Neurofiziológiai kurzus – tervezett program
I. Félév – celluláris neurofiziológia
A neuronok elektrofiziológiája: membrán potenciál, ioncsatornák és ion transzporterek; elektrotónusos és akciós potenciálok ionális mechanizmusai, a membrán passzív elektromos tulajdonságai és ennek következményei – az ionáramok mérése és jellemzése Szinaptikus transzmisszió: a szinapszis felépítése és típusai, pre- és posztszinaptikus celluláris folyamatok a kémiai szinapszisban, neurotranszmitterek és transzmitter receptorok, intracelluláris szignalizáció, posztszinaptikus potenciálok, a szinaptikus plaszticitás alapjai, wiring versus volume transmission A szenzoros transzdukció celluláris alapjai: a szenzoros inger – neurális aktivitás összefüggés általános törvényszerűségei, a szenzoros (generátor) potenciál keletkezése különböző szenzoros modalitásokban, a szenzoros információ kódolása a neuronokban
Ajánlott irodalom: Principles of Neural Science (Eric R. Kandel, James Schwartz, and Thomas Jessell) Neuroscience, 2nd ed. (Dale Purves, George J Augustine, David Fitzpatrick, Lawrence C Katz, Anthony-Samuel LaMantia, James O McNamara, and S Mark William) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=neurosci http://nobelprize.org/ - Official web site of the Nobel Prize
A neuronok kalcium háztartása és annak élettani és kórélettani vonatkozásai – az ic. Ca2+ tranziensek mérése
Élettan tankönyvek (Fonyó A. Ligeti E.: Orvosi Élettan)
Intracelluláris transzport folyamatok a neuronokban: az axonális transzport mechanizmusai és jelentősége, a neuronális (membrán) fehérjék életciklusa – az axonális és az intraneuronális transzport folyamatok vizsgálata
A molekuláris élettan alapjai (Dr. Erdélyi Lajos)
Neurogenezis, differenciálódás (cell faith), fejlődés és regeneráció, neuronális őssejtek, de novo neurogenezis, neurotrophikus faktorok és egyéb trofikus szignálmolekulák, „axonal guidance”
Basic Neurochemistry, 6th ed. (George J Siegel, MD, Bernard W Agranoff, Wayne Albers, Stephen K Fisher and Michael D Uhler) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=bnchm
A neuronok intermedier anyagcseréjének és energiaháztartásának jellegzetességei. A neuronális energiaháztartás zavarai, a mitochondriumok szerepe a neuronális funkciókban és a neuronok károsodásában, neurodegeneráció és apaptózis
A plazmamembrán klasszikus „fluid mosaic” modellje (Singer és Nicholson, 1972 )
A plazmamembrán felépítése I. – lipidek - lipoidok Amphiphyl lipid molekolák által képzett lipid kettősréteg: foszfolipidek: foszfatidilkolin, foszfatidilszerin, foszfatidiletanolamin, stb. sphingomyelin glikolipidek: gangliozidok koleszterin Spontán membrán képződés (mesterséges membránok) + micellák, liposzómák A lipidmembrán permeabilitása: hirofób anyagok >> hidrofil anyagok Plaszticitás: deformáció, lefűződés, összeolvadás „Lipid Raft“-ok: koleszterinben és glikolipidekben gazdag membrán szigetek (raftok): „Detergent Resistant Lipid Microdomain“
Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997
1
Suggested definition of lipid rafts (Pike LJ. 2006. J. Lipid Research
Lipid kettősréteg Diffúziós konstans függ: hőmérséklettől A diffundáló anyag és a diffúziós barrier fiziko-kémiai tulajdonságaitól: Zsír- és vízoldékonyság Palzmamembrán esetében magas permeabilitás: gázok, etilalkohol, urea, lipidek nagyméretű vízoldékony molekulák és ionok: nagyon csekély permeabilitás
"Membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, steroland sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes. Small rafts can sometimes be stabilized to form larger platforms through proteinprotein and protein-lipid interactions."
Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997
A lipid raftok
A plazmamembrán alkotói II. - fehérjék (a tömeg 25-70%-a) Az hidrofób amninósav oldalláncok és a zsírsav láncok közötti apoláros kölcsönhatások rögzítik az egyes fehérjéket -transzmembrán domének – hidrofób aminósav oldalláncok dominálnak (Val, Leu, Ile stb.) A fehérjék (és a lipoidok) transzport vezikulák segítségével recirkulálnak Intraceluláris transzport folyamatok biztosítják a fehérjék célzott mozgását „Trafficking”, axonális (dendritikus) transzport
Jelentőségük: platform egyes fehérjék felszíni sűrűségének növelésére, fehérje komplexek kialakulására és stabilizálására (jelátvitel, endo-/exocitózis, stb.)
