náznak fenotypu GFAP+ astrocytů. Podle nižší exprese BrdU v jádře se však dá usuzovat, že již prodělaly další jedno až dvě dělení. Naproti tomu u zvířat přežívajících 3 měsíce po IA-lézi (při stejném časovém intervalu aplikace BrdU, tj. 15 a 3 hodiny před usmrcením zvířat) jsme v blízkosti centra léze, kde je poškození striata nejvýraznější, nalezli většinu buněk s BrdU+ jádrem vykazujících fenotyp astrocytů, včetně výrazné GFAP-pozitivity (obr. 4b – šipky). U řady z nich byla rovněž snížená pozitivita BrdU v jádře v důsledku buněčného dělení. Některé z těchto buněk již dokonce svými vaskulárními nožkami participovaly na vytvoření membrana limitans gliae perivascularis (prázdná šipka) kolem cév v SEV. Tyto buňky s fenotypem astrocytů však nevykazovaly tendenci migrovat do denervovaného striata. Zajímavostí bylo, že rostrálně a ve menším rozsahu i kaudálně od uvedeného místa byla převážná většina buněk, resp. všechny BrdU+ buňky stále ještě nediferencované.

Diskuse a závěry K hodnocení proliferační aktivity v SEV v reakci (a) na neurodegenerativní proces ve striatu, tj. na výrazné poškození a (b) na mechanické poškození striata vpichem jehly a instilaci malého množství fyziologického roztoku (kontrolní léze) jsme použili porovnání dvou proliferačních markerů BrdU a Ki-67. Výsledný počet pozitivních buněk v daném řezu se lišil – u všech testovaných zvířat, včetně kontrol byl vždy větší počet Ki-67+ buněčných jader než BrdU+. Statistické vyhodnocení těchto našich nálezů nemohlo být provedeno vzhledem k malému počtu vzorků (1–3) v každé skupině, v zásadě je však celkový výsledek v souhlase s nálezy Kee a spol. (11). Zmíněný jev je důsledkem rozdílného způsobu vazby těchto antigenů v jádře: zatímco BrdU, který je analogem thymidinu, se zabudovává do molekuly DNA pouze v S-fázi mitotického cyklu, Ki-67 je v jádře exprimováno během celého buněčného cyklu, pravděpodobně pouze s výjimkou časné G1 fáze. Kee a spol. (11) udávají, že Ki-67+ buněk je o 50 % více než BrdU+. Naše nálezy takto velký rozdíl nevykazují (počet Ki-67+ buněk je vyšší o cca 25–30 %). Tyto rozdílné údaje zcela korespondují s rozdílným schématem aplikace BrdU – zatímco Kee a spol. (11) podávali BrdU pouze jednorázově, 24 hodin před usmrcením potkanů, my jsme BrdU aplikovali 2x, 15 a 3 hodiny před utracením potkanů. Interval 24 hodin předpokládá, že je to minimální doba, během níž se dokončí alespoň jeden buněčný cyklus, ve kterém se během S-fáze inkorporoval do jádra BrdU (16). Zdá se však, že interval 1 buněčného cyklu neurálních buněk v SEV může být i kratší, a proto opakovaná aplikace v kratším časovém intervalu postihne více buněk vstupujících do S-fáze, a tak je námi uváděný (i když jen přibližný) počet BrdU+ buněk vyšší.

Z uvedených výsledků vyplývá, že proliferace NKB a prekurzorů v SEV je aktivována jakýmkoliv poškozením mozku (neurotoxická IA-léze, mechanická léze). Tomu odpovídají i nálezy dalších autorů, kteří popisují zvýšenou proliferační aktivitu v SEV také v souvislosti s experimentální alergickou encefalomyelitidou, tedy se zánětlivým procesem v mozku (4), nebo po dalších typech mechanického poškození mozku – aspirační kavita, řezné či bodné poranění (např. 22). Na rozdíl od uvedených autorů jsme však prokázali, že intenzita odpovědi (proliferace) v SEV je přímo úměrná intenzitě a rozsahu poškození parenchymu mozku (zde striata). Výrazný nárůst počtu nově generovaných NKB a následně i prekurzorů se bezesporu odehrává v krátkém časovém úseku ihned po chirurgickém zákroku na mozku. Velká část těchto Ki-67+, resp. BrdU+, buněk však zůstává velmi dlouho (pokud ne trvale) nediferencovaná, pro což také svědčí přetrvávající zvýšená exprese Nestinu v SEV i u zvířat přežívajících 3 měsíce po IA-lézi. Tyto buňky by mohly představovat zdroj nediferencovaných buněk, které by se, v případě potřeby výrazně zvýšit proliferaci v SEV, mohly změnit v přechodně se množící elementy (9). Pro upřesnění vztahu exprese BrdU a Nestinu v nově generovaných buňkách v SEV chceme v následující studii použít také imunofluorescenční detekci kombinace zmíněných markerů (BrdU a Nestinu). Výrazně rozšířená SEV, kterou popisujeme v reakci na neurodegenerativní proces ve striatu za 1 i 3 měsíce po aplikaci IA (tedy v době, kdy je neurotoxická léze již plně rozvinuta), je téměř výlučně tvořena GFAP+ astrocyty. Je tedy zcela evidentní, že většina novotvořených NKB se vydiferencovala (pravděpodobně již v časné fázi reakce na poškození) v astrocyty, výrazně exprimující GFAP. Tento fakt zcela odpovídá uváděné charakteristice nově generovaných astrocytů v SEV v dospělém mozku jak zvířat, tak člověka (18). Je však pravděpodobné, že i přes expresi GFAP nejsou tyto buňky totožné s GFAP-pozitivními astrocyty v mozkovém parenchymu (např. 9,12). Závěrem můžeme konstatovat, že naše nálezy zapadají do mozaiky poznatků řady autorů, kteří v posledních letech stále častěji zdůrazňují nezastupitelný význam gliových buněk – astrocytů, přítomných i nově generovaných v SEV. V interakci s endotelovými a ependymovými buňkami astrocyty vytvářejí mikroprostředí (niche) jednak pro optimální vývoj neuronů v neurogenních oblastech SEV (např. 14,21), jednak v určitých částech SEV (např. v laterální stěně postranních mozkových komor) pravděpodobně naopak přispívají k supresi neurogeneze a vytvářejí optimální mikroprostředí pro gliogenezi v reakci na aktuální změny v tkáni CNS (9). Poděkování Autoři děkují laborantkám Ústavu histologie a embryologie, UK v Praze, LF v Hradci Králové, paní J. Pipkové a paní M. Hetešové za zpracování histologického materiálu, paní H. Hollerové za provedení všech imunohistochemic69

kých detekcí a paní H. Rückerové za pomoc při práci se zvířaty a při odběru materiálu. Práce byla podpořena Výzkumným záměrem MŠMT ČR (MSM 111500001) a grantovým projektem IGA MZ ČR (NF 7594).

Literatura 1. Altman J. Autoradiographic and histological studies of postnatal neurogenesis. IV. urogenesis. IV. on and migration in the anterior forebrain, with special reference to persisting neurogenesis in the olfactory bulb. J Comp Neurol 1969; 137:433–58. 2. Alvarez-Buylla A, Herrera DG, Wichterle H. The subventricular zone: source of neuronal precursors for brain repair. In: Dunnett SB, Björklund A, eds. Prog Brain Res 127. Functional neural transplantation II. Novel cell therapies for CNS disorders. Amsterdam, Elsevier Sci, 2000:1–11. 3. Burrows RC, Lillien L, Levitt P. Mechanisms of progenitor maturation are conserved in the striatum and cortex. Dev Neurosci 2000;22:7–15. 4. Calza L, Giardino L, Pozza M, Bettelli C, Micera A, Aloe L. Proliferation and phenotype regulation in the subventricular zone during experimental allergic encephalomyelitis: in vivo evidence of a role for nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:3209–14. 5. De Carlos JA, Lopez-Mascaraque L, Valverde F. Dynamics of cell migration from the lateral ganglionic eminence in the rat. J Neurosci 1996;16:6146–56. 6. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981;292:154–6. 7. Fentress JC, Stanfield BB, Cowan WM. Observation on the development of the striatum in mice and rats. Anat Embryol (Berl) 1981;163:275–98. 8. Gage FH. Mammalian neural stem cells. Science 2000;287:1433–8. 9. Goldman S. Glia as neural progenitor cells. Trends Neurosci 2003;26:590–6. 10. Isacson O, Brundin P, Gage FH, Björklund A. Neural grafting in a rat model of Huntington’s disease: Progressive neurochemical changes after neostriatal ibotenate lesions and striatal tissue grafting. Neuroscience 1985;16:799–817. 11. Kee N, Sivalingam S, Boonstra R, Wojtowicz JM. The utility of Ki-67 and BrdU as proliferative markers of adult neurogenesis. J Neurosci Methods 2002; 115:97–105.

70

12. Laywell ED, Rakic P, Kukekov VG, Holland EC, Steindler DA. Identification of a multipotent astrocytic stem cell in the immature and adult mouse brain. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:13883–8. 13. Letinic K, Kostovic I. Transient fetal structure, the gangliothalamic body, connects telencephalic germinal zone with all thalamic regions in the developing human brain. J Comp Neurol 1997;384:373–95. 14. Lim DA, Alvarez-Buylla A. Interaction between astrocytes and adult subventricular zone precursors stimulates neurogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:7526–31. 15. Lois C, Alvarez-Buylla A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science 1994;264:1145–48. 16. Nowakowski RS, Lewin SB, Miller MW. Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population. J Neurocytol 1989;18:311–8. 17. Olsson M, Björklund A, Campbell K, Turnbull K. Early specification of striatal projection neurons and interneuronal subtypes in the lateral and medial ganglionic eminence. Neuroscience 1998;84:867–76. 18. Rao MS. Multipotent and restricted precursors in the central nervous system. Anat Rec 1999;257:137–48. 19. Rice CM, Scolding NJ. Adult stem cells – reprogramming neurological repair? Lancet 2004;364:193–9. 20. Seri B, Garcia-Verdugo JM, Collado-Morente L, McEwen BS, Alvarez-Buylla A. Cell types, lineage, and architecture of the germinal zone in the adult dentate gyrus. J Comp Neurol 2004;478:359–78. 21. Song H, Stevens CF, Gage FH. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature 2002;417:39–44. 22. Weinstein DE, Burrola P, Kilpatrick TJ. Increased proliferation of precursor cells in the adult rat brain after targeted lesioning. Brain Res 1996;743:11–6.

Doc. MUDr. Yvona Mazurová, CSc., Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Ústav histologie a embryologie, Šimkova 870, poštovní přihrádka 38, 500 38 Hradec Králové. e-mail: [email protected]

METODA POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE (PCR) V DIAGNOSTICE TOXOPLAZMÓZY Zuzana Čermáková1, Lenka Plíšková2, Petr Prášil3, Olga Ryšková1 Fakultní nemocnice v Hradci Králové: Ústav klinické mikrobiologie1, Ústav klinické biochemie a diagnostiky2, Klinika infekčních nemocí3 Summary: Method of polymerase chain reaction in toxoplasmosis diagnosis. Since introduction of polymerase chain reaction for the detection of DNA Toxoplasma gondii 398 biological samples from 301 patients were examined from 2000 to 2003. Positive finding of toxoplasmosis DNA we noted in 23 cases. Polymerase chain reaction enables exact and fast diagnosis of the actual parasitemia Toxoplasma gondii, which is important especially in the pregnant patients, new-born with suspicion on congenital toxoplasmosis and in the patients with immunosupression.

Key words: DNA Toxoplasma gondii; Polymerase chain reaction; Toxoplasmosis; Amniotic fluid

Souhrn: Od zavedení metody polymerázové řetězové reakce na průkaz DNA Toxoplasma gondii v roce 2000 bylo do konce roku 2003 vyšetřeno 398 biologických vzorků od 301 pacientů. Pozitivní nález toxoplazmové DNA jsme zaznamenali ve 23 případech. Polymerázová řetězová reakce umožňuje přesnou a rychlou diagnostiku aktuální parazitemie Toxoplasma gondii, která má význam zejména u gravidních pacientek, novorozenců s podezřením na kongenitální toxoplazmózu a u pacientů s imunosupresí.

Úvod Infekce parazitickým prvokem Toxoplasma gondii je ve světě jednou z nejčastěji se vyskytujících parazitárních nákaz, například ve Velké Británii se udává promořenost 20–40 %, ve Francii 80–90 % (32). Výsledky sérologických vyšetření naznačují, že i v České republice se více než polovina naší populace setkala s antigeny T. gondii. Většina infekcí člověka (80–90 %) proběhne jako asymptomatický proces nebo pod obrazem nespecifických klinických příznaků (zduření lymfatických uzlin v oblasti šíje, horečka, bolesti hlavy, svalů, zvýšená únava). Výjimečně se u imunokompetentních jedinců projeví výrazné symptomy, například generalizovaná lymfadenopatie, makulo-papulózní exantém, hepatitida, encefalitida, popřípadě myokarditida a další. Závažné jsou zejména infekce plodu získané in utero, oční formy toxoplazmózy (30) a infekce imunokompromitovaných jedinců (23,32). V laboratorní parazitologické diagnostice se k potvrzení nebo vyloučení infekce prvokem T. gondii využívají v současné době nejčastěji metody průkazu protilátek v séru. K dispozici jsou komerčně vyráběné sérologické testy: reakce vazby komplementu, metody enzymové imunoanalýzy pro průkaz markerů akutní infekce ve třídách IgM, IgA, IgE a průkaz protilátek ve třídě IgG (popř. pro stanovení jejich vaznosti – avidity) (7,26). Metody přímého průkazu původce založené na infekci vnímavého laboratorního zvířete (bílé laboratorní myši) ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):71–73

nebo infekce tkáňové kultury jsou časově i metodicky náročné a výsledek získáme teprve za několik dnů až týdnů. Z těchto důvodů jsme proto v roce 2000 přistoupili k zavedení metody polymerázové řetězové reakce (PCR) k průkazu DNA Toxoplasma gondii z klinického materiálu od pacientů (15). Průkaz, resp. vyloučení přítomnosti DNA prvoka v organismu hostitele a tím průkaz stávající parazitemie, je důležitý především pro některé kategorie pacientů: gravidní ženy (9,27), imunokompromitovaní jedinci, novorozenci matek, které prodělaly infekci v těhotenství (19,22), a pacienti s významnými klinickými příznaky. Pro získání validního laboratorního výsledku je zapotřebí dodržovat důležité zásady při odběru a zasílání materiálu.

Materiál a metody 1. Materiál vhodný pro průkaz DNA T. gondii metodou PCR odebíráme dle předpokládaného stadia onemocnění a kategorie pacienta (gravidní žena, oční toxoplazmóza, jaterní léze atd.). 1.1 Krev (nesrážlivá) – s přídavkem ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) popř. citrátu sodného, alespoň 5 ml krve (6). 1.2 Fetální krev – EDTA, citrát, v množství, které lze odebrat. 1.3 Plodová voda (16) – v množství alespoň 10 ml, bez konzervačních přísad. 71

1.4 Likvor (25) – 1–2 ml i více. 1.5 Pupečníková krev (12) – EDTA, citrát, v množství, které lze získat. 1.6 Kostní dřeň (4,7), kmenové buňky k transplantaci (4), biopsie (játra, lymfatické uzliny). 1.7 Oční tekutina. 1.8 Další druhy tělesných tkání a biologických vzorků. Materiál odebíráme v doporučeném množství (krev, plodová voda) nebo alespoň v takovém množství, které lze bez komplikací odebrat (likvor, oční tekutina, biopsie a další materiály). Pro potvrzení diagnózy lze vyšetřit i materiál z plodů po abortu, popř. sekční materiály. Vzorky pro vyšetření metodou PCR nezmrazujeme ani nekonzervujeme, uchováme v chladničce, a pokud možno neprodleně (do 24 hodin) doručíme do laboratoře (1). 2. Metody Metoda průkazu DNA prvoka Toxoplasma gondii byla vypracována jako vlastní modifikace PCR metod (6,11,13, 14,20,21,24,29,31) a byla zavedena do rutinního provozu v roce 2000 ve společné laboratoři molekulárně biologických metod Ústavu klinické mikrobiologie a Ústavu klinické biochemie a diagnostiky Fakultní nemocnice v Hradci Králové. Vzhledem ke skutečnosti, že v současné době je naše pracoviště jediné v ČR, které provádí průkaz DNA T. gondii z klinického materiálu, obsahuje vyšetřený soubor biologické vzorky z celého území našeho státu. 2.1 Izolace DNA Toxoplasma gondii z tekutých materiálů (33): komerčním kitem firmy QIAGEN (QIAampDNA Mini Kit). 2.1.1 Izolace DNA ze tkáně: fenol-chloroformová extrakce. 2.2 Amplifikace izolované DNA je prováděna paralelně ze dvou oblastí genomu T. gondii. 2.2.1 Oblast genu B1: opakuje se v genomu T. gondii 35x, metoda amplifikace je postavena jako nested PCR (29) a dosahuje analytické citlivosti, tzv. meze detekce 5–10 organismů v 1 ml (5). Produkt o velikosti 362 bp je detekován vizualizací v 2% agarózovém gelu barveném ethidium bromidem. 2.2.2 Oblast genu TGR1E: opakuje se v genomu T. gondii 30–35x, metoda je standardní PCR s mezí detekce 1–10 organismů v 1 ml. Produkt o velikosti 191 bp je detekován v 3% agarózovém gelu při barvení ethidium bromidem. 2.3 Kontrola metody: 2.3.1 negativní kontrola = prevence falešně pozitivních výsledků, zkumavky s vodou, které se zpracovávají stejně jako vzorek izolované DNA. 2.3.2 pozitivní kontrola = DNA připravená izolací z asi 100 tachyzoitů (vegetativní forma T. gondii). 2.3.3 kontrola meze detekce (citlivosti) metody = DNA připravená izolací z 1–10 tachyzoitů (5). 2.3.4 inhibiční zkouška (kontrola nepřítomnosti inhibitorů PCR reakce) = koamplifikace části humánního genu pro beta globin. 72

Výsledky V období od 1.5.2000 do 19.12.2003 bylo metodou PCR vyšetřeno na přítomnost DNA Toxoplasma gondii 398 vzorků klinických materiálů od 301 pacientů nejen z Fakultní nemocnice v Hradci Králové, ale i z různých pracovišť z celé České republiky. Z celkového počtu vyšetřených vzorků jsme nalezli DNA T. gondii v 5,78 %. Krev byla pozitivní v 4,61 %, plodová voda v 4,63 %. Vzorky plodové vody a krve současně, od gravidních žen (k vyloučení aktivní toxoplazmózy v těhotenství), jsme obdrželi v 53 případech. Pozitivní průkaz DNA Toxoplasma gondii v krvi i v plodové vodě byl zjištěn jedenkrát, u 3 žen byla pozitivní pouze krev a ve 3 případech jenom plodová voda. V ostatních 46 dvojicích vzorků krve a plodové vody v této skupině nebyla DNA T. gondii prokázána. Od 55 gravidních žen nám byl zaslán k vyšetření jenom vzorek plodové vody bez paralelního vzorku krve. Detekce DNA T. gondii v této skupině byla pozitivní jednou. Ve vzorcích kmenových buněk od imunosuprimovaných pacientů (před transplantací kmenových buněk) s klinickými příznaky toxoplazmózy jsme v obou případech detekovali DNA T. gondii (4). Tab.: Přehled vzorků biologického materiálu vyšetřených metodou PCR (detekce DNA Toxoplasma gondii). Materiál Krev Likvor PV KB Játra lymf. uzlina fetální krev Sklivec DNA izol. Výpotek Celkem

260 14 108 2 2 1 5 1 3 2 398

PCR + PCR + PCR + PCR + části genů části genů části genů celkem B1,TGR1E B1 TGR1E 6 1 5 12 0 0 0 0 3 0 2 5 1 1 0 2 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 12 2 9 23

Diskuse a závěr Správná aplikace molekulárních biologických metod v diagnostice toxoplazmových infekcí je důležitá především v časném stadiu gravidity, u novorozenců s podezřením na kongenitální toxoplazmózu a u imunosuprimovaných osob (8). Vyšetření krve a plodové vody jsou indikována zejména v případech gravidních žen s pozitivními sérologickými markery (2,3,6) akutní infekce (protilátky ve třídách IgM, IgE a IgA). Po zavedení detekce DNA T. gondii z plodové vody bylo možno snížit na minimum kordocentézu pro vyšetření protilátek z pupečníkové krve. Metoda je vhodná

rovněž v případech vyšetření mozkomíšního moku u novorozenců při podezření na kongenitální toxoplazmózu. Polymerázová řetězová reakce je nezastupitelná také pro detekci DNA T. gondii v séru a mozkomíšním moku u symptomatických pacientů v hlubokém stupni defektu buněčné imunity k vyloučení mozkové toxoplazmózy, kdy vyšetření protilátek nemá příliš velký praktický význam. Pozitivita či negativita výsledku PCR usnadňuje rozhodování o volbě specifické terapie (10). V případě pozitivní detekce DNA parazita podáváme vybraným skupinám pacientů sulfadiazin a pyrimethamin, při negativním výsledku volíme spíše zajišťovací terapii spiramicinem. Vzhledem k výsledkům dosaženým při laboratorním vyšetření doporučujeme odebírat u gravidních žen s pozitivními sérologickými markery akutní infekce nejen plodovou vodu, ale současně i vzorek nesrážlivé žilní krve (EDTA, citrát – zásadně nepoužívat heparin). I v případě negativního výsledku průkazu DNA T. gondii v plodové vodě může přetrvávat parazitemie v organismu matky. Bez specifické terapie matky (na základě negativního výsledku PCR v plodové vodě) by mohl nastat i v pozdějším období gravidity transplacentární prostup tachyzoitů T. gondii a ohrožení zdraví plodu toxoplazmózou (17). Je známo, že riziko transplacentární infekce plodu stoupá s pokročilostí gravidity. V zájmu pacientů je třeba, aby odběr vzorků byl proveden pokud možno před zahájením antibiotické terapie, nejdéle však do 2–3 dnů (18). Po podání účinných antibiotik dochází zpravidla k rychlé eliminaci parazita a k degradaci DNA, takže výsledek PCR může být falešně negativní. Důležité je, aby materiál odebraný od pacientů byl co nejrychleji dopraven k vyšetření (nejlépe do 24 hodin), neboť vlivem biochemických změn v biologických vzorcích dochází k poškození DNA a výsledek není spolehlivý. Při dodržení podmínek indikace vyšetření, odběru a transportu vzorků poskytuje metoda PCR pro detekci DNA Toxoplasma gondii vysoce senzitivní a specifické výsledky (3, 28).

Literatura 1. Alanen A. Polymerase Chain Reaction in the Detection of Microbes in Amniotic Fluid. Ann Med 1998;30:288–95. 2. Awady MK, Hosseiny LA, Ismail SM, Abdel-Aziz MT, Demellaway MA. Comparison between Toxoplasma gondii DNA and specific immunoglobulins during pregnancy. East Mediterr Health J 2000;6:888–97. 3. Bastien P. Molecular diagnosis of toxoplasmosis. Transactions of the Royal society of Tropical medicine and hygiene 2002;96(Suppl 1):205–15. 4. Bretagne S, Costa JM, Kuentz M, et al. Late toxoplasmosis evidenced by PCR in a marrow transplant recipient. Bone Marrow Transplant 1995;15:809–11. 5. Burg LJ, Grover MCH, Pouletty P, Boothroyd JC. Direct and Sensitive Detection of a Pathogenic Protozoan, Toxoplasma gondii, by Polymerase Chain Reaction. J Clin Microbiol 1989;27:1787–92. 6. Cazenave J, Forestier F, Bessieres MH, Broussin B, Begueret J. Contribution of a New PCR Assay to the Prenatal Diagnosis of Congenital Toxoplasmosis. Prenat Diagn 1992;12:119–27. 7. Dupouy-Camet J, Bougnoux ME, Lavareda de Souza S et al. Comparative value of polymerase chain reaction and conventional biological tests for the prenatal diagnosis of congenital toxoplasmosis. Ann Biol Clin 1992;50:315–9. 8. Dupouy-Camet J, Lavareda de Souza S, Maslo C, Paugam A, Saimot AG. Detection of Toxoplasma gondii in Venous Blood from AIDS Patients by Polymerase Chain Reaction. J Clin Microbiol 1993;31(7):1866–9. 9. Foulon W, Naessens A, Derde MP. Evaluation of the possibilities for preventing congenital toxoplasmosis. Am J Perinatol 1994;11:57–62.

10. Foulon W, Villena T, Stray-Pedersen B et al. Treatment of toxoplasmosis during pregnancy: A multicenter study of impact on fetal transmission and children’s sequelae at age 1 year. Am J Obstet Gynecol 1999;180:410–5. 11. Franzen C, Altfeld M, Hegener P et al. Limited Value of PCR for Detection of Toxoplasma gondii in Blood from Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients. J Clin Microbiol 1997;35(10):2639–41. 12. Gratzl R, Hayde M, Kohlhauser C, Hermon M, Burda G. Follow-Up of Infants with Congenital Toxoplasmosis Detected by Polymerase Chain Reaction Analysis of Amniotic Fluid. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1998;17:853–8. 13. Gross U, Roggenkamp A, Janitschke K, Heesemann J. Improved Sensitivity of the Polymerase Chain Reaction for Detection of Toxoplasma gondii in Biological and Human Clinical Specimens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1992;11(1): 33–9. 14. Guay JM, Dubois D, Morency MJ, Gagnon S, Mercier J. Detection of the Pathogenic Toxoplasma gondii by Specific Amplification of Ribosomal Sequences Using Comultiplex polymerase Chain Reaction. J Clin Microbiol 1993;31(2):203–7. 15. Guy EC, Joynson DHM. Potential of the Polymerase Chain Reaction in the Diagnosis of Active Toxoplasma Infection by Detection of Parasite in Blood. J Infect Dis 1995;172:319–22. 16. Guy EC, Pelloux H, Lappalainen M, Aspöck H, Hassl A. Interlaboratory Comparison of Polymerase Chain Reaction for the Detection of Toxoplasma gondii DNA Added to Samples of Amniotic Fluid. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1996;15:836–9. 17. Hohlfeld P, Daffos F, Costa JM et al. Prenatal Diagnosis of Congenital Toxoplasmosis with a Polymerase-chain-reaction Test on Amniotic Fluid. N Eng J Med 1994;331(11):695–9. 18. Ho-Yen DO, Joss AWL, Balfour AH, Smyth ETM, Baird D. Use of the polymerase chain reaction to detect Toxoplasma gondii in human blood samples. J Clin Pathol 1992;45:910–3. 19. Jenum PA, Holberg-Petersen M, Melby KK, Stray-Pedersen B. Diagnosis of congenital Toxoplasma gondii infection by polymerase chain reaction (PCR) on amniotic fluid samples. APMIS 1998;106:680–6. 20. Jenum PA, Stray-Pedersen B, Melby KK et al. Incidence of Toxoplasma gondii Infection in 35 940 Pregnant Women in Norway and Pregnancy Outcome for Infected Women. J Clin Microbiol 1998;36(10):2900–6. 21. Joss AWL, Chatterton JMW, Evans R, Ho-Yen DO. Toxoplasma polymerase chain rection on experimental blood samples. J Med Microbiol 1993;38:38–43. 22. Jungersen G, Bille-Hansen V, Jensen L, Lind P. Transplacental transmission of Toxoplasma gondii in minipigs infected with strains of different virulence. J Parasitol 2001;87:108–13. 23. Khalifa KS, Roth A, Roth B, Arasteh KN, Janitschke K. Value of PCR for Evaluating Occurence of Parasitemia in Immunocompromised Patients with Cerebral and Extracerebral Toxoplasmosis. J Clin Microbiol 1994;32(11):2813–9. 24. Lamoril J, Molina JM, Gouvello A, Garin YJ, Deybach JC. Detection by PCR of Toxoplasma gondii in blood in the diagnosis of cerebral toxoplasmosis in patients with AIDS. J Clin Pathol 1996;49:89–92. 25. Lebech M. Detection of Toxoplasma gondii DNA by Polymerase Chain Reaction in Cerebrospinal Fluid from AIDS Patients with Cerebral Toxoplasmosis. J Infect Dis 1992;65:982–3. 26. Montoya JG. Laboratory Diagnosis of Toxoplasma gondii Infection and Toxoplasmosis. J Inf Dis 2002;185(S1):73–82. 27. Palička P, Slabá H, Zitek K. Aktivní ovlivňování výskytu kongenitální toxoplasmózy v populaci. Prakt Gynekol 1998;5(1):23–7. 28. Pelloux H, Guy E, Angelici MC et al. A second European collaborative study on polymerase chain reaction for Toxoplasma gondii involving 15 teams. FEMS Microbiol Lett 1998;165:231–7. 29. Pujol-Riqué M, Derouin F, García-Quintanilla A, Valls ME, Miró JM, Jimenéz de Anta MT. Design of a one-tube hemi-nested PCR for detection of Toxoplasma gondii and comparison of three DNA purification methods. J Med Microbiol 1999;48:857–62. 30. Roberts F, McLeod R. Pathogenesis of Toxoplasmic Retinochoroiditis. Parasitol Today 1999;15(2):51–7. 31. Rodríguez JC, Martínez MM, Martínez AR, Royo G. Evaluation of Different Techniques in the Diagnosis of Toxoplasma encephalitis. J Med Microbiol 1997;46:597–601. 32. Savva D, Morris JC, Johnson JD, Holliman RE. Polymerase Chain Reaction for Detection of Toxoplasma gondii. J Med Microbiol 1990;32:25–31. 33. Ven VE, Melchers W, Galama J, Camps W, Meuwissen J. Identification of Toxoplasma gondii Infections by B1 gene Amplification. J Clin Microbiol 1991; 29:2120–4

MVDr. Zuzana Čermáková, Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Ústav klinické mikrobiologie, Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové. e-mail: [email protected] 73

74

ÚČINKY POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ NA KOSTNÍ DŘEŇ Monika Hrudková1, Zdeněk Fiala2, Lenka Borská1, Jakub Novosad3, Lukáš Smolej4 Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové: Ústav patologické fyziologie1, Ústav hygieny a preventivního lékařství2, Ústav klinické imunologie a alergologie3; Fakultní nemocnice v Hradci Králové: II. interní klinika4 Summary: The effect of Polycyclic aromatic hydrocarbons to bone marrow. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) represent a group of ubiquitous environmental pollutants. Their toxic effects are demonstrated mainly in tissues with high proliferation. The direct distribution of PAH in non-metabolized form to bone marrow and their biotransformation at this site to the toxic metabolites is necessary for demonstration of their toxic effect here. CYP1B1 that is constitutive expressed by stromal cells plays probably the main role in biotransformation of PAH in bone marrow. Reactions of toxic metabolites, development of oxidative stress and interference with intracellular calcium are ranged between the most important mechanisms of structural and functional changes of bone marrow after exposure to PAH. Pathological induction of apoptosis and malignant transformation of stem cells represent the concrete forms of bone marrow damage, caused by exposure to PAH. The bone marrow constitutes the central organ of hematopoiesis and the sites of production of cells of immune system. Its damage can bring therefore crucial health consequences for the whole organism.

Key words: Polycyclic aromatic hydrocarbons; Bone marrow; Cytochrome 1B1; Genotoxicity; Leukaemia

Souhrn: Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) představují všudypřítomné environmentální polutanty. Jejich toxické účinky se projevují především ve tkáních s vysokou proliferací. Pro projev toxických účinků PAU na kostní dřeň je nezbytné, aby byly do kostní dřeně distribuovány ve své primární podobě a teprve zde biotransformovány na toxické metabolity. Klíčovou úlohu při biotransformaci PAU v kostní dřeni má pravděpodobně CYP1B1, který je konstitutivně exprimován stromálními buňkami. Mezi nejdůležitější mechanismy změn struktury a funkce buněk kostní dřeně (po expozici PAU) řadíme reakce toxických metabolitů, rozvoj oxidativního stresu a ovlivnění hladin nitrobuněčného vápníku. Konkrétní forma poškození kostní dřeně expozicí PAU může mít podobu patologické indukce apoptózy nebo maligní transformace kmenových buněk. Kostní dřeň je ústředním orgánem krvetvorby a místem produkce buněk imunitního systému. Její poškození může mít proto zásadní zdravotní význam pro organismus jako celek.

1. Expozice polycyklickým aromatickým uhlovodíkům Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) jsou látky v životním prostředí všudypřítomné a lze je nalézt v ovzduší, půdě, vodě i v potravinách. Představují heterogenní skupinu chemických sloučenin, vznikajících při nedokonalém spalování organické matrice jako je dřevo, uhlí, tabák, ropné produkty, organické odpady a řada dalších materiálů (15). Do organismu PAU vstupují převážně cestou inhalační a orální, méně pak cestou dermální. K významným pracovním expozicím (především inhalačním) dochází při těžbě, zpracování a využívání fosilních paliv a rud, tj. v průmyslu ropném, hutním a strojírenském. Hlavní mimopracovní expozice probíhají ve formě inhalace kontaminovaného ovzduší a příjmu kontaminovaných potravin (52). ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):75–81

2. Absorpce a distribuce PAU Nejvýznamnějšími cestami vstupu PAU do organismu jsou sliznice respiračního a gastrointestinálního traktu. PAU snadno přestupují přes fosfolipidové membrány buněk sliznic bez spoluúčasti aktivních přenašečů. Po vstupu do systémové cirkulace jsou PAU poměrně rychle distribuovány a biotransformovány. V důsledku lipofilního charakteru mohou však být rovněž deponovány v tukové tkáni, což má za následek zpomalení biotransformačního procesu a prodloužení jejich toxického působení v organismu (16,27,52).

3. Biotransformace a eliminace PAU Biotransformace PAU probíhá ve dvou na sebe navazujících fázích. V první fázi dochází velmi často k bioaktivaci základních struktur na aktivní metabolity, jež jsou ve větši75

ně případů zodpovědné za nepříznivé biologické účinky PAU. Výsledkem druhé fáze jsou ve vodě rozpustné konjugáty, které jsou z organismu poměrně rychle eliminovány močí a stolicí (16,27). Hlavními reakcemi první biotransformační fáze PAU jsou oxidace. Probíhají za účasti monooxygenázového enzymatického systému závislého na cytochromu P450 (CYP450). Významnou úlohu v metabolismu PAU má rodina CYP1A, zejména izoenzymy CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1. U izoenzymů rozlišujeme expresi bazální (konstitutivní) a indukovanou (inducibilní) (27). CYP1A1 je exprimován nejen v játrech, ale i v řadě extrahepatálních tkání jako jsou plíce, placenta a buňky periferní krve. Konstitutivní exprese CYP1A1 je nízká a k jejímu zvýšení dochází až po indukci za účasti AhR (Aryl Hydrocarbon Receptor) (8). CYP1A2 je rovněž exprimován v játrech, avšak v podstatně větším množství než CYP1A1. Nenalézá se extrahepatálně. K indukci dochází, podobně jako u CYP1A1, prostřednictvím AhR (52). Ke zvýšení indukované exprese CYP1A2 postačuje menší množství induktoru, avšak je nezbytný vliv jaterního mikroprostředí (27). Zdá se, že v metabolismu PAU hraje CYP1A2, v porovnání s CYP1A1, méně významnou úlohu (25). CYP1B1 je nedávno popsaný izoenzym, jež byl poprvé identifikován v myších embryonálních fibroblastech a v krysích nadledvinkách. Následně byla zjištěna jeho konstitutivní exprese i v ovariích, varlatech, prsní žláze, děloze, prostatě a ve stromálních buňkách kostní dřeně. Jaterní, ledvinná a plicní exprese CYP1B1 je velmi nízká (24,25). Vysoká konstitutivní exprese CYP1B1 byla naproti tomu nalezena ve stromálních buňkách kostní dřeně (23). Izoenzymy CYP450 vykazují značný genetický polymorfismus, který dramaticky mění jejich schopnost metabolizovat jednotlivé PAU. Existence genetického polymorfismu ovlivňuje individuální vnímavost osob vůči PAU, a tím i míru zdravotních rizik souvisejících s jejich účinky (52). Majoritními produkty první biotransformační fáze PAU jsou nestabilní primární epoxidy (arenoxidy). Arenoxidy mohou být konjugovány s glutationem a vylučovány z organismu nebo jsou hydratovány epoxid-hydratázou na odpovídající fenoly a dihydrodioly (16,52). Dihydrodioly mohou dále podléhat oxidaci na dihydrodiol-epoxidy. Vysoká biologická aktivita dihydrodiol-epoxidů má základ v jejich spontánní konverzi na reaktivní karboniové ionty, které jsou schopny tvořit kovalentní vazby s nukleofilními centry DNA a proteinů a vytvářet s nimi DNA addukty či proteinové addukty. Vznikem adduktů dochází k poškození struktury i funkce cílových biomolekul a následně k alteraci buněčných funkcí (16,27,52). Jako vedlejší produkt výše zmíněných oxidačních reakcí vznikají též vysoce reaktivní volné kyslíkové radikály zodpovědné za rozvoj oxidativního stresu (37).

4. Mechanismus indukce CYP450 Jednou ze základních charakteristik CYP450 je indukovatelnost, která zásadně mění jejich metabolickou kapacitu 76

po opakované expozici některým chemickým látkám. Indukční zvýšení exprese příslušných izoenzymů má za následek nárůst hladin reaktivních metabolitů bioaktivovaných chemických látek a tím i nárůst zdravotního rizika expozice. PAU patří mezi látky, které mají schopnost indukovat expresi izoenzymů CYP450, zejména CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1. Indukce izoenzymů probíhají s rozdílnou intenzitou v závislosti na AhR. AhR je cytoplazmatický receptor a transkripční faktor, který je aktivován mnohými ligandy včetně PAU (52). Ligandem s největší afinitou k AhR je TCDD (2,3,7,8–tetrachlorodibenzo-p-dioxin). Z tohoto důvodu bývá AhR někdy označován jako „dioxin receptor“ (27). AhR se řadí do rodiny proteinů/transkripčních faktorů Per/ARNT/Sim. V klidové fázi je asociován se stresovým proteinem Hsp90 a s molekulou ARA9/XAP-2 (hepatitis B virus X-associated protein 2) (37). Vazba disociuje při navázání ligandu a poté je aktivovaný AhR translokován do jádra za spoluúčasti transportéru ARNT (Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator), se kterým AhR formuje heterodimerní komplex. Cílovou strukturou tohoto komplexu jsou krátké regulační úseky DNA, známé jako DRE (Dioxin Response Elements) neboli XRE (Xenobiotic Response Elements). Touto vazbou je zahájena transkripce příslušných genů následovaná proteosyntézou (19,27). DRE sekvence regulují skupinu genů označovanou jako AhR-genová baterie. Ta je tvořena minimálně šesti geny kódujícími expresi enzymů více či méně souvisejících s metabolismem PAU. Jedná se zejména o CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 a dále o glutationS-transferázu, UDP-glukuronyl transferázu a aldehyd-dehydrogenázu (24,37).

5. Účinky PAU Účinky PAU na cílové tkáně jsou výsledkem působení reaktivních metabolitů vznikajících v průběhu biotransformace. K nejohroženějším tkáním z hlediska toxických účinků PAU patří tkáně s vysokým stupněm proliferace. Účinky je možno rozdělovat na účinky orgánově specifické a účinky orgánově nespecifické (16). Mezi orgánově specifické účinky PAU řadíme poškození respiračního, zažívacího a vylučovacího traktu, poškození kůže a poškození hematopoetického, imunitního a endokrinního systému. Rozsah poškození uvedených tkání je závislý na úrovni a době trvání expozice PAU, na aktivitě enzymatických systémů zprostředkujících bioaktivaci PAU a na úrovni reparačních mechanismů napadených tkání (16,27). Mezi orgánově nespecifické účinky PAU řadíme účinky genotoxické, mutagenní a karcinogenní. Genotoxické účinky jsou obecně charakterizovány jako poškození struktury DNA. Konkrétními projevy tohoto poškození jsou genové mutace, chromozomální aberace, zlomy jednořetězcové DNA, výměna sesterských chromatid, neplánovaná syntéza DNA a tvorba adduktů jaderné a mitochondriální DNA. Molekula jaderné DNA je z hlediska funkcí buňky a buněčných pochodů ústřední molekulou, jejíž alterace může vy-

ústit, v závislosti na rozsahu poškození a funkční úrovni reparačních mechanismů DNA, v buněčnou smrt či maligní transformaci (16,27,52). Mutace představuje bodové poškození molekuly DNA v místě strukturálního genu či regulační sekvence. Toto poškození může vyvolat produkci nefunkčního či chybně fungujícího transkriptu nebo poruchu regulace transkripce jiných genů (43). Některé PAU jsou velmi účinnými mutageny v důsledku afinity jejich elektrofilních metabolitů k molekule jaderné DNA. S mutagenním potenciálem PAU velmi úzce souvisí účinky karcinogenní (4,33). Karcinogeneze je charakterizována jako multifaktoriální, vícestupňový proces, jehož hlavním společným rysem je několikanásobná mutace nejméně dvou (spíše však čtyř) soustav genů, stěžejních pro život buňky. Konkrétně se jedná o postupně probíhající mutace v celulárních protoonkogenech a antionkogenech, které ovládají buněčnou proliferaci, o vícečetné změny v genech apoptotické kaskády a o vícečetné změny v genech reparačních mechanismů DNA (13,42).

6. Účinky PAU na kostní dřeň Kostní dřeň patří k orgánům s dynamickou obnovou buněčných populací a vysokou senzitivitou vůči působení PAU. Experimentálně bylo prokázáno, že buňky kostní dřeně jsou schopny biotransformovat PAU na řadu toxických metabolitů. Kostní dřeň jako ústřední orgán hematopoezy a tvorby buněk imunitního systému hraje v organismu nezastupitelnou úlohu. Její poškození expozicí PAU má proto velmi závažné důsledky pro celý organismus (23,25). PAU mohou v kostní dřeni indukovat široké spektrum poškození, která se laboratorně i klinicky manifestují velmi pestrou symptomatologií. Na základě výsledků experimentálních studií na zvířatech a na kulturách buněk kostní dřeně (i humánních) lze rozvoj nežádoucích hematologických účinků předpokládat i u exponované lidské populace. 6.1 Charakteristika kostní dřeně a význam stromálních buněk Kostní dřeň, jako největší krvetvorný systém, je možno rozdělit se na oddíl krvetvorný a oddíl cévní. Krvetvorná část se skládá z postupně vyzrávajících a diferencujících se kmenových buněk, jež jsou obklopeny buňkami stromatu. Stroma kostní dřeně však nepředstavuje pouze mechanickou podporu diferencujícím se kmenovým buňkám, ale vytváří zároveň i induktivní mikroprostředí pro krvetvorbu. Buňky stromatu aktivně secernují množství regulačních působků, jako například CSF-1, interleukiny (IL-7, IL-11), leukotrieny, prostaglandiny a monokiny, kterými stimulují hematopoezu (3,28,30). Kromě těchto uvedených funkcí stromálních buněk je jim připisována i ústřední role v metabolismu PAU v kostní dřeni (24). 6.2 Metabolismus PAU v kostní dřeni Důležitým předpokladem účinků PAU na buňky kostní dřeně je jejich metabolická aktivace přímo v kostní dřeni.

Zdá se, že důležitou roli v tomto procesu sehrává CYP1B1. Vysoké aktivity CYP1B1 byly nalezeny ve stromálních buňkách (25). Experimentální práce některých autorů prokázaly přítomnost PAU v kostní dřeni po dermální, intratracheální, perorální a intraperitoneální aplikaci (9,18,41, 57). Jako modelová struktura pro hodnocení toxických účinků PAU na kostní dřeň je často využíván 7,12–dimethylbenz[a]anthracen (DMBA), na jehož metabolismu se výrazně podílí CYP1B1 (8). 6.2.1 Exprese cytochromu CYP1B1 stromálními buňkami kostní dřeně Stromální buňky kostní dřeně konstitutivně exprimují velké množství CYP1B1, zatímco exprese dalších izoenzymů CYP450, důležitých pro bioaktivaci PAU, je zanedbatelná. V řadě experimentů s PAU „in vivo“ (DMBA) a „in vitro“ (benzo[a]pyren) byly v kostní dřeni identifikovány toxické metabolity příslušných PAU a zároveň zjištěny i objektivní známky poškození buněk kostní dřeně. Uvedená fakta vedou k závěru, že stromální buňky mohou aktivně metabolizovat PAU, pravděpodobně za majoritní účasti CYP1B1 (25,46,47). Tuto domněnku podporuje i fakt, že u myší linie postrádající CYP1B1, nebylo po podání PAU (DMBA) objektivní poškození kostní dřeně prokázáno (25). 6.2.2 Význam AhR pro metabolismus PAU v kostní dřeni Exprese CYP1B1 je indukovatelná prostřednictvím AhR, jehož přítomnost byla ve stromálních buňkách prokázána. Zdá se však, že za bioaktivaci PAU je ve velké míře zodpovědná již vysoká exprese konstitutivní. Stromální buňky pokusných „AhR-deficientních myší“ metabolizovaly kompletně podaný PAU. Navíc se zdá, že konstitutivní exprese CYP1B1 stromálními buňkami je na AhR prakticky nezávislá (23). Názoru, že k bioaktivaci PAU v kostní dřeni není třeba indukce CYP1B1 za spoluúčasti AhR, oponuje ustálené tvrzení, že účinky většiny PAU (včetně účinků karcinogenních) jsou primárně determinovány právě aktivitou AhR. Je nutno upřesnit, že posledně uvedené tvrzení platí pro PAU, jež jsou silnými ligandy AhR a jsou přednostně metabolizovány za účasti CYP1A1. Jak bylo uvedeno výše, bazální exprese CYP1A1 je zanedbatelná a zvyšuje se teprve po indukci za účasti AhR. Prototypem silného ligandu AhR je například benzo(a)pyren. Jeho bioaktivace za účasti CYP1A1 probíhá mimo kostní dřeň (zejména v játrech) a z tohoto důvodu nedosahují toxické metabolity PAU v kostní dřeni dostatečných koncentrací pro výraznější biologický účinek. Uvedenou úvahu potvrzují „in vivo“ studie, z jejichž výsledků vyplývá, že při orálním podání benzo(a)pyrenu a DMBA myším s vysokou afinitou AhR (a tím i výraznou indukcibilitou CYP1A1) není benzo(a) pyren pro buňky kostní dřeně zdaleka tak toxický jako DMBA, metabolizovaný majoritně CYP1B1. Výraznou toxicitu vůči buňkám kostní dřeně vykazoval benzo[a]pyren 77

pouze v případech, kdy byl v přímém kontaktu s kulturou buněk kostní dřeně (10,29,48). Výsledky další studie uvádějí, že poškození kostní dřeně je závažnější u myší s „nízkoafinním AhR“, kdy jaterní CYP1A1 je méně indukován, metabolizuje PAU v menší míře a ty jsou pak více distribuovány v primární podobě do cílových tkání včetně kostní dřeně (24,52).

Vápník sehrává v regulaci buněčných metabolických pochodů klíčovou roli jako druhý posel a podílí se na aktivaci enzymatických systémů. Toxické metabolity PAU ovlivňují nepříznivým způsobem homeostázu vápníku ve smyslu zvýšení jeho hladiny v buňce. Uvedený jev zvyšuje rizika deplece energetických zásob, dysfunkce mikrofilament a aktivace hydrolytických enzymů (27,36).

6.3 Molekulární mechanismy účinků PAU v kostní dřeni Mechanismy působení PAU na dělící se buňky kostní dřeně jsou rozmanité, mají však jednu společnou charakteristiku – dochází k alteraci struktury a funkce buňky. Mezi nejdůležitější řadíme vznik toxických metabolitů, rozvoj oxidativního stresu a ovlivnění hladin nitrobuněčného vápníku. Výše zmíněné mechanismy se navzájem úzce prolínají a ovlivňují. Při efektivním zapojením detoxifikačních a reparačních mechanismů může mít poškození zcela reverzibilní charakter, v opačném případě končí maligní transformací či smrtí buňky (36,37,49).

6.3.3 Metody detekce genotoxického poškození buněk kostní dřeně Pro objektivizaci genotoxického poškození buněk kostní dřeně metabolity PAU je využívána řada metod, včetně detekce adduktů na DNA, detekce poškození chromozómů a detekce mikrojader (14,40). Detekce mikrojader velmi citlivě vypovídá o chromozómovém poškození buňky. Zvýšená frekvence mikrojader v kostní dřeni po podání PAU byla experimentálně prokázána v řadě prací (18,21,32). Mikrojádra jsou chromozómové fragmenty či celé chromozómy, které se nestávají součástí dceřiných jader během dělení buňky, ale zůstávají od nich zřetelně odděleny. V buňce jsou detekovatelné až po kompletním rozdělení jádra (1,12). Pro průkaz genotoxického poškození jsou vlastní buňky kostní dřeně užívány téměř výhradně pouze v experimentech. V lékařské praxi je frekvence mikrojader zjišťována v buňkách periferní krve, a to v lymfocytech a erytrocytech (7,22,35,50). Nález mikrojader v kostní dřeni nesvědčí pouze o poškození kostní dřeně jako takové, ale podle výsledků mezinárodní studie „The Human MicroNucleus Project“ úzce koreluje s genotoxickým poškozením organismu jako celku. Uvedené závěry jsou založeny na faktu, že buňky kostní dřeně vykazují extrémní citlivost k působení genotoxických agens včetně PAU (13). Byla popsána přímá souvislost mezi frekvencí mikrojader v cílových orgánech nebo v buňkách kostní dřeně a rizikem vzniku nádorového bujení (12).

