A nociceptinerg és a biogén aminerg rendszer kapcsolata a központi idegrendszerben

A nociceptinerg és a biogén aminerg rendszer kapcsolata a központi idegrendszerben Doktori értekezés

Gyenge Melinda Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Tekes Kornélia, egyetemi tanár, kandidátus Hivatalos bírálók: Dr. Marton Sylvia, egyetemi tanár, D.Sc. Dr. Gáspár Róbert, egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Takácsné Dr. Novák Krisztina, egyetemi tanár, D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Fekete Márton, tudományos főmunkatárs, kandidátus Dr. Riba Pál, egyetemi adjunktus, Ph.D.

Budapest 2009

TARTALOMJEGYZÉK Az értekezésben használt rövidítések jegyzéke ................................................................ 5 1

BEVEZETÉS .......................................................................................................... 8 1.1

1.2

A NOCICEPTIN SZEREPE A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN ............ 8 1.1.1

A nociceptin és receptora ......................................................................... 8

1.1.2

NOP receptor ligandok ........................................................................... 16

A NOCICEPTINERG ÉS A BIOGÉN AMINERG RENDSZER

KAPCSOLATA A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN .......................................... 19 1.2.1

A nociceptin hatása a hisztamin felszabadulásra .................................... 19

1.2.2

A nociceptinerg rendszer hatása a szerotonerg rendszerre ..................... 22

1.2.3

A nociceptinerg és a dopaminerg rendszer kapcsolata ........................... 24

1.2.4

A nociceptinerg rendszer hatása a noradrenalin felszabadulására.......... 27

1.2.5

A nociceptinerg rendszer és az acetilkolin kapcsolata ........................... 29

2

CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................ 31

3

MÓDSZEREK ...................................................................................................... 32 3.1

ÁLLATMODELLEK ..................................................................................... 32 3.1.1

Exogén nociceptin hatásának vizsgálata................................................. 32

3.1.2

Neuropátiás fájdalom modell (krónikus diabétesz) ................................ 33

3.1.3

Stressz modell ......................................................................................... 33

3.1.4

Alkohol modell ....................................................................................... 34

3.1.5

Újszülöttkori nociceptin, illetve nocisztatin kezelés (imprinting) .......... 34

3.1.6

β-endorfin kezelés .................................................................................. 34

3.1.7 Biszpiridinium-aldoxim meghatározása validált HPLC-EC módszerrel ........................................................................................................... 35 3.2

ISCHÉMIÁS BETEGCSOPORTOK ............................................................. 35

3.3

MÉRÉSI MÓDSZEREK ................................................................................ 37 3.3.1

Hisztamin meghatározása mikroradioenzimatikus módszerrel .............. 37

2

3.3.1.1 Hisztamin-N-metil-transzferáz enzim (HNMT) preparálása tengerimalac agyszövetből .............................................................................. 37 3.3.1.2 A hisztamin szöveti szintjének meghatározása .................................. 37 3.3.2 Biogén aminok (dopamin, szerotonin) és metabolitjainak (5hidroxi-indolecetsav, homovanillinsav) meghatározása validált HPLC-EC módszer alkalmazásával ...................................................................................... 38 3.3.3 Nociceptin és nocisztatin meghatározása humán plazma, illetve patkány plazma és liquor mintákból radioimmunoassay módszerrel.................. 40 3.4 4

STATISZTIKAI ANALÍZIS .......................................................................... 41

EREDMÉNYEK ................................................................................................... 42 4.1

A NOCICEPTINERG ÉS A HISZTAMINERG RENDSZER

KAPCSOLATÁNAK VIZSGÁLATA ....................................................................... 42 4.1.1 4.2

Nociceptin hatása az agyi hisztamin és szerotoninszintekre .................. 42

ENDOGÉN NOCICEPTIN- ÉS NOCISZTATINSZINTEK VIZSGÁLATA

ÁLLATMODELLEKEN ............................................................................................ 51

4.3

4.4

4.2.1

Neuropátiás fájdalom modell (krónikus diabétesz) ................................ 51

4.2.2

Stressz modell ......................................................................................... 55

4.2.3

Alkohol modell ....................................................................................... 58

NOP RECEPTOR IMPRINTING .................................................................. 60 4.3.1

Újszülöttkori nociceptin, illetve nocisztatin kezelés .............................. 60

4.3.2

β-endorfin kezelés .................................................................................. 68

A NOCICEPTIN ÉS AZ ACETILKOLINERG RENDSZER ....................... 71 4.4.1 Biszpiridinium-aldoxim (K-27) meghatározása validált HPLC-EC módszerrel ........................................................................................................... 71 4.4.2

4.5

K-27 hatása az agyi biogén amin szintekre ............................................ 76

PLAZMA NOCICEPTIN- ÉS SZEROTONINSZINTEK VÁLTOZÁSA

ISCHÉMIÁS BETEGEKBEN ................................................................................... 78 5

MEGBESZÉLÉS .................................................................................................. 82 5.1

A NOCICEPTINERG ÉS A HISZTAMINERG RENDSZER

KAPCSOLATÁNAK VIZSGÁLATA ....................................................................... 82 5.2

ENDOGÉN NOCICEPTIN- ÉS NOCISZTATINSZINTEK VIZSGÁLATA

ÁLLATMODELLEKEN ............................................................................................ 86

3

5.3

5.2.1

Neuropátiás fájdalom modell (krónikus diabétesz) ................................ 86

5.2.2

Stressz modell ......................................................................................... 88

5.2.3

Alkohol modell ....................................................................................... 90

NOP RECEPTOR IMPRINTING .................................................................. 92 5.3.1

Újszülöttkori nociceptin, illetve nocisztatin kezelés .............................. 92

5.3.2

β-endorfin kezelés .................................................................................. 97

5.4

A NOCICEPTIN ÉS AZ ACETILKOLINERG RENDSZER ....................... 99

5.5

PLAZMA NOCICEPTIN- ÉS SZEROTONINSZINTEK VÁLTOZÁSA

ISCHÉMIÁS BETEGEKBEN ................................................................................. 101 6

KÖVETKEZTETÉSEK..................................................................................... 104

7

ÖSSZEFOGLALÁS ........................................................................................... 107

8

SUMMARY ......................................................................................................... 108

9

IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................... 110

10

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ............................................................. 122

11

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................ 124

4

Az értekezésben használt rövidítések jegyzéke 5-HIAA

5-hidroxi-indolecetsav

5-HT

5-hidroxi-triptamin, szerotonin

ACh

acetilkolin

AChÉ

acetilkolin-észteráz

APN

aminopeptidáz N

C

carotis területi keringészavar

cAMP

ciklikus-adenozin-monofoszfát

CGRP

calcitonin-gene related peptide, kalcitonin-génhez kapcsolt fehérje

CHO

kínai aranyhörcsög petefészek sejtvonal

CompB

Compound B

CRF

corticotropin-releasing factor

CSF

cerebrospinális folyadék, liqour

DA

dopamin

DAT

dopamin transzporter

EDTA

etiléndiamin-tetraecetsav

EP

endopeptidáz

FC

frontális cortex

f.f.

feszültségfüggő

GABA

γ-amino-vajsav

GAT-1

GABA transzporter-1

H1-receptor

hisztamin1 receptor

H2-receptor

hisztamin2 receptor

H3-receptor

hisztamin3 receptor

HA

hisztamin

HIPP

hippocampus

HNMT

hisztamin-N-metil-transzferáz

HPA

hypothalamic-pituitary-adrenal axis, hypothalamohypophisealis tengely

5

HPLC

high performance liquid chromatography, nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia

HY

hypothalamus

HVA

homovanillinsav

ICH

International Conference on Harmonization

i.c.

intracellulárisan

i.c.v.

intrecerebroventrikuláris

i.d.

intredermális

i.pl.

intraplantáris

i.t.

intratekális

i.v.

intravénás

K-27

1-(4-hidroximino-metil-piridinium)-3-(4-karbamoilpiridinium) propán dibromid

KIR

központi idegrendszer

KO

knockout

L

lacunaris területi keringészavar

LOQ

limit of quantitation, mennyiségi meghatározás alsó határa

MCDP

mast cell degranulating peptide, hízósejt degranuláló peptid

mRNS

messenger ribonukleinsav

NA

noradrenalin

NBH

naloxon-benzoylhydrazon

NC

nociceptin

NC II

nociceptin II

NC III

nociceptin III

n.e.

nem értelmezhető

NK

neurokinin

NMDA

N-metil-D-aszpartátsav

NOP

nociceptin/orphanin FQ receptor

n.sz.

nem szignifikáns

PCA

perklórsav

PPNC

prepronociceptin (nociceptin prekurzor)

RIA

radioimunnoassay

6

RNS

ribonukleinsav

SAM

S-adenozil metionin

SD

standard deviatio (szórás)

SNc

substantia nigra pars compacta

SP

substance P, P anyag

TFA

trifluoro-ecetsav

TIA

transiens ischémiás attack

TM

tuberomamilláris

7

1

BEVEZETÉS

1.1 1.1.1

A NOCICEPTIN SZEREPE A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN A nociceptin és receptora

A nociceptinnek (NC) számos központi idegrendszeri (KIR) és perifériás hatása ismert és kiterjedt kutatás folyik szerepének élettani és kórélettani körülmények közötti megismerése, valamint farmakológiai jelentőségének feltárása érdekében. A δ-opioid receptor klónozása során, a homológia vizsgálatok egy új, addig ismeretlen opioid-szerű receptor létét igazolták [1, 2], mely kezdetben az opioid-like-1 nevet kapta, majd OP4, a legújabb nevezéktan szerint pedig NOP receptorként ismert. Jellegzetessége, hogy naloxonnal nem antagonizálható és a klasszikus μ-, κ- és δopioid-receptorok agonistáit gyakorlatilag nem köti, hatását a sejt belseje felé Gi/G0 fehérje közvetíti. A NOP receptort jelenleg az opioid receptorcsalád nem-opioid tagjaként tartják számon. A NOP receptor génje a humán 20. kromoszóma q13.2-13.3 régiójában található [1]. Más opioid receptorokhoz hasonlóan 7 transzmembrán doménnel rendelkezik. A három klasszikus opioid receptorral való homológia foka 63-65 %. A NOP receptorhoz intracellulárisan (i.c.) másodlagos ingerületátvivőként egy Gproteinhez kötött rendszer kapcsolódik, amely az adenil-cikláz gátlása révén megakadályozza a ciklikus-adenozin-monofoszfát (cAMP) felhalmozódását [2], illetve a feszültségfüggő (f.f.) Ca+2-csatornák aktivációját [3], valamint stimulálja a sejtbe irányuló K+ áramot [4]. A NOP receptor az állatkísérletes adatokkal jól egyezően számos humán idegrendszeri struktúrában megtalálható. Rágcsálók agyának és a gerincvelő egyes részeinek vizsgálata során, a NOP receptor mRNS-t in situ hibridizációs technikával számos területen megtalálták (1. ábra), különösen a kérgi és a cortico-limbicus (amygdala, hippocampus, habenula, septum) és a hypothalamicus területek (ventromedialis és paraventricularis magvak), a thalamus, az agytörzs (locus coeruleus, parabrachialis magvak, központi szürke állomány, hátulsó raphe magvak) és a gerincvelő hátulsó és elülső szarvai mutattak nagy aktivitást [1, 5].

8

A patkány KIR-ében maga a NOP receptor-fehérje megtalálható a cortex, az amygdala, a hypothalamus (ventromedialis és paraventricularis magvak), és az agytörzs területén [6], hasonlóképpen megtalálható a humán agy különböző területein is, ahol a cortex, a striatum, a thalamus, és a hypothalamus területén a legnagyobb a mennyisége [7, 8]. Humán vizsgálatok és állatkísérletes adatok igazolják jelenlétét a periférás szövetekben is: a belekben, a vas deferensben, a lépben, a májban, valamint a lymphocytákban [9, 10, 7]. Az NOP receptor ezen KIR-i eloszlása alapján feltételezhető volt, hogy ligandja a fájdalomérzet kialakulásra, a tanulásra, az emlékezésre, a figyelemre, az érzelmekre, a szimpatikus, a paraszimpatikus és érző neuronokra, valamint a hypothalamohypophisealis (HPA)-tengely működésére egyaránt hatással lehet.

9

1. ábra: A NOP receptor és NOP receptor mRNS előfordulásának sematikus ábrája patkány KIR-ében [12]. (ABL-basolateral amygdaloid nucleus; AC-anterior comissure; ACB-nucleus accumbens; ACE-central amygdaloid nucleus; ACO-cortical amygdaloid nucleus; AD-anterodorsal thalamus; AL-anterior lobe, pituitary; AMB-nucleus ambiguus; AME-medial amygdaloid nucleus; AON-anterior olfactory nucleus; ARC-arcuate nucleus, hypothalamus; BST-bed nucleus, stria terminalis; CC-corpus callosum; CE-central canal; CL-centrolateral thalamus; CMcentromedial thalamus; CPU-caudate putamen; CRB-cerebellum; DG-dentate gyrus; DH-dorsal horn, spinal cord; DMH-dorsomedial hypothalamus; DPG-deep gray layer, superior colliculus; DTN-dorsal tegmental area; ENTentorhinal cortex; EPL-external plexiform layer, olfactory bulb; FCX-frontal cortex; G-nucleus gelatinosus, thalamus; GL-glomerular layer, olfactory bulb; GP-globus pallidus; HL-lateral habenula; HM-medial habenula; HPChippocampus; IC-inferior colliculus; IGR- intermediate granular layer, olfactory bulb; IL-intermediate lobe, pituitary; ING-intermediate gray layer, superior colliculus; IntP-interposed cerebellar nucleus; IP-interpeduncular nucleus; LClocus coeruleus; LD-laterodorsal thalamus; LG-lateral geniculate thalamus; LHA-lateral hypothalamic area; LRNlateral reticular nucleus; LS-lateral septum; MD-mediodorsal thalamus; ME-median eminence; Med-medial cerebellar nucleus; MG-medial geniculate thalamus; Mi-mitral cell layer, olfactory bulb; MM-medial mammillary nucleus; MS-medial septum; MV-medial vestibular nucleus; NDB-nucleus diagonal band; NL-neural lobe, pituitary; NRGC-nucleus reticularis gigantocellularis; NTS-nucleus tractus solitarii; OB-olfactory bulb; ot-optic tract; OTUolfactory tubercle; PAG-periaqueductal gray; PBN-parabrachial nucleus; PCX-parietal cortex; PIR-piriform cortex; PN-pons; PnR-pontine reticular; PO-posterior nucleus thalami; POA-preoptic area; POR-periolivary region; PrSpresubiculum; PV-paraventricular thalamus; PVN-paraventricular hypothalamus; RD-dorsal raphe; RE-reuniens thalami; RM-raphé magnus; RME-maedian raphé; SC-superior colliculus; SCP-superior cerebellar peduncle; SGsubstantia gelatinosa; SNc-substancia nigra, pars compacta; SNr-substantia nigra, pars reticulata; SNT- sensory trigeminal nucleus; SON-supraoptic nucleus; STCX-striate cortex; STN-spinal trigeminal nucleus; SUG-superficial gray layer, superior colliculus; TCX-temporal cortex; VH-ventral horn, spinal cord; VL-ventrolateral thalamus; VMventromedial thalamus; VMH-ventromedial hypothalamus; VP-ventral pallidus; VPL-ventroposterolateral thalamus; VTA-ventral tegmental area; ZI-zona incerta)

10

A NOP receptor endogén agonistája a 17 aminosavból álló orphanin FQ vagy másnéven nociceptin, mely a többi endogén opiát szerkezetétől, még a hozzá legközelebb álló dinorfin A-tól is alapvetően különbözik abban, hogy az első aminosava fenilalanin (F) és nem tirozin (Y) (2. ábra), [11, 12].

Nociceptin

FGGFTGARKSARKLANQ

Dinorfin A

YGGFLRRIRPKLKWDNQ

Dinorfin B

YGGFLRRQFKVVT

Béta-endorfin

YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNVHKKGQ

Leu-enkefalin

YGGFL

Met-enkefalin

YGGFM

Alfa-neoendorfin

YGGFLRKYPK

Endomorfin 1

YPWF

Endomorfin 2

YPFF

2. ábra: A nociceptin és más opioid peptidek aminosav szekvenciája [11, 12]. (G-glicin, A-alanin, V-valin, L-leucin, I-izoleucin, P-prolin, F-fenilalanin, Y-tirozin, W-triptofán, Sszerin, T-treonin, M-metionin, N-aszpargin, Q-glutamin, D-aszpartát, E-glutamát, K-lizin, R-arginin, Hhisztidin).

A NOP receptor ligandját a nociceptint 1995-ben azonosították patkány agyban [13] és sertés hypothalamusban [14]. A nociceptin aminosav szerkezetében az első négy a „message domain”, mely a receptorhoz való kötődés szempontjából meghatározó, de az 5-13-ig terjedő aminosav szakasz, az „adress domain” szintén alapvetően fontos a NOP receptorral való kölcsönhatásban. A nociceptin egy 176 aminosavból álló prekurzorból, a prepronociceptinből (PPNC) hasad ki a megfelelő inger hatására, mely PPNC a nociceptinen kívül más biológiailag aktív peptideket is tartalmaz, mint a nocisztatin és a nociceptin II (NC II) [15], (3. ábra). A prohormon-konvertáz II hatására keletkező nocisztatin számos hatásában funkcionális antagonistaként viselkedik. A nocisztatin kutatásokat azonban hátráltatja, hogy mindmáig nem sikerült azonosítani receptorát.

11

A nociceptin és a NC II szerkezeti analógja a szintén PPNC-ből származtatható nociceptin III (NC III), amely a farmakológiai vizsgálatok szerint a NOP receptoron inaktív [16].

szignál peptid MKVLLCDLLLLSLFSSVFSSCQRDCLTCQEKLHPALDSFDLEV CILECEEKVFPSPLWTPCTKVMARSSWQLPAAPEHVAALYQ Nocisztatin PRASEMQHLRRMPRVRSLFQEQEEPEPGMEEAGEMEQKQLKR Nociceptin

NC II

NC III

FGGFTGARKSARKLANQKRFSEFMRQYLVLSMQSSQRRRTLHQNGNV

176

3. ábra: A PPNC prekurzor szekvenciája [17, 18]. (G-glicin, A-alanin, V-valin, L-leucin, I-izoleucin, P-prolin, F-fenilalanin, Y-tirozin, W-triptofán, Sszerin, T-treonin, C-cisztein, M-metionin, N-aszpargin, Q-glutamin, D-aszpartát, E-glutamát, K-lizin, Rarginin, H-hisztidin).

A

nociceptin

metabolizmusát

in

vitro

körülmények

között

egéragy

cortex

homogenizátumából nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC) [19], illetve humán

vérmintában

tömegspektrometriával

vizsgálták

[20].

A

nociceptin

inaktivációjáért két cink-metallopeptidáz, a membrán-kötött aminopeptidáz-N (APN) és a főként a citoszolban elhelyezkedő, a nociceptinre specifikus, endopeptidáz 24.15 (EP24.15) enzim a felelős. A heptadekapeptid nociceptint az APN, illetve az EP 24.15 négy kritikus helyen hasítja (4. ábra). Az így keletkezett metabolitok, teljesen inaktívak a NOP receptoron, hiszen a NOP aktiválásához szükséges minimális szekvenciát nociceptin (1-13) már nem tartalmazzák [13]. A metabolizmusban elsődleges jelentőségű az APN, ennek szelektív gátlása szinte teljesen (95±2,6 %) meggátolja a nociceptin metabolizmusát. A humán PPNC génje a 8. kromoszómán a 8p21 régióban található [21]. A nociceptin receptora az állatkísérletes adatokkal jól egyezően számos humán idegrendszeri struktúrában megtalálható, radioimmunoassay (RIA) vizsgálatok szerint a humán agyban való eloszlása jól egyezik a patkány agyban való eloszlásával [22].

12

FGGFTGARK + SARK EP? FGGFTGARKSARK + LANQ EP? FGGFTGARKSARKLANQ

EP24.15

APN

F+GGFTGARKSARKLANQ

FGGFTGARKSAR+KLANQ FGGFTGARKSA+RKLANQ FGGFTGA+RKSARKLANQ

4. ábra: A nociceptin enzimatikus hasítása az aminopeptidáz-N (ANP) és az endopeptidáz 24.15 (EP24.15) által (EP? = nem azonosított endopeptidáz) [17]. (G-glicin, A-alanin, L-leucin, F-fenilalanin, S-szerin, T-treonin, N-aszpargin, Q-glutamin, K-lizin, Rarginin).

Az emberi agy rendkívül gazdag nociceptin-immunoreaktív sejtcsoportokban [22], és a liquorban (CSF) is jelentős mennyiségben megtalálható. Legnagyobb koncentrációban a periaqueductalis szürkeállomány, a locus coeruleus, a hypothalamus nucleus ventromedialis, a septum és a gerincvelő hátsó szarva tartalmazza, de a hypothalamus többi magja, a ventralis szürkeállomány, a tegmentum, az amygdala, a formatio reticularis és a gerincvelői nucleus trigeminalis is a gazdagon ellátott területek közé tartozik. Számos perifériás szövetben (légzőrendszer, szív-, és érrendszer, gyomor-bél rendszer, vizeletkiválasztó rendszer) is kimutatott mind a NOP receptor, mind a nociceptin jelenléte [23].

13

Emberben a ganglion trigeminale közel 70 %-a mutat nociceptin-immunopozitivitást és együtt fordul elő a calcitonin-génhez kapcsolt fehérjével (CGRP), a P-anyaggal (SP), a nitrogénmonoxid-szintázzal és az agyalapi mirigy adenilát-cikláz aktiváló fehérjével [24]. A

nociceptin

KIR-i

hatásai

rendkívül

sokrétűek.

Kiemelendő,

hogy

intracerebroventrikulárisan (i.c.v.) adva hyperalgesiát okoz és csökkenti a morfinnal kiváltott fájdalomcsillapítást, valamint az opiát-elvonási tüneteket, viszont intratekálisan (i.t.) fájdalomcsillapító hatást közvetít és fokozza a morfin hatását. Állatkísérletes adatok igazolják szerepét a táplálékfelvétel, a helyváltoztatás, a tanulás, a stresszkiváltotta szorongás szabályozó mechanizmusaiban, mely hatások részben a dopamin (DA)-, a szerotonin (5-HT)-, és az acetilkolin (ACh)-felszabadulást gátló hatásával magyarázható [25, 26, 27, 28]. Az immunhisztokémiai vizsgálatok azt igazolják, hogy a NOP receptor megtalálható a KIR-i

szabályozó

rendszer

szinte

valamennyi

magcsoportjában,

így

az

adrenerg/noradrenerg, a kolinerg, a dopaminerg és a szerotonerg magcsoportokban. A NOP receptor és a receptor mRNS nagy mennyiségben van jelen az adrenerg rendszer részét képező locus coeruleus területén, így szerepe lehet számos a stresszhatás kapcsán fellépő vegetatív és viselkedési reakcióban. A nociceptin nagy koncentrációban van jelen az amygdalában, a septohippocampalis régióban, a thalamicus és a hypothalamicus magvakban, valamint a paraventricularis hypothalamusban. Ezek a területek kiemelt jelentőségűek a félelem, a szorongás és a stressz érzelmi komponenseinek összehangolásában. Fontos szerepet tulajdonítanak a nociceptinnek az akut stresszre adott válasz endogén szabályozásában

[29],

miután

más

fontos

stressz

neuropeptidek

hatásának

összehangolásában is részt vesz, mint az a corticotropin-releasing factor (CRF), a cholecystokinin, a neuropeptid Y, és a SP esetében igazolt [30]. A NOP receptor bizonyítottan jelen van az elülső bazális kolinerg komplex, a telenchephalon és a tegmentális magcsoportok területén. A kolinerg neuronok kapcsolatban állnak a kérgi területekkel a hippocampusszal, a thalamusszal, és az agytörzsi területekkel, amelyek a figyelem, a tanulás és a memória szabályozásában vesznek részt.

14

A NOP receptor mRNS expressziója a substantia nigra területén azt mutatja, hogy a nociceptin hatással van a mozgáskoordinációt szabályozó nigro-striatális dopaminerg rendszerre. A NOP receptor jelenléte a ventrális tegmentális areában arra utal, hogy a nociceptinerg rendszer befolyásolja a mezocorticolimbicus rendszeren keresztül a motivációt, a hangulatot, és a gondolkodást [31]. A raphe magvakban, melyek a KIR-i szerotonin szintézis helyei, szintén nagy mennyiségben megtalálható a NOP receptor és a receptor mRNS. A nociceptin a raphe magvak területén a K+-áram fokozásán keresztül gátolja a neuronális aktivitást [32]. A nociceptin kimutatható ugyanakkor a nucleus raphe magnusban is, ami arra enged következtetni, hogy a szerotonerg rendszerre (raphe-magvak) hatva a fájdalomérzés szupraspinális kontrolljában tölt be szerepet [6]. A NOP receptor aktivációja a kérgi szerotonin felszabadulás egyik legfontosabb preszinaptikus modulátora [26]. A nociceptin jelentős mennyiségben megtalálható a paraventricularis hypothalamusban (mint a CRF forrása), ami arra utal, hogy a nociceptin a hypothalamo-hypophysealis rendszer működését is szabályozza. A NOP receptor kimutatható a nucleus tractus solitariiban és az oldalsó retikuláris magcsoport területén. Ezek a magcsoportok olyan vegetatív funkciók szabályozásában vesznek részt, mint az artériás vérnyomás, a szívfrekvencia, a légzés és az endokrin szabályozás [5]. A NOP receptor gyakori előfordulásával ellentétben, a nociceptin immunreaktív rostjai és terminálisai sokkal kisebb mértékben fordulnak elő az agyban. Azokon a területeken, ahol a receptor nagy sűrűségben van jelen, a peptid és a prekurzora nem, vagy csak nagyon kis mértékben volt kimutatható immunhisztokémiai eljárásokkal, beleértve a cortexet,

a

chyasma

opticum

feletti

supraopticus

magokat,

a

hypotalamus

paraventricularis és a ventromediális magjait, és a dorsalis raphe magvakat [31]. A nociceptin pozitív rostok denz fonata a gerincvelő dorzális szarvának felületi rétegében található meg, a nervus trigeminusban és olyan területeken, amelyek részt vesznek a fájdalom percepciójában. Ugyanakkor a NOP receptor a gerincvelő hátulsó szarvának valamennyi rétegében megtalálható, legnagyobb mennyiségben a II. laminában; elsősorban az interneuronokban van jelen.

15

1.1.2

NOP receptor ligandok

A táblázatok a jelenleg ismert és intenzíven kutatott NOP receptor agonista és antagonista, illetve peptid és nem peptid vegyületeket, és azok néhány jelentősebb kísérletes adatait foglalják össze (1.-3. táblázat).

1. táblázat: Kórképek, melyekben a NOP ligandok kedvező hatásúak lehetnek [32].

NOP agonista

NOP antagonista

Neuropátiás fájdalom, migrén.

Általános fájdalomcsillapítás

Viszketés

?

Viselkedés

Szorongás

Depresszió

Táplálkozás

Anorexia

?

Drogfüggőség

Alkohol-,

Fájdalomérzés

morfin-,

kokain-,

?

amfetamin addikció. Húgyutak

Húgyhólyag beidegzés

?

Légzés

Köhögés, asztma.

?

Keringés

Ödéma, hipertenzió, impotencia.

?

Tanulás, memória

?

Demencia

Motoros aktivitás

?

Parkinsonizmus

Agyi keringés

Stroke

?

16

2. táblázat: NOP receptor peptid ligandok [33]. Peptid

NOP

µ-

δ-

κ-

In vivo hatások a

Irodalmi

receptor

receptor

receptor

NOP receptoron

hivatkozások

Inaktív

Inaktív

Inaktív

i.v.: hypotensio és

Malinowska és mtsai, 2000.

*

„Dooley”-féle peptidek és származékok Ac-RYYRIK-NH2

Parciális agonista

Ac-

Parciális

RYYRWKKKKKKKNH2

agonista

bradycardia.

Inaktív

Inaktív

Inaktív i.v.: pronociceptív

Rizzi és mtsai, 2002.

(ZP120) Ac-RY(3-Cl)YRWR-

Parciális

NH2(Syn-1020)

agonista

Inaktív

Inaktív

Inaktív

Antimorfin (i.c.v.); Antinociceptív (s.c.); Anti-allodínia (i.p.).

Khroyan és mtsai, 2007; Khroyan és mtsai, 2007; Khroyan és mtsai, 2007.

Más peptidek III-BTD

Antagonista

Parciális

Agonista

agonista

OS-461, OS-462, OS-500

Agonista

Nincs adat

Parciális agonista

Nincs adat

Nincs adat

Nincs adat, antinociceptív?

i.c.v.: hyperphagias

-

Economidou és mtsai, 2006.

hatás

* A 2. és 3. táblázat irodalmi hivatkozásai a dolgozat ’Irodalomjegyzék’ fejezetében külön nincsenek feltüntetve.