Laterális diffúzió: a membrán alkotó molekulák mozgása a membrán síkjában „Single Particle Imaging/Tracking” de: a laterális diffúziót különböző kölcsönhatások akadályozhatják: más membrán fehérjék, citoszkeleton, membránszkeleton („Confinement”)
2
Anyagáramlás a IC és az EC folyadéktér között – transzmembrán transzport folyamatok Szabad diffúzió Ioncsatornán és pórusokon keresztül történő transzport Facilitált diffúzió (karrier/transzporter mediált passzív transzport) Karrier mediált aktív transzport (pumpák) Exo- és endocytózis (vezikuláris transzport)
Transzport molekulák Ioncsatornák és pórusok (porinok, perforin, komplement MAC) „Karrier” molekulák, pumpák Hajtóerő lehet passzív: koncentráció grádiens Ionok: elektrokémiai grádiens (Nernst potenciál) aktív trp.: metabolikus energia (ATP hidrolízis) Általános tulajdonságok: Specifikus: szelektív permeabilitás, szubsztrátspecifikus kötés Szaturáció: A transzport sebessége függ az aktív karrierek/csatornák mennyiségétől (Tmax): maximális transzport ráta Hőmérséklet függőség Aktiválható/szabályozható: „Gating“ (csatorna alegységek konformáció váltása) Kovalens/nem-kovalens modifikációk gén expresszió változás, transzlokáció Szelektív gátolhatóság szelektív farmakonokkal gátolható (aktiválható) (pl. kompetitív kötés, csatorna gátlás)
Csatornák: Vezetőképesség: 106-108 ion/s (Siemens (S): pS = 10-12 S) Ionszelektivitás: szelektív és nem szelektív ioncsatornák (pl. NMDA receptor) Rektifikáció: a csatorna vezetőképessége függhet az áram irányától is A csatornák aktivitása (nyitás/zárás) általában szabályozott: kapuzás (Gating) feszültségfüggő csat. (transzmembrán potenciál) ligandfüggő csat. (transzmitter, mediátor) feszülés érzékeny csat. (mechano- és ozmoreceptorok) hőmérséklet érzékeny csat. (termoreceptorok) intracelluláris szignálra érzékeny csat. (g-fehérje, foszforiláció, stb.) Szivárgó (leaky) csatornák–tartósan nyitott csatornák – membrán potenciál beállítása „background current”
3
Az ioncsatorna működés funkcionális modellje – kölcsönhatás a transzportált ion és a csatorna között A pórus domain konzervetív konszenzus szekvenciája
IC
EC
Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997
Ion potenciális energiája
MacKinnon, Nobel ea. 2003
Az ionáramok feszültségfüggése – a rektifikáció jelensége
Im
Az ioncsatorna „kapuzás” molekuláris háttere
Kifelé (outward) rektifikálás Ohmikus áram (nincs rektifikáció)
Em
Befelé (inward) rektifikáció
Voltage-current relationship of Kir2 channels
MacKinnon, Nobel ea. 2003
4
Hot on the trail of TRP channel structure. Moiseenkova-Bell VY, Wensel TG. J Gen Physiol. 2009 Mar;133(3):239-44.
Comparison of reported structures from electron microscopy of TRP channels and other membrane proteins. Negative stain structures, resolution: Prestin, 20 Å (Mio et al., 2008a); CFTR, 20 Å (Mio et al., 2008b); TRPM2, 37 Å (Maruyama et al., 2007); TRPC3, (Mio et al., 2005). Cryo–electron microscopy structures: Na channel, 19 Å (Sato et al., 2004); InsP3 receptor, 20 Å (Sato et al., 2004); TRPC3, 15.3 Å (Mio et al., 2007); TRPV1, 19 Å (Moiseenkova-Bell et al., 2008). Fourier shell correlation >0.5 is used as the resolution criterion for electron microscopy structures. X-ray structure: Kv2.1-1.2, 2.4 Å (Long et al., 2007). J Gen Physiol. 2009 March; 133(3): 239–244. doi: 10.1085/jgp.200810123.