6.3.1 Toxické metabolity PAU v kostní dřeni Bioaktivací PAU ve stromálních buňkách vzniká řada toxických metabolitů (zejména diol-epoxidů), které působí na jednotlivá vývojová stadia hematopoetických kmenových buněk. Dominuje genotoxické poškození díky vysoké afinitě těchto metabolitů k DNA. Biochemickou podstatou poškození DNA je tvorba DNA-adduktů v důsledku přímé interakce DNA s elektrofilními karboniovými ionty (toxickými metabolity). Oblast DNA, jež je vznikem adduktu pozměněna, se stává inaktivní a jsou postiženy procesy její replikace a transkripce (40). Jakákoli změna ve struktuře DNA automaticky spouští kaskádu reparačních pochodů. Jejich kapacita je však limitovaná a při jejím překročení je již poškození DNA ireverzibilní. Nerovnováha mezi aktivitou poškozujících mechanismů a úrovní reparačních mechanismů DNA se poté projevuje vznikem chromozomových zlomů, delecí, translokací a inverzí. Je evidentní, že mechanismy reparace DNA jsou jedním ze stěžejních procesů obrany organismu vůči genotoxickým látkám, zejména u tkání s vysokou úrovní proliferace (27,43). 6.3.2 Oxidativní stres a porucha hladin nitrobuněčného vápníku Oxidativní stres a nerovnováhy hladin nitrobuněčného vápníku jsou dalšími molekulárními mechanismy poškození buňky v souvislosti s expozicí PAU. Oxidativní stres je definován jako poškození buňky či organismu volnými kyslíkovými radikály (ROS-Reactive Oxygen Species). Volné radikály jsou mimořádně reaktivní molekuly či molekulární fragmenty obsahující ve své valenční vrstvě nepárový elektron. Značné množství ROS vzniká v buňce jako vedlejší produkty při oxidaci substrátů prostřednictvím CYP450 (například PAU) a jejich zvýšená produkce může vyústit k degradaci celé řady endogenních struktur včetně DNA (37,38). 78

6.4 Biologické účinky vyvolané působením PAU na buňky kostní dřeně Vlivem uvedených molekulárních mechanismů dochází na buněčné úrovni k rozvoji rozmanitých, vzájemně propojených biologických účinků. Ke stěžejním nepochybně patří zástava buněčného cyklu, indukce apoptózy a maligní transformace buňky (24). 6.4.1 Zástava buněčného cyklu Buněčný cyklus je přísně regulovaný sled dějů zahrnující období od jednoho buněčného dělení k dalšímu za vzniku dvou identických dceřiných buněk (44). Na základě morfologických a biochemických charakteristik je rozdělen do několika základních fází – G0, G1, S, G2 a M fáze. Kontrola buněčného cyklu je pro každou buňku stěžejní záležitostí a její narušení může mít za následek transformaci normální buňky v buňku nádorovou, která nepodléhá regulačním mechanismům a je schopna nekontrolovaného růstu (42). Zástava buněčného cyklu umožňuje reparaci poškozené DNA. Je jedním z ochranných dějů, směřujících

k zachování integrity genomu buňky. Při poškození jaderné DNA dochází v buňce ke zvýšení aktivity proteinu p53. Hlavní funkcí tohoto proteinu je regulace transkripce genů zodpovědných za zástavu buněčného cyklu a apoptózu. Proteinem p53 je pozitivně transkripčně regulován také protein p21WAF1, který v buňce funguje jako blokátor cyklindependentních kináz, které jsou spolu s cykliny klíčovou skupinou proteinů v regulaci buněčného cyklu (42). V experimentech „in vitro“ bylo prokázáno, že PAU jsou schopny zastavit (převážně v S fázi) buněčný cyklus hematopoetických buněk kostní dřeně (6,45). Zdá se, že hlavním mechanismem zástavy buněčného cyklu je v tomto případě zvýšení aktivity proteinu p53 a p21WAF1 (5). Pokud je poškození DNA natolik rozsáhlé a závažné, že je překročena kapacita reparačních mechanismů, může být prostřednictvím proteinu p53 nastartována apoptóza. V opačném případě hrozí riziko maligní transformace. 6.4.2 Indukce apoptózy buněk kostní dřeně Apoptózu můžeme definovat jako konkrétní formu geneticky determinované buněčné smrti. Je nezastupitelným prostředkem k udržení tkáňové homeostázy, tj. optimálního počtu funkčních buněk. Bylo potvrzeno, že PAU indukují apoptózu buněk kostní dřeně, zejména pre-B lymfocytů (55). Pre-B lymfocyty jsou nezralé prekurzory B lymfocytů, charakterizované expresí povrchového receptoru preBcR. Vykazují poměrně jedinečné vlastnosti z hlediska jejich citlivosti vůči vnějším proapoptotickým signálům, což má svůj fyziologický význam v rámci vývoje specifické humorální imunity. Apoptóza indukovaná PAU je však dějem patologickým, negativně ovlivňujícím principy tkáňové homeostázy populace vyzrávajících B lymfocytů v kostní dřeni a představuje jeden z možných mechanismů imunosupresivního účinku PAU (23,31,38,55). Indukce apoptózy pre-B lymfocytů prostřednictvím PAU je závislá na přítomnosti a funkci stromálních dřeňových buněk. Rozhodující úlohu v nastartování apoptotické kaskády v pre-B lymfocytech má CYP1B1, konstitutivně exprimovaný právě ve stromálních buňkách. Aktivně metabolizuje PAU na řadu toxických metabolitů, které difundují z buněk stromatu do cytoplazmy hematopoetických buněk. Pre-B lymfocyty jsou k proapoptotickým signálům nejcitlivější a reprezentují zřejmě nejzranitelnější buněčnou populaci v kostní dřeni (24,25,38,55). Vedle toxických metabolitů PAU, které poškozují genom buňky (což vede ke zvýšené aktivitě proteinu p53 a k nastartování apoptózy), mají v indukci apoptózy nezanedbatelnou úlohu i volné kyslíkové radikály a zvýšené hladiny nitrobuněčného vápníku (36,37,38). Indukce apoptózy pre-B lymfocytů kostní dřeně je jedním z důležitých imunotoxických účinků PAU, vedoucích k supresi specifické humorální imunitní odpovědi. Podílí se spolu s jinými projevy imunotoxicity (snížení buněčnatosti thymu a sleziny) na zvýšení vnímavosti organismu vůči infekcím a nádorovému bujení (31,51,54). Opakovaně byla popsána přímá souvislost mezi imunosupresivními účinky PAU a karcinogenezí (16,23,53).

6.4.3 Leukemogenní účinek PAU Leukemogenní účinek PAU je bezesporu nejzávažnějším projevem toxického účinku na buňky kostní dřeně a opakovaně byl prokázán jak v pokusech „in vitro“, tak v pokusech „in vivo“ (25,34,39,49). Leukemie je nádorové onemocnění postihující primárně kostní dřeň; podstatou je maligní transformace kmenové buňky krvetvorby. Maligní transformace probíhá v souladu s teorií mnohastupňové karcinogeneze a jejím výsledkem je vznik patologického klonu nekontrolovaně se dělících buněk s poruchou vyzrávání a diferenciace (11). Principem malignizace kmenové buňky jsou genové alterace (mutace, amplifikace, rekombinace) způsobené v případě expozice PAU toxickými metabolity, vznikajícími za účasti CYP1B1. Úvahy o klíčové úloze CYP1B1 v leukemogenezi vyvolané PAU podporují výsledky experimentů „in vivo“, kdy u zvířat postrádajících tento izoenzym nebyl ani po opakovaném podání PAU výskyt leukemie pozorován (25). Má-li se buňka maligně transformovat, musí zmíněná alterace (např. mutace) postihnout geny přímo se účastnící regulace buněčného cyklu nebo apoptózy. Těmito geny jsou protoonkogeny a nádorové supresorové geny (antionkogeny). Protoonkogeny jsou strukturní buněčné geny, které se svými translačními produkty podílejí do značné míry na regulaci dělení buněk a jejich diferenciaci. Protoonkogeny změněné mutací se nazývají onkogeny. Antionkogeny naproti tomu svými proteiny proliferaci buněk potlačují a udržují buňku v klidovém stadiu G0 (2,43). Nově vzniklá genová alterace vede k získání selekční výhody takto pozměněné buňky. Selekční výhoda pro buňku představuje vymknutí se z regulačních mechanismů buněčného cyklu a diferenciace, získání „neomezeného a bezúčelného“ růstového potenciálu a neochotu odpovídat na proapoptotické stimuly. Tyto vlastnosti buňky jsou geneticky podmíněné a jsou vlastnostmi trvalými. Díky nim dochází k porušení rovnováhy mezi přírůstkem a zánikem nádorové masy (42,43). V leukemických buňkách, nalezených u laboratorních zvířat po expozici PAU, byla opakovaně prokázána specifická mutace protoonkogenu N-ras. PAU touto cestou vyvolávaly (ve většině případů) rozvoj erytroleukemie, patřící do skupiny AML (Akutní Myeloidní Leukemie). Obdobná mutace byla identifikována ve vysokém procentu i v lidských leukemických buňkách u pacientů s AML a MDS (Myelodysplastický Syndrom) (34,49). Produkt protoonkogenu N-ras (G-protein Ras) je přednostním přenašečem mitogenních signálů z receptorů růstových faktorů na cílové proteiny a touto cestou je schopen stimulovat dělení buňky. Aby mohl Ras-protein přenést růstový signál z receptoru do nitra buňky, musí být v aktivní GTP-vázané formě (jeho aktivita je ukončena hydrolýzou GTP). Za normálních růstových podmínek je v aktivní formě pouze malé procento Ras-proteinu. Pokud je však protoonkogen N-ras mutován, zůstává Ras-protein v trvale aktivní GTP-vázané formě a jeho neustálé působení na cílový protein navozuje onkogenní proces. Maligní buňka pak získává „neomezený“ proliferační potenciál (2,43). 79

PAU jsou pokládány za jednoho z etiologických činitelů v chemické karcinogenezi hematologických malignit včetně leukemie (3). Četné populační studie popisují vztah mezi expozicí cigaretovému kouři (jehož významnou součástí jsou i karcinogenní PAU) a leukemogenezí. Dokonce i u dětí, jejichž rodiče byli již prekoncepčně aktivní či pasivní kuřáci, byly nalezeny signifikantně zvýšené mutace v T lymfocytech pupečníkové krve a bylo pozorováno zvýšení incidence hematologických malignit (leukemií a lymfomů) (17,26).

7. Závěr Existují důkazy o tom, že PAU mohou poškozovat kostní dřeň. Pro jejich účinky je nezbytné, aby byly do kostní dřeně distribuovány ve své primární podobě a teprve zde metabolizovány na toxické produkty. Klíčovou úlohu v produkci toxických metabolitů v kostní dřeni má pravděpodobně CYP1B1, který je konstitutivně exprimován buňkami dřeňového stromatu. Mezi nejdůležitější mechanismy změn struktury a funkce buněk kostní dřeně (vlivem PAU) řadíme reakce toxických metabolitů, rozvoj oxidativního stresu a ovlivnění hladin nitrobuněčného vápníku. Konkrétní forma poškození kostní dřeně expozicí PAU může mít podobu patologické indukce apoptózy nebo maligní transformace kmenových buněk. Kostní dřeň je ústředním orgánem hematopoezy a místem produkce buněk imunitního systému. Její poškození může mít proto zásadní význam pro organismus jako celek. Z uvedených důvodů chceme podtrhnout význam dalšího výzkumu mechanismů účinků PAU na kostní dřeň, který by dále přiblížil zdravotní rizika této expozice a nastínil možnosti ochrany exponovaných osob.

Literatura 1. Abramsson-Zetterberg L, Grawé J, Zetterberg G. Erythropoiesis and the induction of micronuclei in mouse spleen determined by flow cytometry. Mutat Res 1997;394:17–28. 2. Alberts B, Bray D, Lewis J et al. Molecular biology of the cell – third edition. London: Garland publishing Inc., 1994:1250. 3. Anděl M, Gregor P, Horák J. Vnitřní lékařství, díl IIIb. Hematologie, první vydání. Praha: Galén, 2001:230. 4. Bartsch H. Studies on biomarkers in cancer etiology and prevention: a summary and challenge of 20 years of interdisciplinary research. Mutat Res 2000; 462:255–79. 5. Binková B, Giguere Y, Rössner P et al. The effect of dibenzo[a,l]pyrene and benzo[a]pyrene on human diploid lung fibroblasts: the induction of DNA adducts, expression of p53 and p21WAF1 proteins and cell cycle distribution. Mutat Res 2000;471:57–70. 6. Black KA, McFarland RD, Grisham JW et al. S-phase block and cell death in human lymphoblasts exposed to benzo[a]pyrene diol epoxide or N-acetoxy-2–acetylaminofluorene. Toxicol Appl Pharmacol 1989;97(3):463–72. 7. Bonassi S, Neri M, Lando C et al. Effect of smoking habit on the frequency of micronuclei in human lymphocytes: results from the Human MicroNucleus Projects. Mutat Res 2003;543(2):155–66. 8. Buters JTM, Sakai S, Richter T et al. Cytochrome P450 CYP1B1 determines susceptibility to 7,12–dimethylbenz[a]anthracene-induced lymphomas. Proc Natl Acad Sci 1999;96(5):1977–82. 9. De Flora S, D’Agostini F, Balansky R et al. Modulation of cigarette smoke-related end-points in mutagenesis and carcinogenesis. Mutat Res 2003;523–524: 237–52. 10. Dertinger SD, Nazarenko DA, Silverstone AE et al. Aryl hsydrocarbon receptor signaling plays a significant role in mediating benzo[a]pyrene- and cigarette smoke

80

condensate-induced cytogenetic damage in vivo. Carcinogenesis 2001;22(1): 171–7. 11. Eckschlager T, Průša R. Laboratorní vyšetření v onkologii. Praha: Triton, 2002: 254. 12. Fenech M, Holland N, Chang WP et al. The HUman MicroNucleus Project- An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutat Res 1999;428:271–83. 13. Fenech M. The in vitro micronucleus technique. Mutat Res 2000;455:81–95. 14. Fenech M. The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutat Res 1993;285(1):35–44. 15. Fiala Z, Vyskočil A, Krajak V et al. Polycyklické aromatické uhlovodíky I. Kontaminace prostředí a expozice osob. Acta Med (Hradec Králové) Suppl 1999;42(2):77–89. 16. Fiala Z, Borská L, Vyskočil A et al. Polycyklické aromatické uhlovodíky II. Toxické účinky. Acta Med (Hradec Králové) Suppl 2000;43(3):37–61. 17. Finette BA, O‘Neill JP, Vacek PM et al. Gene mutations with characteristic deletions in cord blood T lymphocytes associated with passive maternal exposure to tobacco smoke. Nat Med 1998;4(10):1144–51. 18. Glatt H, Seidel A, Oesch F et al. Fjord-region diol-epoxides of benzo[c]chrysene are potent inducers of micronuclei in murine bone marrow. Mutat Res 1994; 309(1):37–43. 19. Hankinson O. The aryl hydrocarbon receptor complex. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1995;35:307–40. 20. Haugen A. Cancer susceptibility genes and molecular epidemiology. Lung Cancer 1997;18(2):71–2. 21. Hayashi M, Sofuni T, Ishidate M Jr. Kinetics of micronucleus formation in relation to chromosomal aberrations in mouse bone marrow. Mutat Res 1984; 127(2):129–137. 22. Hayashi M, Norppa H, Sofuni T et al. Mouse bone marrow micronucleus test using flow cytometry. Mutagenesis 1992;7(4):251–6. 23. Heidel SM, Czuprynski CJ, Jefcoate CR. Bone Marrow Stromal Cells Constitutively Express High Levels of Cytochrome P4501B1 that Metabolize 7,12–Dimethylbenz[a]anthracene. Mol Pharmacol 1998;54:1000–6. 24. Heidel SM, Holston K, Buters JT et al. Bone Marrow Stromal Cell Cytochrome P4501B1 Is Required for Pre-B Bell Apoptosis Induced by 7,12–Dimethylbenz[a]anthracene. Mol Pharmacol 1999;56:1317–23. 25. Heidel SM, MacWilliams PS, Baird WM et al. Cytochrome P4501B1 Mediates Induction of Bone Marrow Cytotoxicity and Preleukemia Cells in Mice Treated with 7,12–Dimethylbenz[a]anthracene. Cancer Res 2000;60:3454–60. 26. Ji BT, Shu XO, Linet MS et al. Paternal cigarette smoking and the risk of childhood cancer among offspring of nonsmoking mothers. J Natl Cancer Inst 1997;89:238–44. 27. Klaasen CD. Casarett and Doull’sToxicology – The Basic Science of Poisons. Fifth edition. London: McGrow-Hill Companies, Inc., 1996:1360. 28. Klener P. Vnitřní lékařství. Praha: Galén, 1999:949. 29. Legraverend C, Harrison DE, Ruscetti FW et al. Bone marrow toxicity induced by oral benzo[a]pyrene: protection resides at the level of the intestine and liver. Toxicol Appl Pharmacol 1983;70(3):390–401. 30. Lu L, Osmond DG. Apoptosis and its modulation during B lymphopoiesis in mouse bone marrow. Immunol Rev 2000;175:158–74. 31. Mann KK, Matulka RA, Hahn ME et al. The role of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in dimethylbenz[a]anthracene-induced pre-B lymphocyte apoptosis. Toxicol Appl Pharmacol 1999;161:10–22. 32. Martelli A, Campart GB, Benvenuto F et al. Comparison of micronucleus formation in mouse bone marrow and spleen. Mutat Res 1993;292(1):63–7. 33. Mastrangelo G, Fadda E, Marzia V. Polycyclic aromatic hydrocarbons and cancer in man. Environ Health Perspect 1996;104(11):1166–70. 34. McCord A, Boyle SP, Knowler JT et al. Metabolism of benz[a]anthracene by human bone marrow in vitro. Chem Biol Interact 1996;99:29–40. 35. Moore FR, Urda GA, Krishna G et al. An in vivo/in vitro method for assessing micronucleus and chromosome aberration induction in rat bone marrow and spleen. 1. Studies with cyclophosphamide. Mutat Res 1995;335(2):191–9. 36. Nebert DW, Puga A, Vasiliou V. Role of the Ah receptor and the dioxin-inducible [Ah] gene battery in toxicity, cancer and signal transduction. An NY Acad Sci 1993;685:624–40. 37. Nebert DW, Roe AL, Dieter MZ et al. Role of the Aromatic Hydrocarbon Receptor and [Ah] Gene battery in the Oxidative Stress Response, Cell Cycle Control, and Apoptosis. Biochem Pharmacol 2000;59:65–85. 38. Novosad J, Fiala Z, Borská L et al. Immunosuppressive effect of polycyclic aromatic hydrocarbons by induction of apoptosis of pre-B-lymphocytes of bone marrow. Acta Med (Hradec Králové) 2002;45(4):123–8. 39. Osaka M, Matsuo S, Koh T et al. Loss of heterozygosity at the N-ras locus 7,12–dimethylbenz[a]anthracene-induced rat leukemia. Mol Carcinog 1997; 18(4):206–12. 40. Poirier MC. DNA adducts as exposure biomarkers and indicators of cancer risk. Environ Health Perspect 1997;105(4):907–12. 41. Poon R, Chu I, Davis H et al. Systemic toxicity of a bitumen upgrading product in the rat following subchronic dermal exposure. Toxicology 1996;109:129–46.

42. Rejthar A, Vojtěšek B. Obecná patologie nádorového růstu. Praha: Grada Publishing, spol. s.r.o., 2002:206. 43. Rosypal S. Úvod do molekulární biologie, díl druhý, druhé rozšířené vydání. Brno, 1997:556. 44. Rosypal S. Terminologie molekulární biologie, první vydání. Brno, 2001:280. 45. Rössner P, Binkova B, Sram RJ. The influence of occupational exposure to PAUs on the blood plasma levels of p53 and p21WAF1 proteins. Mutat Res 2003; 535:87–94. 46. Savas U, Carstens CP, Jefcoate CR. Biological oxidations and P450 reactions. Recombinant mouse CYP1B1 expressed in Escherichia coli exhibits selective binding by polycyclic hydrocarbons and metabolism which parallels C3H10T1/2 cell microsomes, but differs from human recombinant CYP1B1. Arch Biochem Biophys 1997;347(2):181–92. 47. Shimada T, Hayes CL, Yamazaki H et al. Activation of chemically diverse procarcinogens by human cytochrome P-450 1B1. Cancer Res 1996;56(13): 2979–84. 48. Shimizu Y, Nakatsuru Y, Ichinose M et al. Benzo[a]pyrene carcinogenicity is lost in mice lacking the aryl hydrocarbon receptor. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(2):779–82. 49. Sugiyama T, Osaka M, Koami K et al. 7,12–DMBA-induced rat leukemia: a review with insights into future research. Leuk Res 2002;26:1053–68. 50. Sun JT, Armstrong MJ, Galloway SM. Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure. Mutat Res 1999;439(1):121–6. 51. Thurmond LM, Lauer LD, House RV et al. Immunosuppression following exposure to 7,12–dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) in Ah-responsive and Ah-nonresponsive mice. Toxicol Appl Pharmacol 1987;91(3):450–60.

52. WHO. Enviromental Health Criteria 202: Selected Non-heterocyclic Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Geneva: WHO, 1998:240. 53. WHO. Enviromental Health Criteria 180: Principles and Methods for Assessing Direct Immunotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Geneva: WHO, 1996:203. 54. Yamaguchi K, Near R, Schneider A et al. Fluoranthene-Induced Apoptosis in Murine T Cell Hybridomas Is Independent of the Aromatic Hydrocarbon Receptir. Toxicol Appl Pharmacol 1996;139:144–52. 55. Yamaguchi K, Near RI, Matulka RA et al. Activation of the aryl hydrocarbon receptor/transcription factor and bone marrow stromal cell-dependent preB cell apoptosis. J Immunol 1997;158(5):2165–73. 56. Zhang L, Savas Ű, Alexander DL et al. Characterization of the Mouse Cyp1B1 Gene, identification of an enhancer region that directs aryl hydrocarbon receptormediatet constitutive and induced expression. J Biol Chem 1998;273(9): 5174–83. 57. Zhong BZ, Gu ZW, Stewart J et al. Micronucleus formation induced by three polycyclic aromatic hydrocarbons in rat bone marrow and spleen erythrocytes following intratracheal instillation. Mutat Res 1995;326:147–53.

MUDr. Monika Hrudková, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Ústav patologické fyziologie, Šimkova 870, 500 38 Hradec Králové. e-mail: [email protected]

81

82

GENETICKÉ ASPEKTY IDIOPATICKÝCH STŘEVNÍCH ZÁNĚTŮ Michal Pintér, Martina Kolesárová Fakultní nemocnice v Hradci Králové: II. interní klinika Summary: Genetic aspects of idiopatic bowel disease. Idiopatic bowel disease, Crohn’ s disease and ulcerative colitis, are grave illneses of gastrointestinal tract. Mechanisms that lead to the development of inflammatory bowel disease are not well understood, but genetic play an important role. The main arguments gathered are ethnic/racial difference in disease frequency, positive family history, increased concordance rate in monozygotic twins relative to dizygotic and genes associated with Crohn’s disease and ulcerative colitis. The enviromental factors play also an important role.

Key words: Crohn’s disease; Ulcerative colitis; Heritability; Chromosom

Souhrn: Idiopatické střevní záněty, mezi které řadíme Crohnovu nemoc a ulcerózní kolitidu, představují závažná onemocnění trávicí trubice. Ačkoliv bylo dosaženo mnoha úspěchů v diagnostice a léčbě, není dosud jasná jejich etiologie a patogeneze. Existují důkazy o tom, že právě genetika hraje velkou roli. Mezi tyto důkazy patří zejména etnické rozdíly ve výskytu onemocnění, familiární výskyt, studie na dvojčatech a v poslední době i důkazy o vazbě mezi střevním onemocněním a specifickými místy (lokusy) na chromozomech. Zda se onemocnění projeví, nezávisí však pouze na genetické predispozici, ale i na zevních faktorech.

Epidemiologie a etnické rozdíly Obě onemocnění vykazují rozdílnou prevalenci a incidenci v různých částech světa v závislosti na řadě činitelů, jako jsou geografická poloha, rasové a etnické odlišnosti, familiární agregace (29). Zvýšená incidence Crohnovy choroby byla zaznamenána během posledních 30 let zejména v rozvinutých zemích. Uváděné incidence jsou 6,0 v USA (27), 3,4 v Itálii (42), 4,1 v Dánsku (31), 5,9 ve Velké Británii (41) a 14,6 v Kanadě (5) na 100 000 obyvatel. Incidence ulcerózní kolitidy na 100 000 obyvatel je v Dánsku 8,1 (25), v USA 8,3 (27) a v Kanadě 14,3 (5). Obecně řečeno je zvýšené riziko rozvoje idiopatických střevních zánětů v urbanistických oblastech, ve vyšších socioekonomických skupinách a v rozvinutých zemích. Incidence se zvyšuje při emigraci z nízkorizikových oblastí do vysokorizikových oblastí (15). Mezi etnickými skupinami jsou na prvním místě Židé. Ve srovnání s nežidovskou populací je incidence až 2–4krát vyšší a prevalence 2–9krát vyšší (46). Bylo prokázáno, že u Židů, kteří emigrovali do Izraele z Evropy nebo Severní Ameriky (tzv. Aškenázové), je nápadně vysoký výskyt idiopatických střevních zánětů ve srovnání s ostatní populací (15). Právě vyšší výskyt onemocnění u Aškenázů ve srovnání s ostatními etnickými skupinami potvrzuje možný genetický vliv na vznik a vývoj střevního zánětu. Ukázalo se, že postižení členové mají často společný typ nemoci, chování, lokalizaci, přítomnost extraintestinálních komplikací a klinických příznaků (10,33). V některých rodinách ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):83–87

se vyskytuje jak ulcerózní kolitida, tak Crohnova choroba. Těchto tzv. „smíšených rodin“ je 25–30 %. I tato skutečnost znamená, že dvě fenotypově odlišná onemocnění mohou mít některé rizikové geny společné (4). Studie na dvojčatech demonstrují velkou genetickou vazbu mezi monozygotickými dvojčaty ve srovnání s dizygotickými. Vyšší vazba je opět u Crohnovy choroby ve srovnání s ulcerózní kolitidou. Závislost mezi monozygotickými dvojčaty u Crohnovy choroby je 42–58 %, zatímco u dizygotických dvojčat je shodná s normálními potomky. U ulcerózní kolitidy je tato závislost menší, konkrétně u monozygotů 6–17 % a dizygotů 0–5 %. Vzhledem k tomu, že závislost u monozygotických, tedy geneticky identických dvojčat, není 100%, hrají velkou roli i negenetické vlivy (9,38). Jaký je vzájemný vztah sporadické a familiární formy idiopatických střevních zánětů? Je vůbec mezi nimi nějaký rozdíl? Vyskytuje se specifický gen, který by byl zodpovědný za familiární formu? Má sporadická forma idiopatických střevních zánětů nějaké specifické klinické příznaky, které by ji odlišily od familiární formy? Asi největším dosud objeveným znakem je věk rozvoje onemocnění. Zjistilo se, že familiární formy jsou diagnostikovány dříve. Konkrétně u Crohnovy choroby je popsána diagnostika nemoci kolem 22.–26. roku proti 26.–28. roku u sporadické formy (10,12). Familiární ulcerózní kolitida je diagnostikována průměrně ve 23. roce, u sporadické formy ve 28. roce (46). Zajímavý nález byl učiněn při srovnání pohlaví mezi familiární a sporadickou formou ve prospěch žen s familiár83

ním idiopatickým zánětem. Poměr ženy/muži byl u familiární formy Crohnovy choroby od 1,23–1,68/1 (26,32). Oproti tomu postihuje Crohnova choroba v dětském věku častěji chlapce. Mezi všemi pacienty s ulcerózní kolitidou je postižena více spíše mužská část populace. Navzdory tomu byla ve dvou studiích převaha žen, a to v poměru ženy/muži 1,3–1,5/1 (26). Při srovnávání závažnosti průběhu familiární formy proti sporadické formě Crohnovy choroby nebyly nalezeny signifikantní rozdíly. U pacientů s familiární formou Crohnovy choroby se první projevy onemocnění objevovaly dříve, častěji bylo postiženo tenké střevo a častěji se jednalo o vazivově-stenózující typ onemocnění (12). Pacienti s familiární formou byli častěji operováni na perforující komplikace (46 % proti 34 %). Nutnost užití imunosupresivního léku (azathioprin, 6–merkaptopurin) a čas první střevní resekce byly také shodné (10). Byla popsána signifikantní konkordance typu idiopatického střevního zánětu (děti rodičů postižených Crohnovou chorobou byly opět častěji postiženy Crohnovou chorobou) (26). V rodině s postiženými 2 členy bylo 56 % konkordantních stran lokalizace onemocnění a 49 % stran typu onemocnění. U perianálních lokalizací byla shoda u 43,5 % pacientů v rodinách s postiženými dvěma členy a 45 % v rodinách s postiženými 3 a více členy. Spíše silnější vazba byla pro postižení tenkého proti tlustému střevu (12).

Modely dědičnosti Neexistuje zatím model dědičnosti, který by vysvětlil vznik idiopatických střevních zánětů. Z jakého důvodu? 1. ze studií na dvojčatech vyplývá nízká penetrace genů, což znamená, že genetický základ není jediný, který určuje vznik nemoci; 2. ulcerózní kolitida a Crohnova choroba jsou jistě geneticky příbuzná onemocnění, což dokazuje společný výskyt v tzv. „smíšených rodinách“. Dále se obě nemoci vyskytují častěji v židovské populaci, zejména u Aškenázů; 3. fakt, že dizygotická dvojčata mají shodné riziko jako ostatní potomci, spíše ukazuje velký vliv faktorů životního prostředí na vznik onemocnění; 4. v případě Crohnovy choroby hraje větší roli genetika v porovnání s ulcerózní kolitidou; 5. existují důkazy potvrzující podíl genetiky na vzniku a vývoji onemocnění; 6. na studiích s geneticky modifikovanými zvířecími modely bylo prokázáno, že různé geny mohou způsobit stejný fenotyp střevního onemocnění; 7. zvířecí modely ukazují vliv interakcí mezi geny a prostředím (40). Mendelovský model dědičnosti se nezdá být pravděpodobný. Multilokulární/oligogenní model dědičnosti vysvětluje manifestaci onemocnění při interakci dvou a více hlavních genů. Model genetické heterogenity chápe ulcerózní kolitidu a Crohnovu chorobu jako syndromy s podobným fenotypem, ale různou etiologií a genetickým podkladem. Polygenní/multifaktoriální model vysvětluje onemocnění jako výsledek působení více různých genů s malým účinkem, s některými společnými geny pro obě onemocnění (40). V souvislosti s idiopatickými střevními záněty je zmiňována i tzv. genetická anticipace. 84

Jedná se o stav, kdy se určitý genetický jev objevuje v mladších generacích dříve, než tomu bylo u starších generací. V případě idiopatických střevních zánětů by to znamenalo diagnostiku v časnějším věku, která byla v mnoha studiích popsána (17), a závažnější průběh onemocnění u dětí nemocných rodičů, což se na druhou stranu v literatuře nevyskytuje (18). Otázkou do diskuse však zůstává, jak velkou roli hraje vlastní onemocnění, rychlá změna životního prostředí a možnosti diagnostiky onemocnění v dané době.

Subklinické známky idiopatických střevních zánětů pANCA (perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies) jsou perinukleárním typem protilátek namířeným proti cytoplazmě neutrofilních leukocytů. Známá je jejich vazba s ulcerózní kolitidou. Je popsána séropozitivita tohoto markeru i u nepostižených členů rodiny. pANCA jsou proto v některých pracích zvažovány jako subklinická známka ulcerózní kolitidy (14), ne však ve všech (1). Vyšší titr pANCA protilátek je spojen s klinicky horším průběhem, levostranným typem onemocnění a častějším rozvojem idiopatického zánětu ileoanálního rezervoáru (tzv. pouchitida) (36). Pozitivita pANCA u Crohnovy choroby je spojena s klinickými příznaky ulcerózní kolitidy (levostranná kolitida, distálnější lokalizace, kontinuální a povrchovější postižení sliznice). ASCA (anti Saccharomyces cerevisiae antibodies) jsou protilátky namířené proti kvasinkám Saccharomyces cerevisiae. Hrají roli zejména u Crohnovy choroby a vykazují určitou odlišnost u familiární formy střevního zánětu. Pozitivita ASCA protilátek se popisuje u sporadické formy idiopatických střevních zánětů u 35 % pacientů s Crohnovou chorobou a u 12 % pacientů s ulcerózní kolitidou. U familiární formy idiopatických střevních zánětů je pozitivita ASCA až u 55 % pacientů s Crohnovou chorobou a u 25 % pacientů s ulcerózní kolitidou. Pro srovnání u kontrolní skupiny to jsou 2 % (3). Vyšší titr protilátek ASCA je spojen s častějším rozvojem onemocnění, vazivově-stenózující formou onemocnění a tvorbou s píštělí (15). C3 složka komplementu je součástí imunitní odpovědi a zánětlivého procesu. Byly popsány abnormality C3 složky komplementu, které poukazují na možnou roli ve vzniku a rozvoji idiopatických střevních zánětů. Stanovení propustnosti sliznice tenkého střeva pro velké molekuly, které se za normálních okolností do vnitřního prostředí nedostávají, prokázalo vyšší propustnost u pacientů s idiopatickým střevním zánětem. Střevní propustnost je zvýšená u pacientů s aktivní Crohnovou chorobou i ulcerózní kolitídou. U ulcerózní kolitidy se potom hodnoty střevní propustnosti normalizují. U pacientů s Crohnovou chorobou bez klinické, laboratorní i endoskopické známky aktivity onemocnění přetrvává vyšší propustnost střevní a je subklinickou známkou nebo prognosticky nepříznivou známkou pro další relaps onemocnění (29,45). Příčiny mohou být na jedné straně genetická predispozice idiopatic-

kých střevních zánětů, na druhé straně vliv zevních faktorů. Uvažuje se o působení vlastního zánětu na sliznici střeva (39). Prováděla se vyšetření imunoglobulinů a jejich podtypů u pacientů s Crohnovou chorobou a ulcerózní kolitidou. Nebyla prokázána asociace mezi koncentrací imunoglobulinů a idiopatickými střevními záněty (15).

Mapování chromozómů Cílem genového inženýrství je identifikování specifického genu, konkrétně specifické varianty genu (alely), která je zodpovědná za konkrétní formu či formy idiopatického střevního zánětu. Nejprve je vypozorována fyziologická porucha, odpovědná biochemická abnormalita, odpovědný protein a jeho genová sekvence. Tzv. kandidátní geny jsou takové geny, které se mohou podílet svojí funkcí na vzniku a rozvoji střevního zánětu. Patří sem imunoregulační molekuly, geny pro receptory T-lymfocytů, adhezivní molekuly a cytokiny, proteiny zodpovědné za funkci hlenu. Chromozóm 16 – lokus IBD1 – jako první byly popsány v roce 1996 Hugotem a spol. (21) kódující cytosolové proteiny skupiny NOD (nucleotide-binding oligomerization domain). Ty se uplatňují v odpovědi na zevní patogeny. Jsou podobné tzv. R-proteinům u rostlin (proteiny zajišťující rostlinám rezistenci vůči infekcím). Jsou spojovány zejména s Crohnovou chorobou. NOD, jiným názvem označovány jako CARD (caspase activating recruitment domain) 15, se vyskytují v monocytech a granulocytech periferní krve a hemopoetických buněk s CD34+ znaky (36). Tyto proteiny se aktivují při kontaktu s lipopolysacharidovými antigeny, které jsou součástí bakteriálních membrán. Výsledkem je aktivace nukleárního faktoru kappa-B s následnou indukcí exprese imunitně závislých genů včetně zánětlivých cytokinů. Abnormální citlivost vůči bakteriím v případě mutace (se sníženou produkcí nukleárního faktoru kappa-B) vede k abnormální T-buněčné odpovědi a tkáňovému zánětu (22,24). Existují celkem tři možné rizikové alely tohoto genu (Leu1007fsinsC, Gly908, a Arg702Trp). Pacienti nesoucí jednu riskantní alelu tohoto genu mají 2–4krát vyšší riziko rozvoje Crohnovy choroby, u dvou rizikových alel, ať už jako homozygot či heterozygot pro dvě rizikové alely, je riziko rozvoje 20–40násobné (6). Při interpretaci variant tohoto genu však musí být zvážena i etnická závislost. Zajímavý vztah je zejména u židovské populace. Frekvence alely Leu1007fsinsC je stejná u židovských (7,3 %) i nežidovských (8,4 %) pacientů s Crohnovou chorobou (9) v kontrastu s alelou Gly908, která má vyšší frekvenci výskytu u židovské populace (10,2 %) ve srovnání s nežidovskou (4,3 %). Frekvence alely Arg702Trp se vyskytuje u nežidovské populace asi u 10,7 %, u židovské populace u 2,6 %. Studie z roku 2002 popisuje u Aškenázů (viz výše) vyšší výskyt alely Gly908 u familiární formy Crohnovy choroby ve srovnání se sporadickou formou. Všichni pacienti s familiární formou Crohnovy choroby, postižení třemi rizikovými alelami ať už jako homozygoti či složením heterozygoti,

mají časnější riziko výskytu nemoci. Alespoň jednu alelu z těchto tří nese celkem 40,2 % pacientů s familiární formou Crohnovy choroby na rozdíl od sporadické formy (27,2 %) a zdravé populace (26,4 %). Většina homozygotů a heterozygotů obsahuje alelu Gly908 (48). Některé práce popisují CARD15/NOD2 varianty jako možné riziko komplikovanějších forem Crohnovy choroby (20), jiné ne (28). Zdá se, že bělošská rasa je primárně rizikovou skupinou pro tyto tři alely ve srovnání s jinou rasou (23). Zdá se, že tyto tři rizikové alely hrají roli i ve fenotypu Crohnovy choroby. Byla nalezena asociace mezi postižením tenkého střeva, časnějším věkem diagnostiky, pozitivní rodinnou anamnézou a přítomností alespoň jedné ze tří alel (13). Fakt, že frekvence těchto alel u zdravé populace není nízká (26,4 %), nás nutí myslet na to, zda tyto alely jsou nějak evolučně výhodné pro lidský organismus. Ovšem jak? Geny pro receptor IL-4 (IL-4R) ovlivňující činnost makrofágů a E-cadherin, transmembránový cytosolový glykoprotein zodpovědný za interakce mezi buňkami střevního epitelu, jsou dalšími kandidátními geny (2). Chromozóm 12 – lokus IBD2 – zde jsou kandidátní geny pro tvz. NRAMP 1 a 2 (natural resistance-associated macrophage protein 1 a 2). NRAMP 1 „kontroluje“ odpověď organismu vůči infekci, zejména mykobakteriální, NRAMP 2 reguluje transport kovových iontů v buněčné membráně. Dále zde najdeme integrin beta 7, což je adhezivní molekula uplatňující se při migraci leukocytů, a interferon gama, cytokin s širokým uplatněním v zánětlivé odpovědi (2). Chromozóm 6 – lokus IBD3 – překrývající oblast HLA systému je spojován s Crohnovou chorobou i s ulcerózní kolitidou (47). HLA I. třídy obsahuje geny kódující proteiny, které se nacházejí na všech lidských buňkách daného jedince. Obsahují lehký a těžký řetězec kódovaný třemi polymorfními geny HLA -A, B, C. Proteiny HLA II. třídy jsou exprimovány pouze na specializovaných imunitních buňkách. Složeny jsou z řetězce alfa a beta kódovaných geny HLA-DP, DQ, DR. HLA-DP a HLA-DQ jsou polymorfní pro oba řetězce, HLA-DR je polymorfní pouze pro řetězec beta. Tento polymorfismus může být příčinou interindividuálních rozdílů v možnosti prezentace antigenu, a tím je ovlivnit imunitní systém. Byla popsána pozitivní asociace u ulcerózní kolitidy s DR2, DR9 a DRB1*0103 a negativní asociace s DR4. Byl popsán vyšší výskyt alely DRB1*0103 u pacientů s nutností chirurgické léčby (34). U Crohnovy choroby byla nalezena pozitivní asociace s DR7, DRB3*0301 a DQ4 a negativní asociace s DR2 a DR3. Popsána je asociace HLA I. a II. třídy s fenotypem idiopatických střevních zánětů, zejména s lokalizací postižení u ulcerózní kolitidy a extraintestinálními komplikacemi (6). V této oblasti se také nachází gen pro TNF-alfa (tumor nekrotizující faktor alfa), který je dalším funkčním kandidátem idiopatických střevních zánětů. Jeho funkce v organismu spočívá v širokém ovlivnění zánětlivých procesů. U idiopatických střevních zánětů je spojován zejména s procesem tvorby granulomů a s cílenou migrací cirkulujících zánětlivých buněk do tkání. U pacientů byla zjištěna zvýšená hladina TNF 85

alfa v séru, sliznici a stolici. Anti-TNF terapie má velkou účinnost při terapii idiopatických střevních zánětů (8,35). Byla popsána asociace mezi polymorfismem TNF alfa a výskytem idiopatických střevních zánětů (43). Chromozóm 14 – lokus IBD4 – je spojovaný s Crohnovou chorobou. Kandidátní geny v sobě zahrnují proteiny pro receptory alfa a delta T-lymfocytů, proteiny leukotrienového receptoru B4 (2). Chromozóm 5 – lokus IBD5 – je popsána asociace s tímto chromozómem a výskytem Crohnovy choroby u rodin s časnou manifestací. Konkrétní gen a specifická riziková alela nebyly dosud identifikovány. Mezi kandidátní geny patří ty, které mohou hrát důležitou roli v patofyziologii zánětu s produkcí IL-3,4,5 a 14 (6). Chromozóm 19 – lokus IBD6 – kandidátními geny jsou kódující ICAM 1 (intercelulární adhezivní molekuly), jejichž zvýšené koncentrace byly nalezeny u pacientů s idiopatickým střevním zánětem. Byla popsána asociace alely K469E s postižením střeva idiopatickým střevním zánětem v japonské populaci (30). C3 složka komplementu, receptor pro tromboxan A2 a leukotrien B4-hydroxylázu jsou dalšími kandidáty (6). Chromozóm 1 – lokus IBD7 – byl popsán u amerických chaldeanských iráckých rodin postižených idiopatickým střevním zánětem. Kandidátní geny jsou ty, které kódují rodinu proteinů pro TNF receptory a kaspázu 9 (6).

Ostatní Selhání farmakologické terapie idiopatických střevních zánětů je následováno chirurgickým výkonem asi u 20 % pacientů s ulcerózní kolitidou a přibližně u jedné poloviny pacientů s Crohnovou chorobou. Jako jedna z možností farmakologického selhání se udává exprese genu MDR-1 (multidrug resistance) kódujícího membránový P-glykoprotein 170. Ten se uplatňuje jako pumpa čerpající různé látky (léky, bakteriální produkty) z intracelulárního prostoru, a tím snižuje koncentraci a účinek těchto látek. Tento protein je produkován v lymfocytech periferní krve a epiteliálních buňkách střevní sliznice. Je popsán vztah mezi expresí tohoto proteinu a odpovědí na glukokortikoidy (16), konkrétně pozitivní asociace alely C3435T MDR-1 genu a ulcerózní kolitidy (37). Interleukin 1 alfa a beta je jedním z hlavních prozánětlivých cytokinů uplatňujících se na začátku zánětlivé kaskády. Má svého přirozeného antagonistu receptoru IL 1 (IL1–RA). Byla popsána pozitivní asociace IL1–RA s ulcerózní kolitidou (11). I když jsou pacienti s idiopatickými střevními záněty rizikovější skupinou pro vznik trombózy, nebyla potvrzena pozitivní asociace mezi těmito střevními záněty a protrombotickými genovými variantami (15). Dalším možným faktorem podílejícím se na vzniku a vývoji idiopatických střevních zánětů je kvalita a kvantita hlenu. Hlen působí jako ochranná vrstva proti chemickým, fyzikálním a biologickým vlivům. Změna kvality nebo kvantity hlenu může hrát důležitou roli v patogenezi idiopatických střevních zánětů. Muciny jsou glykoproteiny 86

produkované žlázkovými buňkami. Některé jsou vylučovány do střeva a tvoří hlavní součást hlenu, jiné jsou především součástí epiteliální stěny střevních buněk. Existuje vztah mezi transmembránovým glykoproteinem MUC-1 a sekrečním proteinem MUC-2 a ulcerózní kolitidou. Byly detekovány autoprotilátky proti MUC-1 proteinu. Zajímavým nálezem je však i pozitivita těchto protilátek u žen – multipar. Protilátková odpověď souvisí s cirkulací MUC-1 proteinu v krvi těhotných a kojících žen. Tvorba a vylučování sekrečního proteinu MUC-2 je snížená zejména u aktivních forem ulcerózní kolitidy. Snížení počtu pohárkových buněk bylo nalezeno zejména v distálních částech tlustého střeva, tedy v nejvíce postižené části střeva u pacientů s ulcerózní kolitidou (19).

Vztah zevních faktorů a idiopatických střevních zánětů Výsledky studií prováděných na dvojčatech, postižení Aškenázů, výskyt onemocnění v závislosti na industrializaci ukázaly sice silnou genetickou závislost, ale zároveň potvrdily, že k manifestaci onemocnění jsou nutné ještě další faktory. Tyto zevní spouštěče jsou nedílnou součástí aktivace onemocnění. Epidemiologické studie identifikovaly různé faktory jako kouření, stav po apendektomii, infekci, užívání orální antikoncepce atd. Manifestace onemocnění pak závisí na celkovém součtu faktorů. Některé zevní faktory, jako například kouření, působí na vznik a průběh onemocnění protikladným efektem. Bylo prokázáno zhoršení průběhu Crohnovy choroby při kouření a naopak ochranný vliv nikotinu pro pacienty s ulcerózní kolitidou (44).

Závěr Medicína pokročila od doby diagnostikování kupředu. Usilovné zkoumání etiologie a patogeneze onemocnění nás jistě směřuje ke zdárnému cíli porozumět onemocnění a poznat, jak ho léčit. Z dosud dostupných údajů vyplývá, že genetika hraje velkou, ne však jedinou roli. Zvláště vyjádřená je dědičnost u Crohnovy choroby, daleko silněji než u ulcerózní kolitidy. Genetické vyšetřování u idiopatických střevních zánětů si v současné době teprve hledá svoje místo. Využití by mohlo být například ve stanovování CARD15 při rozlišování typu idiopatického střevního zánětu v případech indeterminované kolitidy, ve vyšetřování u dětí s pozitivní rodinnou anamnézou. Zda najdou genetická vyšetření uplatnění vedle současných diagnostických metod, nám ukáže teprve čas.

Literatura 1. Achkar JP, Barmada MM, Antibodies Are Not Markers for genetic Heterogenity in Familial Ulcerative Colitis. Am J Gastroenterol 2002;97:2343–9. 2. Ahmad T, Satsangi J, McGovern D, Jewell DP. Review article: the genetic of inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther 2001;15:731–48. 3. Annese V, Andreoli A, Andriulli DR, Gionchetti P, Latiano A, Lombardi G. Familial Expression of Anti-Saccharomyces cerevisiae Mannan Antibodies in Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis: A GISC Study. Am J Gastroenterol 2001;8:2407–12.

