A nociceptinerg rendszer változása hepatológiai kórképekben, különös tekintettel a hepatocelluláris carcinomára

SEMMELWEIS EGYETEM

GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

A nociceptinerg rendszer változása hepatológiai kórképekben, különös tekintettel a hepatocelluláris carcinomára

Doktori (Ph.D.) értekezés

DR. HORVÁTH ANDREA

Témavezeto: Dr. Szalay Ferenc, Ph.D.

Semmelweis Egyetem, I. sz. Belgyógyászati Klinika

Budapest, 2005.

1

Szigorlati Bizottság: Elnök:

Prof. Dr. Papp János Ph.D.

Tagok:

Dr. Tímár Júlia Ph. D.

Dr. Horváth Gábor Ph.D.

Hivatalos Bírálók: Dr. Werling Klára Ph.D. Dr. Szalai László Ph.D.

2

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

........................................................................................................5

I.

BEVEZETÉS

........................................................................................................7

II.

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

........................................................................................................9

A.

a nociceptin és receptora..........................................................................................9 1. A nociceptin és a nociceptin-receptor elnevezése ...................................................9 2. A NOP receptor .......................................................................................................9 3. A NOP receptor ligandjai (nociceptin, nocistatin, nociceptin II, exogén ligandok) ................................................................................................................11 4. A nociceptin intracelluláris jelátviteli mechanizmusai..........................................15 5. A nociceptin metabolizmusa és bioaktív metabolitjai...........................................17 B. A nociceptin neurokémiai hatásai..........................................................................18 1. Központi idegrendszeri hatások.............................................................................18 2. Perifériás hatások ...................................................................................................20 C. A nociceptin farmakológiai hatásai .......................................................................20 1. Központi idegrendszeri hatások.............................................................................20 2. A nociceptin perifériás hatásai...............................................................................25 D. A nociceptinerg rendszer klinikai vonatkozásai: humán vizsgálatok ....................30 1. Fibromyalgia ..........................................................................................................30 2. A nociceptinerg rendszer jellemzése különbözo fájdalommal járó betegségekben........................................................................................................30 E. A non-nociceptinerg opioid rendszer és a májbetegségek kapcsolata ...................33 F. A hepatocelluláris carcinoma ................................................................................34 III.

A. B. IV.

CÉLKITUZÉSEK

..................................................................................................... 37

Humán vizsgálatok ................................................................................................37 Experimentális hepatocelluláris carcinoma modell ..............................................38 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

..................................................................................................... 39

A.

HUMÁN VIZSGÁLATOK ...................................................................................39 1. Kontroll csoport .....................................................................................................39 2. Beteg csoport .........................................................................................................39 3. Stádiumbeosztás ....................................................................................................41 B. KÍSÉRLETES ÁLLATMODELL .........................................................................42 1. Májcirrhosis és hepatocelluláris carcinoma modell Fischer-344 patkányokon.....42 2. Vér, liquor, és májszövet mintavétel .....................................................................43 3. Laboratóriumi paraméterek ...................................................................................43 4. Szövettani feldolgozás ...........................................................................................43 C. Mérési módszerek: Plazma, CSF, májszövet nociceptin és nocistatin tartalmának meghatározása radioimmunoassay segítségével....................................................43 1. Mintavétel, elotisztítás, és extrakció......................................................................43 2. Szöveti nociceptin és nocistatin meghatározás ......................................................44 3. Májszövet...............................................................................................................44 4. Ascites nociceptin szintjének vizsgálata................................................................44 D. Extrakció ................................................................................................................44 E. A radioimmunoassay módszer leírása ...................................................................45 F. Statisztikai analízis ................................................................................................45

3

V.

EREDMÉNYEK

A. B.

C. D. E. F. G. VI.

A. B.

C. D. E. F. G. VII.

..................................................................................................... 47

Plazma nociceptinszint vizsgálatok krónikus májbetegekben...............................47 ESETISMERTETÉS: Primer biliáris cirrhosis talaján kialakult hepatocelluláris carcinoma; plazma nociceptin szint követése a daganat kialakulásával párhuzamosan ........................................................................................................51 Hepatocelluláris carcinoma és cirrhosis modell Fischer-344 patkányban.............54 a nocistatin szint kísérletes hepatocelluláris carcinomában...................................61 A nociceptin tartalom vizsgálata humán daganatos májszövetben és az azt körülvevo nem daganatos májszövetben ...............................................................62 Nociceptin szintje különbözo etiológiájú daganatokban.......................................64 A nociceptintartalom kimutatása ascitesben..........................................................65 MEGBESZÉLÉS

..................................................................................................... 67

Plazma nociceptin szint vizsgálatok hepatológiai kórképekben............................67 Primer biliáris cirrhosis talaján kialakult hepatocelluláris carcinoma: a plazma nociceptin szint követése a daganat kialakulásával párhuzamosan: az eset megbeszélése .........................................................................................................69 Kísérletes májcirrhosis és hepatocelluláris carcinoma ..........................................70 a nocistatin szint kísérletes hepatocelluláris carcinomában...................................73 A nociceptin tartalom vizsgálata humán daganatos májszövetben és az azt körülvevo nem daganatos májszövetben ...............................................................73 Extrahepatikus daganatok és májmetasztázisok ....................................................73 nociceptintartalom kimutatása ascitesben..............................................................74 KONKLÚZIÓ

..................................................................................................... 75

VIII. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ..................................................................................................... 76 IX.

ÖSSZEFOGLALÓ

..................................................................................................... 78

X.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

..................................................................................................... 84

4

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

5HT

szerotonin

Ach

acetilkolin

APN

aminopeptidáz N

Ca

kalcium

cAMP

ciklikus adenozil- monofoszfát

CHO

tengerimalac petefészeksejtek

CRF

kortikotropin releasing faktor

DA

dopamin

EDTA

ethylén-diamin- tetraacetát

EFS

elektromos terület stimuláció

EGFR

epidermális növekedési faktor receptor

EP

endopeptidáz

ERK

extracelluláris jel mediált kináz

GABA

gamma-amino- vajsav

GPRC

G proteinhez kapcsolt receptor

HCC

hepatocelluláris cacinoma

i.c.v.

intracerebroventrikuláris

JNK

c-jun NH2-terminális kináz

K

kálium

LTP

tartós potenciáció

MAPK

mitogén aktivált protein kináz

mRNS

messenger ribonukleinsav

NF?-B

nukleár faktor kappa B

N/OFQ

nociceptin/orphanin FQ

NA

noradrenalin

NCAM

idegsejt adhéziós molekula

NMDA

N-metil- D-aszpartát

NOP

nociceptin receptor

NPY

neuropeptid Y

NT

nocistatin

5

ORL1

opioid receptor- like 1 receptor

PAG

periaqueductalis szürkeállomány

PKC

protein kináz C

PLC

foszfolipáz C

ppN/OFQ

prepronociceptin

PTX

pertussis toxin

RT-PCR

real-time polimeráz láncreakció

SP

substance P

STAT

signalling

transductor

and

transcription TGFa

transforming growth faktor alfa

TH

tyrozin- hidroxiláz

TM

tuberomamillaris

6

activation

of

I.

BEVEZETÉS

M

ég nincs tíz éve (1995), hogy a nociceptint (N/OFQ) és receptorát (NOP), mint az opioid peptid család egy új tagját elsoként leírták. 1, 2 A peptid az eltelt idoben

a farmakológiai kutatások homlokterébe került. Ma már számos központi idegrendszeri és perifériás hatása ismert, és továbbra is kiterjedt kutatás folyik szerepének élettani és kórtani körülmények közötti megismerése, valamint farmakológiai jelentoségének tisztázására. A nociceptin a nevét, a fájdalomérzetet befolyásoló tulajdonságáról kapta. 3 A nociceptin egy 17 aminosavból álló polipeptid, amely szerkezetében leginkább a dinorfin-A- hoz hasonlít. A nagy hasonlóság ellenére a nociceptinben, a többi opioid peptidtol eltéroen, az elso helyen tirozin helyett fenilalanin található. Hasonlóság mutatkozik még a C-terminálison lévo 16.-17. aminosavig terjedo szakaszban, amelynek azonban a receptoraktivációban nincs szerepe. A szerkezeti egyezések ellenére a nociceptin nem kötodik a klasszikus ? -, ? -, és ?- opioid receptorokhoz.2 A pre-pronociceptinbol (ppN/OFQ) enzimatikus hasítással képzodik a központi idegrendszerben és a periférián egyaránt. Ebbol a 176 aminosavat tartalmazó polipeptidbol a nociceptinen kívül több biológiailag aktív neuropeptid, mint a nocistatin és a nociceptin II hasad le, amelyek nem a NOP receptoron, hanem saját receptoraikon fejtik ki hatásukat. 4 A pre-pronociceptin génje emberben a 8. kromoszómán, a 8p21 régióban található. 5 A nociceptin receptora az állatkísérletes adatokkal egyezoen18 számos humán idegrendszeri struktúrában megtalálható. Szerepet tulajdonítanak a nociceptinnek a stresszhatás kapcsán fellépo vegatatív és viselkedési reakciókban, a szorongás és a stressz érzelmi komponenseinek összehangolásában, vegetatív funkciók szabályozásában, mint az artériás vérnyomás, a szívfrekvencia, a légzés és az endokrin szabályozá s, a figyelem, a tanulás, és a memóriafunkciók, a fájdalomérzés, és a hypothalamo- hypophyseális rendszer muködésének szabályozásában. A hepatocelluláris carcinoma (HCC) a leggyakoribb primer májdaganat, amely foként a krónikus májcirrhosis szövodményeként alakul ki. Évente a világon több mint 500.0000 új esetet regisztrálnak. Két és félszer annyi férfi lesz májdaganatos, mint no. Az esetek gyakorisága évrol-évre no, és földrajzi és nemi megoszlásokat mutat. 6, 7 A fo kockázati tényezok a hepatitis B és C vírusok, az alkohol, az aflatoxin, az orális antikoncipiensek, a dohányzás mellett számos úgy nevezett „minor” kockázati tényezo

7

is szerepel, mint az öröklodo anyagcserezavarok, étkezési szokások és kemikáliák (arzén). A HCC szurése az egész világon kulcsfontosságú, annak ellenére, hogy nem áll rendelkezésünkre egyetlen 100%- ig specifikus és szenzitív módszer sem. A szérum alfa- fetoprotein egy olyan markere a HCC-nek, amelynek szenzitivitása 39-65%, specificitása 76-94%, a pozitív prediktív értéke pedig 9-50%. 8, 9 Bár a nociceptint már tíz éve felfedezték, és a farmakológiai kutatások száma nagy, a klinikai kutatások száma csekély. A Semmelweis Egyetem Gyógyszerhatástani Intézete és az I. sz. Belgyógyászati Klinika kutatócsoportja bebizonyította, hogy Wilson kórban emelkedett a nociceptin szint. A kutatások azon fázisába kapcsolódtam be, amikor egy Wilson kóros betegben kiugróan magas plazma nociceptin szintet mértünk. Késobb igazolódott a beteg hepatocelluláris carcinomája.

Célunk primer hepatocelluláris

carcinomában, illetve egyéb hepatológiai betegségekben a nociceptinerg rendszer vizsgálata volt. Továbbá kísérletesen létrehozott hepatocelluláris carcinoma modellen kívántuk vizsgálni a plazma, liquor, agy és májszövet nociceptin tartalmát. Módszert dolgoztunk

ki

különbözo

májból,

valamint

ascitesbol

történo

nociceptin

meghatározásra. Humán hepatocelluláris carcinoma szövetben, valamint azt körülvevo cirrhotikus részben mértük meg a nociceptintartalmat.

8

II.

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

A.

A NOCICEPTIN ÉS RECEPTORA

1.

A nociceptin és a nociceptin-receptor elnevezése

A klasszikus opioid receptorokkal nagy homológiát mutató új receptort ORL1-nek26 (opioid-receptor- like 1) késobb OP4-nek nevezték el. 10 A nociceptin-receptor szerkezete és transzdukciós mechanizmusa alapján az opioid receptorcsalád új, negyedik tagjának tartották. A klasszikus nem szelektív opioid receptor ligandok (pl. naloxon) alacsony affinitást mutatnak az ORL1 receptorhoz, ugyanakkor rendkívül nagy affinitással kötodnek a ? -, ?-, ?-, receptorokhoz. Az orphan, azaz árva nevet ez alapján a tulajdonsága alapján kapta. Maga a ligand, a nociceptin is számos nevet kapott az eltelt bo tíz évben: nociceptin (NC, Noc, Noci), orphaninFQ receptor nevet (OFQR, NOR hasonlóan a klasszikus opioid receptorokhoz MOR, DOR, és KOR). Ezt követoen a IUPHAR 2000. évi nevezéktan jelentésében a receptor az NOP (nociceptin-receptor) és az N/OFQ (nociceptin) elnevezést kapta.

2.

A NOP receptor

A NOP receptor génje a humán 20. kromoszóma q13.2-13.3 régiójában található.1 A 370 aminosavból álló fehérje 7 hidrofób, egyenként 23-25 aminosavból álló transzmembrán domént tartalmaz, amelyet intra- és extracelluláris variábilis régiók kapcsolnak össze. Három aszparaginhez kötött glikolizációs hely található az Nterminális régióban (Asn21 , Asn28 , Asn39 ), cisztein residuumok az extracelluláris hurkon (Cys123 , Cys 200 ), és potenciális acilációs helyek a C-terminális intracelluláris régióban (Cys324 ). (1. ábra) A többi opioid receptor a transzmembrán doménekben és az intracelluláris hurkokban mutat hasonlóságot a NOP-pal. A szekvenciaazonosság az NOP, a ? -, ?-, és ? -opioid receptorok között igen magas (63-65%-os homológia). 11

9

Q286: köti a nociceptint, de f unkcionálisan inaktív

NH2

S-S

P

P

P P

P

N133W: folyamatosan aktiválja az ORL1 receptort

A216K, T3051I és VQV (279 281)IHI : köti a nociceptint és a dinorfin A-t

Asp 130,Tyr131, Phe220, Phe224 és Trp276 : a ligand köto régióban vannak

P

P

P

COOH

1.ábra A NOP receptor szerkezete (New et al.)