Példa I.: ligandfüggő ioncsatorna - nikotinerg acetylcholin (Ach) receptor ionotróp receptor: a receptor fehérje egyben ioncsatorna is (motoros véglemez, vegetatív ganglion)
Példa II.: feszültségfüggő ioncsatorna TTX (tetrodotoxin) érzékeny Na+-csatorna (axolemma, izomrostok)
5
Példa III: g-fehérje (receptor) kapcsolt ioncsatorna: muszkarinerg Ach receptor (szív, zsigeri simaizomsejtek, szekretoros hámsejtek) Metabotróp receptor: a ligand kötés másodlagos hírvivőket aktivál
Példa IV.: Hőmérséklet függő ioncsatornák
A hőmérséklet hatására aktiválódó ioncsatornák Fájdalmas meleg (>43 °C) receptor („capsaicin” is aktiválja – paprika hatóanyaga) hideg (<25 °C) receptor (menthol is aktiválja – borsmenta) elsődleges érző neuronok, fájdalom és hőérzékelés
Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997
Az ioncsatornák (ionáramok) jellemzése •
Nagy und Rang J.Neusci. 2002
A kation csatornák „kombinatórikus” evolúciója
Farmakológiai módszerek agonisták (aktivátor anyagok) vagy antagonisták (gátlószerek: nyitás gátlása, refrakteritás stabilizálása)
Tetrodotoxin (TTX) (fugu vernicularis) Feszültségfüggő Na+ csatorna gátlása
Skorpió toxin: számos K+ csatorna gátlószere
6
A feszültségfüggő Ca2+ csatornák családfája (új nómenklatúra)
http://www.iuphar-db.org/index.jsp
Molekuláris biológiai módszerek: Heterológ expresszió sejtkultúrákban (Xenopus oocyta, inmortalizált sejtvonalak) Knock-out egér modellek, antiszenz RNS, RNS-interferencia: a vizsgált csatornák expressziójának célzott gátlása
Karrier-mediált transzport : Enzim analógia: S(IC)⇔S+karrier⇔S(EC) Transzport sebessége: <104 (pumpák 102) ion(molekula)/s Passzív trp. (facilitált diffúzió): csak az elektrokémai grádiensnek megfelelő irányba lehetséges Aktív trp. (primer, szekunder, tercier): az elektrokémai grádienssel szemben is folyhat metabolikus energia (ATP) felhasználásával
Példa : primer aktív transzport – Na+/K+ ATPáz (pumpa) elektrogén antiport
ECF
Primer aktív trp.: pumpák, ATPáz aktivitással Szekunder/tercier aktív trp.: passzív transzporterek és ionpumpák kapcsolt transzport rendszert képeznek Uniporter: 1 molekula transzportja (pl. GLUT1-5: glukóz transzporter család) Szimporter: több ion/molekula egyirányú transzportja Antiporter: több ion/molekula ellentétes irányú transzportja A transzportált anyagok sztöchiometrikus aránya ionok transzportja esetén: Elektrogén transzport: nettó töltésáramlás egy irányba (pl. Na/K ATPáz: 3 Na+ vs. 2 K+) Elektroneutrális transzport: nincs nettó töltésáramlás (pl.: H+/K+ pumpa: 1:1 arány)
ICF
Szelektív gátlóanyag: szívglikozidok (Digoxin, Ouabain)
ATP hiány hatása a sejtek Na+ transzportjára (DNP: dinitro-fenol)
Digitalis lanata – gyapjas gyűszűvirág Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997
7
A vezikuláris monoamin transzporter (VMAT) szekunder (H+ kapcsolt) aktív transzport
SERT: szeroteonin transzporter (reuptake): Na+; Cl- kapcsolt transzport
Transzmembrán potenciál (Em) Nyugalmi potenciál (E0): (Bernstein 1900 évek – sértési pot.; Young: óriás axon) Elektromos szempontból nyugalomban lévő sejt membránján mért potenciál különbség (a membránpotenciált befolyásoló külső és belső ingerek hiánya) Mértéke sejttípustól függ: -90 - -50 mV Az ionkoncentrációk és az iontranszport determinálják
Cytoplasm
Mérése: mikroelektróda + erősítő + voltméter – direkt elektromos kontaktus szükséges Élettani szerepe: •Ingerület képzés és ingerület továbbítás •Transzportfolyamatok hajtóereje •A sejttérfogat szabályozásának faktora Extracellular fluid