4. Annese V, Latiano A, Andriulli A. Genetics of inflammatory bowel disease. The beginning of the end or the end of the beginning? Dig and Liv Dis 2003; 35:442–9. 5. Bernstein CN, Blanchard JF, Rawsthorne P, Wajda A. Epidemiology of Crohn’s disease and ulcerative colitis in a central Canadian province: a population-based study. Am J Epidemiol 1999;149:916–24. 6. Bonen DK, Cho JH. The genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2003;124:521–36. 7. Bonen DK, Ogura Y, Nicolae DL et al. Crohn’s disease-associated NOD2 variants share a signating defect in response to lipopolysaccharide and peptidoglycan. Gastroenterology 2003;124:140–7. 8. Braegger CP, Nichols S, Murch SH et al. Tumor necrosis factor alpha in stool as a marker of intestinal inflammation. Lancet 1992;339:89–91. 9. Breslin NP, Todd A, Kilgallen C, O’Morain C. Monozygotic twins with Crohn’s disease and ulcerative colitis: a unique case report. Gut 1997;41:557–60. 10. Carbonel F, Macaigne G, Beaugerie L et al. Crohn’s disease severity in familial and sporadic cases. Gut 1999;44:91–5. 11. Carter MJ, Di Giovine FS, Jones S et al. Association of the interleukin 1 receptor antagonist gene with ulcerative colitis in Northern European Caucasians. Gut 2001;48:461–7. 12. Colombel JF, Grandbastien B, Gower-Rousseau C et al. Clinical characteristics of Crohn’s disease in 72 families. Gastroenterology 1996;111:604–7. 13. Cuthbert AP, Fisher SA. The contribution of NOD2 gene mutations to the risk and site of disease in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2002; 122:867–74. 14. Duerr RH, Targan SR, Landers CJ, Sutherland LR, Shanahan F. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in ulcerative colitis. Comparison with other colitides/diarrheal illnesses. Gastroenterology 1991;1590–6. 15. Ekbom A. The Changing Faces of Crohn’s Disease and Ulcerative Colitis. In: Inflammatory Bowel Disease: From Bench To Bedside, 2sease: From Bench To Bedside, 2: Academic Publishers BV, 2003:5–20. 16. Farrell RJ, Murphy A, Long A et al. High multiredrug Resistance (PGlycoprotein 170) Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients Who Fail Medical Therapy. Gastroenterology 2000;118:279–88. 17. Faybush EM, Blanchard JF, Rawsthorne BCN. Generational Differences in the Age at Diagnosis With IBD: Genetic Anticipation, Bias, or Temporal Effects. Am J Gastroenterol 2002;3:636–40. 18. Hampe J, Heymann K. Anticipation in inflammatory bowel disease: a phenomenon caused by an accumulation of confounders. Am J of Med Genet 2000; 92:178–83. 19. Hayashi T, Ishida T. Mucins and Immune Reactions to Mucins in Ulcerative Colitis. Digestion;2001;63(supplementum 1):28–31. 20. Heliö T, Halme L, Lappalainen M et al. CARD/NOD2 gene variants are associated with familially occuring and complicated forms of Crohn’s disease. Gut 2003;52:558–62. 21. Hugot JP, Laurent-Puit P, Gower-Rousseau C et. al. Mapping of a susceptibility locus for Crohn’s disease on chromosome 16. Nature 1996;79:821–3. 22. Inohara N, Ogura Y, Nunez G. Nods: a family of cytosolic proteins that regulate the host response to pathogens. Current Opinion in Microbiol 2002;5:76–80. 23. Inoue N, Tamura K et. al. Lack of common NOD2 variants in Japanese patients with Crohn’s disease. Gastroenterology 2002;123:86–91. 24. Kment M.Choroby gastrointestinálního traktu v graviditě. Triton 2003;43. 25. Langholz E, Munkholm P, Nielsen OH, Kreiner S, Binder V. Incidence and prevalence of Ulcerative colitis in Copenhagen county from 1962 to 1987. Scand J Gastroenterol 1991;26:1247–56. 26. Lee JC, Lennard-Jones JE. Inflammatory Bowell Disease in 67 families each with three or more affected first-degree relatives. Gastroenterology 1996;111:587–96. 27. Loftus EV Jr., Silverstein MD, Sandborn WJ et al. Crohn’s disease in Olmsted County, Minnesota, 1940–1993: incidence, prevalence, and survival. Gastroenterology 1998;114:1161–8. 28. Louis E, Michel V, Hugot JP et al. Early development of stricturing or penetrating pattern in Crohn’s disease is influenced by disease location, number of flares, and smoking but not by NOD/CARD15 genotype. Gut 2003;52:552–7.

29. Lukáš M.Definice, historie, terminologie a klasifikace ISZ. In: Lukáš M a kol. Idiopatické střevní záněty. Galén, Praha:1998,25–33. 30. Matsuzawa J, Sugimura K, Takazoe M et al. Association between K469E allele of¨intercellular adhesion molecule 1 gene and inflammatory bowel disease in a Japanese population. Gut 2003;52:75–8. 31. Munkholm P, Langholz E, Nielsen OH, Kreiner S, Binder V. Incidence and prevalence of Crohn’s disease in th county of Copenhagen, 1962–1987: a sixhold increase in incidence. Scand J Gastroenterol 1992;27:609–14. 32. Peeters M, Cortot A, Vermeire S et al. Familial and sporadic inflammatory bowel disease: different entities? Inflamm Bowel Dis 2000;6:314–20. 33. Peeters M, Nevens H, Baert F et al. Familial Aggregation in Crohn’s disease: increased age-adjusted risk and concordance in clinical charakteristics. Gastroenterogy 1996;111:597–603. 34. Roussomoustakaki M, Satsangi J, Welsh K et al. Genetic Markers May Predict Disease Behavior in Patients With Ulcerative Colitis. Gastroenterology 1997;112:1845–53. 35. Sanborn WJ, Hanauer SB. Infliximab in the Treatment of Crohn’s Disease: A User’s Guide for Clinicians. Am J Gastroenterol 2002;97:2962–72. 36. Sandborn WJ, Landers CJ. Antineutrophil cytoplasmic antibody correlates with chronic pouchitis after ileal pouch-anal anastomosis. Am J Gastroenterol 1995;90:740–7. 37. Schwab M, Schaeffeler E, et al. Assotiation Between the C3434T MDR1 Gene Polymorphism and Susceptibility for Ulcerative Colitis. Gastroenterology 2003; 124:26–33. 38. Subhani J, Montgomery SM, Ounder RE, Wakefield AJ. Concordance rates of twins and siblings in inflammatory bowel disease. Gut 1998;42:A40. 39. Suderholm JD, Olaison G, Lindberg E et al. Different intestinal permeability patterns in relatives and spouses of patients with Crohn’s disease: an inherited defect in mucosal defence? Gut 1999; 44:96–100. 40. Taylor KD, Rotter JI, Yang H. Genetics of Intestinal Bowel Disease. In: Shanahan F, Karp LC. Inflammatory Bowel Disease: From Bench To Bedside, 2nd Edition. Great Britain: Kluwer Academic Publishers BV 2003:21–65. 41. Thomas GA, Millar-Jones D, Rhodes J, Roberts GM, Williams GT, Mayberry JF. Incidence of Crohn’s disease in Cardiff over 60 years: 1986–1990 an update. Europ J Gastroenterol and Hepatol 1995;7:401–5. 42. Trallori G, Palli D, Saieva C, Bardazzi G, Bonanomi AG, d’Albasio G, Galli M. A population-based study of inflammatory bowel disease in Florence over 15 years (1978–2). Scand J Gastroenterol 1996;31:892–99. 43. Van Heel DA, Udalova IA, De Silva AP et al. Inflammatory bowel disease is associated with a TNF polymorphism that affects an interaction between the OCT1 and NK-kappaB transcription factors. Hum Molecular Genet 2002;11:1281–89. 44. Wakefield AJ, Sawyerr AM, Dhilon AP et al. Pathogenesis of Crohn’s disease: multifocal gastrointestinal infarction. Lancet 1989;1:1057–62. 45. Wyatt J, Vogelsang H, Hubl W et al. Intestinal permeability and the prediction of relapse in Crohn’s disease. Lancet 1993;341:1437–39. 46. Yang H, McElree C, Roth MP, Shannahan F, Targan SR, Rotter JI. Familial empirical risks for inflammatory bowel disease: differences between Jews and nonJews. Gut 1993;34:517–24. 47. Yang H, Plevy S. Linkage of Crohn’s disease to the major histocompatibility region is detected by multiple non-parametric analyses. Gut 1999;44:519–26. 48. Zhifeng Zhou, Xing-yu Lin. Variation at NOD2/CARD15 in Familial and Sporadic Cases of Crohn’s Disease in the Ashkenazi Jewish Population. Am J Gastroenterol 2002;12:3097–101.

MUDr. Michal Pintér, Fakultní nemocnice v Hradci Králové, II. interní klinika, 500 05 Hradec Králové. e-mail: [email protected]

87

88

VZÁJEMNÉ OVLIVNĚNÍ FERTILITY A IDIOPATICKÝCH STŘEVNÍCH ZÁNĚTŮ: SHRNUTÍ SOUČASNÝCH POZNATKŮ Martina Kolesárová, Michal Pintér Fakultní nemocnice v Hradci Králové: II. interní klinika Summary: The influence of fertility and idiopatic bowel disease: a summary. Idiopatic bowel diseases parallels the female reproductive period, therefore it’s been examined the influence of Crohn’s disease and ulcerative colitis on pregnancy and of pregnancy on disease itself. There are many questions about the effects of the disease on fertility, course of pregnancy, influence of fetus and other factors related to puerperium. Many factors of the disease, pharmacological therapy and surgical interventions are associated with the disease. Psychological aspects are also included

Key words: Crohn’s disease; Ulcerative colitis; Fertility; Pregnancy; Therapy

Souhrn: Vzhledem k tomu, že první projevy idiopatických střevních zánětů se vyskytují v mladém věku, probíhá podstatná část onemocnění ve fertilním období. Velice často se setkáváme s problematikou vzájemného ovlivnění střevního onemocnění a fertility v širokém slova smyslu. Často jsou také kladeny otázky, jestli pacienti s idiopatickým střevním zánětem budou schopni navázat normální vztah, jakým způsobem ulcerózní kolitida nebo Crohnova choroba ovlivní ženskou či mužskou plodnost a průběh gravidity, jestli je ohroženo zdraví plodu, porod a šestinedělí. Dnes je již zřejmé, že existuje vzájemný vztah mezi idiopatickými střevními záněty a fertilitou. Podílí se zde řada faktorů daného onemocnění, medikamentózní a chirurgické terapie. Svoji roli zde hraje i psychika pacienta.

Idiopatický střevní zánět jako psychosomatické onemocnění, ovlivnění kvality života Pacienti s idiopatickými střevními záněty většinou nejsou primárně ohroženi smrtí vlastním onemocněním. Podstatně je však ovlivněna kvalita života. U ulcerózní kolitidy nejsou signifikantně vyjádřené rozdíly v pohlaví, u Crohnovy choroby je poměr mezi mužem a ženou 1:1,8 (6). Ženy mají asi o 20–30 % vyšší riziko vzniku Crohnovy choroby než muži (31). Pacienti mají obdobné psychické obtíže jako pacienti s jinými chronickými onemocněními. K těmto se však často přidávají i specifické příznaky nemoci, které komplikují život nemocným ve smyslu společenském. Patří sem zejména nutkavé průjmy a flatulence, které přicházejí v nečekaných denních situacích. Tyto příznaky mohou způsobit frustraci, snížit sebevědomí pacientů a narušit sexuální důvěrnosti. Inkontinence v průběhu pohlavního styku může silně potlačit sexuální motivaci (69). Jak je kvalita života ovlivněna po chirurgickém zákroku na střevu, popisuje studie pacientů s ileostomií, Kockovým pouchem (kontinentní ileostomie) a ileoanálním rezervoárem (IPAA – ileal pouchanal anastomosis). Většina (97 % pacientů s ileostomií, 96 % pacientů s Kockovým pouchem a 95 % pacientů s ileoanálním rezervoárem) byla spokojena s dietním opatřením. Kvalita sociálních aktivit, rekreace, domácích prací a roACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):89–96

dinných vztahů byla ve všech skupinách shodná. Ze všech nemocných byli nejvíce spokojeni se sportovní a sexuální aktivitou pacienti s ileoanálním rezervoárem, následovala skupina ošetřovaných s Kockovým pouchem a s ileostomií (67). U většiny nemocných je složité takovéto obtíže detekovat. Ženy většinou nejsou ochotné diskutovat o těchto citlivých tématech v gastroenterologické ambulanci, zejména je-li lékařem muž. Jednou z možností je návštěva obou partnerů u psychologa nebo psychiatra. Mezi často kladené otázky jistě patří, jaký vliv má onemocnění na ženské fyziologické pochody. Kane a kol. v r. 1998 publikovali studii sledující vliv menstruačního cyklu na idiopatické střevní záněty a syndrom dráždivého tračníku v porovnání se zdravou populací. Jako gynekologické obtíže obecně definovali dráždivost, nervozitu, deprese, bolesti hlavy, strach, pocit na zvracení, zvracení, pocení, bolest prsů, akné, pelvické bolesti, bolesti zad, průjem, zácpu, časté močení atd. Premenstruační obtíže uvedlo 93 % ze všech dotázaných. Nejčastější byla v 73 % zvýšená dráždivost, v 59 % deprese a v 56 % hmotnostní přírůstek. Mezi zdravou populací a nemocnou skupinou nebyly nalezeny signifikantní rozdíly u těch obtíží, které nesouvisejí s trávicím traktem. Nauzea a průjem byly signifikantně vyšší u idiopatických střevních zánětů i u syndromu dráždivého tračníku. Menstruační obtíže byly popisovány u 80 % účast89

nic. Dominovaly zejména pelvické bolesti (52 %), bolesti zad (36 %), průjem (26 %). Incidence jakýchkoliv obtíží byla signifikantně vyšší u pacientů s Crohnovou chorobou a syndromu dráždivého tračníku (41). V jiné práci Weber a spol. popisují menstruační abnormality (amenorea, nepravidelný menses, dysmenorea, menoragie) až u 58 % pacientek. Jako hlavní faktory označil vliv chronického onemocnění, malnutrici a léky (73).

Orální antikoncepce a idiopatické střevní záněty Vliv orální antikoncepce na idiopatické střevní záněty je zkoumán již řadu let. O vzájemném vztahu existují kontroverzní názory. Takzvaná mikrovaskulární hypotéza vzniku a vývoje Crohnovy choroby vysvětluje zhoršování průběhu choroby tím, že sama aktivní choroba zvyšuje riziko trombembolické nemoci. Orální antikoncepce zvyšuje riziko vzniku mikrotrombů, a tím působí jako precipitát pro vznik fokálních nekróz s následným zhoršením průběhu onemocnění. Závažnost postižení závisí zejména na obsaženém množství estrogenů v tabletě. Jako hraniční je označována dávka nad 50 ug ethyloestradiolu v tabletě (72). Jako další negativní efekt antikoncepce na idiopatický střevní zánět je popsána častější rekurence onemocnění, zvýšená spotřeba kortikoidů k navození remise a anální lokalizace onemocnění (17). Timmer a spol. popisují, že ženy s idiopatickým střevním zánětem, které někdy užívaly orální antikoncepci, mají až trojnásobné riziko relapsu onemocnění (66). V protikladu jiné práce, jako např. studie Cosnese a spol., neprokázaly žádné rozdíly mezi aktivitou onemocnění a užíváním orální antikoncepce. Relaps onemocnění byl shodný v obou sledovaných skupinách, u nemocných užívajících antikoncepci ve 46 %, u pacientek bez antikoncepce ve 43 %. Nebyla zaznamenána trombotická komplikace (16). Zvažováno je ale i to, že pacientky s nedávno aktivním onemocněním by se pravděpodobně preventivním užíváním orální antikoncepce vyhnuly komplikacím následného těhotenství. Co tedy poradit pacientkám? Obecné pravidlo o nevhodnosti kouření v kombinaci s orální antikoncepcí se pacientkám s idiopatickým střevním zánětem nevyhýbá. Pokud chtějí pacientky-nekuřačky v remisi, které nemají rizikové faktory pro trombembolismus, užívat orální antikoncepci, jsou jim doporučeny preparáty s nízkým obsahem estrogenů (3).

Fertilita u žen s idiopatickým střevním zánětem Fertilita žen s ulcerózní kolitidou Nebyl shledán vliv samotné ulcerózní kolitidy na fertilitu (75). Snížená fertilita se zdá být spíše u žen s chronickou aktivní formou onemocnění. Faktem však zůstává, že pacientky s ulcerózní kolitidou mají menší počet dětí než ženy zdravé. Snížený počet otěhotnění u těchto pacientek je spíše spojen se strachem z onemocnění a dobrovolným odmítnutím těhotenství. Je však i pravdou, že se s rozvojem 90

medikamentózní terapie a možností chirurgického zásahu při dlouhodobé perzistenci příznaků snižuje možnost posoudit skutečný vliv chronického onemocnění na fertilitu. Fertilita mužů s ulcerózní kolitidou Neexistují důkazy o tom, že by ulcerózní kolitida sama o sobě ovlivňovala mužskou fertilitu. Jsou zde však minimálně dva faktory, které hrají roli. Jedním je vliv medikace. Užívání sulfasalazinu, ne však přípravků 5–ASA, je spojeno s oligospermií a azoospermií (nepřítomností pohyblivých spermií v ejakulátu) (70). Prevalence tohoto nálezu u mužů užívajících sulfasalazin je 64–86 % (43). Pokud se však tento lék vysadí nebo se přejde na preparáty 5–ASA, dojde během několika týdnů k úpravě stavu (68). Druhým faktorem jsou chirurgické výkony v pánevní oblasti s negativním dopadem na mužskou plodnost. Impotentia generandi je porucha tvorby spermií. Její příčinou může být výše uvedená farmakoterapie, ale i pozánětlivé stenózy a neprůchodnost spermií ductus deferens. Impotentia coecundi znamená neschopnost pohlavního styku spojenou s neschopností erekce, poruchou ejakulace a libida. Incidence pohlavní dysfunkce u mužů je 1–3 % (60). Jednou z možností jak předejít možné impotenci je předoperační odebrání semene. Fertilita žen s Crohnovou chorobou U pacientek trpících Crohnovou chorobou jsou výsledky provedených studií celkem jednoznačné. Ačkoliv jedny z prvních prací na toto téma nepopisovaly rozdíl fertility ve srovnání se zdravou populací (20), následně se ukázalo, že u relativně velkého počtu pacientek je schopnost koncepce nižší. Je zřejmé, že na snížené fertilitě se podílí řada faktorů, a to nejen aktivita vlastní choroby a komplikace z ní vyplývající (malnutrice, endokrinní problémy, hnisavé komplikace v malé pánvi, přítomnost rektovaginálních a perineálních píštělí, dyspareunie, ztráta libida, obtíže s hygienou), ale i medikamentózní a chirurgická terapie (36,73). Velkou roli také hrají psychosociální faktory a strach z gravidity. Právě obava z těhotenství je přirozenou a pochopitelnou reakcí, neboť chronický průběh nemoci s výhledem eventuálních operací přináší pocit nejistoty a strachu z budoucnosti. V roce 1986 byla publikována Evropská multicentrická studie o fertilitě a komplikacích gravidity, zahrnuto bylo i Československo. V této práci se prokázalo, že po stanovení diagnózy Crohnovy choroby se počet gravidit snižuje v porovnání se stejně zdravými ženami. Nebyl však prokázán vyšší počet předčasných porodů. Nebyla přímá závislost mezi lokalizací Crohnovy choroby a snížením fertility. Na nižší fertilitu těchto žen vlivem onemocnění lze usuzovat nepřímo z toho, že celkové procento pacientek užívajících antikoncepci je významně menší než ve zdravé populaci (28 % nemocných proti 42 % zdravých žen). Počet porodů u pacientek s Crohnovou chorobou po stanovení diagnózy byl 28 % případů v porovnání se 40 % zdravých žen ve stejné věkové kategorii (48).

Fertilita mužů s Crohnovou chorobou Pro ovlivnění mužské fertility Crohnovou chorobou platí stejné údaje jako u ulcerózní kolitidy. Existují však i práce, které popisují vliv aktivního onemocnění a současně malnutrice na oligospermii (26).

Vliv těhotenství na průběh idiopatického střevního zánětu Vliv těhotenství na průběh ulcerózní kolitidy Období remise – pacientky, které jsou v době početí v remisi, obvykle zůstávají v remisi i během těhotenství a šestinedělí. Přibližně u jedné třetiny žen dojde během těhotenství k relapsu onemocnění, a to nejčastěji v prvním trimestru, což je srovnatelné s pozorováním netěhotných pacientek v ročním intervalu. Remise dosažená v průběhu těhotenství s největší pravděpodobností vydrží až do konce těhotenství. Z toho vyplývá, že ženy s ulcerózní kolitidou by měly své těhotenství naplánovat na období remise. Byl popsán vyšší výskyt relapsů u nechtěných nebo neplánovaných těhotenství (33). Aktivní forma ulcerózní kolitidy v době početí – s největší pravděpodobností bude aktivní až do konce těhotenství a může se zhoršit. I když je pravdou určitá neshoda mezi autory (19,33,46). Asi jedna třetina pacientek se zlepší nebo zcela přejde do remise, zatímco většina má průjmy a krvácení po celé těhotenství a šestinedělí (75). Komplikace u těchto žen jsou srovnatelné s netěhotnými ženami s aktivní formou ulcerózní kolitidy. Fulminantní kolitida řešená kolektomií není překážkou porodu zdravého dítěte (8). Chirurgický výkon však může být spojen častěji s předčasným porodem nebo spontánním potratem (5). První ataka ulcerózní kolitidy v průběhu těhotenství a šestinedělí – jsou popisovány nárazy ulcerózní kolitidy se závažným průběhem, často končící smrtí matky nebo potratem (19). Náraz začíná obvykle v prvním trimestru, ale se současnou znalostí terapie většinou s dobrou reakcí na léky, a to i bez ohrožení plodu. Nárazy v době šestinedělí jsou vzácné a mají spíše mírný průběh. Průběh ulcerózní kolitidy v čase po porodu není odlišný v porovnání s jinou časovou periodou (75). Některé studie dokonce popisují snížení relapsů ve tříletém sledování po porodu ve srovnání s touto časovou periodou před porodem (14). Chování ulcerózní kolitidy v dalších těhotenstvích – zdá se, že dřívější názory, které radily ženám s prodělaným relapsem v průběhu jednoho těhotenství nepořídit si další vlastní dítě (19), již v současné době neplatí. Na základě mnoha prací, ve kterých byl popisován různý průběh ulcerózní kolitidy v průběhu několika těhotenství u jednotlivých pacientek, se zdá, že průběh jednoho těhotenství nekoreluje s průběhem dalších (75).

Vliv těhotenství na průběh Crohnovy choroby Období remise – pokud je dítě počato v období remise, bude tato trvat s největší pravděpodobností po celé těho-

tenství. Relapsy se vyskytují celkově asi ve 30 % a nejčastěji v prvním trimestru a šestinedělí (49). Nebyly nalezeny větší gastrointestinální komplikace během těhotenství (22). Některé práce udávají snížení počtu relapsů, ale i snížení vazivových stenóz na střevu v průběhu těhotenství (52). Jiné popisují kontroverzně entero-uterinní píštěle (76) a vzácně možný vznik peritoneální sepse (34). Popisován je ve 40 % relaps onemocnění po porodu (27). Období aktivního onemocnění – obecně se udává, že třetina onemocnění zůstane stejně aktivní, třetina přejde do remise a třetina pacientek se zhorší (20,50). První ataka během těhotenství – podle dřívějších prací byla prognóza těchto pacientek i jejich plodů špatná. Těhotenství často končila potraty a chirurgickým řešením nemoci u matek. S novými chirurgickými i medikamentózními postupy se však prognóza zlepšila (7).

Vliv idiopatického střevního zánětu na těhotenství Vliv ulcerózní kolitidy na těhotenství V dosud provedených studiích nebyl prokázán jednoznačný vliv ulcerózní kolitidy na průběh těhotenství, které končí ve většině případů porodem zdravého dítěte. Nízká porodní hmotnost, nezralost nebo předčasný porod dítěte nebyly shledány signifikantně častěji ve srovnání se zdravou populací žen. Konkrétně kongenitální abnormality jsou popisovány u 0–3 % porodů (deficity končetin, obstrukční vrozené abnormality), spontánní potraty se vyskytují v 9 % (51). Zda hraje nějakou roli stupeň aktivity onemocnění, není dosud zcela jasné. Většina žen může očekávat nekomplikovaný vaginální porod. Prognóza normálního porodu u žen v remisi je dobrá. U pacientek s aktivním onemocněním během těhotenství lze očekávat vyšší riziko předčasného porodu a spontánních či indukovaných potratů (75). Vliv Crohnovy choroby na těhotenství U dětí matek s Crohnovou chorobou nebyl nalezen signifikantně vyšší výskyt kongenitálních malformací ve srovnání se zdravou populací (75). Tyto pacientky však mají vyšší riziko předčasného porodu a porodu dětí s nižší porodní hmotností (50). Podle jedné dánské studie byla průměrná hmotnost novorozenců signifikantně nižší v porovnání se zdravou populací. Signifikantně více dětí vážilo méně než 2500 gramů a byly narozeny před 37. týdnem gestace (28). Efekt Crohnovy choroby na porodní hmotnost je porovnatelný s dětmi, jejichž matky kouřily (53). Větší riziko abnormálního těhotenství mají ženy s aktivním onemocněním v čase těhotenství (48). Vliv předchozího chirurgického zákroku na fertilitu, těhotenství, způsoby porodu (císařský řez, vaginální porod a episiotomie) Chirurgická terapie ulcerózní kolitidy je resekce postiženého střeva s vytvořením ileoanálního rezervoáru, Kockova pouche, terminální ileostomie a ileorektální anastomózy. Chirurgické výkony jsou indikovány v případech 91

volné perforace, krvácení, toxického megacolon nereagujícího na konzervativní léčbu, u stenóz, rakoviny střeva a selhání konzervativní léčby. Proktokolektomie s vytvořením ileoanálního rezervoáru signifikantně snižuje fertilitu žen (42). Ženy, které prodělaly proktokolektomii s vytvořením ileoanálního rezervoáru z důvodu ulcerózní kolitidy, mohou očekávat normální průběh těhotenství a porod zdravého donošeného dítěte s minimálním vlivem na funkci rezervoáru. Jsou popisovány oba způsoby porodu, vaginální cestou i císařským řezem (49). Snížená kapacita rezervoáru z důvodů zvětšené dělohy, postižení pudendálních nervů (perzistentní pudendální neuropatie) vlivem tlaku plodu při II. době porodní nebo při porodu kleštěmi (40) může vést k častějším stolicím během dne i noci. Vzhledem k těmto údajům je volen spíše císařský řez. Komplikace byly popsány asi u 7 % pacientek, častěji po opakovaných porodech. Pánevní lokalizace ileoanálního rezervoáru se ale zdá být do jisté míry i ochranou. U pacientek po proktokolektomii s ileostomií nebo s Kockovým pouchem jsou popsány komplikace při těhotenství u 29 %. Možné vysvětlení větších komplikací je v přímém účinku břišní stěny na stomie (63). Procento císařských řezů je vyšší u žen s ileoanální anastomózou (44 %) ve srovnání s pacientkami s ileostomií (37 %), nebo pacientkami s Kockovým pouchem (24 %). Skutečným důvodem je patrně strach z vaginálního porodu. Pro úplnost je nutné zmínit se i o zánětu ileoanálního rezervoáru (tzv. pouchitida). Jedná se o idiopatické zánětlivé onemocnění postihující ileoanální rezervoár. Až u poloviny pacientů s ulcerózní kolitidou bez ohledu na pohlaví se během života objeví zánět ileoanálního rezervoáru s 15% přechodem do chronického postižení. Diagnóza je stanovena na základě klinického (průjem, vodnatá stolice, nutkání na stolici, rektální krvácení), endoskopického a histologického vyšetření. Etiologie je neznámá. Mezi etiologické faktory patří fekální stáza a/nebo bakteriální „přerůstání“, nutriční deficit, ischemické komplikace chirurgického výkonu, rekurence ulcerózní kolitidy v ileoanálním rezervoáru a nepoznaná Crohnova choroba (47). Mezi chirurgické výkony u pacientů s Crohnovou chorobou patří strikturoplastiky, resekce střeva a vlastní kapitolu tvoří chirurgie píštělí. Je popsána snížená fertilita u žen s idiopatickým střevním zánětem po chirurgickém výkonu pro Crohnovu chorobu (36,73). Obecně platí, že se ženy s idiopatickým střevním zánětem podrobují častěji císařskému řezu ve srovnání se zdravou populací. Jedním z důvodů je strach z možných komplikací v podobě perianálních píštělí po episiotomii, zvláště je-li onemocnění v době porodu aktivní. Vyšší riziko je popisováno u žen s Crohnovou chorobou a současně historií perianálního onemocnění (9). U žen s Crohnovou chorobou bez aktivity onemocnění v době porodu, bez historie perianálního postižení se zdá, že není riziko relapsů v perianální krajině a je více méně na daném porodnickém pracovišti a rodičce, pro jaký způsob porodu se rozhodne (38). 92

Malnutrice a těhotenství u žen s idiopatickými střevními záněty Výživa jako terapie – výživa je nezbytnou součástí léčebného schématu. V případě idiopatických střevních zánětů hraje v podstatě dvojí roli. Je používána jako primární terapie s cílem navození a udržení remise onemocnění, ale funguje i jako nutriční podpora ke zlepšení stavu výživy. Cílem terapeutické výživy je zabezpečit optimální přísun energetických substrátů a upravovat porušenou rovnováhu minerálů, tekutin, vitamínů a stopových prvků. Při výběru způsobu nutriční podpory se snažíme vždy o co nejpřirozenější způsob. Dáváme přednost, je-li to možné, nejprve enterální výživě. Elementární enterální výživa podávaná po dobu 12 týdnů se ukazuje jako vhodná k navození remise u lehčích a středně aktivních forem Crohnovy choroby. V případě ulcerózní kolitidy nebyla popsána žádná výhoda při použití totální parenterální výživy ve srovnání s enterální výživou (37). Parenterální výživa je obvykle indikována v případě fulminantně probíhající Crohnovy choroby a ulcerózní kolitidy zejména se střevní obstrukcí nebo u fistulujících forem. Často se používá i v rámci předoperační přípravy. Nebezpečí totální parenterální výživy „obcházející“ střevo spočívá v možné slizniční atrofii s následným bakteriálním „přerůstáním“. Jsou popsány i případy vzniku akutní pankreatitidy jako komplikace totální parenterální výživy (71). Malnutrice – idiopatické střevní záněty narušují fyziologické děje související s příjmem, zpracováním a využitím potravy jako energetického substrátu. Malnutrice je popisována bez ohledu na aktivitu onemocnění. Deficit se týká jak makronutrientů (sacharidy, tuky, bílkoviny), tak i mikronutrientů (vitamíny a stopové prvky). Až u 90 % pacientů v remisi bylo popsáno snížení sérového karoténu a snížení zinku, selenu, magnézia a vitamínu C až u 50 % nemocných (30). Snížení příjmu potravy může být způsobeno příznaky vlastního onemocnění s následnou anorexií, předčasným pocitem sytosti. Maldigesce (porucha trávení) je způsobená časově nedostatečným kontaktem enzymů s tráveninou, možnou exogenní insuficiencí slinivky břišní a hepatobiliárními komplikacemi (71). Malabsorpce v užším slova smyslu (porucha vstřebávání) je závislá na strukturálním i funkčním poškození enterocytů zánětem, redukcí resorpčního povrchu, zrychlením času průchodu tráveniny střevem (tzv. transit time) vlivem zvýšené střevní motility, bakteriálním přerůstáním, deficitem žlučových kyselin, laktázovou intolerancí. Faktorem je i interakce mezi potravou a léky užívanými při terapii. Vedle sníženého příjmu potravy hraje roli i zvýšený výdej energie vlivem aktivního zánětu (zvýšená spotřeba kyslíku, zvýšená lipolýza (1), zvýšená tělesná teplota). Ztráty tekutin, makronutrientů i mikronutrientů souvisejí s chronickými průjmy. Byla popsána exsudativní enteropatie se ztrátami bílkovin do trávicího ústrojí (32). Těhotenství a nutrice – v těhotenství jsou nutriční potřeby žen vysoké, zejména těch, které prodělaly střevní resekci. Malnutrice během gestace vede k intrauterinní růstové

retardaci vyvíjejícího se organismu. Je asociována se změnami v chování, metabolismu a fyziologických funkcích plodu (56). Malnutrice signifikantně zvyšuje perinatální morbiditu a mortalitu. Má vliv na porodní hmotnost i na dobu porodu (35) zejména u žen se závažným průběhem idiopatického střevního zánětu na tenkém střevu nebo žen po chirurgické resekci s projevy syndromu krátkého střeva. Jakýkoliv deficit nutrice by měl být u těhotných žen doplněn, zvláštní důraz je kladen na substituci železa a kyseliny listové. Byly popsány případy se zavedením totální parenterální výživy těhotným s idiopatickým střevním zánětem z důvodů malnutrice. Úspěšná těhotenství byla popsána i po dlouhodobé domácí parenterální výživě (29). Možnosti vyšetřovacích metod u žen s idiopatickými střevními záněty během těhotenství Flexibilní sigmoideoskopie byla shledána jako bezpečný výkon. Koloskopii bychom měli provádět v případech, kde by endoskopický nález nějak významně ovlivnil následnou terapii. Těhotná by se měla vyhnout RTG paprskům z důvodu možných teratogenních a mutagenních účinků zejména v prvním trimestru (12). Chirurgická intervence u ulcerózní kolitidy z důvodů toxického megacolon, perforace nebo krvácení je v případě subtotální kolektomie následována asi 50% rizikem pooperačního potratu. V některých pracích je popsána mateřská letalita až 29 % (7). Vliv lékové terapie idiopatických střevních zánětů na těhotenství a období kojení Léky jsou jedním ze základních pilířů současné terapie idiopatických střevních zánětů. Výběr léku užívaného v těhotenství by měl v sobě zahrnovat bezpečnost a správnost indikace. Prevalence fetálních malformací v běžné populaci se pohybuje okolo 2 % všech těhotenství a ve většině případů není možné určit příčinu. Zmíněné „malformační pozadí“ je třeba brát v úvahu při interpretaci teratogenního účinku léčiv, ale i v případě vlivu vlastního onemocnění na vyvíjející se plod. Sulfasalazin a jeho deriváty – prostupuje placentární bariérou a je vylučován do mateřského mléka. Vzhledem k nízké absorpci je jeho koncetrace v plazmě a mateřském mléku velmi nízká. Nebyl prokázán vliv léku na nízkou porodní hmotnost, nezralost a spontánní potraty. Byla však prokázána interference se sníženou absorpcí folátů (18). I přesto by měla udržovací terapie sulfasalazinem pokračovat i v průběhu těhotenství. Riziko relapsu onemocnění je pro plod vyšší než vlastní lék. Dalším, byť teoretickým rizikem je vedlejší účinek sulfapyridinu. Ten může vytěsňovat bilirubin z albuminu v plazmě plodu a kojence, a způsobovat tak jádrový ikterus. Mnoho studií potvrdilo jeho bezpečné užívání během těhotenství i kojení (39). Preparáty 5-ASA – užití mesalazinu v doporučené dávce nemá teratogenní účinky (23). Vzácně jsou popisovány reverzibilní komplikace jako kožní exantém, intersticiální

nefritida a trombocytopenie, ale ne častěji ve srovnání s netěhotnými ženami (15). Antibiotika – nejčastěji se používají metronidazol a ciprofloxacin. Nebylo prokázáno zvýšené riziko rakoviny nebo vrozených vad u člověka při podávání metronidazolu (21), ačkoliv dlouhodobé podávání tohoto léku hlodavcům a bakteriím má karcinogenní, resp. mutagenní účinky (24). Naproti tomu ciprofloxacin ovlivňuje růst chrupavek u zvířat i lidí a je příčinou artropatie. Obě antibiotika přestupují do mateřského mléka. V několika případech však nebyl popsán nepříznivý účinek ciprofloxacinu užívaného během těhotenství (45). Nic se však nemění na tom, že ciprofloxacin a metronidazol nejsou doporučeny v těhotenství a v období kojení. Kortikoidy – rizika se zdají být malá a obecně platí pravidlo, že pokud je klinická indikace k užívání, jako středně či vysoce aktivní onemocnění, jsou v době těhotenství tyto léky podávány. Kortikoidy přestupují přes placentu a jsou rychle konvertovány na méně aktivní kortizon a prednisolon. Jsou popsána tři potenciální rizika užití: kongenitální malformace (především rozštěp patra), neonatální adrenální insuficience, nízká porodní hmotnost. Rozštěp patra byl popsán u experimentálních zvířat při vysokých dávkách kortikoidů. U člověka nejsou příliš jasně podporující údaje, že by kortikoidy zvyšovaly riziko rozštěpu patra (13). Vzhledem k tomu, že se patro uzavírá do 12. týdne gestace, je toto potenciální riziko rozštěpu ovlivnitelné. Neonatální adrenální insuficience je neobvyklá. Výsledkem rychlého mateřského metabolismu prednisolonu, vazbou na proteiny a konverzí na neaktivní metabolit placentárním enzymem 11 beta-hydroxysteroid-dehydrogenázou, je poměrně nízká koncentrace hormonů ve fetální krvi v porovnání s mateřskou (77). Výsledkem je nízká suprese fetální hypofýzy plodů matek užívajících kortikoidy. Mnoho studií poukazuje na nízkou porodní hmotnost potomků experimentálních zvířat užívajících kortikoidy v průběhu gravidity. O možném vlivu kortikoidů na plod rozhoduje dávka, trvání terapie, typ steroidu a eventuální spoluúčast přidružených mateřských nemocí. U matek užívajících steroidní hormony hrozí riziko těhotenstvím indukované hypertenze, gestační diabetes mellitus a předčasný porod z ruptury plodových blan. V mateřském mléku je možné zjistit nízké koncentrace prednisonu a jeho metabolitu prednisolonu. Při užívání 80 mg prednisolonu kojící matkou vstřebá kojenec méně než 0,1 % látky, což je méně než 10 % denní produkce endogenního fetálního kortizolu. Jako možné řešení, jak snížit dávku kortikoidů v mateřském mléku, je kojit až několik hodin po užití prednisonu (55). 6-merkaptopurin (6-MP), azathioprin přestupují oba přes placentu a jsou detekovatelné v krvi plodu. Výskyt vrozených malformací, nízké porodní hmotnosti je popisován na zvířecím modelu. U lidí se zdá, že mají relativně bezpečné použití (4). U mužů užívajících 6-MP v období 3 měsíců před početím bylo prokázáno signifikantně vyšší riziko kongenitálních abnormalit plodu a spontánních potratů (59). 93

Pokud těhotná nemůže být léčena jinými léky, dávají se tyto v průběhu těhotenství (4). Azathioprin a 6-MP jsou detekovatelné v nízkých koncentracích v mateřském mléku. Doporučeno je nekojit. Používání cyklosporinu A je do jisté míry kontroverzní. Teratogenní účinky byly shledány jako nízké. Byla sledována těhotenství v rámci potransplantační péče v prevenci rejekce. U 40 % novorozenců byly nalezeny známky nezralosti, několik dětí mělo mírnou trombocytopenii. U všech novorozenců byly normální jaterní i ledvinné funkce. Indikací k terapii podle některých autorů je těžce probíhající ulcerózní kolitida nereagující na podávanou léčbu. Naproti tomu v jiných pracích byly popsány komplikace v podobě předčasného porodu a nízké porodní hmotnosti (2). Tento lék by se tedy používat v těhotenství neměl. Methotrexat je potenciálně mutagenní a teratogenní, proto musí být vysazen z medikace nejméně tři měsíce před plánovaným otěhotněním. Způsobuje defekty neurální trubice a při jeho užívání je doporučeno současně užívat antikoncepci (74). Infliximab – zkušenosti s touto relativně novou látkou jsou malé. Jedná se o chimerickou monoklonální protilátku tvořenou z části lidské a myší namířenou proti tumor-nekrotizujícímu faktoru alfa (TNF alfa). Používá se u refrakterních a fistulujících forem Crohnovy choroby. Nebyla zatím potvrzena možná toxicita, embryotoxicita nebo teratogenní účinky. Je popsán případ výskytu Fallotovy tetralogie (64). O vlivu infliximabu na mužskou fertilitu nejsou doposud žádné údaje. Infliximab je do jisté míry srovnáván s thalidomidem. Zde jsou teratogenní účinky známy (postižení končetin, očí, uší, dále duodenální píštěle a abnormality neurální trubice). Účinek spočívá v inhibici TNF alfa zvýšením degradace iRNA. Infliximab působí na cytokinový nosič i jako anti-TNF alfa protilátka (65). Jeho koncentrace v mateřském mléku není dosud známa. Právě pro malé zkušenosti by se tato látka neměla používat v těhotenství. Thalidomid – je silně teratogenní preparát s dalšími nežádoucími účinky, kam patří sedace, dermatitida, pruritus, zácpa a změny krevního obrazu. Používá se pouze u nemocných refrakterních na standardní terapii (62). V těhotenství by se podávat neměl. Mykofenolát mofetil – je ester kyseliny mykofenolové, která inhibuje inosin-monofosfát-dehydrogenázu a inhibuje lymfocytární proliferaci. Jeho hlavní použití je v transplantologii. Při terapii idiopatických střevních zánětů se dá použít u chronického onemocnění s alergií na ostatní léky nebo při neúčinnosti azathioprinu a 6-MP (58). Při jedné studii s tímto preparátem nebyly prokázány chromozomální abnormality na plodech během prvního trimestru. Popsány jsou hypoplázie nehtového lůžka a krátký malíček (57). Léky proti průjmům – na studiích prováděných na zvířatech nebyl prokázán vliv léků (difenoxylát s atropinem, loperamid) na vyšší riziko teratogenity. Někteří autoři popisují fetální malformace u plodů matek užívajících difenoxylát s atropinem v průběhu prvního trimestru. Obecné 94

pravidlo proto je: vyhnout se těmto lékům zejména v prvním trimestru a spíše ovlivnit střevní symptomy dietou. Tyto léky je vhodné vyloučit i během kojení, ačkoliv není příliš mnoho zpráv o jejich riziku pro kojence.

Kouření Kouření je jedním ze základních faktorů zevního prostředí, který ovlivňuje průběh idiopatických střevních zánětů. V Československu v roce 1982 Bureš a spol. publikovali studii týkající se kuřáckých návyků ve vztahu k idiopatickým střevním zánětům. Bylo zjištěno 17 % mužů-kuřáků a 4 % žen-kuřaček mezi pacienty s ulcerózní kolitidou ve srovnání s pacienty s Crohnovou chorobou, mezi nimiž bylo 42 % mužů-kuřáků a 8 % žen-kuřaček (11). Byla prokázána pozitivní asociace mezi kouřením a Crohnovou chorobou. Pacienti měli vyšší počet relapsů, horší průběh onemocnění a častější chirurgické řešení. U silných kuřáků bylo popsáno častější postižení tenkého střeva a ileocékální oblasti (61). Vztah kouření a idiopatického střevního zánětu byl zkoumán i v rodinách s vícečetným postižením. Zde byly výsledky obdobné a sice negativní asociace s ulcerózní kolitídou a pozitivní asociace s Crohnovou chorobou. Pokud mají tato dvě onemocnění shodný genetický základ, což je zatím předmětem výzkumu, znamenalo by to, že faktory zevního prostředí, v tomto případě kouření, mohou ovlivnit výsledný fenotyp střevního zánětu (10,44). Hlavní látkou v cigaretách je nikotin. Vliv nikotinu na vznik idiopatických střevních zánětů je spojován s ovlivněním imunitního systému, zánětlivé kaskády, střevní motility, produkce hlenu, střevní propustnosti, toku krve a aktivace destiček. Vlastní mechanismus však dosud znám není (25). Ovlivnění Crohnovy choroby může spočívat ve zhoršování vaskulárních intestinálních lézí a podílet se na vzniku multifokálních tkáňových infarktů (72). I přesto, že existují údaje o tom, že kouření pozitivně ovlivňuje ulcerózní kolitídu, je nutné podotknout trvající negativní postoj vůči kouření.

Závěr Otázky fertility a problémy s ní spojené jsou jistě středem pozornosti každého dospívajícího páru. Pokud je jeden z budoucích rodičů navíc postižen idiopatickým střevním zánětem, zvyšují se jistě strach a obavy z nastávajícího rodičovství. V případech plánovaného rodičovství dochází u pacientek k menšímu počtu relapsů v průběhu těhotenství. Doporučená je alespoň roční remise před otěhotněním. Aktivita onemocnění je jedním z hlavních faktorů ovlivňujících těhotenství a je spojena s nižší porodní hmotností a předčasným porodem, zejména u Crohnovy choroby. Pacientky s idiopatickým střevním zánětem v remisi mohou očekávat normální průběh těhotenství, porodu a kojení. Co se týká farmakologické terapie, po celé těhotenství je povoleno používat aminosalicyláty, kortikoidy se mohou v době těhotenství podávat, pokud je klinická indikace

k užívání. Pacientky, zejména kuřačky, by měly vynechat užívání orální antikoncepce. Jsou možné oba způsoby porodu, vaginální cestou i císařským řezem. K císařskému řezu se přikláníme u žen s aktivním onemocněním a v případě předchozího chirurgického zákroku. Idiopatické střevní záněty patří jistě mezi závažná onemocnění, ale z pohledu současné medicíny nebrání otěhotnění a porodu zdravého dítěte.

Literatura 1. Al-jaouni R, Hébuterne X. Energy Metabolism and Substrate Oxidation in Patients With Crohn’s Disease. Nutrition 2000;16:173–8. 2. Al-Khader AA, Absy M, Al-Hasani MK et al. Successful pregnancy in renal transplant recipients treated with cyclosporin. Transplantation 1988;45:987–8. 3. Alstead EM. The pill: Safe sex and Crohn’s disease? Gut 1999;45:165–7. 4. Alstead EM, Ritchie JK, Lennard-Jones JE et al. Safety of azathioprine in pregnancy in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1990;99:443. 5. Anderson JB, Turner GM, Wiliamson RC. Fulminant ulcerative colitis in late pregnancy and puerperium. J R Soc Med 1987;80:492. 6. Andres PG, Friedman LS. Epidemiology and the natural course of inflammatory bowel disease. Gastroenterol Clin North Am 1999;28:255–81. 7. Bohe MG, Ekelund GR, Genell SN et al. Surgery for fulminating colitis during pregnancy. Dis Colon Rectum 1983;26:119–22. 8. Boulton R, Hamilton M, Lewis A et al. Fulminant ulcerative colitis in pregnancy. Am J Gastroenterol 1994;89:931. 9. Brandt LJ, Estabrook SG, Reinus JF. Results of a survey to evaluate whether vaginal delivery and episiotomy lead to perianal involment in women with Crohn’s disease. Am J Gastroenterol 1995;90:1918–22. 10. Brignola C, Belloli C. The Relationship Between Heritability and Smoking Habits in Crohn’s Disease. Am J Gastroenterol 2000;11:3171–5. 11. Bureš J, Fixa B. Kouření a ulcerózní kolitída. Vnitřní lékařství 32 1985;2: 196–200. 12. Cappell MS, Colon VJ, Sidhom OA. A study at 10 medical centers of the safety and efficacy of 48 flexible sigmoidoscopies and 8 coloscopies during pregnancy with follow-up of fetal outcome and with comparison to control groups. Dig Dis Sci 1996;41:2353. 13. Carmichael SL, Shaw GM. Maternal corticosteroid use and risk of selected congenital anomalies. Am J Med Genet 1999;86:242. 14. Castiglione F, Pignata S, Morace F et al. Effect of pregnancy on the clinical course of a cohort of women with inflammatory bowel disease. I J Gastroenterol 1996; 28:199. 15. Colombel JF, Brabant G et al. Renal insufficiency in infant: side-effect of prenatal exposure to mesalasine? Lancet 1994;344:620–1. 16. Cosnes J, Carbonel F, Carrat F, Beaugerie L, Gendre J-P. Oral contraceptive use and the clinical course of Crohn’s disease: a prospective cohort study. Gut 1999;45:218–22. 17. Cottone M, Camma C. Oral contraceptive and recurrence in Crohn’s disease (Abstract).Gastroenterology 1999;116:3015. 18. Craxi A, Pagliarello F. Possible embryotoxicity of sulfasalazine. Arch Intern Med 1980;140:1674. 19. Crohn BB, Yarnis H, Crohn EB, Walter RI, Gabrilove LJ. Ulcerative colitis and pregnancy. Gastroenterology 1956;30:391–403. 20. Crohn BB, Yarnis H, Korelitz BI. Regional enteritis complicating pregnancy. Gastroenterology 1956;31:615–28. 21. Czeizel AE, Rockenbauer M. A population based case-control teratologic study of oral metronidazole treatment during pregnancy. B J Obstet and Gynaecol 1998;105:322. 22. De Dombal FT, Burton IL, Goligher JC. Crohn’s disease and pregnancy. BMJ 3:550–3. 23. Diav-Citrin O, Park YH, Veeransuntharam G et al. The safety of mesalamine in human pregnancy: a prospective controlled cohort study. Gastroenterology 1998;114:23–8. 24. Falagas ME, Walker AM, Jick H et al. Late incidence of cancer after metronidazole use: a matched metronidazole user/nonuser study. Clin Infect Dis 1998;26:384. 25. Farrell RJ, Peppercorn MA. Ulcerative colitis. Lancet 2002;359:331–40. 26. Farthing MJG, Dawson AM. Impaired semen quality in Crohn’s disease – drugs, ill health or undernutrition? Scand J Gastroenterol 1983;18:57–60. 27. Fielding JF, Cooke WT. Pregnancy and Crohn’s disease. BMJ 1970;2:76–7. 28. Fonager K, Sorensen HT, Olsen J et al. Pregnancy outcome for women with Crohn’s disease: a follow-up study based on linkage between national registries. Am J Gastroenterol 1998;93:2426. 29. Gatenby SJ. Maintenance of pregnancy in Crohn’s disease by parenteral nutrition: a case study. Human Nutrition: Applied Nutrition 41A:345–49.