17

3. táblázat: Nem-peptid NOP receptor ligandok [33]. Osztályok és vegyületek

Farmakológiai profil

In vivo hatások

Irodalmi

*

hivatkozások Morphinan NOP TRK820

antagonista;

µ-

receptor

Antinociceptív egérben, majomban.

parciális agonista; κ- receptor

Viszketéscsillapító

agonista.

majomban.

hatás

Urémiás betegekben, a Fázis III vizsgálatokban viszketéscsillapító.

Buprenorphin

µ-receptor parciális agonista és

Analgézia a µ- receptoron;

NOP receptor parciális agonista.

széleskörben

használt

Mizoguchi és mtsai, 2003. Endoh és mtsai,2001. Wakasa és mtsai, 2004.

Yamamoto és mtsai, 2006.

fájdalomcsillapító. Naloxon benzoylhydrazon

Nem szelektív µ-opioid receptor

Antinociceptív egérben, azonban a

antagonista;

NOP-/-

κ-opioid

receptor

egerekben

nincs

ilyen

Noda és mtsai, 1998.

agonista; NOP parciális agonista.

hatása.

NOP antagonista, kis szelektivitás

Szisztémás

a µ-opioid receptoron.

antinociceptív hatás egérben.

Yamada és mtsai, 2002; Muratani és mtsai, 2002.

Antinociceptív,

Zeilhofer és mtsai, 2003.

4-aminoquinolin JTC-801

és

spinális

Benzimidazopiperidin J-113397 (CompB)

Nagy

szelektívitású

NOP

antagonista.

hatás. Csökkent

Aril-piperidin SB-612111

Nagy

pro-nociceptív

szelektívitású

NOP

NC

indukálta

pro-

nociceptív, antinociceptív hatás. Antidepresszáns hatás.

antagonista.

Rizzi és mtsai, 2007.

Fázis I parkinsonizmusban.

Shering vegyületsorozat

Nagy szelektívitású NOP agonista.

Köhögéscsillapító

hatás

kapszaicin-indukálta

köhögésben

a

Ho és mtsai, 2007.

tengerimalacon. Spiropiperidin Ro64-6198

szelektív NOP agonista

Anxiolítikus és hyperphagias hatás

NNC-63-0532

kis szelektivitású NOP agonista

patkányban

NNC-63-0780

szelektív NOP antagonista

-

Shering vegyületsorozat

nagy szelektívitású NOP agonista

-

18

Shoblock és mtsai, 2007.

1.2

A NOCICEPTINERG ÉS A BIOGÉN AMINERG RENDSZER KAPCSOLATA A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN

1.2.1

A nociceptin hatása a hisztamin felszabadulásra

Patkány tuberomammilláris (TM) neuronokon végzett in vitro kísérletes adatok alapján megállapítást nyert, hogy a nociceptin dózisfüggő mértékben (10-300 nM) és reverzibilisen hiperpolarizálja a neuronokat, ezáltal gátolja a hisztamin (HA) felszabadulását [34]. A morfin, mint szelektív opioid receptor agonista vegyület, ezzel ellentétben depolarizáló hatású a TM neuronokon. A nociceptin hisztamin felszabadulást gátló hatását a tetradotoxin nem befolyásolja, ebből következően posztszinaptikus hatásról van szó, ami a lassú K+-áram fokozódásával hozható összefüggésbe, viszont a dinorfin A (1-13) κ-receptor agonista, 100-300 nM-os koncentrációtartományban sincs hatással ezen neuronok kisülésére. Ehhez hasonló, μ-receptor agonista által mediált excitátoros hatást figyeltek meg a substantia nigra és a ventralis tegmentalis area neuronjain, valamint a nucleus accumbens területén, ahol a μ-receptor agonisták dopamint szabadítanak fel [35, 36], és ezt a hatást a nociceptin gátolni képes [37]. Ezen excitátoros, μ-receptor által mediált hatásban, fontos szerepe van a ventrális tegmentális area területén található γ-aminovajsav (GABA)-erg interneuronok hiperpolarizációjának [38]. A hisztamin a periaqueductalis szürkeállományban közreműködik az opioid mediált analgézia kialakulásában [39]. Az ezen területre injektált hisztamin patkányokban antinociceptív hatású [40, 41]. A H3-autoreceptorok (H3R), illetve a hisztamin-N-metil-transzferáz enzim (HNMT) blokkolása, szintén antinociceptív hatást fejt ki [42]. Az i.c.v. adott H2-antagonista gátolja a morfin hatását, ami bizonyítja a H2-receptorok (H2R) szerepét a morfin analgézia kialakulásában [39]. A μ-receptor mediált hisztamin felszabadulás antinociceptív hatású. A nociceptinnek és a morfinnak ellentétes hatása van a TM neuronokra, és így a hisztamin felszabadulására. A nociceptin feltételezhetően az opioid kiváltotta hisztamin felszabadulás gátlásán keresztül befolyásolja a fájdalom mechanizmusát [34].

19

A nociceptin (20 µg/kg, intraperitoneálisan (i.p.)) erősen gátolja a hízósejt degranuláló peptid (MCDP, 0,25 µg/100 µl), kiváltotta plazma extravazációt krónikusan denervált patkány hátsólábon, ugyanakkor nincs jelentős hatással a szerotonin (0,5 µg/100 µl) és a hisztamin (0,1 µg/100 µl) által kiváltott plazma extravazációra. Patkány izolált tracheán a nociceptin (100 és 300 nM) mérsékeli a kapszaicin (10-8 M) és bradikinin (10-7 M) által előidézett SP, CGRP és szomatosztatin felszabadulást [43]. A szintetikus nociceptin analóg vegyületek tehát fontos szerepet játszhatnak a gyulladásgátló folyamatokban, hiszen mind a hízósejteken, mind pedig a nociceptív szenzoros neuronokon gyulladásgátló hatásúak. Az i.t. adott nociceptin egerekben, magatartási teszteken, erősíti a nociceptív viselkedést, amely megszűnik az i.t. együtt adott NOP receptor antagonista vegyületek az UFP-101 és a [Nphe1]nociceptin(1-13)NH2 hatására. A nociceptin-indukált nociceptív viselkedés, teljesen hiányzik a NOP receptor knockout egerekben [44]. A hisztaminnak fontos szabályozó szerepét a nociceptív transzmisszióban több kutatócsoport is igazolta [45, 46, 47]. Az i.t. adott hisztamin felerősíti egerekben a jellegzetes nociceptív viselkedést, amely hasonló az i.t. adott nociceptin kezelés után megfigyelhető nociceptív viselkedéshez [48]. A nociceptinnel i.t. együtt adott H1receptor (H1R) antagonista d-chlorphenyramin és pyrilamin csökkenti, a H2-receptor antagonista nincs hatással, míg a H3-receptor antagonista thioperamid elősegíti a nociceptin indukálta viselkedési formákat. H1-receptor knockout (H1R-KO) egerek i.t. adott nociceptin hatására nem mutatnak nociceptív viselkedést, ugyanakkor az i.t. adott SP a H1R-KO egerekben nociceptív viselkedést indukál. Neurokinin1-receptor (NK1) antagonista vegyületek (CP-99,994, sendid), ellentétben az N-metil-D-aszpartátsav (NMDA)-receptor antagonistákkal (MK-801, D-APV), gátolják a nociceptin indukálta spinalis nocicepciót [49]. Sakurada és mtsai kimutatták, hogy a nociceptin által előidézett nociceptív válasz mértékét csökkentí az i.t. együtt adott GABAA- (muscimol) és GABAB-receptor agonista ((R)-baclofen) [50]. Ezzel ellentétben az i.t. adott GABAA és GABAB receptor antagonisták (SR 95531, 2-hydroxysaclofen) a nociceptinhez és hisztaminhoz hasonlóan nociceptív választ idéztek elő, mely hatást csak az i.t. együtt adott H1R antagonista volt képes gátolni, a H2- illetve NOP-receptor antagonista nem. A nociceptin a NOP

20

receptoron tehát hisztamin felszabadító hatású, mely hisztamin a SP-t is tartalmazó neuronokon található H1R-on keresztül fejti ki gerincvelői szinten nociceptív hatását. A NOP receptor mRNS megtalálható számos nem idegrendszeri szövetben és szervben (bél, vázizom, vas deferens, vese) [51], valamint az immunsejteken (T-, B-lymphocyta, monocyta sejtvonalak) [7, 52]. Németh és mtsai in vivo kísérletekben a nociceptinnek az immunrendszerre kifejtett hatását vizsgálták [53]. Kísérletes eredményeik szerint az intraperitoneálisan (i.p.) adott nociceptin gyulladásgátló hatású, mivel gátolja a szubplantárisan adott hisztamin és MCDP által kiváltott plazma extarvazációt denervált patkány hátsólábon. Egyelőre még tisztázatlan, hogy ez a nociceptinnek egy közvetlen hatása az immunsejtekre vagy pedig egy indirekt módon, különböző mediátorok (SP, CGRP) által érvényesülő gátló folyamat. Németh és mtsai továbbá azt is igazolták, hogy izolált tracheán a nociceptin meggátolja a bradikinin és kapszaicin által indukált SP, CGRP és szomatosztatin felszabadulást és így gyulladásgátló hatását ezen neuropeptidek felszabadulásának szabályozása által fejti ki. Az intradermálisan (i.d.) adott nociceptin (5 pmol-5 nmol) ugyanakkor dózisfüggően érpermeabilitást fokozó hatású, azaz fokozza a gyulladásos reakciókat, melyet a H1receptor antagonista pyrilamin dózisfüggően képes kivédeni [54]. Patkány peritoneális hízósejt preparátumon igazolást nyert továbbá, hogy a nociceptin (10-8-10-4 M) dózisfüggően stimulálja a hisztamin felszabadulását és hisztamin felszabadító hatásának maximumát már 30 másodpercen belül eléri. Ez a hatás gátolható pertussis toxinnal és Ca2+-al, míg naloxonnal nem, ami azt igazolja, hogy a nociceptin a NOP receptorok izgatásával serkenti a hízósejtekből a hisztamin felszabadulását [54]. A gyulladás helyén megjelenő nociceptin feltételezhetően a vérkeringésből, vagy pedig az infiltrálódott leukocytákból származhat. A nociceptin komplex szerepe a gyulladásos és fájdalommal járó folyamatokban továbbra sem tisztázott teljes mértékben. Kísérletes adatok azt igazolják, hogy a nociceptin hyperalgesiás hatása nem mutatható ki a NOP receptor knockout egerekben [55]. Szupraspinálisan anti-opioid hatású [13], egérben i.c.v. hyperalgesiát és [13, 56, 57] allodyniát [58, 59] okoz. A nociceptin tehát erősíti a gyulladásos folyamatokat, hyperalgesiát és allodyniát idéz elő.

21

Az i.c.v adott nociceptin meggátolja a stressz, illetve az opioidok által előidézett analgetikus hatásokat [60]. Más kísérletes eredmények viszont azt mutatják, hogy az i.t adott nociceptin az opioidokhoz hasonlóan analgetikus hatású [61, 62], gátolja a carageen által indukált termális hyperalgesiát patkány hátsólábon [61]. Elmondhatjuk tehát, hogy a nociceptin különbözőképpen hat a fájdalommal és gyulladással járó folyamatokban,

egyes

esetekben

serkent

(lokális

gyulladásos

folyamatok,

szupraspinálisan), máskor pedig gátló hatást fejt ki (gerincvelő). Patkányokon az intravénasan (i.v.) adott nociceptin (0,6-60 nmol/kg) hatására vérnyomáscsökkenés, a mezenterikus artériák és venulák dilatációja (<50 µm) figyelhető meg. A vazodilatációt a NOP receptor-antagonista UFP-101 (60 és 150 nmol/kg, i.v.), a H1-antagonista pyrilamin (1 mg/kg, i.v.), a H2-antagonista ranitidin (1 mg/kg, i.v.), valamint a hízósejt stabilizáló cromolyn (1 mg/kg, i.v.) gátolja. Az eredmények azt mutatják, hogy a hisztamin nociceptin hatására felszabadul a hízósejtekből, aktiválja az erek simaizomzatának H1- és H2-receptorait és vazodilatációt idéz elő. Ezen kísérletes adatok a nociceptin-NOP rendszernek a mikrovaszkuláris gyulladásos folyamatokban betöltött jelentős szerepére hívják fel a figyelmet [63, 64]. A kísérletes adatok összességében arra engednek következtetni, hogy a nociceptin hisztamint szabadít fel a hízósejtekből, a hízósejtek felszínén elhelyezkedő NOPreceptor aktiválásán keresztül [65, 66], bár a hisztamin közvetlen meghatározása ezekben a vizsgálatokban nem történt meg.

1.2.2 A nociceptinerg rendszer hatása a szerotonerg rendszerre

A NOP receptor és a nociceptin nagy mennyiségben megtalálhatóak a raphe magvakban, melyek a KIR-i szerotonin szintézis helyei. Ezeken a területeken a nociceptin a K+-áram fokozásán keresztül gátolja a neuronális aktivitást [19]. A nociceptin megtalálható a nucleus raphe magnusban is, ami arra enged következtetni, hogy a szerotonerg rendszerre hatva a fájdalomérzés szupraspinális kontrolljában ugyancsak fontos szerepet játszik.

22

A nociceptin (0,1-3 µM) NOP receptoron, patkány cortexben, koncentrációfüggő mértékben gátolja az elektromosan kiváltott szerotonin felszabadulást (Emax = 54 %) [67]. Patkány cortex szinaptoszóma szuperfuzátumon pedig gátolja a spontán (EC50 = 7 nM) és a K+-kiváltotta (EC50 = 13 nM, Emax = 31 % gátlás) szerotonin effluxot, ami naloxonnal (10 µM) nem gátolható, viszont a szelektív NOP receptor-antagonista [Nphe1]nociceptin(1-13)NH2

és

naloxon

benzoylhydrazon

(NBH)

10

µM-os

koncentrációban antagonizálni képes [26]. A kísérletes eredmények továbbá igazolják, hogy sem a deltorfin I (szelektív δ-receptor agonista), sem az endomorfin I (szelektív µreceptor agonista), szignifikánsan nem befolyásolja a szerotonin felszabadulást, ami arra enged következtetni, hogy a NOP receptor aktiváció a kérgi szerotonin felszabadulás egyik legfontosabb preszinaptikus modulátora. Egerekben hole-board teszteken vizsgálták az i.c.v. adott nociceptin hatását az állatok „felderítő” viselkedésére. A viselkedésvizsgálat-tesztek erdeményei azt mutatják, hogy a kis dózis nociceptin (0,01 nmol, i.c.v.) anxiolítikus hatást vált ki az állatokban, míg az i.c.v. adott nagyobb dózis (1-5 nmol), dózisfüggő mértékben anxiogén hatású [68]. Az anxiogén és anxiolítikus hatást a nocisztatin (5 nmol, i.c.v.) előkezelés szignifikánsan csökkentette, ugyanakkor a nocisztatin (5 nmol) egymagában nem volt szignifikáns hatással a felderítő viselkedésre hole-board teszteken. A nociceptin kis dózisa (0,01 nmol, i.c.v.) szignifikánsan megemelte a szerotonin turnovert a hippocampusban (az amygdalában nem okozott szignifikáns változást), míg nagyobb dózisa (1-5 nmol, i.c.v.) szignifikánsan csökkentette az amygdalában. Egér neocortex szinaptoszóma preparátumon a nociceptin gátolja a szerotonin felszabadulást [69]. A kutatócsoport patkány cerebrocorticalis szinaptoszóma preparátumon is elvégezte ugyanezen kísérleteket, mivel egyes kísérletes adatok azt igazolták, hogy a preszinaptikusan elhelyezkedő szerotonin felszabadulást szabályozó NOP receptorok, egér neocortex-ben, nagyobb szelektivitást mutatnak a nociceptin iránt, mint patkány neocortexben (pEC50 = 8,15 vs. 7,9) [26]. Ezek a vizsgálatok felvetik annak lehetőségét, hogy a NOP receptorok valamelyest különbözhetnek az egyes állatfajokban. A nociceptin (30-300 µM) a dorsalis raphe nucleusban és a nucleus accumbensben, patkányokon végzett mikrodialízis kísérletekben, dózisfüggően gátolja a szerotonin effluxot [70]. A NOP receptor antagonista [Nphe1]nociceptin(1-13)NH2 (300 µM)

23

önmagában megemeli a szerotonin effluxot, míg a nociceptin előtt adva blokkolja a nociceptin szerotonin felszabadulást gátló hatását. Ezeken az agyterületeken a nociceptin szerotonerg rendszerre kifejtett gátló hatása feltételezhetően NOP receptor által modulált gátló hatás. Humán neocorticalis agyszeleteken a nociceptin (0,1 és 1 µM) gátolja a szerotonin felszabadulást, amit a NOP receptor antagonista J-113397-tel (0,1 µM) való előkezelés gátolni képes [71]. Ezek a kísérletes adatok egyrészt arra engednek következtetni, hogy a nociceptinerg rendszernek fontos szerepe van a KIR-i szerotonin mediált biológiai funkciók irányításában, másrészt pedig arra, hogy a nociceptin a kérgi területeken a szerotonin felszabadulás egyik legfontosabb preszinaptikus modulátora.

1.2.3

A nociceptinerg és a dopaminerg rendszer kapcsolata

A NOP receptor mRNS igazoltan jelen van a substantia nigra területén, ami arra enged következetni, hogy a nociceptin hatással lehet a mozgáskoordinációt szabályozó nigrostriatális dopaminerg rendszerre. A NOP receptor jelenléte a ventrális tegmentális areában pedig azt feltételezi, hogy a nociceptinerg rendszer a mezocorticolimbikus rendszeren keresztül hatással lehet a motivációra, a hangulatra, és a gondolkodásra [8]. A nociceptin és receptora nagy mennyiségben megtalálható a cortex és a subcorticalis motoros régiókban [12], míg a substantia nigra pars compacta (SNc) területén a dopaminerg neuronok mintegy 50 %-a expresszálja a NOP receptort. A nociceptin mRNS-t legnagyobb mennyiségben a GABA-erg neuronokban, míg a NOP receptor mRNS-t a dopaminerg neuronokban azonosították [72]. In situ hibridizációs vizsgálatokkal is igazolták a NOP receptorok jelenlétét a ventrális tegmentális area és a substantia nigra területén [73]. A nociceptinerg rendszer inhibítoros hatása a striatum dopaminerg neuronjaira, több kutatócsoport által igazolást nyert [27, 74, 75]. A nociceptin 0,1 μM-os koncentrációban gátolja tengerimalac és egér striatumban, valamint tengerimalac retinán a dopamin felszabadulást [27]. Ezt a hatást a NOP receptor antagonista Ac-RYYRIK-NH2 (0,032

24

μM) és naloxon-benzoylhydrazon (NBH, 5 μM) képesek kivédni, ami arra utal, hogy a nociceptin ezen gátló hatása NOP receptorhoz kötött. A medialis eminencia, a striatum, a nucleus accumbens, valamint a hypothalamicus paraventriculáris nucleus területén, a nociceptin dózis (0,01-10 μg, i.c.v.) és időfüggően gátolja a dopamin felszabadulását [74, 31]. Kínai aranyhörcsög petefészek sejtvonalon (CHO; jelölt D8 sejtek) expresszált patkány dopamin transzporteren (DAT), valamint patkány striatalis szinaptoszómán igazolást nyert, hogy a nociceptin gátolja a dopamin felvételt, amely egy kompetitív gátlás (IC50 = 1,9 µmol) [76]. Ezen kísérletes adatok szerint a nociceptin nagy valószínűséggel a DAT endogén antagonistája lehet, így közvetlen hatással van a dopaminerg transzmisszióra, és ezáltal a dopaminerg rendszer által szabályozott funkciókra. A nociceptin ugyanakkor a GABA transzporter 1-et (GAT-1) is gátolni képes, ami arra enged következtetni, hogy a GAT-1 gátlása révén, közvetett úton is hat a dopaminerg rendszerre. Szelektív peptid (UFP-101) és nem-peptid (J-113397) NOP receptor antagonisták serkentőleg hatnak a nigrostriatalis dopaminerg transzmisszióra és a motoros funkciókra [77, 78, 79], ugyanakkor gátolják a substantia nigra pars reticulataban a glutamát felszabadulást. Patkányokban a haloperidol (0,8 mg/kg, i.p.) kiváltotta akinéziát, ugyanezen NOP receptor antagonisták javítják: javul a motoros teljesítmény, ami az endogén nociceptinnek a Parkinson-szindrómában vélt fontos szerepére utal [80]. Ezt bizonyítja az is, hogy a substantia nigrában, a nociceptin-NOP-rendszer blokkolása, csillapítja a Parkinson-szerű akinéziát/hipokinéziát haloperidol kezelt patkányokon, a NOP receptor knockout egerek pedig ellenállóbbak a haloperidol-előidézte motoros depresszióval és akinéziával szemben [28]. Mindezek alapján elképzelhető, hogy a NOP receptor antagonistáknak, szerepe lehet majd a Parkinson betegség kombinált (szimptómás és neuroprotektív) kezelésében. In vivo patkány mikrodialízis kísérletekben és viselkedés teszteken (bar teszt), a NOP receptor antagonista J-113397 (1 mg/kg, i.p.) és az L-DOPA (25 mg/kg, i.p.) nagyobb dózisainak kombinációja, enyhíti a parkinsonos tüneteket (akinézia/hipokinézia) azáltal, hogy csökkenti a substantia nigra reticulatában a GABA kiáramlást [81]. E két vegyület már önmagában is (L-DOPA 0,1-6 mg/kg; J-113397 0,1-3 mg/kg) dózisfüggően enyhíti

25

a parkinsonos tüneteket, azonban kombinációban való alkalmazásuk additív hatásúnak bizonyult. A NOP receptor nem-peptid antagonista Compound B (CompB) in vivo mikrodialízis kísérletekben, dózisfüggően (0,3-30 mg/kg) stimulálja a mezolimbikus dopamin felszabadulást a nucleus accumbensben. A 10 mg/kg dózisban alkalmazott CompB, jelentős mértékben megemeli a mezolimbikus dopamin felszabadulást a vad és a NOP receptor knockout egerekben, ami azt mutatja, hogy a CompB hatása a nucleus accumbensben nem NOP receptorhoz kötött [82]. A nociceptin (7 nmol, i.c.v.) egér mikrodialízis kísérletekben gátolja a mezolimbikus dopamin felszabadulását, amit a NOP receptor-szelektív peptid-antagonista UFP-101 (5 nmol, i.c.v.) gátolni képes. Az UFP-101 önmagában nincs hatással a mezolimbikus dopamin felszabadulásra [83]. A nociceptinnek ezen szuppresszív hatása nem mutatható ki a NOP receptor knockout egerekben, ebből pedig arra következtethetünk, hogy a nociceptin dopamin felszabadulást gátló hatása NOP receptor által modulált. Patkány középagyi primér dopaminerg sejtkultúrán a nociceptin (0,01-100 nM) gátolja a dopamin felszabadulást (EC50 = 0,65 nM) anélkül, hogy befolyásolná a GABA-erg, illetve glutamáterg transzmissziót [84]. Ez arra utal, hogy a nociceptin közvetlen úton gátolja a dopaminerg neuronokat, az azok szómáin és/vagy dendritjein elhelyezkedő NOP receptorokon keresztül. Az intraperitoneálisan (i.p.) adott morfin (2,5 és 10 mg/kg) fokozza a dopamin felszabadulását a nucleus accumbensben és csökkenti a GABA-szintjét a ventrális tegmentális area területén. Amikor a nociceptint (5 és 10 nmol) 15 perccel a morfin (5 és 10 mg/kg) előtt adták, megemelkedett a GABA-szintje a ventralis tegmentalis area területein, ezáltal csökkent a morfin-indukálta dopamin felszabadulás a nucleus accumbensben [85]. A morfin, illetve más függőséget okozó anyagok, mint a kokain, az amfetamin vagy az alkohol, dopamint szabadítanak fel a nucleus accumbensben. Mivel a nociceptin gátolja a morfin dopamin felszabadulást fokozó hatását a nucleus accumbensben (közvetett út, GABA-erg rendszer kapcsolat), ez arra enged következtetni, hogy a nociceptinnek esetleg szerepe lehet a drogfüggőség kezelésében.

26

Mindezen kísérletes adatok alapján elmondható, hogy a nociceptinnek a vizsgált agyrészletekben általánosságban gátló hatása jut kifejezésre a dopaminerg rendszeren.

1.2.4

A nociceptinerg rendszer hatása a noradrenalin felszabadulására

A nociceptinerg és a noradrenerg rendszer szerepe és kapcsolata a fájdalom, az opioid dependencia és tolerancia, a szorongás, a félelem, a stressz, a tanulási folyamatok és a memóriát érintő folyamatokban intenzíven kutatott [23]. A NOP receptor nagy mennyiségben van jelen az adrenerg rendszer részét képező locus coeruleus területén, így szerepe lehet számos, a stresszhatás kapcsán fellépő vegetatív és viselkedési reakcióban. [3H]-noradrenalinnal előkezelt egéragy cortexben a nociceptin koncentrációfüggő mértékben (0,01-0,5 µM) gátolja a noradrenalin felszabadulását (Emax = 80 % gátlás). A nociceptinnek ezen noradrenalin felszabadulást gátló hatása a NOP receptor szelektív antagonista NBH-val (5 µM) és az α2-adrenoreceptor agonista talipexollal (0,2 µM) gátolható, ami arra enged következtetni, hogy a nociceptin ezen gátló hatása nagy valószínűséggel

a

noradrenerg

neuronok

preszinaptikus

α2-autoreceptoraival

kapcsolatban álló NOP receptor által medált [86]. 0,1 µM [3H]-noradrenalinnal előkezelt humán (elhunyt személyek) és patkány neocorticalis agyszeleteken a nociceptin dózisfüggően gátolja az elektromosan kiváltott noradrenalin felszabadulást (Emax = 64 % és 37 %) [87]. A nociceptin (1 µM) ugyanakkor a K+-áram (15 mM) kiváltotta [3H]-noradrenalin felszabadulást is gátolja humán és patkány neocorticalis agyszeleteken. A nem-peptid NOP receptor antagonista J-113397 (0,1 µM) önmagában nincs hatással sem a spontán, sem pedig a stimulált [3H]-noradrenalin

felszabadulásra,

azonban

gátolja

a

nociceptin

noradrenalin

felszabadulást gátló hatását. Mivel a kísérletes adatok arra engednek következtetni, hogy a nociceptin humán és patkány neocortexben a preszinaptikusan, a noradrenerg axonterminálisokon elhelyezkedő NOP receptoron keresztül gátolja a noradrenalin felszabadulását, ezért felmerülhet a NOP receptor agonisták alkalmazásának lehetősége a szorongás, illetve a stressz kezelésében.

27

A szelektiv NOP receptor antagonista J-113397 csökkenti a nociceptin által előidézett noradrenalin felszabadulást gátló hatást patkányon, így feltételezhetően hasznos lehet majd a drogfüggőség kezelésében [88], hiszen korábbi kísérletes adatok is azt igazolják, hogy a nociceptin patkányban képes enyhíteni a morfin megvonásos tüneteket [89]. Mivel a J-113397 önmagában nem csökkentette a [3H]-noradrenalin felszabadulást patkány neocortexben, ez arra utal, hogy a preszinaptikusan elhelyezkedő NOP receptor, nagy valószínűséggel nincs állandó jellegű aktivált alapállapotban a nociceptin által. Újszülött patkány, egér és tengerimalac 0,1 µM [3H]-noradrenalinnal előkezelt agykéregben a nociceptin (0,01-3 μM) gátolja a noradrenalin felszabadulást (Emax = 54 %; Emax = 61 %; Emax = 38 %) [90]. Mindhárom állatban a nociceptin noradrenalin felszabadulást gátló hatását a NOP receptor antagonista [Nphe1]nociceptin(1-13)NH2 (10 μM) kivédi, ami arra utal, hogy a nociceptin a noradrenerg neuronokon preszinaptikusan elhelyezkedő NOP receptoron fejti ki ezen noradrenalin felszabadulást gátló hatását. Éber patkányokon, mikrodialízis kísérletekben a nociceptin (1 μM) ugyancsak gátolja a noradrenalin felszabadulást (70 %) az amygdala basolateralis magvaiban [91], ugyanakkor a nem-peptid és kompetitív NOP receptor antagonista J-113397 (20 mg/kg i.p.) már önmagában is szignifikánsan megemeli a noradrenalinszintet (150-200 %). Ezen kísérletes adatok szerint a basalis noradrenerg neuronok feltételezhetően az endogén nociceptinnek NOP receptoron kifejtett, gátló hatása alatt állnak, hiszen a J113397 kiváltotta noradrenalin felszabadulást fokozó hatást a nociceptin képes meggátolni. Mindezek alapján elmondhatjuk, hogy a nociceptinnek főként gátló hatása jut kifejezésre a noradrenerg rendszeren, azonban annak megítélése, hogy pontosan milyen szerepet is játszik a noradrenerg rendszert is érintő folyamatokban, még további vizsgálatokat igényel.