A sejtek többsége stabil, negatív membrán potenciállal rendelkezik a stabilitást folyamatos ATP felhasználás biztosítja (akár az ATP 70%-át is felemészti) Bizonyos sejtek nem rendelkeznek stabil E0-lal: pacemaker (ritmusgenerátor) sejtek
Ionok diffúziós egyensúlya - töltésszétválasztás - a Nernst potenciál Az extracelluláris és az intracelluláris folyadéktér aszimmetrikus ioneloszlása
ECF (mmol/L) (intersticiális folyadék)
ICF (mmol/L) (sejtplazma)
A kémiai (koncentráció grádiens) és az elektromos (elektrosztatikus erőtér) hajtóerők egyensúlya következtében a nettó ionáramlás megszűnik – diffúziós egyensúly Nernst potenciál – megadja a vizsgált ion diffúziós egyensúlyi állapotában mért feszültséget (Nernst v. reversal potential) Kiindulási állapot diffúziós egyensúly
-
+
0.00004 (pH=7.4)
Plazmamembrán Szelektív K+ permeábilis membrán
Negatív
Pozitív
8
A Nernst egyenlet: megadja az adott ion egyensúlyi potenciálját az
Problémák: •A különböző ionoknak eltérő egyensúlyi potenciáljuk van •Ezek az értékek eltérnek a tapasztalati E0 értékétől is
adott ECF és ICF koncentráció értékek mellett: Z = ionok töltése R = gáz konstans F = Faraday konstans T = hőmérséklet
Egyensúlyon alapuló tartós membránpotenciál feltétele, hogy a figyelembe vett ionok (K+, Na+, Cl) nettó diffúziója (ionáram) nulla legyen. Ohm törvénye: R = U / I → I = U / R és I = U x g
T=37 ºC
Az egyes ionokra számított egyensúlyi potenciál értékek (ld. korábbi adatok):
(g=vezetőképesség)
Mekkora az egyes ionokra ható elektrokémiai hajtóerő (Ei) =?? - Az aktuális membránpotenciál (Em) és az ion egyensúlyi potenciáljának (ENernst) a különbsége: →Ei = ENernst – Em Pl. A kálium áram (IK+) nagysága: IK+=EiK+ x gK+ =(EK+- Em) x gK+
ΣInet = 0 = IK++ INa++ ICl- = gK+ x EiK+ + gNa+ x EiNa+ + gCl- x EiCl-
Goldmann-Hodgkin-Katz (GHK) egyenlet: Megadja az egyensúlyi membránpotenciál értéket az adott ionkoncentráció és ion permeabilitás (konduktancia) értékek esetén:
Újabb probléma: az ionok folyamatos egyirányú áramlása (A. ábra) hamar megszüntetné a koncentráció grádienst → végül az Em 0 mV körül stabilizálódna! Az élő sejtekben egy elektrogén transzport a passzívan diffundáló Na+ és K+ ionokat visszajuttatja az ECF-be illetve ICF-ba , és stabilizálja a membrán potenciált (B. ábra) Na+ -K+ ATPáz
A sejtmembrán nyugalmi permeabilitás (konduktancia) értékeinek aránya:
PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,45
Magas K+ permeabilitás - a nyugalmi potenciál közel van a K+ egyensúlyi potenciáljához. A fenti paraméterekben bekövetkező változások az Em (E0) változását okozzák! Em negatív irányba tér el: hiperpolarizáció Em pozitív irányba tér el: depolarizáció Az ionkoncentrációk megváltozása: [K+] az ECF-ban megnő (hyperkalémia): depolarizáció – (transzmitter release kísérletek) [K+] az ECF-ben lecsökken (hypokalémia): hiperpolarizáció – (arrhythmiák, idegi zavarok A konduktancia változik meg (pl. ioncsatornák aktiválódása/zárása): fázikus (gyors) változások: akciós potenciál – feszültség függő csatornák öngerjesztő akt. tónusos (lassú) változások: posztszinaptikus potenciál, szenzoros (generátor) potenciál
A sztöhiometrikus arány: 3 Na+ kifelé 2 K+ befelé (nettó 1+ kifelé/ciklus) Az ATPáz elektrogén hatása eltolja a GHK egyenletből számított egyensúlyi potenciál értékét még kb. 5 mV-tal a negatív irányba - hiperpolarizáló pumpa potenciál Következmények: A Na-K ATPáz gátlása (pl.: ouabain, hypoxia) depolarizálja a membránt. Az Em csökkenése Cl- (és Na+) beáramlást okoz, ami sejtduzzadáshoz vezet (pl.: az agyban ödéma alakul ki) → Na+ -K+ ATPáz részt vesz a sejttérfogat szabályozásában! A)