30. Geerling BJ, Badart-Smook A. Comprehensive nutritional status in patients with long-standing Crohn disease currently in remission. Am J Clin Nutr 1998; 67:919–26. 31. Glic M.Crohn’s disease epidemiology at the turn of the century-solving puzzle. Am J Gastroenterol 2000;95:321–3. 32. Griffiths AM, Drobnies A, Soldin SJ, Hamilton JR. Enteric protein loss measured by fecal alpha1–antitrypsin clearance, in the assessment of Crohn’s disease activity. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1986;5:907. 33. Hanan IM, Kirsner JB. Inflammatory bowel disease in the pregnant woman. Clin Perinatol 1985;12:669. 34. Hill J, Clark A, Scott NA. Surgical treatment of acute manifestations of Crohn’s disease during pregnancy. J R Soc Med 1997;90:64. 35. Hobel C, Culhane J. Role of Psychological and Nutricional Stress on Poor Pregnancy Outcome. J Nutr 2003;133:1709S-15S. 36. Hudson M, Flett G, Sinclair TS et al. Fertility and pregnancy in inflammatory bowel disease. Int J Gynaecol and Obstet1997;58:229–37. 37. Huix FG. Enteral versus parenteral nutrition as adjunct therapy in acute ulcerative colitis. Am J Gastroenterol 1993;88:227–32. 38. Ilnyckyj A, Blanchard JF, Rawstone P, Bernstein ChN. Perianal Crohn’s Disease and Pregnancy: Role of the Mode of Delivery. Am J Gastroenterol 1999; 11:3274–8. 39. Jarnerot G, Andersen S, Esbjorner E et al. Albumin reserve for binding of bilirubin in maternal and cord serum under treatment with sulphasalazine. Scand J Gastroenterol 1981;16:1049. 40. Juhasz ES. Ileal pouch-anal anastomosis function following childbirth. An extended evaluation. Dis Colon Rectum 1995;38:159–65. 41. Kane SV. The Menstrual Cycle and Its Effect on Inflammatory Bowel Disease and Irritable Bowel Syndrome: A Prevalence Study. Am J Gastroenterol 1998; 93(10):1867–72. 42. Kasper OO, Svend J, Berndtsson I, Oresland T, Laurberg S. Ulcerative Colitis: Female Fecundity Before Diagnosis, During Disease, and After Surgery Compared With a Population Sample. Gastroenterlogy 2002;122:15–9. 43. Korelitz BI. Pregnancy, fertility and inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol 1985;80:365–70. 44. Lee JCW, Lennard-Jones JE. Inflammatory bowel disease in 67 families each with three of more affected first degree relatives. Gastroentrology 1996;111: 587–96. 45. Loebstein R, Addis A, Ho E et al. Pregnancy outcome following gestational exposure to fluoroquinolones: A multicenter prospective controlled study. Antimicrob Agents Chemother 1998;42:1336. 46. MacDougal I. Ulcerative colitis and pregnancy. Lancet 1956;2:641–3. 47. Mahadevan U, Sanborn WJ. Pouchitis: clinical characteristics and management. In: Targan SR, Shanahan F, Karp LC. Inflammatory Bowel Disease: From Bench To Bedside, 2nd Edition. Great Britain: Kluwer Academic Publishers BV, 2003: 643–55. 48. Mayberry JF, Weterman IT. European survey of fertility and pregnancy in women with Crohn’s disease: a case control study by European collaborative group. Gut 1986;27:821–5. 49. Nelson H, Dozois RR, Kelly KA et al. The effect of pregnancy and delivery on the ileal pouch-anal anastomosis functions. Dis Colon Rectum 1989;32:384. 50. Nielsen OH, Andreasson B, Bondesen S et al. Pregnancy in Crohn’s disease. Scand J Gastroenterol 1984;19:724. 51. Norgard B, Puho E, Pedersen L et al. Risk of Congenital Abnormalities in Children Born to Women With Ulcerative Colitis: A Population-Based, CaseControl Study. Am J Gastroenterol 2003;98:2006–10. 52. Nwokolo CU, Tan WC, Andrews HA, Allan RN. Surgical resections in parous patients with distal ileal and colonic Crohn’s disease. Gut 1994;35:220–3. 53. Olsen J. Cigarette smoking in pregnancy and fetal growth. Does the type of tobacco play a role? Int J Epidemiol 1992;21:279. 54. Olsen KO, Juul S, Berndtsson I et al. Ulcerative colitis: Female fecundity before diagnosis, during disease, and after surgery compared with a population sample. Gastroenterology 2002;122:15–9. 55. Ost L, Wettrell G, Bjorkhem I, Rane A. Prednisolone excretion in human milk. J Pediatr 1985;106:1008. 56. Pennington SN, Pennington JS, Ellington LD et al. The effect of maternal malnutrition during pregnancy in the rat on the ofspring’s weight, glucose uptake, glucose transporter protein levels and behaviors. Nutr Res 2000;21:755–69. 57. Pergola PE, Kancharia A, Riley DJ. Kidney transplantation during the first trimester of pregnancy: immunosuppression with mycophenolate mofetil, tacrolimus, and prednisone. Transplantation 2001;71:994–7. 58. Present DH. Is mycophenolate mofetil a new alternative in the treatment of inflammatory bowel disease? Gut 1999;44:592–3. 59. Rajapakse RO, Korelitz BI, Zlatanic J. Outcome of pregnancies when fathers are treated with 6–mercaptopurine for inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol 2000;95:684–8. 60. Rosen RC. The international Index of Erectile Function (IIEF): a multidimensional scale for assesment of erectile dysfunction.Urology 1997;49:822–30. 61. Thomas GAO, Rhodes T, Green JT, Richardson Ch. Role of smoking in inflammatory bowel disease: implications for therapy. Postgrad Med J 2000;76:273–9.

95

62. Sands BE, Podolsky DK. New life in a sleeper: thalidomide and Crohn’s disease. Gastroenterology 1999;117:1485–8. 63. Scott HJ, McLeod RS, Blair J, O’Connor B, Cohen Z. Ileal pouch anal anastomosis; pregnancy, delivery and pouch function. Int J Colorectal Dis 1996; 11:84–7. 64. Srinivasan R. Infliximab Treatment and Pregnancy Outcome in Active Crohn’s Disease. Am J Gastroenterol 2001;96:2274–6. 65. Stephens TD, Bunde CJW, Fillmore BJ. Mechanism of action in thalidomide teratogenesis. Biochem Pharmacol 2000;59:1489–99. 66. Timmer A, Sutherland LR, Martin F. Canadian mesalamine for remission of Crohn’s disease study group. Gastroenterology 1998;114:1143–50. 67. Tjandra JJ, Fazio VW. Similar functional results after restorative proctocolectomy in patients with familial adenomatous polyposis and mucosal ulcerative colitis (Abstract). Am J Surg 1993;165:322–5. 68. Toovey S, Hudson E, Hendry WF, Levi AJ. Sulphalazine and male fertility; reversibility and possible mechanism. Gut 1981;22:445–51. 69. Trachter AB. Inflammatory bowel disease in Women: Impact on Relationship and Sexual Health. Inflammatory bowel disease, 8(6);413–21. 70. Traub AI, Thompson W, Carville J. Male fertility due to sulphasalazine. Lancet 1979;2:639–40.

96

71. Van Citters GW, Lin HC. Nutrition in inflammatory bowel disease. In: Targan SR, Fergus S, et. al. Inflammatory Bowel Disease: From Bench to Bedside. Great Britain: Kluwer Academic Publishers, 2003:587–99. 72. Wakefield AJ, Sawyerr AM, Dhilon AP et al. Pathogenesis of Crohn’s disease: multifocal gastrointestinal infarction. Lancet 1989;1:1057–62. 73. Weber AM, Ziegler C, Belinson JL et al. Gynecologic History of Women with inflammatory bowel disease. Obstet and Gynecol 1995;86:843–7. 74. Weinstein GD. Methotrexate. Ann Intern Med 1977;86:199–204. 75. Willoughby CP, Truelove SC. Ulcerative colitis and pregnancy. Gut 1980;21:469–74. 76. Wulfeck D, Williams T, Amin A, Huang TY. Crohn’s disease with unusual enterouterine fistula in pregnancy. J Ky Med Assoc 1994;92:267. 77. Yang K. Placental 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase: barrier to maternal glucocorticoids. Rev Reprod 1997;2:129.

MUDr. Martina Kolesárová, Fakultní nemocnice v Hradci Králové, II. interní klinika, 500 05 Hradec Králové. e-mail: [email protected]

PROFESIONÁLNÍ BRONCHIÁLNÍ ASTMA: SOUČASNÝ STAV PROBLÉMU Karin Boušová Fakultní nemocnice Hradec Králové, Klinika nemocí z povolání Summary: Occupational asthma: Current state of the problem. Occupational asthma is a disease with serious medical, social and economical consequences. Most patients have to change their jobs and very often they lose their professional qualification. This article gives a current review of the problems of occupational bronchial asthma and alergic rhinitis in the region of Eastern Bohemia. The results obtained are compared with the situation in the whole Czech Republic and in the world. The number of new cases of occupational asthma and alergic rhinitis discovered in the contact area of the Department of Occupational Medicine at the University Hospital in Hradec Králové fluctuates around 15–20 cases per year, and 80–100 new cases are reported in the whole republic.The rate of occupational asthma and occupational alergic rhinitis of the total asthma and rhinitis incidence in the Czech population fluctuates between 5–15 %. Regarding the number of affected employees, flour is considered the most important allergen. Other important noxas include agricultural allergens, textile dust, diisocyanates and disinfectious preparations. The importance of the alergogenius effect of natural rubber latex and diisocyanates has increased in occupational medicine mainly in the last 20 years. Regarding latex, its harmful effect has been especially demonstrated in health providers who wear protective latex gloves, which results not only in contact eczema – dermatitis, but also in bronchial asthma and alergic rhinitis. Diisocyanates, highly reactive and agressive substances, originate during polyurethan production which has a wide industrial application (production of polyurethan foam and rubber, paints, adhesives, injected substances, glues, varnishes etc.). The incidence of occupational asthma diseases in workers exposed to diisocyanates is high. Typically, a development of the disease begins after a short time exposure. In this thesis, a diagnostic method in suspected occupational alergic disease of the airways is suggested and possibilities for the application of particular diagnostic methods are given with emphasis on their advantages and limitations and the necessity to determine a proper diagnostic method for the individual patient. In searching for a particular cause of the occupational disease a significant benefit is the determination of a wide range of specific Ig E class serum antigens, in case IgG and standardization of the method provoke tests for its practical application.

Key words: Occupational asthma; Occupational allergic rhinitis; Allergens at work

Souhrn: Profesionální astma je onemocnění se závažným medicínským, sociálním i ekonomickým dopadem. U většiny nemocných vede k potřebě pracovního přeřazení, často ke ztrátě původní profesionální kvalifikace. Článek přináší aktuální přehled o problematice profesionálního bronchiálního astmatu a alergické rinitidy v oblasti východních Čech. Zjištěné výsledky jsou porovnány se situací v celé České republice a ve světě. Počet nově zjištěných onemocnění profesionálním astmatem a alergickou rinitidou ve spádové oblasti Kliniky nemocí z povolání FN v Hradci Králové se pohybuje kolem 15–20 případů ročně, v celé republice se ročně hlásí 80–100 nových onemocnění. Podíl profesionálního astmatu a profesionální alergické rinitidy na obecném výskytu astmatu a rinitidy v populaci se pohybuje mezi 5 a 15 %. Z hlediska počtu postižených pracovníků je nejzávažnějším alergenem mouka. K významným škodlivinám patří dále zemědělské alergeny, textilní prach, diizokyanáty a dezinfekční látky. Závažné je rovněž alergogenní působení latexu a diizokyanátů, jejichž význam v pracovním lékařství vzrostl především v posledních 20 letech. Pokud jde o latex, jeho škodlivý účinek se projevuje především u zdravotníků v souvislosti s používáním ochranných latexových rukavic. Setkáváme se nejen s kontaktním ekzémem – dermatitidou, ale také s bronchiálním astmatem a alergickou rinitidou. Diizokyanáty jsou vysoce reaktivní a agresivní látky vznikající při výrobě polyuretanů, které mají široké průmyslové využití (výroba polyuretanové pěny a pryže, barev, adheziv, vstřikovacích hmot, lepidel, laků aj.). Incidence onemocnění profesionálním astmatem u pracovníků exponovaných diizokyanátům je vysoká, typický je vývoj onemocnění po krátké době expozice. V práci je uveden diagnostický postup u podezření na profesionální alergické onemocnění dýchacích cest a konkrétní možnosti využití jednotlivých diagnostických metod, s upozorněním na jejich výhody i omezení a na potřebu stanovení odpovídajícího diagnostického postupu individuálně pro každého nemocného. V pátrání po konkrétní příčině profesionálního onemocnění je zřetelným přínosem možnost stanovení širokého spektra specifických sérových protilátek třídy Ig E, případně IgG a standardizace metodiky provokačních testů s jejich praktickým využitím. ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):97–105

97

Úvod V populaci je celkově kolem 25 % alergiků. V České republice je známo 250 000 astmatiků (periodická prevalence se pohybuje mezi 1,8–3,3 na 100 000 obyvatel) (12) a zhruba stejný počet onemocnění zůstává dosud neodhalen a tedy neléčen (27,30). V příčinách astmatu hrají významnou roli vlivy profesionální. Podle různých literárních pramenů představuje profesní astma 2–15 %, resp. až 30 % všech onemocnění bronchiálním astmatem (7,15,24). Vznik astmatu v dospělém věku by měl vždy budit podezření na faktory pracovního prostředí jako jednu z možných příčin onemocnění. Pro včasnou a přesnou diagnostiku je nutný určitý algoritmus vyšetření, opírajících se o spolupráci s alergologem, pneumologem i dalšími odborníky a o kvalitní funkční i laboratorní diagnostiku. Vedle nejzávažnější formy alergických onemocnění, bronchiálního astmatu, se pravidelně setkáváme s alergickou rinitidou, resp. rinokonjunktivitidou, která astma provází nebo mu předchází. Přítomnost alergické rinitidy u postižených zvyšuje riziko budoucího vývoje bronchiálního astmatu až čtyřnásobně oproti osobám stejně exponovaným dané noxe, avšak bez alergické rinitidy (6). V České republice se v posledních letech každoročně hlásí kolem 2000 nových nemocí z povolání (5,9,26). V nich podíl respiračních alergických onemocnění celostátně činí 5 % a na rozdíl od řady jiných profesionálních chorob počet těchto onemocnění v průběhu let narůstá. V celé republice je ročně hlášeno kolem 30 nových onemocnění samotnou profesní alergickou rinitidou (PAR) a 40–70 onemocnění bronchiálním astmatem samostatným nebo v kombinaci s rinitidou. Podstatná část těchto onemocnění je hlášena ze spádové oblasti kliniky nemocí z povolání v Hradci Králové (20–30 %). Asthma bronchiale bylo v České republice zařazeno do seznamu nemocí z povolání až od roku 1976. Poslední znění Seznamu nemocí z povolání, uvedené v příloze k Nařízení vlády č. 290/95 Sb. a platné od 1.1.1996, uvádí v kapitole III pod položkou 10 kromě bronchiálního astmatu nově také jiná alergická onemocnění horních cest dýchacích, což umožňuje hlásit jako nemoc z povolání i samostatnou alergickou rinitidu, bez současné přítomnosti astmatu. Existuje veliké množství alergenů, které mohou vyvolávat astma, a to jak ve venkovním či domácím prostředí, tak také na jednotlivých pracovištích. Dosud bylo popsáno kolem 360 škodlivin a jejich počet trvale narůstá (27,31). O profesním astmatu hovoříme tehdy, jestliže v roli primární, hlavní či převažující příčiny bylo potvrzeno působení škodliviny, které byl pacient vystaven ve svém pracovním prostředí. Škodliviny v pracovním prostředí mohou způsobit zánět dýchacích cest dvěma mechanismy (3, 6, 10): a) přímým toxickým poškozením způsobeným inhalací chemikálie s iritativním účinkem (iritativní astma), 98

b) prostřednictvím získané reakce přecitlivělosti na inhalovaný proteinový alergen nebo nízkomolekulární chemický hapten (alergické astma). Imunopatologické mechanismy vzniku profesionálního AB (3,10,23): a) Th2 cytokin/Ig E dependentní mechanismus (atopie) se uplatňuje především u vysokomolekulárních alergenů (prach obilí, moučný prach…) a některých nízkomolekulárních chemických sloučenin (anhydridy kyselin, soli platiny), b) mechanismy zprostředkované buňkami se uplatňují např. u nízkomolekulárních alergenů typu diizokyanátů nebo u kyselin obsažených v cedrovém dřevu. Alergická rinitida je významný rizikový faktor bronchiálního astmatu, hodnotíme ji jako preastmatický stav (28). Průduškové astma se vyskytuje současně u čtvrtiny až poloviny pacientů s alergickou rinitidou. Naopak rinitidou trpí 78 %, resp. 88 % astmatiků (22,25). Celosvětově se prevalence alergické rinitidy v populaci odhaduje na 10–25 % (25). Profesionální alergická rinitida je alergická rinitida, u které bylo prokázáno, že příčinou (hlavní či převažující) onemocnění je škodlivina, které je nebo byl pacient vystaven ve svém pracovním prostředí. Zřetelným přínosem pro posuzování profesionality a s tím spojeného uplatňování nápravných opatření byla poslední novela Seznamu nemocí z povolání (příloha k Nařízení vlády č. 290/95 Sb.), platná od 1. ledna 1996, podle níž lze jako nemoc z povolání hlásit nejen bronchiální astma, ale samostatně i jiná alergická onemocnění horních cest dýchacích, tedy především alergickou rinitidu (38). Toto opatření vyvolalo potřebu zpřesnit, zkvalitnit a sjednotit diagnostiku profesionální alergické rinitidy tak, aby se nejen v konečné fázi umožnil, ale také urychlil proces vyřazení nemocných z původního alergogenního pracovního prostředí. Pro profesní astma i alergickou rinitidu je typický vznik nebo zhoršení projevů v souvislosti s pobytem na pracovišti, resp. s expozicí dané profesionální noxe, a zmírnění či ústup obtíží při pobytu mimo pracoviště, o víkendech, během dovolené nebo při pracovní neschopnosti.

Hlavní epidemiologické charakteristiky K nejčastěji postiženým pracovníkům v České republice patří pekaři, cukráři a zpracovatelé obilovin, dále chovatelé hospodářských zvířat, textilní dělníci a zdravotníci. Mezinárodní webový server pro profesionální astma (31) uvádí incidenci astmatu u pekařů podle výsledků různých studií mezi 5–24 % a řadí moučný prach celoevropsky na 2. místo v pořadí nejčastějších příčin astmatu. Vzhledem k profesní struktuře v daných odvětvích ekonomické činnosti jsou profesionálním průduškovým astmatem a alergickou rinitidou v našich podmínkách častěji postiženy ženy než muži (2–3:1).

Diagnostika, diferenciálně diagnostický postup Praktický lékař a spolupracující odborníci v rámci diferenciální diagnostiky dušnosti, kašle, event. jiných respiračních symptomů diagnózu astmatu vyloučí (o nemoc z povolání se tedy nejedná) nebo naopak potvrdí a doporučí nemocného s podezřením na profesionální etiologii onemocnění k vyšetření odborníkem pro pracovní lékařství, resp. nemoci z povolání. Diagnostika se opírá o anamnézu s důrazem na rozbor vztahu obtíží k pracovní činnosti a expozici jednotlivým škodlivinám, o pohovor o současných obtížích, fyzikální vyšetření nemocného, základní spirometrické vyšetření. V dalším postupu je důležité alergologické vyšetření s provedením prick testů, event. intradermálních testů (testy s ubikviterními alergeny, podle možností také s profesními alergeny), vyšetření plicní, otorinolaryngologické, podle potřeby kožní. Dále se využívají reexpoziční a eliminační testy, nespecifický bronchoprovokační test a bronchoprovokační testy specifické, provedené buď v podmínkách nemocničního zařízení s podezíraným alergenem nebo jako reexpoziční test přímo na pracovišti postiženého. V diagnostice profesionální AR jsou velmi užitečné rinoprovokační testy (= nazální provokační testy) se specifickými alergeny z pracovního prostředí. Provádějí se metodou aktivní přední rinomanometrie, u níž se hodnotí změny průtokové rychlosti a nosních odporů po inhalaci podezírané noxy. Komplexní posouzení s využitím údajů ze zdravotnické dokumentace nemocného je nezbytné. Součástí procesu je žádost o posouzení pracoviště oddělením hygieny práce příslušné hygienické stanice, případně dodání zajištěných vzorků škodlivin z pracoviště k provedení specifického bronchoprovokačního (rinoprovokačního) testu. Specifické pro obor nemocí z povolání – pracovního lékařství je povinné hlášení nemoci z povolání po stanovení diagnózy profesionálního AB a AR.

Posuzování profesionality alergických onemocnění dýchacích cest Jako pro každou nemoc z povolání, tak i pro alergická onemocnění dýchacích cest, posuzované z hlediska profesionality, platí dva základní požadavky: 1) stanovení přesné diagnózy nemoci odpovídající citaci v Seznamu nemocí z povolání, 2) potvrzení pracovních podmínek, za nichž onemocnění posuzované z hlediska profesionality může vzniknout. Diagnózu stanoví klinické pracoviště, posudek o pracovních podmínkách vypracovává na žádost hygienik práce místně příslušné hygienické stanice, případně s dodáním zajištěných vzorků škodlivin z pracoviště k provedení specifického provokačního testu. Stanovení diagnózy profesionálního astmatu, kdy je nutné vyhledat a označit jediný, resp. převažující vyvolávající alergen, má svá četná úskalí, vyplývající z množství problémů a omezení. K nim patří především tyto skutečnosti: • Jako profesní alergeny mohou působit škodliviny odlišných imunologických a fyzikálně-chemických vlastností, z nichž některé nejsou navíc dosud přesně definovány. • Jednotlivé složky pracovního prostředí mívají komplexní alergogenní efekt, jindy z řady důvodů není možné označit a vybrat jedinou škodlivinu zodpovědnou za vznik zdravotních obtíží. • Na postižené pracovníky působí vedle škodlivin z pracoviště soubor faktorů životního prostředí, příčinných či podpůrných, jejichž podíl je nezbytné zvažovat a zkoumat při rozhodování o možné profesionalitě onemocnění. Pokud je vliv neprofesionálních faktorů shledán jako rozhodující, není možné hlásit nemoc z povolání. K nejčastějším a nejzávažnějším příčinným faktorům neprofesionálního charakteru patří domovní a bytové alergeny (domácí roztoči, zvířecí alergeny, plísně), alergeny zevního životního prostředí (pyly, venkovní plísně), případně léky, potraviny a potravinová aditiva. Jako podpůrný fak-

Krok č. 1: podezření na profesionální příčinu podle anamnézy (expoziční – eliminační test) Krok č. 2: alergologické prick testy: pozitivní ➤ krok č. 3: specif. IgE – pozitivní ➤ stanovení diagnózy nemoci z povolání – negativní ➤ stanovení diagnózy nemoci z povolání negativní ➤ krok č. 3: specif. IgE – pozitivní ➤ stanovení diagnózy nemoci z povolání – negativní ➤ krok č. 4 Varianta kroku č. 2 (pokud nelze provést prick testy): specif. IgE: pozitivní ➤ stanovení diagnózy nemoci z povolání negativní ➤ krok č. 4 (3): specifický bronchoprovokační test – pozitivní ➤ stanovení diagnózy nemoci z povolání – negativní ➤ nejde o nemoc z povolání Varianta kroku č. 2 (nelze provést prick testy ani IgE): specifický bronchoprovokační test – pozitivní ➤ stanovení diagnózy nemoci z povolání – negativní ➤ nejde o nemoc z povolání Schéma 1: Algoritmus diagnostických metod u podezření na profesionalitu při stanovené diagnóze bronchiálního astmatu a alergické rinitidy. 99

tor vzniku astmatu a dalších alergických onemocnění dýchacích cest působí především kuřáctví, a to aktivní i pasivní, znečištění zevního ovzduší (oxid siřičitý, oxidy dusíku, ozón), znečištění vnitřního prostředí (oxid uhelnatý a uhličitý, oxidy dusíku, formaldehyd, diizokyanáty…), vliv infekcí (především virové infekce dýchacích cest). Podstatu diagnostického postupu shrnuje schéma 1. I když je dán určitý, v současnosti velmi podrobný algoritmus vyšetření, je v diagnostice profesionality astmatu nezbytné postupovat vždy individuálně s ohledem na daný stav nemocného, na jeho pracovní podmínky, způsob expozice a na řadu dalších okolností.

Metodika a sledovaný soubor Náš soubor tvoří 112 nemocných, jimž bylo v letech 1994–2000 Klinikou nemocí z povolání Fakultní nemocnice v Hradci Králové hlášeno profesionální bronchiální astma a/nebo profesionální alergická rinitida. Kromě věkového složení souboru, zastoupení nemocných podle pohlaví a údajů o kouření byla pozornost soustředěna zejména na výskyt jednotlivých profesí a výrobních odvětví a s tím související přehled alergenů, potvrzených jako etiologické agens. Byl proveden rozbor použitých vyšetřovacích metod a vyhodnoceno jejich využití. Zjišťován byl i podíl přítomnosti dalších alergických projevů profesionálního charakteru, přítomnost jiných alergických onemocnění v osobní anamnéze před nástupem do alergogenního prostředí a také údaje o výskytu alergických onemocnění v rodinné anamnéze. Dále byly sledovány údaje o délce trvání obtíží před odesláním pacientů k odbornému vyšetření, o délce expozice do ohlášení nemoci z povolání, údaje o případné invaliditě v důsledku profesionálního AB a o dalším vývoji onemocnění po pracovním přeřazení. Všichni nemocní se podrobili celkovému vyšetření na klinice nemocí z povolání, zahrnujícím odběr anamnézy včetně podrobné pracovní anamnézy, objektivní fyzikální vyšetření, komplex laboratorních vyšetření. Funkční vyšetření plic zahrnovalo nespecifický bronchoprovokační test, bronchodilatační test, popřípadě specifický bronchoprovokační (rinoprovokační) test s podezíraným alergenem.

Výsledky Za uvedené sedmileté období 1994–2000 bylo prostřednictvím Kliniky nemocí z povolání FN v Hradci Králové ohlášeno celkem 112 onemocnění. 1. Samostatná alergická rinitida byla zjištěna u 28 nemocných, tj. u 25 %. 2. Samostatné bronchiální astma jsme hlásili u 41 nemocných (36,6 %). 3. Bronchiální astma v kombinaci s alergickou rinitidou, resp. konjunktivitidou bylo hlášeno u 43 nemocných (38,4 %). 100

Pokud jde o zastoupení nemocných podle pohlaví, v souboru významně převažují ženy (3:1), což je dáno především profesní strukturou s převahou zaměstnanosti žen v těch odvětvích, kde je výskyt AB tradičně nejvyšší: potravinářství (především zpracování mouky), textilní průmysl, zemědělská výroba i zdravotnictví. Celkově bylo hlášeno profesionální AB, resp. AB současně s AR u 61 žen (72,6 %) a 23 mužů (27,4 %) a samostatná AR u 22 žen 78,6 %) a 6 mužů (21,4 %). Průměrný věk v celém souboru nemocných v době hlášení nemoci z povolání činil 39 let (18–61, SD ± 10,8). Nejpočetněji byly zastoupeny v souboru AR shodně věkové skupiny 31–40 a 41–50 let, v souboru AB, resp. AB + AR, výrazně převažovala věková skupina 41–50. Kouření cigaret ve své osobní anamnéze uvedlo celkem 36 osob, tj. 32 % souboru. Ve skupině žen kouřilo 29 % osob, ve skupině mužů 43 % osob. Nejpočetnější profesní skupinu v celém souboru tvoří tradičně dělníci zpracovávající mouku (22 % osob ze souboru). Následují pracovníci v textilním průmyslu (17 %) a ošetřovatelé skotu (15 %). Početné zastoupení mají rovněž zdravotníci, a to především zdravotní sestry (8 %), dále dělníci v rostlinné výrobě, ošetřovatelé drůbeže, dělníci ve výrobě plastů a montážní dělníci v kovovýrobě. Výčet profesí a přehled o jejich zastoupení v souboru přináší tabulka 1. Z alergenů, které nejčastěji zapříčinily profesní AB či AR, je na prvním místě moučný prach (u 24 % onemocnění), dále textilní prach (15 % onemocnění), kravské epitelie (14 % onemocnění) a rostlinný prach – prach sena, slámy, prach ze stodol… (9 %). Z chemických škodlivin byly kromě dezinfekčních prostředků ve zdravotnictví jako vyvolávající alergen zjištěny především ty, u nichž dochází k uvolňování izokyanátů. Výčet alergenů uvádí tabulka 2. Pokud jde o použité vyšetřovací metody, ve skupině samostatné AR bylo onemocnění nejčastěji diagnostikováno pomocí specifického nazálního provokačního testu (29 %) nebo potvrzením pozitivity eliminačního a reexpozičního testu (rovněž 29 %). U části nemocných byla prokázána pozitivita intradermálního testu, u další části současně pozitivita intradermálního testu s pozitivitou specifických protilátek třídy IgE. Ve skupině osob s AB a AB v kombinaci s AR je situace jiná, nejčastěji byla diagnóza nemoci z povolání stanovena pomocí pozitivity intradermálních testů, za současné pozitivity eliminačního a reexpozičního testu – šlo o 40 % osob. U 23 % nemocných byl pro stanovení diagnózy využit specifický bronchoprovokační test. U části nemocných jsme se v diagnostice mohli opřít pouze o pozitivitu eliminačního a reexpozičního testu, dále o současnou pozitivitu intradermálních testů a pozitivitu specifických IgE nebo o izolovanou pozitivitu specifických IgE. Současnými kožními alergickými projevy profesionálního původu trpělo celkem 8 % osob v souboru. Těmto pacientům byly proto hlášeny dvě nemoci z povolání způsobené jednou noxou. Neprofesionálním kožním alergickým one-

mocněním trpělo ve skupině AR 18 % osob a ve skupině AB a AB + AR 17 % osob. Celkem bylo některou kožní alergií postiženo 28 nemocných z celého souboru, tj. 25 %. Dřívější neprofesionální alergická onemocnění v osobní anamnéze byla zjištěna celkem u 24 % osob. Ve skupině osob s izolovanou AR se jednalo o 32 % nemocných, ve skupině osob s AB, resp. AB+AR o 21 % nemocných. Pacienti uváděli většinou polékovou kožní reakci nebo polinózu, která se v době vzniku nemoci z povolání již klinicky neprojevovala. Nebyla prokázána statisticky významná závislost mezi pozitivitou či negativitou osobní alergologické anamnézy a věkem nemocných v době vzniku nemoci z povolání (p = 0,329). Naopak bylo zjištěno, že pozitivní osobní anamnéza má vliv na délku expozice profesnímu alergenu: ve skupině nemocných s preexistujícím alergickým onemocněním v osobní anamnéze došlo k vývoji profesního astmatu či rinitidy v průměru po pracovní expozici 6,9 ± 6,0 roku, zatímco ve skupině osob s negativní osobní anamnézou po expozici 12,6 ± 10,5 roku. Tento rozdíl je statisticky významný (p = 0,037). Tab. 1: Přehled profesí u pacientů s hlášeným bronchiálním astmatem a/nebo alergickou rinitidou (%). zpracovatelé mouky, pekaři textilní dělníci, švadleny ošetřovatelé skotu zdravotní sestry dělníci v rostlinné výrobě ošetřovatelé drůbeže, dělníci v čistírně peří montážní dělníci v kovovýrobě dělníci ve výrobě plastů elektromechanici ostatní

22 17 15 8 5 5 4 4 3 17

Tab. 2: Alergeny, které vyvolaly bronchiální astma a/nebo alergickou rinitidu (%). mouka prach bavlny, lnu a ostatní textilní prach kravské epitelie seno, sláma, další rostlinný prach dezinfekční prostředky diizokyanáty drůbeží epitelie latexové rukavice spalné produkty kalafuny dřevěný prach ostatní

24 15 14 9 7 6 4 6 2 2 14

Tab. 3: Délka trvání pracovní expozice do hlášení nemoci z povolání. do 1 roku 2–5 let 6–10 let 11–15 let 16 let a více let Celkem

AR počet osob % 7 25,0 8 28,5 5 17,9 5 17,9 3 10,7 28 100,0

AR + AB počet osob % 11 13,1 20 23,8 14 16,7 10 11,9 29 34,5 84 100,0

Legenda: AB – bronchiální astma; AR – alergická rinitida

Pokud jde o délku expozice vyvolávajícímu alergenu do vyslovení podezření na profesionální etiologii, případně do ohlášení nemoci z povolání, lišila se u jednotlivých případů často velmi výrazně: v souboru osob s profesionální AR činila nejkratší doba expozice 21 dní (u dělnice v kovovýrobě, v kontaktu s chladicí emulzí Cimstar), nejdelší 36 let (u traktoristy exponovaného zemědělským alergenům). Průměrná délka expozice byla 7,5 roku (SD ± 8,6). Nejpočetnější skupinu tvoří nemocní, u nichž bylo onemocnění zjištěno po 2–5leté expozici danému profesnímu alergenu (29 % nemocných), resp. po délce trvání expozice do 1 roku (25 %). V souboru nemocných s AB a AB+AR byla průměrná doba expozice alergenu delší, a sice 12,5 roku (SD ± 10,8). V této skupině jsou v největším počtu zastoupeny osoby s expozicí delší než 16 let (34,5 % nemocných). Nejkratší doba expozice zde činila jeden týden (u dělnice ve výrobě plastů), nejdelší expozice byla 42 let (u traktoristy – krmiváře s alergií na zemědělské alergeny). Diference mezi průměrnou délkou expozice u samostatné alergické rinitidy a u bronchiálního astmatu a jeho kombinace s rinitidou není statisticky významná (p = 0,099). Situaci dokumentuje tabulka 3. Nejdelší průměrná doba pracovní expozice byla zjištěna u textilního prachu (19,6 ± 10,6 roku), nejkratší u diizokyanátů (0,46 ± 0,9 roku). Tento rozdíl je statisticky významný (p = 0,004). Délka trvání obtíží do vyšetření na klinice nemocí z povolání: V souboru s izolovanou AR byla nejkratší doba 18 dní (u výše zmíněné dělnice v kovovýrobě v kontaktu s chladicí emulzí), nejdelší 10 let (u fotografa vystaveného působení derivátům parafenylendiaminu obsaženým ve vyvíjecí lázni a u traktoristy – krmiče exponovaného zemědělským alergenům). Průměrná délka trvání obtíží byla 2,3 roku (SD ± 2,5). Nejpočetnější skupinu představují nemocní, u nichž obtíže trvaly do ohlášení nemoci z povolání nejvýše jeden rok (54 %). V souboru nemocných s AB a AB+AR byla nejkratší doba trvání obtíží jeden měsíc (u několika nemocných, kde vyvolávajícím alergenem byly sláma, sušený vaječný bílek, izokyanáty, dezinfekční prostředky), nejdelší doba činila 21 let (u ošetřovatelky skotu, u níž vyšetření s průkazem přecitlivělosti na kravskou srst a prach ze šrotu bylo provedeno až po 20 letech trvání zdravotních potíží!). Průměrná délka trvání obtíží zde byla 3,5 roku (SD ± 3,8). Pro hodnocení dalšího vývoje respiračního alergického onemocnění po pracovním přeřazení byly použity pouze údaje o subjektivních obtížích pacientů sdělené při kontrole a výsledky kontrolního spirometrického vyšetření. Ve skupině nemocných s AR došlo s výjimkou jediného pracovníka u všech nemocných k pracovnímu přeřazení. Toto opatření vedlo u 43 % pracovníků k úplnému vymizení projevů rinitidy a k možnosti vysazení protialergické léčby. Ke zlepšení při pokračující medikamentózní léčbě došlo u 32 % nemocných, u 21 % pacientů se stav onemocnění nezměnil. 101

Ve skupině nemocných s AB a AB + AR alergické obtíže zcela vymizely u 20 % osob, ke zmírnění obtíží za současné protialergické léčby došlo u 48 % osob. Beze změny zůstal stav u 25 % nemocných, ke zhoršení obtíží i přes pracovní přeřazení došlo u 6 % osob. Byla zjištěna statisticky významná souvislost mezi délkou trvání nemoci v době hlášení a jejím dalším vývojem – k vymizení či zmírnění obtíží došlo významně častěji u osob s kratší dobou trvání obtíží. Pokud se týká dalšího pracovního uplatnění pacientů po ohlášené profesionální rinitidě, zaznamenali jsme zřetelně příznivější situaci než u skupiny osob s profesionálním astmatem: Ve skupině nemocných s AR celkem 46 % osob zůstalo v pracovním poměru u původního zaměstnavatele, a to po určité úpravě pracovních podmínek nebo změně pracovního místa. Vhodnou práci u jiného zaměstnavatele nalezlo 36 % pacientů, dva nemocní (7 %) pobírali invalidní důchod pro obecnou nemoc, dva nemocní (7 %) byli nezaměstnaní a u jedné pacientky se údaj o dalším osudu nepodařilo získat. Ve skupině pacientů s AB a AB+AR zůstalo u původního zaměstnavatele 36 % osob, práci u jiného zaměstnavatele získalo 32 % osob. Dlouhodobě nezaměstnáno bylo 14 % osoba dalších 10 % pobíralo plný invalidní důchod pro nemoc z povolání.

Diskuse Náš soubor 112 osob s respiračním alergickým onemocněním představuje pouze část nemocných, vyšetřených za dané období na Klinice nemocí z povolání FN v Hradci Králové s diagnózou suspektního profesionálního bronchiálního astmatu. Ze zkušeností vyplývá, že zhruba u 40 % takto posuzovaných pacientů se vůbec nejedná o alergické onemocnění, 35 % nemocných trpí alergickým onemocněním neprofesionálního původu a pouze asi 25 % tvoří nemocní, u nichž je stanovena diagnóza profesionálního bronchiálního astmatu či alergické rinitidy. Podíl profesionálního astmatu a alergické rinitidy na výskytu bronchiálního astmatu v populaci obecně se v porovnání s celosvětovými, a především evropskými, čísly neliší. Pohybuje se podle různých pramenů mezi 5–15 % (7, 21). Lee udává výskyt profesního astmatu u 4–9 % dospělých astmatiků v Singapuru a dalších rozvinutých zemích (15). Youakim udává přinejmenším 10% výskyt profesního astmatu v Kanadě (24). Montanaro odhaduje, že u 2–15 % nemocných s astmatem je potvrzena zřetelná profesionální příčina (19). Pokud jde o zastoupení nemocných podle pohlaví, podle mezinárodně platného dokumentu GINA (30) celkově v populaci není rozdíl v incidenci výskytu astmatu u mužů a u žen, s výjimkou dětského věku do 10 let, kdy je astma častější u chlapců. U profesního astmatu a AR je v našem souboru výrazně častější výskyt u žen, a to vůči mužům v poměru 3:2, nebo 102

dokonce 3:1, což odráží i situaci celostátní a je dáno již zmíněnou profesní strukturou v odvětvích s tradičně nejčastějším výskytem profesionálních alergických onemocnění (2,26). Brhel při hodnocení výskytu profesionálního astmatu v ČR zjistil, že 66 % postižených nemocných jsou ženy (5,26). Studie autorů McDonalda a spolupracovníků zpracovávající údaje o hlášeném profesním astmatu ve Velké Británii v letech 1989–1997 naopak uvádí vyšší počet postižených mužů, a to nejvýrazněji ve věku 45 let a vyšším, kde počet nemocných mužů byl dvojnásobný než počet žen (17). Podobné údaje o převaze mužů v souboru postižených astmatiků se objevují v dalších britských studiích. Údaj o věku nemocných v době vzniku a hlášení nemoci z povolání je závažný zejména tím, že onemocnění nejčastěji postihuje pracovníky v produktivním věku kolem 40 let. Tato skutečnost nepříznivě ovlivňuje jak životní situaci samotných pracovníků, tak jejich zaměstnavatele a celou společnost, neboť možnosti dalšího pracovního uplatnění v prostředí odpovídajícím zdravotnímu stavu postižených jsou výrazně omezeny. Brhel zjistil, že PA u pracovníků v ČR vzniká nejčastěji ve věku 33–44 let. Kopferschmitt-Kubler nalezl u souboru nemocných s profesním astmatem průměrný věk 36 let (SD ± 13 let) (14). Kouření cigaret neovlivňuje vznik profesního astmatu přímo, často však je důležitým podpůrným faktorem vzniku nemoci a působí jako významný spouštěč exacerbace astmatických obtíží Podle GINA (27,30) aktivní kuřáctví může zvýšit riziko vzniku profesního astmatu, jestliže je kuřák vystaven kontaktu s některými profesními chemickými látkami. Pokud jde o výčet nejčastějších profesí s výskytem astmatu a alergické rýmy, uvedená situace se v průběhu celého sledovaného období v zásadě nemění, souhlasí s celostátní statistikou (9,26) i s čísly celoevropskými, kde převažují pekaři, ošetřovatelé hospodářských zvířat a textilní dělníci, i když v řadě vyspělých zemí Evropy jsou v pořadí postižených profesí v posledních letech častěji na prvním místě uváděni především dělníci ve výrobě plastů, exponovaní diizokaynátům (1,20). Karjalainen uvádí výskyt astmatu vyvolaného moučným a obilným prachem a živočišnými alergeny celkem u 60 % pracovníků s ohlášeným profesním astmatem ve Finsku (11). Rovněž Kopferschmitt-Kubler (14) označuje za nejvíce ohroženou profesní skupinu pekaře (23,9 % sledovaného souboru), dále pracovníky ve zdravotnictví (12 % nemocných), malíře a natěrače (9,1 % nemocných). Meredith nalezl ve skupině nemocných s PA ve Velké Británii 17 % pracovníků exponovaných diizokyanátům (18). Přestože celosvětově obecně přibývá nových alergenů, zejména chemické povahy, nejčastějším alergenem zůstává mouka – v tom se situace ve východních Čechách a v celé České republice v průběhu let rovněž nemění (2,5,26). Důležitý je poznatek, že u alergenu mouky závisí do značné míry

na míře prašnosti, tzn. na koncentraci moučného prachu v ovzduší pracoviště. Chemické alergeny typu diizokyanátů představují skupinu značně agresívních látek, u nichž ke vzniku obtíží dochází většinou velmi brzy, často již po několikadenní, případně po několikahodinové expozici. Waddell označuje toluendiizokyanát a formaldehyd za dvě nejčastější průmyslově široce užívané chemikálie způsobující bronchiální astma (23). Moscato a spolupracovníci uvádějí diizokyanáty jako etiologické agens ve 41,6 % případů PA, zatímco moučný prach „pouze“ u 19,8 % případů (20). V nesourodé skupině alergenů chemické povahy, které byly v našem souboru příčinou celkem 22 % onemocnění astmatem či rinitidou, se nejčastěji jednalo o dezinfekční prostředky používané ve zdravotnictví (především na bázi glutaraldehydu), a to u 7 % z celkového počtu nemocných. Diizokyanáty byly příčinou u 6 % onemocnění. Stanovení diagnózy astmatu se opírá především o rozbor anamnestických údajů, klinický obraz a o výsledky opakovaného funkčního vyšetření plic doplněného nespecifickým bronchoprovokačním testem. V určitých případech bývá problémem odlišit, zda jde o bronchiální astma nebo o chronickou obstrukční plicní nemoc s projevem chronické bronchitidy a s přítomnou bronchiální hyperreaktivitou. U části nemocných jsou přítomny CHOPN a astma současně. U bronchiálního astmatu se ve většině případů jedná o onemocnění spojené s humorálně zprostředkovanou odpovědí, proto je stanovení přítomnosti IgE důležitým vodítkem při posuzování profesionality onemocnění. Průkaz specifických sérových protilátek podporuje diagnózu profesionálního astmatu, resp. rinitidy, ve vztahu k danému konkrétnímu alergenu (či alergenům), zvláště při současné pozitivitě prick testů, která však není podmínkou. Samotné zjištění pozitivity protilátek IgE bez klinického korelátu alergického onemocnění nelze hodnotit jako nemoc z povolání. Tento nález však může být důvodem pro určité pracovní omezení do budoucna. Přestože specifické provokační testy jsou celosvětově považovány za „zlatý standard“, ze současného písemnictví vyplývá, že ke stanovení diagnózy jsou využívány poměrně zřídka. Například v USA a v Kanadě se provádějí pouze v několika institucích. Ortega a spolupracovníci uvádějí jako překážky v provedení testů nejčastěji nedostupnost vyšetření specifickými inhalačními testy v zařízeních posuzujících profesionalitu onemocnění, nedostatek zkušeností s hodnocením výsledků, problémy s úhradou finančních nákladů a nedostatek potřebných diagnostických alergenů k testování (22). Lee doporučuje provádět specifické inhalační (provokační) testy pouze v případě, kdy je nezbytné stanovit určitý vyvolávající alergen z většího množství podezíraných škodlivin současně, nebo v situaci, kdy není možné u exponovaného pracovníka využít seriál měření vrcholové výdechové rychlosti (PEF) (15). Bernstein zdůrazňuje, že specifické bronchoprovokační testy s diizokyanáty jsou vyhrazeny pro situace, kdy dia-

gnózu nelze potvrdit na pracovišti, mohou být však prováděny pouze zkušeným personálem ve specializovaných centrech (1). V České republice provádí specifické bronchoprovokační a nazální provokační testy několik pracovnělékařských pracovišť, a to buď samostatně, nebo ve spolupráci s plicním, případně alergologickým oddělením. Reexpoziční test na vlastním pracovišti nemocných provádíme spíše výjimečně, a to především z důvodu značné časové zátěže vyšetřujícího personálu, v menší míře z důvodů organizačních. Pokud je technicky proveditelný simulovaný reexpoziční (provokační) test ve fakultní nemocnici, dáváme mu na našem pracovišti přednost před vyšetřením v terénu. Význam kožních alergických projevů nelze podceňovat: kromě častého výskytu kontaktního alergického ekzému se setkáváme s alergickou urtikarií a s recidivami Quinckeho edému. Kožní projevy mohou být prvním důvodem, který pacienty vede k návštěvě praktického a později odborného lékaře. Při podrobnějším vyšetření dermatologem bývá odhalena také přítomnost různě intenzivních respiračních příznaků, které jsou nakonec posouzeny jako nemoc z povolání, a to samostatně, nebo současně s profesionální kožní alergologickou diagnózou. Cílený dotaz odborníků dermatologů na případné respirační obtíže je proto nezbytnou součástí anamnézy. Pokud jde o osobní anamnézu, jsou předchozí projevy atopie faktorem, který má vliv na vznik pozdějších alergických onemocnění s reakcí I. typu (časné přecitlivělosti) v souvislosti s expozicí profesnímu alergenu (21). Těchto onemocnění je podle našich zkušeností i podle údajů z literatury většina. Převážná část odborníků v této souvislosti důrazně doporučuje, aby osoby se známou atopií byly podrobně informovány o riziku vývoje profesionálního respiračního onemocnění a podrobovaly se pravidelně zdravotním prohlídkám. Část onemocnění, kde se jedná o jiné imunopatologické mechanismy (reakce buněčné imunity) nebo o vzácně se vyskytující profesní astma z neimunologických příčin (tzv. iritativní astma), není při svém vzniku a vývoji ovlivněna přítomností atopické konstituce (1,3,16). Novotná dokládá, že iritačně indukované astma nevzniká u atopiků častěji než u neatopiků, existuje zde však kauzální vztah mezi úrovní expozice (koncentrací škodliviny v ovzduší) a účinkem (21). Je zřejmé, že délka pracovní expozice do vzniku a hlášení nemoci z povolání závisí na typu alergenu pouze do určité míry a že vznik obtíží v daném období je ovlivněn celým komplexem faktorů, v nichž podstatnější úlohu hrají individuální faktory genetické, imunologický status nemocného, přítomnost dalších onemocnění, faktory zevního prostředí, celková situace daného pracoviště. Obecně lze konstatovat, že u vysoce reaktivních chemikálií dochází k alergizaci organismu a vzniku obtíží výrazně dříve než u ostatních škodlivin. Námi zjištěné průměrné době expozice 12,5 roku u PA odpovídá téměř shodný výsledek konstatovaný Brhelem u souboru nemocných z Jihomoravského kraje (12,8 103

roku). U samostatné rinitidy Brhel zjistil průměrnou dobu expozice 5,1 roku oproti našemu výsledku 7,5 roku (4). Z našich výsledků také vyplývá, že samostatná profesionální alergická rýma se vyvíjí dříve než astma nebo astma v kombinaci s alergickou rinitidou, a to celkově o 5 let (7,5 roku proti 12,5 roku). Celostátní průměr doby expozice u vzniklého PA v České republice byl za období 1991–1998 11,4 roku u mužů a 12 let u žen (5). Naproti tomu celostátní průměrná doba expozice u PAR za sledované období 1996–2000 byla 9,6 roku, tedy delší ve srovnání s výsledky z východních Čech (7,5 roku) a především z jižní Moravy (5,1 roku) (6). Zkušenosti s vývojem profesního astmatu a rinitidy po pracovním přeřazení ukazují, že u většiny nemocných dochází k podstatnému zlepšení či dokonce k vymizení příznaků. Obecně se uvádí, že bronchiální astma z profesních příčin mívá průběh mírnější, nejčastěji jde o intermitentní a lehké perzistující astma (2,20). Tato situace se dále zlepšuje díky uplatňování zásad globální strategie léčby astmatu (30). Moscato (20) konstatuje, že v okamžiku stanovení diagnózy má více než polovina nemocných astma intermitentní nebo perzistující lehké (celkem 52,8 %) a 41,6 % má perzistující středně těžké astma. Novotná a Brhel sledovali údaje za celou Českou republiku do roku 1998 a zjistili u 37 % postižených výrazné subjektivní zlepšení stavu, u 31 % stav beze změny a u 32 % zhoršení obtíží (21). Dykewicz soudí, že pro posouzení trvalého postižení a pracovního omezení způsobeného profesionálním astmatem je optimální doba 2 roky od vyřazení z expozice alergenu, kdy se klinický stav jeví jako stabilizovaný a pacient dosáhl maximálního zlepšení zdravotního stavu (8). Z výsledků je zřejmé, že jedna třetina nemocných má možnost zůstat v pracovním poměru u svého původního zaměstnavatele a je přeřazena na vhodnější pracovní místo nebo je možné upravit pracovní podmínky na původním pracovišti. Další třetina nemocných získá pracovní uplatnění u jiného zaměstnavatele. Zbývající třetina postižených zůstává dlouhodobě nezaměstnána, případně je těmto nemocným přiznán invalidní důchod (pro nemoc z povolání nebo nemoc obecnou). Osoby s izolovanou alergickou rýmou se v porovnání s astmatiky profesionálně uplatňují mnohem snadněji, a to jak u původního zaměstnavatele, tak u dalších zaměstnavatelů. V porovnání se zkušenostmi ze západoevropských zemí se přístup k dalšímu pracovnímu zařazení nemocných s profesionálním astmatem někdy liší: v západní Evropě zůstávají nemocní častěji na původním pracovišti, byť s určitou úpravou pracovních podmínek, zatímco v České republice je takřka 100 % nemocných přeřazeno (2,5,21). Počet osob s profesním astmatem pobírajících invalidní důchod z titulu nemoci z povolání se v porovnání s dříve posuzovaným obdobím let 1984–1993 v další etapě výrazně snížil: v prvně zmíněném období byl invalidní důchod přiznán polovině nemocných s profesním astmatem (z toho 65 % pobíralo plný invalidní důchod a 35 % částečný inva104

lidní důchod), zatímco v současnosti je přiznáván invalidní důchod pouze jedné pětině nemocných s profesním astmatem, v poměru plného a částečného důchodu 1:1 (3). Podobné údaje zjistil také Brhel v Jihomoravském kraji.