28

1.2.5

A nociceptinerg rendszer és az acetilkolin kapcsolata

In vivo patkány mikrodialízis kísérletekben megállapítást nyert, hogy a nociceptin (10-5 M) gátolja az ACh felszabadulást patkány striatumban (79 % gátlás). A nociceptin ezen gátló hatását a NOP receptor parciális agonista [Phe1ψ(CH2-NH)Gly2]nociceptin-(113)-NH2, azaz a Pheψ, mikromoláris koncentrációban antagonizálni képes [25]. Ezen kísérletes adatok szerint a Pheψ-nak patkány striatumban antagonista hatása jut kifejezésre, tehát a nociceptin, ebből eredendően gátló hatást fejt ki patkányban a striatalis ACh felszabadulásra, mely gátló hatás NOP receptor által mediált. Patkány agykéreg és hippocampus preparátumon végzett kísérletes eredmények szerint, a nociceptin (0,03-3 µM) ugyancsak gátolja az elektromos úton stimulált [3H]kolineffluxot, azaz az ACh felszabadulást, amit a NOP receptor antagonista [Nphe1]NC(113)NH2 (10 µM) képes kivédeni [92]. NOP-receptor knockout egerekben, in vivo mikrodialízis kísérletekben megállapítást nyert, hogy a hippocampális ACh-szint szignifikánsan magasabb, mint a kontroll csoportban, ami a nociceptinerg rendszernek a hippocampális kolinerg funkciókra kifejtett inhibítoros hatását látszik igazolni [93]. Mivel a kolinerg neuronok kapcsolatban állnak a kérgi területekkel, a hippocampusszal, a thalamusszal, valamint az agytörzsi területekkel, amelyek a figyelem, a tanulás és a memória szabályozásában vesznek részt, a kísérletes eredmények arra engednek következtetni, hogy a hippocampusban a nociceptinerg rendszer a kolinerg rendszer gátlásával befolyásolja a hippocampális működést és szabályozást. Másrészről több kutatócsoport által is igazolást nyert, hogy a NOP/NC knockout egerekben nő a tanulási képesség és javul a memória [94, 95], ami arra utal, hogy a nociceptinerg rendszernek talán gátló hatása lehet a tanulást és az emlékezést érintő folyamatokra. A nikotinos ACh receptor antagonista mecamylamin (49 µmol/kg, s.c.) egerekben rontja az emlékezést és a tanulási képességet (step-through típusú passzív elkerülési teszten), illetve csökkenti az ACh felszabadulást a hippocampusban in vivo mikrodialízis kísérletekben. A mecamylamin ezen gátló hatását a nociceptin kis dózisa (10 fmol/patkány, i.c.v.) gátolni képes [96]. A NOP receptor antagonista [Nphe1] nociceptin(1-13)NH2 (1 nmol/patkány, i.c.v), nincs hatással a mecamylamin okozta károsító és ACh felszabadulást gátló hatásokra és nem antagonizálja a mecamylamin

29

kísérletekben a kis dózisban alkalmazott nociceptin ACh felszabadító hatását. Az önmagában és kis dózisban adott nociceptin (100 fmol/állat, i.c.v.) a hippocampusban nem befolyásolja az extracelluláris ACh-szintet, míg a nagy dózisban adott nociceptin (500 pmol/álat, i.c.v.) az ACh-szint csökkenését eredményezi. Ezen kísérletes eredmények azt mutatják, hogy a nociceptin nagyobb dózisokban rontja, míg kisebb dózisokban javítja a tanulási képességet és az emlékezést, ugyanakkor az eredmények azt is igazolják, hogy a nagyobb dózisú nociceptin hatások feltételezhetően NOP receptor által moduláltak, míg a kisebb dózisban alkalmazott nociceptin hatás pontos mechanizmusának tisztázása további vizsgálatokat igényel. Ezen kísérletes eredmények

összességében

ugyancsak

arra

engednek

következtetni,

hogy

a

nociceptinnek nagy valószínűséggel fontos szerepe van az emlékezést és a tanulást érintő folyamatokban. Mindezek alapján megállapíthatjuk, hogy a nociceptinnek a KIR-ben, az opioid peptidekhez hasonlóan [97, 98], főként gátló hatása jut kifejezésre a kolinerg rendszeren.

30

2

CÉLKITŰZÉSEK

Vizsgálataink célkitűzései az alábbiak voltak: 1. Vizsgálni kívántuk, hogy patkányokban az exogén (i.c.v.) adott nociceptin, hogyan befolyásolja a hisztamin- és szerotoninszintet a periférián, illetve a központi idegrendszerben? 2. Változik-e a perifériás és a központi idegrendszeri nociceptin- és nocisztatinszint neuropátiás fájdalom esetén? 3. A stressz okoz-e az endogén nocisztatinszintben a liquorban és a plazmában változást, illetve a feltételezhető hatás okoz-e változást a szerotonerg neurotranszmisszióban? 4. A rövid ideig tartó nagy dózisú, illetve a hosszú idejű kis dózisú alkoholterhelés, milyen hatást fejt ki a perifériás és központi idegrendszerben a nocisztatin anyagcserére? 5. Befolyásolja-e az újszülöttkori nociceptin, nocisztatin, illetve a perinatális korban β-endorfinnal való kezelés (hormonális imprinting) patkányban a központi idegrendszeri dopamin és szerotonin anyagcserét? 6. Egy

újonnan

kifejlesztett

kolinészteráz

reaktivátor

vegyület

központi

idegrendszerbe való bejutásának vizsgálata. 7. Akut ischémiás stroke betegek plazma nociceptinszintje mutat-e eltérést a korban és nemben illesztett kontroll személyekéhez hasonlítva, valamint a nociceptinnek az állatkísérletekben kimutatott központi idegrendszeri szerotonin kiáramlást

csökkentő

hatása,

kimutatható-e

szerotoninszintjének változásában is?

31

ezen

betegek

plazma

3

MÓDSZEREK

3.1

ÁLLATMODELLEK

Vizsgálatainkat Wistar (Charles River, barrier mögött tartott) patkányokon végeztük. Az állatokat ad libitum víz és táp, normál fény-sötét ciklusú standard körülmények között tartottuk. Az állatokat éter narkózis alkalmazása mellett (az állatvédelmi szabályok betartásával, 1806/007/2004), a belső szemzugon át elvéreztettük és a foramen occipitale magnum-on át liquor mintát vettünk. A kálium-etiléndiamin-tetraecetsavval (K-EDTA) alvadásgátolt vérhez (4-8 ml) azonnal 0,6 TIU/ml aprotinint (Calbiochem, Darmstadt, Németország) adtunk proteáz inhibítorként. A vért 1600 g-n, 15 percig, 4°C-on centrifugáltuk (Janetzky-K70, Berlin, Németország) és a plazmát mintavételi csövekbe gyűjtöttük. A liquor mintákat (90-170 µl) közvetlenül alkalmaztuk a mérésekhez. Az állatokból jéghideg alumínium lapon eltávolítottuk a különböző agyrészleteket: a frontális cortexet, a hypothalamust, a hippocampust, a striatumot és az agytörzset. A mintákat a felhasználásig -80 °C-on tároltuk.

3.1.1

Exogén nociceptin hatásának vizsgálata

Vizsgálatainkat nyolc hetes (súly: 170-230 g) hím patkányokon végeztük. A nociceptint (Bachem, Svájc) 5,5 nmol/állat, a SP-t (Bachem, Svájc) 50 nmol/állat, a compound 48/80-at (Sigma, USA) 100 μg/kg és a cromolynt (Orion, Finnország) 1 mg/kg dózisban adtuk. A vegyületek mindegyikét fiziológiás sóoldatban, i.c.v., 20 μl térfogatban alkalmaztuk. A kontroll csoport csak az azonos térfogatú, oldószerként használt fiziológiás sóoldat kezelést kapta. Mindegyik csoportba 5 állatot soroltunk. Vér- és liquor mintát vettünk 1 órával a 48/80 kezelés és 2 órával a nociceptin, valamint a SP kezelést követően. A kombinált kezelések alkalmával a cromolyn-t 30 perccel a compound 48/80 előtt adtuk. Az agyrészletek közül a frontális cortexet, a hypothalamust, és a hippocampust használtuk további méréseinhez.

32

3.1.2

Neuropátiás fájdalom modell (krónikus diabétesz)

A neuropátiás fájdalom metabolikus modelljeként, a Streptozotocin indukálta krónikus diabétesz modellt alkalmaztuk [99]. A vizsgálathoz hím patkányokat használtunk (súly: 180-220 g). Az állatokat két csoportra osztottuk: mind a kontroll, mind pedig a diabéteszes csoportba 35-35 állatot soroltunk. A diabéteszt i.p. 50 mg/ttkg pentobarbital-nátriumoldattal altatott patkányokon, a vena femoralisba adott egyszeri, 60 mg/ttkg, ex tempore készült Streptozotocin oldattal (a Streptozotocin oldószere: 22 ng/ml-es citromsav és fiziológiás sóoldat keveréke volt) váltottuk ki. A kontroll csoportba tartozó állatok i.v. 0,9 %-os NaCl oldatot kaptak. A diabétesz indukciója után, hetenként ellenőriztük a testtömeg és a vércukorszint alakulását. A vércukormérést GOD-POD

Reanal

Diagnosztika

módszerrel

végeztük

(Hitachi

U-200

Spektrofotométer, Tokió, Japán, 500 nm hullámhosszon). Azokat az állatokat tekintettük diabéteszeseknek, melyek vércukorszintje a normál vércukorszintnek háromszorosa volt (18 mmol/l). A diabétesz kialakulása után 2, 4, 8, 12 és 16 héttel az állatok egy-egy csoportjából (egy csoportba 7 állatot soroltunk) a testtömeg feljegyzése után, vér- és liquor mintát vettünk.

3.1.3

Stressz modell

Kísérleteinkben a nőstény patkányokat elválasztáskor (21 napos) 2 nap teljes víz és tápmegvonásnak tettük ki, mellyel az igen erős akut stresszhatást modelleztük [100], majd a négy hónapos kort elért állatokból (120 napos) vér és liquor mintát vettünk. Mindegyik csoportba 12 állatot soroltunk.

33

3.1.4

Alkohol modell

Vizsgálatainkat nőstény patkányokon végeztük. Kísérletes modellünkel az anyák szoptatás alatti alkoholfogyasztását próbáltuk demonstrálni [101]. A szoptatós patkányokat három csoportba soroltuk: 1) a szülés napjától 21 napig, 3 % alkohol tartalmú vizet ivott; 2) a szülés utáni 4. napon, 24 órán át, 15 % alkohol tartalmú vizet ivott; 3) a kontroll csoport csapvizet ivott (ad libitum). Az utódállatokat a 21. napon választottuk el, és a leválasztott utódállatok csapvizet kaptak (ad libitum). Mindegyik csoportba 10 állatot soroltunk. Amikor az utódok elérték a 3 hónapos kort, vér és liquor mintát vettünk.

3.1.5

Újszülöttkori nociceptin, illetve nocisztatin kezelés (imprinting)

Nőstény patkányokat ad libitum víz és táp, normál fény-sötét ciklusú standard körülmények között tartottuk. Ezek hím és nőstény utódait újszülött korban (a születést követő 24 órában) fiziológiás sóoldatban oldott 10 µg nociceptin, illetve 10 µg nocisztatinnal kezeltünk. A kontroll csoport fiziológiás sóoldat kezelést kapott. Mindegyik csoportba 5 állatot soroltunk. Amikor az utódok elérték a 3 hónapos kort, liquor mintát vettünk, majd eltávolítottuk az agyrészleteket.

3.1.6

β-endorfin kezelés

Vizsgálatainkhoz nőstény patkányokat használtunk. A 3 nőstény patkány a vemhesség 19. napján, i.m. egyszeri dózis, fiziológiás sóoldatban oldott 10 µg β-endorfint kapott. A 3 nőstény kontroll állat fiziológiás sóoldat kezelést kapott. A hím utódállatok a 21. napon kerültek elválasztásra, majd azt követően standard laboratóriumi körülmények között tartottuk őket.

34

Az 5 hónapos hím Wistar utódállatokat használtuk további kísérletes céllal (12 kontroll és 12 β-endorfin kezelt). Az állatoktól vér és liquor mintát vettünk. A különböző agyrészleteket azonnal eltávolítottuk (frontális cortex, hippocampus, hypothalamus, agytörzs).

3.1.7

Biszpiridinium-aldoxim meghatározása validált HPLC-EC módszerrel

Kísérleteinkben hím patkányokat (súly: 190±1,9 g, Toxicoop) használtunk. Az állatok i.m.

49,5

μmol

(22,12

mg)

K-27

((1-(4-hidroximino-metil-piridinium)-3-(4-

karbamoilpiridinium) propán dibromid); Department of Toxicology, Faculty of Military Health Sciences, Defence University, Hradec Kralove, Cseh Köztársaság) oldattal kezeltük (oldószer: fiziológiás sóoldat). A kontroll állatok oldószerkezelést kaptak. Mindegyik csoportba 5 állatot soroltunk. 60 perccel a kezelést követően az állatokból liquort és vért vettünk, majd a szérumot centrifugáltuk (Janetzky-K70, Berlin, Németország; 1600 g, 15 perc, 4 0C). A teljes agyat a liquor vétel után azonnal eltávolítottuk. A vizeletmintákat egyedileg gyűjtöttük.

3.2

ISCHÉMIÁS BETEGCSOPORTOK

A vérminták gyűjtése és az elvégzett vizsgálatok a Szent János Kórház Etikai Bizottságának 188/2004 számú engedélyével történtek. A vizsgált személyek a mérések elvégzéséhez tájékozott beleegyezésüket adták. A betegek a kórház Neurológiai Osztályára akut stroke miatt felvételre került személyek voltak, míg a kontrollok korban és nemben egyező csoportja részben olyan személyekből állt (K1), akiknek volt már stroke-ja, de a vérminta vétele időpontjában akut történése nem volt, illetve olyan személyekből (K0), akiknek semmiféle agyi érbetegsége sem akutan, sem korábban nem került megállapításra. A laboratóriumi vizsgálatokat végzők részére a személyek csoportbeosztása csak a mérések elvégzése után vált ismertté. A stroke-ot képalkotóvizsgálattal kimutatott releváns eltérés bizonyította. A vénás vért (2 x 3,0 ml) K-EDTAval alvadásgátolt vakuténerbe gyűjtöttük, melyhez proteázgátlóként 0,6 TIU/ml aprotinint (Calbiochem, Darmstadt, Németország) adtunk 100 μl mennyiségben. A

35

plazmát centrifugálással nyertük (Janetzky -K70, Berlin, Németország; 1600 g, 15 perc, 4 0C).

36

3.3

3.3.1

MÉRÉSI MÓDSZEREK

Hisztamin meghatározása mikroradioenzimatikus módszerrel

3.3.1.1 Hisztamin-N-metil-transzferáz enzim (HNMT) preparálása tengerimalac agyszövetből

A HNMT preparálása Brown és mtsai módszerének Schwartz által módosított módszere szerint történt [102]. A tengerimalacok dekapitálása után a teljes agyszövetet négyszeres térfogatú

0,25

mol/l

szaharózban,

Potter

csőben

homogenizáltuk,

majd

a

homogenizátumot ultracentrifugáltuk (Janetzky UP65, Németország) 100.000 g-n, 60 percig, 4 0C-on. A nyert felülúszót NH4SO4-tal telítettük és 120 perc állás után 10.000 g-n, 20 percig, 4 0C-on centrifugáltuk (Janetzky UP65, Németország). Az üledéket 0,01 mol/l Na3PO4 (pH 7,9) pufferben vettük fel, és egy éjszakán át dializáltuk 0,001 mol/l Na3PO4–tal (pH 7,9) szemben, majd ismét centrifugáltuk 100.000 g-n, 60 percig, 4 0Con. A felülúszó HNMT-preparátum fehérjetartalmát 3,8 mg/ml-re állítottuk be. Az egy kisérlethez szükséges enzim-mennyiségeket -20 0C-on tároltuk, legfeljebb 14 napig.

3.3.1.2 A hisztamin szöveti szintjének meghatározása A hisztamin szöveti szintének meghatározása Taylor és Snydler módszere szerint történt [103]. A reakcióelegybe a 0,1 mol/l Na3PO4-pufferben (pH 7,9) felvett hím Wistar patkány agyszövet homogenizátumhoz (20 µl), illetve liquor mintához (20 µl), vagy plazma mintához (20 µl) HNMT preparátumot (20 µl) adtunk, és a 37 0C-on végzett 5 perces előinkubálás után a reakciót 67 µmol/l

3

H-SAM (S-adenozil metionin;

Amersham, Anglia, spec.akt.: 9,25 MBq) hozzáadásával indítottuk. A 60 perces, 37 0Cos vízfürdőben enyhe rázatással történt inkubálás után, a reakciót 5 μl, 2,4 N HClO4 hozzáadásával állítottuk le, majd 20 μl, 10 N NaOH-dal a mintákat átlúgosítottuk. A 3HNτ-metil-hisztamint-t 400 µl kloroformba extraháltuk (Vortex, 3 perc), majd az elegyet

37

10 perces, 2500 fordulat/perc-es centrifugálásnak vetettük alá (Janetzky-K26, Berlin, Németország). A felülúszót háromszor mostuk az alábbi módon: 100 μl NaCl-dal telített 3 N NaOH-ot adtunk a mintákhoz és ismét centrifugáltuk (Janetzky-K26, Berlin, Németország; 10 perc, 2500 fordulat/perc). Végül a kloroformos fázisból 200 μl-t N2 gáz áramoltatással szárazra bepároltuk és a radioaktivitását 5 ml Ultima Gold (Packard, Hollandia) szcintillációs koktél hozzáadása után, folyadékszcintillációs módszerrel (Beckmann 9000) határoztuk meg (1 pg hisztamin = 40 dpm).

3.3.2

Biogén

aminok

(dopamin,

szerotonin)

és

metabolitjainak

(5-hidroxi-

indolecetsav, homovanillinsav) meghatározása validált HPLC-EC módszer alkalmazásával

Validált módszert dolgoztunk ki patkány liquor, plazma, szérum és agyszövet biogén amin tartalmának meghatározására. Mintaelőkészítés A teljes agymintákat négyszeres mennyiségű 0,8 M-os perklórsavval (PCA) (Fluka, Neu-Ulm, Svájc) higítottuk, majd Ultra Turrax T25 Janke&Kunkel homogenizáló készülékkel

(IKA

Labortechnik,

Staufen,

Németország),

20.000

rpm/perc

fordulatszámon, 1 percig homogenizáltuk. A 400 µl agyhomogenizátumhoz fehérjementesítés céljából 800 µl 0,8 M PCA-t adtunk, majd a meghigított mintákhoz hozzáadtuk a belső standard oldatot (N-metil-szerotonin, 50 ng/ml) és Eppendorf centrifugával (A. Hettich, Tuttlingen, Németország) 14.000 g-n, 10 percig, 4 0C-on centrifugáltuk. A továbbiakban a felülúszót használtuk a mérésekhez, melyet a HPLC meghatározásig -80 ºC-on tároltunk. A szérum, a vizelet, a liquor és a plazma mintákat fehérjementesítés céljából 0,8 M-os PCA-val higítottuk a következőképpen: 50 µl szérum + 1200 µl 0,8 M PCA; 50 µl vizelet + 1950 µl 0,8 M PCA; 50 µl liquor + 150 µl 0,8 M PCA, 50 µl plazma + 1200 µl 0,8 M PCA, ezután a mintákat Eppendorf centrifugával (A. Hettich, Tuttlingen,

38

Németország) 14 000g-n, 10 percig, 4 0C-on centrifugáltuk. A továbbiakban a felülúszót használtuk a mérésekhez, melyet a HPLC meghatározásig -80 ºC-on tároltunk. Kromatográfiás rendszer A méréshez alkalmazott vegyszerek: 5-hidroxitriptamin oxalátsó (Sigma, St. Louis, USA); 5-hidroxi-indolecetsav (5-HIAA) (Sigma, Svájc); N-metil-5-hidroxitriptamin oxalátsó (belső standard) (Sigma, Heidelberg, Németország); dopamin hidroklorid (Sigma, Heidelberg, Németország); homovanillinsav (HVA) (Sigma, St. Louis, USA). A méréshez Jasco pumpát (PU1580, Tokyo, Japán) és Decade elektrokémiai detektort használtunk (Antec, Leyden, Hollandia). A kromatográfiás körülmények a következők voltak: loop 50 µl, hőmérséklet 30°C, Eox. = 0,65 V, érzékenység 10 nA, átfolyási sebesség 1 ml/perc, filter: 0,1 perc. A méréshez Zorbax RX-C18 4,6 x 250 mm (5 μm) analitikai oszlopot (Agilent, USA) és Zorbax RX-C18 4,6x12,5 mm (5 μm), előtétoszlopot (Agilent, USA) használtunk. A mobil fázis összetétele: 56,2 mmol/l Na2HPO4 (Merck, Darmstadt, Németország), 47,9 mmol/l citromsav-monohidrát (Merck, Darmstadt, Németország), 0,027 mmol/l Na2-EDTA (Merck, Darmstadt, Németország), 0,925 mmol/l 1-oktánszulfonsav (SigmaAldrich, Steinheim, Németország), és 75:950 acetonitril/ foszfát puffer. A mobil fázis pH-ját 85 % H3PO4-al (Sigma-Aldrich, Budapest, Magyarország) 3,7-re állítottuk be. Kalibráció: A 100 μg/ml-es szerotonin, dopamin, homovanillinsav és 5-hidroxiindolecetsav törzsoldatok mindegyikéből 0,8 M-os PCA-val 1 μg/ml-es oldatokat, majd kalibrációs sorozatot (1 ng/ml, 2 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml) készítettünk. A módszert lineárisnak találtuk 1-100 ng/ml tartományban. Mérési erdeményeinket ezen kalibrációs sorozatra készült 7 pontos kalibrációs egyenesre számoltuk ng/mg nedves agyszövet, illetve ng/ml egységben. A kalibrációs sorozatból minden nap újat készítettünk és mindegyik koncentrációhoz 3 párhuzamos mérést végeztünk. A kvantitatív meghatározásokhoz az N-metil-5-hidroxitriptamin oxalátsót alkalmaztuk belső standardnak.

39

A kromatográfiás kiértékelés Borwin 1.21 kromatrográfiás software-rel történt (JMBS, Le Fontanil, Franciaország). Validálás Standard addíciós módszerrel a kontroll és a kezelt állatok agyhomogenizátumában azonosítottuk

a

vizsgálandó

agyhomogenizátumában

a

biogén

vizsgálandó

aminokat. anyagokra

Meghatároztuk (dopamin,

patkány szerotonin,

homovanillinsav, 5-hidoxi-indolecetsav) a mennyiségi meghatározás alsó határát, azaz az LOQ értékét, melyek számértékei a 4. táblázatban láthatóak . 4. táblázat: Dopamin és szerotonin, valamint metabolitjaik patkány agyszövetre számolt LOQ (a mennyiségi meghatározás alsó határa) értékei. LOQ

3.3.3

Dopamin

0,8 ng/ml

Szerotonin

0,67 ng/ml

Homovanillinsav

1,0 ng/ml

5-hidroxi-indolecetsav

0,5 ng/ml

Nociceptin és nocisztatin meghatározása humán plazma, illetve patkány plazma és liquor mintákból radioimmunoassay módszerrel

A

plazma

és

a

liquor

nociceptinszintjének

meghatározása

validált

125

I-

radioimmunoassay (125I-RIA) módszerrel történt. A plazma és liquor mintákból a nociceptin extrakcióját az alábbiak szerint végeztük: 1,0 ml plazmához, illetve 100 µl liquor mintához azonos mennyiségben 1 %-os trifluoro-ecetsavat (TFA; SIGMA, Budapest, Magyarország) adtunk, majd 20 percig, 17.000 g-n, 4 0C-on centrifugáltuk (Eppendorf centrifuga, Hettich Mikro 22R, Németország) és a felülúszót előkészített (1 %-os TFA, majd 1 %-os TFA-t tartalmazó 60 %-os vizes acetonitril) C18 SPE (ABL&E JASCO, Budapest, Magyarország) oszlopra vittük. Az oszlopon lévő mintákat 1 %-os vizes TFA-val mostuk és 1 % TFA-t tartalmazó 60 %-os vizes acetonitrillel oldottuk le.

40

Az extrakciót követően a mintákat vakuumcentrifugában (SAVANT, Farmingdale, New York, USA) szárazra pároltuk. A RIA mérésekhez

125

I-Nociceptin RIA kit-et használtunk (Phoenix Pharmaceuticals

Inc, Belmont, Kalifornia, USA), mely 1-128 pg/ml tartományban mér. A radioaktivitást 10 mintaváltós γ-mérővel (BIO-RAD, Magyarország) határoztuk meg, melyhez ISODATA 20/20 (ISODATA, Pittsburg, USA) spline-illesztéssel értékelő számítógépes program csatlakozott.

3.4

STATISZTIKAI ANALÍZIS

A kísérletek eredményeit Student-féle kétmintás t-próbával értékeltük ki. Az egyes csoportok értékei közötti különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha a Student féle kétmintás t-próba szerint a p<0,05 értéket adott.

41

4

EREDMÉNYEK

4.1

A

NOCICEPTINERG

ÉS

A

HISZTAMINERG

RENDSZER

KAPCSOLATÁNAK VIZSGÁLATA

4.1.1

Nociceptin hatása az agyi hisztamin és szerotoninszintekre

Mérési adataink szerint az i.c.v. 5,5 nmol/állat dózisban alkalmazott nociceptin időfüggően hisztamint szabadít fel a liquorban. A nociceptin hisztamin felszabadító hatásának maximumát a beadás után 120 perccel mértük (5. ábra), ekkor a kontroll hisztaminszintet (4,5±0,5 ng/ml) közel másfélszeresére emelte meg, majd 180 percnél a hisztaminszint csökkenést mutatott, de még ekkor is nem szignifikánsan magasabb volt, mint a kontrollokban mért érték.

Kontroll % ±S D

* 150

100 0

1

2

3

Idő (óra) 5. ábra: Patkány liquor hisztaminszint változásának időfüggése 5,5 nmol/állat, i.c.v. nociceptin kezelés hatására. Kontroll hisztaminszint±szórás (SD) = 4,5±0,5 ng/ml;*p<0,05; n=5.

42

Az i.c.v. adott 5,5 nmol/állat nociceptin 120 percnél, a liquor szerotonin-koncentrációját szignifikánsan csökkentette a kontroll 1,14±0,17 ng/ml-ről 0,58±0,06 ng/ml-re (p<0,05) (6. ábra).

200

kontroll % ± SD

* 150

100

* 50

0 kontroll HA

kontroll

kontroll 5-HT

hisztamin (HA)

szerotonin (5-HT)

6. ábra: Patkány liquor hisztamin- és szerotoninszintjének változása 5,5 nmol/állat, i.c.v. nociceptin kezelés után 120 perccel; *p<0,05; n=5. A 100 μg/kg i.c.v. adott compound 48/80, hízósejt degranuláló vegyület, hatásmaximumát a beadás után 60 perccel tapasztaltuk. Ekkor a liquorban a kontroll hisztaminszinttel (4,5±0,5 ng/ml) szemben 8,5±3,1 ng/ml-es szignifikánsan (p<0,05) magasabb értéket mértünk, illetve a kontroll szerotoninszint (1,14±0,17 ng/ml) 1,32±0,36 ng/ml-re történő nem-szignifikáns változását tapasztaltuk (7. ábra).

43

200

*

kontroll %± SD

150

100

50

0

kontoll HA

kontroll

kontroll 5-HT

hisztamin (HA)

szerotonin (5-HT)

7. ábra: Patkány liquor hisztamin- és szerotoninszintjének változása 100 μg/kg, i.c.v. compound 48/80 kezelés után 60 perccel, *p<0,05; n=5. A plazmában az i.c.v. adott nociceptin a beadás után 120 perccel sem a hisztamin, sem pedig a szerotoninszintekre nem volt szignifikáns hatással (8. ábra). A compound 48/80 azonban 60 perccel a beadását követően, szignifikánsan megemelte a plazmában mind a hisztamin, mind pedig a szerotoninszintet (9. ábra).

44

kontroll % ± SD

200

100

0

HA

5-HT kontroll

NC

8. ábra: Patkány plazma hisztamin- és szerotoninszintjének változása 5,5 nmol/állat, i.c.v. nociceptin kezelés után 120 perccel, *p<0,05; n=5.

*

kontroll % ± SD

200

*

100

0

HA

5-HT kontroll

48/80

9. ábra: Patkány plazma hisztamin- és szerotoninszintjének változása 100 μg/kg, i.c.v. compound 48/80 kezelés után 60 perccel, *p<0,05; n=5.