Az immunhisztokémiai vizsgálatok eredménye szerint a NOP receptor megtalálható a központi idegrendszeri szabályozó rendszer szinte valamennyi magcsoportjában, így az adrenerg/noradrenerg, kolinerg, dopaminerg, szerotonerg magcsoportokban. A NOP receptor és mRNS-e nagy koncentrációban van jelen az adrenerg rendszer részét képezo locus coeruleus területén. Mivel a locus coeruleus összetett feladatokat lát el az agyban, ezért feltételezhetoen a nociceptinerg rendszernek is szerepe van számos, a stresszhatás kapcsán fellépo vegetatív és viselkedési reakcióban. A nociceptin nagy mennyiségben van jelen az amygdalában, a septohippocampalis régióban, a thalamicus és a hypothalamicus magvakban, valamint a paraventricularis hypothalamusban12, 13 . Ezek a területek részt vesznek a félelem, a szorongás és a stressz érzelmi komponenseinek összehangolásában. A NOP receptor szintén nagy koncentrációban kimutatható nucleus tractus solitarii-ban és az oldalsó retikuláris magcsoport területén. Ezek a magcsoportok olyan vegetatív funkciók szabályozásában vesznek részt, mint az artériás vérnyomás, a szívfrekvencia, a légzés és az endokrin szabályozás. 14 A NOP receptorok megtalálhatók az elülso bazális kolinerg complexben, a telenkefalon és a tegmentális magcsoportok területén. A kolinerg neuronok kapcsolatban állnak a kérgi területekkel a hippocampusszal, a thalamus-szal, és az agytörzsi területekkel, amelyek a figyelem, a tanulás, és a

10

memóriafunkciók szabályozásában vesznek részt. Ezen kívül jelen vannak a szintén kolinerg rostokat tartalmazó retina amakrin sejtjein. 15 A NOP receptor mRNS expressziója a substancia nigra területén azt mutatja, hogy a nociceptin hatással van a mozgáskoordinációt szabályozó nigro-striatralis dopaminerg rendszerre. A NOP receptor jelenléte a ventrális-tegmentális area területén arra utal, hogy a nociceptinerg rendszer befolyásolja a mezokortikolimbikus rendszeren keresztül a motivációt, a hangulatot, és a gondolkodást. 16 A raphe magvak a központi idegrendszeri szerotonin szintézis helyei, ahol szintén nagy mennyiségben megtalálhatóak a NOP receptorok és a receptor mRNS is. A nociceptin a raphe magvak területén a K+-áram fokozásán keresztül gátolja a neuronális aktivitást. 17 A nociceptin jelen van a nucleus raphe magnusban, így a szerotonerg rendszerre (raphe- magvak) hatva a fájdalomérzés supraspinalis kontrolljában tölt be szerepet. 18 A NOP receptor aktiváció mutatkozik a kérgi szerotonin felszabadulás legfontosabb preszinaptikus modulátorának. 19 A gerincvelo

hátsó

szarvának

valamennyi

rétegében

reprezentált,

legnagyobb

mennyiségben a II. laminában; elsosorban az interneuronokban van jelen. A NOP receptor központi idegrendszeri eloszlása alapján feltételezheto volt, hogy ligandjai a fájdalomérzet kialakulására, a tanulásra, az emlékezésre, a figyelemre, az érzelmekre, a mozgásra, a szimpatikus, paraszimpatikus és érzo neuronokra, valamint a hypothalamo-hypophyseális tengely muködésére egyaránt hatással lehetnek. A NOP receptor jelenléte bizonyított a perifériás idegrendszer mellett a különbözo perifériás szövetekben is. Azonosították patkány bélen174 , egér vas defferensen20 , tengerimalac gyomor-bél traktusában, májában21 . RT-PCR-al igazolták jelenlétét a tengerimalac idegdúcaiban, mint a prevertebrális és paravertebrális szimpatikus idegdúcokban, valamint a nyaki idegdúcokban. A receptorkötési vizsgálatok alapján a nociceptin nagy affinitással kötodik patkány retinán15 és szíven22 . Humán vizsgálatok, és állatkísérletek is kimutatták perifériás szövetekben is: a belekben, vas deferens-ben, a lépben, a májban valamint a limphocytákban. 23, 24, 25

3.

A NOP receptor ligandjai (nociceptin, nocistatin, nociceptin II, exogén ligandok)

Az opioid receptor család negyedik tagjának a felfedezése óriási lökést adott az opioidok kutatásának. Az új G-proteinhez kapcsolt receptor egyértelmuen az opioid

11

receptorokhoz hasonlított, de nem kötötte meg az opiátokat hasonló affinitással, mint a többi receptor. 26 Egy évvel késobb két egymástól független kutatócsoport azonosította az új receptor ligandját, a 17 aminosavból álló neuropeptidet, amelyet az egyik kutatócsoport nociceptinnek2 , a másik pedig orphanin FQ-nak nevezett el. 27 Így az agyi opiátoknak ma öt csoportját ismerjük: dinorfinok, endomorfinok, enkephalinok, bétaendorfinok és a nociceptin. A N/OFQ a 176 aminosavból álló prekurzor molekulából a pre-pronociceptinbol (ppN/OFQ) hasad le, amelynek génje a 8. kromoszóma 8p21 régiójában található.5

Prekurzor K R

98-132

98-132

K

135-151

K R

R

154-170

K

181

R

Peptidek Nocistatin

98-132 135-151

N/OFQ

154-170

OFQ II (1-17) OFQ II (1-28)

154-181

2. ábra A prepronociceptin és hasítási termékei.

A többi prekurzor molekulához hasonlóan a ppN/OFQ a nociceptinen kívül egyéb biológiailag aktív peptidet is tartalmaz, mint a nocistatin (NT) és a nociceptin II (N/OFQII). A ppN/OFQ mRNS központi idegrendszeri eloszlása nagyon hasonló a NOP eloszlásához. 5 Mindketto az agy legtöbb régiójában megtalálható, kivéve a kisagyban. A nociceptin jelentos mennyisége a paraventricularis hypothalamusban (mint a corticotropin-releasig faktor (CRF) forrása), arra utal, hogy a nociceptin a hypothalamo-hypophyseális rendszer muködésének is szabályozója. A cAMP analógok indukálják a ppN/OFQ gén expresszióját, a fehérje szintézisét és szekrécióját NS20Y neuroblastoma sejtvonalon. 28

12

1. táblázat Az immunreaktív nociceptin mennyisége különbözo agyi régiókban (Witta és munkatársai 2004) Régió

N/OFQ fmol/mg

Régió

átlag ± SEM

N/OFQ fmol/mg átlag ± SEM

Cortex

Basális magok

Prefrontális

10.6 ± 0.92

Nucleus caudatus

4.83 ± 0.46

Frontális

7.95 ± 2.21

Putamen

4.48 ± 0.86

Cingulum

11.39 ± 0.74

Globus pallidus

2.2 ± 0.43

Parahippocampus

4.87 ± 0.93

Substantia nigra

7.93 ± 0.75

Insula

10.94 ± 1.31

Somotomotoros

7 ± 0.84

Thalamus

Somatosensoros

8.99 ± 0.82

Nucleus thalamus anterior

10.89 ± 4.46

Temporális

7.39 ± 2.29

Dorsomediális

8.78 ± 2.4

Occipitális

5.9 ± 0.55

Ventrális

4.02 ± 0.79

Fehérállomány

0.72 ± 0.2

Pulvinar

8.3 ± 2.02

Laterális

7.3 ± 2.92

Mediális

12.63 ± 6.77

Limbikus rendszer Hippocampus

7.69 ± 1.3

Habenula

4.41 ± 1.2

Hypothalamus

Septum

30.26 ± 6.76

Anterior/preoptikus

27.97 ± 4.83

Amygdala

15.05 ± 2.44

Supraoptikus

10.27 ± 4.72

paraventrikuláris

26.56 ± 4.3

Ventromediális

37.39 ± 9.83

Cerebellum Cortex

1.94 ± 0.23

Magok

0.91 ± 0.1

Agytörzs

Fehérállomány

0.61 ± 0.12

Nucleus ruber

3.61 ± 0.88

Nucleus pontin

1.66 ± 0.18

Pontine tegmentum

23.27 ± 2.89

Hátsó szarv

30.22 ± 9.24

Locus coeruleus

41.06 ± 16.11

Elülso szarv

6.75 ± 0.95

Retikulum

14.86 ± 3.82

Szürkeállomány

21.25 ± 10.22

Trigeminus nucleus

20.14 ± 4.13

Funiculus

0.47 ± 0.04

Ventromedulláris medulla

10.68

Gerincvelo

Fontos szerepet tulajdonítanak a nociceptinnek az akut stresszre adott válasz endogén szabályozásában29 , miután más fontos „stressz” neuropeptidek hatásának összehangolásában is részt vesz, mint a CRF, a cholecystokinin (CCK), a neuropeptid Y (NPY), és a supstance P (SP) esetében bizonyított. 30 A nocistatin a nociceptin antagonistájának bizonyult, de kimutatták, hogy a nociceptin II egyes hatásait is antagonizálja. Míg a nociceptin a legtöbb fajban azonos aminosavszerkezetu, addig a nocistatin szerkezete minden fajban más és más. Egyedül a karboxiterminális hexapeptid orzi a közös eredet nyomait, és felelos a központi

13

idegrendszeri hatásért. Az opioid peptidek rendelkeznek az N-terminális régióban egy motívummal (Tyr-Gly-Gly-Phe), amelyben elhelyezkedo tirozin felelos a receptorhoz kötodésért31,

32

. Ezeket a konzervatív régiókat a nociceptinben a dynorphin-A rokon

régióira cserélve, az új vegyület elveszíti a NOP köto képességét, de képes lesz aktiválni a ?- és ?-opioid receptorokat.

33

Bár a NOP receptor sok konzervatív régióval

rendelkezik, még sem található meg benne a hagyományos „opioid-köto zseb”, amely a többi opioid receptor ekvivalens helyén a ligand kötéséért felelos. Okuda-Ashitaka írta le eloször, hogy a nocistatin (NT) kis dózisban antagonizálja a nociceptin hatásait, nagy dózisban azonban nem. 34 Humán vizsgálatok igazolták az NT jelenlétét az agyszövetben, a liquorban. 35 A nocistatin a cAMP termelés fokozásával fejti ki hatását, az eddig még részletesen fel nem térképezett nocistatin receptoron keresztül. 36 Inoue és munkatársai megállapították, hogy mind a nocistatin, mind a nociceptin közös intracelluláris jelátviteli utakat aktivál Gi/o , foszfolipáz C és substance P felszabadításával a kapszaicin érzékeny I-típusú C-rostokon. 37 A nocistatin tompítja a gátló GABAerg és glycerinerg interneuronokat a hátsó szarvban, ahol a N/OFQ gátolja a glutamáterg szinaptikus transzmissziót. 38 Mogil egy összefoglaló közleményben az addigi eredmények részletes elemzése után, feltételezte, hogy a krónikus fájdalom fokozott nocistatin termeléssel jár a gerincvelo hátsó szarvában. 39 A nociceptin II (azonos a bPNP-4-vel) a prepronociceptinbol lehasadó szintén 17 aminosavból álló polipeptid. Kevés kutatócsoport foglalkozott még ezzel a heptadekapeptiddel, az eredmények ellentmondásosak. Dózisfüggo analgéziát hoz létre mind spinális, mind supraspinalis alkalmazás után. 40 Japán kutatók megfigyelték, hogy a nociceptin II nocistatinszeru tulajdonságokat hordoz spinálisan injektálva, ugyanakkor spinális adogolásával nem lehet analgéziát kiváltani. 41 A NOP receptor farmakológiai ligandjait két nagy csoportra bonthatjuk: peptid és nem peptid ligandokra. A 17 aminosavból álló N/OFQ legjobban a dynorphin A- hoz hasonlít. Az N-terminális aminosav, amelyben különbözik a többi általános opioidtól, a fenilalanin (a tirozin helyett). Ez a különbség elég ahhoz, hogy ne tudjon a klasszikus opioid receptorokhoz kötodni. Varani és munkatársai kimutatták, hogy a fenilalanint tirozinra cserélve visszanyeri azt a képességét, hogy kapcsolódjon a ?-, µ- és a d-opioid receptorokhoz. 42 A C-terminális amidálása megorzi a vegyület eredeti funkcióját és affinitását. A kezdeti kutatások kimutatták, hogy a legkisebb aktív aminosavrészlet a C-

14

terminális négy aminosav, bár a N/OFQ(1-13)OH már elveszíti a receptor affinitását és kevésbé eros.

4.

A nociceptin intracelluláris jelátviteli mechanizmusai

Bebizonyították, hogy a NOP receptor a többi opioid receptor szubtípushoz hasonlóan Gi/o -proteinhez

kapcsolódik,

amely

adenyl

ciklázt,

befelé

irányuló

K+-

és

feszültségfüggo Ca2+-csatornákat aktivál. Amikor a nociceptin és a többi opioid receptor intracelluláris jelátviteli mechanizmusait összehasonlították, egy különös paradox jelenséget figyeltek meg: a N/OFQ gyakran közömbösíti az opioidok hatását, bár látszólag ugyanazon a szignál-transzdukciós úton hat. A magyarázatot erre a kérdésre többek között az adhatja, hogy a NOP és többi opio id receptor az idegrendszer különbözo régióiban helyezkedik el, és a neuronális hálózat más- más lépését befolyásolja 43 , más neuron csoportokat

44, 45, 46

aktivál a fájdalom szabályozásában.