Závěr Profesionální bronchiální astma představuje jeden z nejzávažnějších problémů pracovního lékařství. V České republice v roce 2002 poprvé předstihl počet hlášených onemocnění profesním astmatem počet onemocnění pneumokoniózami a dostal se tak na první místo v profesionálních onemocněních respiračního systému. Celoevropská i celosvětová situace je obdobná. Snahou zdravotnických zařízení je a snahou zaměstnavatelů by mělo být zastavit tento dosud vzestupný trend. Je však zřejmé, že přes snahy o kvalitní provádění vstupních a periodických preventivních prohlídek a přes četná pracovnělékařská, technická, technologická a organizační zlepšení na pracovišti počet nových onemocnění astmatem neklesá. Naopak úsilí o včasnou a přesnou diagnostiku profesního astmatu vede k odhalení většího počtu těchto onemocnění, která dosud zůstávala nerozpoznána. Seznam použitých zkratek AB – asthma bronchiale AR – alergická rinitida CHOPN – chronická obstrukční plicní nemoc FN – fakultní nemocnice GINA – Global Initiative for Asthma, Globální iniciativa pro astma (mezinárodní dokument) IgE, IgG – sérové imunoglobuliny třídy E, G PA – profesní astma PAR – profesionální alergická rinitida PEF – Peak Exspiratory Flow, vrcholová výdechová rychlost Poděkování Za statistické zpracování výsledků děkuji panu Mgr. Václavu Bláhovi, CSc.

Literatura 1. Bernstein DI, Jolly A. Current diagnostic methods for diisocyanate induced occupational asthma. Am J Ind Med 1999;36(4):459–68. 2. Boušová K. Incidence onemocnění profesionálním bronchiálním astmatem ve východočeském regionu v letech 1994–1998. Prakt Lék 2000;80(4):200–4. 3. Boušová K, Krčmová I. Profesionální bronchiální astma způsobené diizokyanáty: od teorie k realitě. Pracov Lék 2003;55(3):119–22. 4. Brhel P. Zkušenosti s diagnostikou profesionální alergické rinitidy. Pracov Lék 1999;51(2):82–5. 5. Brhel P, Hassmanová, V, Boušová K. Profesionální astma v České republice. Alergie 2000;2(2):84–9. 6. Brhel P. Profesionální alergická rinitida v České republice. Klin imunol alergol 2001;11(2):10–7. 7. Brhel P, Nakládalová M, Boušová K a kol. Profesionální průduškové astma – doporučený postup diagnostické a léčebné péče (reg.č. o/037/040). Alergie 2001;3(1):75–80. 8. Dykexwicz MS. Occupational asthma: a practical approach. Allergy Asthma Proc 2001;22(4):225–33. 9. Fenclová Z, Urban P a kol. Profesionální onemocnění hlášená v České republice v roce 2000. České pracovní lékařství 2000;2(2):62–7. 10. Holgate ST, Church MK, Lichtenstein LM. Allergy. London:Mosby 2001:388.

11. Karjalainen A, Kurppa K, Virtanen S et al. Incidence of occupational asthma by occupation and industry in Finland. Am J Ind Med 2000;37(5):451–8. 12. Klener P, Brodanová M, Friedmann B, Jirásek V et al.Vnitřní lékařství. Praha: Galén, 1999:949. 13. Kohout J, Nakládalová M. Alergická rinitida jako preastmatický stav. Pracov Lék 2000;52(3):20–2. 14. Kopferschmitt-Kubler MC, Ameille J, Popin E et al. Occupational asthma in France: a 1–yr report of the Observatoire National des Asthmes Professionnels project. Eur Respir J 2002;19(1):84–9. 15. Lee HS, Chee CB. Clinical update on occupational asthma. Am Acad Med Singapore 2001;30(5):546–50. 16. Mapp CE, Boschetto P, Miotto D et al. Mechanisms of occupational asthma. Ann Allergy Asthma Immunol 1999;83(6):645–64. 17. McDonald JC, Keynes HL, Meredith SK. Reported incidence of occupational asthma in the United Kingdom 1989–97. Occup Environ Med 2000; 57(12):823–9. 18. Meredith SK, Bugler J, Clark RL. Isocyanate exposure and occupational asthma: A case – referent study. Occup Environ Med 2000;57(12):830–6. 19. Montanaro A. prognosis of occupational asthma. Ann Allergy Asthma Immunol 1999;83(6):593–6. 20. Moscato G, Dellabianca A, Maestrelli P et al. Features and severity of occupational asthma upon diagnosis: an Italian multicentric case review. Allergy 2002; 57(3):236–42. 21. Novotná B, Brhel P. Profesionální bronchiální astma. Alergie 2000;2(2):120–6. 22. Ortega HG, Weisman DN, Carte DL, Banks D. Use of specific inhalation challenge in the evaluation of workers at risk for ocupational asthma: a survey of pulmonary, allergy and occupational medicine residency training programs in the United States and Canada. Chest 2002;121(4):1323–8.

23. Waddell WJ. Toxicologic considerations in the diagnosis of occupational asthma. Ann Allergy Asthma Immunol 1999;83(6):618–23. 24. Youakim S. Work-related asthma. Am Fam Physician 2001;64(11):1839–48. 25. Alergická rýma a její vliv na astma – kapesní průvodce, ČIPA (WHO 2001), Praha: Jalna, 2002:38. 26. Centrální registr nemocí z povolání, Hygiena práce a nemocí z povolání, SZÚ, Praha (www.szu.cz). 27. Global Initiative for Asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention. National Heart, Lung and Blood Institute. WHO/NHLBI workshop report. National Institutes of Health, Bethesda, Revised 2002:188. Publication No. 02–3659 (www.ginasthma.com). 28. K některým výsledkům mezinárodního sympozia o alergické rinitidě. Medicína 2002;IX(3):10–1 (zdroj: J Allergy Clin Immunol 2001;108 (Supp. to No 5). 29. Occupational Asthma: www.asmanet.com 30. Seznam nemocí z povolání. Sbírka zákonů České republiky, Příloha k Nařízení vlády č. 290/95, částka 76:3968–78. 31. Strategie diagnostiky, prevence a léčby průduškového astmatu v České republice, Česká iniciativa pro astma, Praha, 1996:79.

MUDr. Karin Boušová, Ph.D., Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Klinika nemocí z povolání, 500 05 Hradec Králové. e-mail: [email protected]

105

106

ONEMOCNĚNÍ Z AZBESTOVÉHO PRACHU A TREND JEJICH VÝVOJE U EXPONOVANÝCH PRACOVNÍKŮ V LETECH 1951–2003 Valerie Hassmanová Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové: Klinika nemocí z povolání Summary: Diseases caused by asbestos dust and the trend of their development in exposed workers in 1951–2003. The paper summarizes the principal information on the properties and effects of asbestos and a survey of diseases which can be recognized in the Czech Republic as occupational diseases according to the List of Occupational Diseases (Government Order 290/1995 Coll.).The paper lists possible diagnostic means and criteria for evaluation and presents a survey of developmental trends of the disease in exposed workers of the plant under study. In the period of years 1951–2003, 87 cases of occupational diseases were reported. The first asbestosis occurred in 1955, the first lung cancer in a patient with a previously reported asbestosis in 1962, the first pleural mesothelioma in 1976, the first asbestosis of the lung with concurrent lung cancer in 1981, and the first pleural hyalinosis in 1999. A very serious fact is that 56, i.e. 64,4 % of diseases, particularly lung cancer and mesothelioma, were diagnosed after the termination of working in risk and many years of latency. A long-term folow-up of workers, even of those with a short exposure, is therefore necessary.

Key words: Asbestos; Occupational diseases; Developmental trends

Souhrn: V práci jsou shrnuty základní informace o vlastnostech a účincích azbestu a přehled nemocí, které je možno v ČR uznat jako nemoc z povolání ve smyslu Seznamu nemocí z povolání (Nařízení vlády 290/1995 Sb). Jsou uvedeny diagnostické možnosti a kritéria pro posuzování a je podán přehled a vývojové trendy onemocnění u exponovaných pracovníků sledovaného závodu. Za období 1951–2003 bylo hlášeno 87 nemocí z povolání. První azbestóza v roce 1955, první plicní rakovina u nemocného s dříve hlášenou azbestózou v roce 1962, první mezoteliom pleury v roce 1976, první azbestóza plic se současnou rakovinou plic v roce 1981 a první hyalinóza pleury v roce 1999. Závažné je, že 56, tj. 64,4 % nemocí, zejména rakovina plic a mezoteliom, bylo diagnostikováno po skončení práce v riziku a mnohaleté latenci. Proto je nezbytné dlouhodobé sledování i krátkodobě exponovaných pracovníků. Věnováno památce doc. MUDr. Pavla Hassmana, CSc.

Úvod 1. Přehled o formách, vlastnostech a účincích azbestu Azbest (asbestinon, ř. = nespalitelný) nebo též osinek je přírodní vláknitá odrůda několika metamorfovaných křemičitanů obsahujících hořčík, často i dvojmocné železo, hliník, eventuálně některé jiné stopové prvky (42). Z celé řady minerálních forem azbestu uvádíme nejčastější: aktinolitový, amfibolový (krocidolit – krokydolit – vločkový či vlněný kámen – modrý azbest nebo též riecbekitový azbest medicínsky nejzávažnější), antofylitový, serpentinový (chrysotil – technicky nejvýznamnější) a tremolitový azbest. Jednotlivé druhy se liší barvou, délkou vláken, chemickým složením, bodem tání a indexem světelného lomu. Základní vlastností azbestu je vysoká pevnost v tahu (tensile strength) ve směru podélné osy, nehořlavost a tepelná odolnost, vysoký elektrický odpor, schopnost pohlcovat ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):107–120

zvuk a chemická inertnost. Kromě chrysotilu, který je slabě rozpustný v HCl, jsou všechny ostatní v HCl nerozpustné. Ložiska azbestu jsou především v Austrálii a JAR (zejména krocidolit), dále v Botswaně, Číně, Finsku, Itálii, Kanadě, Zambii (dříve Severní Rhodesii), Zimbabwe (dříve Jižní Rhodesii), na Filipinách, Korsice a Uralu. Z některých jmenovaných zemí se k nám dovážel. V mineralogii se za vlákno považuje částice s délkou větší nebo rovnou 5 µm a poměrem délky ku šířce větším nebo rovným 3:1. Azbest s vlákny delšími než 8 µm (textilní azbesty) se používal k výrobě nehořlavých tkanin pro ochranné oděvy, filtrů pro čistící zařízení a papíru. Azbest s vlákny o délce 2–8 µm k výrobě azbestových nebo azbestocementových materiálů (dříve střešní krytina eternit, odpadní roury, dlaždice, brzdová a spojková obložení) a krátkovláknité azbesty s vlákny kratšími než 2 µm k výrobě izolačních materiálů (výplň prostorů mezi kajutami lodí, a dokonce paradoxně do filtrů respirátorů plynových masek a cigaret). 107

Obr. 1: Azbestová tělíska.

Obr. 2: Azbestová tělíska.

O používání azbestu mluvíme v minulém čase proto, že pro známý fibrogenní, ale především karcinogenní účinek se většina západních zemí od práce s ním odklonila. I v ČR byl Výnosem hlavního hygienika s platností od 1.11.1989 (64) stanoven nejvyšší počet respirabilních vláken/cm3 vzduchu (původní gravimetrické metody byly doplněny metodou počítání vláknitých částic). Pro materiály s obsahem azbestu do 10 % 1 vlákno a koncentrace prachu 4 mg/m3, pro materiály s obsahem azbestu nad 10 % 1 vlákno a koncentrace prachu 2 mg/m3 vzduchu. Další je Výnos hlavního hygienika z 27. 2. 1990 § 11b (65) o ustanoveních platných pro práci s azbestem a výrobky a materiály azbest obsahující, zákaz dovážení a používání krocidolitu. Náležitosti hlášení prací s azbestem konkretizovala vyhláška MZČR 89/2001, která byla zrušena vyhláškou 432/2003 Sb. (66). Základní biologický účinek azbestu spočívá v indukci fibrogenity a karcinogenity. Fibrogenní účinek vede k zánětlivé reakci, reparačnímu procesu a následnému jizvení. Karcinogenní účinek vyplývá z genové mutace DNA zasažených buněk, molekulárních změn, proliferace postižených buněk a jejich změn v buňky nádorové. Vláknitá forma azbestu způsobuje, že vlákna o šíři zlomků mikronů a mnohonásobně větší délce mohou být zachycena již v horních dýchacích cestách, ale mohou prouděním vzduchu proniknout až do alveolů. Přestože se některá lámou, jejich vláknitá struktura zůstává zachována. Předpokládá se, že vlákna kratší než 7 µm a jejich fragmenty jsou fagocytovány. Delší vlákna jsou retinována v plicní tkáni. Existuje předpoklad, že čím déle je vlákno retinováno, tím závažnější je jeho biologický účinek. To do určité míry vysvětluje, že především pro nádorová onemocnění je významnější doba latence než délka expozice. V některých pracích je uvažován počátek expozice, v jiných, včetně naší, její konec. Po inhalaci zůstávají v plicní tkáni po určitou dobu vlákna holá (naked bodies), během několika měsíců se kolem nich vytváří mukopolysacharidový obal a vznikají

tzv. azbestová tělíska (obr. 1, 2). Obal je zpočátku transparentní, později se zbarvuje žlutě až hnědě podle množství v něm uloženého hemosiderinu. Protože tělíska nejsou v tkáni pevně fixována, mohou se dostat na povrch výstelky bronchů, do bronchiálního sekretu i do horních cest dýchacích. Nalezena mohou být i za desítky let po skončení expozice azbestu (4,7,11,39). Vzhledem k popsanému účinku je azbest nahrazován jinými nosnými materiály organickými i anorganickými a řadou doplňujících látek. V námi sledovaném závodě jsou z nosných materiálů medicínsky významná vlákna čedičová (MMMF – man made mineral fibres) a skelná, z doplňujících materiálů pak především fenolformaldehydové pryskyřice. I na naší klinice jsme se účinkem MMMF v jiném závodě zabývali (14) a celosvětových informací přibývá. Klimczak (23) popisuje granulomatózní plicní onemocnění u 39letého muže, který pracoval se skelným vláknem. Podrobným vyšetřením byla u něho jiná onemocnění (alergická alveolitida, sarkoidóza, silikóza, azbestóza, tuberkulóza, metastatický proces) vyloučena. Berrigan popisuje signifikantní nárůst rakoviny dýchacích cest u pracujících se skelnou vatou a skelným vláknem (3). Sami jsme se u pracujících se skelným vláknem (např. výroba laminátů) s podobnými nálezy zatím nesetkali. Detailnější informace by přesáhly rámec této studie.

108

2. Nemoci z povolání způsobené prachem obsahujícím azbest V Seznamu nemocí z povolání (Nařízení vlády 290/1995 Sb.) jsou v Kapitole III. pod položkou 2, body a,b,c,d, nemoci plic, pohrudnice a pobřišnice způsobené prachem azbestu (63). Jedná se o následující onemocnění: • Azbestóza – RTG znaky od změn s2, t2, u2 a výše dle Mezinárodní klasifikace pneumokonióz – International classification of radiographs of pneumoconioses 1971,

respektive 1980, ILO – International Labour Office Geneva (62). • Hyalinóza pohrudnice s poruchou plicních funkcí (do seznamu zařazena nově). • Mezoteliom pohrudnice nebo pobřišnice. • Rakovina plic ve spojení s azbestózou nebo hyalinózou. Zásady diagnostiky onemocnění – Pracovní anamnéza – charakter práce, délka expozice eventuálně doba latence od jejího začátku či skončení, jiná expozice fibrogenním nebo karcinogenním vlivům. – Subjektivní obtíže, kouření (vztah především k bronchogennímu karcinomu). – Fyzikální interní nález (krepitace, pleurální výpotek, ascites…). – RTG hrudníku formátu 35x35 cm – azbestóza – posouzení ve srovnání s klasifikací ILO (nepravidelné lineární

stíny -s-, středně hrubé stíny -t-, hrubé skvrnité až nepravidelné opacity -u- o četnosti 1,2,3). Maximum změn je zejména na počátku onemocnění bazálně. Pro uznání nemoci z povolání se vyžaduje četnost 2 a výše všech typů změn. – CT a především HRCT (hight-resolution computed tomography) k diagnostice azbestózy, ale především u podezření na maligní onemocnění obou typů a pro průkaz hyalinóz. – Funkční vyšetření plic – restrikční ventilační porucha a snížení difuzní plicní kapacity pro CO2 (především u čisté azbestózy). – Bronchoskopie – nález azbestových tělísek a obraz chronické deformující bronchitidy. – Bronchoalveolární laváž (BAL) s cytologií. – Cytologie pleurálního výpotku nebo ascitu. – Biopsie plic, ale především pleury. – Jiná vyšetření (chromozomové aberace, antineutrophil cytoplasmatic antibodies – ANCA).

Vlastní pozorování

Obr. 3: Navažování suché směsi před lisováním.

Obr. 4: Vyndávání azbestu z vozíků.

1. Informace o situaci v podniku Ve východních Čechách vznikl v roce 1950 závod, ve kterém se zpracovával azbest pro výrobu textilních výrobků, těsnících a třecích materiálů, především brzdového a spojkového obložení. V době největšího rozvoje v něm bylo zaměstnáno kolem 500 osob. I když nelze doložit, které druhy azbestu a v které době se používaly, lze podle údajů pamětníků předpokládat, že nejvíce byl zastoupen chrysotil, ale bylo možné se setkat i s modrým azbestem – krocidolitem. Tento předpoklad podporuje i fakt, že závod O.K. vznikl jako odštěpný závod podstatně starší továrny ve Středočeském kraji, kde se ještě po 2. světové válce přimíchával krocidolit a teprve od 70.

Obr. 5: Doprava azbestu do nakladače mykacího stroje.

Obr. 6: Obsluha mykacího stroje.

109

let minulého století se začal výlučně používat chrysotil. Z vlastních zkušeností můžeme potvrdit, že při opakovaných návštěvách závodu jsme se s modrým azbestem v některých provozech setkávali. V 50. a 60. letech byly koncentrace prachu s podílem azbestu nad 10 % s normou do 2 mg/m3 vzduchu na všech pracovištích významně překračovány a ve vysoce rizikových provozech, jakým byla například mykárna, dosahovaly až 192 mg/m3 vzduchu. Extrémní hodnoty prašnosti byly ještě v roce 1972, a to i na pracovištích konečné kontroly a expedice, kde dosáhly až 112 mg/m3 vzduchu. V dalších letech docházelo ke zlepšování pracovních podmínek a výměně starých nevyhovujících strojů za nové. Výsledkem bylo, že se koncentrace prachu s obsahem azbestu pohybovaly v normě nebo v hodnotách, které většinou nepřesahovaly 10 mg/m3 vzduchu (54). Stav některých pracovišť v 60. letech minulého století je dokumentován na obrázcích 3,4,5,6. V roce 1993 se změnou vlastníka závodu výroba azbestových materiálů skončila a byla nahrazena technologií s novými nosnými a doplňujícími materiály, jak jsou zmiňovány v přehledu o účincích azbestu.

Statistické zhodnocení provedla RNDr. Eva Čermáková z Oddělení výpočetní techniky Ústavu lékařské biofyziky LF UK v Hradci Králové. Zpracování bylo provedeno statistickým softwarem NCSS 2004 Statistica, pro porovnání byl použit dvouvýběrový t-test a analýza rozptylu s následným mnohonásobným porovnáním Fisherovým LSD testem. V tabulkách jsou uvedeny četnosti, průměry, v závorkách minimum a maximum. Práce je shrnutím informací o vývoji profesionálních onemocnění let během dlouhodobého sledování a čerpá především z vyšetření na naší klinice. 3. Výsledky Za celé období sledování bylo naší klinikou hlášeno 87 nemocí z povolání u 40 mužů a 47 žen. • 1955 – první azbestóza • 1962 – první rakovina plic při dříve diagnostikované azbestóze • 1976 – první mezoteliom pleury • 1981 – první rakovina plic se současnou azbestózou • 1999 – první hyalinóza pleury Příklady RTG obrazů profesionálních onemocnění

2. Soubor a metodika Zaměstnanci bývalého závodu O.K. jsou na klinice nemocí z povolání sledováni od roku 1951. Kromě obvyklé zdravotnické dokumentace jsou archivovány zhotovované RTG snímky pro možnost porovnání vývoje, a to i po skončení práce v riziku. Protože v posledních letech přibývá bývalých pracovníků vyšších věkových kategorií, kteří se na naši kliniku obtížně dostavují, úzce spolupracujeme s lékaři plicní ambulance v Rychnově nad Kněžnou. V pravidelných lhůtách jsou nám zasílány informace o zdravotním stavu a RTG dokumentace dispenzarizovaných osob. Ostatní stále kontrolujeme na klinice.

RTG 1: Azbestóza. 110

RTG snímek 1 – Azbestóza Azbestóza u 52letého dělníka po 25 letech práce při výrobě brzdového obložení zjištěná v době, kdy ještě pracoval. Zemřel za 7 let po ohlášení nemoci z povolání v důsledku srdečního selhání při ICHS. Byl kuřák. RTG snímek 2 – Azbestóza Azbestóza u 55leté dělnice po 36 letech práce v textilních provozech včetně mykárny, zjištěná v roce 1992 – za 1 rok po skončení rizikové práce. Nález trvale progreduje, dokumentovaný snímek je z poslední kontroly v roce 2004. Nemocná přes opakovaná vysvětlování kouří 8–10 cigaret denně.

RTG 2: Azbestóza.

RTG snímky 3, 4, 5 – Hyalinóza pohrudnice s rozsáhlými kalcifikacemi Kalcifikovaná hyalinóza (pleuritis calcarea) byla zjištěna u 74letého hlídače v mísírně krmiv, který 40 let pracoval v závodě na výrobu střešní krytiny – eternitu – při vykládání azbestu z vagónů. Starší RTG dokumentaci se nepodařilo získat, takže určení počátku zjištěných změn nebylo možné. Ve sputu odebraném při bronchoskopii byla nalezena azbestová tělíska, přestože od skončení rizikové práce uplynulo více jak 10 let. Bronchoskopické vyšetření prokázalo chronickou deformující bronchitidu. Nekouřil. Nemocný zemřel v 84 letech, RTG obraz nedoznal dalších změn. RTG snímky 6, 7 – Mezoteliom pleury (před punkcí pleurálního výpotku a po ní)

Mezoteliom pleury u 60letého úředníka po 28 letech práce v závodě bez přímé expozice azbestu. Onemocnění bylo diagnostikováno krátce před odchodem do starobního důchodu. Zemřel za 10 měsíců od stanovení diagnózy. Nekouřil. RTG snímky 8, 9, 10 – Rakovina plic Rakovina plic (histologicky malobuněčný karcinom) zjištěná při preventivní prohlídce v roce 1981 u 54letého nekouřícího technologa výroby třecích materiálů s 24letou nepřímou expozicí azbestu. Nález byl asymptomatický, patrný pouze na bočném snímku a tomogramech. RTG známky azbestózy nebyly, ani v histologickém obrazu nebyl obraz intersticiální fibrózy. Léčba byla chirugická a cytostatická. Nemocný zemřel za 18 let od stanovení této diagnózy nikoliv v důsledku profesionálního onemocnění, ale na generalizovaný Grawitzův tumor.

RTG 3: Kalcifikovaná hyalinóza pleury.

RTG 4: Kalcifikovaná hyalinóza pleury.

RTG 5: Kalcifikovaná hyalinóza pleury.

RTG 6: Mezoteliom pleury před punkcí. 111

RTG obr. 7: Mezoteliom pleury po punkci.

RTG obr. 8: Ca plic – normální nález na ZP snímku.

RTG obr. 9: Ca plic patrný v oblasti Th páteře.

RTG obr. 10: Ca plic na bočných tomogramech.

Přehled všech naší klinikou hlášených profesionálních onemocnění uvedený v tab. 1 a grafech 1,2,3 rozdělujeme do období let 1951–1975 a 1976–2003. Důvodem pro tento přístup je počátek sledování zaměstnanců závodu v roce 1951 a významný nárůst maligních onemocnění počínaje rokem 1976, kdy byl diagnostikován první mezoteliom pleury. U skupiny plicních rakovin uvádíme v tabulce tuto diagnózu bez současné azbestózy (Kapitola III, položka 2d Seznamu nemocí z povolání). Je to proto, že prakticky u všech nemocných byly pouze diskrétní (nebo žádné) známky postižení plicního intersticia, které nebyly kompatibilní s typickými RTG známkami azbestózy. Přesto jsme se, v souhlasu s celosvětovými informacemi o vysoké incidenci plicní rakoviny u osob exponovaných azbestu, přiklonili k uznání její profesionální etiologie, i když to není v úplné shodě s citací ve zmiňovaném seznamu.

Jestliže do roku 1975, tedy za 25 let existence závodu, bylo hlášeno 19 nemocí z povolání (22 % souboru), pak za dalších 27 let jich bylo 68 (78 % souboru), z nich pak celá polovina (34) za posledních 10 let (1994–2003). V prvním období dominují azbestózy, kterých bylo 16 (84,2 %) u 15 žen a jednoho muže. Rakovina plic při předcházející azbestóze byla diagnostikována u tří nemocných (15,8 %). Zásadně jiná je situace od roku 1976. Za dobu 27 let, tedy jen nepatrně delší než je první období, bylo hlášeno 36 maligních onemocnění (52,9 %) s významnou převahou u mužů – 28. Azbestóza byla u 21 osob (30,9 %), u tří nemocných (4,4 %) došlo za řadu let od diagnostikování azbestózy k vývoji rakoviny plic. Onemocnění nově zařazené do seznamu nemocí z povolání – hyalinóza nebo hyalinóza s azbestózou, byla u osmi osob (11,8 %). V tabulce 2 je uveden průměrný věk 82 nemocných (není započítáno pět osob, u kterých byla nemoc z povolá-

112

Tab. 1: Přehled nemocí z povolání hlášených v letech 1951–2003.

Azbestóza Ca plic Mezoteliom Hyalinóza Azb+hyal Azb+pozdní Ca Celkem

Muži 1

1951–1975 Ženy Celkem 15 16

2 3

1 16

3 19

Muži 7 16 9 2 1 2 37

1976–2003 Ženy Celkem 14 21 4 20 7 16 4 6 1 2 1 3 31 68

Muži 8 16 9 2 1 4 40

1951–2003 Ženy Celkem 29 37 4 20 7 16 4 6 1 2 2 6 47 87

Graf 1: Nemoci z azbestu 1951–2003.

Graf 2: Nemoci z azbestu 1951–1975. 113

Graf 3: Nemoci z azbestu 1976–2003. Tab. 2: Věk nemocných s hlášenou nemocí z povolání.

Azbestóza Nádorová onemocnění plic nebo pleury Hyalinóza Hyalinóza+azbestóza Celá sestava Ca plic Mezoteliom Azbestóza s pozdější rakovinou

Celá sestava prům. věkové počet věk rozmezí 43 58,3 (36–83)

věkové rozmezí (36–67)

počet

12

Muži prům. věk 56,6

počet

31

Ženy prům. věk 59

věkové rozmezí (39–83)

31

66

(43–85)

20

65,1

(43–79)

11

67,8

(55–85)

6 2 82 17 14

70,8 65 62,3 65,2 67

(64–78) (61–69) (36–85) (53–77) (43–85)

2 1 35 13 7

66,5 69 62,3 65 65,1

(64–69)

73 61 62,3 66 68,9

(67–78)

(36–79) (53–75) (43–79)

4 1 47 4 7

(39–85) (60–77) (55–85)

6

63,5

(61–66)

4

62,5

(61–65)

2

65,5

(65–66)

věk bez pacientů hlášených port mortem ní hlášena post mortem). V celé sestavě byl 62,3 roku (36–85 let), vzácně shodný pro obě pohlaví. Statisticky významně odlišný je věk u rakoviny plic, mezoteliomu a hyalinózy ve srovnání s čistou azbestózou (hladina významnosti p ≤ 0,05). Mezi diagnózami maligních onemocnění není ve věku statisticky významný rozdíl. Podle charakteristiky všech šesti nemocných s azbestózou, u nichž došlo k pozdějšímu vývoji rakoviny plic (n = 6), byl jejich věk 63,5 roku (61–66), expozice 27,3 let (6–45), doba latence 9,8 roku (1–24) a věk v době úmrtí 63,7 (61–66). Až na jednoho nemocného všichni zemřeli ve stejném roce, kdy byla rakovina diagnostikována. Délka expozice azbestu, jak ji demonstruje tabulka 3, je pro celou sestavu 21,5 roku (1–45 let). Její delší doba u mužů je nepochybně ovlivněna delší expozicí u mezoteliomů. U mužů je 24,6 roku (7–40 let), u žen pouze 11,7 roku (1–24 let). Mezi jednotlivými diagnózami se délka expozice statisticky neliší. 114

V převažujícím zaměstnání v textilních provozech, jak je uvedeno v tabulce 4, je zřejmé vyšší zastoupení žen, a to jak pro skupinu azbestóz (20 žen), tak mezoteliomů (6 žen). Vysvětlením je podstatně vyšší zaměstnanost žen v textilních dílnách (skárna, přádelna, pletárna). Na pracovištích se smíšenou expozicí a u výroby třecích materiálů převažují muži. Po všechna desetiletí byli pracovníci upozorňováni na nebezpečí kouření, protože jeho negativní vliv se s účinky azbestového prachu sumuje. Podle ústního sdělení doc. MUDr. Navrátila, CSc. bylo v některých zemích, především v Anglii, známé kuřáctví kontraindikací práce v riziku azbestu. V našem souboru bylo 27 kuřáků včetně tří bývalých kuřáků (31 % souboru) s významnou převahou mužů. Nezpochybnitelná spoluúčast kouření je evidentní především u mužů s plicní rakovinou, jak demonstruje tabulka 5. Kuřáctví jsme u plicních rakovin brali v úvahu vždy, a to jak pokud jde o jeho délku, tak i intenzitu. U významných ex-

Tab. 3: Délka expozice v riziku azbestového prachu.

Azbestóza Nádorová onemocnění plic nebo pleury Hyalinóza Hyalinóza+azbestóza Celá sestava Ca plic Mezoteliom Azbestóza s pozdější rakovinou

Celá sestava prům. rozmezí počet expozice expozice r. r. 43 22 (5–45)

Muži prům. rozmezí expozice expozice r. r. 24,9 (6–45)

počet 12

počet 31

Ženy prům. rozmezí expozice expozice r. r. 20,9 (5–38)

36

20,6

(1–40)

25

22,8

(7–40)

11

15,4

(1–32)

6 2 87 20 16

27,5 10,5 21,5 21,9 18,9

(3–40) (5–16) (1–45) (12–36) (1–40)

2 1 40 16 9

38 16 24,1 21,9 24,6

(36–40)

22,3 5 19,4 21,8 11,7

(3–34)

(6–45) (12–36) (7–40)

4 1 47 4 7

(1–38) (15–32) (1–24)

6

27,3

(6–45)

4

26,8

(6–45)

2

28,5

(24–33)

Tab. 4: Převažující pracoviště. Azbestóza Mykárna Textil Třecí materiály Smíšená Celkem

M 2 2 4 4 12

Ca plic

Ž M+Ž M 2 3 18 20 1 3 7 4 10 14 8 21 43 16

Mezoteliom

Ž M+Ž M 3 1 2 1 1 5 2 2 10 6 4 20 9

Ž M+Ž M 6

7 2 7 16

1 7

Azbestóza Celkem +hyalinóza Ž M+Ž M Ž M+Ž M Ž M+Ž 1 1 6 6 4 5 1 1 5 30 35 10 4 14 1 19 13 32 4 6 1 1 2 40 47 87

Hyalinóza

1 1 2

Tab. 5: Údaje o kouření.

Azbestóza Ca plic Mezoteliom Hyalinóza Azbestóza+hyalinóza Azbestóza s pozdější Ca plic

Muži 8 16 9 2 1 4

Celá sestava Ženy 29 4 7 4 1 2

Celkem 37 20 16 6 2 6

40

47

87

Celkem

Muži 4 12+1 2

Kuřáci cigaret Ženy 1 1 0+1 0+1

Celkem 5 13+1 2+1 0+1

4 4 22+1 = 55 % 2+2 = 8,5 % 24+3 = 31 % mužů žen celé sestavy

Poznámka: za + je počet bývalých kuřáků pozic azbestu jsme se ale i u kuřáků přiklonili k uznání nemoci z povolání. Detailní rozbor množství vykouřených cigaret neuvádíme proto, že se v průběhu dlouholetého sledování anamnestické údaje měnily. Z údajů, které jsme měli k dispozici (n = 8), vyplývá, že počet kouřených cigaret byl 15,6 (5–20) a doba kouření 37,8 (30–50) let. Pokud se údaje alespoň přibližně blížily realitě, zdá se, že počet kouřených cigaret byl nižší, než je obvyklé u dělnických profesí osob stejného věku. V tabulce 6 je uvedena doba latence do diagnostikování nemoci z povolání. Nejdelší je sice u hyalinózy a hyalinózy s azbestózou, domníváme se ale, že v těchto případech je ovlivněna tím, že onemocnění bylo zařazeno do seznamu nemocí z povolání až s účinností od roku 1996. Mnohem

významnější je velice dlouhá doba latence u maligních onemocnění, především u mezoteliomů žen, kde je průměrně 21,7 roku (4–38 let). Statisticky významně je odlišná doba latence mezi karcinomy a mezoteliomy (hladina významnosti p ≤ 0,05). Z tohoto pohledu je sledování bývalých pracovníků v riziku azbestu i po opuštění rizika, ať z důvodu změny zaměstnání nebo odchodu do důchodu, nutností. To podporují i údaje v tabulce 7, ve které je uvedeno, že v námi sledovaném souboru byl převažující počet profesionálních onemocnění (56, tj. 64,4 % souboru) hlášen až po skončení expozice. Z tabulky 8 je zřejmé, že ke konci roku 2003, kdy byla práce uzavírána, žilo 24 nemocných (27,6 % souboru) průměrného věku 72,2 roku (56–84). Jedná se o 15 osob 115

Tab. 6: Přehled onemocnění diagnostikovaných po skončení rizikové práce, délka expozice a doba latence. Celá sestava

Muži

Ženy

DG A Ca Me Hy Hy+A A Ca Me Hy Hy+A A Ca Me Hy Hy+A

Počet 20 15 13 6 2 4 11 7 2 1 16 4 6 4 1

Věk 65.8 (55–83) 67.5 (56–77) 68.8 (43–85) 70.8 (64–78) 65 (61–69) 62.3 (60–63) 68 (56–75) 66.9 (43–79) 66.5 (64–69) 69 66.6 (55–83) 66 (60–77) 71.2 (55–85) 73 (67–78) 61

Expozice 26.3 (6–45) 20.3 (12–32) 17.7 (1–40) 27.5 (3–40) 10.5 (5–16) 32.8 (9–45) 19.8 (12–26) 24 (7–40) 38 (36–40) 16 24.7 (6–38) 21.8 (15–32) 10.3 (1–24) 22.3 (3–34) 5

Doba latence 10.3 (2–27) 9.9 (1–19) 16.1 (4–38) 17.2 (1–40) 19 (8–30) 9.25 (2–27) 10.4 (4–19) 11.3 (5–19) 4.5 (1–8) 30 10.5 (2–22) 8.8 (1–14) 21.7 (4–38) 23.5 (12–40) 8

Pozn: později diagnostikované karcinomy jsou zahrnuty mezi azbestózami (nehlásí se nová nemoc z povolání) Legenda: A – azbestóza; Ca – Ca plic; Me – mezoteliom; Hy – hyalinóza Tab. 7: Přehled doby latence u jednotlivých diagnóz. A Ca Me Hy Hy+A Celkem

Roků Muži Ženy Muži Ženy Muži Ženy Muži Ženy Muži Ženy Muži Ženy

Celkem muži+ženy

1–5 3 4 1 1 1 1 1 – – – 6 6 12

6–10 – 6 5 1 2 1 1 – – 1 8 9 17

s azbestózou (12 žen a 3 muži), všech osm nemocných s pleurální hyalinózou a jednu nemocnou s plicní rakovinou. Jak vyplývá z tabulky 9, zemřelo ke konci stejného období 63 nemocných (72,4 %). Podle průběžně doplňovaných informací byla příčinou úmrtí všechna profesionální maligní onemocnění. Jedinou výjimkou byl muž s plicní rakovinou, který zemřel za 18 let po jejím zjištění na generalizovaný Grawitzův nádor. Údaje o této skupině shrnuje tabulka 10. Je evidentní, že u nemocných s maligními onemocněními byla doba přežití velice krátká. U ostatních nemocných nebylo profesionální onemocnění (azbestóza) v příčinné souvislosti s úmrtím.

Diskuse Zmínky o prvním používání azbestu pocházejí již z doby kolem roku 2500 př. n. l. v nynějším Finsku, kde se 116

11–15 – 2 4 2 3 – – 1 – – 7 5 12

16–20 – 3 1 – 1 1 – 1 – – 2 5 7

21–25 – 1 – – – – – 1 – – – 2 2

26–30 1 – – – – 1 – – – – 1 1 2

nad 30 – – – – – 2 – 1 1 – 1 3 4

Celkem 4 16 11 4 7 6 2 4 1 1 25 31 56

používal do pletiva dřevěných chatrčí. O negativním vlivu na zdraví otroků pracujících v azbestových dolech se zmiňuje Plinius. Další doklady jsou z doby zániku Pompejí, kdy řada zemřelých byla nalezena v rubáších obsahujících azbest. Informace pocházejí i z pera Marca Pola a z doby vlády Petra I. Velikého, kdy v Rusku byla založena první továrna na výrobu azbestových tkanin. V 19. století n. l., v roce 1897, upozorňoval na dechové obtíže dělníků v přádelně bavlny a azbestových vláken Netoliczky (36). V roce 1900 pozorovali škodlivý účinek azbestu Murray a Montague v Anglii a pak již následovala řada pozorování v dalších zemích. První vědecké studie se objevují ve 30. letech minulého století a v roce 1930 se v Anglii uznává azbestóza jako nemoc z povolání. U nás pochází první práce z roku 1950 (9). Na dalším rozvoji diagnostiky onemocnění z azbestu má zásluhu především v minulém roce zemřelý, celosvětově uznávaný

Tab. 8: Věk žijících nemocných. Diagnóza

Celá sestava Počet Věk 15 73,5 (56–84) 1 66 6 72,3 (69–79) 2 65,5 (62–69) 24 72,2 (56–84)

A Ca Hy Hy+A Celkem

Muži

Ženy

Počet 3

Věk 69,3 (56–80)

2 1 6

69 69 68,7 (56–80)

Počet 12 1 4 1 18

Věk 74,5 (66–84) 66 74 (69–79) 62 73,6 (62–84)

Tab. 9: Věk v době úmrtí bez ohledu na jeho bezprostřední příčinu. Diagnóza

Celá sestava Počet Věk 22 70,5(37–85 19 65,3(53–77) 16 66,7(44–86)

A Ca Me Hy Hy+A Celkem

63

67,5 (37–86)

Muži

Ženy

Počet 5 19 9

Věk 59,8(37–71) 65(53–75) 64, 6 (44–80)

Počet 17 6 7

Věk 73,6 (61–85) 66,3 (60–77) 69,4 (56–86)

33

64,1 (37–80)

30

71,2 (58–86)

Pozn.: Ve skupině karcinomů je zahrnuto 6 nemocných s azbestózou a pozdním vývojem karcinomu. Tab. 10: Údaje o nemocných zemřelých v důsledku nemoci z povolání. Celá sestava Muži Ženy

DG Ca Me Ca Me Ca Me

Počet 24 16 18 9 6 7

Věk 62,6 (41–77) 66,2(43–85) 63 (45–75) 64,1 (43–79) 61,5 (41–77) 68,9(55–85)

Expozice 23,4 (6–45) 18,9(1–40) 23,2(6–45) 24,6 (7–40) 24 (15–33) 11,7 (1–24)

Doba latence 9,4 (1–19) 16 16,1(4–38)13 9,6 (2–19) 11 11,3 (5–19) 7 8,8 (1–14) 5 21,7(4–38)

Věk úmrtí 65,1 (53–77) 66,7(44–86) 64,7 (53–75) 64,6 (44–80) 66,3 (60–77) 69,4 (56–86)

Délka onem 0,4 (0 -1) 21 0,5 (0 -1) 14 0,4 (0 -1) 15 0,4 (0 -1) 7 0,5 (0 -1) 6 0,6 (0 -1) 7

Pozn.: U doby latence a délky trvání onemocnění jsou za závorkou uvedeny počty, ze kterých se charakteristiky počítaly. odborník doc. Navrátil, s kterým jsme měli čest řadu let spolupracovat (29,30,34,35). O onemocněních způsobených azbestem široce pojednává práce Vejlupkové (55). Existenci hyalinních změn na pleuře, zejména nástěnné, popsal u exponovaných azbestem již v roce 1939 Wedler (56). U nás se jim opět věnoval Navrátil (31,32). Změny bývají častěji na vnitřní straně parietální pleury, ale mohou zasahovat i na pleuru viscerální, zejména v interlobiu. Skutečnost, že hyalinóza pohrudnice se může objevovat i bez profesionální expozice azbestu, dokumentuje ve své práci Pivec (43). V lokalitě umístěné ve směru převládajících větrů od závodu O.K. byly tyto změny pozorovány u běžné populace, aniž by vedly k subjektivním obtížím. Kromě hyalinóz menšího rozsahu (podle Navrátila hyalinosis simplex) se mohou objevovat hyalinózy s difuzním ztluštěním pleury, které zasahuje do interlobárních a interlobulárních štěrbin (podle Navrátila hyalinosis complicata). Těmto nálezům často předchází benigní, ale mnohdy recidivující, pleurální výpotek. Zatím otevřenou zůstává otázka, do jaké míry jsou tyto změny predispozicí pro vznik mezoteliomu, i když se tato souvislost nabízí (2,40). Práce Jovera-Saenze uvádí, že jedi-

ným rentgenologickým nálezem u později, při torakotomii diagnostikovaném mezoteliomu byly unilaterální pleurální plaky a ztluštění (21). Pokud jde o souvislost s jinými onemocněními, je možno citovat práci Korholy a spol. (24), kteří zjistili, že u nemocných z rizika azbestu s angiograficky ověřenými změnami na koronárních arteriích byly u 35 % přítomny pleurální plaky. Zastoupeni byli muži i ženy a riziko se zvětšovalo s věkem. Možnosti diagnostiky pleurálních hyalinóz se zlepšují díky HRCT. Jsou popisována pleurální ztluštění různého tvaru, do nich zasahující „comet tail“ bronchovaskulárních struktur, okrouhlé atelektázy, opacity připomínající matné (mléčně zkalené) sklo, „shagg“ silueta srdce a nepřesně konturované bránice (9,12,41,44,52). U nás je tato diagnostika předmětem probíhající studie Lebedové a spol. z pražské kliniky nemocí z povolání. Z ní vyplývá doporučení, aby za hyalinózu byla považována ztluštění šíře nad 3 mm, délky po obvodu nad 50 mm a kraniokaudálním rozměru nad 80 mm. I z naší kliniky vyšla řada prací, z nichž významné jsou studie o pleurálních změnách v obrazu počítačové tomo117

grafie (15,17). Další prací je studie sledující vývoj onemocnění z azbestu za období 40letého sledování (18), na kterou současná práce navazuje. Přínosnou je práce, která vznikla na základě požadavku Fondu národního majetku ČR, v níž je stanovena perspektiva vývoje onemocnění z azbestu v závodě O.K. do roku 2015. Důvodem pro ni byla skutečnost, že v roce 1993, kdy se v závodě O.K. s azbestem přestalo pracovat, nepřevzal nový majitel závazky za onemocnění vzniklá v souvislosti s expozicí azbestu. Proto se, bohužel, několik nemocných realizace odškodnění podle v té době platné vyhlášky (67) nedožilo, i když jsme posudky o návrhu jeho výše vystavili. Na základě naší studie vytvořil Fond národního majetku pro formálně existující závod O.K. finanční rezervu, ze které jsou nároky současných nemocných realizovány. Ve zkrácené verzi byla práce publikována (16). V současnosti jsou nově hlášená onemocnění odškodňována a váže se k nim vyhláška 440/2001 Sb. 68). Je třeba upozornit, že o vystavení posudku o odškodnění může požádat pouze nemocný (nebo organizace zodpovědná za škodu) a jeho realizace musí být ukončena během života. Na odškodnění onemocnění hlášených post mortem nevzniká pozůstalým právní nárok. Důvodem, který vede k dalším studiím o účinku azbestu, je především jeho nesporný vztah k neoplaziím (61). Praxe i experimentální studie ukazují, že nejzávažnější je v tomto směru krocidolit. Je otázkou, do jaké míry se vedle azbestových vláken uplatňují i stopové prvky, které se v hornině mohou vyskytovat. První zmínka o kombinaci azbestózy s plicní rakovinou je v práci Lynche a Gibbona v roce 1935, vztah k mezoteliomu poprvé popsal McCaughey v roce 1958. U nás podal první celkový pohled na incidenci rakoviny u osob pracujících s azbestem Navrátil v roce 1966 (28) a následně v řadě dalších prací (31,32). První mezoteliom pleury v naší republice popsal Dobiáš v roce 1972 (10). Na naší klinice byl poprvé zjištěn v roce 1976 a od tohoto roku výskyt onemocnění narůstá. Větší studie o jeho epidemiologii z roku 1981 (30) a naše současná práce tento trend potvrzují. Vysvětlením nárůstu maligních onemocnění je zřejmě dobíhající doba latence potřebná k jejich vývoji u dříve exponovaných pracovníků. Potěšující je studie Montanara a jeho spolupracovníků z řady evropských zemí z roku 2003, která obsahuje zjištění, že v Evropě je sice stále ještě mírný nárůst výskytu mezoteliomů, ale v některých státech již dochází k pozvolnému poklesu. Ten zřejmě souvisí se zákazem používání azbestu a ubýváním nově exponovaných osob (25). O obou maligních onemocněních je veliké množství prací. Kishimoto a spol. (22) analyzovali 120 nemocných s plicní rakovinou, kteří byli exponováni azbestu 2–60 let s průměrnou dobou expozice 27 roků. Věk nemocných byl 47–87 let, průměrně 70 let. Rakovina plic byla zjištěna za 15–69 let od počátku expozice azbestu s průměrnou dobou 43 let. U 35 nemocných byla spojena s azbestózou, u 77 s pleurálními změnami. U 32 nemocných byl vyšetřen i druh azbestových vláken. U 14 se jednalo o krocidolit, 118

u 10 o amosit a u 8 chrysotil. Kouřilo 40 nemocných. Další práce Badorreye a spol. (1) uvádí, že z 82 nemocných plicní rakovinou mělo expozici azbestu 25 osob. U 13 byla detekována přítomnost azbestových tělísek v bronchoalveolární laváži nebo v plicní tkáni. Současně bylo sledováno 25 osob s expozicí azbestu bez známek pleuropulmonálního onemocnění. I u nich byla azbestová tělíska nalezena. Pokud jde o vztah expozice azbestu k rakovině plic a kouření, je evidentní, že prevalence rakoviny závisí na množství vykouřených cigaret. U malých azbestových expozic je výskyt podobný výskytu v populaci, u vyšších významně stoupá. Osinubi a spol. (38) uvádějí, že azbestová expozice ve spojení s kouřením významně zvyšuje riziko plicní rakoviny a připívá i k rozvoji intersticiální fibrózy. Tytéž zkušenosti má i Winter a spol (59). Ze 100 pracovníků exponovaných azbestu v průměru 21 let byly v průběhu 4 let sledování nalezeny RTG známky azbestózy u 21 osob, u 58 byly přítomny pleurální změny. Pravidelně kouřilo 15 osob, 61 bylo bývalými kuřáky a 24 nikdy nekouřilo. Byla zjišťována častější laryngitida především u současných kuřáků a jednou byl diagnostikován karcinom laryngu. Vztah azbestu k laryngeálnímu karcinomu popisuje i Browne (6), ale nebyl podložen větším klinickým materiálem. Pro velkou proudovou rychlost dýchaného vzduchu a nepříznivé podmínky pro impakci a penetraci vláknitých materiálů se hrtan jeví jako orgán málo vhodný pro záchyt a účinek azbestových vláken. Přesvědčivé nejsou ani studie o manifestaci maligních onemocnění jiných orgánů ve vztahu k azbestu. Především je diskutována otázka nádorů zažívacího traktu. Spolykaná azbestová vlákna a jejich penetrace zřejmě nejsou pro zcela odlišné vlastnosti žaludeční sliznice a výstelky dýchacích cest rozhodujícím faktorem pro karcinogenitu (5,26,58). Stejně tak je velice diskutabilní kauzální vztah azbestu k non Hodgkinovu lymfomu, o kterém uvažuje Weisenburger (57). Mezoteliom je agresivní nádor velice špatně reagující na chemoterapii i aktinoterapii. Pro pozdní diagnostiku většinou léčebný chirurgický zákrok nepřichází v úvahu. Studie vesměs uvádějí, že nemocní umírají do 1 roku od stanovení diagnózy (20,60), a i naše práce to dokládá. Stejně tak naše studie ve shodě se zahraničními potvrzují vývoj onemocnění po dlouhé době latence a neovlivnění jeho výskytu kouřením (13). Bianchi u 557 maligních mezoteliomů zjistil dobu latence od prvního kontaktu s azbestem do úmrtí 14–75 let (průměrně 48,8 roku). U 67 % zemřelých byla prokázána azbestová tělíska (4). Častější je mezoteliom pleury, ale jsou popsány i mezoteliomy peritonea (47). Hypotéz snažících se vysvětlit průnik azbestu na peritoneum je více. Pravděpodobnost přestupu spolykaných vláken na peritoneum je malá (5). Nabízí se možnost účasti lymfatických cest mezi dutinou hrudní a břišní přes bránici nebo možnost přímého průniku azbestových vláken z brániční pleury na peritoneum. Stejně jako jsou popsány případy neprofesionálních hyalinóz, jsou i zmínky o neprofesionálním mezoteliomu souvisejícím s expozicí azbestu. Rom (46) sledoval 38leté-

ho muže s mezoteliomem pleury, který mezi svými 8–17 léty bydlel a navštěvoval školu v blízkosti továrny, ve které se zpracovával amfibolový azbest. Z vlastní praxe můžeme vzpomenout na stejné onemocnění 51leté ženy, která v letech 1950–1955 žila v bytě, který byl svými okny obrácen do dvora závodu O.K., kde se v inkriminované době ještě významně používal krocidolit. Tento neprofesionální mezoteliom byl diagnostikován v roce 1983 a nemocná zemřela za 5 měsíců od stanovení diagnózy. Vedle nejzávažnějšího krocidolitu a chrysotilu se uplatňují i jiné azbesty. Roggli a spol. (45) analyzovali plicní parenchym u 312 nemocných mezoteliomem a u 166 z nich nalezli tremolit. Neobvyklý je mezoteliom u 73letého dělníka, který 35 let pracoval v textilní továrně na zpracování vlny, kde těsnící kroužky strojů obsahovaly azbest (8). Mnohem vzácnější mezoteliom peritonea popisuje Rosenthal (47). Na naší klinice jsme jej nepozorovali. Na základě současných znalostí je o něm možné mezi našimi nemocnými uvažovat u ženy, která byla azbestu exponována 16 roků a ve svých 47 letech onemocněla azbestózou. V roce 1971, za 14 let po skončení expozice, se u ní objevil hemoragický ascites. Vzhledem k velice rychlému průběhu a skutečnosti, že se sekce neuskutečnila, nebyla diagnóza stanovena. V souvislosti s nárůstem maligních profesionálních onemocnění, jak ukazuje tato práce, jsme se pokusili zjistit, zda se v regionu, kde se námi sledovaný závod nachází, neobjevuje více plicních malignit než u populace v jiných lokalitách. Informaci onkologů spádového oddělení přes jejich maximální snahu nelze použít. V registru hlášených maligních plicních onemocnění řada údajů, včetně údajů o zaměstnání, chybí, takže bližší interpretace není možná a uváděné počty by neměly odpovídající výpovědní hodnotu. Nezpochybnitelnou souvislost azbestu se zhoubnými onemocnění může doplnit dlouhodobé sledování chromozových aberací (48,49,50). Kromě celé řady samostatných autoimunních onemocnění je popsána kombinace silikózy s glomerulonefritidou, vaskulitidou a Wegenerovou granulomatózou (27,37,51). Stanovení antineutrofilních cytoplazmatických protilátek (antineutrophil cytoplasmatic antibodies, ANCA) může u osob exponovaných azbestu diagnostiku doplnit a nabízí se možnost jejich sledování.