45

Az 50 nmol/állat dózisban alkalmazott neuropeptid SP, 120 perccel az i.c.v. kezelés után, a liquor hisztamin koncentrációját 9,36±1,68 ng/ml-re emelte (p<0,01), ami a kontroll értéknek több mint kétszerese. A szerotoninszint a kontroll értékekhez képest (0,93±0,38 ng/ml) nem változott (0,96±0,8 ng/ml). A plazmában a SP hatására nem tapasztaltunk szignifikáns hisztaminszint változást (10. ábra). SP kezelés hatására a frontális cortexben (34,4± 4,6 ng/g vs. 55,38±2,98 ng/g; p<0,05) és a hypothalamusban (128±13 ng/g vs. 281±14 ng/g; p<0,01) mértünk szignifikáns hisztaminszint emelkedést, 120 perccel a kezelést követően (11.ábra). A compound 48/80, 60 perc múlva mért hisztaminkiáramlást fokozó hatását (188±36,4 %), a hízósejt stabilizáló cromolyn (1 mg/kg, i.c.v) előkezeléssel (a compound 48/80 előtt 30 perccel adva) teljes mértékben kivédhetőnek találtuk a liquorban (103±9 %) (12. ábra).

300

**

kontroll HA % ± SD

kontroll 200

SP SP+Cro

100

0

LIQUOR

PLAZMA

10. ábra: Patkány liquor és plazma hisztaminszintjének változása 50 nmol/állat, i.c.v. Substance P kezelés után 120 perccel, illetve 1 mg/kg, i.c.v. 30 perces cromolyn előkezelést követően, **p<0,01; n=5.

46

300

**

kontroll HA % ± SD

250

*

200

150

100

50

0

HYPOTHALAMUS

FRONT. CORTEX

kontroll

SP

11. ábra: Patkány hypothalamus és frontális cortex hisztaminszintjének változása 50 nmol/állat, i.c.v. Substance P kezelés után 120 perccel, *p<0,05; **p<0,01; n=5.

200

kontroll HA % ± SD

180

** **

160 140 120 100 80 60 40 20 0

LIQUOR

kontroll

HYPOTHALAMUS

48/80

Cro+48/80

12. ábra: Patkány liquor és hypothalamus hisztaminszintjének változása 100 μg/kg, i.c.v. compound 48/80 kezelés után 60 perccel, illetve 1 mg/kg, i.c.v. 30 perces cromolyn előkezelés után, **p<0,01; n=5.

A nociceptin előtt 30 perccel adott cromolyn, a nociceptin 120 percnél mért hisztaminszint-emelő hatását, ugyancsak szignifikánsan gátolta a liquorban (152±9 %

47

vs. 128±3 %) (13. ábra). A SP esetében azt tapasztaltuk, hogy a cromolyn előkezelés a liquor hisztaminszintjének 120 percnél mért szignifikáns emelkedését (208±18 %), teljes mértékben képes volt gátolni (100±12 %) (10. ábra). Vizsgálatainkban a hízósejt stabilizáló cromolyn önmagában az alkalmazott dózisban nem befolyásolta sem a hisztamin, sem pedig a szerotoninszintet. A vizsgált agyrészletek közül (frontális cortex, hippocampus, hypothalamus) az i.c.v. alkalmazott 5,5 nmol/állat nociceptin szignifikáns (p<0,05) hisztaminszint emelkedést 120 perc múlva a hypothalamusban (128±13 ng/g vs. 211±11,5 ng/g), valamint a hippocampusban okozott (20,1±1,9 ng/g vs. 29,95±0,23 ng/g) (13. ábra), míg a frontális cortexben (34,4±4,6 ng/g vs. 35,6±3,6 ng/g) nem tapasztaltunk szignifikáns változást.

kontroll HA % ± SD

200

150

*

*

LIQUOR

HYPOTHALAMUS

100

50

0

NC

Cro+NC

HIPPOCAMPUS

kontroll

13. ábra: Patkány liquor, hypothalamus és hippocampus hisztaminszintjének változása 5,5 nmol/állat, i.c.v. nociceptin kezelés után 120 perccel, illetve 1 mg/kg, i.c.v. 30 perces cromolyn előkezelés után. NC vs. Cro+NC, *p<0,05; n=5. A compound 48/80 kezelés 60 perc után a hypothalamusban emelte meg szignifikáns (p<0,01) mértékben a hisztaminszintet (128±13 ng/g vs. 179±14 ng/g), míg a

48

hippocampusban nem okozott szignifikáns változást (20,1±1,9 ng/g vs. 21±2,1 ng/g) (12. és 14. ábra).

A nociceptin előtt 30 perccel adott cromolyn a hypothalamusban szignifikánsan (p<0,05) csökkentette a nociceptin 120 percnél mért hisztaminszintet emelő hatását (165±16 % vs. 121±6 %), míg a hippocampusban ezt a védő hatást nem tapasztaltuk (149±12 % vs. 145±5 %) (13. ábra). A 30 perces cromolyn előkezeléssel, a compound 48/80 60 percnél mért szignifikáns hisztaminszintet emelő hatását, a hypothalamusban teljes mértékben kivédhetőnek találtuk (102±5 % vs. 100±16 %) (12. ábra). A SP-nek 120 percnél mért liquor hisztaminszintet emelő hatását cromolyn előkezeléssel, ugyancsak teljes mértékben ki tudtuk védeni (208±18 vs. 100±12) (10. ábra). A compound 48/80 vegyület önmagában, 60 perc múlva, a hypothalamusban és a liquorban emelte meg szignifikáns mértékben a hisztaminszintet, ugyanakkor a frontális cortexben és a hippocampusban nem tapasztaltunk jelentős változást. A nociceptin és a compound 48/80 kombinált kezelés, amikor a nociceptint a compound 48/80 után 60 perccel adtuk, a hypothalamusban és a hippocampusban okozott szignifikáns hisztaminszint emelkedést, míg a liquorban és a frontális cortexben nem változott a hisztaminszint (14. ábra).

49

48/80

48/80 +nociceptin

kontroll HA % ± SD

200

** NS

150

*

*

** NS

NS NS

100

50

0

K

CSF

HY

HIPP

FC

Liquor (CSF) Hypothalamus (HY) Hippocampus (HIPP) Front.cortex (FC) Kontroll (K±SD) (n=5) 4,2±0,55 ng/ml

128±13 ng/g

20,1±1,9 ng/g

153±5

138±6

113±10

106±12

48/80 + NC (%±SD) (n=5) 148±2

155±3

137±13

112±10

48/80 (%±SD) (n=5)

34,4±3,6 ng/g

14. ábra: Patkány liquor, hypothalamus, hippocampus és frontális cortex hisztaminszintjének változása 100 μg/kg, i.c.v. compound 48/80 kezelés után 60 perccel, illetve 48/80+NC (a nociceptint 60 perccel a compound 48/80 után adtuk) kombinált kezelés hatására. NS = nem szignifikáns; 48/80 vs. 48/80+NC *p<0,05; Kontroll vs. 48/80 **p<0,01.

50

4.2

ENDOGÉN NOCICEPTIN- ÉS NOCISZTATINSZINTEK VIZSGÁLATA ÁLLATMODELLEKEN

4.2.1

Neuropátiás fájdalom modell (krónikus diabétesz)

Eredményeink azt mutatják, hogy az egyszeri, i.v. adott 60 mg/ttkg Streptozotocin kezelést követő második héten a kontroll csoporthoz képest (4,85±1,01 mmol/l) a kezelt csoport minden egyedében a kontroll értéknek legalább háromszorosára emelkedett a vércukorszintje (20,22±5,97 mmol/l), mely a kísérlet teljes időtartama alatt fennállt. A kísérlet alatt a diabéteszes állatok súlygyarapodása jelentősen elmaradt a kontroll csoporthoz képest (5. táblázat).

5. táblázat: Streptozotocin indukálta diabétesz hatása a testtömeg és a vércukorszint alakulására a diabétesz 4., 8., 12. és 16. hetében. Diabétesz fennálásának ideje

Kontroll csoport testtömeg (g±SD) Diabéteszes csoport testtömeg (g±SD) Kontroll csoport vércukorszint (mmol/l±SD) Diabéteszes csoport vércukorszint (mmol/l±SD)

4.hét

8.hét

12.hét

16.hét

321,6±22,9

378,3±30,7

483,8±55,8

542,7±28,1

n=7

n=7

n=7

n=7

214±65,3

170±19,2

186,4±7,3

201,2±5,4

n=7

n=7

n=7

n=7

5,5±0,5

5,6±1,3

6,2±0,4

6,2±0,6

n=7

n=7

n=7

n=7

25,7±6,8

38,8±6,5

37,6±3,8

40,1±4,7

n=7

n=7

n=7

n=7

51

Eredményeink azt mutatják, hogy a vizsgált időintervallumban a 16 hétig fennálló krónikus diabétesz nem befolyásolja sem a plazmában (15. ábra), sem pedig a liquorban (16. ábra) a nociceptinszintet. A diabéteszes állatok plazma és liquor nociceptinszintje a kontroll állatoknál tapasztaltakhoz hasonlóan jól korrelál. A korrelációs koefficiens 0,991. A 16. héten mért adatok alapján a diabéteszes állatokban a plazma/liquor hányados 0,1nek adódott, ami megegyezik a kontroll értékekből számolható hányadossal (0,1). A plazma/ liquor hányados tehát változatlan a kísérlet teljes időtartama alatt. Ezzel szemben, a nocisztatinra kapott eredményeink azt mutatják, hogy a krónikusan fennálló diabétesz megemeli mind a plazmában, mind pedig a liquorban a nocisztatinszintet. Ez a nocisztatinszint emelkedés a plazmában a 4. héttől szignifikáns és tovább emelkedik a vizsgált időintervallumban egészen a 16. hétig (17. ábra). A liquorban a nocisztatinszint emelkedés a 8. héttől válik szignifikánsan magasabbá és a krónikus diabétesz 16. hetéig szignifikánsan magasabb szinten is marad (18. ábra).

52

kontroll

16

plazma nociceptinszint (pg/ml ± SD)

diabéteszes

12

8

4

0 2

4

6

8

10

12

14

16

diabétesz időtartama hetekben

C SF n o cicep tin sz in t (p g /m l±SD )

15. ábra: Tartósan fennálló diabétesz hatása patkányok plazma nociceptinszintjére (n=7).

160

kontroll diabéteszes

120

80

40

0

2

4

6

8

10

12

14

16

diabétesz időtartama hetekben 16. ábra: Tartósan fennálló diabétesz hatása patkányok liquor nociceptinszintjére (n=7).

53

plazma nocisztatinszint (pg/ml± SD)

35

30

25

* 20

15

10

5

0

C

2

4

8

12

16

diabétesz időtartama hetekben 17. ábra: Tartósan fennálló diabétesz hatása patkányok plazma nocisztatinszintjére (n=7), *p<0,05 vs. kontroll. .

CSF nocisztatinszint (pg/0,1ml ± SD)

10 9 8

*

7 6 5 4 3 2 1 0

C

2 4 8 12 16 diabétesz időtartama hetekben

18. ábra: Tartósan fennálló diabétesz hatása patkányok liquor nocisztatinszintjére (n=7); *p<0,05 vs. kontroll.

54

4.2.2

Stressz modell

Eredményeink azt mutatják, hogy az elválasztáskor (21 napos) stresszhatásnak (2 nap víz és tápmegvonás) kitett, majd a négy hónapos (120 napos) korban vizsgált nőstény patkányokban a stresszhatás erdeményeképpen nem változik a vizsgált agyrészletek (frontális cortex, striatum, hypothalamus, hippocampus, agytörzs) szerotoninszintje, viszont az 5-HIAA-szint igen (6. táblázat). A stresszhatásnak kitett nőstény állatokban szignifikánsan megemelkedett az 5-HIAAszint a striatumban (p<0,02) és csökkent a hypothalamusban (p<0,05), valamint az agytörzsben (p<0,0001). A frontális cortexben és a hippocampusban nem tapasztaltunk jelentős változást. Az 5-HIAA/5-HT arány szignifikánsan nem változott. A plazmában szignifikánsan (p<0,01) megemelkedett a nocisztatinszint a stresszelt csoportban a kontroll csoporthoz képest (1,69±0,33 pg/ml vs. 2,28±0,25 pg/ml) (19. ábra). A liquorban a stresszhatásnak kitett állatok és a kontroll csoport nocisztatin értékei között nem találtunk szignifikáns változás (2,79±0,59 pg/0,1 ml vs. 2,39±0,51 pg/0,1 ml) (20. ábra).

55

6. táblázat: Különböző agyrészletek szerotonin- és 5-hidroxi-indolecetsav-szintjének változása stresszhatásnak kitett, nőstény Wistar patkányokban (ng/mg nedves szövet±SD). Agyrészlet

Állat

5-HT (ng/mg

p

nedves

5-HIAA

p

(ng/mg

szövet±SD)

5-HIAA/

p

5-HT

nedves szövet±SD)

Frontális cortex

kontroll

0,61±10,37

0,29

9,5±1,78

0,11

21,03±10,4

0,77

n=12 stresszelt

0,48±0,18

8,33±1,59

19,96±6,4

n=12 Stiatum

kontroll

0,88±0,83

0,38

7,73±1,35

0,02

15,65±9,2

0,31

n=12 stresszelt

0,58±0,47

9,23±2,15

20,92±10

n=12 Hippocampus

kontroll

0,69±0,61

0,86

8,4±1,96

0,35

16,98±8,3

0,57

n=12 stresszelt

0,63±0,86

7,84±1,86

19,05±8,2

n=12 Hypothalamus

kontroll

1,0±0,62

0,27

13,53±1,71

0,05

19,67±13,2

0,65

n=12 stresszelt

0,74±0,44

12,08±1,77

22,3±13,94

n=12 Agytörzs

kontroll

1,08±0,79

0,13

15,72±2,82

0,0001

24,47±18,5

n=12 stresszelt

0,66±0,42

10,01±2,72

n=12

56

18,78±7,68

0,35

Plazma nocisztatinszint (pg/ml±SD)

3

** 2,5

KONTROLL STRESSZELT

2 1,5 1

0,5 0

CSF nocisztatinszint (pg/0,1 ml±SD)

19. ábra: Plazma nocisztatinszintjének változása stresszhatásnak kitett nőstény Wistar patkányokban (**p<0,01; n=12).

3,5 KONTROLL

3

STRESSZELT

2,5 2 1,5 1 0,5 0

20. ábra: Liquor nocisztatinszintjének változása stresszhatásnak kitett nőstény Wistar patkányokban (n=12).

57

4.2.3

Alkohol modell

Nőstény Wistar patkányok szoptatás alatt egyszeri, nagy dózisú (a szülés utáni 4. napon, 24 órán át, 15 % alkohol) alkoholos víz fogyasztása, a három hónapos utódok liquor nocisztatinszintjében szignifikáns (p<0,01) emelkedést okozott a kontroll csoporthoz képest (6,6±1,41 pg/ 0,l ml vs. 12±2,56 pg/ 0,l ml) (21. ábra). Az utódgenerációkban az anyák hosszabb távon és kis dózisú (3 % alkohol a szülés napjától számítva 21 napig) alkoholfogyasztása viszont, nem volt hatással a liquor nocisztatinszintjére (6,6±1,41 pg/0,l ml vs. 8,12±1,53 pg/ 0,l ml).

**

CSF nocisztatinszint (pg/0,1 ml ± SD)

16

kontroll 3 % alkohol, hosszú távon 15% alkohol, rövid távon

12

8

4

0 K

3% alkohol 15% alkohol

21. ábra: A liquor nocisztatinszintjének változása a szoptatás alatt alkoholt fogyasztott anyák három hónapos utódaiban (pg/0,1ml±SD); K = kontroll; 3 % alkohol = az anyák hosszabb távon (21 napig), kis dózisban fogyasztottak alkoholt; 15 % alkohol = az anyák egyszer (24 órán át), nagy dózisban fogyasztottak alkoholt, **p<0,01. A plazmában a kontroll csoporthoz képest (4,96±0,39 pg/ml), csak a 21 napig, kis dózisban (3 % alkohol) fogyasztott alkohol hatására emelkedik meg szignifikánsan (p<0,01) az utódokban a nocisztatinszint (9,3±2,54 pg/ml) (22. ábra). A nagy dózisban

58

kapott egyszeri, 24 órás alkoholfogyasztás, nem eredményezett jelentősebb változást az utódok plazma nocisztatinszintjében (4,96±0,39 pg/ml vs. 5,71±1,71 pg/ml).

plazma nocisztatinszint (pg/ml ± SD)

16

kontroll

**

3% alkohol, hoszú távon

12

15% alkohol, rövid távon

8

4

0

K

3% alkohol 15% alkohol

22. ábra: A plazma nocisztatinszintjének változása a szoptatás alatt alkoholt fogyasztott anyák három hónapos utódaiban (pg/ml±SD); K = kontroll; 3 % alkohol = az anyák hosszabb távon (21 napig), kis dózisban fogyasztottak alkoholt; 15 % alkohol = az anyák egyszer (24 órán át), nagy dózisban fogyasztottak alkoholt, **p<0,01.

59

4.3

4.3.1

NOP RECEPTOR IMPRINTING

Újszülöttkori nociceptin, illetve nocisztatin kezelés

Az újszülöttkori nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatását a szerotonerg és dopaminerg rendszerre a liquorban és az egyes agyrészletekben (hypothalamus, agytörzs, hippocampus, striatum, frontális cortex) vizsgáltuk. A hypothalamusban eredményeink azt mutatják, hogy mind a hím, mind pedig a nőstény állatokban az újszülöttkori (a születést követő 24 órában) 10 µg nociceptin, illetve 10 µg nocisztatin kezelés szignifikáns változásokat eredményez. Három hónappal a nociceptin kezelést követően, mindkét nemben, szignifikánsan magasabb szerotonin és 5-HIAA-szintet mértünk. A nocisztatin kezelés a mennyiségi meghatározás alsó határa (LOQ (szerotonin) = 0,67 ng/ml) alá csökkentette a szerotoninszintet,

és

szignifikánsan

megemelte

az

5-HIAA-szinteket.

A

hypothalamusban a nociceptin kezelés nem okozott szignifikáns változást a dopaminszintben, viszont nocisztatin kezelés hatására a dopamin értékek mindkét nemben szignifikáns csökkenést mutattak. A HVA-szintekben nem mutatkozott jelentősebb változás (7. és 8. táblázat). Az agytörzsben a nociceptin kezelést követően nem, csak a nocisztatin kezelés következtében alakult ki szignifikáns változás mind a dopaminerg, mind pedig a szerotonerg rendszerben. A nociceptin kezelés a HVA-szintek szignifikáns emelkedését okozta, a két vizsgált biogén aminra (dopamin, szerotonin) és a szerotonin metabolitjára az 5-HIAA-ra nem volt jelentős hatással. A nocisztatin kezelés következtében mindkét nemben a mennyiségi meghatározás alsó határa (LOQ (szerotonin) = 0,67 ng/ml; LOQ (dopamin) = 0,8 ng/ml) alá csökkent a dopamin- és a szerotoninszint, míg a HVA értékek szignifikáns emelkedést mutattak. A 5-HIAA-szintekben nem mutatkozott jelentősebb változás. (9. és 10. táblázat).

60

A hippocampusban a nociceptin, illetve a nocisztatin kezelés csak a szerotonerg rendszerben fejtett ki jelentősebb változást, mindkét nemben megemelkedett a szerotonin metabolit 5-HIAA-szint. Nociceptin kezelés hatására sem a hím, sem pedig a nőstény állatokban nem változott a szerotoninszint, míg a nocisztatin kezelés hatására a kimutathatósági határ alá csökkent. Nocisztatin kezelés hatására a dopaminszint is a mennyiségi meghatározás alsó határa alá csökkent mind a hím, mind pedig a nőstény egyedekben (11. és 12. táblázat). A striatumban a nociceptin csak az 5-HIAA-szintet befolyásolta, szignifikánsan megemelve azt mindkét nemben. A nocisztatin kezelés a mennyiségi meghatározás alsó határa alá csökkentette a szerotoninszintet, és szignifikánsan megemelte a metabolit 5HIAA-ét. A dopaminszint szignifikáns csökkenést mutatott mindkét nemben. A nőstény állatokban jelentős HVA-szint emelkedés volt megfigyelhető (13. és 14. táblázat). A frontális cortexben mindkét nemben szignifikáns 5-HIAA-szint csökkenést mértünk mind nociceptin, mind pedig nocisztatin kezelés hatására. A nociceptin kezelés következtében a szerotoninszint csökkenést mutatott a hím egyedekben, míg a nocisztatin kezelés a mennyiségi meghatározás alsó határa alá csökkentette azt. A nociceptin kezelés nem hatott a dopaminerg anyagcserére. Nocisztatin kezelés hatására csak a nőstény állatokban csökkent a mennyiségi meghatározás alsó határa alá a dopaminszint (15. és 16. táblázat). A liquorban a nocisztatin kezelés eredményezett változást és csak a hím egyedekben, minek eredményeképpen szignifikánsan csökkent a két metabolit a HVA- és 5-HIAAszintje (17. és 18. táblázat).

61

7. táblázat: A hypothalamus biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására hím Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. n.sz. = nem szignifikáns, n.e. = nem értelmezhető. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

DA

270,9±55,4

251,3±35,4

n.sz.

37,4±3,9

0,001

HVA

63,8±14,7

75,8±14,9

n.sz.

67,4±6,9

n.sz.

5-HT

64,1±29,7

182,8±75,7

0,01


n.e.

5-HIAA

155,7±17,3

801,2±171,6

0,001

693,1±81,6

0,000001

8. táblázat: A hypothalamus biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására nőstény Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

217,7±77,7

225,3±52,7

n.sz.

34,3±3,2

0,005

HVA

63,6±8,5

61,4±7,4

n.sz.

65±10,5

n.sz.

5-HT

75,9±36,9

141,8±51,7

0,02


n.e.

5-HIAA

277,7±106

787,6±126.7

0,00001

616,4±94,1

0,0007

DA

62

9. táblázat: A agytörzs biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve kezelés hatására hím Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. n.sz. = nem szignifikáns, n.e. = nem értelmezhető. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

138,3±45,8

100,9±20

n.sz.


n.e.

HVA

50,9±3,2

69,2±11,2

0,01

68,1

0,005

5-HT

389,2±71,2

340,2±76,8

n.sz.


n.e.

n.sz.

1040,4±203,7

n.sz.

DA

5-HIAA

1081,6±179,4 1302,1±150,4

10. táblázat: A agytörzs biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására nőstény Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

DA

125±40,3

90,2±53,3

n.sz.


n.e.

HVA

47,6±1,1

140,3±72,5

0,01

73,6±10,4

0,005

5-HT

239±37,5

258,2±79,5

n.sz.


n.e.

n.sz.

1099,9±140

n.sz.

5-HIAA

1061,6±215,6 1214,3±325,7

63

11. táblázat: A hippocampus biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására hím Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. n.sz. = nem szignifikáns, n.e. = nem értelmezhető. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

DA

36,7±8,2

46±19,2

n.sz.


n.e.

HVA

62,2±17,2

47,1±4,1

n.sz.

58,2±20

n.sz.

5-HT

36,65±9,06

34,81±9,73

n.sz.


n.e.

87,6±29

307,9±28,7

0,000002

345,5±48,5

0,0000005

5-HIAA

12. táblázat: A hippocampus biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására nőstény Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

DA

52±14,2

45,3±13,5

n.sz.


n.e.

HVA

43,1±9

45,9±2

n.sz.

58,2±20

n.sz.

5-HT

36, 78±10,1

35,113±9,2

n.sz.


n.e.

5-HIAA

110,6±22,5

338,2±47

0,0000005

345,5±48,5

0,0006

64

13. táblázat: A striatum biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására hím Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. n.sz. = nem szignifikáns, n.e. = nem értelmezhető. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

DA

5068,9±1181

5540,1±680,9

n.sz.

235,3±127,7

0,0007

HVA

1133,7±135,9 1059,3±122,7

n.sz.

1175,8±163,9

n.sz.

5-HT 5-HIAA

182,7±53,4

191,7±47,8

n.sz.


n.e.

192±69

430±66,7

0,0005

351,8±87,3

0,005

14. táblázat: A striatum biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására nőstény Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

5344±1151

4992,7±1231,9

n.sz.

315,6±179,8

0,0005

HVA

1110,4±112,7

1089,2±118,1

n.sz.

1353±128,7

0,01

5-HT

202,1±47,2

169,9±27,7

n.sz.


n.e.

5-HIAA

187,9±72,2

469,5±83,7

0,00009

307,4±36

0,01

DA

65

15. táblázat: A frontális cortex biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására hím Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. n.sz. = nem szignifikáns, n.e. = nem értelmezhető. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

DA

40,3±6,6

54,2±38,4

n.sz.

24,5

n.sz.

HVA

56,8±16,1

103,3±54,6

n.sz.

58,1±18.4

n.sz.

5-HT

126,5±43,8

70,4±16

0,05


n.e.

5-HIAA

457,3±46,1

312,5±50

0,001

330,2±40,2

0,001

16. táblázat: A frontális cortex biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására nőstény Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

DA

31,2±7,2

30,5±6,9

n.sz.


n.e.

HVA

53,1±17,5

45,5±4,3

n.sz.

56,7±23,9

n.sz.

5-HT

124,1±25,6

92,8±38,5

n.sz.


n.e.

5-HIAA

509,7±58,3

346,6±53,3

0,0009

328,7±64,6

0,001

66

17. táblázat: A liquor biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására hím Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. n.sz. = nem szignifikáns, n.e. = nem értelmezhető. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

5,286±1,87

6,49±3,47

n.sz.

5,65±6,1

n.sz.

HVA

26,7±3,5

24±3,7

n.sz.

18,3±0,4

0,005

5-HT

17±9,2

22,8±11,4

n.sz.

9±2,1

n.sz.

164±36,4

159±32,7

n.sz.

98,9±18,2

0,01

DA

5-HIAA

18. táblázat: A liquor biogén amin tartalmának változása kontroll, újszülöttkori 10 µg nociceptin, illetve nocisztatin kezelés hatására nőstény Wistar patkányokban (ng/ml±SD), n (kontroll) = 5, n (NC) = 5, n (NS) = 5. Kontroll

NC

Szignifikancia

NS

(p)

Szignifikancia (p)

4,98±1,67

5,78±2,1

n.sz.

5,2±7,14

n.e.

HVA

29,9±13

23±5,5

n.sz.

19,1±1,9

n.sz.

5-HT

16,8±9,5

28,5±15,8

n.sz.

23,3±14,5

n.sz.

5-HIAA

106,3±51

115,8±40,9

n.sz.

99,8±10,4

n.sz.

DA

67

4.3.2

β-endorfin kezelés

A vemhesség 19. napján, i.m. egyszeri dózis, 10 µg β-endorfinnal kezelt Wistar patkányok öt hónapos hím utódaiban a szerotoninszint a vizsgált agyrészletek (frontális cortex, hippocampus, hypothalamus, agytörzs) mindegyikében szignifikánsan csökkent (19. táblázat). A szerotonin metabolitjának az 5-HIAA-nak a szintje, a hippocampus kivételével azonban minden vizsgált agyrészletben szignifikáns emelkedett. Az 5-HIAA/5-HT arány minden vizsgált agyrészletben szignifikáns csökkenést mutatott. A β-endorfin kezelés ugyanakkor az utódok plazma nocisztatinszintjének igen jelentős (p<0,0028) emelkedését okozta (1,525±0,049 pg/ml vs. 2,168±1,168 pg/ml) (23. ábra). A kontroll és a β-endorfinnal megkezelt állatok között nem tapasztaltunk eltérést sem az utódok számában, sem pedig a 21 napos vemhességi időintervallumot tekintve.

68

19. táblázat: Különböző agyrészletek szerotonin és 5-hidroxi-indolecetsav-szint változása a vemhesség 19. napján i.m. 10 µg β-endorfinnal kezelt nőstény patkányok öt hónapos hím utódaiban (ng/mg nedves szövet±SD).

Agyrészlet

Állatok

5-HT (ng/mg

p

5-HIAA

nedves

(ng/mg

szövet±SD)

nedves

p

5-HIAA/

p

5-HT

szövet±SD)

Frontális

kontroll

cortex

n=10 β-endorfin

0,0733±0,031

0,001

0,0216±0,007

0,567±0,17

0,0056

0,806±0,20

8,8±3,84

0,00006

41,06±16,55

n=10 Hippocampus

kontroll

0,0521±0,024

0,0022

0,425±0,16

0,492

8,87±3,17

0,0026

n=10 β-endorfin

0,0226±0,009

0,475±0,18

23,13±11,91

n=10 Hypothalamus

kontroll

0,161±0,065

0,0004

0,915±0,19

0,0019

6,47±2,58

0,0002

n=10 β-endorfin

0,058±0,043

1,255±0,27

30,07±15,39

n=10 Agytörzs

kontroll

0,171±0,065

0,0002

1,107±0,21

0,0001

7,04±2,04

n=10 β-endorfin

0,071±0,034

1,498±0,19

n=10

69

22,48±12,21

0,0052

plazma nocisztatinszint (pg/ml ± SD)

3

*** 2,5

kontroll β-endorfin

2

1,5

1

0,5

0

K

I

23. ábra: A plazma nocisztatinszintjének változása a vemhesség 19. napján i.m. 10 µg β-endorfinnal kezelt, nőstény Wistar patkányok, öt hónapos hím utódaiban (pg/ml±SD). K = kontroll csoport; I = β-endorfin kezelt csoport, ***p<0,0028; n=10.