Adenyl cikláz A NOP kapcsolódik a másodlagos jelátviteli rendszerhez, az adenyl ciklázhoz. A NOP receptorral fertozött CHO és a HEK-293 sejtekben a nociceptin gátolja a forskolin stimulálta cAMP akkumulációt. 47,

48

Foszfolipáz C/Ca 2+ A NOP receptor aktivációja a foszfolipáz C/Ca2+/protein kináz C (PKC) intracelluláris jelátviteli rendszert hozza muködésbe. A PKC aktivációját a CHO sejteken figyelték meg, amelyek stabilan expresszálják a NOP receptort. A válasz PTX (pertussis toxin) szenszitív és gátolható a PKC inhibitorokkal, Ca2+-chelátorokkal és a foszfolipáz C (PLC) inhibitorokkal. 49 Ez a receptor aktiválási mintázat hasonlít az opioid receptoroknál

megfigyelheto

aktivációjához50,

51

Gß?-alegység

által

létrehozott

PLC ß -egység

, bár ennek az alegységnek a szerepét a nociceptin aktivációjában

még nem bizonyították. A PLC ß stimulációjának szerepe még nem egyértelmu a nociceptinerg rendszer muködésében, bár néhány tanulmány igazolta, hogy a nociceptin által generált PKC aktiváció fokozott szuperoxid képzodéséhez vezet, amely károsítja a sertés piális artériáit hypoxia/ischemia után. 52 A Ga16 és Ga14 alegységek számos Gikapcsolt GPCR-val (G-protein coupled receptor) lépnek interakcióba, lehetové téve, hogy azok aktiválják a PLCß jelátviteli rendszert.

15

MAPK (mitogén aktivált protein kináz) jelátviteli rendszererek A GPCR a sejt proliferációt és differenciációt szabályozza MAPK rendszer által. Ezek a szerin/treonin protein kinázok számos transzkripciós faktort képesek foszforilálni.53 Legalább 3 MAPK szubtípust ismerünk: az extracelluláris–szignál-regulált kinázok (ERK), amelyeket foként a növekedési faktorok stimulálnak, a c-Jun NH2-terminális kinázok (JNK), és a p38 MAP kinázok, amelyek a celluláris stresszhatásokra érzékenyek. 54,

55

A N/OFQ stimulációja az NOP receptor expressziójához, amely az

ERK indukciója által (PTX-szenzitív mechanizmus) az Elk-1 és a Sap1a transzkripciós faktorok aktiválásához vezet. 56 Ezt a folyamatot gátolni lehet a PKC és a foszfolipáz C inhibíciójával57, 58 , ami azt feltételezi, hogy p21ras-független utak közvetítik a választ. Feltételezik, hogy a Gß?-alegység aktiválja ezt a folyamatot a PI3K/Src/SOS/p21ras jelátviteli rendszeren keresztül. A STAT (signalling transducer and activator of transcription) proteinek számos cytokin, növekedési faktor és hormon mediátorai, és olyan immunológiai folyamatokat befolyásolnak, mint a sejtproliferáció, az apoptosis, és a differenciá lódás. Kimutatták, hogy a nociceptin rendelkezik a neuronális differenciációt befolyásoló képességgel. 59 Az opioid receptorok is aktiválják a MAPK utat, de a többi opioid receptorral ellentétben számos szembetuno különbség van a szabályozásban. Mindhárom opioid receptor a Gß?-függo úton aktiválja a NOP receptort. A nociceptin parciálisan gátolja az N-típusú Ca2+-csatornákat60 , de a N/OFQ esetében az ERK aktivációja részlegesen függ a PLC aktivációjától. A jelátviteli mintázatban található eltérés a Gi/o -kapcsolt receptoroknál figyelheto meg, amely magyarázatot adhat a nociceptin és a többi opioid eltéro in vivo hatásaira. Bár ezeknek a mechanizmusoknak a lényegét még nehéz fiziológiai funkciókra fordítani, de így is belátható, hogy a nociceptin gátolja a többi opioid hatását molekuláris szinten. Feszültség-függo Ca 2+ csatornák Az humán neuroblastoma sejtvonalon, amely endogén módon expresszálja a NOP receptort, a nociceptin parciálisan gátolja az N-típusú Ca2+-csatornákat.60 A patkány hátsó gyöki ganglionjaiban és az egerek kis nociceptív trigeminális ganglionjaiban is megfigyelték, hogy a nociceptin szupresszálja a nagy-feszültségu, N-típusú Ca2+csatornákat. 61, 62

16

Befelé irányuló K+-csatornák Xenopus oocytákon végzett vizsgálatok igazolták, hogy a NOP receptor képes aktiválni a K+-csatornákat. 63,

64

A NOP receptort expreszáló neuronokban a receptor és a K+

csatornák funkcionálisan kapcsolódnak egymáshoz. A nociceptin aktiválja a befelé irányuló K+-csatornákat minden PAG (periaqueductalis szürkeállomány) neuronban és gátolja a gyors GABAerg és glutamáterg posztszinaptikus áramban a PAG neuronok nagy részében. 65 Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a N/OFQ preszinaptikus inhibitoros és posztszinaptikus aktivációja által rendelkezik azzal a képességgel, hogy befolyásolja a PAG analgéziát, viselkedést és autonóm funkciókat irányító idegsejtjeit.

C a2+

K+

ORL1

Ga 16 Ga12 Ga14

ORL 1

PLC ß

Ga1/o/z Pl3K?

??

Src SOS

??

IP 3

AC cAMP

Rac

Ga 14/16

??

Ras

ATP

PKA PKC

Ca 2+ raktár

JAK2 ERK

JNK

STAT3

C -Jun

p38

Elk-1

p108

STAT3

ATF-2

Sap1a

CREB

3. ábra Intracelluláris jelátviteli mechanizmusok a sejtben és a sejtmagban a nociceptin receptor aktivációja után (New és munkatársai vizsgálata alapján)

5.

A nociceptin metabolizmusa és bioaktív metabolitjai

A nociceptin metabolizmusa patkány hyppocampusában két lépésben zajlik. Az elso lépésben az 1-13 aminosav hasítódik le, majd az 1-9 aminosav. A hasítási helyek az Arg12 -Lys13 és az Arg8 -Lys9 aminosavpárok. Érdekes, hogy mind az 1-13, mind az 1-9 fragmenseknek a C-terminális vége az Ala-Arg-Lys triplet. Ezt a mintázatot ismeri fel az enzim. 66

17

A heptadekapeptid nociceptint az aminopeptidáz N (APN) illetve az endopeptidáz (EP) 24.15 négy kritikus helyen hasítja a Phe 1 -Gly2 , Ala7 -Arg8 , Ala11 -Arg12 , és Arg12 -Lys13 kötéseknél. 67,

67

Az így keletkezett metabolitok, N-, és C-terminális részek teljesen

inaktívak az NOP receptoron, hiszen az aktiválásához szükséges minimális aktív szekvenciát N/OFQ (1-13) már nem tartalmazzák.4 A gerincveloben a neutrális szerin endopeptidáz hasítja a nociceptint N/OFQ (1-11), majd (1-6 fragmensre). 68 Sejtkultúrákon igazolták, hogy a nociceptin 1-13 és 1-9 fragmensekre bomlik. A hasítást fémek és SH-reagensek gátolják, bizonyítva, hogy a metabolizmusban részt vevo enzimek metallo-endopeptidázok. 69 Ezeken a sejtkultúrákon a morfin képes mind a nociceptin felszabadulását, mind a metabolizmusát befolyásolni. 70 Humán perifériás vérmintában a hasítást foként az aminopeptidáz N végzi, amely egy Zink-kötött proteolitikus ectoenzim. Szelektív gátlása (EDTA) szinte teljes (95? 2,6%) védelmet nyújt a nociceptin metabolizmusa ellen. A fo fragmensek a N/OFQ (3-17), (417) és az (5-17). 71 A kortikális régióban viszont az endogén opiátoktól eltéroen (EP 24.12), az endopeptidáz 24.15 (EP 24.15) aktivitás a meghatározóbb. Az N-terminális 1-13 vég lehasítása teljes inaktivitást jelent az NOP receptoron (a Ctermiális nem aktív). 72

B.

A NOCICEPTIN NEUROKÉMIAI HATÁSAI

1.

Központi idegrendszeri hatások

In vitro vizsgálatok alapján kimutatták, hogy a N/OFQ gátolja az adrenalin felszabadulást tengerimalac, patkány és egér kortikális agyszeleteken73, cerebelláris,

hippocampális

és

hipothalamikus

agyszeleteken75 ,

a

74

és egér dopamin

felszabadulást egér striátumában76 , a szerotonin felszabadulást a patkány cortexében77, 78

és egérben

75

, 4. és a glutamát felszabadulást patkány cortex szeleteken79 . Bár a

nociceptin a legtöbb agyi régióban gátolja ezeknek a neurotranszmittereknek a felszabadulását, nagyságrendbeli különbség mutatkozik a gátlás mértékében. 80 A naloxon gátolta a patkány cortex szeleteken a noradrenalin (NA) felszabadulást74 , ugyanakkor a magas koncentrációban adott naloxon nem befolyásolta a nociceptin gátlását a noradrenalin73 , szerotonin74 , és felszabadulásra79 . A nociceptinnek ez a gátló

18

hatása a noradrenerg neuronok preszinaptikus ? 2-autoreceptoraihoz kapcsolt NOP receptoron keresztül valósul meg. 150 Számos közlemény bizonyítja, hogy az opioid peptidekhez hasonlóan a N/OFQ általános hatása az Ach felszabadulás gátlása. 81,

82

Patkány agyának striátumában in

vitro és in vivo végzett vizsgálatok egyaránt azt mutatják, hogy az opioid peptideknek Ach felszabadulást gátló hatása van

81, 82

, amely a ? -opioid receptorok aktivációja révén

fokozza a dopamin (DA) felszabadulást. 83 A nociceptin hatására létrejövo NOP aktiváció gátolja a kolinerg transzmissziót, ugyanakkor ez a hatás független a ? -receptor hatástól mivel a nociceptinnek elhanyagolhatóan csekély az aktivitása a klasszikus opioid receptorokon. 11 In vitro patkány kortikális szinaptoszomában a nociceptin koncentrációfüggo mértékben gátolja mind a spontán, mind pedig a K+ kiváltotta [3 H]-5-HT kiáramlást. Így ez a neuropeptid a kérgi szerotonin felszabadulás legfontosabb preszinaptikus modulátora19 , jelentos szerepe van a központi idegrendszeri 5HT mediált biológiai funkciók irányításában. In situ hibridizációs vizsgálatok eredményei alapján az adenozin, és a dopamin neurotranszmissziót gátló kezelés nem okoz változást a nociceptin expresszióban szeptális és striatrális területen. 84 Az a tény, hogy a dopaminerg neurotranszmisszió gátlása a szeptum és a striatum területén nem befolyásolja a nociceptin expressziót arra utal, hogy a nociceptinnek a félelem, a szorongás és a stressz érzelmi komponenseinek összehangolásában

tulajdonított

hatása

a

dopaminerg

rendszer

közvetlen

befolyásolásának eredménye lehet. A nociceptin és a nocistatin glutamát és GABA szinaptikus transzmisszióját, befolyásoló hatását patkány laterális amygdala sejteken vizsgálva, a nociceptin koncentráció-függo mértékben csökkentette a glutamát receptor- mediálta excitátoros posztszinaptikus potenciál (EPP) amplitúdóját, de a GABA receptor-mediált inhibitoros posztszinaptikus potenciál (IPP) mértékét is. 85 A nociceptin a morfinnal ellentétben jelentosen gátolta a tuberomammillaris (TM) neuronokban a hisztamin felszabadulást. A csökkenés a lassú K+ áram fokozódásával hozható összefüggésbe. 86 A ? -receptor mediálta hisztamin felszabadulás antinocicepciót hoz létre. A nociceptinnek a fájdalom kialakulásában betöltött szerepének egy

19

lehetséges útja, hogy gátolja az opioid kiváltotta hisztamin felszabadulást a TM neuronokból. In vivo tanulmányok során az intracerebroventrikárisan (i.c.v.) adott N/OFQ csökkentette a dopamin felszabadulást altatott patkányokban a nucleus accumbensben87 , a ventrális tegmentális areában88 , amely utóbbi bizonyítja, hogy a N/OFQ befolyásolja a mezolimbikus dopaminerg rendszert. Szintén i.c.v. adott nociceptin viselkedésfarmakológiai teszten dózis- függo mértéku anxiolitikus

hatást

okozott89 ,

már

nem

szedatív

dózisban

is.

Ez

a

hatás

valószínusíthetoen a nociceptinnek az akut stresszre adott válasz szabályozásában betöltött fontos szerepére utal, de ennek a mechanizmusa még nem ismert. Jenck és munkatársai feltételezték, hogy a félelem és a szorongás kialakulásában a CRF, a CCK, a NPY és a SP mellett a nociceptin szerepe egyaránt valószínusítheto, amelyek a GABA és monoamin rendszerek szabályozásán keresztül fejtik ki hatásukat.30

2.

Perifériás hatások

Altatott nyulak retináján a nociceptin dózis-függo mértékben csökkentette a fény által kiváltott acetil-kolin felszabadulást. 90 Patkány gyomor-bél traktusában csökkenti az elektromos inger kiváltotta izom-összehúzódást és Ach felszabadulást mind a gyomorban, mind pedig a vékonybélben, de a vastagbélben azonban nem. 91 A

nociceptin

egyéb

neurokémiai,

perifériás

hatásait

az

egyes

perifériás

szervrendszerekre kifejtett nociceptinerg hatások részben ismertetem.

C.

NOCICEPTIN FARMAKOLÓGIAI HATÁSAI

1.