Závěr Práce shrnuje onemocnění z azbestového prachu u zaměstnanců závodu, ve kterém výroba azbestových materiálů probíhala 43 let (1950–1993). V období let 1951–2003 bylo hlášeno 87 nemocí z povolání. Za prvních 25 let to bylo pouze 19 onemocnění (22 % souboru), a to 16 azbestóz a tři azbestózy s pozdějším vývojem plicní rakoviny. Dalších 27 let sledování počíná rokem 1976 a představuje hlášení 68 onemocnění (78 % souboru), z nich v po-

sledním desetiletí 34, tedy polovinu. Mezi nimi dominují rakovina plic a mezoteliom pleury (57,3 %). Novým onemocněním, které je zařazeno do seznamu nemocí z povolání až s účinností od roku 1996, je hyalinóza pleury. Zatím byla diagnostikována u osmi nemocných, z toho u dvou ve spojení s azbestózou. Práce potvrzuje prognózu incidence onemocnění z azbestového prachu obsaženou v naší studii z roku 1996. Perspektivně budou v kratším období po skončení práce s azbestem relativně narůstat azbestózy, v delším časovém horizontu je předpokládán menší, ale dlouhodobý výskyt maligních onemocnění. Se zlepšením diagnostiky a po stanovení kritérií pro uznání profesionální hyalinózy se zřejmě bude i její počet zvyšovat. Vzhledem k prokázané dlouhé době latence do manifestace onemocnění je nezbytná dispenzarizace v minulosti i krátkodobě exponovaných osob. Zvlášť důležité je u všech popsaných onemocnění nebo důvodném podezření na ně pátrat po expozici azbestu. Především u maligních onemocnění, zejména u mezoteliomu, jehož incidence je ve srovnání s plicní rakovinou mnohem menší, je nutno možnou příčinnou souvislost s azbestem cíleně hledat. Po stanovení diagnózy je třeba zejména u maligních onemocnění řešit uznání nemoci z povolání v nejkratší možné době, aby byl čas na realizaci nároků nemocného. Uznání nemoci z povolání a vystavení posudku s návrhem bodové výše odškodnění je výlučně v kompetenci příslušných odborných klinických pracovišť oboru nemocí z povolání (pracovního lékařství). Poděkování Za statistické zpracování velice děkuji paní RNDr. Evě Čermákové z Oddělení výpočetní techniky Ústavu lékařské biofyziky LF UK v Hradci Králové. Nemenší dík patří paní Ireně Šulcové z II. interní kliniky a Katedry interních oborů LF UK v Hradci Králové za technickou pomoc a především za prezentaci rentgenové a fotografické dokumentace.

Literatura 1. Badorrey MI, Monso E, Teixido A et al. Frequency and risk of bronchopulmonary neoplasia related to asbestos. Med Clin (Barc) 2001;117(1):1–6. 2. Bandoh S, Fujita J, Fukunaga Y et al. Nodular thickening of interlobar fissures: an early manifestation of malignant mesothelioma: a case report. Jpn J Clin Oncol 2001;31(2):82–5. 3. Berrigan D. Respiratory cancer and exposure to man-made vitreous fiber – a systematic review. Am J Ind Med 2002;42(4):354–62. 4. Bianchi C, Brollo A, Ramani L, Giarelli L. Asbestos exposure in malignant mesothelioma of the pleura: survey of 557 cases. Ind Healh 2001;39(2):161–7. 5. Bolton C, Richards A, Ebden P. Asbestos-related disease. Hosp Med 2002; 63(3):148–51. 6. Browne K, Gee JB. Asbestos exposure and laryngeal cancer. Ann Occup Hyg 2000;44(4):239–50. 7. Capellaro E, Chiesa A, Villari S et al. Asbestos bodies in bronchoalveolar lavage fluid and sputum. Med Lav 1997;88(2):99–107. 8. Colli G, Terzi M, Vinci L, Terzi R, Candura SM. A case of pleural mesothelioma caused unusual occupational exposure to asbestos in the wool industry. G Ital Med Lav Ergon 2001;23(1):18–20. 9. Cvitanovic S, Znaor L, Konsa T et al. Malignant and non malignant asbestos-related pleural and lung disease: 10–year folow up study. Croat Med J 2003; 44(5):618–25.

119

10. Dobiáš J, Navrátil M. Maligní mezoteliom pleury u azbestózy. Pracov Lék 1973; 25:547–58. 11. Dumortier P, Coplu L, Bropucke I, Emri S et al. Erinonite bodies and fibres in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of residents from Tuzkoy, Cappadocia, Turkey. Occup Environ Med 2001;58(4):261– 6. 12. Gevenois PA, de Maertelaer V, Madani A et al. Asbestosis, pleural plaques and diffuse pleural thickening: three distinct beningn responses to asbestos exposure. Eur Respir J 1998;11(5):1021–7. 13. Gilg Soit Ilg A, Bigmon J, Valleron J. Estimation of the past and future burden mortality from mesothelioma in France. Occup Environ Med 1998;55:765. 14. Hassman P, Hassmanová V. Zdravotní stav pracujících závodu na výrobu izolačních materiálů z umělých minerálních vláken typu man- made mineral fibres (MMMF). Pracov Lék 1987;39(7):319–21. 15. Hassman P., Hassmanová V, Heger L. Hodnocení plicích nálezů u pracujících s azbestem opakovaným vyšetřením počítačovou tomografií v odstupu tří let. Pracov Lék 1990;40(5):208–10. 16. Hassman P, Hassmanová V, Strnad L. Prognóza incidence plicních nemocí z povolání u zaměstnanců závodu O.K. po ukončení expozice prachu azbestu na příštích 20 let. Prakt Lék 1998;78(7):479–82. 17. Hassmanová V, Hassman P, Heger L. Hyalinózy pleury u pracujících s azbestem v obraze počítačové tomografie. Lék Zpr LF UK v Hradci Král 1982;27(7–8). 18. Hassmanová V, Hassman P. Onemocnění způsobená azbestovým prachem – zkušenosti za 40leté období sledování zaměstnanců závodu na zpracování azbestu ve východních Čechách. Pracov Lék 1995;47(5):208–14. 19. Holomáň K. K otázce azbestózy na Slovensku. Pracov Lék 1950;2:69–72. 20. Järvholm B, Englud A, Albin, M. Pleural mesothelioma in Sweden: an analysis of the incidence according to the use of asbestos. Occup Environ Med 1999; 56:111–3. 21. Jover-Saenz A, Vila-Justribo M, Salud-Salvia A. Malignant pleural mesothelioma with an unusual radiologic manifestation.An Med Interna 1999;16(7): 354–6. 22. Kishimoto T, Ohnishi K, Saito Y. Clinical study of asbestos – related lung cancer. Ind health 2003;41(2):94–100. 23. Klimczak A, Langfort R, Zych J, Bestry I, Rowinska – Zakrzewska E. Granulomatous lung lesions after occupational exposure to glass fibers. Pneumolog Alergol Pol 2000;68(5–6):273–8. 24. Korhola O, Hiltunen A, Karjalainen A, Martikainen R, Riihimaki H. Association between pleural plaques and coronary heart disease. Scand J Work Environ Health 2001;27(6):420–1. 25. Montanaro F, Bray F, Gennaro V et al. Pleural mesothelioma incidence in Europe: evidence of some deceleration in the increasing trends. Cancer Causes Control 2003;14(8):791–803. 26. Mc Cullagh SF. Is there a risk to health in using asbestocement pipes for the carriage of drinking water? Ann Occup Hyg 1980;23:189–93. 27. Nakajima H, Miyazaki M, Imai N, Yokohawa T, Yamamoto S. A case of silicosis with MPO-ANCA- associated glomerulonephritis and alveolar haemorrhage. Nippon Jinzo Gakkai Shi 2001;43(4):351–6. 28. Navrátil M, Stejskal J, Fingerland A. Výskyt plicní rakoviny při azbestóze. Pracov Lék 1966;18:256–60. 29. Navrátil M, Hassmanová V, Nosál M, Benický L. Vztah mezi azbestózou a příčinami smrti u zemřelých osob z některých československých závodů. Sborník IX, Čs. Sympozia o silikóze. Piešťany 1980. 30. Navrátil M, Hassmanová V. Epidemiologie mezoteliomů pleury a peritonea u pracujících exponovaných azbestu, Stud Pneumol Cechosl 1981;41:404–10. 31. Navrátil M. Azbestóza plic a její komplikace. Praha: Avicenum, 1982:108 s. 32. Navrátil M, Morávková K, Gafronová M. Osud lidí s pleurálními hyalinózami: vztah k přímé a nepřímé expozici azbestu. Pracov Lék 1986;38(10):433–37. 33. Navrátil M, Švandová E, Hruška E, Gafronová M. Vztah mezi expozicí prachu azbestu (chrysotilu) a neoplastickými nemocemi u pracovníků závodu na zpracování azbestu. Pracov Lék 1989;41(4):150–5. 34. Navrátil M, Hassman P, Hassmanová V. Časná diagnostika azbestózy a signalizace ohrožení nemocí z povolání. Pracov Lék 1989;41(10):369–471. 35. Navrátil M, Hassman P, Hassmanová V. Nemoci ve vztahu k azbestu v koncepci legislativ Československa a některých evropských zemí. Prac Lék 1990;42(8): 359–61. 36. Netoliczky A. Hygiene der Textilindustrie. Geverbehygiene, Teil II, Abt 5. G. Jena: Fischer Verlag, 1897:1102– 3. 37. Neyer U, Woss E, Neuweiler J. Wegener’s granulomatosis associated with silicosis. Nephrol Dial Transplant 1994;9(5):559–61. 38. Osinubi OX, Afilaka AA, Doucette J et al. Study of smoking behavior in asbestos workers. Am J Ind Med 2002;41(1):62–9.

120

39. Paris C, Galateau-Salle F, Creveuil C et al. Asbestos bodies in the sputum of asbestos workers: correlation with occupational exposure. Eur Respir J 2002; 20(5):1167–73. 40. Parkes WR. Occupational lung disorders. Third ed. MĚSTO: ButterworthHeinemann, Ltd., 1994. 41. Peacock C, Copley SJ, Hansel DM. Asbestos-related benign pleural disease. Clin Radiol 2000;55(6):422–32. 42. Petránek J. Encyklopedický slovník geologických věd. Sv. I. Praha:Academia, 1983:114–5. 43. Pivec R, Kopáček J. Hyalinóza pohrudnice. Stud Pneumol Cechosl 1979; 39:601–9. 44. Roach HD, Davies GJ, Attanoos R et al. Asbestos: when the dust settles an imaging review of asbestos-related disease. Radiographics 2002;22(Spec No):167–84. 45. Roggli VL, Vomer RT, Butnor KJ, Sporn TA. Tremolite and mesotelioma. Ann Occup Hyg 2002;46(5):447–53. 46. Rom WN, Hammar SP, Rusch V, Dodson R, Hoffman S. Malignant mesothelioma from neighbourhood exposure to antophyllite asbestos. Am J Ind Med 2001; 40(2):211–4. 47. Rosenthal R, Langer I, Dalquen P, Marti WR Oertli D. Peritoneal mesothelioma environmental asbestos exposure. Swiss Surg 2003;9(6):311–4. 48. Srb V, Tejral J, Šmejkalová J, Fiala Z. K problematice azbestu, umělých vláken a „Zdraví pro všechny“. Sborník semináře Problematika asbestu v životním prostředí, Ekomonitor, Praha, 5. 10.1999; 4–17. 49. Šmejkalová J, Srb V, Fiala Z, Musil M. Biologicko-medicínské monitorování osob profesionálně exponovaných vláknitým materiálům. Lék Zpr LF UK v Hradci Král. 1977;42(3–4):97. 50. Tejral J, Šmejkalová J, Srb V, Fiala Z, Musil M.,Valeš P. K medicínskému monitorování osob profesionálně exponovaných vláknitým materiálům. Acta Med (Hradec Král) Suppl. 1997;40(2):107–11. 51. Tervaert JW, Stegeman CA, Kallenberg CG. Silicon exposure and vasculitis. Curr Opin Rheumatol 1998;10(1):12–7. 52. Tiitola M, Kivisaari L, Zitting A et al. Computed tomography of asbestos-related pleural abnormalities. Int Arch Occup Environ Health 2002;75(4):224–8. 53. Topcu F, Bayram H, Simsek M et al. High – resolution computed tomography in cases with environmental exposure to asbestos in Turkey. Respiration 2000; 67(2):134. 54. Valeš P. Hygienicko-zdravotnická problematika výroby třecích materiálů v n.p. Osinek Kostelec n/ Orlicí, atestační práce, 1988. 55. Vejlupková J, Lebedová J. Nemoci způsobené azbestem. Prakt Lék 2000;80(8): 441–6. 56. Wedler HW. Klinik der Lungenasbestose. Leipzig: G. Thieme Verlag, 1939. 57. Weisenburger DD, Chiu BC. Does asbestos cause non Hodgkin’ s lymphoma or related hematolymphoid cancers? A review of the epidemiologic literature. Clin Lymphoma 2002;3(1):36–40. 58. Wigle DT. Cancer mortality in realiton to asbestos in municipial water supplies. Arch Environ Hlth 1977;32:185–90. 59. Winter M, Pfeifer A, Waldfahrer F et al. Findings in a higt- risk group following asbestos exposure. Benefit of ENT examinations in patients with long-term exposure to asbestos. HNO 2002;50(11):989–96. 60. Zellos L, Sugarbaker DJ. Current surgical management of malignant pleural mesotelioma. Curr Oncol Rep 2002;4(4):354–60. 61. IARC (International Agency for Research on Cancer) Monographs on evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans WHO – Lyon 1987. 62. International Labour Office (ILO): International Classification of Radigraphs of Pneumoconioses 1971 (Revised 1980) Geneva, ROK:STR. 63. Seznam nemocí z povolání (Nařízení vlády 290/95Sb). 64. Výnos hlavního hygienika s platností od 1.11.1989. 65. Výnos hlavního hygienika z 27.2.1990 § 11b. 66. Vyhláška MZČR 89/ 2001 Sb. (zrušena vyhl. 432/2003 Sb.). 67. Vyhláška 32 / 1965 Sb. o bolestném a ztížení společenského uplatnění ve znění dalších předpisů. 68. Vyhláška č. 440/2001 Sb o bolestném a ztížení společenského uplatnění.

MUDr. Valerie Hassmanová, CSc., Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Klinika nemocí z povolání, 500 05 Hradec Králové. e-mail: [email protected]

âern˘ dÛl, 19.–21. kvûtna 2004 Vážení čtenáři, dostáváte do rukou číslo obsahující soubor článků, které byly základem pro přednášky na XXVII. DNECH LÉKAŘSKÉ BIOFYZIKY. Tato odborná akce vznikla před 26 lety v době, kdy se lékařská fyzika měnila v lékařskou biofyziku. Změna znamenala přesun těžiště z oblasti aplikací klasických částí fyziky, zejména v použití diagnostickém a terapeutickém, do oblasti uplatnění výsledků nově vznikajících přírodovědných oborů, jako byly molekulární biologie, informatika a modelování. Došlo tak k rozšíření záběru oboru, který je pěstován zejména na lékařských fakultách. Zmíněné rozšíření s sebou též přineslo větší různost problémů, jejichž řešení se pracovníci kateder či ústavů lé-

ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):121

kařské biofyziky věnují, a též rozšíření okruhu spolupracovníků i do oblasti mimo vysoké školství. Uveřejněné práce jsou toho důkazem. Věřím, že poté, co se seznámíte s jejich abstrakty, najdete práce, které si přečtete in extenso a shledáte je zajímavými. Někteří možná natolik, že mne požádáte o zaslání informace o konání dalších Dnů lékařské biofyziky, protože se budete chtít osobně seznámit se zajímavou komunitou českých a slovenských lékařských biofyziků. Na závěr Vás chci ještě upozornit, že nedílnou součástí výsledků prezentovaných na uvedené akci jsou ještě sdělení v angličtině v Acta Medica 2004;47(4). prof. MUDr. Pravoslav Stránský, CSc.

121

122

VLASTNÍ STATISTICKÉ PROGRAMY V EXCELU Josef Bukač Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové: Ústav lékařské biofyziky Summary: Our statistical programs in Excel. We prefer to use a spreadsheet program when teaching statistics. We have written several programs to cover the methods students use. The input data are typed in the spreadsheet MS Excel, we mark the data, and the program creates an output table. The outputs are both in Czech and English, they contain the basic results useful for students, various alternatives, test criteria, acceptance regions, and p-values. Since the programs are user-friendly, they make it easier on students.

Key words: Teaching; Statistics; Spreadsheet; Programs

Souhrn: Dáváme přednost výuce statistiky pomocí tabulkových procesorů. Bylo napsáno několik vlastních programů pro metody, které používají studenti. Vstupní data se zapisují v tabulkovém procesoru MS Excel, provede se označení dat a program vytvoří výstup. Výstupy jsou česky a anglicky, obsahují základní údaje vhodné pro studenty, různé alternativy, testová kritéria, obory přijetí a p-hodnoty. Zjednodušení obsluhy a výstupů znamená snadnější práci pro studenty.

Úvod Zastáváme názor, že není vhodné studenty zatěžovat profesionalními statistickými programy, protože mají každý trochu jiné zadávání vstupních dat, což je jistě ztrátou času. Studenti jsou obvykle seznámeni s nějakým tabulkovým procesorem a to pro začátek stačí. Proto soudíme, že je vhodné používat statistické programy, které spolupracují s Excelem jako známým a rozšířeným programem.

proč by nemohla být do programu zařazena oboustranná alternativa, není, jiné programy ji mají běžně, protože je také nejčastěji používána. Správnou p-hodnotu pro oboustrannou alternativu ale vypočítá funkce Ftest, která je zařazena nikoliv mezi statistické programy, ale mezi funkce. Takové zbytečné komplikace jsou časté a je těžké studentům vysvětlovat, že to tak je, když k tomu důvod není. Při porovnání s profesionálními programy je jasné, že je možné napsat programy, které dávají srozumitelnější výstup.

Nedostatky

Tvar vstupních dat

Firma Microsoft dodává statistické programy pro Excel a doposud jsme je pro výuku používali. Tyto programy ale mají podstatné nedostatky. Jedním z nich je nevhodná terminologie v české verzi. O tom pojednává například Tvrdíkův článek (1). Uvedenému problému je možné se snadno vyhnout tím, že používáme anglickou verzi také pro české studenty. Možná budou tu anglickou terminologii někdy potřebovat. Ale ani anglická verze na tom není dobře. Není jistě závadou to, že nejsou k dispozici tak široké možnosti jako u specializovaných statistických programů, vždyť jde o výuku základních postupů. Problematický je však tvar výstupu, ale hlavně chyby, kterých se uživatel díky tomu snadno dopustí. Jako příklad je možné uvést program F-Test Two-Sample for Variances. Tento program nepočítá p-hodnotu pro oboustrannou alternativu. Vypočítána je p-hodnota pouze pro jednostrannou alternativu, ale neříká se, pro kterou z možných dvou. Zabere to trochu času zjistit, která to je. Důvod,

Pro naše programy použijeme Excel jako prostředek pro zápis vstupních dat. Data musí být organizována ve sloupcích. Je to starý zvyk ještě z dob, kdy se sčítalo ručně. Jako první řádek musí být uvedena v každém sloupci hlavička, čili název sloupce. Názvy sloupců jsou kopírovány do výstupů. Více řádku pro hlavičku není povoleno, počet znaků v hlavičce není omezen. Vstupní data je možné označit předem pomocí myši. K označení dat ve více sloupcích, které netvoří souvislou oblast, je možné použít klávesy Ctrl. Pak lze spustit program. Pro označení předem je možné použít také značení celých sloupců. Program si pak sám značení upraví tak, aby prázdné buňky dole pod daty byly ignorovány. To je třeba zkontrolovat a případně program zastavit. Značení celých sloupců podstatně urychluje práci uživatele, pokud se ve sloupcích kromě hlavičky a dat nevyskytuje nic jiného. Značení je možné provádět po spuštění programu. Pravidla jsou stejná jako při značení předem. Při značení

ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):123–124

123

dat lze označit také jednu buňku, od které počínaje chceme umístit výstup. Program to pozná tak, že je označena jen jedna buňka. Pokud není, je automaticky zvolena buňka několik řádků pod vstupními daty. Toto značení je možné při výpočtu změnit.

Výpočetní postup Před začátkem programování je nutné mít k dispozici metody pro výpočet obvyklých distribučních funkcí odvozených z normálního rozdělení. Ty jsou uvedeny například v práci Olehly a kol. (2), hodí se typicky pro výpočet p-hodnot. Rovněž je dobré mít předem rychlé metody výpočtu kvantilů. Kvantily jsou použity jak pro výpočet intervalů spolehlivosti, tak pro výpočet oborů přijetí. Je toho třeba udělat víc, než se zdá. Čísla mohou být zapsána s desetinnou tečkou v angličtině, zatímco Evropané raději používají čárku. Program přijímá obě možnosti. Veliká opatrnost je nutná také při výpočtu průměru a rozptylu. Zaokrouhlovací chyby mohou způsobit to, že součet čtverců odchylek vyjde kladný, i když velmi malý, přestože má být nula. Proto se při výpočtu zjišťuje, zda jsou všechny hodnoty stejné.

Výstupy Výstup je dvojjazyčný, protože máme studenty mluvící anglicky a česky. Čísla jsou společná pro všechny. I když běžné statistické programy obory přijetí neuvádějí, pro výuku jsou žádoucí, protože na nich studenti mohou vidět jejich souvislost s p-hodnotou. Ve srovnání s profesionálními programy je výstup téměř minimální, protože neobsahuje údaje pro studenty nadbytečné.

Další vývoj Je možné naprogramovat také jiné metody než jen ty základní pro studenty. Pokud nějaká metoda není snadno dostupná, nebývá problém si ji naprogramovat. Takových

124

programů je k dispozici více. Jen nedávno byl naprogramován výpočet tabulek pro Stuartův test, test linearity regrese, test exponenciality a další. Jiný směr by byl spíš zaměřen na výuku. Porozumění statistickým postupům se dá podstatně zlepšit pomocí grafů. Bylo by vhodné zobrazit hustotu rozdělení testového kritéria za předpokladu nulové hypotézy. Student by si sám mohl vymýšlet příklady a zkoušet, co to udělá. Stejně užitečné by bylo grafické znázornění rozdělení testového kritéria při neplatnosti nulové hypotézy. Je jasné, že se jedná o jednoduchou alternativu, kterou by si student zadal sám, jak ho napadne.

Závěr Statistické pojmy je možné zavádět velmi abstraktně, což je pro začátečníka těžké. V takovém případě by měly ihned následovat příklady, jak se k takové abstrakci došlo. Pro studenty tudíž nejsou vhodné profesionální programy. Spíš by byl vhodnější program, který bychom mohli nazvat průvodce statistickou metodou. Výstup by nejen vypočítal p-hodnotu, o které uživatel má vědět, co znamená, výstup by měl naznačit, jak ta p-hodnota vznikla. Konkrétně se to dá znázornit na binomickém rozdělení. Student by měl mít možnost se podívat na jednotlivé pravděpodobnosti, mohlo by se znázornit, jak je obor přijetí vypočten. Pro začátečníky nejlépe graficky.

Literatura 1. Tvrdík J. Excel, lokalizace a zmatek. Bull Čes Statist Spol 1998;2:13–20. 2. Olehla M. et al. Řešení úloh matematické statistiky ve Fortranu. Praha: Nadas, 1982: 368 s.

Ing. Josef Bukač, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Ústav lékařské biofyziky, Šimkova 870, 500 38 Hradec Králové. e-mail: [email protected]

HODNOCENÍ AUTONOMNÍ REAKTIVITY U BALBUTIES PŘI BRONCHODILATAČNÍ TERAPII Tomáš Grézl, Josef Pešák Univerzita Palackého, Lékařská fakulta: Ústav lékařské biofyziky

Summary: Assessment of autonomous reactivity at stuttering treated in bronchodilatation therapy. By the measurement of autonomous reactivity according to the variability of heart frequency we get a picture that describes the activity of autonomous nervous system and stuttering at bronchodilatal therapy.

Key words: Stuttering; Autonomous reactivity of nervous systém; Bronchodilatal therapy of stuttering; Variability of heart frequency

Souhrn: Měřením autonomní reatlivity dle variability srdeční frekvence získáváme obraz o aktivitě autonomního nervového systému a balbuties při bronchodilatační terapii.

Úvod Podle MKN-10 patří koktavost pod F98.5 Koktavost, balbuties. Zadrhávání v řeči. F98 Jiné poruchy chování a emocí se začátkem obvykle v dětství a dospívání. kap. V., (F 00–99) Duševní poruchy a poruchy chování. (MKN-10 Mezinárodní statistická klasifikace nemocí a přidružených zdravotních problémů ve znění 10. decenální revize – překlad podle International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems ICD-10, World Health Organization, Geneva, 1992.)

Etiologie koktavosti se nezná (1). Hodnocením variability srdeční frekvence získáváme pohled na autonomní nervový systém (ANS), máme tedy možnost hodnotit jeho aktivitu. ANS je hlavním regulačním homeostatickým systémem inervujícím vnitřní orgány. Tvoří ho dva subsystémy – sympatický a parasympatický subsystém (obr. 1).

Metodika

Obr. 1: Princip autonomní inervace. hrudních orgánů.

Pro hodnocení aktivity ANS u balbuties využíváme od konce roku 2001 mikropočítačový systém VarCor PF5 s možností logaritmického zobrazení. Sestava obsahuje PC pocket, interface typ SWG, plošné hrudní elektrody, snímací a vyhodnocovací program typu VarCor. Měření patří k doplňkovým neinvazivním diagnostickým vyšetřením (5). Hodnocení spočívá v analytickém vyhodnocení periodického kolísání srdeční frekvence. Využíváme metodiku stanovující variabilitu srdeční frekvence na základě rozboru tachogramu R-R (série normálních sinusových stahů N-N) (7). Podle délky analyzovaného EKG záznamu lze provádět: – dlouhodobá měření po dobu 18–24 hodin a – krátkodobá měření VSF po dobu cca 5 minut. Po čas vyšetření PC pocket nasnímá přibližně 3x300 srdečních cyklů (metodika LEH-STOJ-LEH) a naměřená data se přenášejí do stolního počítače, kde se vyhodnotí. Výstupem programu je pak grafické i numerické znázornění aktivity ANS. Součástí vyšetření je i vyplnění formuláře, kvůli standardizaci.

ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):125–126

125

Obr. 2: Typ (S) záznamu se snadno potlačitelnou vagovou aktivitou.

Obr. 3: Typ (L) záznamu se zvýšenou nervosvalovou dráždivostí.

Výsledky

nalez stresové odpovědi byl pozorován během stresu i u zdravých osob – 7), nebo nefyziologickým přenosem impulsů mezi sympatikem a hladkou svalovinou bronchů. Tuto možnost v současné době ověřujeme podrobnějším rozborem spirometrických parametrů metodou impulsní oscilometrie (sestava MasterScreen IOS fy Jaeger).

Pacienty s řečovou poruchou na základě jejich spektrálních výkonů zařazujeme do dvou skupin podle typů (2,3,4): – typ „L“ s převahou parasympatické části ANS, se zvýšenou nervosvalovou dráždivostí – typ „S“ se snadno potlačitelnou vagovou aktivitou Obr. 2 znázorňuje spektrální analýzu charakteristickou pro typ S. Vyznačuje se typickým snížením spektrálních výkonů a spektrální výkonové hustoty v pásmu vyšší frekvence HF 0,25–0,5 Hz vykazující aktivitu vagu. Tyto nálezy nesvědčí pro organické postižení autonomního nervového systému, nýbrž s velkou pravděpodobností pro poruchu regulačních mechanismů sympatikovagové rovnováhy s relativní převahou sympatiku (6). U typu L, viz příklad na obr. 3, byly zjištěny naopak nálezy s vysokými hodnotami spektrálních ukazatelů, ukazujících na převahu parasympatické aktivity vagu. Pro typ L je tedy typické, že nedochází k potlačení složky v pásmu vyšší frekvence HF 0,25–0,5 Hz, spíše naopak. V rámci vyšetření ANS u balbuties při bronchodilatační terapii jsme vyšetřili celkem 43 probandů balbutiků ve věku od 6 do 25 let. Jejich spektrální analýza ANS byla u 25 probandů dle typu S a u dle typu L 18 probandů. Ani jednou však nebyla jako u probandů bez řečových obtíží.

Připraveno s podporou výzkumného záměru CEZ: J14/98:N30000018 „Integrované studium hlasu a řeči“.

Literatura 1. Adams RD, Victor M. Principles of neurology. McGraw-Hill Information Services Company, Fourth Edition, New York, St. Louis, San Francisco, Colorado Springs, Auckland, Bogotá, Caracas, Hamburg, Lisbon, Madrid, Mexico, Milan, Montreal, New Delhi, Panama, Paris, San Juan, SaoPaulo, Singapore, Sydney, Tokyo, Toronto, 1989:480–1. 2. Grézl T, Pešák J, Opavský J. Hodnocení autonomní reaktivity u balbutiků. In: Sborník 9. Semináře univerzitního Společenství pro studium hlasu a řeči, Ed: Doc. RNDr. Josef Pešák, CSc., Ústav lékařské biofyziky LF UP v Olomouci, Olomouc, květen 2002:33–6. 3. Grézl T, Pešák J, Opavský J. Počátek hodnocení autonomní reaktivity u balbutiků. In: Kniha súhrnov: Novinky v rinologii, foniatrii a audiologii, Ed: M. Profant, I. ORL klinika LF UK, FN a SPAM, Bratislava, 4.–6. Septembra 2002:24. 4. Grézl T, Pešák J. Hodnocení autonomní reaktivity u balbutiků. Assesment of autonomous reactivity in balbuties. In: Novinky ve foniatrii 2002, Ed: Olga Dlouhá, Milan Lašťovka pořadatelé sborníku, Praha: Galén, říjen 2002:78. 5. Metelka R. Hodnocení variability srdeční frekvence v krátkodobých záznamech. (Autoreferát disertační práce) LF UP v Olomouci, Olomouc, 2001:66. 6. Opavský J. Autonomní nervový systém a diabetická autonomní neuropatie. Praha: Galén, 2002:304. 7. Salinger J, Pumprla J, Vychodil R et al. Microcomputer Systém for Telemetric Assessment of Short Term Heart Rate Variability in Time and Frequency Domain, Type VariaCardio TF4. Comput Cardiol 1999;26:599–602.

Závěr Naše měření ukazují, že spektrální výkony (aktivita ANS) jsou u probandů klinické multicentrické studie s balbuties v každém případě odlišné než u probandů bez řečových potíží, jsou příliš vysoké nebo nízké. Domníváme se, že to může být buď důsledek zátěžových psychogenních vlivů (obdobný

126

MUDr. Tomáš Grézl, Univerzita Palackého, Lékařská fakulta, Ústav lékařské biofyziky, LF UP, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc. e-mail: [email protected]

MULTIMEDIÁLNÍ VÝUKOVÝ PROGRAM (MVP) VE VZDĚLÁVÁNÍ NA VYSOKÝCH ŠKOLÁCH Rita Chalupníková Univerzita Hradec Králové, Fakulta informatiky a managementu: kikm Summary: Multimedial courseware in university education. This article is aimed at developing of multimedia teaching programs. Authoring tool Authorware Professional for Windows is briefly described as a suited system for the developing of didactic applications. Author presents own application based on Authorware – Biophysics of perception of sound and light. At the end are also disscused benefits of multimedia teaching tools.

Key words: Multimedia teaching program; Authoring system; Authorware Professional for Windows; Knowledge object (KO)

Souhrn: Tento článek je zaměřený na rozvoj multimediálních výukových programů. Stručně je zde popsán autorský nástroj Authorware Professional for Windows, vhodný pro tvorbu didaktických aplikací. Autorka představuje vlastní aplikaci, vytvořenou v programu Authorware, nazvanou Biofyzika vnímání zvuku a světla. Na konci článku jsou diskutovány přínosy používání multimediálních výukových programů.

Úvod

Současný stav

Nedostatek finančních prostředků ovlivňuje všechna odvětví národního hospodářství, školství nevyjímaje. Tempo růstu přímých i nepřímých nákladů na vzdělávání není pokryto patřičným nárůstem financí ze státní pokladny ani ze soukromých zdrojů. Přesto že se stále zvyšuje poptávka po vzdělání a roste množství zpracovávaných informací, ozývají se hlasy pro redukci pedagogických pracovníků. Jeden z ukazatelů, ve kterém ztrácíme krok s vyspělými evropskými státy, je počet vysokoškolsky vzdělaných lidí. Zabezpečit nárůst VŠ absolventů, aniž by dramaticky stoupla hodnota přímých nákladů, lze zefektivněním procesu vyučování využitím moderních počítačových technologií. Vybavenost vzdělávacích institucí počítačovou technikou je ve srovnání s Evropou standardní. Navíc se rychlým zaváděním počítačového vybavení do ZŠ a SŠ velmi zlepšila a stále zlepšuje počítačová gramotnost studentů přicházejících do terciálního vzdělávání. Odpadá tak nutnost vyučovat studenty základním dovednostem a studenti mohou již od 1. semestru aktivně využívat všech možností, které moderní informační technologie poskytují. Pomocí kvalitních MVP lze vhodnou formou zpřístupnit informace velkému množství studentů i bez nutnosti přímého kontaktu s přednášejícím a bez nutnosti zvyšovat prostorovou kapacitu vzdělávací instituce. Možné využití MVP připadá v úvahu nejen u konzultativních, distančních a denních studií, ale může podpořit i u nás zatím nedostatečně fungující systém celoživotního vzdělávání.

Na vysokých školách stále ještě převládá tradiční forma výuky (tj. přednáška, cvičení a seminář). Změnou prezentace vybraných témat lze napomoci zefektivnění procesu učení i zvýšení úrovně znalostí, které může student v daných přednáškách získat. Pravdou je, že existuje mnoho výukových programů v českém jazyce, které však pokryjí možnosti základní, eventuálně střední školy. Jedná-li se o obor specializovaný (vysokoškolský), není pro firmy lákavé vytvářet takové programy. Náklady budou veliké a ve specializovaném oboru nedosáhnete tak velké cílové skupiny, aby bylo možné ze zisku pokrýt náklady spojené s vytvořením a distribucí těchto programů. Proto je vytvářeno mnoho MVP samotnými pedagogy.

ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):127–130

Úloha MVP Primárním úkolem MVP je vzdělávat, ne jenom informovat. Proto by měl program průběžně ověřovat správné pochopení učiva, aktivizovat uživatele zadáváním jednoduchých úloh či problémů, nutit jej k tvůrčí činnosti. Je důležité, aby program konfrontoval výsledky úloh se správnými výsledky. Bezprostřední zveřejnění správných odpovědí upevňuje učivo a také motivuje studenta k další činnosti.

Možnosti tvorby Původně byl výukový SW vyvíjen pouze užitím klasických programovacích jazyků, kde MVP programujeme (ať již tvorbou kódů nebo vizuálním návrhem). Programovací 127

jazyky jsou univerzální, a můžeme tedy vytvořit dokonalý MVP. Tvorba takovéto aplikace však vyžaduje dobrého informatika, majícího velmi dobré programátorské vědomosti. Dokonce i pro tvorbu jednoduché vyučovací lekce je třeba dobré znalosti z oboru programování. K programátorovi je nutné přibrat minimálně jednoho zkušeného pedagoga, didaktika a grafika. Důsledkem tvorby v programovacích jazycích je dlouhá doba vývoje a vysoká cena aplikace. Vzhledem k stálému nedostatku financí ve školství nelze takový realizační tým sestavit a vytvořit dokonalý (úzce specializovaný) MVP. Pro zkrácení námahy, doby výroby i ceny aplikace nám slouží autorské systémy. Jsou sice méně univerzální, ale jsou použitelné pro zbytek populace, která se neřadí mezi informatiky. Zde je většina programování už skryta a vlastní program se vytváří pouze skládáním již hotových komponent. (I tyto autorské nástroje však doznaly během vývoje značného rozšíření – jsou v nich zakomponovány rysy programovacích jazyků, tzn. dokonale ovládnout daný autorský nástroj znamená naučit se v něm programovat. Přesto i v těchto nástrojích dokáže začátečník díky vestavěným průvodcům vytvořit slušně vypadající aplikaci.) MPV může sloužit k získávání nových znalostí, pro opakování znalostí či k jejich testování. Tyto funkce MVP ovlivňují použitý software pro vývoj produktu. V současnosti je na trhu celá řada autorských systémů, majících své přednosti i omezení. Jedním z těchto produktů je Macromedia Authorware Professional for Windows. Produkty firmy Macromedia se staly celosvětově uznávané a používané. Na trhu jsou prakticky od roku 1993 a během těchto let doznaly podstatného vývoje. S produkty firmy Macromedia pracuje mnoho velkých firem, které v nich vytvářejí materiály pro školení svých vlastních zaměstnanců (AT&T, Lucent Technologies, atd.). Další firmy využívají Authorware pro školení na svoje produkty (Hewlett-Packard, IBM a další). Navíc není tak cenově nedostupný. Pro školy a pro tvorbu MVP pro učební účely (ne komerční) je možné získat slevy přes 90 % z koncové ceny AW P for Windows. Authorware Professional dává možnost relativně nenáročné tvorby a distribuce aplikací v prostředí Windows. Authorware je nástroj typu RAD (Rapid Application Development). Práce v systému je založena na využívání předem definovaných tříd objektů, které implementují základní bloky programu (cykly, podmínky, podprogramy). Vše je řešeno v plně vizuálním, jednoduchém a uživatelsky příjemném prostředí. Znalost konkrétních programovacích jazyků není nutná. Authorware je jedním z nejkomplexnějších autorských systémů pro vývoj interaktivních multimediálních programů na osobních počítačích. Je to ideální nástroj pro tvorbu e-learningových aplikací, interaktivních katalogů a publikací, populárně naučných elektronických publikací, interaktivních vzdělávacích kurzů, digitálních kiosků nebo nejrůznějších simulátorů. Tvorbu takto zaměřených aplikací významně usnadňují nástroje jako vestavěné full textové vyhledávání, možnosti práce s daty na internetu, vyhod128

nocování odpovědí nebo plná podpora e-learningových standardů (např. SCORM – The Sharable Content Object Reference Model. Jedná se o standardy v oblasti courseware, které umožňují výměnu obsahu mezi jednotlivými produkty. Jde o to, aby už hotové kurzy nebyly vázané na platformu, na které byly vytvořeny, tj. aby se nemusel celý kurz předělat, když náhodou dojde ke změně dodavatele courseware). Nejsilnější zbraní Authorwaru je revoluční způsob tvorby aplikací – struktura programu se buduje pouhým přetahováním ikon na osu. Kontrolu nad chováním aplikace a složitější výpočty pak zabezpečuje několik set vestavěných funkcí a proměnných. Díky Authorware Web Playeru lze aplikaci vytvořenou v Authorware snadno přenést na internet nebo intranet a prohlížet ve webových prohlížečích. Interaktivita zůstává i na internetu zachována, podporován je i streaming (postupné nahrávání dat). Authorware lze rozšiřovat o další funkce a nástroje pomocí doplňků Xtras. Základním objektem pro začínajícího uživatele je tzv. Knowledge object (KO). S tímto objektem je spojen průvodce, díky němuž jsme schopni vytvořit jednoduchou aplikaci, splňující požadavky MVP. Při této tvorbě není nutná znalost programovacího jazyka. Stručně popíšeme, jak jednoduché je vytvořit dobře vypadající MPV – resp. kostru MPV, protože i přes hezký kabát je pořád nejdůležitější vlastní obsah: Po spuštění AW založíme nový soubor. Pro tvorbu výukového softwaru, prezentace, školení či ostatních vzdělávacích aplikací je zde KO-Aplikace. Průvodce vás povede při volbě různých struktur, možností a kontrol. Je možné nastavit velikost okna, rozvržení, funkce aplikace (nápověda, obsah, rejstřík…). Nyní začíná práce pro pedagoga. Před chvílí vytvořená aplikace je skutečně pouhou kostrou, která neobsahuje to nejdůležitější – vlastní obsah. V tuto chvíli začíná namáhavá práce, kdy musíte zadat všechna didakticky zpracovaná data. Obsah mohou tvořit obrázky, texty animace, zvuk nebo i videosekvence. Authorware umožňuje do textu včleňovat také hypertextové odkazy, čímž lze měnit původně lineární strukturu textu. Vytvořenou aplikaci můžete distribuovat jako samostatnou aplikaci na paměťovém médiu (CD-ROM) nebo prostřednictvím internetu (Authorware od verze 6.0 umožňuje automatickou přípravu aplikace pro distribuci prostřednictvím Internetu včetně vytvoření spouštěcí www stránky ve formátu html, která obsahuje kód pro automatickou instalaci prohlížeče Web Player).

MVP – Biofyzika vnímání zvuku a světla V daném autorském systému jsme podobným způsobem vytvořili program nazvaný Biofyzika vnímání zvuku a světla. Program byl původně určen pro studenty medicíny v pregraduálním studiu. (Nicméně vzhledem k hraniční disciplíně – biofyzika – lze tento program využít i na pedagogických fakultách pro studenty biologie a fyziky.) Vstupní požadavky uživatelů (studentů) jsou základní gymnaziální

Biofyzika vnímání zvuku a světla

Struktura programu

Výuka – Režim výuky provádí studenta danou problematikou. Výklad je členěn do 4 zákl. celků (Světlo, Oko, Zvuk a Ucho). Celky jsou členěny do jednotlivých podcelků (lekcí). Na každé obrazovce je zpracován jeden výukový cíl. V závěru každé lekce je shrnutí, kde se pomocí hypertextových odkazů můžete v okamžiku dostat zpět na stránku, kde je daný pojem vysvětlován. Daná problematika je vysvětlována pomocí textu, schematických obrázků i snímků různých tkání. Pro lepší pochopení některých biofyzikálních procesů je použita 2D animace. Oko – skladba a funkce oka Světlo – fyzikální optika Zvuk – fyzikální akustika Ucho – skladba ucha a vedení zvuku

Ovládací prvky – Jsou k dispozici po celou dobu výuky (na pravé straně obrazovky). Slouží k ovládání programu. Po opuštění některého ovládacího prvku se vracíte zpět na místo v programu, které jste opustily. rejstřík – abecedně řazené pojmy (s vysvětlením, popř. obrázkem či zvukem) obsah (je členěn na základních kapitoly výuky a jejich podkapitoly. Po kliknutí se dostanete přímo na požadovanou stránku nápověda – popisuje, jak ovládat program, specifické cíle, kterých by měl uživatel dosáhnout a ostatní údaje o programu tisk – pomocí tohoto tlačítka se vytiskne aktuálně zobrazená stránka konec – po jeho stisknutí je program ukončen interaktivní šipky – patří také mezi ovládací prvky. Pomocí nich se lze pohybovat po obrazovkách. Je možné je ovládat myší či šipkami na klávesnici

Test – Jednou z důležitých částí MVP je možnost otestování dosažených znalostí. Testování by mělo plnit funkci zpětné vazby. Mělo by studenta motivovat k další práci. Otázky jsou náhodně vybírány z databáze otázek. Test je založen na testování pomocí výběrových odpovědí. Jsou zařazovány 3 (4) nabídky odpovědí (Vyloučeny jsou odpovědi beze vztahu k otázce, nesmyslné odpovědi a do souboru odpovědí jsou zahrnuty typické chyby.). a po ukončení testování jsou vědomosti ohodnoceny procentuální úspěšností odpovědí uživatele.

Obr. 1: Struktura programu zobrazená na pozadí MVP-Biofyzika vnímání zvuku a světla. znalosti z fyziky (především zákonitosti elmg. vlnění a optika) a biologie (biologie člověka). Úkolem tohoto MVP je názorně (zařazením vhodných obrázků, fotografií a grafů), srozumitelně a správně didakticky vysvětlit sluch a zrak z pohledu biofyziky. Pomocí animací prezentovat těžko popsatelné fyziologické děje. Průběžně ověřovat dosažené znalosti. Motivovat studenta k dalšímu sebevzdělávání. Student by měl získat následující znalosti: znát potřebné biofyzikální veličiny a s nimi související vztahy a jednotky, znát skladbu a funkci oka a ucha. Následující fáze se bude týkat zavedení do výuky (používání), poté analýzy příchozích požadavků od studentů a opravy případných nedostatků v programu. Zvažujeme přepsání MVP v anglickém jazyce pro zahraniční studenty. Pozornost bude věnována též statistice používání a efektivnosti programu.

Závěr Pedagogické přínosy používání MVP ve vzdělávacím procesu:

• realizace individualizovaného učení (proces vzdělávání se přizpůsobuje úrovni znalostí i inteligenčním kvalitám studenta) • použitím hypertextů má student možnost vracet se k nepochopeným pojmům ve chvíli, kdy je potřebuje • zlepšení některých didaktických postupů, vizualizace dat (pomocí videosekvencí a animací i obrázků se zvyšuje chápání prezentovaných dat a jejich uchování v paměti) • snížení strachu z neúspěchu (počítač vám umožní udělat chybu bez rizika ztráty sociálního statutu) • zvýšení motivace (zatraktivnění výuky) • interaktivní prostředky umožňují experimentovat, provádět pokusy • realizace zpětné vazby, kontrola dosažených cílů – v závěrech větších kapitol mohou být testy s vyhodnocením, klasifikací i evidencí pro učitele ekonomické a organizační přínosy • snížení nákladů (snadná a rychlá aktualizace programu) • program spustitelný prostřednictvím internetu se stává dostupným široké veřejnosti 129

• může dojít k redukci počtu hodin organizované výuky (šetří se síly pedagoga, šetří se náklady na prostory pro přednášky a s tím spojené další náklady na elektřinu,…) Nasazením MVP nezískáme samozřejmě všechny přínosy. Záleží na kvalitě MVP, na studentovi i na učiteli. MVP nemůže zcela nahradit již existující formy a metody získávání a přenosu informací. Může však být velkým pomocníkem pro vyučující i studenty.