70

4.4

4.4.1

A NOCICEPTIN ÉS AZ ACETILKOLINERG RENDSZER

Biszpiridinium-aldoxim (K-27) meghatározása validált HPLC-EC módszerrel

Kísérleteinkben vizsgálni kívántuk egy újonnan kifejlesztett acetilkolin-észteráz (AChÉ) reaktivátor vegyület KIR-be való bejutását és a vegyület esetleges hatását a KIR-i dopamin-, és szerotonin anyagcserére. Ehhez első lépésként a vegyület biológiai közegből történő meghatározására validált módszert kellett kidolgoznunk. A vegyület kémiai szerkezete a 24. ábrán látható.

O

H2N

-

Br

+

N

-

Br

+

N

NOH

24. ábra: A K-27 ([1-(4-hidroximino-metil-piridinium)-3-(4-karbamoilpiridinium) propán dibromid]; C15H18O2N4Br2; M=446,16) kémiai szerkezete.

Validálás A szérum, a liquor és a vizelet minták előkészítése a 3.3.2. mintaelőkészítés fejezetben leírtak szerint történt. A 0,8 M-os PCA-ban oldott K-27 törzsoldatból (10 μg/ml) felvett 7 pontos kalibrációs sorozat (mindegyik koncentrációhoz három párhuzamos mérést végeztünk) 5-200 ng/ml koncentrációtartományban linearitást mutatott. A regressziós egyenes paraméterei a következőnek adódtak: y=165661x-70858, a korrelációs koefficiens értéke pedig

71

R2=0,9985 volt. A K-27 oldat egy napon belüli stabilitása megfelelőnek bizonyult (100±5 % SD). A mennyiségi meghatározás alsó határa (LOQ) 10 ng/ml. A

kontroll

állatok

(fiziológiás

sóoldattal

kezelt

hím

Wistar

patkányok)

agyhomogenizátumának felülúszójából felvett K-27 kalibrációs egyenes 5-200 ng/ml koncentrációtartományban ugyancsak lineárisnak mutatkozott. A regresszós analízis eredménye: y=136641x-1529392, a korrellációs koefficiens értéke pedig R2=0,9902 volt. Az International Conference on Harmonization (ICH) Topic Q2B számítások szerint a módszer egy napon belüli és napok közötti pontosság és torzítatlanság értékei elfogadhatónak bizonyultak a vizsgált koncentráció tartományban (100±5 % SD). Kromatográfiás rendszer A

kromatográfiás

rendszer

optimalizálása

során

változtattam

a

különböző

paramétereket. Az eluensben az acetonitril részarányának változtatása során megállapítottam, hogy az acetonitril

mennyiségének

növelésével

csökken,

míg

csökkentésével

nő

az

elválasztandó anyagok retenciós ideje. A 950 ml foszfátpuffer-75 ml acetonitril elegy a rendszer szempontjából optimálisnak mondható, ugyanis csak ezen acetonitril-víz elegy mellett válnak el optimálisan egymástól a biogén aminok és a K-27 csúcs. A megfelelő cellaáram kiválasztásához különböző potenciálokon (Eox = 0,3-0,8 V) mértem az elválasztás hatékonyságát. Alacsonyabb cellaáramokon a jel/zaj arány nem volt megfelelő, illetve nem mindegyik meghatározni kívánt biogén amin adott jelet. Az optimális cellaáram 0,65 V-nak bizonyult. A pH megváltoztatására reagált a legkevésbé érzékenyen a kromatográfiás rendszer, a pH csökkentésével csökkent, míg növelésével nőtt a vegyületek retenciós ideje. A mérés szemponjából optimálisnak a 3,7-es pH mondható. Az optimalizált rendszer részletes leírása a 3.3.2.-es fejezetben olvasható.

72

K-27 kezelés Az i.m. 49,5 μmol (22,12 mg) K-27-tel kezelt patkányok agyhomogenizátumának kromatogramján látható, hogy a K-27 jól elválasztható és jól azonosítható csúcsot ad a mintában lévő egyéb komponensek (szerotonin, dopamin, homovanillinsav, 5-hidroxiindolecetsav) mellett az alkalmazott kromatográfiás rendszeren belül (25. ábra). A K27 retenciós ideje 11,9 perc. Eredményeink azt mutatják, hogy az i.m. 49,5 μmol K-27-tel kezelt állatok szérumában a K-27 koncentrációja 60 perccel a kezelést követően 44,29±6,26 µg/ml koncentráció értéket ér el (26. ábra). Az agyhomogenizátum mintákban 2506±217 ng/mg nedves szövet K-27 koncentráció értéket mértünk 60 perccel az i.m. K-27 kezelést követően, mely az aktuális szérum koncentráció 6 %-ának felel meg. A K-27 AChÉ reaktivátor vegyület a liquorban is megjelenik 1439±187 ng/ml koncentrációban, mely az aktuális szérum koncentráció 3 %-a (27. ábra). A vizeletben mért mennyiség 2966±1176 μg/mlnek adódott 60 perccel az i.m. K-27 kezelést követően (28. ábra).

73

A

B

25. ábra: A. ábra: Kontroll patkány agyhomogenizátum B. ábra: i.m. 49,5 μmol K-27-tel kezelt patkány agyhomogenizátum. A jelöletlen csúcsok által reprezentált anyagokat/komponenseket nem azonosítottuk.

74

26. ábra: A kromatogram a szérum K-27 koncentrációját mutatja 60 perccel az i.m. kezelést követően. A K-27 acetilkolin-észteráz reaktivátor retenciós ideje 11,9 perc. A jelöletlen csúcsok által reprezentált anyagokat/komponenseket nem azonosítottuk.

27. ábra: A kromatogram a liquor K-27 koncentrációját mutatja 60 perccel az i.m. kezelést követően. A K-27 acetilkolin-észteráz reaktivátor retenciós ideje 11,9 perc. A kromatogramon a K-27 jól elválasztható csúcsot ad az 5-HIAA-tól. A jelöletlen csúcsok által reprezentált anyagokat/komponenseket nem azonosítottuk.

75

28. ábra: A kromatogram a vizelet K-27 koncentrációját mutatja 60 perccel az i.m. kezelést követően. A K-27 acetilkolin-észteráz reaktivátor retenciós ideje 11,9 perc. A jelöletlen csúcsok által reprezentált anyagokat/komponenseket nem azonosítottuk.

4.4.2

K-27 hatása az agyi biogén amin szintekre

Az i.m. adott 49,5 μmol K-27, 60 perccel a kezelést követően, szignifikánsan nem változtatta meg sem a dopamin, sem a szerotonin, sem pedig metabolitjaiknak a homovanillinsavnak és az 5-hidroxi-indolecetsavnak a szintjét az agyhomogenizátum mintákban (20. táblázat).

76

20. táblázat: K-27-tel kezelt állatok biogén amin szintjének változása patkányok agyhomogenizátumában (ng/ml±SD). Kontroll = oldószerrel kezelt csoport, K-27 = i.m. 49,5 μmol K-27-tel kezelt csoport.

DA HVA 5-HT 5-HIAA

Kontroll (ng/ml±SD)

K-27 (ng/ml±SD)

Szignifikancia (p)

786,166±29,62

805,655±53,67

0,21

n=5

n=5

81,789±16,1

70,521±7,34

n=5

n=5

674,506±118,04

627,788±25,28

n=5

n=5

455,553±409,95

517,108±14,89

n=5

n=5

77

0,5 0,43 0,28

4.5

PLAZMA

NOCICEPTIN-

ÉS

SZEROTONINSZINTEK

VÁLTOZÁSA

ISCHÉMIÁS BETEGEKBEN

Kísérleteinkben

vizsgáltuk,

hogy

akut

ischémiás

stroke

betegek

plazma

nociceptinszintje mutat-e eltérést a korban és nemben illesztett kontroll személyekéhez hasonlítva, illetve hogy a nociceptinnek az állatkísérletekben kimutatott KIR-i szerotoninkiáramlást

csökkentő

hatása

kimutatható-e

ezen

betegek

plazma

szerotoninszintjének változásában is. A kísérletben vizsgált személyek demográfiai adatait a 21. táblázat foglalja össze. 21. táblázat: A vizsgált személyek demográfiai adatai. Jellemzők

N (személyek száma )

KONTROLL Összesen

36

Életkor (év±SD)

65,6 ± 13,7

Akinek volt már stroke-ja, de jelenleg akut történése nincs (K1) Összesen

13

Életkor (év±SD)

71,7 ± 11,5

Semmiféle agyi érbetegsége nincs és nem is volt (K0) Összesen

23

Életkor (év±SD)

62,3 ± 13,8

ISCHÉMIÁS BETEGEK Összesen

32

Életkor (év±SD)

73,5 ± 10,1

Carotis területi keringészavar (C) Összesen

14

Életkor (év±SD)

76,5 ± 13,1

Lacunaris területi keringészavar (L) Összesen

12

Életkor (év±SD)

71,8 ± 9,9

Transiens ischémiás attack (TIA) Összesen

6

Életkor (év±SD)

68,67 ± 8,9

78

A kontroll személyek plazma nociceptinszintje a K1 csoportban (akinek volt már stroke-ja, de jelenleg akut történése nincs) 10,1±1,56 pg/ml, a K0 csoportban (akinek semmiféle agyi érbetegsége nincs és nem is volt) 9,9±1,75 pg/ml-nek adódott. Miután szignifikáns különbség nincs a két érték között, a továbbiakban a két csoport mérési eredményeit egyesítve alkalmaztuk az ischémiás betegekkel való összehasonlítás során. Az ischémiás betegek plazma nociceptin értéke 17,37±3,3 pg/ml-nek adódott, mely p<0,01 szinten szignifikánsan magasabb a kontroll értéknél. A vizsgált ischémiás betegek csoportok szerinti értékei az alábbiaknak adódtak: carotis területi keringészavarban 17,12±4,5 pg/ml; lacunaris területi keringészavarban 18,09±2,8 pg/ml, TIA esetén 16,9±2,6; mely értékek között szignifikáns eltérés nincs,

plazma nociceptinszint (pg/ml±SD)

ezért a 29. ábrán az összesített adatokat ábrázoltuk.

25

**

kontroll ischémiás betegek

20

15

10

5

0

29. ábra: Plazma nociceptinszint alakulása kontroll személyekben és akut ischémiás betegekben (pg/ml±SD), p<0,01. A kontroll csoportot 36 személy alkotta: 13 korábbi stroke-ból felépült és 23 olyan személy, akiknek semmiféle agyi érbetegsége sem korábban, sem aktuálisan nem volt. Az ischémiás csoportban 26 beteg adatai szerepelnek (14 carotis-, 12 lacunaris területet érintő keringészavar és 6 TIA), **p<0,01. A kontroll személyek plazma szerotonin értéke a K1 csoportban 45,67±20,10 pg/ml, és a K0 csoportban 48,90±24,18 pg/ml értéket mutatott, melyek között szignifikáns különbség nincs. Az ischémiás betegek összesített plazma 5HT értéke 44,2±14,0 pg/ml, mely csoportonként az alábbiak szerint alakult: carotis területi keringészavarban

79

52,15±26,65 pg/ml, lacunaris területi keringészavar esetén 38,21±8,81 pg/ml és a TIA betegekben 42,24±6,64 pg/ml. Sem a beteg csoportok külön-külön összehasonlítva a kontroll értékkel, sem a betegek csoportjai egymáshoz viszonyítva szignifikáns különbséget nem mutatnak, bár a lacunaris területi keringészavar és a TIA csoport betegei alacsonyabb értékkel jellemezhetők (30. ábra).

plazma szerotoninszint (pg/ml±SD)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

C

TIA

L

K1

K0

30. ábra: Plazma szerotoninszint akut stroke betegekben (pg/ml±SD). A K1 csoportot azok a kontroll személyek alkották (n=13), akik korábbi stroke betegségükből teljesen felépültek, a K0 csoportba azokat a kontroll személyeket soroltuk (n=23), akiknek semmiféle agyi érbetegsége sem korábban, sem aktuálisan nem volt. A carotis területet érintő stroke betegek száma (C) n=14, a lacunaris területet érintő stroke betegek száma (L) n=12 és a transiens ischémiás attack (TIA) betegek száma n=6. A plazma 5-HIAA-szinteket tekintve a K1 csoportban 50,18±13,33 pg/ml, a K0 csoportban 38,92±14,96 pg/ml értékeket mértünk, melyek p=0,1 szinten különböznek egymástól. A betegek összesített plazma 5-HIAA értéke 46,02±14,11 pg/ml-nek adódott, mely a K0 értéktől szignifikánsan nem különbözik. A carotis területi keringészavarban szenvedők értéke 54,88±16,41 pg/ml, mely a K0 értéktől szignifikánsan (p<0,01) magasabb. A TIA-csoport plazma 5-HIAA értéke 32,58±14,81 pg/ml-nek adódott, mely nem különbözik a K0 értékétől, míg a lacunaris keringészavarban szenvedők csoportjában 50,61±11,12 pg/ml értéket mértünk, mely a K0 csoport értékétől szignifikánsan (p<0,01) magasabb (31. ábra). Az egyes beteg csoportok összehasonlítása során azt találtuk, hogy a TIA csoport mind a carotis területi, mind a lacunaris területi keringészavarban szenvedők értékeitől szignifikánsan (p<0,01) alacsonyabb.

80

plazma 5-HIAA-szint (pg/ml±SD)

80 70

*

60

§ #

50 40 30 20 10 0

C

TIA

L

K1

K0

31. ábra: Plazma 5-HIAA-szint ischémiás betegekben (pg/ml±SD); *p<0,01 a K0 (azok a kontroll személyek, akiknek semmiféle agyi érbetegsége sem korábban, sem aktuálisan nem volt, n=23) csoporthoz viszonyítva; #p<0,01 a C (carotis területet érintő stroke betegek, n=14) és az L (lacunaris területet érintő stroke betegek, n=12) csoporthoz viszonyítva; §p<0,01 a K0 csoporthoz viszonyítva.

81

5

5.1

MEGBESZÉLÉS

A

NOCICEPTINERG

ÉS

A

HISZTAMINERG

RENDSZER

KAPCSOLATÁNAK VIZSGÁLATA

Mivel a nociceptin és hisztamin kapcsolatára vonatkozóan ellentmondásosak az irodalmi adatok, egyes esetekben a nociceptinnek hisztamin felszabadító [50, 54], más vizsgálatokban pedig hisztamin felszabadulást gátló hatását [34, 53] igazolták, ezért vizsgálni kívántuk, hogy az exogén (i.c.v.) alkalmazott nociceptin, vajon hogyan hat a hisztamin felszabadulására a KIR-ben. Az irodalmi adatokat figyelembe véve, vizsgálatainkban a nociceptint 5,5 nmol/állat közepes dózisban alkalmaztuk [54, 68]. Eredményeink szerint az i.c.v. adott 5,5 nmol/állat nociceptin, patkány KIR-ben a liquorban és az egyes agyrészletekben, szignifikánsan megemeli a hisztaminszintet. A továbbiakban a nociceptin által felszabadított hisztamin hízósejtes, illetve neuronális eredetét tanulmányoztuk. Ennek megfelelően a nociceptin hatásának elemzését a hízósejteket degranuláló compound 48/80, a hízósejtek membránját stabilizáló cromolyn és a fájdalomérzés szabályozásban fontos szerepet játszó neuropeptid SP hatásával vetettük össze. Mivel a hízósejtekből a hisztamin a szerotoninnal együtt szabadul fel, ezért a hisztamin mellett a szerotoninszintek változását is figyelemmel kísértük. A nociceptin által felszabadított hisztamin hízósejtes, illetve neuronális eredetének tisztázása érdekében megvizsgáltuk, hogy a hízósejtekben gazdag hypotalamusban a hízósejtekben szegény hippocampusban, valamint a hízósejteket nem tartalmazó frontális cortexben (negatív kontroll) [104, 105], hogyan változik a hisztaminszint. Eredményeink azt mutatják, hogy a nociceptin a liquorban szignifikáns hisztaminszint emelkedést okoz, míg a szerotoninszintet csökkenti. A liquorban a nociceptin hisztamin felszabadító hatásának maximumát 120 percnél mértük, ezért az agyrészletekben és a plazmában is a hisztamin- és szerotoninszintek változását a nociceptin beadását

82

követően 120 percnél néztük. Mivel a plazmában a nociceptin nem okoz jelentős hisztamin- és szerotoninszint változást, ezért elmondhatjuk, hogy hatása csak a KIR-ben érvényesül, azaz nem jut át a vér-agy gáton, és nincs hatással a perifériás hisztamin- és szerotoninszintekre. Az agyrészletek közül a nociceptin kezelés a hízósejtekben és neuronokban gazdag hypothalamusban, valamint a hízósejtekben szegény, de hisztaminerg neuronokban gazdag hippocampusban emelte meg jelentős mértékben a hisztaminszintet. A frontális cortexben hisztaminszint emelő hatást nem mutatott. A

hypothalamusban,

a

hízósejt

membránstabilizáló

cromolyn

előkezelés

eredményeképpen, jelentősen csökkent a nociceptin által megemelt hisztaminszint, de nem érte el a kontroll értéket. Ebből következik, hogy a nociceptin a hízósejtekből, de ugyanakkor a hisztaminerg neuronokból is képes hisztamint felszabadítani. Ezt megerősítik a hippocampusra kapott eredményeink, miszerint a szignifikáns hisztaminszint emelkedést a cromolyn előkezelés jelentősen nem csökkentette, tehát a nociceptin a hízósejtek mellet a neuronokból is szabadít fel hisztamint. A compound 48/80 vegyület önmagában, 60 perc múlva mind a liquorban, mind pedig a hízósejtekben gazdag hypothalamusban megemelte a hisztaminszintet. A frontális cortexben és a hippocampusban nem tapasztaltunk jelentős változást. A cromolynnal, mint hízósejt stabilizáló vegyülettel történő előkezelés, mind a liquorban, mind pedig a hypothalamusban kivédte a compound 48/80 által kiváltott jelentős mértékű hisztaminszint emelkedést, ami a compound 48/80 kiváltotta hisztamin kiáramlás hízósejtes eredetét bizonyítja. A compound 48/80 azonban nem csak a KIR-ben, a plazmában is szignifikánsan megemelte a hisztaminszintet. Ez arra enged következtetni, hogy a compound 48/80 a nociceptinnel ellentétben, a beadását követően 60 perc után, képes átjutni a vér-agy gáton (ahol hiányos vagy nincsen vér-agy gát), illetve növeli annak átjárhatóságát.

Az i.c.v. adott SP a liquorban, a hypothalamusban és a frontális cortexben okozott szignifikáns hisztaminszint emelkedést, míg a plazmában a nociceptinhez hasonlóan, nem volt hatással a hisztaminszintekre. A SP 120 percnél mért KIR-i hisztaminszintet emelő hatását tapasztaltuk a legerőteljesebbnek.

83

A SP hisztamin felszabadító hatása a liquorban cromolyn előkezeléssel gátolható volt, míg a szerotoninszintekben nem okozott szignifikáns változást. A hízósejtekben gazdag hypothalamusban szignifikánsan megemelte a hisztaminszintet, ugyanakkor a hízósejteket

nem tartalmazó

frontális

cortexben is szignifikánsan

magasabb

hisztaminszintet eredményezett, ami azt bizonyítja, hogy neuronális hisztaminfelszabadító hatással (is) rendelkezik.

A nociceptin és a compound 48/80 kombinált kezelés, amikor a nociceptint a compound 48/80 után 60 perccel adtuk, a hypothalamusban és a hippocampusban okozott szignifikáns hisztaminszint emelkedést, míg a liquorban és a frontális cortexben nem változott a hisztaminszint. A hypothalamusban és a hippocampusban tapasztalt nagyobb hisztaminszint emelkedés utal a neuronális eredetre, hiszen a kombinált (NC+48/80) kezelés az önmagában adott 48/80-hoz képest, szignifikánsan megemelte a hisztaminszintet. Ez ugyancsak azt bizonyítja, hogy a nociceptinnek neuronális hisztamin felszabadító hatása (is) van.

Megállapíthatjuk tehát, hogy mind a nociceptin, mind a compound 48/80, mind pedig a SP fokozza a KIR-i hisztamin-kiáramlást, azonban hatásuk a hízósejtes és a neuronális hisztamin vonatkozásában eltérő. Kísérletes eredményeink továbbá azt is igazolják, hogy az i.c.v. adott nociceptin és SP hatása csak a KIR-ben érvényesül, míg a compound 48/80 a perifériás hisztamin- és szerotoninszintekre is hatással van.

Míg a nociceptin fokozza mind a hízósejtekből, mind pedig a neuronálisan jelenlévő hisztamin kiáramlását, a KIR-i szerotoninszintet szignifikánsan csökkenti, vagyis a szerotonerg rendszeren gátló hatása érvényesül, amely összhangban áll az irodalmi adatokkal [26, 67, 69, 70, 71].

A nociceptin és a hisztamin szerepe a fájdalommal és gyulladással járó folyamatokban többszörösen igazolt. A hisztaminerg rendszernek fontos szerepet tulajdonítanak a fájdalomérzés kialakulásának mechanizmusában, a megemelkedett endogén agyi

84

hisztaminszintnek pedig jelentős szerepe van a fájdalomcsillapításban [39, 40, 41]. A nociceptin szerepe a fájdalom percepciójában ugyancsak többszörösen igazolt, szupraspinálisan antiopioid peptidként viselkedik [13] hyperalgesiát és [13, 56, 57] allodyniát [58, 69, 61] okoz, míg gerincvelői szinten az opioidokhoz hasonlóan antinociceptív hatását figyelték meg [61, 62, 63]. Miután ismert, hogy a hisztamin a KIR-ben a fájdalom mechanizmusának kialakulásában jelentős szereppel bír és kísérleteinkben a nociceptin hisztamin felszabadító hatását igazoltuk, feltételezzük, hogy a nociceptin a hisztamin fájdalomcsillapításban betöltött hatását esetlegesen támogatni/fokozni képes. A nociceptin különbözőképpen hat a gyulladással járó folyamatokban, egyes esetekben serkent (lokális gyulladásos folyamatok) [54], máskor pedig gátló hatást fejt ki [53, 106]. Németh és mtsai denervált patkány hátsólábon az i.p. adott nociceptin gyulladásgátló hatását igazolták [106]. Ugyanezen kutatócsoport továbbá kimutatta azt is, hogy izolált tracheán a nociceptin gátolja a bradikinin és kapszaicin által indukált SP, CGRP és szomatosztatin felszabadulást és így gyulladásgátló hatását közvetett módon, ezen neuropeptidek felszabadulásának szabályozása által fejti ki [54]. Az irodalomban több kísérletes adat is azt igazolja, hogy a nociceptin közvetlen [54, 65, 66], és közvetett [50, 53] hisztamin felszabadító hatással is rendelkezik. Mérési eredményeink alapján a nociceptin nem-közvetlen hisztamin felszabadító hatása sem zárható ki.

85

5.2

ENDOGÉN NOCICEPTIN- ÉS NOCISZTATINSZINTEK VIZSGÁLATA ÁLLATMODELLEKEN

5.2.1

Neuropátiás fájdalom modell (krónikus diabétesz)

A neuropátiás fájdalom metabolikus modelljeként, a Streptozotocin indukálta krónikus diabétesz modellt elsőként Courteix és kutatócsoportja alkalmazta [99]. Az irodalomban számos kísérletes adat azt bizonyítja, hogy mind a nociceptinnek [13, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 107, 108, 109], mind pedig a nocisztatinnak [110, 111, 112] kiemelt jelentősége van a neuropátiás fájdalomban. A

nociceptin

szerepe

a

fájdalommal

járó

folyamatokban

nem

tisztázott.

Szupraspinálisan anti-opioid hatását mutatták ki [13], hyperalgesiás és [13, 56, 57] allodyniás [58, 59] hatását igazolták. Az i.c.v adott nociceptin gátolja a stressz, illetve az opioidok által előidézett analgetikus hatásokat [60], míg i.t. az opioidokhoz hasonlóan analgetikus hatású [61, 62], gátolja a carageen által indukált termális hyperalgesiát patkány hátsólábon [61].

Az i.t. adott nociceptin (0,1-10 nmol) diabéteszes egereken tail-flick és formalinindukálta nocicepció teszten antinociceptív hatású, és antinociceptív hatása sokkal erőteljesebb a diabéteszes állatokon, mint a kontroll csoportban [107]. Megállapítást nyert továbbá az is, hogy a nociceptin i.t. (0,1-10 µg/állat) adva csökkenti a mechanikai hyperalgesiát (paw-pressure teszten), mely hatása naloxonnal gátolható [108]. Ugyanezen kutatócsoport azt is kimutatta, hogy az i.t. adott nociceptin és az i.v. adott morfin kombinációja az analgetikus hatás erősödését eredményezi, vagyis a nociceptin és a morfin együttes alkalmazása szuperadditív módon gátolja a hyperalgesiát. Az i.t., illetve intraplantárisan (i.pl.) alkalmazott NOP receptor agonista Ro64-6198, neuropátiás fájdalom modellen anti allodyniás hatást mutatott [105]. Az Ro64-6198 antiallodyniás hatását a szelektív NOP receptor antagonista PhePsi és NPhe gátolni tudta, ami arra utal, hogy a nociceptin spinális és perifériás antinociceptív hatása NOP receptor által mediált. Mindezen kísérletes adatok arra engednek következtetni, hogy a

86

nociceptinnek mind a gerincvelőben, mind pedig perifériásan fontos szerepe lehet a krónikus neuropátás fajdalmak kezelésében.

Okuda-Ashitaka és mtsai ugyanakkor kontroll patkányokban az i.t. adott nociceptin allodyniás és hyperalgesiás hatását igazolták és megállapították, hogy a nociceptin ezen hatását a nocisztatin gátolni képes [110]. A nocisztatin nem kötődik a NOP receptorhoz, azonban nagy affinitást mutat az agy és a gerincvelő membránjához. A nocisztatin receptor és transzdukciós mechanizmusa eddig még nem ismert, az anti-nociceptin hatásért feltételezhetően a nocisztatin felettébb konzervatív karboxi-terminálja, a GluGln-Lys-Gln-Leu-Gln felelős [111]. A nocisztatinnak, mint a nociceptin funkcionális antagonistájának, tehát ugyancsak jelentős szerepe lehet a neuropátiás fájdalmak kezelésében. Az i.c.v. adott nocisztatin (0,5-50 pmol/állat) egerekben dózisfüggően antihyperalgesiás hatást mutatott a carrageenan/kaolin indukálta gyulladásos hyperalgesia teszten [112], míg az önmagában adott 50 pmol/állat nocisztatin a fájdalomküszöbre nem volt hatással.

A pentapeptid leu-enkefalin kontroll patkányokban a hasnyálmirígy inzulin- és glukagon szekréciójának szignifikáns emelkedését okozza [113], míg a diabéteszes állatokban nincs hatással e két hormon szekréciójára. A leu-enkefalin indukálta inzulin kiáramlás a muszkarin-receptor gátló atropinnal, az opiát-receptor antagonista naloxonnal, valamint az α2-receptor agonista yohimbinnel gátolható volt. A glukagon szekréciót a három vegyület közül egyedül a naloxon nem volt képes gátolni, ezért felvetődik a kérdés, hogy a nociceptinnek, vajon milyen szerepe lehet a glukagon hormon felszabadulásának szabályozásában. Jelen ismereteink szerint a nociceptin hatása a glukagon szekrécióra nem ismert, és pontos szerepe sem tisztázott a neuropátiás fájdalom mechanizmusában.

Miután

igazolt,

hogy

neuropátiás

fájdalomban

megemelkedik

a

gerincvelői

dinorfinszintje [114], ezért arra voltunk kiváncsiak vajon a krónikus diabétesz, milyen hatással van az endogén nociceptin- és nocisztatinszintekre.

87

A krónikus diabétesz nociceptinerg anyagcserére kifejtett hatásainak vizsgálata során megállapítottuk, hogy a krónikus diabétesz sem a KIR-i, sem pedig a perifériásan mérhető nociceptinszinteket nem befolyásolja, a nocisztatinszintek azonban mind a liquorban, mind pedig a plazmában a diabétesz előrehaladtával szignifikáns emelkedést mutattak. A neuropátiás fájdalom egy másik modelljén (partial sciatic nerve ligation model)

Joseph

és

mtsai

is

megerősítették

mind

a

nociceptin-,

mind

a

nocisztatinszintekben tapasztalt mérési eredményeinket [115]. Mivel a nocisztatin a nociceptin hyperalgesiás és allodyniás hatását is gátolni képes [110], ezért felvetődik további szerepének tisztázása a neuropátiás fájdalmak csillapításában. Ismert, hogy az agy opioidjainak termelése alapszinten független a fájdalomingertől, fájdalom hatására viszont azonnal hatnak pre-, illetve posztszinaptikus receptoraikon és mRNS-szintézisük azonnal megemelkedik. Gyakori fájdalominger (krónikus fájdalommal járó betegségekben) az endogén opioidok agyi szintjének fokozódását eredményezi. Ez megnyilvánulhat abban, hogy a fájdalomküszöb megemelkedik, és így a fájdalommal szemben nagyobb a tolerancia. Mivel esetünkben a nocisztatinnak, mint endogén fájdalomcsillapító molekulának a szintje ugyancsak szignifikánsan megemelkedett mind a liquorban, mind pedig a plazmában, elképzelhető, hogy szerepe lehet a krónikus fájdalmakban megfigyelhető fájdalommal szembeni nagyobb tolerancia kialakulásában, illetve a fájdalomküszöb emelkedésében.