Központi idegrendszeri hatások

a)

A nociceptin és a fájdalom, fájdalomérzet

Az agyi opiátoknak ma öt csoportját ismerjük: dinorfinok, endomorfinok, enkephalinok, béta-endorfinok és a nociceptin. 92 Viselkedés-vizsgálatok megerosítették, hogy a nociceptinnek fájdalomkelto és fájdalomcsillapító hatása egyaránt van. A peptid és receptor széles központi idegrendszeri eloszlása alapján feltételezheto, hogy számos idegi funkciót befolyásol. A többi opioid vegyülettel mutatott közös tulajdonság ellenére, a N/OFQ minden csak nem közönséges fájdalomcsillapító. Az elmúlt két

20

évtized során ismertük meg az agy saját kábítószereit, az endogén opiátokat és kannabinoidokat, amelyeknek meghatározó szerepe van a fájdalom csillapításában. Az exogén adott nociceptin gátolja, vagy fokozza az opioid analgéziát akár i.c.v. adjuk akár az agy olyan speciális régiójába, amelyrol ismert, hogy µ-opioid hatást közvetít. Tompítja az opioidok és nem-opioidok által kiváltott analgéziát, valamint az akupunktúra okozta érzéskiesést, interferál az a2- adrenerg agonista clonidin és GABA agonista baclofen okozta analgéziával.3,

93, 94, 95

Mogil és munkatársai arról számoltak

be, hogy N/OFQ fájdalomra adott válaszai önmagában nagyon különbözoek. Egyes szerzok szerint az i.c.v. adott nociceptin nem befolyásolja a fájdalomérzetet, más szerzok szerint hyperalgesiát vált ki. Yang és munkatársai analgéziáról számoltak be.96 A különbségekre adott lehetséges magyarázatok egyike az, hogy az i.c.v. adott peptid a különbözo agyi régiókban másképpen hat és a cél struktúrájától függ a hatása. Ha az amygdalába injektáljuk a N/OFQ-t, akkor analgéziát 97 , míg a középagy periaqueductalis állományába adva hyperalgesiát 98 , a rostrális ventrális medullába adva két különbözo kutatócsoport sem tudott fájdalmat befolyásoló hatást kimutatni. 99,

100

Az i.c.v. adott

nociceptin antagonizálja a morfin analgéziát, de önmagában nincs antiopioid hatása gerincveloi szinten. Egyes megfogalmazások szerint a nociceptin supraspinalisan antiopioid peptidként és spinalisan opioid peptidként viselkedik. 101 A fentiekbol is látható, hogy a nociceptinnek, a fájdalom kialakulásában, szabályozásában rendkívül összetett hatássa van. Egy új megközelítés szerint a prosztaglandin és a nociceptinerg rendszer kölcsönhatása lehet a magyarázat a nociceptinnek a fájdalom kialakulásával kapcsolatban megfigyelt ellentétes hatásaira.

36

A farmakológiai antagonisták kifejlesztése után, az eredmények

az endogén peptid pronociceptív vagy antianalgesztikus hatásáról számoltak be. 102 A nociceptinnek és a NOP központi idegrendszerben való elhelyezkedésébol fakadóan fontos szerepet játszhat a fájdalomérzet kialakításában, és komplex hatást közvetíthet a gerincvelobol történo fájdalom továbbításában is. Elektrofiziológiai vizsgálatok igazolták, hogy a C-rostokból eredo ismétlodo elektromos impulzus a gerincvelo hátsószarvi neuronjainak eros izgalmát váltja ki, amely N-metilD-aszpartát (NMDA) receptor antagonisták gátolnak. A gerincveloi hátsó szarvi neuronok izgalmi állapota szerepet játszik a neuropáthiás és a gyulladásos fájdalom kialakulásában és fenntartásában. 103 Patkányoknak i.t. különbözo dózisban adott

21

nociceptin dózis-függo mértékben gátolja az izgalmi tüneteket. A nociceptin által kiváltott gátló hatást csak igen nagy dózisú naloxonnal lehet antagonizálni. A nociceptin patkány hippocampusban is gátolja a hosszan tartó izgalmi tünetek kiváltását, amely NMDA receptor antagonistákkal is gátolható. 104 Decerebrált patkányok lumbális gerincbe adott nociceptin a mozgató neuronok supramaximális ingerlését követoen dózis-függo mértékben erosíti a flexor reflexet.

105

Az i.t. adott nagyobb dózisú

nociceptin viszont koncentráció-függo mértékben csökkentette a flexor reflexet. Courteix és munkatársai patkányokban kísérletesen létrehozott neuropathia modelleken (diabetszes és traumás) vizsgálták a nociceptin hatását a hyperalgesiára és a morfin analgéziára. Az i.t. adott N/OFQ etiológiától függo antinocicepciót hozott létre, amelyet az opioid receptorok közvetítenek. A nociceptint morfinnal kombinálva az antinociceptív

hatás

felerosödött

(szinergizmus),

amelyet

a

szerzok

ígéretes

lehetoségnek tartanak a neuropathia kezelésében. 106 A nociceptin szerepe a nociceptív transzmisszióban a szélesköru vizsgálatok ellenére sem tisztázott, ugyanakkor a Society for Neuroscience 1998-ban „izgalmas” jövot jósolt a peptidnek. 107

b)

A nociceptinerg rendszer és a kognitív funkciók: a tanulás és a memória

A klasszikus opioidok, mint a béta-endorfin és a dynorphin szerepet játszanak a tanulási és memória folyamatokban. A NOP nagy mennyiségben kimutatható az anterior cingulumban, a frontális cortexben és a hippocampusban, amely alátámasztja, hogy a N/OFQ szerepet kap a kognitív funkciók szabályozásában. Knockout egerek tanulási képességét és a memóriáját vad típusú egerekével hasonlították össze labirintus teszten (a rövidtávú és a munkamemória használatát igényli). A nociceptin receptor hiánya a spontán viselkedésváltozásban nem mutatkozott meg. 108, 109, 110 A figyelem és a tanulási képesség növekedése nociceptinreceptor knockout egerekben feltételezhetoen, de nem kizárólag a dopaminerg funkciócsökkenés eredménye lehet.108 A N/OFQ hatása a tartós potenciáció-ra (LTP) posztszinaptikus hatás, amely a gyrus dentatus granuláris sejtjeinek a gátlásával, valamint az NMDA receptor mediálta ionáramok gátlásával függ össze. 111 Mamiya és munkatársai a nociceptin hatását vizsgálta a tanulásra, valamint a hosszú távú memóriára. Igazolták, hogy a nociceptin negatívan befolyásolja a tanulási és

22

memóriafolyamatokat az NMDA receptor befolyásolásával, valamint a N-CAM (neuronal cell adhesion molecule) expressziójának fokozásával. 112

c)

A nociceptierg rendszer és a motiváció (reward)

Az opiátokhoz hasonlóan, az amphetamin, a kokain, és az alkohol pozitív megerosítést (reward) hoznak létre. A ventrális tegmentális nucleus accumbensének aktivitációja úgy jöhet létre, hogy növekszik a dopaminfelszabadulás az amphetamin, vagy csökken a dopamin visszavétele a kokain esetében, azaz minden esetben megno a dopamin koncentráció. Az i.c.v. nociceptin adását követoen altatott patkányokban a dopamin felszabadulás csökkenését lehetett megfigyelni a nucleus accumbensben. 113 Tartós agyi kanüllel rendelkezo egereken vizsgálták a nociceptin hatását az opiát vagy a pszichostimuláns kiváltotta feltételes reflexekre, vagy a naloxon- indukálta averzióra. Mind a morfin, mind a kokain indukálta eroteljes téraverziót a nociceptin csak enyhe mértékben

gátolta.

Gátolta

a

pozitív

megerosítést

mind

narkózisban,

mind

pszichostimulánsok hatására. 114

d)

A nociceptin és a táplálkozás

Az i.c.v. adott N/OFQ fokozza a táplálékfelvételt jóllakott patkányokban. 115 Rövid ideig tartó, enyhe hyperphagia jelentkezett akkor, ha a nociceptint határozott agyi régiókba injektálták, mint a nucleus accumbens, a hypothalamikus ventromediális mag és a nucleus tractus solitarii. 116, 117 A nociceptin enyhe orexigén (étvágyfokozó) választ vált ki hasonlóan a klasszikus opioidokhoz. A rendelkezésre álló adatok alapján feltételezheto, hogy a nocieptin nem önmagában, hanem más neuropeptiderg rendszerrel együtt szabályozza a táplálékfelvételt. Felteheto, hogy a N/OFQ gátolja azokat a jelátviteli utakat, amelyek a táplálékfelvétel leállításában szerepet játszanak, mint a vasopressin, a-MSH118 , és a CRH 119 .

e)

A nociceptinerg rendszer szerepe a mozgásban

Számos klinikai vizsgálat indult, annak felderítésére, hogy a nociceptin befolyásolja-e nigrostriatális

(mozgásszabályozó)

dopaminerg

neuronokat,

ezáltal

a

motoros

viselkedést is. Marti és munkatársai leírták, hogy a substantia nigra pars reticulátájában jelenlévo NOP receptorok, amelyeket az endogén N/OFQ aktivál, fiziológiás gátló

23

funkciót tölt be a motoros viselkedésre patkányban. 120 Egereknek i.c.v. adott nociceptin mind a horizontális, mind a vertikális locomotor aktivitás csökkenését, ataxia létrejöttét, valamint az egyensúlyérzék elvesztését okozza.

121

Ugyanakkor az i.t. adott N/OFQ-t

serkento hatású a locomotoros aktivitásra és a “felderíto” viselkedésre. Patkányoknak i.c.v. adott nociceptin tartós motoros gátlást, a koordinációs zavarokat, az egyensúly elvesztését és az izomtónus csökkenését okozza. A hatásokhoz 2-3 napon belül tolerancia alakul ki, és ez a hatás megmarad a kezelést követo 7. napig. 122 Ha a nociceptint közvetlenül a hippocampusba juttatjuk, nem hat a patkány motoros teljesítményére. 123 Ezekben az állatokban a nociceptin által kiváltott csökkent motoros aktivitás speciálisan supraspinális hatásnak tunik. Az eredmények ellenére a NOP receptor knockout egerekben nem hat a spontán és felderíto mozgásokban. 124

f)

A nociceptin és az endokrin és neuroendokrin rendszer

A nociceptin és a NOP hypothalamusban is kimutatható, így feltételezhe to, hogy befolyásolja a hypophysis hormonok elválasztását. Az i.c.v. adott N/OFQ csökkenti a növekedési hormon szintet, de a prolaktin és a kortikotropin szintet nem befolyásolja patkányban. A nagy dózisú N/OFQ antagonizálja a növekedési hormon hatásait, növeli a prolaktin és a kortikotropin szintet a stresszhatásnak kitett állatokban. 125 A hypothalamuson keresztül stimulálja a TRH és TSH felszabadulást. 126 Részlegesen antagonizálja a stressz hatására létrejövo növekedési hormonszint csökkenést és fokozza a prolaktin és kortikotropin szintnövekedést. Ezek a hatások valószínuleg, nem kizárólagosan a NOP receptoron keresztül valósulnak meg. Igazolták, hogy a N/OFQ stresszellenes hatású, valamint kifejezett hyperphagiát vált ki éhezo patkányokban. A CRF-rol ismert, hogy a stressz fo mediátora, valamint hogy az anorexia kiváltásában szerepe van. Ciccocioppo és munkatársai bizonyították, hogy a nociceptin–NOP rendszer farmakológiai célpontja lehet a CRF által kiváltott antianorexiás hatásnak. 127 Az i.c.v. adott nociceptin aktiválta a stressz tengelyt (limbikus rendszer- hypothalamushypophysis- mellékvesekéreg tengely), akkor is, ha nincs stresszt kiváltó faktor. Számos metabolikus folyamat szabályozásában és a stressz befolyásolásában is részt vesz. 128 A nociceptin emeli a stressz-kapcsolt magatartási mintázatok számát, valamint a kortikoszteron szintet világos-sötét félelem teszt során patkányokban. 129

24

Lippl és munkatársai izolált patkány gyomron vizsgálták a bazális szomatosztatin szekréció változását. Alacsonyabb dózisban a gátlás a NOP receptoron, míg nagyobb dózisban csak részben opioid receptoron keresztül valósul meg a gátlás.173

g)

A nociceptin és az alkoholabúzus

I.c.v. adott N/OFQ csökkenti az önkéntes 10%-os etanol bevitelét a Marchigian Sardinian „alkohol-kedvelo” patkányokban. A kísérlet a receptor farmakológiai jellemzését tuzte ki célul.

A receptor hatás közvetítésében a C-terminális 13

aminosavból álló rész vesz részt, amely meghatározza az aktivitást. A szelektív NOP receptor antagonista (Nphe 1 )N/OFQ(1-13)NH2 gátolja az N/OFQ hatását az etanol bevitelre. A N/OFQ gátolja az elektromos hatásra létrejövo stressz után a visszatérést az alkohol-kereso magatartáshoz. A nociceptin és receptora szerepet játszhat az alkoholabúzus farmakológiai kezelésében. 130 Aktivációja tompítja az alkohol pozitív megerosíto hatását, és megelozi környezeti faktorok (szag, fény, zaj) által kiváltott alkohol kereso magatartás visszatérését. 131

2.