Literatura 1. Hán J. Tvorba multimediálních aplikací pomocí autorského systému Authorware 4.0, Nakladatelství: Plzeň:8–12. 2. Martin J. Hyperdocument and how to Create them. N. Y.: Prentice Hall, 1990:95–163. 3. Petty G. Moderní vyučování. Portál, 1996:271–97. 4. Průcha J. Výukový hypertext v distančním vzdělávání. Praha: CSVŠ – Národní centrum distančního vzdělávání, str. 8–15. 5. Shepherd JC. Authoring Authorware. New Jersey: Prentice Hall, 1998:337–58. 6. manuály firmy Macromedia k Authorware Professional for Windows.

Mgr. Rita Chalupníková, Švermova 331, 538 21 Slatiňany. [email protected]

130

MIAPS – PROGRAMOVÝ SYSTÉM PRO ODHADOVÁNÍ POŘADÍ VZÁJEMNÉ PODOBNOSTI/NEPODOBNOSTI CHOVÁNÍ PROTEINŮ V ČASE Jiří Knížek1, Michal Bergmann, Jan Šindelář2, Hana Kovářová3 Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové: Ústav lékařské biofyziky1; Akademie věd ČR: Ústav teorie informace a automatizace2, Ústav živočišné fyziologie a genetiky, Liběchov u Mělníka3 Summary: MIAPS – programme system for order estimation of mutual similarity/dissimilarity of proteins behavior in time. Statistical order estimation of mutual similarity/dissimilarity of proteins’ behavior in time is the main purpose of the programme systém MIAPS. Comparing with Correspondence Analysis (CA) method, mostly used so far, is simultaneously performed. Time series of 2–DE maps are requested as the data. MIAPS is available on http://www.lfhk.cuni.cz/knizekj/ and http://www. utia.cas.cz/user_data/sindelar/miaps.htm.

Key words: 2-DE map; Autocorrelation; Distance; Orthogonal functions; Proteome analysis; Pseudometric; Regression; Time series

Souhrn: Statistický odhad vzájemného pořadí podobnosti/nepodobnosti chování proteinů v čase je hlavním účelem programového systému MIAPS. Zároveň je provedeno porovnání s až dosud nejvíce užívanou metodou korespondenční analýzy (CA). Jako data jsou požadovány časové řady 2–DE map. Systém MIAPS je dostupný na adresách http://www.lfhk.cuni.cz/knizekj/ a http://www.utia.cas.cz/user_data/sindelar/miaps.htm.

Úvod

Metodika

Proteomová analýza je v posledních asi deseti letech jednou z velmi se rozvíjejících oblastí základního výzkumu v biologii a experimentální medicíně. O problematice studia proteomu pomocí dvourozměrné gelové elektroforézy (2–DE) bylo uveřejněno již více než 8000 publikací v renomovaných světových časopisech. Světová biologická a experimentálně medicínská vědecká komunita vkládá velké naděje v rozvoj proteomové analýzy (v těsné návaznosti s genomovou analýzou) jako v obrovský potenciální informační zdroj pro způsoby diagnostiky mnohých chorob a pochopení jejich principů (nádorová onemocnění, infekční choroby atd.). Informačně klíčovou roli při všech těchto studiích hraje experimentální metoda 2–DE, resp. způsob hodnocení jejích informačních výstupů, tj. časových řad proteinových map. Toto hodnocení se provádí především metodou CA (3). V rámci projektu NO/6458–3 IGA MZ ČRi byla navržena nová metodologie třídění proteinů na základě časových řad 2–DE map. Tato metodika umožňuje vyhledávat proteiny důležité z pohledu biochemicko-kinetického chování. Metodologie je založena na metodách regresní analýzy s následným využitím vhodných pseudometrik. Programový systém MIAPS se může stát vyhledávanou pomůckou při vytypovávání potenciálních farmaceutických přípravků nebo jejich složek.

Data Experimentální metoda 2–DE poskytuje data: časové řady proteinových map. Pro vyhledání nesčetného množství ukázek proteinových map lze doporučit jeden z hlavních světových informačních zdrojů: http://au.expasy.org/. Skvrny na těchto mapách představují oddělené proteiny. Pomocí programového systému Mélanie (http://au.expasy.org/ /melanie/) jsou proteinové skvrny standardizovaným způsobem měřeny. Buďto je stanovována jejich tmavost (relative optical density OD%), a/nebo jejich objem (relative optical volume Vol%). Matematicky zapíšeme datovou strukturu časových řad proteinových map ve tvaru

i Název

... .. .

..

.. .

.

,

[1]

...

kde T je počet časových položek v časové řadě, tj. počet naměřených proteinových map, M je počet identifikovaných druhů skvrn na těchto mapách, tj. počet uvažovaných proteinů, τ1,…,τT jsou pozorovací časy a y11,…,yTM jsou příslušné OD% a/nebo Vol%.

projektu: Výzkum a konstrukce počítačového Modulu pro Informační Analýzu časových odezev autonomních Proteinových Systémů (MIAPS).

ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):131–135

131

Metoda CA CA, jedna z metod statistické faktorové analýzy, je účinným prostředkem pro analýzu tabulek dvourozměrných pozorování. Autoři systému Mélanie (3) analyzují tabulku dat, tvořenou y-novou částí matice [1], metodou CA. Časovou proměnnou, tvořenou prvním sloupcem matice [1], a priori vůbec neuvažují. Jednotlivé proteinové mapy (pořízené za experimentálně zcela reprodukovatelných podmínek na témže biologickém studovaném systému v různých časech) nazývají dle jejich experimentálního původu – totiž gely. Je pak předpokládán model, kdy T gelů se sdruženými M druhy skvrn může být reprezentováno T bodů v M-dimenzionálním prostoru, kde každá osa koresponduje s tmavostmi, resp. velikostmi skvrn jednoho konkrétního proteinu. Problém klasifikace zde proto spočívá v pořadové analýze těchto T bodů, z nichž každý koresponduje s příslušným gelem. CA dosáhne redukci dimenzionality ustanovením L-dimenzionálního prostoru, kde L ≤ T – 1, a v důsledku toho, protože T << M, i L << M. V tomto faktorovém, L-dimenzionálním, prostoru je klasifikace mnohem snadnější, protože faktorů je málo nebo nejsou korelovány, a i dimenzionalita je nízká; obvykle 1 ≤ L ≤ 3. Tímto způsobem je pomocí CA odhadnuto pořadí vzájemné odlišnosti proteinů. Jak je uvedeno výše, základní vlastností tohoto přístupu je, že dovoluje reprezentaci obou, tj. T gelů a M skvrn, v jediném klasifikačním prostoru. Daná skupina gelů, resp. daná skupina skvrn, v nichž jsou (bez ohledu na faktor měřítka) gely, resp. skvrny, nalezeny relativně blízko sebe, koresponduje s toutéž, takto danou, třídou gelů, resp. skvrn. Je předpokládáno, že tímto způsobem jsou indikovány podstatné charakteristiky pro jejich rozdělení podle toho, co v daném systému znamenají, podle toho jak se v daném systému chovají. Podrobný matematický popis CA lze nalézt v (3), eventuálně v teoretické části manuálu systému MIAPS, str. 28. Z pozice vědeckého přístupu, pohlížejícího na proteom jako na velmi složitý biochemický reakčně kinetický systém, se jeví CA-způsob odhadování extrémně se chovajících proteinů v čase hrubě aproximativní až konfuzní. CApřístup totiž zcela pomíjí časovou dynamiku procesu odehrávajícího se v proteomu. Z pozice tohoto variantního přístupu nejvíce extrémním chováním se vyznačuje protein, který má vůči ostatním ten nejodlišnější průběh koncentrace v čase.

... .. .

..

.

.. .

,

[2]

...

kde vektory θ1,...,θM 2a představují neznámé konstanty. Pod nimi si lze představit rychlostní a rovnovážné kinetické konstanty, adsorpční koeficienty, koeficienty difuze atd. V tomto pojetí pak matice [1] představuje experimentální datovou reprezentaci spojitých časových závislostí y1(τ),…,yM(τ). Podrobná, reakčně mechanistická, analýza takovéhoto velmi komplikovaného biochemicko kinetického systému je však velmi rozsáhlý úkol, mnohonásobně přesahující možnosti jednoho projektu, viz (2). MIAPS-přístup spočívá ve stanovení vzájemného pořadí proteinů podle toho, jak se co nejodlišněji/nejshodněji ten který protein chová v čase vzhledem ke všem ostatním proteinům. Je to vlastně jakýsi globální, reakčně mechanisticky zcela nepodrobný, přístup k řešení nadmíru složitého problému, který jsme velmi zjednodušeně matematicky popsali soustavou rovnic [2]. Z hlediska techniky matematického principu je MIAPS-stanovení odlišnosti/shodnosti chování dvou proteinů v čase založeno na odhadu velikosti plochy, kterou mezi sebou svírají jejich (nederivované nebo jednou až dvakrát derivované) koncentrační časové průběhy, viz obr. 1. Z čistě matematických důvodů je namísto prosté plochy mezi oběma časovými průběhy odhadován její čtverec. Příslušné matematické vztahy jsou v tomto případě značně jednodušší a vzájemné pořadí proteinů se tím nezmění. Matematicky jsou koncentrační časové průběhy vyjadřovány pomocí lineárních kombinací ortogonálních polynomů. Příslušné polynomické koeficienty jsou zde odhadovány ortogonální polynomickou regresí za současného odhado-

Biochemicko-kinetický model Řada autorů (1) pojímá ve svých pracích OD%, resp. Vol%, jako koncentrace a daný studovaný proteomový systém jako složitý biochemický kinetický model. Za určitých zjednodušujících předpokladů je takovýto přístup z hlediska fyzikálního principu jistě správný, protože jakýkoliv autonomní proteomový systém je ve skutečnosti vlastně velmi komplikovaný biochemický reakční systém. Jeho kinetiku lze za určitých zjednodušujících předpokladů (2) popsat soustavou obyčejných diferenciálních rovnic 132

Obr. 1: Grafické znázornění techniky stanovení odlišnosti/shodnosti chování dvou proteinů v čase τ. Symbol ξ = 0,1,2 označuje stupeň derivace.

Tab. 1: Definice dvanácti MIAPS-metod. method 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

density •

volume

dual

• •

original • • •

derivative

•

mixed

mixed 2nd

• • •

• • •

• • •

• • •

• • •

• •

code d v d+v d‘ v‘ d‘+v‘ d+d‘ v+v‘ d+v+d‘+v‘ d+d‘+d‘‘ v+v‘+v‘‘ d+v+d‘+v‘+d‘‘+v‘‘

Symbol • označuje uskutečnění; blank označuje neuskutečnění. vaní autokorelace prvního řádu, viz teoretická část manuálu systému MIAPS, str. 18–22. Je nutné poznamenat, že pro biologický výzkum tak složité „černé skříňky“ jako je proteom, může být cenná jakákoliv informace, jakákoliv odezva intimních procesů v něm probíhajících. Pod úhlem tohoto pohledu je třeba zkoumat jak proteiny chovající se relativně nejodlišněji vzhledem ke všem ostatním, tak i proteiny chovající se relativně nejkonformněji viz (4). Ve smyslu výše uvedeného je pak možné MIAPS-přístup přehledně a stručně znázornit tabulkou 1. Z přirozeně pravidelného schématu v tabulce 1, tvořeného symboly •, vyplývá 12 navržených MIAPS-metod. Tyto jednotlivé metody se mezi sebou liší buďto tím, jak jsou „do hry“ vzata příslušná density-data (%OD) a/nebo volume data (%Vol), nebo tím, jak jsou „do hry“ vzaty nederivované časové průběhy (d, v, d+v), jednou derivované (d‘, v‘, d‘+v‘) či dvakrát derivované (d‘‘, v‘‘, d‘‘+v‘‘). Přehledné grafické označení písmeny jednotlivých metod se nachází ve sloupečku označeném „code“. Zde je nutné zdůraznit, že jsou odhadovány čtverce velikostí ploch, jaké mezi sebou svírají příslušné superpozice příslušných časových průběhů odpovídajících jednotlivým proteinům, což by např. v případě MIAPS-metody č. 12 byl časový průběh veličiny d(τ)+v(τ)+d‘(τ)+v‘(τ)+d‘‘(τ)+v‘‘(τ)

[3]

apod. Výpočet druhých derivací, jak známo z numerické matematiky, může být zatížen velkou chybou. V MIAPS-algoritmu použité druhé derivace nejsou tak nepřesné, jak by se možná mohlo na první pohled zdát. Získané polynomické závislosti jsou sice nejdříve až dvakrát analyticky derivovány. V další fázi jsou však tyto vztahy analyticky integrovány za účelem výpočtu čtverce plochy. Tím se chyba vzniklá derivací částečně kompenzuje. Z tohoto důvodu lze prohlásit, že chyba druhých derivací je přibližně na úrovni chyby prv-

ních derivací, když by nebyla použita integrace. Při hodnocení dat s velmi nízkými počty map T je nutné brát zřetel na to, že derivace jsou vyčíslovány jen přibližně. Při limitně nízkém počtu map T, zakalkulování druhých (T ≤ 3), resp. prvních (T = 2), derivací má pochopitelně nulový vliv. Příslušné algoritmické předpisy vzniklé analytickým derivováním a následným analytickým integrováním jsou dosti komplikované, viz teoretická část manuálu systému MIAPS, vztahy (II.L.4–7), str. 36–7, a vztahy (II.L.12–25), str. 39–41. Jejich odvození a naprogramování bylo pracné. Původně byla totiž testována značně jednodušší varianta algoritmu používající pro integraci numerickou metodu – Simpsonovo pravidlo. Po realizaci druhé složitější varianty algoritmu se však ukázalo, že značné pracovní úsilí bylo odměněno adekvátními výsledky – algoritmicky složitější varianta je asi 100krát rychlejší a nejméně o dva řády přesnější. Součástí MIAPS-metodiky je uspořádání soutěže mezi jednotlivými MIAPS-metodami. Pro odhad vzájemného pořadí odlišnosti/shodnosti vzájemného chování proteinů zvítězí ta ze dvanácti metod, která poskytuje největší/nejmenší celkový součet čtverců ploch mezi všemi proteiny navzájem. Ta metoda zřejmě má celkově nejlepší předpoklady odhadovat vzájemné pořadí odlišnosti/shodnosti vzájemného chování proteinů v čase. Pro účely vzájemného porovnávání jednotlivých MIAPS-metod jsou jednotlivé časové příspěvky, např. veličiny [3], váženy koeficienty, které numericky legalizují vzájemnou porovnatelnost jednotlivých MIAPS-metod, viz teoretická část manuálu systému MIAPS, vztahy (II.L.8), str. 38, a vztahy (II.L.26a-c), str. 42–44. Celý MIAPS-algoritmus je heuristickým postupem, jehož základní idea vychází z následující jednoduché úvahy. Pokusme se seřadit látky, např. proteiny, podle vzájemné odlišnosti jejich (časově synchronních) reakčně koncentračních průběhů. Za tímto účelem zkoumejme jejich vzájemnou odlišnost pomocí odhadů ploch (resp. jejich čtverců), které mezi sebou svírají. V prvním přiblížení po133

užijeme k tomuto samotné koncentrační průběhy. Snadno zjistíme, že tento přístup je nedokonalý tím, že ze svého principu nedokáže rozlišit, zda porovnávané průběhy mají shodný trend, tj., zda jsou souběžně klesající, či souběžně rostoucí anebo mají opačný charakter. Ve všech třech případech může být svíraná plocha obecně shodná. Abychom i toto spolehlivě rozlišili, je nutné používat i první derivace (podle času) koncentračních průběhů. Za účelem rozlišení případných souběžných/nesouběžných konvexností, resp. konkávností, je pak principiálně nutné používat i druhé derivace koncentračních průběhů. Přesná fyzikální interpretace jednotlivých časových proměnných ze sloupečku „code“ v tabulce 1 je značně komplikovaná a nemá praktický význam. Je třeba zdůraznit, že v rámci dané MIAPS-metody jsou proteiny řazeny vždy podle téže časově proměnné fyzikální veličiny. Tj. jde o to, jakou plochu (resp. její čtverec) svírá dohromady i-tý protein (např. časovým průběhem veličiny (3)) ve srovnání se všemi ostatními proteiny, tj. s proteiny s indexy 1,…,i-1,i+1,…,M, taktéž jejich příslušnými časovými průběhy veličiny [3] apod. Podle těchto kritérií jsou pak proteiny vzájemně seřazovány: Tj., svírá-li i-tý protein vůči všem ostatním dohromady největší/nejmenší plochu (resp. její čtverec), je ze všech proteinů svým chováním relativně nejvíce/nejméně odlišný atd. Následná soutěž jednotlivých metod pak zajišťuje, že jednotlivé metody jsou numericky vzájemně porovnatelné a že je vybrána ta metoda, která má pro definitivní rozhodování o vzájemném pořadí odlišnosti/shodnosti v čase celkově nejlepší předpoklady. Podrobnosti matematického postupu jsou uvedeny v teoretické části manuálu (c:\miaps\doc\miaps_manual.pdf, sample_protocols.pdf), který je součásti instalačního programu.

Podrobnosti o statistickém porovnání MIAPS-metody s CA lze nalézt v teoretické části manuálu systému MIAPS, str. 29–35. Vzájemné porovnání biologické účinnosti MIAPS-metody s CA nebylo provedeno. Toto porovnání by totiž prakticky vyžadovalo, aby navržený algoritmus se stal organickou součástí některého komerčního software pro hodnocení časových řad proteinových map.

Porovnání MIAPS-metody s CA Systém MIAPS byl z hlediska statistického testován jak na simulovaných, tak na experimentálních datech. V tabulce 2 v řádcích „occurence“ a „exact position“ jsou souhrnné výsledky měření účinnosti obou metod na simulovaných datech. V řádku „occurence“ jsou účinnosti v procentech pro odhad výskytu prvních 15 nejodlišnějších proteinů bez ohledu na pořadí v této patnáctce. V řádku „exact position“ jsou účinnosti v procentech pro odhad přesného umístění prvních 15 nejodlišnějších proteinů se zcela striktním požadavkem na pořadí v této patnáctce. Jak je vidět z těchto výsledků, jsou MIAPS-metody (zde označené historickým názvem PS2–DE) vždy významně účinnější než příslušná CA-metoda. Např. MIAPS-metoda aplikovaná na OD% (d-PS2–DE) byla značně účinnější než d-CA: 74,3 % > 47,1 % apod. První dva řádky v tabulce 2 jasně prokazují lepší statistické vlastnosti MIAPS-metody ve srovnání s CA. Souhrnné výsledky v řádcích „identical: simulated“ a „identical: experimental“ pouze demonstrují vzájemnou porovnatelnost v odhadování výskytu 15 nejodlišnějších proteinů na simulovaných i experimentálních datech.

V rámci projektu NO/6458–3 IGA MZ ČR se podařilo dokázat, že MIAPS-metoda poskytuje matematicko-statisticky přesnější výsledky než dosud nejvíce používaná metoda CA. Domníváme se, že MIAPS-metoda velmi pravděpodobně poskytne lepší výsledky i z hlediska co možná nejlepšího principiálního vystižení biologické či biochemické reality. Výsledky testování dat s inhibitorem, pořízených za účelem zkoušení potenciálního farmaceutického přípravku Boheminu (syntetická cyklin-dependentní kináza, viz manual), tomu nasvědčují. Tuto hypotézu je však třeba ještě více ověřit v praxi na hojných případech biologické interpretace časových řad proteinových map.

134

Tab. 2: Výsledky porovnání statistické účinnosti MIAPSmetody s CA; převzato z manuálu systému MIAPS, str. 34; PS2–DE je zde historické označení pro příslušnou MIAPSmetodu.

Diskuse Lze do budoucna očekávat, že budou nalezeny variantní metody pro hodnocení časových řad proteinových map. Lze si jistě představit další matematické přístupy opírající se pravdivěji či méně pravdivěji o ten či onen fyzikální model obecného proteinového systému. Je pravděpodobné, že MIAPS-přístup otevřel nový směr výzkumu formálního proteomu.

Závěr

Programový systém MIAPS MIAPS-přístup je softwarově realizován programovým systémem MIAPS, který je dostupný na adresách http:// www.lfhk.cuni.cz/knizekj/ a http://www.utia.cas.cz/user_data/ /sindelar/miaps. htm.

Literatura 1. De Jong H. Modeling and Simulation of Genetic Regulatory Systems: A Literature Review. J Computat Biol 2002;9(1):67–103.

2. Knížek J, Tesař L, Vohradský J, Kárný M. Bayesian Identification of General Protein Kinetic System (Research Report No. 2079). Praha: UTIA AV CR, 2003: 13s. 3. Pun T, Hochstrasser DF, Appel RD et al. Computerized classification of two-dimensional gel electrophoreto-grams by correspondence analysis and ascendant hierarchical clustering. Appl Theoret Electrophoresis 1988;1:3–9. 4. Vohradský J. ústní sdělení, Mikrobiologický ústav AV ČR (2003).

Ing. Jiří Knížek, CSc., Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, ústav biofyziky, Šimkova 870, 500 38 Hradec Králové. e-mail: [email protected]

135

136

VOLNĚ DOSTUPNÉ ZDROJE PRO VÝUKU LÉKAŘSKÉ INFORMATIKY Jan P. Naidr, Pavel Kasal, Marie Hladíková, Jitka Feberová Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta: Ústav lékařské informatiky

Summary: Free sources for medical informatics teaching. Important worldwide websites offering medical informatics have been searched through to find freely available web-based sources for teaching of medical informatics at faculties of medicine. The conclusion suggests that a complex system for teaching of the whole field of study does not exist. However, a sufficient offer of specialized articles, model programmes and presentations is available, which can be used for teaching. The author lists a brief characterization of the found sources and the programmes he uses. This computer-aided research is only rough. A more precisely defined searching strategy can help find other sources of specialized subjects useful for medical informatics.

Key words: Medical informatics; Teaching at faculty of medicine; On-line sources for teaching of informatics; Freely available sources; The Internet

Souhrn: Byly prohledány významné světové servery nabízející zdravotnické informace s cílem objevit volně dostupné zdroje pro výuku lékařské informatiky na lékařských fakultách. Závěry ukazují, že dosud není nabízen komplexní systém pro výuku celého oboru. Je však k dispozici dostatek odborných textů, ukázkových programů a prezentací, s jejichž podporou lze výukové lekce vytvořit. Autor uvádí v přehledu stručnou charakteristiku vyhledaných zdrojů a programů používaných na jeho pracovišti.Provedený výzkum má orientační charakter, přesnějším zaměřením vyhledávací strategie je možné očekávat objevení dalších zdrojů pro konkrétní témata lékařské informatiky.

Úvod

Metodika

Výuka lékařské informatiky probíhá na všech lékařských fakultách v Čechách i na Slovensku. Náplň tohoto oboru však zatím nebyla definována jak z hlediska obsahu, tak z hlediska rozsahu vyučovaných témat. Problematická je také dostupnost výukových materiálů, učebnic a praktických cvičení. Vytvářet veškeré výukové pomůcky je pro kolektiv jednoho pracoviště velmi náročné. Navíc některá témata velmi rychle ztrácejí na aktuálnosti a je třeba je v krátkých cyklech obnovovat. Dalším problémem je potřeba vyučovat nejen v mateřském jazyce, ale zahraniční studenty také v angličtině. Ideálním řešením by bylo převzít hotové materiály jak pro teoretickou, tak praktickou výuku, případně hotové materiály upravit pro svou potřebu. Před několika lety jsem pátral v Internetu po zdrojích pro výuku lékařské informatiky, ale výsledek byl velmi chudý. Našel jsem několik obstarožních lekcí ve formě textu, několik seriálů prezentačních snímků a nedokončenou on-line učebnici. Když jsem odpovídal na loňských biofyzikálních dnech kolegovi doktoru Bourkovi na dotaz po výukových zdrojích, vycházel jsem z těchto poznatků a odpověď jsem formuloval řka: „je to bída“. Otázka mě však natolik zaujala, že jsem se rozhodl provést průzkum znovu.

Provedl jsem manuální prohlídku zdrojů na serveru Medical Matrix v sekci Informatics, na serveru Hardin M.D. v sekci Medical Informatics & Computers, na serveru Health On the Net Foundation s klíčovými slovy „Medical Informatics Education“ a na serveru Citmed v sekci Informatika. Dále jsem použil vyhledávací systém Copernic Agent Basic, který zadává dotaz v prostoru webu 13 vyhledávacím službám, odstraní duplicity a vyhledané odkazy seřadí podle relevance. Vyhledané odkazy jsem prohlížel individuálně. Dále jsem prohlédl weby ústavů biofyziky a lékařské informatiky na lékařských fakultách v České republice a na Slovensku. K vyhledaným zdrojům jsem připojil výukové programy, které na našem pracovišti používáme, a zdroje zařadil do skupin podle vyučovaného tématu.

ACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):137–150

Výsledky Učebnice, přednášky, praktická cvičení Před několika lety jsme na našem pracovišti sestavili lekce pro praktické vyučování, které jsou pod názvem MEDINFOR (1) přístupné v Internetu. Obsahují 30 lekcí návodů ke cvičením včetně volně dostupného softwaru a připravených pracovních souborů. 137

Již několik roků je k dispozici on-line učebnice informatiky J. H. van Bemmela z Erasmus Univerzity v Rotterdamu (2). Je to obsáhlá práce mnoha spoluautorů, která probírá lékařskou informatiku velmi důkladně. Na rozdíl od své knižní podoby však internetová publikace není dokončena a některé kapitoly jsou načrtnuty jen ve formě osnovy. Přesto lze dobře využít mnoho textového materiálu, obrázků a schémat. Setkal jsem se i s tím, že autoři jiných výukových lekcí odkazují ze svých stránek přímo na stránky této učebnice. Pro výuku základů statistiky je určen výukový materiál našich kolegů z lékařské fakulty v Hradci Králové (3). V angličtině je dostupná on-line verze knihy Statistics at Square One (4). Existují i další zdroje pro výuku statistiky, některé z nich najde zájemce např. na stránkách serveru Citmed (5). Dr. Bourek vystavuje své přednášky o základech informatiky ve formě seriálu snímků. Je k dispozici kolem 120 snímků v češtině (6,7) i angličtině (8,9). Algoritmizace, formalizace, kódování Formalizaci diagnostické úvahy pomocí množinové notace ukazujeme studentům na našem pracovišti v krátké interaktivní prezentaci „Formalizace“ (1) sestavené v Microsoft® PowerPoint®. Tento nepatrný prográmek může posloužit dalším zájemcům také jako příklad, jak s minimálními prostředky sestavit interaktivní prezentaci s větveným scénářem. Výukový systém anglické provenience Crocodile Clips je obdivuhodné dílo. Slouží pro výuku na středních a vyšších školách a na principu simulace přibližuje studentům fyzikální a chemické děje, matematiku, mechanické stroje, analogovou a digitální elektrotechniku. Jeho součástí je modul pro výuku základů programování Crocodile Clips Technology (10), v němž lze sestavovat algoritmy a simulovat jejich průběh. Volně je k dispozici 30denní demoverze programu. Oddělení informatiky na Columbia University v New Yorku vyvinulo ve spolupráci s dalšími autory systém pro automatickou analýzu a kódování lékařského textu MedLEE (Medical Language Extraction and Encoding System). V Internetu je k dispozici ukázková aplikace (11). Uživatel zadá text nebo zvolí některý z příkladů textů propouštěcí zprávy, rentgenologického nálezu, případně mammografie. Pak zvolí způsob práce analyzátoru a formu kódování a odešle dotaz na server. Ten mu na obrazovku vrátí výsledek ve zvoleném formátu. Zpracování biosignálu a obrazu Na našem pracovišti používáme již několik let demonstrační verzi programu pro zpracování EKG firmy Seiva s.r.o (1). Program demonstruje velmi názorně identifikaci, rozměření a automatickou interpretaci signálu. Studenti mohou signál filtrovat, posunovat rozměřovací značky a sledovat výsledek analýzy. Proces zpracování obrazu ukazujeme studentům pomocí grafického editoru Paint Shop Pro (1). Verze na vy138

zkoušení umožňuje pracovat s programem 30 dní. Jsou k dispozici základní filtry jak pro bodové, tak lokální transformace obrazu. Student si může sestavit vlastní filtr např. pro odstranění šumu a sledovat jeho účinek. Morfologická měření v obraze umožňuje program Monti Vision Image Analyser (12) německé firmy Engineering Firm Cymontkowski. Jedná se o 30denní verzi na vyzkoušení. Student může měřit délky, průměry, plochy, úhly a další veličiny. Programy ruské provenience firmy VideoTesT Ltd. provádějí morfologickou a strukturální analýzu na příkladech z medicíny a dalších oborů. Firma dává k dispozici demoverze (13,14), které jsou omezené na zpracování obrazu v jejich vlastním formátu. Modelování a simulace Modelování kompartmentových systémů umožňuje program WinSAAM (15) amerických autorů. Je zdarma pro výukové účely. V jednoduchém editačním režimu sestaví student model a po kompilaci si může zobrazit jak numerický, tak grafický průběh simulace. Pro tento program máme zpracovanou dvouhodinovou lekci, která je ostatním zájemcům k dispozici. Modelování dynamických dějů nabízí program Model Vision Studium (16) patentovaný ruskými autory. Ve verzi Light je zdarma. V režimu editace je sestaven model a po kompilaci je spuštěna simulace. V grafické podobě je znázorněn průběh děje pomocí křivky, sloupcového anebo analogového ukazatele. Student vidí aktuální průběh také na vývojovém diagramu. Je možné modelovat spojité i nespojité děje, vytvářet modely se zpětnou vazbou atd. Trojrozměrný model lidského těla VOXEL-MAN nabízí využití především v anatomii, radiologii a dalších oborech zobrazovacích metod. Centrum experimentální medicíny Univerzity v Hamburku nabízí demonstrační verze programu VOXEL-MAN 3D-Navigator (17) pro oblast vnitřních orgánů dokonce s možností sledování stereobrýlemi. Na stránkách institutu jsou další příklady trojrozměrných modelů, které můžeme velmi efektně zařadit např. do přednášky. Rozhodování, umělá inteligence Pro výpočty aposteriorní pravděpodobnosti podle Bayesova vzorce máme na našem pracovišti zpracovánu lekci v tabulkovém procesoru (1). Oddělení lékařské informatiky Univerzity ve Freiburgu pokročilo dále a ve spolupráci s odděleními lékařské informatiky Univerzity v Maastrichtu a Gentu vytvořilo výukový program Visual Bayes (18), který nabízí zájemcům zdarma. Program umožňuje přepínat mezi němčinou a angličtinou a probírá tématiku hodnocení diagnostických vyšetření zeširoka. Na našem ústavu byl před několika lety sestaven program „Stromy“ (1) pro demonstraci výpočtu rozhodovacích stromů. Na příkladech apendicitidy, jaterního selhání, gangrény nohy a dalších propočítává student jednotlivé rozhodovací uzly a vylučuje nevýhodné větve stromu. Program po ukončení úlohy ohodnotí úspěšnost jeho řešení.

Postupy, kterými řeší počítač problematiku umělé inteligence na principech neprocedurálního programování, ukazujeme studentům ve vlastní lekci (1). Používáme odvozovací stroj Visual Prologu (19), který je pro nekomerční využití zdarma. Studenti řeší problematiku diagnostické úvahy a po změně v databázi faktů sledují změnu v odvozovaných závěrech. Bibliografické databáze, on-line časopisy Donedávna jsme pro výuku bibliografických databází používali lokální klientský program WinSPIRS, kterým jsme se připojovali k databázím na UK. Vzhledem k velkému zájmu studentů o využití volného přístupu k databázi Medline jsme na našem pracovišti zpracovali lekce, které podrobně seznamují uživatele s metodologií práce se zdrojem PubMed (20). Pro výuku lze využít i databázi souhrnů systematických přehledů efektivity zdravotní péče organizace Cochrane Collaboration (21). Tato prezentace významného zdroje pro medicínu založenou na důkazech umožňuje vyhledávání souhrnů podle klíčových slov. Množství vědeckých informací, které můžeme volně využít, se postupně rozrůstá. Možnost volného přístupu k plným textům vědeckých publikací můžeme studentům ukázat na on-line časopisech v Internetu, např. na serveru BioMed Central (22). Postupně se rozvíjí také iniciativa Public Library of Science, která již vydává první volně přístupný on-line časopis PLoS Biology (23) a na podzim roku 2004 je ohlášen start časopisu PloS Medicine. Informační systémy Malé informační systémy, jako např. pro praktické lékaře, je možno procvičovat se studenty pomocí demonstračních verzí různých producentů. Na našem pracovišti používáme program TurboAsistent firmy TENEL CZ s.r.o. (24). Důvod, proč jsme zvolili právě tento systém, je časová neomezenost demoverze. Zájemcům je k dispozici naše dvouhodinová lekce. Student pracuje nejprve se záznamem o jednom pacientovi a v druhé části provádí úkony nad celou kartotékou. Pro anglicky mluvící studenty můžeme využít nabídky zahraničních firem, např. DOCS Inc. a její CD-ROM s ukázkami programu SOAPware (25). Nemocniční informační systémy v demonstračních verzích neexistují. Jediná naše firma AMIS a.s. dokázala tuto situaci vyřešit a před léty nabízela alespoň videokazetu s ukázkou funkcí a modulů informačního systému. Dosud ji s úspěchem pro výuku používáme. Pro zahraniční studenty je možné demonstrovat základy elektronického záznamu o pacientovi např. pomocí demoverze systému MediNous (26), který je nabízen na stránkách firmy k objednání na CD-ROM.

Diskuse Uvedený průzkum bohatých zdrojů v Internetu je jen malou sondou. Pokud bychom hledali dále a zaměřili se na

konkrétní oblasti informatiky, jistě bychom našli další volně dostupné zdroje např. pro demonstraci neuronových sítí, znalostních systémů atd. Stejně tak by bylo vhodné nahradit časově omezené zkušební verze programů softwarem bez tohoto omezení. Bylo by vhodné jednat s producenty programů o vytvoření výukových verzí pro naše účely. Z uvedeného přehledu je zřejmé, že situace se za několik posledních let změnila. Změna nespočívá v tom, že by byly volně dostupné výukové programy pro celou oblast lékařské informatiky, ale existuje dostatek výukových textů, seriálů snímků, programů, ukázkových prezentací a dalšího materiálu. Je však na učitelích lékařské informatiky, aby zdroje vyhledali a s jejich podporou sestavili výukové lekce. Nabízí se myšlenka spojit síly v Čechách a na Slovensku a pokusit se výuku s využitím těchto zdrojů zkvalitnit.

Závěr Provedený průzkum volně dostupných zdrojů pro výuku lékařské informatiky odhalil dostatek odborných textů, programů, ukázkových prezentací, ale žádný systém pokrývající celý obor.

Literatura 1. Naidr JP, Kasal P, Hladíková M, Feberová J. MEDINFOR 2, Informatika pro zdravotníky – praktická cvičení. UK, 2. LF, Ústav lékařské informatiky [on-line] 2000 [cit. 2004 Mar 25]. Dostupný na: 2. van Bemmel JH. HANDBOOK of MEDICAL INFORMATICS. Erasmus University, Rotterdam [on-line] 1999 [cit. 2003 Feb 17]. Dostupný na: 3. Krulichová I, Bukač J, Záhora J. STATproMED, Hypertextový program pro výuku pravděpodobnosti a statistiky na lékařských fakultách. UK, LF v Hradci Králové, Ústav lékařské biofyziky [on-line] 2001 [cit. 2004 Mar 25]. Dostupný na: 4. Swinscow TDV. Statistics at Square One. BMJ Publishing Group Ltd. [on-line] 1997 [cit. 2003 Feb 17]. Dostupný na: 5. Kasal P, Adla T, Feberová J et al. Citmed. UK, 2. LF, Ústav lékařské informatiky [on-line] 2001 [cit. 2004 Mar 26]. Dostupný na: 6. Bourek A. INFORMACE a VÝVOJ. Biofyzikální ústav LF MU [on-line] [cit. 2004 Mar 26]. Dostupný na: 7. Bourek A. ZDRAVOTNICKÁ INFORMATIKA. Biofyzikální ústav LF MU [online] [cit. 2004 Mar 26]. Dostupný na: 8. Bourek A. DEVELOPMENT OF INFORMATION (1). Biofyzikální ústav LF MU [on-line] [cit. 2004 Mar 26]. Dostupný na: 9. Bourek A. DEVELOPMENT OF INFORMATION (2). Biofyzikální ústav LF MU [on-line] [cit. 2004 Mar 26]. Dostupný na: 10. Crocodile Technology. Crocodile Clips Ltd. [on-line] 2004 [cit. 2003 Jul 8]. Dostupný na: 11. Friedman C. MedLEE – A Medical Language Extraction and Encoding System. Columbia University New York, Department of Medical Informatics [on-line] 1995 [cit. 2004 Mar 25]. Dostupný na: 12. MontiVision Image Analyser. Engineering Firm Cymontkowski [on-line] 2003 [cit. 2004 Mar 8]. Dostupný na: 13. VideoTesT-Morphology 4.0. VideoTesT, St.Petersburg, Russia [on-line] [cit. 2004 Mar 15]. Dostupný na: 14. VideoTesT-Structure 4.0. VideoTesT, St.Petersburg, Russia [on-line] [cit. 2004 Mar 15]. Dostupný na: 15. Boston RC, Greif PC. WinSAAM. University of Pennsylvania, New Bolton Center, Biostatistics Unit [on-line] [cit. 2004 Feb 17]. Dostupný na: 16. Inihov D, Kolesov Y, Senichenkov Y. Model Vision Studium Light. Experimental Object Technologies (XJ) [on-line] 2001 [cit. 2004 Feb 17]. Dostupný na:

139

17. VOXEL-MAN 3D-Navigator. Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Zentrum für Experimentelle Medizin [on-line] 2003 [cit. 2004 Mar 11]. Dostupný na: 18. Klar R et al. Visual Bayes – A tutoring and simulation system for the validation of diagnostic tests. Freiburg University Hospital, Department of Medical Informatics [on-line] 2003 [cit. 2004 Feb 17]. Dostupný na: 19. Visual Prolog Personal Edition. Prolog Development Center A/S, Denmark [online] [cit. 2004 Feb 17]. Dostupný na: 20. PubMed. U.S. National Library of Medicine [on-line] [cit. 2004 Mar 26]. Dostupný na: 21. Cochrane Reviews: abstracts & full-text access. The Cochrane Collaboration [online] [cit. 2004 Mar 26]. Dostupný na: 22. BioMed Central. BioMed Central Ltd. [on-line] [cit. 2004 Jan 26]. Dostupný na:

140

23. PLoS BIOLOGY. PLoS, San Francisco, USA [on-line] [cit. 2004 Feb 18]. Dostupný na: 24. TurboAsistent. TENEL CZ s.r.o. [on-line] [cit. 2004 Mar 26]. Dostupný na: 25. SOAPware. DOCS, Inc. [on-line] [cit. 2004 Feb 26]. Dostupný na: 26. Medinous Hospital Management System. Medinous Health Systems [on-line] [cit. 2004 Mar 8]. Dostupný na:

MUDr. Jan P. Naidr, Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta, Ústav lékařské informatiky, V Úvalu 84, 150 06 Praha 5. e-mail: [email protected]

VYUŽITÍ ELEKTRONICKÉHO PODPISU NA ELEKTRONICKÉ ZDRAVOTNICKÉ DOKUMENTACI Miroslav Novotný1, Petr Krásný2 STAPRO s.r.o.1, Dialog MIS spol s.r.o.2 Summary: Application of electronic signature for electronic medical documents. This work deals with analysis of technical and legal aspects of qualified electronic signature implementation in the area of electronic medical information systems with respect to real usability of such a signature as an equivalent to a manual signature on paper medical documents.

Key words: Electronic signature; Public key infrastructure; Electronic patient record; Medical information system

Souhrn: příspěvek se zabývá rozborem právních i technických dopadů aplikace zaručeného elektronického podpisu (ZEP) na zdravotnickou dokumentaci v elektronickém IS s ohledem na reálné možnosti jeho rovnocenného využití ve vztahu k vlastnoručnímu podpisu na papírové dokumentaci.

Zkratky a vysvětlivky Asymetrická kryptografie Skupina kryptografických algoritmů, které využívají rozdílné klíče (tajemství) pro proces šifrování a dešifrování. Tyto klíče jsou matematicky vzájemně komplementární a tvoří unikátní dvojici. Jeden klíč páru je držen jeho vlastníkem v tajnosti (soukromý klíč), druhý je naopak zveřejněn (veřejný klíč). Zašifrování zprávy jedním klíčem páru vede k použití druhého klíče v procesu dešifrování. Při tom nelze snadno odvodit soukromý klíč z klíče veřejného. Certifikát veřejného klíče Jde o digitální strukturovaný dokument, jehož struktura je definována příslušnými standardy. Tento dokument důvěryhodným způsobem vytváří vazbu mezi klíčovým párem a jeho vlastníkem. Důvěryhodnost dokumentu je zaručena digitálním podpisem certifikační autority, která certifikát vydala a zároveň na něm vyznačila období platnosti. CA (Certification Authority) Certifikační autorita, nezávislá a důvěryhodná strana, je hlavním subjektem poskytujících certifikační služby v rámci PKI. Jejím úkolem je vystavovat podle stanovených podmínek certifikáty vlastníkům klíčových párů asymetrické kryptografie a řídit jejich životní cyklus. Digitální podpis Jde o bitový řetězec odvozený z podepsaného dokumentu speciálním kryptografickým postupem za pomoci některého autentizačního faktoru (např. bezpečnostního předmětu). Digitální podpis může být založen na asymeACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):141–145

trické i symetrické kryptografii. V textu se budeme zabývat pouze EP založeným na asymetrické kryptografii. EP Elektronický podpis je jakákoli autentizační informace v číslicové formě: např. jméno a příjmení v elektronickém textovém dokumentu, digitalizovaný obraz manuálního podpisu (sken) připojený k elektronickému dokumentu, digitalizovaná podoba otisku prstu, digitální podpis. Všechny uvedené příklady elektronického podpisu umožňují jednoznačně identifikovat autora podpisu, ale pouze digitální podpis umožňuje (za určitých splnitelných podmínek) zajistit autentičnost podpisu. EZD Elektronická zdravotnická dokumentace je elektronická forma zdravotnické dokumentace jako alternativa k formě listinné a jako taková obsahuje (mimo jiné) citlivé osobní údaje sloužící k uskutečňování zdravotní péče. Kvalifikovaný certifikát Je definován v (8) jako určitý typ certifikátu podpisových dat, který splňuje náležitosti tohoto zákona (je označen jako kvalifikovaný; obsahuje obchodní jméno a sídlo CA, dále údaj o vydání v ČR, jméno a příjmení podepisující osoby, resp. její pseudonym, zvláštní znaky osoby, pokud to vyžaduje účel certifikátu, data pro ověření podpisu, zaručený elektronický podpis CA vydávajícího daný certifikát, evidenční číslo certifikátu, počátek a konec platnosti certifikátu, případné omezení použití, případné omezení hodnot transakcí). Dalším požadavkem je, aby byl vydán poskytovatelem certifikačních služeb (CA) splňujícím pod141

mínky zákona kladené na vydávání kvalifikovaných certifikátů dle vyhlášky (7). PKI (Public Key Infrastructure) Infrastruktura veřejného klíče je technologické, organizační a procesní prostředí poskytující služby spojené s vydáváním certifikátů veřejných klíčů využívaných pro bezpečnostní funkce (utajení, digitální podpis, autentizace aj.) založené na asymetrické kryptografii. TS (Time Stamp) Časové razítko je elektronický certifikát stvrzující skutečnost, že nějaký dokument existoval před daným časovým okamžikem v dané podobě. Tento certifikát je opatřen zaručeným elektronickým podpisem TSA (viz níže), která jej vydala. Časové razítko lze vydat a připojit i k samotným digitálním podpisům. TSA (Time Stamping Authority) Časová autorita je nezávislá důvěryhodná strana, která vystupuje v rámci PKI jako subjekt vydávající tzv. časová razítka k libovolným elektronickým dokumentům vč. ZEP. ZEP Zaručený elektronický podpis je definován v (8) jako určitý typ digitálního podpisu, který vykazuje následující bezpečnostní vlastnosti: • je jednoznačně spojen s podepisující osobou • umožňuje identifikaci podepisující osoby ve vztahu k datové zprávě (nehovoří se zde o míře důvěry v danou identifikaci) • byl vytvořen a připojen k datové zprávě pomocí prostředků, které podepisující osoba může udržet pod svou výhradní kontrolou • je svázán s datovou zprávou takovým způsobem, že je možné zjistit jakoukoliv následnou změnu dat ZIS Zdravotnický informační systém je zde chápán jako soubor SW zdravotnických aplikací, HW vybavení, dat obsahujících informace týkající se zdraví osob, procesů probíhajících nad těmito daty a zdravotnického personálu.

1) splňovaly ve vztahu k elektronickému dokumentu právní požadavky ekvivalentně jako vlastnoruční podpis ve vztahu k papírovému dokumentu 2) byly přijímány jako důkazní materiál v soudním řízení a zároveň nebyly a priori odmítány jako důkazní materiál jenom proto, že nesplňují některý bezpečnostní atribut (nejsou založeny na kvalifikovaném certifikátu, popř. nejsou vytvořeny prostředky pro bezpečné vytváření el. podpisů) Zmíněná direktiva zavázala členské státy EU, aby uvedly v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro naplnění jejích požadavků do 19. července 2001. Je třeba zdůraznit, že výše zmíněné požadavky neznamenají plné zrovnoprávnění elektronických a vlastnoručních podpisů v tom smyslu, že lze v právním řádu obě formy podpisu libovolně zaměňovat. Česká republika, ačkoli v tu dobu nebyla členem EU, reagovala na tento akt přijetím Zákona č. 227/2000 Sb. o elektronickém podpisu již s účinností od 1.10.2000 (8). O 10 měsíců později (1.8.2001) nabyla účinnosti novela 260/2001Sb., kterou se mění zákon 20/1966 Sb., o péči o zdraví lidu (9), jež kromě jiného stanoví právní podmínky pro vedení čistě elektronické zdravotnické dokumentace. Autoři novely stanovili jako nezbytnou podmínku vybavovat každou samostatnou část EZD zaručeným elektronickým podpisem. V době formulování textu tohoto příspěvku je před projednáním v parlamentu návrh novely (6), s nímž přišlo MI v srpnu 2003 a jež v případě schválení stávajícího znění poměrně zásadně změní právní prostředí pro využívání ZEP v ČR.

2. Standardizační báze EP Tento příspěvek z praktických důvodů nezkoumá využití jiné technologie elektronického podpisu než ZEP založený na architektuře PKI. Na poli technické a technologické standardizace EP operuje současně více subjektů, jejichž nejvýznamnější výsledky jsou v krátkosti níže rozvedeny. Nutno podotknout, že tento jistý standardizační paralelismus není konkurenční, ale konsensuální – normy a standardy vydané různými subjekty na sebe volně navazují (např. ETSI normy se odkazují na RFC a naopak).