5.2.2

Stressz modell

A nocisztatin és a szerotonin is mind a fájdalomérzékelésben, mind pedig a stressz kiváltotta válaszreakcióban bizonyítottan szerepet játszik. A nociceptinnek és a szerotonerg rendszernek egyaránt fontos szerepet tulajdonítanak az akut stresszre adott válasz endogén szabályozásában [29]. Jenck és mtsai igazolták, hogy a nociceptin részt vesz a stressz neuropeptidek (CRF, cholecystokinin, neuropeptid Y, SP) hatásáinak összehangolásában [30]. Kísérleteinkben

nőstény

patkányokat

elválasztáskor

2

napos

teljes

víz

és

tápmegvonásnak tettünk ki, mellyel az igen erős akut stresszhatást modelleztük [100].

88

Eredményeink szerint az alkalmazott stressz iránt az egyes vizsgált agyterületek különböző érzékenységet mutatnak. Az elválasztás kritikus időszakában alkalmazott stressz, mérési adataink alapján, a felnőttkori szerotonerg funkciókra is hatással van. A stresszhatásnak kitett nőstény állatokban szignifikánsan megemelkedett az 5-HIAAszint a striatumban, és csökkent a hypothalamusban, valamint az agytörzsben. Az 5-HIAA-szint csökkenése az agytörzsben és a hypothalamusban megállapítást nyert, hogy összefüggésben lehet a párzási időszak alatt megfigyelhető intenzívebb védekező magatartási reakciókkal [100], amit a striatum szerotoninszintjének emelkedése is alátámaszt. Pucilowski és mtsai igazolták, hogy a dorsalis raphe nucleusból felszálló szerotonerg pályák, melyek a mezostriatalis rendszer neuronjait képezik, gátló hatást gyakorolnak a különböző eredetű agresszív viselkedésformákra [116]. Ismert, továbbá az is, hogy az 5-HIAA-szint változása, mint a szerotonin metabolizmusának markere [117], jó korellációt mutat az állatok agresszív viselkedésével. A stresszhatás (izoláció) fokozza a fájdalom iránti érzékenységet, a morfin analgéziás hatását csökkenti, ami az endogén ópiát rendszer deficitjét mutatja [118]. Az a megfigyelésünk, hogy az elválasztási periódusban elszenvedett stresszhatás eredményeképpen a felnőttkorú nőstény patkányok plazmájában kétszeresére emelkedik a nocisztatinszint, melynek feltételezhetően jelentősége lehet a stressz által kiváltott károsító hatások mérséklésében [119, 120, 121, 122]. A nocisztatin és a szerotonerg rendszer kapcsolata az irodalomban kevésbé vizsgált. Fantin és mtsai vizsgálatai szerint egér corticalis szinaptoszóma preparátumon, a nocisztatin preszinaptikus Gi/o útvonalon, gátolja a K+-indukálta [3H]-szerotonin felszabadulást [123], mely hatás a NOP receptor knockout egerekben is kimutatható. Kísérleteinkben a nőstény patkányokat elválasztáskor tettük ki akut stresszhatásnak, majd a későbbiekben, a már felnőtt állatokban vizsgáltuk annak következményeit. Irodalmi adatok azt mutatják, hogy amikor Swiss-Webster egereket prenatális és posztanális korban stresszhatásnak (cold-water swim stress) tettek ki, mind a nőstény, mind a hím állatokban emelkedett mindkét esetben a fájdalomküszöb [124]. Kinsley és

89

mtsai [125] a morfin indukálta opioid receptor mediált és a prenatális (a vemhesség 1522 napján) stressz indukálta (cold-water swim stress) analgéziás hatást elemezve azt találta, hogy a stressz csak a felnőtt nőstény állatokban csökkentette szignifikánsan a fájdalomküszöböt. Sternberg és mtsai vizsgálataikban viszont azt tapasztalták, hogy a korai posztnatális korban ért stressz [126] a fájdalomküszöb emelkedését okozza mind a nőstény, mind pedig a hím egyedekben. Megállapítást nyert továbbá az is, hogy a vemhesség késői szakaszában és a szoptatás ideje alatt, a HPA-tengely kevésbé érzékeny az emocionális és fizikális stresszorokra, vagyis adaptálódik az adott helyzethez, és ezáltal minimalizálja a stressz-okozta károsító hatásokat [127, 128]. A HPA-tengely csökkent működésének eredményeképpen, csökkent noradrenalin felszabadulás figyelhető meg a paraventricular nucleusban, és emelkedik az endogén enkefalin és a µ-opioid receptorok száma az agytörzsben [129]. A prenatális, a korai posztnatális élet, valamint a szoptatás-elválasztás időszakában ért erőteljes ingerek (hormonális imprinting) tehát az egyedi élet késői szakaszában, egyes esetekben transzgenerációsan is maradandó hatásokat eredményeznek [130, 131, 132]. Ezek a hosszútávú hatások a fájdalom érzékelésének folyamatában, az endogén ópiátrendszer működésében [124, 125, 126], a HPA-tengely működésében [127, 128, 129] és a biogén amin anyagcserében [129] egyaránt kimutatást nyertek. Vizsgálatainkban

a

stresszhatások

eredményeit

hónapokkal

később

mértük,

megállapíthatjuk tehát, hogy az elválasztási periódusban ért akut stresszhatás a későbbiekben, a már felnőtt állatokban megjelenő, tartós változásokat eredményez.

5.2.3

Alkohol modell

Kísérletes modellünkkel az anyák egyszeri, nagy dózisú alkoholfogyasztását, illetve a krónikus alkoholfogyasztás hatását vizsgáltuk az utódok felnőttkori liquor és plazma nocisztatinszintjére. Olive és mtsai kísérleteikben azt igazolták, hogy az etanol és egyes kábítószerek (kokain, d-amfetamin) akut adagolásban megemelik a nucleus accumbenben az

90

endorfinszintet [133]. Patkányokban igazolást nyert továbbá az is, hogy a kombinált prenatális (a vemhesség 1-22-ik napjáig) és posztnatális korban (2-10 napig) kapott alkoholterhelés következtében az amygdala centrális magvaiban szignifikánsan csökken a met-enkefalinszint mind a hím, mind pedig a nőstény állatokban [130]. A nociceptinnek is bizonyított szerepe van az alkohol felvétel szabályozásában. A Marchigian Sardinian alkoholt-preferáló patkány törzsön végzett vizsgálatokban (alkoholizmus modell) [134, 135], megállapítást nyert, hogy a nociceptin i.c.v. (0,25-8 µg/óra, 7 napon át) adott infúziója dózisfüggően csökkenti az alkohol önadagolását és a stressz-indukálta alkoholkereső magatartást [136]. A nociceptin nagyobb dózisa, 24 órán át (akut hatás), ezzel ellentétben megemelte az állatok alkoholfogyasztását. Martin Fardon és mtsai is megerősítették az alkohol-preferáló patkány törzsön nyert eredményeket [137]. Alkohol-preferáló patkánytörzsön végzett újabb vizsgálatok szerint pedig, csak a centrális amygdalaba adott nociceptin gátolja az etanol önadagolását, míg a basolateralis amygdalaba injektált nociceptin nem [138]. A nocisztatinra vonatkozó ezirányú kísérleteket az irodalomban nem találtunk. Kísérleteinkben az endogén nocisztatinszint alakulását vizsgáltuk rövidtávú, nagy dózisú, illetve tartós és kis dózisban fogyasztott alkohol hatására a szoptatós anyák három hónapos utódaiban. A szoptatós anyák nagy dózisú (15 % alkohol) és rövidtávú (szülés utáni 4. napon, 24 órán át) ad libitum alkoholfogyasztása a liquor nocisztatinszintjét emeli meg jelentős mértékben a három hónapos utódokban, míg a hosszútávon (a szülés napjától számított 21 napig, 3 % alkohol) ad libitum alkoholfogyasztása, pedig a plazma nocisztatinszintjének szignifikáns emelkedését okozza. Eredményeink azt igazolták, hogy mindkét alkohol-adagolási algoritmus, hatással van az endogén nocisztatinszintre. A fenti adatok arra utalnak, hogy a szoptatás időszakában az anyai szervezetet ért rövidtávú, nagy dózisú és a hosszútávú, kis dózisú alkohol-terhelés egyaránt hatással van a felnőttkorú utódokban az endogén opiát fájdalomcsillapító rendszeren, az opioidok által szabályozott különböző viselkedésformákon (szexuális, társas viselkedés) túl, a nocisztatin endogén szintjére is.

91

5.3

NOP RECEPTOR IMPRINTING

5.3.1

Újszülöttkori nociceptin, illetve nocisztatin kezelés

Hormonális imprinting alatt, a jelenség első felismerésének időszakában, azt a folyamatot értették, amikor az egyedi élet korai szakaszában, a fejlődő hormonreceptor és hormonja közötti első találkozás történik [139, 140]. A receptor, fejlődése során, eléri a maximális kötési képességét, determinálódik a normál szignál transzdukciós rendszere és a normál hormon produkció [141, 142, 143]. A későbbi vizsgálatokban megerősítést nyert, hogy vannak más, kritikus „imprinting periódusok” is nemcsak a neonatális időszak és az endogén hormonokon túlmenően, egy olyan molekula, mely képes kötődni a receptorhoz hamis imprintinget eredményezhet, ha a kritikus periódusban történik az endogén célmolekulával (receptorral) ez a találkozás. Az imprinting egy életre szóló morfológiai, biokémiai, funkcinális, genetikai és viselkedésváltozásokat okoz [139, 140, 144, 145, 146, 147, 148, 149], befolyásolja az adott receptorszabályozta folyamatokat. Kísérleteinkben arra kerestünk választ, hogy az újszülöttkori nociceptinnel, illetve nocisztatinnal végzett imprinting hatására változik-e a szerotonerg és a dopaminerg anyagcsere patkányok agyrészleteiben (hippocampus, hypothalamus, agytörzs, frontális cortex, striatum), illetve a liquorban. Eredményeink szerint mind a nociceptinnel, mind a nocisztatin-nal végzett újszülöttkori imprinting

jelentős

biogén

amin

szint

változásokat

eredményez

a

vizsgált

agyrészletekben (22. és 23. táblázat). A nociceptin kezelés iránt az egyes agyterületek különböző érzékenységet mutattak és főként

a

szerotonerg

rendszerben

tapasztaltunk

szignifikáns

eltéréseket.

A

hypothalamusban, a hippocampusban és a striatumban emelkedett az 5-HIAA-szint, míg a frontális cortexben csökkent. A hypothalamusban szignifikánsan magasabb szerotoninszint alakult ki, a hippocampusban csökkent szerotonin értéket tapasztaltunk, míg a frontális cortexben csökkent szerotoninszintet csak a hím állatok mutattak. A

92

nociceptin kezelés a dopaminerg rendszerre nem volt jelentős hatással, egyedül az agytörzsben mértünk szignifikánsan magasabb HVA-szintet. Az

újszülöttkori

nociceptin

kezelés

(NOP

receptor

imprinting)

hatásának

vonatkozásában, eredményeink jó összhangot mutatnak azokkal az irodalmi adatokkal, melyekben a nociceptin a szerotonin felszabadulás egyik legfontosabb preszinaptikus modulátorának mutatkozott, rágcsálók corticalis szinaptoszóma preparátumán [69]. A nociceptinnek az irodalmi adatok alapján a dopaminerg rendszeren általánosságban gátló hatása jut kifejezésre [27, 31, 74, 75, 76]. Az a megfigyelésünk, hogy a NOP receptor újszülöttkori, nagy dózisú nociceptinnel történt stimulációja, a felnőttkorú patkányoknak csak az agytörzs dopamin anyagcseréjére (HVA/DA arány növekedéssel jellemzett turnover-fokozódás) volt hatással, arra utalhat, hogy az egyedi fejlődés során kompenzációs folyamatok történtek. Ezzel szemben a nocisztatin kezelés jelentős hatással bír mind a szerotonerg, mind a dopaminerg rendszerre. A hypothalamusban, a hippocampusban és a striatumban szignifikánsan megemelkedett az 5-HIAA-szint, míg a frontális cortexben csökkent. Nocisztatin kezelés hatására a szerotoninszint mind a hypothalamusban, mind az agytörzsben, mind a striatumban, mind pedig a frontális cortexben csökkent. A nociceptinnel szemben, a nocisztatin kezelés a hypothalamusban, az agytörzsben, a hippocampusban és a striatumban is szignifikánsan csökkentette a dopaminszintet, míg a frontális cortexben csak a nőstény állatokban figyelhető meg ez a változás. A HVAszint az agytörzsben mutatott szignifikáns emelkedést, míg a striatumban csak a nőstényekben mértünk jelentős emelkedést. A nocisztatin receptora jelenleg nem ismert. Az újszülöttkori nocisztatin és a felnőttkori szerotonerg rendszer kapcsolatáról irodalmi adatok nem találhatóak. Az a megfigyelésünk, hogy a nocisztatin imprinting csökkent szerotoninszinteket eredményezett a vizsgált agyrészletek mindegyikében, míg metabolitjának az 5-HIAAnak a szintje mindegyik agyrészletben szignifikáns emelkedést mutatott az utódokban. A nocisztatin és a dopaminerg rendszer kapcsolatára vonatkozó kísérletes adatokat az irodalomban nem találtunk. Vizsgálataink szerint a nocisztatin imprinting az utódokban

93

a vizsgált agyrészletek mindegyikében szignifikánsan csökkent dopaminszinteket erdeményezett. Eredményeink azt valószínűsítik, hogy a KIR-ben mind a szerotonerg, mind pedig a dopaminerg rendszer a nocisztatin hatásra fokozottan érzékeny az egyedi élet korai szakaszában. Elmondhatjuk tehát, hogy a neonatális nociceptin és nocisztatin imprinting a felnőtt állatokban kimutatható biogén aminerg változásokat okoz, vagyis hosszútávú következményeket jelent a szervezetre nézve, megváltozott szerotonerg és dopaminerg anyagcserét eredményez, mely az egész szervezet működésére kihat. Mivel a különböző agyrészletekben a nociceptin és nocisztatin imprinting eredményeképpen más és más hatások jutnak kifejezésre, ezek alapján nagyon nehéz lenne megítélni a hamis imprinting hatására kialakuló szervezetben változásokat. Imprinting vizsgálataink alapján elképzelhető az is, hogy például a szülés hossza és intenzitása, a különböző fájdalomcsillapítók, valamint az anya érzékenysége a különböző behatásokra, befolyásolja a későbbiekben a fájdalomban szerepet játszó különböző anyagok termelődését. Ez azt jelenti, hogyha ezen a fájdalomcsillapításban fontos anyagoknak, mint a nociceptinnek, a nocisztatinnak vagy az endorfinnak, valamilyen oknál fogva újszülöttkorban megváltozik a szervezetben a normál szintje, akkor hamis imprinting hatások alakulhatnak ki, melyek megváltoztatják a szerotonerg és a dopaminerg rendszer működését.

94

22. táblázat: Újszülöttkori 10 µg nociceptin kezelés hatása a liquor és a vizsgált agyrészletek dopamin-, szerotonin-, homovanillinsav- és 5-hidroxi-indolecetsavszintjére.

biogén

Nociceptin kezelés

aminok liquor hypothalamus agytörzs

hippocampus striatum

frontális cortex

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

hím

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

HVA

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

hím

DA nőstény

nőstény hím

n.sz.

n.sz.

n.sz.

5-HT

n.sz.

n.sz.

n.sz.

hím

n.sz.

n.sz.

5-HIAA

n.sz.

n.sz.

nőstény

nőstény

95

n.sz.

23. táblázat: Újszülöttkori 10 µg nocisztatin kezelés hatása a liquor és a vizsgált agyrészletek dopamin-, szerotonin-, homovanillinsav- és 5-hidroxi-indolecetsavszintjére.

biogén

Nocisztatin kezelés

aminok liquor hypothalamus agytörzs

hippocampus striatum

frontális cortex

hím

n.sz.

DA

n.sz.

n.sz.

nőstény hím

HVA

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

n.sz.

nőstény

hím

n.sz.

5-HT

n.sz.

nőstény

n.sz.

hím 5-HIAA

n.sz.

n.sz.

nőstény

96

n.sz.

n.sz. n.sz.

5.3.2

β-endorfin kezelés

Irodalmi adatok azt mutatják, hogy Wistar patkányok újszülött korban β-endorfinnal való kezelése, a felnőtt korban vizsgált állatokban szignifikánsan magasabb szerotoninszintet erdeményez a különböző agyrészletekben [150], nő az agresszivitás a hím és a nőstény állatokban, a nőstény állatok szexuális aktivitása pedig erőteljes csökkenést mutat. A neonatális korban való β-endorfin kezelés nincs hatással a liquor nociceptinszintjére, ugyanakkor szignifikánsan emelkedett nocisztatinszint mérhető [151]. Kísérleteinkben arra kerestük a választ, vajon a hormonális imprinting szempontjából egy igazoltan érzékeny másik életszakaszban, a perinatális korban való β-endorfin kezelés, hatással van-e a perifériás nocisztatinszintekre, illetve a KIR-ben a β-endorfin kezelés után tapasztalt szerotonin emelkedés a periférián is megnyilvánul-e. Eredményeink azt mutatják, hogy a vemhesség 19. napján, β-endorfinnal kezelt nőstény patkányok öt hónapos hím utódaiban, szignifikánsan megemelkedik a nocisztatinszint a plazmában. A nocisztatinnak, mint a nociceptin funkcionális antagonistájának [110, 111, 152], a β-endorfinhoz hasonlóan, a fájdalomcsillapításban van ugyancsak bizonyított szerepe. A nocisztatin mellett vizsgáltuk továbbá a szerotoninszinteket a különböző agyrészletekben. Az a megfigyelésünk, hogy az újszülöttkori β-endorfin kezelés hatására minden vizsgált agyrészletben a szerotoninszint csökken, a hippocampus kivételével. Erre utal az is, hogy a felnőtt utódokban szerotonin turnover fokozódás volt megfigyelhető. A KIR-i szerotoninszint változások és az agresszív viselkedés között bizonyított az összefüggés [153, 116], ugyanakkor megállapítást nyert az is, hogy a szerotonerg rendszer működésének deficitjét a liquorban az 5-HIAA-szint jelzi, mely jó korellációt mutat az állatok agresszív viselkedésével [117].

97

A nocisztatin és a szerotonin kapcsolatáról ismereteink szerint egyetlen közlemény számol be, mely szerint a nocisztatin egér corticalis szinaptoszóma preparátumon gátolta a K+-indukálta [3H]-szerotonin felszabadulását [123]. Annak megítélése, hogy a β-endorfinnal történt újszülöttkori kezelés nocisztatinszint emelő hatása és a szerotonin turnover fokozó hatás között, milyen összefüggés van, további elemzéseket igényel.

98

5.4

A NOCICEPTIN ÉS AZ ACETILKOLINERG RENDSZER

Irodalmi adatok szerint a nociceptin−NOP receptor stimuláció útján−gátló hatást fejt ki az acetilkolin felszabadulásra [25, 92, 93]. Igazolást nyert továbbá az is, hogy NOP receptor knockout egerekben szignifikánsan magasabb a hippocampális ACh-szint [93], a NOP/NC knockout egerekben pedig javul a tanulási képesség és a memória [94, 95], ami azt mutatja, hogy a nociceptinerg rendszer hatást gyakorol a tanulást és az emlékezést érintő folyamatokra. Újabb kísérletes eredmények arról számolnak be, hogy az opioid szerű anyagoknak (dinorfinok) szerepe lehet az Alzheimer kór kialakulásában [154], neurodegeneratív hatásúak és károsíthatják a kognitív funkciókat. Alzheimer típusú dementiában a kolinészteráz enzim aktivitása csökken és a kolinerg transzmisszió funkcionális aktivitásának visszaállítására törekednek, melynek egyik lehetséges módja az AChÉ gátlók alkalmazása lehetne [155]. Az irreverzibilis kolinészterázgátlók okozta mérgezésekben az oximok (pralidoxim, obidoxim) a klinikumban használatos AChÉ reaktivátorok, bár klinikai hatékonyságuk nem a legjobb. In vitro [156] és in vivo állatkísérletes adatok szerint [157, 158, 159], az újonnan szintetizált AChÉ enzim reaktivátorok közül a K-27 jelű az egyik leghatékonyabb. Szignifikánsan megemeli az organofoszfáttal mérgezett állatok túlélési arányát, vagyis sokkal ígéretesebbnek tűnik, mint a klinikumban használatos pralidoxim és obidoxim [159]. Vizsgálatainkban egy olyan kutatási irányhoz csatlakoztunk, mely a nociceptinerg rendszer és az acetilkolinerg neurotranszmisszió kapcsolatát, az AChÉ reaktivátorok hatásának elemzése útján célozza feltárni. Vizsgálataink közvetlen célja egyrészt egy olyan kromatográfiás rendszer kifejlesztése volt, amelyben a K-27 és a biogén aminok (szerotonin, dopamin), valamint metabolitjaik (5-HIAA, homovanillinsav) egy kromatográfiás rendszeren belül, különböző biológiai mintákból meghatározhatók.

99

Irodalmi adatok szerint az i.m. alkalmazott 50 µmol K-27 a plazmában 15 perccel a beadás után éri el maximális koncentrációját [160]. Kísérleteink azt mutatják, hogy még 60 perccel az i.m. kezelést követően is az agyszövetben a K-27 koncentrációja az aktuális szérum koncentráció közel 6 %-át teszi ki, a liquorban pedig az aktuális szérum koncentráció 3 %-a volt mérhető. Adataink jól korellálnak a Lorke és mtsai által mért eredményekkel [161]. Az, hogy egy ilyen erősen hidrofil vegyület, mint a K-27, milyen módon képes átjutni a vér-agy gáton egyelőre még vitatott. Felmerül annak lehetősége, hogy carrier fehérjék által mediált a folyamat, de a hiányos vér-agy gáttal bíró agyi területek szerepe sem zárható ki [162, 163]. A K-27 KIR-be való penetrációját közvetve támasztja alá, hogy más, szintén erősen hidrofil oxim-származékok (obidoxim, pralidoxim) esetében is jelentős KIR-i szint volt mérhető [161]. Sakurada és mtsai [164] azt igazolták, hogy a pralidoximnak mintegy 10 %-a jut át a vér-agy gáton, ugyanakkor Bajgar és mtsai [165] rámutattak arra, hogy a pralidoximnak már kis hányada (2-3 %) is elég, ha bejut a KIR megfelelő régióiba ahhoz, hogy kifejthesse farmakológiai hatását. A pralidoxim KIR-be való bejutásának dózisfüggés vizsgálata során megállapítást nyert továbbá az is, hogy a pralidoxim kisebb dózisából nagyobb hányad jut be a KIR-be, mint a nagyobb dózisból [166]. A K-27 kezelésnek a szerotonin és dopamin anyagcserére gyakorolt hatását vizsgálva azt találtuk, hogy a K-27, habár hatékony dózisban képes bejutni a KIR-be, önmagában nincs hatással a KIR-i szerotonerg és dopaminerg anyagcserére még 60 perccel az i.m. beadását követően sem.

100

5.5

PLAZMA

NOCICEPTIN-

ÉS

SZEROTONINSZINTEK

VÁLTOZÁSA

ISCHÉMIÁS BETEGEKBEN

Állatkisérletes adatok az agyi ischémia és a nociceptinerg rendszer kapcsolatára utalnak [167, 168]. A nociceptin növeli az arritmogén hatásokkal szembeni kardiális reziszteniciát [169]. Patkányokban, akut myocardialis ischémia modellen a hátsó gyöki ganglionokban és a gerincvelőben nociceptin up-reguláció figyelhető meg [170], ugyanakkor nociceptin upreguláció a hátsó gyöki ganglionokban perifériás gyulladásos folyamatokban is kimutatható [171]. Patkány corticalis agyszeletekben megállapítást nyert, hogy a nociceptin gátolja az akut ischémia indukálta glutamát effluxot, vagyis neuroprotektív hatása feltételezhető akut ischémiás kórképekben [172]. Klinikai beteganyagon végzett, az egyes kórképekben tapasztalható endogén nociceptinszint változások vizsgálatára irányuló mérések száma azonban egyrészt rendkívül kevés, másrészt érthető etikai okokból ezek is elsősorban a plazmaszintek mérésére korlátozódnak. Vizsgálatainkban arra kerestünk választ, hogy akut ischémiás betegek plazma nociceptinszintje mutat-e eltérést a korban és nemben illesztett kontroll személyekéhez hasonlítva. Vizsgálni kivántuk továbbá azt is, hogy a nociceptinnek a KIR-i szerotoninkiáramlást csökkentő hatása kimutatható-e a plazma szerotoninszintjének változásában is. Ismereteink szerint elsőként vizsgálva összesen 26 akut stroke beteg és 6 TIA-n átesett beteg plazma nociceptinszintjét azt találtuk, hogy a keringészavar helyétől függetlenül, a betegek szignifikánsan magasabb plazma nociceptinszinttel jellemezhetőek. Az emelkedett plazma nociceptinszint patofiziológiai jelentőségének értékelésénél felmerül a kérdés, hogy ez az emelkedés a betegség következménye-e vagy a korábban is fennálló magasabb nociceptinszint a stroke bekövetkeztének esélyét növelte-e. Miután a korábban stroke-on már átesett és abból felépült személyek (K1 csoport) értékei nem különböztek a semmiféle agyi érbetegségben korábban sem szenvedők

101

értékétől (K0 csoport), úgy gondoljuk, hogy az akut stroke-ban tapasztalt szignifikánsan magasabb plazma nociceptinszint az akut agyi keringészavar során alakulhat ki. Ischémia/hypoxia reperfúzió modellen Armstead és mtsai szignifikánsan magasabb nociceptinszintet mértek a liquorban és azt is igazolták, hogy a nociceptinnek az ischémia/hypoxia utáni agyi keringés, azaz hemodinámia visszaállításában van jelentős szerepe [167]. További kérdés, hogy a KIR-i folyamatokat mennyire tükrözi a plazma nociceptinszint alakulása. Állatkisérletes adatok szerint a nervus sciaticus lekötésével, illetve carrageninnek a glutealis izomba történő adásával létrehozott gyulladásos fájdalomban, a gerincvelő hátsó szarvában és a hypothalamusban szignifikáns nociceptinszint emelkedés figyelhető meg [173]. Az i.d. adott nociceptin, szignifikáns vaszkuláris permeabilitás-fokozódást eredményez [54], mely feltételezhetően a vér-agy gát fokozott átjárhatóságát is maga után vonja, ezzel megnövelve a nociceptin számára a KIR-i és a perifériás kompartmentek között való átjárhatóság lehetőségét is. NOP receptor knockout, prepronociceptin knockout és kétszeres knockout egerek formalinnal, illetve zymosan A-val kiváltott fájdalomreakcióját a vadtípusúakhoz viszonyítva Depner és mtsai azt találták, hogy az endogén nociceptinnek szabályozó szerepe nem az akut fájdalomérzésben, hanem a krónikus fájdalmak esetén van [174]. Az ischémiás betegek plazma szerotoninszintjét az összesített kontrollcsoport értékeihez hasonlítva szignifikáns eltérést nem tapasztaltunk. Az egyes vizsgált beteg csoportok között sem mutatkozott szignifikáns különbség, bár mind a TIA, mind a lacunáris területi stroke miatt hospitalizált betegek plazma szerotoninszintje alacsonyabbnak mutatkozott a kontroll értéknél. Az irodalmi adatok arra utalnak, hogy stroke esetén jelentős változások következnek be a szerotonin anyagcserében; közvetlenül a stroke bekövetkezte után csökken a vérlemezkékben a funkcionáló 5HT-transzporterek száma [175] és sok közlemény a stroke utáni kialakuló depresszióban a szelektív szerotonin-visszavétel gátlásával ható antidepresszív szerek [176], illetve az 5HT1A-receptor agonisták [177] hatékonyságát igazolja. Ugyanakkor egy 12 vizsgálat adatait feldolgozó összefoglaló értékelés szerint

102

[178] az antidepresszánsok hatékonysága a stroke-ból való felépülésre kétséges. Adataink értékelésénél azt is hangsúlyozni szeretnénk, hogy a vérmintáink akut strokebetegekből származnak, míg ezek az irodalmi adatok a stroke utáni szerotoninanyagcserezavarok a poszt-stroke depresszióban tapasztaltakra vonatkoznak. In vitro vizsgálatok azt igazolják, hogy a nociceptin (0,1-3 µM) patkány cortexben koncentrációfüggő mértékben gátolja a szerotonin felszabadulást [68], mely hatás a preszinaptikus

NOP-receptor

izgatásának

következménye.