A NOCICEPTIN PERIFÉRIÁS HATÁSAI

A NOP receptort számos központi idegrendszeren kívüli területen kimutatták patkányban, úgymint belek, vas deferens, máj, lép és szív, valamint humán lymphocytákon. A nociceptinnek számos biológiai hatását bizonyították perifériás preparátumokon. 132 A perifériás hatások elsosorban a transzmitterfelszabadulást befolyásolják

hasonlóak

a

többi

opioid

perifériás

idegrendszerre

kifejtett

neuromodulátoros hatásaihoz.

a)

A nociceptin és a légzorendszer

Tengerimalac légcsövén igazolták, hogy a nociceptin a légutak falában lévo immunreaktív idegrostokon hat, amelyek különböznek a tachykinin tartalmú rostoktól. 133

Részt vesz a légutak fiziológiai szabályozásában a tachykininerg neurotranszmisszió

befolyásolásával. 134 A tachykinin tartalmú érzo rostokon a nociceptin indukálta hyperpolarizáció a befelé-egyenáramú K+ csatornákon keresztül gátolja a kapszaicin 135 és a fenoterol által érzékenyített bronchokonstrikciót 136 . Az elektromos stimulusra kiváltott non-adrenenerg non-cholinerg (NANC) bronchuskonstrikciót gátolja. 137,

25

138

Összefoglaló közlemények jelentek meg arról, hogy a N/OFQ és receptora a többi endogén

opioiddal

együtt

szerepet

140, 141, 142

köhögéscsillapításban

kaphat

az

asthma

kezelésében139

és a

Az intrathoracikus légutak mechanikus stimulációjával

kiváltott köhögések száma és mélysége is csökkent az intravénás nociceptin adására macskában. 143 A gastrooesophagalis reflux betegség köhögést, bronchuskonstrikciót és gyulladást vált ki a betegek többségében, amely a tachykinin felszabadulás következménye. Rouget és munkatársai azt vizsgálták, hogy az intraoesophagealisan adott HCl, hogyan befolyásolja a légutak plazma extravasatioját. A N/OFQ saját receptorán keresztül csökkenti a plazma extravasatiot a tachykinin felszabadulás közvetett gátlásával. Ugyanakor az substance P okozta extraváziót nem befolyásolja. 144

b)

A nociceptin és a cardiovascularis rendszer

Intenzív cardiovascularis kutatások folynak, amióta a NOP receptorról kimutatták, hogy azokon a pre-, és/vagy postganglionáris szimpatikus és paraszimpatikus neuronokon is jelen vannak, amelyek az ereket, a szívet, valamint azokat a szerveket is beidegzik. Ugyanezek a receptorok a gyulladás, az arteriális hypertenzió és a kardiális és cerebrális ischemia kialakulásában is közremuködnek. 145 A nociceptin nM-os koncentrációban jelentos vazorelaxáns hatással van az elozetesen phenilephrinel kezelt macskavese, mezenteriális, szív és combcsont érintetlen endotheliumú artériáin. Patkányon végzett vizsgálatok szerint a nociceptin szintén vazorelaxáns hatású az artériákon. 146 Giuliani és munkatásai a nociceptin hatására artériás vazokonstrikciót és bradikardiát hoztak létre. 147 Egyes kutatók szerint a N/OFQ hipotenziót, bradikardiát okoz a NOP receptor hatásnak 148,149 , míg mások i.c.v. adott N/OFQ hypotenzív, bradikardizáló, a vesében szimpatoinhibitoros és diuretikus hatását nem centrális a2-adrenerg vagy centrális opioiderg receptor hatásnak tartották. 150 Venkatesan és kutatócsoportja szerint a nociceptin által okozott gátlás a GABAerg neuronokon keresztül valósul meg és növeli a paraszimpatikus hatást, amely szerepet játszhat a bradikardia kiváltásában. 151 Az Ntípusú Ca-csatornák blokkolása után a nociceptin gátolta a neurotranszmitter felszabadulást a szimpatikus neuronokból, amely szerepet játszhat a cardiovascularis rendszer depressziójában. 152 A nociceptin hatását vizsgálták oubain által kiváltott noradrenalin és acetilkolin felszabadulásra és igazolták, hogy a N/OFQ gátolja a

26

cardiális autonóm neurotranszmissziót a preszinaptikus NOP receptoron keresztül. 153 Shah és munkatársai patkány nuclues tractus solitariusba adott nociceptinnel igazolták, hogy a commisurális subnucleus NOP részt vesz a kardiovaszkuláris rendszer szabályozásában. 154 A nociceptin növelte az antinatriuretikus peptid szintjét neonatális kardiális myocytákon. 155 Arrythmiában mind a perifériás, mind a centrális NOP receptor stimulációja növeli a kardiális ellenállást az acotinine által kiváltott szívritmuszavar ellen. 156

c)

A nociceptin és a cerebrovasculáris rendszer

Régóta ismert, hogy a klasszikus endogén opiodok (enkephalin, dynorphin) az agyi erek hemodinamikájának szabályozásában szerepet játszanak. 157 Armstead és munkatársai igazolták eloször, hogy a hypoxiás- ischemiás károsodást követoen a N/OFQ részt vesz a piális artériák NMDA indukálta vasodilatációjában. Feltételezték, hogy a nociceptin indukálta PKC-függo O2- keletkezése a nociceptin felszabadulás függvénye. 158 Az ischemia/reperfúzió okozta károsodást követon nem csak az adenilát cikláz és a K(ATP) csatorna- függo, hanem a cAMP és a K(Ca)-csatorna-függo mechanizmusok is szerepet kapnak a nociceptin okozta vasodilatációban. 159 Szerepet játszik a hypoxaemiásischémiás károsodás létrejöttében, a szuperoxid anion koncentrációjának emelésével, amely a károsodott piális artériák NMDA- függo vasodilatációja után szabadul fel. 160 Ugyanez a kutatócsoport igazolta, hogy a megváltozott ciklooxigenáz metabolizmus részt vesz a károsodott vazodilatáció létrejöttében cerebrális sérülést követoen patkányban161,

162

, valamint, hogy a protein-kináz K és a mitogén-aktiválta protein-

kináz K szintén szerepet kap az N/OFQ-indukálta hypercapnia létrejöttében, amit a piális artériák vazodilatációja hoz létre. 163, 164, 165

d)

A nociceptin és gasztrointesztinális rendszer

A nagy dózisú nociceptin gátolja a gyomor és vékonybél passage-t in vivo. 166 Késobb kimutatták, hogy ez a gátlás régióspecifikus. A N/OFQ gátolja a kolinerg neurotranszmissziót a gyomorban és a vékonybélben, míg a stimulálja a colon kontrakciót, gátolva a plexus myentericust. 167,

168

Kimutatták a NOP-t sertés

bélrendszerén, valamint igazolták, hogy a receptor befolyásolja az intesztinális

27

simaizom kontrakciót és a mukozális transzportot. 169 A szubkután adott kisebb dózisú nociceptin fokozza a colon motilitását, míg a dynorphin A nagyobb dózisban (30-100 nmol/kg) gátolja. 170 Gyomor motoros izgalmát váltja ki, feltételezhetoen nem a paraszimpatikus, vagy szimpatikus idegeken keresztül, hanem a gyomor saját beidegzése által171 , a motilitás neuromodulátoros befolyásolása mellett, az intesztinális véráramlás fokozásában, az aktív ion transzportban és az immunitás szabályozásában is szerepet játszik 172 . Gátolja a szomatosztatin szekréciót a gyomorban. Alacsonyabb koncentrációban a saját receptorán, míg magasabb koncentrációban opiát receptoron keresztül hat. 173 Centrális úton is befolyásolja a gasztrointesztinális propulzív aktivitást és a gyomorsav szekréciót patkányban. 174

e)

A nociceptin és az urogenitális rendszer

A NOP receptort kimutatták az egér2 , a patkány175 ,és a nyúl176

és humán177 vas

deferensen. A N/OFQ valamennyi felsorolt fajban gátolta a vas deferens kontrakcióját. A nociceptin i.v. és i.c.v., adását követoen jelentosen növeli a vese perctérfogatát, de csökkenti a Na+-kiválasztást. Altatott patkányokban gátolja az EFS (elektromos stimuláció) által kiváltott hólyagkontrakciót, a medence területét szabályozó idegek preés posztszinaptikus gátlása révén. Ez a hatás a gátolt excitátoros transzmitter felszabadulásnak

tulajdonítható,

a

hólyag

postganglionáris

kolinerg

motoros

idegekben. 178 Tengerimalacból izolált vesemedence preparátumon az EFS pozitív inotrop hatást fejt ki a perifériás kapszaicin szenzitív primer afferens neuronok idegvégzodéseibol felszabaduló tachykinin befolyásolásán keresztül. 179 Az opioidokhoz hasonlóan a nociceptin is koncentráció- függo mértékben gátolja az érzoidegek transzmisszióját az urogenitális rendszerben az excitátoros transzmittereken keresztül (tachykinin) hat, a húgyhólyagnál tapasztaltakhoz hasonlóan. 180 Hadrup és munkatársai a NOP receptor aquaresire (sómentes vizelet kiválasztás növekedés) kifejtett hatását vizsgálták. Eredményeik igazolták, hogy a vese gyujtocsatornáiban elhelyezkedo NOP receptorok stimulációja az egészséges és a kongesztív szívelégtelenségben szenvedo állatokban az aquaresis növekedését váltja ki, amelyet a vasopressin független aquaporin-2 downregulációja okoz. 181

28

f)

A nociceptin hatása a gyulladásos fájdalom kialakulására

A neurogén fájdalmat a mielinizálatlan C-típusú rostok, valamint a vékonyan mielinizált (Ad) típusú kapszaicin érzékeny rostok közvetítik. 182 Az intraperitoneálisan adott N/OFQ szelektíven gátolta a neurogén gyulladás kialakulását patkány n. saphenuson mustárolajos, antidróm ingerre, anélkül, hogy a bradikinin mediálta, nem-neurogén gyulladást befolyásolta volna. Ellentétes hatást bizonyított Inoue és kutatócsoportja. A nociceptív flexor válasz kiváltásában a N/OFQ 10000x hatásosabb, mint a substance P intraplantárisan. 183 A nociceptin a választ, a substance P felszabadításával váltja ki a primer afferens idegevégzodésekbol. A NOP receptor stimulációja során aktiválódik az inozitol trifoszfát és Ca2+ áramlik a sejtbe.

g)

A nociceptin és az immunrendszer

Nishi 1997-ben még azt közölte, hogy a nociceptin és receptora csak funkcionális szerepet játszik az immunrenszer muködésében. 184 Késobb NOP receptorok jelenlétét mutatták ki az immunrendszer különbözo tagjain. A receptor mRNS-t a sertés thymus, lép, inguinalis és mesenteriális lymphocytákon, alveoláris machrophagokon és frissen izolált lépsejteken RT-PCR technikával vizsgálták. A humán neutrophil granulocyták szintén termelnek nociceptint és expresszálnak NOP-t.185 A prepronociceptin eloszlása hasonló a különbözo sejteken, kivéve a nyirokcsomókban. Bár a receptor mRNS-e megjelenik az immunrendszer különbözo tagjain. Ez azonban nem azt jelenti, hogy ezek a

receptorok

muködoképesek,

vagy

azt,

hogy

funkcionális

receptorok

expresszálódnak. 186 Bizonyították, hogy a humán perifériás sejtek képesek a prepronociceptin termelésére, hasítására és bioaktív metabolitok képzésére. Miután funkcionális NOP receptorokat mutattak ki immunsejteken, feltételezheto, hogy a nociceptin egy immunmodulátor. 187 Traumás stressznek kitett patkányokon (dorsomyotómia és laparotómia) peritoneális makrofágok nociceptin, interleukin-1 és tumor nekrózis faktor-alfa termelését vizsgálták. 188 Az IL-1 és a TNF-alpha termelés szignifikánsan növekedett trauma után, ugyanakkor az i.c.v. adott nociceptin ezzel ellent étes hatást váltott ki. Buzas és munkatársai bizonyították, hogy a gyulladásos mediátorok az astrocyták fokozott

29

nociceptin expressziójához vezetnek. Ezek a gliasejtek fontos szerepet játszanak a gyulladásos- és immunválaszok közvetítésében. 189

D.

A NOCICEPTINERG RENDSZER KLINIKAI VONATKOZÁSAI: HUMÁN VIZSGÁLATOK

1.

Fibromyalgia

Anderberg és munkatársai fibromialgiás (FMS) nokben vizsgálták a plazma nociceptin szint változását. A betegség pathofiziológiája a mai napig ismeretlen: a monoaminok, a neuropetidek és a stressz szerepét feltételezik. Az FMS betegekben a kontrollokhoz képest alacsonyabb a N/OFQ szintet mértek. Az FMS csoporton belül elkülönítették a menstruciós ciklus luteális fázisában lévo betegeket, akikben a nociceptin szint csökkenés szignifikánsabb volt. A megzavart nociceptinerg rendszer hátterében mind a nemi hormonok, mind a stressz szerepét feltételezték. 190 2004-ben közölt adatok szerint nem volt különbség a nociceptin szintjében fibromyalgiás, hát fájdalomról beszámoló és kontroll betegek között. Ugyanakkkor az SF-36 fájdalom kérdoív szerint szignifikáns volt

a

különbség

(fibromyalgia>

hátfájdalom>kontroll

csoport)

a

fájdalom

mértékében. 191

2. A nociceptinerg rendszer jellemzése különbözo fájdalommal járó betegségekben a)

Spontán akut fájdalom

Brooks és munkatársai mértek eloszö r humán liquor nociceptin szintet. Tíz- tíz terhes not vontak be a vizsgálatba. 10 teljesen egészséges, elektív császármetszésre váró no spinális anesztéziát kapott (E csoport). A másik csoportba, tíz olyan no került (L csoport), akiknél már megindult a vajúdás. Ebben a csoportban kombinált spinálisepidurális fájdalomcsillapítókkal értek el analgéziát. A liquor nociceptin szint az E csoportban 52,49 ± 34,25 pg/ml, az L csoportban pedig 63,39 ± 33,26 pg/ml volt. A liquor nociceptin szinjét szignifikánsan magasabbnak találták, mint a plazmáét. Nem találtak különbséget a liquor nociceptin szintjében a két csoportban (vajúdással járó fájdalom megléte, illetve hiánya között). 192

30

b)

Cluster fejfájás

Ertsey és munkatársai cluster fejfájásban vizsgálták a plazma nociceptin szintet roham alatt és rohammnetes periódusban. Érdekes módon a 14 clusteres beteg plazma N/OFQ szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a roham alatt, mint a korban, nemben illesztett kontrolloké. A nociceptin szint nem korrelált a betegek korával, a betegség fennállásával és roham idotartamával. Feltételezésük szerint az alacsonyabb nociceptin szint a roham alatt, a trigeminus aktivitásnak megromlott szabályozására vezetheto vissza, amely nem véd megfeleloen a rohamok ellen. 193 c)

Akut fájdalom injekció következtében

Egy dán kutatócsoport tovább vizsgálta a nociceptin szerepét a fájdalomban. A kísérlet elso fázisában a N/OFQ jelenlétét vizsgálták a ganglion trigemináléban, az artéria temporálisban, valamint a nyaki borszövetben. A második fázisban nociceptint injektáltak a musculus temporalisba, hogy a lehetséges reakciókat figyeljék a fájdalom hatására. A harmadik részben egészséges fiatalok musculus trapeziusának ínába injektáltak N/OFQ-t, hogy a nociceptív, antinociceptív válaszokat feltérképezzék. Immunhisztokémiai vizsgálattal igazolni tudták a nociceptin jelenlétét a ganglion trigemináléban, de nem tudták kimutatni az artéria temporalisban és a nyaki borszövetben sem. A musculus temporalisba adott nociceptin hatásásra a 4 önkéntes nem jelzett fájdalmat. A trapazius ínba adott N/OFQ után a 10 önkéntes személy csak enyhe érzékenységrol számolt be, de fájdalmat nem jeleztek. 194 d)

Akut, krónikus és szubakut fájdalom

Ko és kutatócsoportja akut és krónikus fájdalom miatt kezelt betegek plazmamintáiban mérte a neuropetid szintjét. 20 egészséges kontroll személyt és 70 fájdalomról beszámoló beteget vontak be a vizsgálatba. Az utóbbi csoportot 3 részre bontották: akut ( a fájdalom 4 hétnél rövidebb ideje áll fenn, (n=30), szubakut (a fájdalom 4 hét és 6 hónap között jelentkezett, n=20) és a krónikus ( a fájdalom több mint 6 hónapja áll fenn, n=20).