1. Úvod V rámci procesu budování informační společnosti euroregionu byla na sklonku roku 1999 přijata Evropským parlamentem Direktiva 1999/93/EC (5) ukládající členským zemím EU zavést institut elektronického podpisu do jejich právního řádu a upravit podmínky jeho používání. Pro členské země EU z tohoto aktu vyplývá povinnost zajistit v souvislosti s implementací elektronického podpisu do právní praxe zejména to, aby zaručené elektronické podpisy (ZEP) založené na kvalifikovaných certifikátech a vytvořené pomocí prostředků pro bezpečné vytváření elektronického podpisu: 142

2.1 Evropská unie V lednu 1999 zahajuje činnost European Electronic Signature Standardization Initiative (EESSI) z podnětu Information Communications Technologies Standard Board (ICTSB) za podpory Evropské komise. Tato evropská iniciativa pro standardizaci elektronického podpisu pracuje formou širokého diskusního fóra zástupců průmyslu, veřejné správy a dalších subjektů. Posláním EESSI je iniciovat a koordinovat přípravu a přijetí norem pro oblast elektronického podpisu v regionu ES. Vlastní normy vznikají ve dvou nezávislých pracovních skupinách zformovaných v rámci ETSI a CEN na základě

Obr. 1: Rozdělení normotvorné činnosti pokrývající problematiku EP v EU. programu schváleného na sklonku r. 1999 řídícím výborem EESSI, který též rozdělil témata mezi obě skupiny (viz obr. 1). 2.1.1 ETSI/SEC ESI WG (Electronic Signature and Infrastructure Workgroup) 1. XML format for signature policies – TR 102 038 (April 2002) 2. Policy requirements for time-stamping authorities – TS 102 023 (April 2002) 3. Policy requirements for certification authorities issuing public key certificates – TS 102 042 (April 2002) 4. Policy requirements for certification authorities issuing qualified certificates – TS 101 456 v 1.2.1 (April 2002) 5. Provision of harmonized Trust Service Provider status information – TR 102 030 (April 2002) 6. FAQ (March 2002) 7. International Harmonization of Policy Requirements for CAs issuing Certificates – TR 102 040 (March 2002) 8. Time stamping profile – TS 101 861 v1.2.1 (March 2002) 9. Signature Policies Report – TR 102 041 (February 2002) 10. XML Advanced Electronic Signatures (XAdES) – TS 101 903 (February 2002) 11. Electronic Signature Formats – TS 101 733 v 1.3.1 (February 2002) 2.1.2 CEN/ISSS E-Sign Workshop (2001) Information Society Standardization System (ISSS) byl založen v r. 1997 a pracuje formou tzv. dílen (workshop). Cílem dílny E-Sign je stanovit požadavky na:

a) bezpečnost důvěryhodných systémů používaných pro vydávání kvalifikovaných cetifikátů VK (bezpečnost CA) b) bezpečnost bezpečných zařízení pro vytváření EP (generování klíčů, správa klíčů, proces tvorby podpisu) Dokumenty: 1. Guidelines for the implementation of Secure SignatureCreation Devices; Version 0.91, 2001-12-17 (approved) 2. General Requirements for Electronic Signatures, Version 0.66, 2002-05-06 3. Comment Resolution on General Requirements for Electronic Signatures, v.063, Feb 02 2002 4. Security Requirements for Trustworthy Systems Managing Certificates for Electronic Signatures; Version 0.17, 2001-08-01 (approved) 5. Cryptographic Module for CSP Signing Operations – Protection Profile (MCSO-PP); V 0.18 (approved) 6. Cryptographic Module for CSP Key Generation Services — Protection Profile — CMCKG-PP; Version 0.04, 2002-01-25 7. Secure Signatur-Creation Devices, version ‘EAL 4’, 2001-03-01* (approved) 8. Secure Signatur-Creation Devices, version ‘EAL 4+’, 2001-03-01* (approved) 9. Security Requirements for Signature Creation Systems; Version 3.0, 2000-10-08 (approved) 10. Procedures for Electronic Signature Verification; V 1.0.5, 2001-03-13 (approved) 11. Working Draft: Application Interface for SmartCards used as Secure Signature Creation Devices, Version 0.8 Release 0, 12th March 2002 143

12. EESSI Conformity Assessment Guidance: Part 1 – General, 2001-03-15 (approved) 13. EESSI Conformity Assessment Guidance: Part 2 – Certification Authority services and processes, 2001-0315 (approved) 2.2 Obecné standardy 2.2.1 ITU-T X.509 Nejstarší standard pro PKI, který kromě jiného též definuje formát certifikátu VK. 1) verze 1 (1988) – základní definice 2) verze 2 (1992) – přidána flexibilita jmen a) verze 3 (1993) – rozšíření definice o formátované bloky dat, např. definice povolených kryptografických operací, odkaz na CP, volitelné osobní údaje 3) verze 4 – rozšířená syntaxe atributových certifikátů, definice modelu PMI (Privilege Management Infrastructure) 2.2.2 IETF Pracovní skupina PKIX v rámci IETF (Internet Engineering Task Force) vytvořená v roce 1995 za účelem vytvoření RFC standardů pro PKI vyhovující standardu X.509 navrhla sadu standardů pro PKI, např.: – RFC 2439 On-line Certificate Status Protocol (OCSP) – RFC 2459 Internet X.509 Public Key Infrastructure Certificate and CRL Profile (PKIX) – RFC 2527 – standardy definující certifikační politiky (Certification Policy) a certifikační prováděcí směrnice (Certification Practice Statement) – RFC 2630 Cryptographics Message Syntax (CMS) – RFC 2634 Enhanced Security Services (ESS) – RFC 3029 Internet X.509 Public Key Infrastrucure Data Validation and Certification Server Protocols – RFC 3126 Electronic Signature Formats for long term electronic signatures – navazuje na RFC 2630 a RFC 2634 – RFC 3161 Internet X.509 Public Key Infrastrucure Time Stamp Protocol (TSP) – RFC 3280 – definuje způsob validace certifikátu 2.2.3 PKCS Klasická sada standardů pro aplikaci asymetrické kryptografie v PKI vyvíjená firmou RSA Data Security, Inc. jako náhrada dříve chybějících mezinárodních norem. – PKCS #1: „RSA Encryption“ – zahrnuje v sobě PKCS #2 a PKCS #4. Popisuje metodu RSA šifrování a dešifrování pro konstrukci digitálních podpisů a šifrovacích obálek, syntaxe je identická s doporučením X.509. Pro digitální podpis jsou použity 3 varianty: a) MD2 a RSA, b) MD4 a RSA, c) MD5 a RSA. – PKCS #3: Popisuje metodu Diffie-Hellman výměny klíčů. – PKCS #5: Popisuje šifrování zpráv tajným klíčem odvozeným z hesla. K odvození klíče z hesla používá MD2 nebo MD5 a k šifrování používá DES v CBC režimu. 144

– PKCS #6: Popisuje syntaxi certifikátů VK, která je nadmnožinou požadavků na certifikát dle X.509. – PKCS #7: „Cryptographics Message Syntax Standard“ – definuje syntaxi digitálních podpisů a šifrovaných zpráv vč. formátu certifikátů, umožňuje vnoření šifrovaných zpráv a násobné podepisování, povoluje dodatečné atributy, např. časové razítko. – PKCS #8: Popisuje syntaxi soukromého klíče a zašifrovaného SK v souboru – chráněn heslem. – PKCS #9: Definuje vybrané typy atributů tzv. rozšířených certifikátů dle standardu PKCS #6: podepsaných zpráv dle PKCS #7 a SK dle PKCS #8. – PKCS #10: „Certification Request Syntax“ – definuje syntaxi žádosti o vydání certifikátu VK, žádost obsahuje data podepsaná soukromým klíčem žadatele a je z pak odvozen certifikát VK dle X.509 nebo PKCS #6. – PKCS #11: Specifikace kryptografického API pro přenosná kryptografická zařízení (podpora např. v e-mail klientechNetscape Communicator, MSIE, Mozilla). – PKCS #12: „Personal Information Exchnge Standard“ – syntaxe pro uchovávání privátních klíčů a certifikátů VK v souborech – ochrana heslem. – PKCS #15: – definuje formát kryptografických dat uložených na bezpečnostním předmět.

3. Současný stav užití ZEP na EZD 3.1 Obecné právní prostředí využití ZEP 1) Právní řád a orgány MI umožňují technicky provést akreditaci CA tak, aby bylo možné vydávat kvalifikované certifikáty určené pro elektronickou komunikaci v rámci IS veřejné správy. Jediná akreditovaná certifikační autorita na území ČR je od března 2002 I.CA. 2) Právní řád ukládá zřídit elektronické podatelny na orgánech veřejné správy a samosprávy. Tyto elektronické podatelny jsou od počátku roku 2002 postupně uváděny do provozu. 3) Z hlediska právního řádu je možné v mnoha směrech použít ZEP, nikoli však rovnoprávně s podpisem manuálním. Výjimkou jsou dle (6) elektronické podatelny, prostřednictvím nichž probíhá přenos elektronicky podepsaných dokumentů mezi občanem a orgány veřejné moci se stejnou právní zárukou jako v případě ručně podepsaných dokumentů v listinné formě. V praxi nebylo vytvořeno dostatek vhodných a výhodných příležitostí, aby se ZEP začal masivněji používat. 4) Chybí sladění se vznikajícími evropskými standardy v rámci iniciativy EESSI, ačkoli návrh novely (6) a předpokládaná následující prováděcí vyhláška bude tento stav řešit. 5) Návrh novely (6) nově zavádí pojem autentizační data, kterými je možno automaticky autentizovat elektronickou dokumentaci. Z technického pohledu jde o analogii ZEP, který se ovšem generuje automatem, jejž uvádí v činnost autentizující osoba na základě tzv. kvalifikovaného systémového certifikátu. Přičemž autentizující oso-

bou může být jak osoba fyzická, tak právnická. Tento způsob autentizace však není z právního hlediska použitelný na EZD. 3.2 Právní prostředí využití ZEP na EZD Zákon č. 20/1966 Sb. ve znění pozdějších předpisů s účinností od 1.8.2001 výrazně ovlivňuje provoz elektronických informačních systémů ve zdravotnictví, protože stanoví požadavky na vedení čistě elektronické zdravotnické dokumentace. Mezi jinými je zde požadavek vybavit každou „samostatnou část zdravotnické dokumentace“ zaručeným elektronickým podpisem (ZEP) autora dokumentace (oprávněného zdravotnického pracovníka). Zákonná definice ZEP umožňuje v praxi, kdy je pro účely ZEP využívána architektura PKI, více variant realizace, které ve výsledku poskytují různou míru důvěryhodnosti konkrétního ZEP. V současné právní úpravě totiž neexistují dodatečné požadavky na vlastnosti prostředků a prostředí, v němž je ZEP na EZD vytvářen. 3.3 Aktuální stav implementace ZEP v ZIS Dle dostupných informací neexistuje v době psaní příspěvku zdravotnický IS (ZIS) provozovaný na území ČR, který by v rutinním provozu implementoval ZEP v oblasti ambulantní péče, v lůžkové péče, ani v oblasti komplementárních zdravotnických provozů. Většina významných dodavatelů IS v oblasti ambulatní péče na zavedení ZEP již pracuje. Nicméně je patrné více než dvouleté zpoždění mezi počátkem platnosti zákonného ustanovení ohledně povinného používání ZEP na čistě EZD a současným stavem zavedení ZEP do ZIS. Hlavní příčiny tohoto stavu jsou následující: • Uživatelé a provozovatelé ZIS nejsou v dostatečném množství zorientováni a vnitřně srozuměni s podmínkami zákonného vedení elektronické dokumentace. • Zákonné podmínky vedení čisté EZD ve vztahu k ZEP jsou z pohledu tvůrců ZIS nejednoznačně aplikovatelné v důsledku absence příslušných podzákonných norem upravujících specifika používání ZEP v prostředí ZIS (např. dlouhodobá platnost ZEP na archivované zdravotnické dokumentaci, jednoznačná identifikace autora EZD apod.) • Neexistence dlouhodobých zkušeností v oblasti komerčního poskytování a využívání certifikačních služeb vede k nedůvěře uživatelů i poskytovatelů certifikačních služeb v technologicko-obchodní koncept PKI zvláště v situaci, kdy příslušná legislativa není vyzrálá a není plně v souladu s evropským právem (viz 1) a neskýtá stranám zúčastněným v procesu elektronického podepisování dostatečnou právní ochranu v případě pokusů o zneužití ZEP (viz 3). V průběhu roku 2004 lze předpokládat výraznější pokrok v praktické aplikaci ZEP jednak z důvodu tlaku na novelizaci příslušné národní legislativy ze strany orgánů EU (viz 1), a jednak z důvodu pozvolného růstu praktických zkušeností v této oblasti IT v rámci celého evropského regionu (viz např. 2).

4. Analýža požadavku aplikovatelnosti ZEP na EZD Základním smyslem aplikace ZEP na EZD je dosáhnout přibližně ekvivalentní anebo vyšší důkazní síly ve srovnání s podpisem vlastnoručním na papírové zdravotnické dokumentaci. Zároveň je velmi žádoucí celý systém ZEP na EZD a priori neuzavřít jen pro určitou komunitu zdravotnických pracovníků či určitou oblast poskytování zdravotnických služeb, i když lze předpokládat postupné nasazování ZEP např. jen v rámci jednotlivých fakultních nemocnic či v komunitě praktických lékařů. 4.1 Objektivní důvody zavedení ZEP do ZIS Zdravotnická zařízení používající elektronický ZIS mají zájem na minimalizaci papírové formy zdravotnické dokumentace z těchto důvodů: • elektronické ZIS z hlediska dostupnosti informace a manipulačních možností většinou daleko předčí listinné kartotéky • vedení listinné dokumentace způsobuje dodatečné náklady finanční (nákup papíru, archivace, skartování) i časové (vyhledávání dokumentace, předávání na jiné oddělení či jinému zdravotnickému subjektu) • EZD umožňuje mnohem dokonalejší využití uložených informací při hromadném zpracování pro ekonomické, statistické a vědecké účely 4.1.1 Legislativní shoda Vedení čistě elektronické formy zdravotnické dokumentace nevybavené ZEP je od 1.8.2001 na základě novely (9) protizákonné. 4.1.2 Praktické vynucení autentičnosti a nepopiratelnosti autorství V souladu se zdravotnickou etikou vyvíjejí zdravotnická zařízení v ČR (zejména z okruhu FN) tlak na průkazný způsob manipulace s elektronickou zdravotnickou dokumentací. Záměrem je dosáhnout uspokojivé úrovně její autentičnosti ve vztahu k jejímu autorovi (autorům) zejména při transferu této dokumentace elektronickou cestou mezi jednotlivými zdravotnickými zařízeními či jejich provozními jednotkami. 4.2 Požadavky na ZEP na EZD Vycházejí z životního cyklu zdravotnické dokumentace. Podstatné se jeví následující skutečnosti: • Konkrétní zdravotnickou dokumentací může vytvářet více zdravotnických pracovníků (autorů), kteří potřebují vzájemně validovat jednotlivé její části. • Využití zdravotnické dokumentace může překročit hranice jednoho zdravotnického zařízení. • Autentičnost zdravotnické dokumentace musí být důvěryhodně přezkoumatelná během celého svého životního cyklu, aby nebylo možno v případě soudního sporu popřít její autorství. 145

4.2.1 Bezpečnostní požadavky 1. Udržení privátního klíče v tajnosti. 2. Použití dostatečně důvěryhodného poskytovatele certifikačních služeb (CA), a tím i důvěryhodného certifikátu. 3. Zachování pravidel práce s certifikáty ze strany ověřovatele ZEP. 4. Použití důvěryhodného časového razítka (TS) pro konstrukci ZEP. 5. Použití dalších datových atributů při konstrukci ZEP zakládajících jeho dlouhodobou důvěryhodnost (viz 4). 4.2.2 Realizační podmínky 1. ZEP musí být zaveden v souladu s platnou legislativou (viz kapitola 1.). 2. ZEP musí být po stránce technické realizován na základě mezinárodně uznávaných a používaných standardů (viz kapitola 2). 3. Procesy související se zavedením a využíváním ZEP (proces vydávání certifikátů, funkce certifikačních služeb, vytváření a ověřování ZEP) musí být navrženy, implementovány tak, aby respektovaly bezpečnostní nároky vyplývající ze specifičnosti EZD (zejména dlouhodobá přezkoumatelnost platnosti ZEP na EZD). 4. Certifikáty (data pro ověření ZEP) musí jednoznačně identifikovat majitele podpisových dat, aby bylo možné snadno určit autora EZD na základě jeho certifikátu, a musí být veřejně dostupné. 5. Komerční podmínky používání certifikačních služeb (zejména vydávání kvalifikovaných certifikátů a kvalifikovaných časových razítek ), jakož i dostupnost vhodných prostředků pro bezpečné vytváření a ověřování ZEP musí odpovídat možnostem trhu v segmentu zdravotnictví. 4.3 Sporné body využití ZEP pro EZD 1) Současná zákonná definice ZEP umožňuje v praxi, kdy je pro účely ZEP využívána architektura PKI, více variant realizace, které ve výsledku poskytují různou míru důvěryhodnosti konkrétního ZEP. Je zde patrná absence příslušných podzákonných norem upravujících specifika používání ZEP v prostředí ZIS (dlouhodobá platnost ZEP na archivované zdravotnické dokumentaci, jednoznačná identifikace autora EZD apod.). 2) Není jasné, jak bude justice postupovat v případě soudního řízení, kdy jako důkazní materiál bude použita EZD podepsaná ZEP splňující minimální bezpečnostní požadavky novely (9), které nemohou zaručit důkazní sílu ekvivalentní podpisu vlastnoručnímu zvláště v dlouhodobém časovém horizontu. 3) Sporným bodem je pojem „samostatná část zdravotnické dokumentace“, jejíž zápisy mají být vybaveny ZEP. Tento pojem není z hlediska technického dostatečně přesně v novele (9) vymezen. 4) Není jasné, jaké jsou zákonné požadavky na délku archivace zdravotnické dokumentace. S tím souvisí technický problém dlouhodobé (trvající desetiletí) důvěryhodnosti 146

ZEP na archivované dokumentaci, který je dán následujícími faktory: a) Elektronická média podléhají rychlému technologickému vývoji. Použitelnost týchž originálních médií nelze v horizontu desetiletí předpokládat (na rozdíl od např. filmové nebo papírové dokumentace). b) ZEP nevybavený časovým razítkem se z principu své realizace vymkne z období (typicky několikaletého), kdy je prostřednictvím PKI garantována jistá míra jeho důvěryhodnosti. c) ZEP vybavený časovým razítkem je sice relativně dlouho zachován v režimu garantované důvěryhodnosti, nicméně s ohledem na rychlost snižování odolnosti kryptografických postupů způsobené neustálým zlevňováním jednotkového výpočetního výkonu nelze rovněž předpokládat delší období garance důvěryhodnosti než 20 až 30 let. 5) Není vytvořen systém jednotné identifikace zdravotnických pracovníků, jejichž unikátní identifikátor by měl být součástí certifikátu.

5. Návrh řešení Jak vyplývá z kapitoly 3.1, plošné zavedení ZEP na zdravotnické dokumentaci nebude v ČR zcela pionýrským projektem, protože státní správa v souladu s programem Státní informační politiky postupně realizuje kroky vedoucí k faktickému využívání ZEP na bázi PKI (viz např. zřizování elektronických podatelen na základě Nařízení vlády 304/2001 Sb. a v současnosti projednávání novely – 6). Nicméně úspěch zavedení ZEP a využití PKI v resortu zdravotnictví velmi závisí na respektování specifických potřeb tohoto resortu. Subjekty, které se účastní práce s elektronicky podepsanou zdravotnickou dokumentací, tvoří zejména: 1. zdravotnická zařízení 2. zodpovědní zdravotničtí pracovníci aktivně se podílející na zdravotní péči (dále jen zodpovědní pracovníci) a vytvářející EZD pomocí SW aplikace NIS, ambulantní IS, IS komplementů apod. 3. ostatní pracovníci s vymezeným právem nahlížet do zdravotnické dokumentace viz § 67b odst. 10 novely (9) (dále jen ostatní oprávnění pracovníci). 5.1 Důvěryhodnost ZEP na EZD Jak bylo výše zmíněno, platná právní úprava (9) neklade explicitní požadavky na důvěryhodnost ZEP připojeného k EZD, čímž existují podstatná rizika zneužití ZEP (viz např. 3). Je zřejmé, že dosažení vyšší důvěryhodnosti ZEP je spjaté s vyššími náklady a organizačními nároky na celou infrastrukturu PKI. Vzhledem k povaze zdravotnické dokumentace však navrhujeme, aby pro ZEP na EZD byly kladeny minimálně stejné nároky jako na ZEP používaný pro komunikaci občanů se státní správou, tj. aby splňoval následující rysy:

1. Je vytvářen prostředkem pro bezpečné vytváření EP (viz § 17 zákona (8) ve znění novely (6)). Prostředkem pro bezpečné vytváření el. podpisů je soubor HW a SW komponent (např. čipová karta, čtečka čipových karet, SW knihovna pro přístup aplikace k datům na čipové kartě, SW nástroj pro práci s dokumentací), které umožňují zodpovědným pracovníkům (podepisujícím osobám) bezpečně manipulovat s privátními podpisovými daty a splňují další bezpečnostní kritéria stanovená zákonem. Tento bod tedy zajistí první bezpečnostní požadavek z podkapitoly 4.2.1, kterým je znemožnění zneužití platných podpisových dat pro podvržení ZEP na EZD. 2. Je založen na kvalifikovaném certifikátu vydaném akreditovaným poskytovatelem certifikačních služeb (viz § 11 zákona (8) ve znění novely (6)). Tento bod zajistí druhý bezpečnostní požadavek z podkapitoly 4.2.1 na důvěryhodnost ZEP tím, že zaručí důvěryhodnost údajů uvedených v certifikátech uživatelů podpisových dat, neboť příslušný vydavatel certifikátů je vázán naplnit ustanovení § 6, § 6a, § 6b zákona (8) ve znění novely (6). Tato ustanovení směřují k zajištění bezpečné a důvěryhodné funkce akreditovaného poskytovatele certifikačních služeb, bezpečnost jeho informačního systému je prověřena orgánem MI a jeho činnost je pod dozorem MI. V rámci akreditace je též prověřena schopnost poskytovatele svými finančními zdroji krýt škody způsobené chybnou činností při vydávání a udržování kvalifikovaných certifikátů. Oproti stávajícím požadavkům kladeným na statut akreditovaného poskytovatele certifikačních služeb návrh novely (6) umožňuje, aby tímto poskytovatelem mohla být i fyzická či právnická osoba nezapsaná v obchodním rejstříku, která splňuje zákonem stanovené podmínky. Toto jisté rozvolnění by mohlo umožnit zřízení certifikační autority a systému registračních autorit v gesci MZ, které budou naplňovat vysoké nároky kladené na akreditovaného poskytovatele certifikačních služeb a při tom nepůjde o komerční činnost. Tím by mohly být vytvořeny ekonomické i technické předpoklady pro masivní vydávání kvalifikovaných certifikátů v resortu MZ. 3. Je ověřován prostředkem pro bezpečné ověřování elektronických podpisů (viz § 17 zákona (8) ve znění novely (6)). Obdobně s bodem 1. prostředek pro bezpečné ověřování elektronických podpisů je zpravidla SW nástroj, který má zejména zaručenou funkcionalitu co do pravdivosti a úplnosti obsahu dotčeného dokumentu, jehož podpis je ověřován, a dále umožňuje snadnou a bezpečnou kontrolu platnosti dat pro ověření podpisu (certifikátu veřejného klíče zodpovědné osoby). Praktické naplnění tohoto bodu je samozřejmě vázáno na naplnění bodu 1. Tímto je položen základ pro naplnění 3. bezpečnostního požadavku z podkapitoly 4.2.1. 4. Je opatřen kvalifikovaným časovým razítkem (viz § 12b zákona (8) ve znění novely (6)).

Pojem kvalifikovaného časového razítka není ve stávající právní úpravě ZEP znám, nicméně návrh novely (6) s ním již pracuje. V souvislosti se ZEP na EZD je podstatné důvěryhodně vyznačit časový okamžik, před nímž zcela jistě daný podepsaný dokument existoval, protože pak je možné stanovit, zda byl či nebyl ZEP vytvořen v době platnosti podpisových dat (v architektuře PKI je toto vyznačeno na certifikátu veřejného klíče, tato doba bývá v závislosti na certifikační politice řádově jednotky let a certifikáty jsou uchovávány u akreditovaného poskytovatele certifikačních služeb dle zákona nejméně po dobu 10 let). Kvalifikovaná časová razítka opět může vydávat akreditovaný poskytovatel certifikačních služeb on-line způsobem, zpravidla prostřednictvím sítě Internet. Tím je zajištěn 4. bezpečnostní požadavek na ZEP na EZD, neboť u ní se předpokládá dlouhá doba archivace a potřeba i po mnoha letech ověřit pravost dokumentace. 5. V odůvodněných případech je možné zvážit použití formátů ZEP typu ES-X definovaných v (4) zajišťujících dlouhodobou validovatelnost. Použití těchto formátů s sebou přináší dodatečné kapacitní nároky (velikost ZEP se zmnohonásobí), organizační nároky (např. dlouhodobá archivace certifikátů, seznamů odvolaných certifikátů, systémových certifikátů) a složitější validační proces. 5.2 Proces získání podpisových dat a dat pro ověření EP Tento proces je klíčový pro ekonomické a bezpečné zavedení ZEP na EZD a musí splňovat podmínky uvedené v kapitole 4.2.2. Podílejí se na něm zdravotnická zařízení, zodpovědní pracovníci a akreditovaný poskytovatel certifikačních služeb (dále jen poskytovatel). Proces probíhá na základě standardizované certifikační politiky (CP) vydané poskytovatelem certifikačních služeb schematicky v těchto krocích: 1. Pověřený útvar zdravotnického zařízení vygeneruje standardizovaným způsobem SW nebo HW nástrojem klíčový materiál, z něhož jsou odvozena podpisová data (soukromý klíč), která jsou uchována v příslušném prostředku pro bezpečné vytváření ZEP (čipová profesní karta). SW aplikace dále vygeneruje žádost o vydání příslušného certifikátu veřejného klíče ve formě standardizovaného elektronického digitálně podepsaného formuláře a zašle jej na příslušné registrační místo. V případě praktického lékaře toto provede on sám. Dále je navázán smluvní vztah zakotvující práva a povinnosti podepisujících osob nebo držitelů certifikátů (viz zákon (8) ve znění novely (6)). 2. Je provedena procedura registrace fyzické osoby (zodpovědného pracovníka), jehož jednoznačná identifikace je na žádosti o certifikát uvedena. Toto proběhne na určených registračních místech, jež jsou pod správou akreditovaného poskytovatele, nebo příslušný mobilní registrační orgán může tuto proceduru provést v místě 147

zdravotnického zařízení. Rozhodující pro volbu té které varianty bude ekonomičnost procedury registrace v konkrétním případě. 3. Žádost je zpracována a poskytovatel žadateli vystaví v souladu se zákonem kvalifikovaný certifikát standardního formátu, který splňuje požadavek na jednoznačnou identifikaci zdravotnického pracovníka a po té jej povinně zveřejní (viz zákon (8) ve znění novely (6)). Poskytovatel zajistí dlouhodobou archivaci vydaných certifikátů a seznamů odvolaných certifikátů v souladu s realizačním požadavkem 3. v kapitole 4.2.2. 4. Doporučujeme, aby akreditovaným poskytovatelem certifikačních služeb byl orgán MZ. Lze předpokládat následující výhody: • snížení nákladů spojených s certifikačními službami z důvodu snazší akreditace (meziresortní proces) a neziskovosti provozu (státní dotace) • centrální řiditelnosti celého procesu • zjednodušení PKI architektury • vyšší bezpečnosti než v případě libovolné množiny poskytovatelů operujících v komerční sféře. Samozřejmě vážným rizikem projektu vybudování a provozování akreditovaného poskytovatele budou zejména finanční a personální nároky. 5.3 Proces vytvoření ZEP na EZD Na tomto procesu se podílí zodpovědní pracovníci (podepisující osoby) a akreditovaný poskytovatel. V tomto procesu lze vysledovat tyto kroky: 1. Zodpovědný pracovník se autentizuje vůči bezpečnému prostředku pro vytváření EP, který může být tvořen SW aplikací a HW předmětem (např. čipová karta), který je nosičem podpisových dat. Tato autentizace je alespoň dvoufaktorová a dostatečně bezpečná (toto je dáno specifikací „bezpečného prostředku“). HW předmět je před vlastní autentizací fyzicky připojen k výpočetnímu systému, pomocí něhož se podpis realizuje. Jakékoli i krátkodobé přerušení přítomnosti HW předmětu musí vynutit novou autentizaci zodpovědné osoby před vytvořením podpisu. 2. Zodpovědný pracovník si zobrazí a vyznačí text zápisu, který hodlá vědomě a svobodně elektronicky podepsat (zpravidla půjde o zápis do samostatné části zdravotnické dokumentace – viz odst. 7 písm. a) § 67b v (9)) a dá SW aplikaci pokyn k tomuto úkonu. (Aplikace by měla umožnit i práci bez vytváření ZEP, protože je legální EZD vytisknout a podepsat vlastnoručně.) Vlastní přidání ZEP k danému textu proběhne v souladu s požadavky kladenými na „bezpečný prostředek“, tj. je podepsán právě ten text, k němuž zodpovědný pracovník chtěl podpis připojit, podpisová data nemodifikují vlastní text a podpisová data nejsou během podepisování odposlechnutelná. 3. SW aplikace automaticky ihned nebo na základě určité události (např. při uzavírání kartotéky) vygeneruje žádosti o časová razítka podepsaných, ale neorazítkova148

ných zápisů. Je třeba si povšimnout, že kvalifikované časové razítko nese přesný údaj o SEČ. Pro potřeby EZD však vyhoví údaj o datu podepsání zápisu. Proto je v zásadě možné časová razítka vydávat hromadně s určitým časovým zpožděním, nejpozději však týž den. On-line časová razítka vyžadují rychlý komunikační kanál směrem k poskytovateli, který nemusí být vždy dostupný, zvláště používá-li pro se připojení ZZ k poskytovateli vytáčené internetové spojení. Kromě možných problémů s on-line připojením k poskytovateli je dalším rizikem projektu schopnost zdravotnického zařízení pořídit si odpovídající technologické vybavení a náklady spojené s prověřením bezpečnosti používaných podpisových prostředků (kombinace SW aplikace a HW předmět). 5.4 Proces ověření ZEP na EZD Konkrétní EZD vybavená ZEP zpravidla neslouží jen pro výkon léčebné péče zodpovědného pracovníka, který do ní provádí zápisy. Na tvorbě EZD týkající se jednoho klienta může kooperovat více zodpovědných pracovníků, každý z nich pak může mít potřebu se přesvědčit, který kolega daný zápis provedl. Navíc tato EZD může být zpřístupněna k nahlédnutí ostatním oprávněným pracovníkům nezaměstnaným v daném zdravotnickém zařízení, kteří mohou vyžadovat kontrolu autentičnosti údajů uvedených v EZD. Subjekty kooperujícími v tomto procesu tedy jsou zodpovědní pracovníci, ostatní oprávnění pracovníci, akreditovaný poskytovatel certifikačních služeb. Proces ověření, za jehož realizaci je zodpovědná osoba spoléhající se na ZEP, lze shrnout do těchto kroků: 1. Import a ověření pravosti kvalifikovaného systémového certifikátu poskytovatele (pojem zavedený návrhem novely (6)) do úložiště certifikátů, jež je přístupné bezpečnému prostředku pro ověření EP (např. SW úložiště na lokálním HDD výpočetního systému). Tento krok je potřeba provést na začátku všech následných ověření ZEP. MI zveřejňuje údaje pro ověření pravosti kvalifikovaných systémových certifikátů akreditovaných poskytovatelů certifikačních služeb. 2. Manuální import certifikátů zodpovědných pracovníků, na jejichž ZEP se osoba spoléhá, do lokálního úložiště certifikátů přístupného prostředku pro ověření podpisu, popř. aktivace automatického vyhledávání certifikátů na veřejně přístupném seznamu (adresářová služba dle doporučení ITU-T X.500). Službu zveřejnění certifikátů dodává poskytovatel zpravidla prostřednictvím sítě Internet, ale tato služba může být implementována i v LAN zdravotnického zařízení např. v případě uzavřené lékařské komunity. 3. Použití bezpečného prostředku pro ověření EP, který automaticky zkontroluje aktuální stav certifikátu osoby, která podpis vytvořila (tj. dobu platnosti, platnost všech certifikátů v certifikační cestě a případné předčasné zrušení platnosti), a poté ověří pravost ZEP. Tento proces může být poměrně technicky komplikovaný, pokud bude

ověřována platnost ZEP po době vypršení platnosti časového razítka. 4. Poté je ověřeno kvalifikované časové razítko za pomoci systémového certifikátu poskytovatele a osoba spoléhající se na ZEP je informována o výsledku tohoto ověření. 5. O výsledku ověření pravosti ZEP musí dle § 17 odst. 4 zákona (8) ve znění novely (6) bezpečný prostředek pro ověřování EP spoléhající osobu jednoznačně informovat.

6. Řešení sporných bodů Body 1) a 3) v kapitole 4.3 doporučujeme řešit změnou legislativy zejména novelizací zákona 20/1966 Sb., o péči o zdraví lidu ve znění pozdějších předpisů. Máme signály, že takovéto aktivity na úrovni MZ aktuálně probíhají. Bod 4) je opět řešitelný novelizací příslušných právních norem, nicméně stále chybí zkušenosti s vytvářením a ověřováním dlouhodobě platných ZEP. Velmi klíčová bude otázka volby správného technologického standardu. V této věci by mohlo jistě pomoci vypsání grantu na pilotní realizaci ZIS používající ZEP s dlouhodobou platností. Vyřešení sporného bodu 5) uvedeného v kapitole 4.3 a vybudování resortní PKI je klíčové pro rutinní používání ZEP na EZD zejména v regionálních nemocničních informačních systémech z důvodů velkých datových objemů,

komplikovaného oběhu EZD, velkého množství zdravotnického personálu apod. nicméně si vyžádá především obtížná politická jednání, jejichž výsledek je těžké predikovat.

Zdroje a literatura 1. Antonín M. Cesta k evropskému právu. Data Security Management 2003;6:12-13. 2. Bradner R, van der Haak M, Hartmann M, Haux R, Schmucker P. Electronic Signature for Medical Documents Integration and Evaluation of a Public Key Infrastructure in Hospitals. Methods Inf Med 2002;4:321-30. 3. Matejka J, Vondruška P. Odpovědnost v souvislosti s útoky na „elektronický podpis“. Sborník konference Security 2002, Praha, 6. června 2002:24–38. 4. Pinkas D, Pope N, Ross J et al. Electronic Signatures Formats for long term electronic signatures. RFC 3126, September 2001. ?to je úplná citace 5. Directive 1999/93/EC of the European Parliament of the Council of 13 December 1999 on a Community framework for electronic signatures, Brussels, 13 December 1999. 6. Návrh novely zákona č. 227/2000 Sb. o elektronickém podpisu, www.micr.cz, srpen 2003. 7. Vyhláška 366/2001 Sb. o upřesnění podmínek stanovených v § 6 a § 17 zákona o elektronickém podpisu a o upřesnění požadavků na nástroje elektronického podpisu, Sbírka zákonů, 10.10.2001. 8. Zákon 227/2000 Sb. o elektronickém podpisu, Sbírka zákonů částka 68/2000. 9. Zákon 260/2001 Sb., kterým se mění zákon 20/1966 Sb., o péči o zdraví lidu ve znění pozdějších předpisů, Sbírka zákonů částka 100/2001, 25.7.2001.

Ing. Miroslav Novotný, STAPRO s.r.o., Pernštýnské nám. 51, 530 02 Pardubice e-mail: [email protected] www.stapro.cz

149

150

RADIOTERAPIE S MODULOVANOU INTENZITOU V LÉČBĚ KARCINOMU ŠTÍTNÉ ŽLÁZY Milan Vošmik, Karel Odrážka, Milan Zouhar, Jiří Petera, Josef Dvořák, Zdeněk Zoul Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové a Fakultní nemocnice v Hradci Králové: Klinika onkologie a radioterapie Summary: Intensity-modulated radiotherapy in the treatment of thyroid cancer. The main problem of the conventional radiotherapy in postoperative or curative irradiation in thyroid cancer is to achieve a sufficient dose in the planning target volume with acceptable dose distribution homogeneity and at the same time not to exceed tolerance doses in the organs of risk. Our study presents the advantages of intensity-modulated radiotherapy over conventional radiotherapy on an example of dosimetric comparisons of isodose plans of three patients treated at our department. The intensity-modulated radiotherapy in thyroid cancer offers an improvement of dose homogeneity and better sparing of organs at risk (spinal cord and lungs). Furthermore, dose escalation is feasible in the whole initial planning target volume up to 60 Gy with a simultaneous sparing of healthy tissues and organs at risk.

Key words: Radiotherapy; Intensity-modulated; IMRT; Thyroid gland; Cancer

Souhrn: Hlavním problémem konvenční radioterapie v pooperační nebo kurativní indikaci u karcinomů štítné žlázy je dosažení dostatečné dávky v plánovacím cílovém objemu při akceptovatelné homogenitě distribuce dávky a současném nepřekročení tolerančních dávek v rizikových orgánech. Studie dokumentuje výhody radioterapie s modulovanou intenzitou proti konvenční radioterapii na příkladu dozimetrického srovnání ozařovacích plánů tří pacientů léčených na našem pracovišti. Radioterapie s modulovanou intenzitou u karcinomu štítné žlázy nabízí zlepšení homogenity dávky i šetření rizikových orgánů (míchy a plic). Dále umožňuje eskalovat dávku do celého vstupního plánovacího cílového objemu do výše 60 Gy při současném šetření zdravých tkání a rizikových orgánů.

Úvod Karcinomy štítné žlázy nejsou na pracovištích radiační onkologie příliš častými diagnózami. Jejich léčba je obvykle založena na radikálním chirurgickém výkonu. Diferencované karcinomy (papilární a folikulární) bývají pooperačně indikovány k terapii radiojódem a hormonální supresní léčbě (2). Pooperační zevní radioterapie (RT) může přicházet v úvahu ve vybraných indikacích u medulárního karcinomu i diferencovaných karcinomů, téměř standardně se indikuje u velmi agresivního anaplastického karcinomu (1). Při inoperabilních nálezech bývá indikována zevní radioterapie jako tzv. radikální (eskaluje se dávka na oblast tumoru). Klinický cílový objem zahrnuje štítnou žlázu nebo její lůžko, krční, nadklíčkové a horní mediastinální uzliny po bifurkaci trachey. Plánovací cílový objem (planning target volume; PTV = klinický cílový objem + bezpečnostní lem) obdrží dávku 44–50 Gy, poté se plánovací cílový objem omezí na oblast štítné žlázy nebo jejího lůžka, eventuálně s přilehlými krčními uzlinami. Celková dávka na tuto oblast se obvykle pohybuje od 60 Gy (pooperační RT) do 70 Gy (radikální RT). Vzhledem k uložení spádových lymfatických uzlin je velkým problémem volba ozařovací techniky – musí být zaACTA MEDICA (Hradec Králové) SUPPL 2004;47(2):151–154

ručena dostatečná a homogenní dávka v plánovacím cílovém objemu a zároveň nesmějí být překročeny toleranční dávky rizikových orgánů (především míchy a plic). Maximální dávka v oblasti míchy by neměla překročit 44–46 Gy, při aplikaci vyšších dávek stoupá riziko radiačního poškození. V případě plicní tkáně je snaha minimalizovat objem plicní tkáně, který je ozářen dávkou 20 Gy a výše. Standardně užívané techniky jsou pak nuceny hledat řešení v kompromisu mezi homogenitou dávky a výší aplikované dávky na oblast celého plánovacího cílového objemu. Cílem práce bylo prokázat dozimetrické výhody radioterapie s modulovanou intenzitou (IMRT) v léčbě karcinomu štítné žlázy proti standardně užívané ozařovací technice a ověřit možnou eskalaci dávky na oblast celého cílového objemu bez zmenšování při nepřekročení tolerančních dávek rizikových orgánů.

Metodika Pro dozimetrická srovnání byla použita data tří pacientů z počítačového tomografu (Siemens Somatom DR Plus). Tito pacienti byli v minulých měsících indikováni na našem pracovišti k zevnímu ozáření na oblast krku, nadklíčků 151

Tab. 1: Výsledky z dávkově objemových histogramů porovnávající konvenční radioterapii – standardní technika a IMRT pro dávku 50 Gy: Dmax – maximální dávka v objemu, Dmean – průměrná dávka v objemu, Dmedian – střední dávka v objemu, V≥n Gy – objem orgánu, ozářený dávkou vyšší než n Gy.

PTV Dmax (Gy) PTV Dmean (Gy) PTV Dmedian (Gy) DPTV 90% (Gy) Mícha Dmax (Gy) Mícha + l em 1 cm Dmax (Gy) Pravá plíce V≥10 Gy Pravá plíce V≥250 Gy Pravá plíce V≥30 Gy Levá plíce V≥10 Gy Levá plíce V≥25 Gy Levá plíce V≥30 Gy

Pacient I Stand. IMRT technika technika 55,01 53,60 45,11 50,17 46,29 50,59 ≥39 ≥48 43,65 34,70 45,35 42,29 ≅29% ≅35% ≅24% ≅15% ≅22% ≅11,5% ≅28% ≅38% ≅23% ≅15% ≅22% ≅11%

Tab. 2: Výsledky z dávkově objemových histogramů pro IMRT techniku a dávku 60 Gy: Dmax – maximální dávka v objemu, Dmean – průměrná dávka v objemu, Dmedian – střední dávka v objemu, DPTV 90% – minimální dávka v objemu 90 %. PTV Dmax PTV Dmean PTV Dmedian DPTV 90% Mícha Dmax Mícha+lem Dmax Plíce V≥20 Gy Plíce V≥25 Gy

Pacient III Stand. IMRT technika technika 56,97 53,25 44,62 49,61 45,93 50,02 ≥38 ≥48 44,45 33,65 46,36 39,19 ≅22% ≅26% ≅18% ≅13% ≅17% ≅10% ≅26% ≅32% ≅14% ≅12,5% ≅13% ≅9%

Pacient I

Pacient II

Pacient III

63,66 Gy

65,00 Gy

64,09 Gy

59,56 Gy

59,56 Gy

59,69 Gy

60,03 Gy

60,08 Gy

60,12 Gy

≥57,5 Gy

≥57 Gy

≥ 58 Gy

41,34 Gy

34,90 Gy

31,33 Gy

47,14 Gy

46,05 Gy

45,09 Gy

≅ 25 %

≅ 24 %

≅ 18 %

stinálních uzlin s bezpečnostním lemem 1 cm, a objemy rizikových orgánů: plíce, mícha a mícha s bezpečnostním lemem 1 cm. Pro zakreslování objemů a vlastní plánovací proces byl využit plánovací systém Cadplan V 6.3.6 s modulem Helios pro inverzní plánování a zadanými parametry pro ozařování na lineárním urychlovači Clinac 600C (energie 6 MeV) s vícelistovým kolimátorem (2x26 lamel po 1 cm). Hodnocena byla technika radioterapie s modulovanou intenzitou s využitím 7 koplanárních polí. Technika byla porovnávána se standardně užívanou technikou velkého předního pole s dosycením mediastinální oblasti ze zadního malého pole s podélným klínem. Ozařovací plány počítaly s aplikací 50 Gy na oblast PTV. Hodnocení ozařovacích plánů proběhlo na základě porovnání dávkově objemových histogramů u každého pacienta individuálně. Pro ověření eskalace dávky na oblast vstupního plánovacího cílového objemu (bez zmenšování) byla provedena nová optimalizace s požadavkem dosažení 60 Gy do definovaného PTV při zachování limitů na objemy jednotlivých rizikových orgánů.

≅ 19,5 %

≅ 18 %

≅ 15 %

Výsledky

a mediastina pro některý z karcinomů štítné žlázy (pacient I: žena, věk 63 let, dg. anaplastický karcinom štítné žlázy pT2N0M0, pooperační radioterapie; pacient II: muž, věk 58 let, dg. medulární karcinom štítné žlázy pT1pN1M0, pooperační radioterapie; pacient III: žena, věk 16 let, medulární karcinom štítné žlázy, pT2N0M0 (endokrinologem neindikována lymfadenektomie, doporučena pooperační radioterapie). Byly zakreslovány následující objemy: plánovací cílový objem (planning target volume – PTV) – oblast lůžka štítné žlázy, krčních, nadklíčkových a horních media152

Pacient II Stand. IMRT technika technika 54,39 54,60 45,32 50,11 45,70 50,29 ≥41 ≥48,5 42,38 32,30 43,86 40,5 ≅26,5% ≅35% ≅22% ≅20% ≅20% ≅15% ≅27% ≅42% ≅21,5% ≅21,5% ≅19,5% ≅15%

IMRT technika u karcinomu štítné žlázy a plánované dávce 50 Gy do oblasti PTV nabízí lepší homogenitu dávky (viz tab. 1 a obr. 1a). Je splněn požadavek dávky v PTV – odpovídá průměrná i střední dávka dávce požadované, maximální dávka je stejná nebo nižší. Dávka minimální není hodnocena, protože cílový objem je uložen v oblasti kůže, kde nelze minimální dávku přesně určit. Pro hodnocení je užita minimální dávka v 90% PTV. Ze zjištěných hodnot vyplývá, že konvenční radioterapie není ve velké části PTV požadovanou dávku vůbec zajistit. Ze srovnání maximální dávky v oblasti míchy je patrné lepší šetření při použití

1a

1b

1c

1d

Obr. 1: Srovnání dávkově-objemových histogramů u pacienta I – konvenční technika světle, IMRT technika tmavě – pro plánovací cílový objem (1a), míchu (1b), pravou a levou plíci (1c a 1d). IMRT techniky (viz tab. 1 a obr. 1b). Dávkově objemový histogram plic (viz obr. 1c a 1d) prokazuje u IMRT techniky větší objem plic zatížený nižšími dávkami (V≥10 Gy), ovšem v dávkách větších než 25 Gy a 30 Gy je postižený objem plicní tkáně naopak menší (V≥25 Gy,V≥30 Gy). Výsledky možnosti eskalace dávky – optimalizace pro dávku 60 Gy na oblast vstupního plánovacího cílového objemu. Izodózní plány u všech tří pacientů potvrzují možnost ozáření celého vstupního PTV dávkou 60 Gy (viz tab.

2). Vzhledem ke zjištěným maximálním dávkám v objemu míchy s 1 cm bezpečnostního lemu (hranice toleranční dávky míchy) je namístě co nejdokonalejší fixace a reprodukovatelnost polohy pacienta.

Diskuse Přesné indikace a k nim potřebné dávky na oblast plánovacího cílového objemu nejsou v literatuře jednoznačně 153

stanoveny, nicméně v pooperačních indikacích se obvykle aplikují dávky 44–50 Gy na oblasti lymfatických uzlin s nižším rizikem a 60 Gy a více na oblast lůžka primárního tumoru a oblast uzlin s vyšším rizikem. Radikální radioterapie na oblast rezidua či inoperabilního nálezu znamená aplikovat dávky 60–70 Gy na oblast nádorového postižení. Obvykle se užívá postupného zmenšování cílového objemu (5). Běžnými ozařovacími technikami v těchto indikacích je technika předního velkého pole s individuálními bloky a zadního malého pole doplňujícího dávku na oblast mediastina nebo technika dvou stejně velkých polí s individuálními bloky s využitím podélného klínu pro snížení dávky v oblasti krku (kompenzaci malého AP rozměru v oblasti krku). Využitím IMRT pro radioterapii karcinomu štítné žlázy se dosud zabývaly pouze dvě práce, v obou případech se jedná o dozimetrické studie. V prvním případě Nutting et al porovnává plány IMRT s použitím 3, 5, 7 a 9 poli a plánu konvenční RT (2 stejná protilehlá pole s individuální krytím). IMRT podle Nuttinga (3) zlepšuje dávkové pokrytí cílového objemu a redukci dávky na oblast míchy, autor doporučuje u IMRT užití 5 a více polí. Posner et al porovnává 2 plánovací systémy s využitím CT dat jednoho pacienta s anaplastickým karcinomem štítné žlázy a ověřuje možnost eskalace dávky na oblast vlastního tumoru (4). Naše studie srovnává první jmenovanou konvenční techniku a techniku IMRT se 7 koplanárními poli. V souladu s citovanými pracemi prokazujeme zlepšení jako v homogenitě dávky v plánovacím cílovém objemu, tak v šetření míchy. Při srovnání dávkově-objemových histogramů obou plic je patrné, že při použití techniky IMRT je sice větší objem plic ozářený nižší dávkou, ovšem v oblasti vyšších dávek, které poškozují plicní parenchym, je situace opačná. Proto pokládáme IMRT za výhodnější i pro šetření plicní tkáně. Výrazné šetření zdravých tkání, především míchy, vyvolalo otázku, zda není možné, při akceptovatelném zatížení uvedených rizikových orgánů, navýšit dávku v celém vstupním plánovacím cílovém objemu (hypotetický pacient se zvětšenými uzlinami na krku i horním mediastinu indiko-

154

vaný k samostatné radioterapii nebo při reziduálním nálezu v horním mediastinu i na krku). Vypočtené ozařovací plány u všech tří pacientů naznačují, že při použití IMRT techniky lze, za předpokladu dobré fixace pacienta, bezpečně indikovat i dávku 60 Gy do celého vstupního PTV. Konvenční radioterapie takovéto navýšení dávky neumožňuje.

Závěr Radioterapie s modulovanou intenzitou karcinomu u štítné žlázy nabízí proti konvenční radioterapii zlepšení homogenity dávky i šetření rizikových orgánů – míchy a plic. IMRT umožňuje eskalovat dávku do celého vstupního plánovacího cílového objemu do výše 60 Gy při současném šetření zdravých tkání a rizikových orgánů. Naše pracoviště považuje radioterapii s modulovanou intenzitou za techniku volby při indikaci pooperační či radikální radioterapie u karcinomů štítné žlázy. Práce byla realizována v rámci grantového projektu IGA MZ ČR č. NR 8061-3/2004.

Literatura 1. Grigsby JW, Luk KH. Thyroid. In Perez CA, Brady LW, eds. Principles and Practice of radiation Oncology. 3rd ed., Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1999:1179–201. 2. Němec J, Zamrazil V, Váňa S. Léčba nemocí štítné žlázy. Praha: Avicenum, 1991: 116–32. 3. Nutting CM, Convery DJ, Cosgrove VP et al. Improvements in target coverage and reduced spinal cord irradiation ussing intensity modulated radiotherapy (IMRT) in patients with carcinoma of the thyroid gland. Radiother Oncol 2001Aug;60(2):173–80. 4. Posner MD, Quivey JM, Akazawa PF, Xia P, Akazawa C, Verhey LJ. Dose optimization for the treatment of anaplastic thyroid carcinoma: a comparison of treatment planning techniques. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000Sep;48(2): 475–83. 5. Vošmik M, Feltl D, Vítek P, Vižďa J, Odrážka K. Léčba zhoubných nádorů štítné žlázy. Rad Onkol 2003;3(2):1–10.

MUDr. Milan Vošmik, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Klinika radioterapie a onkologie, 500 05 Hradec Králové. e-mail: [email protected]