Ugyanakkor

az

is

megállapítást nyert, hogy a nociceptin szerotonin-kiáramlást gátló hatékonysága állatfajonként jelentős különbözőséget mutat [71], mely adatok az emberi KIR-i hatására való következtetésnél különösen nagy óvatosságra intenek. Eredményeink szerint a szerotonin metabolit 5-HIAA plazmaszintje alacsonyabb a K0, mint a K1 csoportban, de ez az eltérés nem szignifikáns. A betegek összesített plazma 5HIAA értéke nem különbözik szignifikánsan a K0 csoport értékétől, viszont figyelemre méltó, hogy mind a carotis területi keringészavarban, mind a lacunaris ischémiában szignifikánsan magasabb a K0 értéknél, mely megerősíteni látszik a szerotonerg diszregulációt stroke esetén. Ennek pontos megítéléséhez fontos lenne a poszt-stroke depressziót mutató betegek egy nagyobb csoportjában is elvégezni mind az szerotonin, mind pedig az 5-HIAA méréseket.

103

6

KÖVETKEZTETÉSEK

A nociceptinerg és biogén aminerg rendszer kapcsolatának tanulmányozására irányuló állatkísérletes és humán vizsgálataink új eredményei és az azokból levonható következtetések az alábbiakban foglalhatók össze: 1. Állatkísérleteinkben igazoltuk, hogy a nociceptin a KIR-ben fokozza mind a hízósejtekből, mind a neuronálisan jelen lévő hisztamin kiáramlását, míg a KIRi szerotoninszintet szignifikánsan csökkenti. A compound 48/80 és a SP a nociceptinhez hasonlóan a KIR-ben hisztamin kiáramlást fokozó hatással bír, azonban hatásuk a hízósejtes és a neuronális hisztamin vonatkozásában eltérő. A nociceptin és SP hatása csak a központi idegrendszerben érvényesül, míg a compound 48/80 hatása a periférián is megnyilvánul. Miután ismert, hogy a hisztamin a KIR-ben a fájdalom mechanizmusának kialakulásában jelentős szereppel bír és kísérleteinkben a nociceptin hisztamin felszabadító hatását igazoltuk, feltételezzük, hogy a nociceptin a hisztamin fájdalomcsillapításban betöltött hatását esetlegesen támogatni/fokozni képes. 2. Krónikus diabéteszben, azaz a neuropátiás fájdalom metabolikus modelljén, a centrálisan

és

perifériásan

is

kimutatható

szignifikánsan

magasabb

nocisztatinszint, megerősíti a nocisztatinerg rendszer neuropátiás fájdalomban való érintettségét. 3. Az elválasztási periódusban a szervezetet ért akut stresszhatás, a felnőttkorban vizsgált patkányokban, megváltozott szerotonerg anyagcseréhez vezet és a plazmában

közel

kétszeresére

emelkedik

a

nocisztatinszint.

Mivel

vizsgálatainkban a stresszhatások eredményeit a már felnőtt szervezetben mértük, így megállapítható, hogy ebben a rendkívül érzékeny életszakaszban (elválasztási periódus) a szervezetet ért akut stresszhatás a későbbiekben, a már felnőtt állatokban megjelenő, tartós változásokat eredményez. 4. Alkohol-terhelésés vizsgálatainkból arra következtethetünk, hogy mind az akut, mind pedig a krónikus alkohol-adagolási algoritmus hatással van az utódok endogén nocisztatinszintjére, ezáltal pedig az utódok fájdalomtűrőképessége változhat.

104

5. Elsőként vizsgáltuk és mutattuk ki, hogy a neonatális korban kapott nociceptin, valamint a nocisztatin kezelés egyaránt, megváltozott dopamin és szerotonin anyagcseréhez vezet a felnőtt állatokban, a KIR-ben. A nociceptin kezelés főként a szerotonerg rendszerben okoz szignifikáns eltérést és az egyes agyterületek érzékenysége különböző. A nocisztatin kezelés a felnőttkorú patkányokban a KIR-i szerotonerg és dopaminerg rendszert is jelentősen befolyásolja. Eredményeinkből arra következtethetünk, hogy a KIR-ben mind a szerotonerg, mind pedig a dopaminerg rendszer a nocisztatin hatásra fokozottan érzékeny az egyedi élet korai szakaszában. A hormonális imprinting szempontjából igazoltan érzékeny másik életszakaszban, a perinatális kritikus periódusban

való

β-endorfin

kezelés,

az

utódokban

szignifikánsan

megemelkedett nocisztatinszintet eredményezett a plazmában és a különböző agyrészletekben megváltozott a szerotonerg anyagcsere. 6. Validált HPLC-EC módszert dolgoztunk ki a rendkívül hatékony acetilkolinészteráz reaktivátor biszpiridinium-aldoxim (K-27) szérumból, agyszövetből, liquorból és vizeletből történő meghatározására és annak vizsgálatára, hogy bejut-e hatékony dózisban a KIR-be. Megállapítottuk, hogy erősen hidrofil karaktere ellenére a K-27 hatékony koncentrációt ér el a KIR-ben, viszont a dopaminerg és szerotonerg anyagcserében 60 perccel az i.m. beadását követően sem okoz jelentősebb változást. Az általunk kidolgozott módszer alkalmasnak látszik más acetilkolin-észteráz enzim reaktivátor oximok koncentrációjának gyors, és nagy érzékenységű meghatározására, különböző biológiai mintákból. 7. Elsőként vizsgálva 26 akut stroke és 6 transiens ischémiás attack beteg plazma nociceptin szintjét megállapítottuk, hogy a keringészavar helyétől függetlenül a betegek szignifikánsan magasabb plazma nociceptinszinttel jellemezhetők. Miután

a

korábbi

agyi

keringészavarból

felépült

személyek

plazma

nociceptinszintje vizsgálataink szerint nem különbözik a semmiféle agyi érbetegségben sem aktuálisan, sem korábban nem szenvedőkétől, az emelkedett plazma nociceptinszintet az akut stroke, illetve TIA következményének tartjuk. Mind a carotis területi, mind pedig a lacunaris területet érintő keringészavarban szignifikánsan magasabb volt az 5-HIAA-szint, mint a semmiféle agyi érbetegségben

nem

szenvedett

kontrollok

105

csoportjában.

Eredményeink

megerősítik a más vizsgálatokban is kimutatott szerotonerg diszregulációt stroke esetén.

106

7

ÖSSZEFOGLALÁS

Vizsgálatainkban a nociceptinerg és a biogén aminerg rendszer kapcsolatát tanulmányoztuk. Állatkísérleteinkben egyrészt az exogén nociceptin központi idegrendszeri hatását, másrészt különböző állatmodelleken−krónikus diabétesz, stressz, alkohol-terhelés−az endogén nociceptin- és nocisztatinszintek változását vizsgáltuk. Tanulmányoztuk továbbá a neonatális nociceptin, nocisztatin kezelés, illetve a perinatális korban való βendorfin kezelés (hormonális imprinting) hatásait felnőttkorú patkányokban, biológiai mintákból. A nociceptin és a kolinerg rendszer kapcsolatának vizsgálatára irányuló kísérleteinkben, módszert állítottunk be egy újonnan kifejlesztett acetilkolin-észteráz reaktivátor HPLC-EC-vel történő meghatározására. Humán vizsgálatainkban az agyi ischémia, valamint a szerotonerg és a nociceptinerg rendszer kapcsolatára vonatkozó összefüggéseket kerestünk. Megállapítottuk, hogy a nociceptin fokozza mind a hízósejtekből, mind pedig a neuronálisan jelenlévő hisztamin kiáramlását, míg a szerotonin felszabadulást gátolja. Igazoltuk, hogy krónikus diabéteszben (neuropátiás fájdalom modell) szignifikánsan megemelkedik a nocisztatinszint mind a plazmában, mind pedig a liquorban, míg a nociceptinszint nem változik. Akut stressz modellen a plazma nocisztatinszintjének szignifikáns emelkedését mutattuk ki. Alkohol-terheléses modellen bizonyítottuk, hogy az anyáknak mind a krónikus, kis dózisú, mind az akut, nagy dózisú alkohol fogyasztása az utódokban a nocisztatinszintjének emelkedését okozza. Megállapítottuk, hogy mind az újszülöttkori nociceptin, mind a nocisztatin kezelés rendelkezik imprinting aktivitással. Kimutattuk, hogy a perinatálisan alkalmazott β-endorfin (endogén ópiát rendszer stimuláció) és a nocisztatin endogén szintje között kapcsolat áll fenn, mely a perifériás nocisztatinszint szignifikáns emelkedését okozza felnőttkorban. Validált HPLC-EC módszert dolgoztunk ki egy rendkívül hatékony acetilkolin-észteráz reaktivátor

(K-27)

szérumból,

agyszövetből,

liquorból

és

vizeletből

történő

meghatározására. Megállapítottuk, hogy a K-27 erősen hidrofil karaktere ellenére képes bejutni

a

központi

idegrendszerbe,

azonban

a

dopaminerg

és

szerotonerg

anyagcserében, önmagában nem okoz változást. Humán vizsgálatainkban kimutattuk a plazma nociceptinszintjének emelkedését, valamint a szerotonerg rendszer érintettségét akut ischémiás stroke betegségben.

107

8

SUMMARY

The dissertation is dealing with the interrelation of nociceptinerg/orphanin FQ-erg and biogenic amine system in animal experiments and in clinical samples. In animal studies both the effect of the exogenously (i.c.v.) administered nociceptin on histamine and serotonin release and changes in endogenous nociceptin, nocistatin and also on tissue biogenic amine levels in such animal models as chronic diabetes, stress and alcohol consumption were examined. In hormonal imprinting studies nociceptin, nocistatin and β-endorphin were applied as imprinters and nociceptin, nocistatin as well as dopamine, serotonin and their metabolites from different biological samples (brain areas, CSF, plasma) were measured. To get ready for analysing the nociceptinerg – acethylcholinerg interaction in the CNS, an HPLC-EC method was developed for the determination of a newly synthesized acethylcholine-esterase reactivator, K-27 (1-(4hydroxyimino-methyl-pyridinium)-3-(4-carbamoylpyridinium)-propane-dibromide) from different biological samples. Effect of acute ischemic CNS damage (stroke, TIA) on plasma nociceptin level and serotonergic measures were studied in clinical samples. Experimental data demonstrated that nociceptin has significant histamine releasing activity in the CNS both from neuronal pool and also from mast cells, however decreases tissue serotonin levels. Evidence was given that chronic diabetes (model system for neuropathic pain) does not influences nociceptin level, however produces significant elevation in nocistatin levels both in the CSF and blood plasma. It was found that either long-term low-dose or short-term high-dose alcohol-load of pregnant mothers result in significant nocistatin-level increase in the offspring. Hormonal imprinting studies showed that not only β-endorphin, but both nociceptin and nocistatin have imprinting activity when administered neonatally and imprinting by these compounds cause long-term changes in the dopaminergic and serotonergic measures of the adult rats. Examining the tissue penetration of K-27, it was found that in spite of the hydrophilic nature of the compound it can penetrate the CNS in an effective acethylcholin-esterase reactivating concentration, however this amount of the compound in he CNS has no effect on dopaminergic and serotonergic measures. Studying groups of acute ischemic CNS damage patients (stroke and TIA) we were the first in demonstrating that in these patients plasma nociceptin levels are significantly

108

higher compared to healthy controls. Experiments gave also further evidence on the disturbances of the serotonergic system in these patients.

109

9

IRODALOMJEGYZÉK 1. Mollereau C, Parmentier M, Mailleux P, Butour JL, Moisand C, Chalon P, Caput D, Vassart G, Meunier JC. (1994) ORL1, a novel member of the opioid receptor family. Cloning, funktional expression and lokalization. FEBS Lett, 341: 33-38. 2. Reinscheid RK, Nothacker HP, Bourson A. (1995) Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G-protein-coupled receptor. Science, 270: 792-794. 3. Connor M, Yeo A, Henderson G. (1996) The effect of nociceptin on Ca channel current and intracellular Ca in the SH-SY-5Y human neuroblastoma cell line. Br J Pharmacol, 118: 205-207. 4. Nicol B, Lambert DG, Rowbotham DJ, Smart D, McKnight AT. (1996) Nociceptin induced inhibition of K evoked glutamat release from rat cerebrocortical slices. Br J Pharmacol, 119: 1081-1083. 5. Fukuda K, Kato S, Mori K, Nishi M, Takeshima H, Iwabe N, Miyata T, Houtani T, Sugimoto T. (1994) cDNA cloning and regional distribution of a novel member of the opioid receptor family. FEBS Lett, 343: 42-46. 6. Mollereau C, Mouledous L. (2000) Tissue distribution of opioid receptor-like (ORL-1) receptor. Peptides, 21: 907-917. 7. Peluso J, LaForge KS, Matthes HW, Kreek MJ, Kieffer BL, Gavériaux-Ruff C. (1998) Distribution of nociceptin/orphanin FQ receptor transcript in human central nervous system and immune cells. J Neuroimmunol, 81: 184-192. 8. Neal CR Jr, Akil H, Watson SJ Jr. (2001) Expresson of orphanin FQ and opioid receptor-like (ORL1) receptor in the developing human and rat brain. J Chem Neuroanat, 22: 219-249. 9. Nothacker HP, Reinscheid RK, Mansour A, Henningsen RA, Ardati A, Monsma FJ Jr, Watson SJ, Civelli O. (1996) Primary structure and tissue distribution of the orphanin FQ precursor. Proc Natl Acad Sci USA, 93(16): 8677-82. 10. Wick MJ, Minnerath SR, Roy S, Ramakrishnan S, Loh HH. (1996) Differential expression of opioid receptor genes in human lymphoid cell lines and peripheral blood lymphocytes. J Neuroimmunol, 64: 29-36. 11. Meunier JC. (1997) Nociceptin/orphanin FQ and the opioid receptor-like ORL1 receptor. Eur J Pharmacol, 340: 1-15. 12. Darland T, Heinricher MM, Grandy DK. (1998) Orphanin FQ/nociceptin: a role in pain and analgesia, but so much more. Trends Neurosci, 21: 215-221. 13. Meunier JC, Mollereau C, Toll L. (1995) Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature, 377: 532535. 14. Reinscheid RK, Nothacker HP, Bourson A. (1995) Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G-protein-coupled receptor. Science, 270: 792-794. 15. Terenius L, Sandin J, Sakurada T. (2000) Nociceptin/orphanin FQ metabolism and bioactive metabolites. Peptides, 21: 919-922. 16. Florin S, Leblond F, Suaudeau C, Meunier JC, Costentin J. (1999) Comparison of behavioral effects of NCII or NCIII, two related pronociceptin-derived peptides. Life Sci, 65: 2727-2733.

110

17. Salvadori S, Guerrini R, Calo G, Regoli D. (1999) Structure-activity studies nociceptin/orphanin FQ: from full agonist, to partial agonist, to pure antagonist. Farmaco, 54: 810-25. 18. Calo’ G, Bigoni R, Rizzi A. (2000) Nociceptin/orphanin FQ receptor ligands. Peptides, 21: 935-947. 19. Montiel JL, Corille F, Roquea BP, Noble F. (1997) Nociceptin/orphanin FQ metabolism: role of aminopeptidase and endopeptidase 24.15. J Neurochem, 68: 354-61. 20. Yu TP, Fein J, Phan T, Evans CJ, Xie CW. (1997) Orphanin FQ inhibits synaptic transmission and long-term potentiation in rat hippocampus. Hippocampus, 7: 88-94. 21. Mollereau C, Simons MJ, Soularue P, Liners F, Vassart G, Meunier JC, Parmentier M. (1996) Structure, tissue distribution, and chromosomal localization of the prepronociceptin gene. Proc Natl Acad Sci USA, 93: 86668670. 22. Witta J, Palkovits M, Rosenberger J, Cox BM. (2004) Distribution of nociceptin/orphanin FQ in adult human brain. Brain Res, 997: 24-9. 23. Mogil JS, Pasternak GW. (2001) The molecular and behavioral pharmacology of the orphanin FQ/nociceptin peptide and receptor family. Pharmacol Rev, 53: 381-415. 24. Hou M, Uddman R, Tajti J, Edvinsson L. (2003) Nociceptin immunoreactivity and receptor mRNA in the human trigeminal ganglion. Brain Res, 964: 179-186. 25. Itoh K, Konya H, Takai E, Masuda H, Nagai K. (1999) Modification of acetylcholine release by nociceptin in conscious rat striatum. Brain Res, 845: 242-245. 26. Sbrenna S, Marti M, Morari M, Calo G, Guerrini R, Beani L, Bianchi C. (2000) Modulation of 5-hydroxytryptamine efflux from rat cortical synaptosomes by opioids and nociceptin. Br J Pharmacol, 130: 425-433. 27. Flau K, Redmer A, Liedtke M, Kathmann M, Schlicker E. (2002) Inhibition of striatal and retinal dopamine release via nociceptin/orphaninFQ receptors. Br J Pharmacol, 137: 1355-1361. 28. Marti M, Mela F, Fantin M, Zucchini S, Brown JM, Witta J, Di Benedetto M, Buzas B, Reinscheid RK, Salvadori S, Guerrini R, Romualdi P, Candeletti S, Simonato M, Cox BM, Morari M. (2005) Blockade of nociceptin/orphanin FQ transmission attenuates symptoms and neurodegeneration associated with Parkinson's disease. J Neurosci, 25: 9591-9601. 29. Griebel G, Perrault G, Sanger DJ. (1999) Orphanin FQ, a novel neuropeptide with anti-stress-like activity. Brain Res, 836: 221-4. 30. Jenck F, Ouagazzal AM, Pauly-Evers M, Moreau JL. (2000) OrphaninFQ: role in behavioral fear responses and vulnerability to stress? Mol Psychiatry, 5: 5724. 31. Murphy NP, Maidment NT. (1999) Orphanin FQ/nociceptin modulation of mesolimbic dopamine transmission determined by microdialysis. J Neurochem, 73: 179-186. 32. Chiou LC, Liao YY, Fan PC, Kuo PH, Wang CH, Riemer C, Prinssen EP. (2007) Nociceptin/Orphanin FQ peptide receptors: pharmacology and clinical implications. Current Drug Targets, 8: 117-135.

111

33. Lambert DG. (2008) The nociceptin/orphanin FQ receptor: a target with broad therapeutic potential. Nat Rev Drug Discov, 7: 694-710. 34. Eriksson KS, Stevens DR, Haas HL. (2000) Opposite modulation of histaminergic neurons by nociceptin and morphine. Neuropharmacology, 39: 2492-2498. 35. Di-Chiara G, Imperato A. (1988) Opposite effects of μ and κ opiate agonists on dopamine release in the nucleus accumbens and in the dorsal caudate of freely moving rats. J Pharmacol Exp Ther, 244: 1067-1080. 36. Gifford AN, Wang RY. (1994) The effect of 5-HT3 receptor antagonists on the morphine-induced excitation of A10 dopamine cells: electrophysiological studies. Brain Res, 638: 325-328. 37. Murphy NP, Ly HT, Maidment NT. (1996) Intracerebroventricular orphanin FQ/nociceptin supresses dopamine release in the nucleus accumbens of anaesthetized rats. Neurosci, 75: 1-4. 38. Johnson SW, North RA. (1992) Opioids excite dopamine neurons by hyperpolarization of local interneurons. J Neurosci, 12: 483-488. 39. Hough LB, Nalwalk JW. (1992) Inhibition of morphine antinociception by centrally administered histamine H2 receptor antagonists. Eur J Pharmacol, 215: 69-74. 40. Glick SD, Crane LA. (1978) Opiate-like and abstinence–like effects of intracerebral histamine administration in rats. Nature, 273: 547-549. 41. Thoburn KK, Hough LB, Nalwalk JW, Mischler SA. (1994) Histamine-induced modulation of nociceptive responses. Pain, 58: 29-37. 42. Malmberg-Aiello P, Lamberti C, Ipponi A, Hänninen J, Ghelardini C, Bartolini A. (1997) Effects of two histamine-N-methyl –transferase inhibitors, SKF 91488 and BW 301U, in rodent antinociception. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol, 355: 354-360. 43. Helyes Z, Nemeth J, Pinter E, Szolcsanyi J. (1997) Inhibition by nociceptin of neurogenic inflammation and the release of SP and CGRP from sensory nerve terminals. Br J Pharmacol, 121: 613-615. 44. Inoue M, Matsunaga S, Rashid MH, Yoshida A, Mizuno K, Sakurada T, Takeshima H, Ueda H. (2001) Pronociceptive effects of nociceptin/orphanin FQ (13-17) at peripheral and spinal level in mice. J Pharmacol Exp Ther, 299: 213219. 45. Andrew D, Craig AD. (2001) Spinothalamic lamina I neurons selectively sensitive to histamine: a central neural pathway for itch. Nat Neurosci, 4: 72-77. 46. Sakurada S, Orito T, Sakurada C, Sato T, Hayashi T, Mobarakeh JI, Yanai K, Onodera K, Watanabe T, Sakurada T. (2002) Possible involvment of tachykinin NK1 and NMDA receptors in histamine-induced hyperalgesia in mice. Eur J Pharmacol, 434: 29-34. 47. Schwartz JC, Arrang JM, Garbarg M. (1991) Histaminergic transmission in the mammalian brain. Physiol Rev, 71: 1-15. 48. Sakurada S, Orito T, Furuta S, Watanabe H, Mobarakeh JI, Yanai K, Watanabe T, Sato T, Onodera K, Sakurada C, Sakurada T. (2003) Intrathecal histamine induces spinally mediated behavioral response through tachykinin NK1 receptors. Pharmacol Biochem Behav, 74: 489-93.

112

49. Sakurada T, Yamada T, Tan-no K, Manome Y, Sakurada S, Kisara K, Ohba M. (1991) Differential effects of substance P analogs on neurokinin 1 receptor agonists in the mouse spinal cord. J Pharmacol Exp Ther, 259: 205-210. 50. Sakurada S, Watanabe H, Mizoguchi H, Yonezawa A, Orito T, Katsuyama S, Kuramasu A, Sakurada C, Yanai K, Sakurada T. (2004) Involvment of the histaminergic system in the nociceptin-induced pain-related behaviors in the mouse spinal cord. Pain, 112: 171-182. 51. Wang JB, PS Persico AM, Hawkins AL. (1994) Human mu opiate receptor cDNA and genomic clones, pharmacologic characterization and chromosomal assignment. FEBS Lett, 338: 217-222. 52. Pampusch MS, Osinski MA, Serie JR. (1998) Opioid receptor gene expression in the porcine immune system. Adv Exp Med Biol, 437: 59-65. 53. Nemeth J, Helyes Z, Oroszi G, Thán M, Pintér E, Szolcsányi J. (1998) Inhibition of nociceptin on sensory neuropeptide release and mast cell-mediated plasma extravasation in rats. Eur J Pharmacol, 347: 101-104. 54. Kimura T, Kitaichi K, Hiramatsu K, Yoshida M, Ito Y, Kume H, Yamaki K, Suzuki R, Takagi K. (2000) Intradermal application of nociceptin increases vascular permeability in rats: the possible ivolvment of histamine release from mast cells. Eur J Pharmacol, 407: 327-332. 55. Nishi M, Houtani T, Noda Y, Mamiya T, Sato K, Doi T, Kuno J, Takeshima H, Nukada T, Nabeshima T, Yamashita T, Noda T, Sugimoto T. (1997) Unrestrained nociceptive response and disregulation of hearing ability in mice lacking the nociceptin/orphanin FQ receptor. EMBO J, 16: 1858-1864. 56. Rossi GC, Leventhal L, Pasternak GW. (1996) Naloxone sensitive orphanin FQinduced analgesia in mice. Eur J Pharmacol, 311: 7-8. 57. Shimohigashi Y, Hatano R. Fujita T. (1996) Sensitivity of opioid receptor-like receptor ORL1 for chemical modification on nociceptin, a naturally occuring nociceptive peptide. J Biol Chem, 271: 23642-23645. 58. Okuda-Ashitaka E, Tachibana S, Houtani T, Minami T, Masu Y, Nishi M, Takeshima H, Sugimoto T, Ito S. (1996) Identification and characterization of an endogenous ligand for opioid receptor homologue ROR-C: its involvment in allodynic response toinnocuous stimulus. Mol Brain Res, 43: 96-104. 59. Hara N, Minami T, Okuda-Ashitaka E. (1997) Characterization of nociceptin hyperalgesia and allodynia in conscious mice. Br J Pharmacol, 121: 401-408. 60. Mogil JS, Grisel JE, Reinscheid RK. (1996) Orphanin FQ is a functional antiopioid peptide. Neuroscience, 75: 333-337. 61. Tian JH, Xu W, Fang Y, Mogil JS, Grisel JE, Grandy DK, Han JS. (1997) Bidirectional modulatory effect of orphanin FQ on morphine-induced analgesia: antagonism in brain and potentiation in spinal cord of the rat. Br J Pharmacol, 120: 676-680. 62. Yamamoto T, Nozaki-Taguchi N, Kimura. (1997) Analgesic effect of intrathecally administered nociceptin, an opioid receptor-like1 receptor agonist, in the rat formalin test. Neuroscience, 81: 249-254. 63. Adeagbo AS, Oriowo MA. (1998) Histamine receptor subtypes mediating hyperpolarization in the isolated, perfused rat mesenteric pre-arteriolar bed. Eur J Pharmacol, 347: 237-244. 64. Parsons ME, Ganellin CR. (2006) Histamine and its receptors. Br J Pharmacol, 147: 127-135.

113

65. Serhan CN, Fierro IM, Chiang N, Pouliot M. (2001) Cutting edge: nociceptin stimulates neutrophil chemotaxis and recruitment: inhibition by aspirintriggered-15-epi-lipoxin A4. J Imunnol, 166: 3650-3654. 66. Thorlacius H, Raud J, Rosengren-Beezley S, Forrest MJ, Hedqvist P, Lindbom L. (1994) Mast cell activation induced P-selectin-dependent leukocyte rolling and adhesion in postcapillary venules in vivo. Biochem Biophys Res Commun, 203: 1043-1049. 67. Siniscalchi A, Rodi D, Beani L, Bianchi C. (1999) Inhibitory effect of nociceptin on [3H]-5HT release from rat cerebral cortex slices. Br J Pharmacol, 128: 119-123. 68. Kamei J, Matsunawa Y, Miyata S, Tanaka S, Saitoh A. (2003) Effects of nociceptin on the exploratory behavior of mice in the hole-board test. Eur J Pharmacol, 489: 77-87. 69. Mela F, Marti M, Ulazzi L, Vaccari E, Zucchini S, Trapella C, Salvadori S, Beani L, Bianchi C, Morari M. (2004) Pharmacological profile of nociceptin/orphanin FQ receptors regulating 5-hydroxytryptamine release in the mouse neocortex. Eur J Pharmacol, 19: 1317-1324. 70. Tao R, Ma Z, Thakkar MM, McCarley RW, Auerbach SB. (2007) Nociceptin/orphanin FQ decreases serotonin efflux in the rat brain but in contrast to a κ-opioid has no antagonistic effect on μ-opioid-induced increases in serotonin efflux. Neuroscience, 147: 106-116. 71. Berger B, Rothmaier AK, Wedekind F, Zentner J, Feuerstein TJ, Jackisch R. (2006) Presynaptic opioid receptors on noradrenergic and serotonergic neurons in the human as compared to the rat neocortex. Br J Pharmacol, 148: 795-806. 72. Norton CS, Neal CN, Kumar S, Akil H, Watson SJ. (2002) Nociceptin/orphanin FQ and opioid receptor-like mRNA expression in dopamine system. J Comp Neuro, 444: 358-368. 73. Maidment NT, Chen Y, Tan AM, Murphy NP, Leslie FM. (2002) Rat ventral midbrain dopamine neurons express the orphanin FQ/nociceptin receptor ORL1. Neuroreport, 13: 1137-1140. 74. Shieh KR, Pan JT. (2001) Effects of orphanin FQ on central dopaminergic neuronal activities and prolactin secretion. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol, 280: 705-712. 75. Schlicker E, Werthwein S, Kathmann M, Bauer U. (1998) Nociceptin inhibits noradrenaline release in the mouse brain cortex via presynaptic ORL1 receptors. Arch Pharmacol. Naunyn-Schmiedeberg’s, 358: 418-422. 76. Liu Z, Wang Y, Zhang J, Ding J, Guo L, Cui D, Fei J. (2001) Orphanin FQ: an endogenous antagonist of rat brain dopamin transporter. NeuroReport, 12: 699702. 77. Calo G, Rizzi A, Rizzi D, Bigoni R, Guerrini R, Marzola G, Marti M, McDonald J, Morari M, Lambert DG, Salvadori S, Regoli D. (2002) [Nphe1,Arg14,Lys15]Nociceptin-NH2 , a novel potent and selective antagonist of the nociceptin/orphanin FQ receptor. Br J Pharmacol, 136: 303-311. 78. Kawamoto H, Ozaki S, Itoh Y, Miyaji M, Arai S, Nakashima H, Kato T, Ohta H, Iwasawa Y. (1999) Discovery of the first potent and selective small molecule opioid receptor-like (ORL1) antagonist: 1-[(3R,4R)-1-cyclooctylmethyl-3hydroxymethyl-4-piperidyl]-3-ethyl-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one (J113397). J Med Chem, 42: 5061-5063.