31

*§

Plazma nociceptin (pg/ml)

40 35

*

30

*

25 Kontroll Akut fájdalom Szubakut fájdalom Krónikus fájdalom 2010.65 16.65 20.66 24.44 5.58 8.01 8.98 13.6 15 10 5 0 Kontroll

Akut fájdalom

Szubakut fájdalom Krónikus fájdalom

4. ábra. Nociceptin szint a betegcsoportokban (akut fájdalom, szubakut fájdalom, krónikus fájdalom ) a kontrollokhoz képest (* p<0.05 vs kontroll csoport), (§ p<0.05 vs akut fájdalom csoport) (KO és munkatársai adatai alapján – Neuroreport, 2002)

A plazma nociceptin szint szignifikánsan magasabb volt a krónikus csoportban, mint az akutban és a szubakutban, ugyanakkor minden csoportban a kontrollokhoz képest. Az eredmények hátterében a krónikus fájdalomhoz társuló stresszhelyzet okozta nociceptinerg rendszer megváltozása állhat. 195

e)

Wilson kór

A nociceptin lebontásában a Zn- metalloproteázok csoportjába tartozó aminopeptidáz-N (APN) és az endopeptidáz 24.15 vesz részt. Kimutatták, hogy ha az endopeptidáz enzimben a központi Zn atomot rézre cserélik, akkor az enzim aktivitása jelentosen, mintegy 50%-kal csökken.

196

Mivel Wilson kórban jól ismert a Cu-Zn imbalansz, ezért

kutatócsoportunk feltételezte, hogy a betegségre jellemzo réz akkumuláció miatt csökkenhet a lebontó enzim aktivitása, ezért plazma N/OFQ szint magasabb. A nociceptint és receptorát az agyban, azokban a struktúrákban is kimutatták, amelyeket Wilson kórban a réz toxikus akkumulációja károsítja. Új adatként kimutatták, hogy a plazma nociceptin szint Wilson kóros betegekben magasabb az egészséges kontroll személyekéhez képest. Feltételeztük, hogy ebben a csökkent lebontásnak szerepe lehet. Nincsen egyéb adat a nociceptinerg rendszer és májbetegségek kapcsolatáról. *

32

E. A NON-NOCICEPTINERG OPIOID RENDSZER ÉS A MÁJBETEGSÉGEK KAPCSOLATA

Az endogén opioidok és a májbetegségek kapcsolatáról eddig kevés adat ismert. A methionin-enkephalin alacsony koncentrációban az egészséges ember plazmájában is jelen van. A szimpatikus idegek mellett, a mellékvese, a pancreas és a gyomor is termeli. 197 Jóval késobb Bergasa és munkatársai PBC-s betegek májszövetében kimutattak methionin-enkephalin immunreaktivitást, amely azt jelenti, hogy a máj is termel endogén opioidokat. 198 Ötszörös plazma leucin enkephalin emelkedést írtak le akut májbetegségekben, és háromszoros emelkedést acitessel szövodött cirrhosisban a kontrollokhoz képest. A leucin-enkephalin emelkedése szoros összefüggésben állt a májkárosodás mértékével, a prothrombin

idovel,

az

alanin-aminotranszferáz

szinttel,

ugyanakkor

negatív

összefüggést találtak az albumin szinttel. Magyarázatul az endogén opioid csökkent katabolizmusát, vagy a szimpatikus idegek és/vagy a mellékvese megnövekedett szekrécióját találták. 199 Ugyanez a munkacsoport vizsgálta a béta-endorphin szintjét cirrhosisban. Sem az ascitesszel rendelkezo, sem az ascites nélküli cirrhotikus csoportban nem volt magasabb a béta-endorfin szintje a májbeteg, illetve az egészséges kontroll csoporthoz képest. Több mint kétszeresére emelkedett veseelégtelenségben. Feltételezésük szerint ennek a magyarázata az lehet, hogy a máj eliminálja a nyolc aminosavnál kisebb opioidokat (mint a methionin-, és leucin-enkephalin), de a nagyobbakat, mint a béta-endorfin már nem. 200 Spivey és munkatársai azt vizsgálták, hogy van-e össze függés a viszketés és a methionin-enkephalin szintje között. 54 kezeletlen PBC-s és 20 kontroll személy plazma mintáit vizsgálták. Szoros korrelációt találtak a methionin enkephalin és a bilirubin szintje között, ugyanakkor nem volt összefüggés a viszketés mértéke és az endogén opioid szintje között. 201 Bergasa és munkatársai igazolták, hogy kísérletesen létrehozott cholestasisban a centrális µ-opioiderg receptorok száma csökken. Hátterében a megnövekedett endogén opioid szekréció miatti down-regulációt feltételezték, amely magyarázatot adhat a cholestasisban létrejött viszketésre. 202 Patkányokban létrehozott epeútlekötés után 5

33

nappal mérték a plazma endogén opioid koncentrációit. A plazma methionin-enkephalin szintje hatszor magasabb volt, mint az áloperált, és több mint 17-szer magasabb, mint a kontroll állatokban. 203 A többlet methionin-enkephalin termelés hátterében inkább a szimpatikus idegrendszer, mint a mellékvese megnövekedett termelése állhat. 204 Különbözo cholestasisos patkány modelleken igazolták, hogy a vér-agy-gát is csökkent permeabilitású205 , ezt azonban akut toxikus hepatitis patkány modellen már nem tudták bizonyítani. 206 Cholestasisban az endogén opioidok nagy mennyiségben termelodnek, valamint igazolták, hogy a máj fokozott mértékben akkumulálja is a peptideket. 207 Nincs adat az endogén opioidok és a hepatocelluláris carcinoma kapcsolatáról.

F.

A HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMA

A hepatocelluláris carcinoma (HCC) a máj malignus, körülhatárolt, gócos elváltozása. Az esetek több mint 80%-ában cirrhosisos májban keletkezik. A keletkezésének mechanizmusa igen komplex. A pathomechanizmus számos eleme még most is ismeretlen, bár egyre több faktor szerepe tisztázódott. A hepatocelluláris carcinoma és a nociceptinerg neurotranszmisszió kapcsolatáról nincs adat az irodalomban. Munkám során rávilágítok azokra az intracelluláris jelátviteli mechanizmusban részt vevo elemekre, amelyek mind a nociceptinerg rendszerben, mind a hepatocelluláris carcinoma keletkezésében részt vesznek. A májdaganatok 75-80% -a fennálló HCV és HBV fertozés talaján jelenik meg. A krónikus alkohol abúzus és az alkoholos cirrhosis szintén fontos pathogenetikai faktor, amelyek mellett ritkább okok, mint az aflatoxin, az orális kontraceptívumok alkalmazása, haemocromatosis, Wilson kór és egyéb ritka kórképek is szerepet játszanak a HCC keletkezésében. 208 Kimutatták, hogy a HBsAg pozitivitás és az antiHCV pozitivitás szorosan korrelál a HCC megjelenésével világszerte. 209 A hepatocelluláris carcinoma diagnózisának felállítása a mai napig nem könnyu. A szérum AFP széles köruen elfogadott markere a HCC-nek. 500 ng/ml feletti érték esetén a módszer érzékenysége 50% és specificitása 90%, ha a betegnek HCC-je és májbetegsége is van. 210, 211, 212 Az AFP szint nem mutat lineáris korrelációt sem a tumor méretével, sem a stádiumával. További hátrány, hogy a májrákok jelentos részében nem emelkedik meg az AFP szintje. 213

34

A hepatocelluláris carcinoma kialakulásának mechanizmusa komplex, etiológiától függoen változó. A kutatók érdeklodése a tudomány és a molekuláris diagnosztika fejlodésének köszönhetoen mind inkább az intracelluláris mechanizmusok megismerése felé terelodik. A bonyolult mechanizmusban résztvevo elemek közül itt kiemelten csak azokat ismertetem, amelyek kapcsolódhatnak a nociceptinerg rendszerhez.

TNF NF?B

EGFR

TGFa

STAT3

Proliferáció ? Apoptosis ?

MAPK

5. ábra. A STAT3 és a MAPK rendszer aktivációjának feltételezett, sematikus ábrája hepatocelluláris carcinomában (Sanchez et al.) Nemrégiben napvilágot látott adatok szerint a hepatitis B vírus HBx fehérjéje214 , valamint a hepatitis C vírus core proteinje 215 aktiválhatja a STAT3 fehérjéket. A STAT név egy szignál transzdukciós fehérjecsaládot foglal magába, amelyet külso proteinek aktiválnak a citoplazmában membránhoz kötött receptorokhoz által. Aktivációjuk számos gén expressziójához vezet, amelyek kritikus celluláris funkciókat, mint a sejtproliferáció, differenciáció és fejlodést szabályoznak. 216 Ilyen gének a c- myc, c-jun és c-fos, amelyek szerepe a HCC-ben évek óta ismert. A fiziológiai funkciók befolyásolása mellett egyre több közlemény jelenik meg a STAT fehérjék tumorgenezisben betöltött szerepérol. 217, 218, 219 Ni és munkatársai leírták, hogy a STAT3 gátlása a tumor növekedését gátolja.218 Számos citokin játszhat szerepet a STAT3 szabályozásában.

A

TGF a

aktivitásának

35

szelektív

gátlása

squamosus

sejtes

carcinomában a STAT3 csökkent aktivitásához és a sejtproliferáció gátlásához vezet.219 A TGFa az epidermális növekedési faktor receptorhoz (EGFR) kötodik. Az EGFR egy klasszikus tyrozin kináz receptor, amely a MAPK jelátviteli rendszert aktiválja. 220 A tumor növekedésének fontos lépése, hogy az EGFR upregulá lja az NF?B-t az Akt kinázon keresztül intracellulárisan. 221 Eddig mindössze egyetlen közlemény foglalkozik a STAT fehérjék szerepével hepatocelluláris carcinomában. 222 In vivo kísérletben igazolták, hogy kémiai úton létrehozott hepatocelluláris carcinomában mind a TGFa, mind a STAT3 aktivitás emelkedett. A megbeszélés fejezetben a 24. ábrán foglalom össze a fentebb felsorolt faktorok és a nociceptin rendszer kapcsolatát.

36

III. CÉLKITUZÉSEK Munkacsoportunk korábban emelkedett nociceptin szintet írt le Wilson kórban, amelyet a csökkent katabolikus enzim aktivitással magyaráztunk.

Kimagaslóan magas

nociceptin szintet mértünk egy Wilson kóros betegben, akiben késobb hepatocelluláris carcinoma igazolódott. Munkánk során tovább vizsgáltuk a nociceptin szintet különbözo etiológiájú hepatológiai kórképekben, valamint primer májdagantos betegekben. Kísérletesen létrehozott hepatocelluláris carcinoma patkánymodellen vizsgáltuk, nem csak a plazma, hanem a liquor, valamint a májszövet nociceptin tartalmát. Lehetoségünk nyílt egy primer biliáris cirrhosis talaján kialakult hepatocelluláris carcinoma miatt elhunyt beteg plazmamintáinak mérésére, ezáltal a daganat kialakulásával párhuzamosan tudtuk követni a N/OFQ szint változását. Humán daganatos betegek májszövetmintáiban vizsgáltuk a N/OFQ tartalmat a Semmelweis Egyetem II. sz. Pathológiai Intézetének és az I. sz. Sebészeti Klinikájának segítségével. A méréseket validált radioimmunoassay (RIA) módszerrel végeztük a Semmelweis Egyetem Gyógyszerhatástani Intézetében.

A humán vizsgálatokban tapasztalt eredményeket állatkísérlettel támasztottuk alá. Így lehetoségünk nyílt megvizsgálni a plazma mellett, a liquor és a májszövet nociceptin tartalmát is.

A.

H UMÁN VIZSGÁLATOK

Elozetes megfigyeléseink alapján érdemesnek találtuk megvizsgálni, hogy különbözo májbetegségekben változik-e a plazma nociceptin szint. Célul tuztük ki a nocieptinerg rendszer vizsgálatát hepatocelluláris carcinomában. Az alábbi kérdésekre kerestük a választ : 1. Változik-e a perifériás nociceptin szint krónikus májbetegségekben?

2. Van-e

összefüggés

a

plazma

nociceptin

szint

és

a

laboratóriumi

májparaméterek között?

3. Változik-e a perifériás nociceptin szint primer májdaganatos betegségekben?

37

4. Mutat-e összefüggést a perifériás nociceptin szint változása a fájdalom mértékével HCC-ben?

5. Kimutatható-e nociceptin humán hepatocelluláris carcinoma szövetben? Van-e különbség a tumor, a környezo nem tumoros szövet, és az egészséges májszövet nociceptin tartalma között?

6. Emelkedik-e a plazma N/OFQ szint egyéb térfoglaló folyamatokban, mint például a májmetasztázis esetén, vagy extrahepatikus daganatokban?

7. Kimutatható-e nociceptin a májcirrhosis talaján kialakult májdaganathoz társuló ascitesben?

EXPERIMENTÁLIS HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMA MODELL Fischer 344 patkányban kísérletesen létrehozott cirrhosis, illetve hepatocelluláris carcinomában vizsgáltuk a plazma és a májszövet nociceptin tartalmat vizsgáltuk. A következo kérdéseket fogalmaztuk meg: 1. Kimutatható-e nociceptin a daganatos, a kontroll és a cirrhotikus állatok plazma, liquor és májszövetében?

2. Termel-e a tumoros májszövet nociceptint?

3. Van-e összefüggés a plazma és a liquor N/OFQ szintje között?

4. Megvizsgáltuk, hogy a prepronociceptinbol lehasadó másik peptid, a nocistatin plazma szintje változik-e májtumoros betegekben, és ha igen, az mutat-e összefüggést a nociceptin szinttel?