passzív diffúzió Em=-65mV
B) Em=-70mV passzív diffúzió Na+
K+
Na+ K+ Na+ K+
IC
EC
IC
aktív transzport
EC
9
A membrán kapacitás jelentősége A plazmamembrán kondenzátorként is viselkedik (a lipid kettősréteg a szigetelő réteg, a szomszédos folyadék réteg a vezető). Nyugalmi állapotban a membrán kapacitása határozza meg az Em feszültségű elektromos erőteret fenntartó ionok mennyiségét
C=Q/U → Q=Cm x Um
(Um=Em)
Cm nagyságát a membrán felszíne, vastagsága és a dielektromos állandó határozzák meg
Példa: Gömb alakú, 50 µm átmérőjű sejtnél Em=- 60 mV, a membrán kapacitása Cm= 1 µF/cm2 A számítás szerint 30 x 106 töltés (ion) tartja fenn a membránpotenciált. Azonban ez csak 1/200 000 része a teljes intracelluláris ionmennyiségnek!
A membrán kapacitás hatása a passzív membránpotenciál változás időfüggésére
Ohmikus komp.
A membránpotenciál passzív változásai: elektrotónus
Stimuláló áram
A sejt (membrán) ingerlése intracelluláris elektródával A potenciál változás lefutása: membrán kapacitás gyors „kisülése” (kezdeti gyors depolarizáció) kationok kompenzáló kiáramlása fokozódik (késői lassú depolarizáció és steady state)
electrotónusos potenciál E0
Befelé irányuló áram (+ töltések) – depolarizáció Kifelé irányuló áram (+ töltések) – hyperpolarizáció Az elektromos ingerléssel kiváltott passzív potenciál változást elektrotónusos potenciál változásnak vagy elektrotónusnak nevezzük. ∆Em (Emax) arányos a stimuláló áram intenzításával és a membrán ellenállásával.
sejt
A passzív membrán tulajdonságok szerepe az ingerület szummációban - temporális szummáció (repetitív ingerlés depolarizáció hatása összeadódik)
Kapacitív komponens
τ = time constant (63% ∆Vm)
10
Az elektrotónusos potenciál terjedése elongált struktúrákban (rostokban)
Az áramsűrűség térbeli alakulása az ingerlés környezetében
Az EP amplitúdója a távolsággal exponenciálisan csökken - dekrementum Ok: a depolarizáló áram a stimulus helyétől folyamatosan csökken (inhomogén árameloszlás) lokális áramkörök modell (kábelteória) Rm – membránellenállás Ra – axon (hossz) ellenállás Hossz „konstans” (37% Emax): - Rm: egyenesen arányos - Ra: fordítottan arányos
37% Emax
(közel) egyidejű de eltérő lokalizációjú ingerlés hatásai összeadódnak: Térbeli (spatialis) szummáció
Ra= axon (hossz) ellenállás – az axon vastagsága befolyásolja Rm= transzmembrán ellenállás – ioncsatornák konduktivitása bef.
A membránpotenciál változás „passzív” terjedése elektromosan kapcsolt sejtek között (gap junctions)
11
Extracelluláris ingerlés: Katód –membrán depolarizáció (katelektrotónus) Anód – membrán hiperpolarizációja (anelektrotónus)
katód
ECF
anód
membrán
ICF
Felhasználás a gyógyászatban: Kamrai tachycardia (életveszély!!) – elektrokardioverzió és defibrilláció Pacemaker therápia (szív, rekeszizom, KIR) Elektrokonvulzív therápia (Psychotikus állapot) Endocochlearis implantáció („mesterséges” belső fül) TENS: Transdermal Electric Nerve Stimulation (fájdalomkezelés) Nem külső ingerléssel kiváltott elektrotónusos potenciálok: Posztszinaptikus potenciál (ligandfüggő ioncsatornák, transzmitter receptor szignalizáció Receptor- (generator) potenciál: érzőneuron és érzékhámsejtek Az akciós potenciál terjedése Pacemaker potenciálok (a pacemaker sejtek spontán depolarizációja)
12