114

79. Marti M, Mela F, Veronesi C, Guerrini R, Salvadori S, Federici M, Mercuri NB, Rizzi A, Franchi G, Beani L, Bianchi C, Morari M. (2004) Blockade of nociceptin/orphanin FQ receptor in rat substantia nigra pars reticulata stimulates nigrostriatal dopaminergic transmission and motor behavior. J Neurosci, 24: 6659-6666. 80. Marti M, Mela F, Guerrini R, Calò G, Bianchi C, Morari M. (2004) Blockade of nociceptin/orphanin FQ transmission in rat substantia nigra reverses haloperidolinduced akinesia and normalizes nigral glutamate release. J Neurochem, 91: 1501-1504. 81. Marti M, Trapella C, Viaro R, Morari M. (2007) The nociceptin/orphanin FQ receptor antagonist J-113397 and L-DOPA additively attenuate experimental Parkinsonism through overinhibition of the nigrothalamic pathway. J Neurosci, 27: 1297-1307. 82. Koizumi M, Sakoori K, Midorikawa N, Murphy NP. (2004) The NOP (ORL1) receptor antagonist Compound B stimulates mesolimbic dopamine release and is rewarding in mice by non-NOP-receptor-mediated mechanism. Br J Pharmacol, 143: 53-62. 83. Koizumi M, Midorikawa N, Takeshima H, Murphy NP. (2004) Exogenous, but not endogenous nociceptin modulates mesolimbic dopamine release in mice. J Neurochem, 89: 257-263. 84. Murphy NP, Tan AM, Lam HA, Maidment NT. (2004) Nociceptin/orphanin FQ modulation of rat midbrain dopamine neurons in primary culture. Neuroscience, 127: 929-940. 85. Di Giannuario A, Pieretti S. (2000) Nociceptin differentially affects morphineinduced dopamine release from the nucleus accumbens and nucleus caudate in rats. Peptides, 21: 1125-1130. 86. Werthwein S, Bauer U, Nakazi M, Kathmann M, Schlicker E. (1999) Further characterization of the ORL1 receptor-mediated inhibition of noradrenaline release in the mouse brain in vitro. Br J Pharmacol, 127: 300-308. 87. Rominger A, Förster S, Zentner J, Dooley DJ, McKnight AT, Feuerstein TJ, Jackisch R, Vlaskovska M. (2002) Comparison of the ORL1 receptor-mediated inhibition of noradrenaline release in human and rat neocortical slices. Br J Pharmacol, 135: 800-806. 88. Ciccocioppo R, Angeletti S, Panocka I, Massi M. (2000) Nociceptin/orphanin FQ and drugs of abuse. Peptides, 21: 1071-1080. 89. Ueda H, Inoue M, Takeshima H, Iwasawa Y.. (2000) Enhanced spinal nociceptin receptor expression develops morphine tolerance and dependence. J Neurosci, 20: 7640-7647. 90. Siniscalchi A, Rodi D, Morari M, Marti M, Cavallini S, Marino S, Beani L, Bianchi C. (2002) Direct and indirect inhibition by nociceptin/orphanin FQ on noradrenaline release from rodent cerebral cortex in vitro. Br J Pharmacol, 136: 1178-1184. 91. Kawahara Y, Hesselink MB, Scharrenburg G, Westerink BHC. (2004) Tonic inhibition by orphanin FQ/nociceptin of noradrenaline neurotransmission in the amygdala. Eur J Pharmacol, 485: 197-200. 92. Cavallini S, Marino S, Beani L. (2003) Nociceptin inhibition of acetylcholine efflux from different brain areas. NeuroReport, 14: 2167-2170.

115

93. Uezu K, Sano A, Sei H, Toida K, Houtani T, Sugimoto T, Suzuki-Yamamoto T, Takeshima H, Ishimura K, Morita Y. (2005) Enhanced hippocampal acetylcholine release in nociceptin-receptor knockout mice. Brain Res, 1050: 118-123. 94. Higgins GA, Kew JN, Richards JG, Takeshima H, Jenck F, Adam G, Wichmann J, Kemp JA, Grottick AJ. (2002) A combined pharmacological and genetic approach to investigate the role of orphanin FQ in learning and memory. Eur J Neurosci, 15: 911-922. 95. Manabe T, Noda Y, Mamiya T, Katagiri H, Houtani T, Nishi M, Noda T, Takahashi T, Sugimoto T, Nabeshima T, Takeshima H. (1998) Facilitation of long-term potentiation and memory in mice lacking nociceptin receptors. Nature, 394: 577-581. 96. Hiramatsu M, Miwa M, Hashimoto K, Kawai S, Nomura N. (2008) Nociceptin/orphanin FQ reverses mecamylamine-induced learning and memory impairment as well as decrease in hippocampal acetylcholine release in the rat. Brain Res, 1195: 96-103. 97. Taguchi K, Hagiwara Y, Suzuki Y, Kubo T. (1993) Effects of morphine on release of acetylcholine in the rat striatum: an in vivo microdialysis study. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 347: 9-13. 98. Wichmann T, Starke K. (1990) Modulation by muscarine and opioid receptors of acetylcholine release in slices from striato-striatal grafts in the rat. Brain Res, 510: 296-302. 99. Courteix C, Eschalier A, Lavarenne J. (1993) Streptozocin-induced diabetic rats: behavioural evidence for a model of chronic pain. Pain, 53: 81-8. 100. Csaba G, Kovács P, Tóthfalusi L, Pállinger E. (2005) Prolonged effect of stress (water and food deprivation) at weaning or in adult age on the triiodothyronine and histamine content of immune cells. Horm Metab Res, 37: 711-5. 101. Csaba G, Kovács P, Pállinger E. (2006) Changes in the endorphin and serotonin content of rat immune cells during adulthood following maternal exposure to ethanol during pregnancy and lactation. Alcohol, 38: 111-6. 102. Pollard H, Bischoff S, Llorens-Cortes C, Schwartz JC. (1976) Histidine decarboxylase and histamine in discrete nuclei of rat hypothalamus and the evidence for mast-cells in the median eminence. Brain Res, 118: 509-13. 103. Taylor KM, Snydler SH (1972) Isotopic microassay of histamine, histidine, histidine decarboxylase and histamine methyltransferase in brain tissue. J Neurochemistry, 19: 1343-58. 104. Edvinsson L, Cervós-Navarro J, Larsson LI, Owman C, Rönnberg AL. (1977) Regional distribution of mast cells containing histamine, dopamine, or 5hydroxytryptamine in the mammalian brain. Neurology, 27: 878-83. 105. Bugajski AJ, Chłap Z, Bugajski J, Borycz J. (1995) Effect of compound 48/80 on mast cells and biogenic amine levels in brain structures and on corticosterone secretion. J Physiol Pharmacol, 46: 513-22. 106. Helyes Z, Németh J, Pintér E, Szolcsányi J. (1997) Inhibition by nociceptin of neurogenic inflammation and the release of SP and CGRP from sensory nerve terminals. Br J Pharmacol, 121: 613-5. 107. Kamei J, Ohsawa M, Kashiwazaki T, Nagase H. (1999) Antinociceptive effects of the ORL1 receptor agonist nociceptin/orphanin FQ in diabetic mice. Eur J Pharmacol, 370: 109-16.

116

108. Courteix C, Coudoré-Civiale MA, Privat AM, Pélissier T, Eschalier A, Fialip J. (2004) Evidence for an exclusive antinociceptive effect of nociceptin/orphanin FQ, an endogenous ligand for the ORL1 receptor, in two animal models of neuropathic pain. Pain, 110: 236-45. 109. Obara I, Przewlocki R, Przewlocka B. (2005) Spinal and local peripheral antiallodynic activity of Ro64-6198 in neuropathic pain in the rat. Pain, 116: 1725. 110. Okuda-Ashitaka E, Minami T, Tachibana S, Yoshihara Y, Nishiuchi Y, Kimura T, Ito S. (1998) Nocistatin, a peptide that blocks nocicptin action in pain transmission. Nature, 392: 286-289. 111. Okuda-Ashitaka E, Ito S. (2000) Nocistatin: a novel neuropeptide encoded by the gene for the nociceptin/orphanin FQ precursor. Peptides, 21: 1101-1109. 112. Nakagawa T, Kaneko M, Inamura S, Satoh M. (1999) Intracerebroventricular administration of nocistatin reduces inflammatory hyperalgesia in rats. Neurosci Lett, 265: 64-6. 113. Adeghate E, Ponery AS. (2001) The role of leucine-enkephalin on insulin and glucagon secretion from pancreatic tissue fragments of normal and diabetic rats. Arch Physiol Biochem, 109: 223-9. 114. Malan TP, Ossipov MH, Gardell LR, Ibrahim M, Bian D, Lai J, Porreca F. (2000) Extraterritorial neuropathic pain correlates with multisegmental elevation of spinal dynorphin in nerve-injured rats. Pain, 86: 185-94. 115. Joseph T, Lee TL, Li C, Siau C, Nishiuchi Y, Kimura T, Tachibana S. (2007) Levels of neuropeptides nocistatin, nociceptin/orphanin FQ and their precursor protein in a rat neuropathic pain model. Peptides, 28: 1433-40. 116. Pucilowski O, Kostowski W. (1983) Aggressive behaviour and the central serotonergic systems. Behav Brain Res, 9: 33-48. 117. Ferrari PF, Palanza P, Parmigiani S, de Almeida RM, Miczek KA. (2005) Serotonin and aggressive behavior in rodents and nonhuman primates: predispositions and plasticity. Eur J Pharmacol, 526: 259-73. 118. Alleva E, Caprioli A, Laviola G. (1986) Postnatal social environment affects morphine analgesia in male mice. Physiol Behav, 36: 779-81. 119. Hiramatsu M, Inoue K. (1999) Effects of nocistatin on nociceptin-induced impairment of learning and memory in mice. Eur J Pharmacol, 367: 151-155. 120. Nicol B, Lambert DG, Rowbotham DJ, Okuda-Ashitaka E, Ito S, Smart D, McKnight AT (1998) Nocistatin reverses nociceptin inhibition of glutamate release from rat brain slices. Eur J Pharmacol, 356: 1-3. 121. Olszewski PK, Shaw TJ, Grace MK, Billington CJ, Levine AS. (2000) Nocistatin inhibits food intake in rats. Brain Res, 872: 181-187. 122. Meis S, Pape HC. (2001) Control of glutamate and GABA release by nociceptin/orphanin FQ in the rat lateral amygdala. J Physiol, 532: 701-12. 123. Fantin M, Fischetti C, Trapella C, Morari M. (2007) Nocistatin inhibits 5hydroxytryptamine release in the mouse neocortex via presynaptic Gi/o protein linked pathways. Br J Pharmacol, 152: 415-6.

117

124. Sternberg WF. (1999) Sex differences in the effects of prenatal stress on stressinduced analgesia. Physiol Behav, 68: 63-72. 125. Kinsley CH, Mann PE, Bridges RS. (1998) Prenatal stress alters morphine- and stress-induced analgesia in male and female rats. Pharmacol Biochem Behav, 30: 123-8. 126. Sternberg WF, Ridgway CG. (2003) Effects of gestational stress and neonatal handling on pain, analgesia, and stress behavior of adult mice. Physiol Behav, 78: 375-83. 127. Brunton PJ, Russell JA. (2008) Attenuated hypothalamo-pituitary-adrenal axis responses to immune challenge during pregnancy: the neurosteroid opioid connection. J Physiol, 586: 369-75. 128. Brunton PJ, Russell JA, Douglas AJ. (2008) Adaptive responses of the maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis during pregnancy and lactation. J Neuroendocrinol, 20: 764-76. 129. Russell JA, Douglas AJ, Brunton PJ. (2008) Reduced hypothalamo-pituitaryadrenal axis stress responses in late pregnancy: central opioid inhibition and noradrenergic mechanisms. Ann N Y Acad Sci, 1148: 428-38. 130. Lugo JN Jr, Wilson MA, Kelly SJ. (2006) Perinatal ethanol exposure alters metenkephalin levels of male and female rats. Neurotoxicol Teratol, 28: 238-44. 131. Pállinger E, Csaba G. (2005) Effect of a single early-gestational alcohol consumption on the insulin binding by immune cells of adult rats. Inflamm Res, 54: 483-4. 132. Csaba G, Kovács P, Pállinger E. (2005) Alcohol consumption during gestation reduces the histamine and triiodothyronine content of rat immune cells. Inflamm Res, 54: 479-82. 133. Olive MF, Koenig HN, Nannini MA, Hodge CW. (2001) Stimulation of endorphin neurotransmission in the nucleus accumbens by ethanol, cocaine, and amphetamine. J Neurosci, 21: 184-6. 134. Ciccocioppo R, Economidou D, Fedeli A, Massi M. (2003) The nociceptin/orphanin FQ/NOP receptor system as a target for treatment of alcohol abuse: a review of recent work in alcohol-preferring rats. Physiol Behav, 79: 121-8. 135. Ciccocioppo R, Economidou D, Cippitelli A, Cucculelli M, Ubaldi M, Soverchia L, Lourdusamy A, Massi M. (2006) Genetically selected Marchigian Sardinian alcohol-preferring (msP) rats: an animal model to study the neurobiology of alcoholism. Addict Biol, 11: 339-55. 136. Cifani C, Guerrini R, Massi M, Polidori C. (2006) Chronic intracerebroventricular infusion of nociceptin/orphanin FQ increases food and ethanol intake in alcohol-preferring rats. Peptides, 27: 2803-10. 137. Martin-Fardon R, Ciccocioppo R, Massi M, Weiss F. (2000) Nociceptin prevents stress-induced ethanol- but not cocaine-seeking behavior in rats. Neuroreport, 11: 1939-43. 138. Economidou D, Hansson AC, Weiss F, Terasmaa A, Sommer WH, Cippitelli A, Fedeli A, Martin-Fardon R, Massi M, Ciccocioppo R, Heilig M. (2008) Dysregulation of nociceptin/orphanin FQ activity in the amygdala is linked to excessive alcohol drinking in the rat. Biol Psychiatry, 64: 211-8.

118

139. Csaba G. (1984) The present state in the phylogeny and ontogeny of hormone receptors. Horm Metab Res, 16: 329-35. 140. Csaba G. (1986) Receptor ontogeny and hormonal imprinting. Experientia, 42: 750-9. 141. Csaba G. (1994) Phylogeny and ontogeny of chemical signaling: origin and development of hormone receptors. Int Rev Cytol, 155: 1-48. 142. Csaba G. (2000) Hormonal imprinting: its role during the evolution and development of hormones and receptors. Cell Biol Int, 24: 407-14. 143. Csaba G, Nagy SU. (1985) Influence of the neonatal suppression of TSH production (neonatal hyperthyroidism) on response to TSH in adulthood. J Endocrinol Invest, 8: 557-9. 144. Bern HA, Gorski RA, Kawashima S. (1973) Long-term effects of perinatal hormone administration. Science, 181: 189-190. 145. Bern HA, Jones LA, Mori T, Young PN. (1975) Exposure of neonatal mice to steroids: longterm effects on the mammary gland and other reproductive structures. J Steroid Biochem, 6: 673-6. 146. Nelson KG, Sakai Y, Eitzman B, Steed T, McLachlan J. (1994) Exposure to diethylstilbestrol during a critical developmental period of the mouse reproductive tract leads to persistent induction of two estrogen-regulated genes. Cell Growth Differ, 5: 595-606. 147. Mirzahosseini S, Karabélyos C, Dobozy O, Csaba G. (1996) Changes in sexual behavior of adult male and female rats neonatally treated with vitamin D3. Hum Exp Toxicol, 15: 573-6. 148. Csaba G, Kovács P, Pállinger E. (2002) Single treatment (hormonal imprinting) of newborn rats with serotonin increases the serotonin content of cells in adults. Cell Biol Int, 26: 663-8. 149. Csaba G, Kovács P, Pállinger E. (2003) Effect of a single neonatal endorphin treatment on the hormone content of adult rat white blood cells and mast cells. Cell Biol Int, 27: 423-7. 150. Csaba G, Knippel B, Karabélyos C, Inczefi-Gonda A, Hantos M, Tóthfalusi L, Tekes K. (2003) Effect of neonatal beta-endorphin imprinting on sexual behavior and brain serotonin level in adult rats. Life Sci, 73: 103-14. 151. Tekes K, Hantos M, Csaba G. (2004) Single neonatal treatment with betaendorphin (hormonal imprinting) extremely enhances nocistatin level of cerebrospinal fluid in adult rats. Life Sci, 74: 1993-7. 152. Ito S, Okuda-Ashitaka E, Minami T. (2001) Central and peripheral roles of prostaglandins in pain and their interactions with novel neuropeptides nociceptin and nocistatin. Neurosci Res, 41: 299-332. 153. Sundblad C, Eriksson E. (1997) Reduced extracellular levels of serotonin in the amygdala of androgenized female rats. Eur Neuropsychopharmacol, 7: 253-9. 154. Yakovleva T, Marinova Z, Kuzmin A, Seidah NG, Haroutunian V, Terenius L, Bakalkin G. (2007) Dysregulation of dynorphins in Alzheimer disease. Neurobiol Aging, 28: 1700-8. 155. Rees TM, Brimijoin S. (2003) The role of acetylcholinesterase in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Drugs Today (Barc), 39: 75-83. 156. Lorke DE, Hasan MY, Arafat K, Kuca K, Musilek K, Schmitt A, Petroianu GA. (2008) In vitro oxime protection of human red blood cell acetylcholinesterase inhibited by diisopropyl-fluorophosphate. J Appl Toxicol, 28: 422-9.

119

157. Petroianu GA, Nurulain SM, Nagelkerke N, Al-Sultan MA, Kuca K, Kassa J. (2006) Five oximes (K-27, K-33, K-48, BI-6 and methoxime) in comparison with pralidoxime: survival in rats exposed to the organophosphate paraoxon. J Appl Toxicol, 26: 262-8. 158. Lorke DE, Hasan MY, Nurulain SM, Kuca K, Schmitt A, Petroianu GA. (2008) Efficacy of two new asymmetric bispyridinium oximes (K-27 and K-48) in rats exposed to diisopropylfluorophosphate: comparison with pralidoxime, obidoxime, trimedoxime, methoxime, and HI-6. Clin Toxicol (Phila), 23: 1-7. 159. Lorke DE, Nurulain SM, Hasan MY, Kuca K, Musilek K, Petroianu GA. (2008) Eight new bispyridinium oximes in comparison with the conventional oximes pralidoxime and obidoxime: in vivo efficacy to protect from diisopropylfluorophosphate toxicity. J Appl Toxicol, 28: 920-8. 160. Tekes K, Hasan MY, Sheen R, Kuca K, Petroianu G, Ludányi K, Kalász H. (2006) High-performance liquid chromatographic determination of the plasma concentration of K-27, a novel oxime-type cholinesterase reactivator. J Chromatogr A, 1122: 84-7. 161. Lorke DE, Hasan MY, Nurulain SM, Sheen R, Kuca K, Petroianu GA. (2007) Entry of two new asymmetric bispyridinium oximes (K-27 and K-48) into the rat brain: comparison with obidoxime. J Appl Toxicol, 27: 482-90. 162. Lorke DE, Kalasz H, Petroianu GA, Tekes K. (2008) Entry of oximes into the brain: a review. Curr Med Chem, 15: 743-53. 163. Csermely T, Kalász H, Petroianu GA, Kuca K, Darvas F, Ludányi K, Mudhafar AA, Tekes K. (2008) Analysis of pyridinium aldoximes - a chromatographic approach. Curr Med Chem, 15: 2401-18. 164. Sakurada K, Matsubara K, Shimizu K, Shiono H, Seto Y, Tsuge K, Yoshino M, Sakai I, Mukoyama H, Takatori T. (2003) Pralidoxime iodide (2-pAM) penetrates across the blood-brain barrier. Neurochem Res, 28: 1401-7. 165. Bajgar J, Patocka J, Jakl A, Hrdina V. (1975) Antidotal therapy and changes of acetylcholinesterase activity following isopropyl methylphosphonofluoridate intoxication in mice. Acta Biol Med Ger, 34: 1049-55. 166. Kalasz H, Szoko E, Tabi T, Petroianu G.A., Lorke D.E., Omar A, Alafifi S, Jasem A, Tekes K. (2009) Analysis of pralidoxime in serum, brain and CSF of rats. Med Chem, 5: 237-241. 167. Armstead WM. (2002) Role of Nociceptin/Orphanin FQ in the physiologic and pathologic control of the cerebral circulation. Exp Biol Med, 227: 957-68. 168. Malinowska B, Godlewski G, Schlicker E. (2002) Function of nociceptin and opioid OP4 receptors in the regulation of the cardiovascular system. J Physiol Pharmacol, 53: 301-24. 169. Maslov LN, Krylatov AV, Lishmanov IuB, Berger H, Galo G, Ma L, Beyermann M, Solenkova NV, Stakheev DL. (2003) Role of ORL1 receptors in the regulation of cardiac resistance to arrhythmogenic effects. Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova, 89: 397-408. 170. Guo Z, Yao TP, Wang JP, Ding JY. (2008) Acute myocardial ischemia upregulates nociceptin/orphanin FQ in dorsal root ganglion and spinal cord of rats. Neurosci Lett, 433: 274-8. 171. Andoh T, Itoh M, Kuraishi Y. (1997) Nociceptin gene expression in rat dorsal root ganglia induced by peripheral inflammation. Neuroreport, 8: 2793-6.

120

172. Nelson RM, Calo G, Guerrini R, Hainsworth AH, Green AR, Lambert DG. (2000) Nociceptin/orphanin FQ inhibits ischaemia-induced glutamate efflux from rat cerebrocortical slices. Neuroreport, 11: 3689-92. 173. Rosen A, Lundberg T, Bytner B, Nylander I. (2000) Central changes in nociceptin dynorphin B and Met-enkephalin-Arg-Phe in different models of nociception. Brain Res, 857: 212-218. 174. Depner UB, Reinscheid RK, Takeshima H, Brune K, Zeilhofer H U. (2003) Normal sensitivity to acute pain, but increased inflammatory hyperalgesia in mice lacking the nociceptin precursor polypeptide or the nociceptin receptor. Eur J Neurosci, 17: 2381-2387. 175. Rasmussen A, Christensen J, Clemmensen PM, Dalsgaard NJ, Dam H, Hindberg I, Lunde M, Plenge P, Mellerup E. (2003) Platelet serotonin transporter in stroke patients. Acta Neurol Scand, 107: 150-153. 176. Rasmussen A, Lunde M, Poulsen DL, Sorensen K, Qvitzau S, Bech P. (2003) A double-Blind, placebo-controlled study of Sertraline in the prevention of depression in stroke patients. Psychosomatics, 44: 216-221. 177. Lutsep HL. (2005) Repinotan, a 5-HT1A agonist, in the treatment of acute ischemic stroke. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 4: 119-120. 178. Anderson CS, Hackett M L, House AO. (2004) Interventions for preventing depression after stroke. Cochrane Database Syst Rev, 2: CD003689.

121

10 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés témájában megjelent közlemények 1. Tekes K, Gyenge M, Sótonyi P, Csaba G. (2009) Effect of neonatal nociceptin or nocistatin imprinting on the brain concentration of biogenic amines and their metabolites. Brain&Development, 31: 282-7. IF: 1,464 2. Tekes K, Gyenge M, Hantos M, Csaba G. (2007) Effect of ß-endorphin imprinting during late pregnancy on the brain serotonin and plasma nocistatin levels of adult male rats. Horm Metab Res, 39: 479-481. IF: 2,254 3. Gyenge M, Kalasz H, Petroianu GA, Laufer R, Kuca K, Tekes K. (2007) Measurment of K27, an oxime-type cholinesterase reactivator by highperformance liquid chromatography with electrochemical detection from different biological samples. J Chromatogr A, 1161: 146-151. IF: 3,641 4. Tekes K, Hantos M, Gyenge M, Csaba G. (2007) Perinatal alcohol exposure enhances nocistatin levels in adulthood. Addict Biol, 12: 173-175. IF: 2,833 5. Tekes K, Hantos M, Gyenge M, Karabélyos Cs, Csaba G. (2006) Prolonged effect of stress at weaning on the brain serotonin metabolism and sexuality of female rats. Horm Metab Res, 38: 799-802. IF: 1,997 6. Gyenge M, Hantos M, Laufer R, Tekes K. (2006) Effect of nociceptin on histamine and serotonin release in the central nervous system. Acta Pharm Hung, 76: 127-32. 7. Tekes K, Hantos M, Bator G, Gyenge M, Laufer R, Folyovich A. (2006) Endogenous nociceptin level in ischemic stroke: connection to serotonin system. Neuropsychopharmacol Hung, 8: 53-59. 8. Tekes K, Hantos M, Bizderi B, Gyenge M, Kecskemeti V, Huszti ZS. (2006) Nociceptin induced histamine release in the brain: comparison with compound 48/80-and substance P induced amine secretion. Inflamm Res, 55: 30-31. 9. Tekes K, Hantos M, Bizderi B, Gyenge M, Kecskemeti V, Huszti ZS. (2005) Stimulating effect of nociceptin on histamine release in the rat brain? Inflamm Res, 54: 38-39.

122

10. Tekes K, Hantos M, Gyenge M, Bizderi B, Kecskemeti V. (2005) Diabetes and endogenous orphanin FQ/nociceptin levels in rat CSF and plasma. Int J Diabetes Metabol, 13: 147-153. 11. Gyenge M, Bátor Gy, Hantos M, Bizderi B, Tekes K. (2005) A nociceptinerg és a hisztaminerg rendszer kapcsolatának vizsgálata hím Wistar patkányokon. Orvostudományi Értesítő (EME), 78: 61-65.

Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó közlemények 1. Tekes K, Gyenge M, Hantos M, Csaba G. (2008) Transgenerational hormonal imprinting caused by vitamin A and vitamin D treatment of newborn rats. Alterations in the biogenic amine contents of the adult brain. Brain Dev, (in press). IF: 1,464 2. Tekes K, Gyenge M, Folyovich A, Csaba G. (2009) Influence of neonatal vitamin A or vitamin D treatment on the concentration of biogenic amines and their metabolites in the adult rat brain. Horm Metab Res, 41: 277-80. IF: 2,254 3. Tekes K, Gyenge M, Laufer R, Hantos M. (2007) Gyógyszerkészítmények. Gyógyszerésztovábbképzés, 1: 29-32.

Nazális

4. Tekes K, Gyenge M, Bizderi B, Bátor Gy, Hantos M. (2005) A fejfájásról. Gyógyszerészet, 49: 541-546.

123

11 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik doktori disszertációm elkészültéhez hozzájárultak, valamint a dolgozat alapját képező kísérletek elvégzésében támogattak, segítettek. Elsőként szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Tekes Kornéliának, aki szakmai irányításával támogatott, értékes tanácsaival segítette munkámat. Köszönöm azt a rengeteg értékes gyakorlati és elméleti tudást, amit átadott nekem. Nemcsak szakmailag, emberileg is nagyon sokat tanultam tőle. Dr. Török Tamás professzor úrnak, intézetvezetőnek köszönöm az önzetlen anyagi és emberi segítséget, amelyek lehetővé tették a doktori munkám befejezését. Köszönettel tartozom Dr. Magyar Kálmán professzor úrnak, programvezetőmnek a szakmai és emberformáló beszélgetésekért. Köszönettel tartozom Dr. Csaba György professzor úrnak az imprintinges kísérletek mintáiért, valamint az értékes szakmai tanácsokért. Dr. Folyovich András főorvos úrnak köszönettel tartozom az ischémiás betegek vérmintáiért. Köszönettel tartozom Dr. Huszti Zsuzsannának a hisztaminos kísérletekben nyújtott nélkülözhetetlen segítségéért, hasznos szakmai és személyes tanácsaiért. A folyadékkromatográfiás kísérleti módszerek elsajátításában nyújtott nélkülözhetetlen segítségükért és értékes tanácsaikért köszönettel tartozom Dr. Kalász Huba professzor úrnak és Dr. Lengyel József tudományos munkatársnak. Köszönettel tartozom Dr. Laufer Rudolf és Szegi Péter PhD hallgató kollégáimnak az állatkísérletes és kromatográfiás vizsgálatokban nyújtott segítségükért és a baráti támogatásért. A kísérleti módszerek elsajátításában és elvégzésében nyújtott nélkülözhetetlen és kiváló technikai segítségért, valamint a családias és baráti légkörért köszönettel tartozom Divikiné Gúth Györgyikének, Fejes Évának és Dr. Csaba Györgynének. Hálával

tartozom

a

Gyógyszerhatástani

barátságukért és támogatásukért.

124

Intézet

valamennyi

munkatársának

Végül, de nem utolsó sorban szeretnék köszönetet mondani családomnak, barátaimnak kitartó türelmükért és támogatásukért a kutatómunkám és disszertációm megírásának időszaka alatt.

125