38

IV.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

A.

HUMÁN VIZSGÁLATOK

1.

Kontroll csoport Az egészséges kontroll személyek között önkéntes véradók, orvostanhallgatók, a

klinikai stáb tagjai, életbiztosítási szerzodés miatt vizsgált szemé lyek szerepeltek valamint olyanok, akiknek részletes klinikai vizsgálata során nem igazolódott a tanulmány

szempontjából

releváns

betegsége.

Az

egyes

vizsgálatokban

összehasonlításra azonos nemu és életkorú személyekbol kialakított csoportokat használtunk, így a plazma nociceptin szint vizsgálatához a kontroll csoportba 14 férfi és 16 no (átlagéletkoruk 36? 14 év) került. Gyógyszert (az orális antikoncipiensektol eltekintve n=5) a vérvételt megelozo –legalább- nyolc hétben nem szedtek, alkoholt csak alkalmanként, mértékkel fogyasztottak. Valamennyi résztvevot elozetesen tájékoztattuk a vérvétel céljáról és a vizsgálatba beleegyezésüket adták. 2.

Beteg csoport A betegkiválasztás során a részletes fizikális vizsgálat után, rögzítettük a

kórtörténetet, a családi anamnézist, azt hogy a vizsgálatot megelozo legalább nyolc hétben milyen gyógyszereket vettek be, illetve milyen gyógyszert szedtek rendszeresen. Nem volt olyan beteg aki kábítószert fogyasztot volna, illetve az opioid rendszert befolyásoló szert (pl.: kábító fájdalomcsillapító, opioid köhögéscsillapító) szedett volna. Az anamnézisben részletesen rögzítettük, hogy a beteg az utóbbi fél évben tapasztalt-e a krónikus fájdalmat, illetve mennyi alkoholt fogyaszt. A kiválasztott betegek normál, vegyes táplálkozást folytattak, egyéb krónikus betegségükrol nem tudtak. A májbetegek vérmintái a Semmelweis Egyetem I.sz. Belgyógyászati Klinikáján kezelt (bent fekvo illetve hepatológiai ambulancián gondozott) betegektol származtak. Primer biliaris cirrhosis A betegség diagnózisa: 1. a jellemzo klinikai és laboratóriumi adatokon, 2. az antimitokondriális antitest (AMA M2) pozitivitáson, 3. az extrahepatikus epeúti obstrukció kizárásán (ultrahang, ERCP, cholangio-MR) és 4. kongruens szövettani leleten (májbiopszia) alapult. A stádiumbeosztást (I-IV) a Ludwig féle klasszifikáció szerint

végeztük.

A

betegek

a

diagnózis

39

felállítását

követoen

a

standard

ursodeoxicholsav (Ursofalk) kezelést kapták, preventív célból kalcium és D-vitamin pótlásban részesültek. 21 primer biliáris cirrhosisban szenvedo 36-72 év közötti nobeteget vontunk be a vizsgálatba. Mindannyian AMA M2 pozitív, hisztológiai vizsgálattal igazolt, ursodeoxycholsavval kezelt, betegek voltak. Betegségük fennállásának átlaga: 9,4 év. Wilson kór 26 Wilson kóros (kor: 14-55 év) 11 hepatikus, 15 neurológiai tünetekkel jelentkezo beteg került bevonásra. Mindegyikük D-penicillamine kezelésben részesült. A diagnózis felállítása a szérum coeruloplazmin, réz szinten, a génmutáció vizsgálati leleten és a rézürítési próba eredményén, valamint ritka esetben a májbiopsziás leleten alapult. Krónikus hepatitis 18 krónikus hepatitisben szenvedo (kor: 22-72 év)(14 HCV pozitív, 1 HBV pozitív és 3 autoimmun hepatitises, mindegyikük májbiopsziával igazolt) beteget vizsgáltunk. A diagnózis felállítása a vírus hepatitisek esetében az anti-HCV és HBsAg pozitivitáson és a PCR eredményeken, valamint a májbiopszia eredményen alapult. Májcirrhosis 15 májcirrhosisos (9 alkoholos, 6 HCV pozitív), (kor: 25-74 év) beteg plazmamintáját vizsgáltuk. A diagnózis a laboratóriumi adatok mellett, a fizikális vizsgálaton és a májbiopsziás lelet eredményén alapult. Hepatocelluláris carcinoma 18 primer májdaganatos (hepatocelluláris carcinoma) (32-80 év; 8 alkoholos cirrhosis, 6 HCV, 1 HBV cirrhosis, 1 Wilson kór, 1 PBC talaján, 1 ismeretlen etiológiájú) beteget vontunk be a vizsgálatba. 10 további beteg (44-78 év, 5 alkoholos, 3 HCV fertozött, 2 ismeretlen etiológiájú) sebészetileg eltávolított hepatocelluláris carcinoma, valamint környezo, cirrhotikus májszövet mintáinak nociceptin mérésére nyílt lehetoségünk. A vizsgálatainkban szereplo humán májszövet a Semmelweis Egyetem II.sz. Pathológiai Intézetébol a hozzátartozó beleegyezését követoen elvégzett részleges boncolás után került hozzánk. A hepatocelluláris carcinoma diagnózisa az esetlegesen fennálló klinikai tüneteken, a laboratóriumi adatokon, beleértve a szérum AFP szintet és a képalkotó vizsgálatok eredményein alapult (UH, CT, MRI).

40

Extrahepatikus daganatok 29 extrahepatikus malignus daganatos beteg (18 férfi és 12 no, kor: 41-78 év) plazmamintáit használtuk fel nociceptin mérésére. A betegek valamennyien a Semmelweis Egyetem I.sz. Belgyógyászati Klinikáján feküdtek és beleegyezo nyilatkozatot írtak alá. 3 prostatacarcinomás, 2 choledochus-, 6 tüdo-, 3 emlo-, 5 bor-, 5 pancreas-, 3 vesedagantos és 1 Non- hodgkin lymphomás beteget vizsgáltunk. Egyik betegnek sem volt májmetasztázisa. Májmetasztázisos betegek 22 (7 férfi és 6 no, kor: 31-56 év) olyan, extrahepatikus daganatos beteg plazmamintáit mértük, akiknek egyidejuleg igazolható májmetasztázisa volt. Az alapbetegség diagnózisa szövettani leleten alapult, a metasztázist képalkotó eljárások bizonyították (UH, CT).

3.

Stádiumbeosztás

A klinikai stádiumbeosztás segít a betegek gondozásában és a terápiás lehetoségek megválasztásában. A primer májdaganatos betegek osztályozásához a legújabb nemzetközi stádiumbeosztásokat alkalmaztuk, mint a Cancer of the Liver Italian Program (CLIP) és a Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) stádium felosztás.

2. táblázat. A CLIP stádiumbeosztás Cancer of the Liver Italian Program (CLIP) Pontok Paraméterek

0

1

2

Child-Pugh stádium

A

B

C

Tumor morfológia Uninoduláris

és

a Multinoduláris

és

kiterjedése < 50%-a májnak kiterjedése<50%-a májnak

a

Masszív kiterjedése> májnak

AFP (ng/ml)

<400

>400

V. portae thrombosis

Nincs

Van

41

vagy

a

50%-a

3. táblázat. A BCLC stádiumbeosztás Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) stádiumbeosztás Tumor státusz PST 0 0

Tumor stádium

Okuda stádiumok

Unifokális

I

A2

0

Unifokális

I

A3

0

Unifokális

I

A4 B: közepes súlyosságú HCC

0

3 tumor <3 cm

I-II

Nincs portális hipertenzió, normal bilirubin Portális hipertenzió, normális bilirubin Portális hipertenzió, abnormális bilirubin Child-Pugh A-B

Nagy multinoduláris

I-II

Child-Pugh A-B

C: elorehaladott HCC

0 12a

Vaszkuláris invázió v. extrahepatikus terjedés

I-II

Child-Pugh A-B

D: végstádiumú HCC

3-4

Bármely kiterjedés

IIIb

Child-Pugh C

Stádium A: korai HCC A1

Máj funkcionális státusz

PST: beteg tápláltsági állapota, HCC: hepatocellulár carcinoma

A, B stádiumok: minden kritériumnak meg kell felelnie a betegnek C stádium: legalább egy kritériumnak teljesülnie kell (a): PST 1-2 vagy vaszkuláris invázió/extrahepatikus terjedés D stádium: legalább egy kritériumnak kell teljesülnie (b): PST 3-4 vagy III Okuda stádium/Child-pugh C

B.

KÍSÉRLETES ÁLLATMODELL

1.

Májcirrhosis és hepatocelluláris carcinoma modell Fischer-344 patkányokon A kísérletes májcirrhosis és hepatocelluláris carcinoma létrehozása Zalatnai és

Lapis módszerével történt. 223,

224

A vizsgálathoz hím, Fisher-344 törzsbol származó

(F344)-es patkányokat használtunk, amelyek a vizsgálat kezdetén 180 g tömeguek voltak. Az állatokat légkondicionált, 55%-os páratartalmú szobában tartottuk. A vizsgálat kezdetén az állatokat 3 csoportra osztottuk. A kontroll csoportba 14 állat került. 10 állat egyszeri alkalommal, a vizsgálat kezdetén intraperitoneálisan 200 mg/ttkg 0,9%-os NaCl-ben oldott diethylnitrosamine-t, (DEN; Serva, Heidelberg) kapott. 2 hét múlva az ivóvizet 0,05 %-os phenobarbital (phenobarbital- na; Sigma, St. Louis, MO, USA) oldatra cseréltük. A harmadik csoportba (n=16) a diethylinitrosamine és phenobarbital mellett hetente háromszor intragasztrikus szondán szén-tetrakloridot (0, 5 ml olivaolajban oldva) kapó állatok kerültek. A 8. hét után minden csoportból az állatok fe lét leöltük. A csoportok másik felénél folytattuk a kezelést. A kísérlet 16 hétig

42

tartott, és ezen ido alatt a dyethilnitrosamine-phenobarbital-szén-tetrakloriddal kezelt csoportban az állatok elhullása nem érte el a 20%-ot.

2.

Vér, liquor, és májszövet mintavétel

Az állatokat éterrel altattuk, majd a belso szemzugból kapilláris segítségével véreztettük el. Liquort a ciszterna magna punkciójával nyertünk. A lépet és a heréket eltávolítottuk és mérésig fagyasztva tároltuk. Az állatok májából szövettani vizsgálatra 8%-os formalin oldatban félretettünk mintát, a máj többi részét pedig nociceptin mérésig 80o C-on tároltuk. A makroszkóposan jól elkülönítheto hepatocelluláris carcinoma göböket külön fagyasztottuk le.

3.

Laboratóriumi paraméterek

A vérmintákból a plazma nociceptin meghatározáson kívül az alábbi laboratóriumi paramétereket

határoztuk

meg

a

Semmelweis

Egyetem

I.sz

Belgyógyászati

Klinikájának Központi Laboratóriumában: szérum bilirubin, GOT, GPT, GGT, ALP.

4.

Szövettani feldolgozás

Szövettani vizsgálat céljára állatonként két-két azonos jól definiálható helyrol kivett májszövet darabka szolgált, amelyeket a beágyazásig 8%-os formalin-oldatban tároltunk. A szövettani vizsgálatokat a Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetében végezték. A paraffinba történo beágyazást követoen az 5 ? m-es metszeteket HE-alciánibolya-PAS, picrosirius-red oldattal megfestve mikroszkóp alatt vizsgálták.

C.

M ÉRÉSI MÓDSZEREK: PLAZMA, CSF, MÁJSZÖVET NOCICEPTIN ÉS NOCISTATIN

TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA RADIOIMMUNOASSAY SEGÍTSÉGÉVEL

1.

Mintavétel, elotisztítás, és extrakció A különféle szövetekbol, valamint plazmából és liquorból történo nociceptin

meghatározáshoz az alábbi mintakezelési és elotisztítási módszert alkalmaztuk. Reggel 8 és 10 óra között, éhgyomorra könyökvénából (patkányokban szemzugból) levett (6 ml) K-EDTA-val alvadásgátolt, és Aprotininnel (0,6 TIU/ml vér,

43

Calbiochem), mint proteázgátlóval kezelt vér feldolgozását, a vérvételt követo két órán belül megkezdtük. A vérminták szállítása hutve (0-4ºC) történt. A fentiek szerint elokészített vérmintákból a plazmát centrifugálással nyertük (1600? g fordulatszámon 4ºC-on 15 percig, Janetzky K70, Németország), és a plazma minták 1 ml-es frakcióit 80ºC-on tároltuk.

2.

Szöveti nociceptin és nocistatin meghatározás Validált minta-elokészítési módszert dolgoztunk ki patkány, máj és egyéb

szövetekbol történo nociceptin és nocisistatin meghatározásra. A szöveteket a 0ºC-on történt kivételt követoen a feldolgozásig ? 80ºC-on tároltuk.

3.

Májszövet A felhasznált májszövet átlagos tömege ebben az esetben 100 mg volt. A feltárás

a májszövet esetében két lépésben történt; elsoként magas fordulatszámon késes homogenizálóval végeztük a feltárást, második lépésben pedig ultrahangos (Labsonic) dezintegrálással folytattuk. A feltárást követoen a mintákat ismét 5 percre 95ºC-os vízfürdobe helyeztük. A 0-4ºC fokon történo 10 perces ülepítést követoen a mintákat magas fordulatszámon 10 percig 12.000? g 4ºC-on centrifugáltuk, és a felülúszót leszívtuk. A víztiszta felülúszó 1 ml-es frakcióit a felhasználásig ? 80ºC tároltuk.

4.

Ascites nociceptin szintjének vizsgálata A beteg belegyezését követoen az ascites punkció után mintát tettünk félre

nociceptin szint meghatározásra. A natív csoben tárolt mintát aprotinin hozzáadása nélkül fagyasztottuk, majd határoztuk meg a nociceptin tartalmat.

D.

EXTRAKCIÓ A nociceptin és nocistatin extrakcióját C18 SPE-at tartalmazó oszlopon az

alábbiak szerint végeztük: A felolvasztott mintákhoz azonos térfogatú 1%-os trifluor-ecetsavat (TFA) adtunk, ezután 20 percig 17.000? g 4ºC-on centrifugáltuk. Az így nyert felülúszót elokészített (1%-os trifluor-ecetsavval (TFA), 60%-os acetonitrilben oldott 1%-os TFA) C18 SPE

44

oszlopra (ABL&E JASCO) vittük. Az oszlopon lévo mintákat 1%-os trifluor-ecetsavval mostuk, és 60%-os acetonitrilben oldott 1%-os trifluor-ecetsavval oldottuk le. Az extrakciót követoen a mintákat vákuumcentrifugában (SAVANT, USA) bepároltuk.

E.

A RADIOIMMUNOASSAY MÓDSZER LEÍRÁSA Standard és validált módszert alkalmaztunk. A módszer kiválasztásánál nagy

érzékenységu (a kimutathatósági határ 1 pg) és nagy szelektivitású (nem ad keresztreakciót a hasonló szerkezetu peptidekkel, dynorfin-A, ß-endorfin, metenkefalin), és tág mérési tartományú (1-128 pg/ml) módszert választottunk. Alkalmas módszernek a radioimmunoassay mutatkozott. A módszerhez szükséges standard peptidet, RIA puffert, [125 I]N/OFQ-t és nocistatint, a nyúlban a peptiddel szemben termelt antiszérumot, normál nyúl szérumot, és a kecskében termelt anti nyúl szérumot RIA Kit-ként (PhoenixPeptid, USA, California) alkalmaztuk. Nyúl antiszérumot tettünk (100µl) minden egyes csobe, majd inkubáltuk egy éjszakán át 4o C-on. [125 ][ITyr]N/OFQ vagy nocistatint (8000-10000 c.p.m./100 µl) adtunk mindegyikhez, és újból inkubáltuk azonos körülmények között egy éjszakán át. Kecskében termelt anti nyúlt IgG szérumot és normális nyúl szérumot (100µl) tettünk hozzá, majd 90 percig szobahomérsékleten inkubáltuk. 500µl buffer hozzáadása után 1700g-n 20 percig 4o Con centrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk és ebben a radioaktivitást 10 mintaváltós ?mérovel (BIO-RAD, Magyarország) mértük, amelyhez a mérési eredményeket spline illesztéssel értékelo számítógépes program csatlakozott (ISO-DATA, USA). (Az eredményeket a 4-tol 128 pg- ig terjedo standard nociceptin görbéhez hasonlítottuk.)

F.

STATISZTIKAI ANALÍZIS Az eredmények kiértékelését az egymástól különbözo vizsgálatokból adódóan

többféle statisztikai program segítségével végeztük. A humán vizsgálatok során a plazma nociceptin szintek összehasonlításához a különbözo csoportokban Mann-Whitney U tesztet alkalmaztunk. A nociceptin szint és a májparaméterek közötti összefüggések kimutatását Spearmann RO korrelációval végeztük. Az állatkísérletek eredményeit Student féle t-próbával értékeltük ki. Az alkalmazott szignifikancia szint 95%-os volt. A plazma, liquor és szöveti nociceptin és nocistatin szintek összehasonlítására ANOVA tesztet használtunk. A nociceptin szintek

45

és a laboratóriumi adatok közti összefüggés értékelésére Pearson korrelációt alkalmaztunk. A statisztikai paraméterek értékeléséhez Statistica 6.0 (StatSoft Inc, OK, USA) programot használtunk.

46

V.

EREDMÉNYEK

A.

PLAZMA NOCICEPTINSZINT VIZSGÁLATOK KRÓNIKUS MÁJBETEGEKBEN

26 Wilson kóros, 21 primer biliáris cirrhosisos, 18 krónikus hepatitisben szenvedo, 15 májcirrhosisos (9 alkoholos, 6 HCV pozitív), and 18 primer májdaganatos (hepatocelluláris carcinoma) beteg vett részt a vizsgálatban. A HCC diagnózisa a laboratóriumi adatokon, UH, CT, MRI vizsgálati leleteken, valamint vékonytu biopszia, 3 esetben sebészeti, 1 esetben autopsziát követo hisztológiai vizsgálat eredménye alapján született. A szérum AFP érték 11 esetben volt magas. A tumor átméroje 2,5 és 11 cm között volt, 5 esetben volt kisebb, mint 5 cm, és 13 esetben nagyobb. Egy esetben sem tudtunk igazolni extrahepatikus szórást. A májdaganatos csoportban 12 beteg számolt be fájdalomról, amelyet nem-opioid fájdalomcsillapítókkal kezeltünk. 6 betegnek nem volt fájdalma.

4. táblázat. A különbözo betegcsoportok jellemzoi a plazma N/OFQ szintekkel és a szignifikancia értékekkel (p) Esetszám Kontroll Kr. hepatitis PBC Wilson kór HCC

+

29

Kor év 19-45

Fájdalom 29

Plazma N/OFQ pg/ml 9,2±1,8

18 21 26 19

22-72 36-72 14-55 32-80

12

18 21 26 6

10,2±3,6 12,1±3,2 14,2±2,7 105,9±14,4

p

p<0,001 p<0,001 p<0,0001

Két különbözo HCC stádiumbeosztást használtunk a betegek besorolásához. A BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer)

225

klasszifikáció a beteg állapota, a tumor uni-, vagy

multifokalitása, a vaszkuláris invázió, a portális hipertenzió, az Okuda stádiumbeosztás és a Child-Pugh klasszifikáció alapján pontozza a betegeket. Így a betegek az alábbi stádiumokba kerültek: A1 stádium (n=5), A4 stádium (n=6), B stádium (n=3) és D sádium (n=4). A CLIP (Cancer of the Liver Italian Program) pontrendszer kritériumai226, 227 a ChildPugh klasszifikáció, a tumor morfológiája, kiterjedése, a portalis thrombosis jelenléte és a szérum AFP szint alapján osztályozza betegeket: CLIP 0 (n=2), CLIP 1 (n=5), CLIP 2 (n=5), CLIP 3 (n=4), CLIP 4 (n=1), CLIP 5 (n=1).

47

A 29 kontroll személy a medikusok és a stáb tagajai közül került ki. 140

1 4 0

** 120

1 2 0

NC(pg/mL±SD)

100

1 0 0

80

8 0

60

6 0

40

4 0

*

*

*

20

2 0

0

0

Kontroll (n=29) Wilson (n=26)

PBC (n=21)

CH

(n=18) Cirrhosis (n=15)

HCC (n=18)

6. ábra Plazma nociceptin szint (pg/mL? SD) egészséges kontroll személyekben, Wilson kórban, primer biliáris cirrhosisban (PBC), krónikus hepatitisben (CH), cirrhosisban és hepatocelluláris carcinomában (HCC). * p<0.001 vs kontroll, **p<0.0001 vs kontroll és minden egyéb csoporthoz

Eredményeinket az 5. ábra mutatja. Tízszer magasabb plazma nociceptin szintet mértünk hepatocellulárisd carcinomás betegekben (105.9? 14.4 pg/mL, p<0.0001), mind Wilson kóros (14.0? 2.7 pg/mL, p<0,001), mind PBC-s (12.1? 3.2 pg/mL, p<0,001), mind májcirrhosisos (12.8? 4.0 pg/mL, p<0,001), krónikus hepatitises betegekhez képest (10,2? 3.6 pg/mL), és kontrollokhoz képest (9.2? 1.8 pg/mL, p<0.001 ). A krónikus hepatitises betegek plazmamintában mért N/OFQ szint nem volt szignifikáns a kontrollokhoz képest. Az egyes primer májdaganatos betegekhez tartozó klinikai és laboratóriumi adatokat, AFP és a N/OFQ szinteket az 5. táblázat mutatja.

48

5. táblázat. A 19 hepatocelluláris carcinomás beteg klinikai jellemzoje Tumor mérete (UH) Uni-

Kor Nem Etiol.

AFP

é

(ng/mL) (cm)

nod.

Multi- BCLC CLIP Bi nod.

ALP

CGGT Asc. P

st.cl.

cl.

(mg/dL) (U/L) (U/L)

A4

3

1,72

306

102

1

80

F

Alk.

937

15 x11

+

2

64

F

Alk.

1385,9

5x7x6

+

A1

1

1,92

242

3

60

F

Alk.

89

0,5 – 1,5 és 3

+

B

2

1,07

2169

4

62

F

Alk.

91

1 - 1,5 és 3,5

+

B

2

1,12

5

80

F

Alk.

937

15 x 11

+

A1

3

6

70

F

Alk.

459

7x 6

+

A1

7

59

F

Alk.

7,7

2,3

+

D

8

66

F

Alk.

2

1,5

+

9

48

F

HCV

15

6x6

+

10 66

F

HCV

171

2 x 2, 2 x 2

11 76

F

HCV

9

6 x 7+5 x 4

12 78

F

HCV

350

5x6

13 48

N

HCV

13

2,1 x 2, 1,6 x 2,1

14 81

F

HCV

1050

8 x 10

15 66

F

HBV

6

16 45

N

WD

5

17 68

N

PBC

3480

18 32

N

ism.

1050

N/OFQ (pg/mL)

-

A

108,39

107

-

A

95,02

1000

-

B

96,05

2038

995

-

B

104,17

1,71

306

102

-

A

111,59

2

0,78

192

68

-

A

111,51

2

8,32

44,3

97

-

C

128

A1

0

1,25

192

24

-

A

81,6

A4

1

5,75

1766

253

-

B

90,41

+

A4

1

2,55

460

232

-

A

89,81

+

D

4

13,91

834

276

+

C

114,65

A1

0

0,68

270

37

-

A

114,7

B

1

1,36

474

1060

-

A

128

+

A4

3

3

569

517

-

A

98,31

4 x 4,5

+

D

2

3,35

442

199

+

C

106,03

6 x 4,6

+

A4

1

0,42

910

212

+

B

128

11 x 7, 5

+

D

5

4,79

1856

960

+

C

172,2

10 x 8,5 x 18

+

A4

3

0,34

233

24

-

-

85,5

+ +

AFP = alfa- fetoprotein, BCLC st. cl.= Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) klasszifikáció, CLIP cl.= Cancer of the Liver Italian Program Group (CLIP) pontrendszer, Bi = Szérum összbilirubin, ALP = alkalikus foszfatáz, GGT = gamma glutamyl transferáz,Asc.= ascites C-P =Child-Pugh pontrendszer, N/OFQ = nociceptin/orphanin FQ

Nem találtunk összefüggést a plazma nociceptin szintek és a laboratóriumi májaparaméterek, - beleértve az AFP-t – között egyik csoportban sem. A plazma N/OFQ szint magasabb volt azokban a HCC-s betegekeben is, akikben az AFP szint nem volt emelkedett. Nem találtunk összefüggést a fájdalom megléte illetve hiánya között. Magas nociceptin szintet mértünk mind a HCC-s betegek azon csoportjában, akik fájdalomról számoltak be (104.9? 14.9 pg/mL, n=12), mind azokban, akik nem jeleztek fájdalmat (107.7? 14.5 pg/mL, n=6).

49

N/OFQ (pg/ml)

140 120 100 80 60 40 20 0 Fájdalomról beszámoló betegek

Fájdalommentes betegek

n=12

n=6 HCC

7. ábra. Fájdalomról beszámoló és fájdalommentes HCC-s betegek plazma nociceptin szintje

Nem mutatkozott különbség a tumor mérete szerint sem (a tumor mérete kisebb, mint 5 cm: 109,4? 16,5, n=5, nagyobb, mint 5 cm: 115,2? 12,7, n=13) és az uni-, és multifokalitás között.

N/OFQ (pg/ml)

140 120 100 80 60 40 20 0 Tumor mérete > 5 cm

Tumor mérete < 5 cm

n=5

n=13 HCC

8. ábra. HCC-s betegek plazma nociceptin szintje a tumor mérete szerint csoportosítva

Nem találtunk semmilyen összefüggést a stádiumok között sem a BCLC, sem a CLIP rendszer szerint.

50

Egy betegben lehetoségünk nyílt az ethanolos injekciót megelozoen, majd azt követoen a plazma nociceptin szint követésére. A magas nociceptinszint nem csökkent drasztikusan 10 napon belül. A terápiát megelozoen a N/OFQ szint 116 pg/mL volt, majd 110, 108, 112, 103 pg/mL-t mértünk az 1., 3., 7. és tizedik napon. 120

N/OFQ (pg/ml)

115 110 105 100 95 Terápia elott

1. nap

3. nap

7.nap

10.nap

9. ábra. Alkoholos infiltrációval kezelt hepatocelluláris carcinomás beteg plazma nociceptin szintje a terápia elott, illetve az azt követo 1., 3., 7. és 10. napon

B.

ESETISMERTETÉS: PRIMER BILIÁRIS CIRRHOSIS TALAJÁN KIALAKULT HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMA ; PLAZMA NOCICEPTIN SZINT KÖVETÉSE A DAGANAT KIALAKULÁSÁVAL PÁRHUZAMOSAN

A 47 éves nobeteg gyengeséggel, viszketéssel, májmegnagyobbodással valamint magas alkalikus

foszfatáz

és

gamma-GT

értékek

miatt

jelentkezett

hepatológiai

szakrendelésünkön. A primer biliáris cirrhosis diagnózisát a klinikai tünetek, laboratóriumi leletek, AMA M2 pozitivitás, a negatív ultrahang, ERCP kép és a májbiopszia

(II/III

stádiumú

primer

biliáris

cirrhosis)

bizonyította.

Családi

anamnézisében semmilyen májbetegség nem szerepelt, valamennyi egyéb kockázati tényezot, mint alkoholfogyasztás, HBV és HCV infekció ki lehetett zárni. Anamnézisében appendectomia, két császármetszés szerepelt. 38 éves korában elmaradt a menstruációja, ennek megfeleloen a BMD értékei alacsonyabbak voltak, mint az azonos korú noi populációban. Éveken keresztül ursodeoxycholsav (Ursofalk), kalcium és D-vitamin kezelésben részesült.

51

Osteoporosisa a betegség elorehaladtával súlyosbodott. A PBC diagnózisa után 5 évvel a BMD értékek mind a femur nyakon (T-score: –5.12, Z score: -3.38), mind a lumbalis csigolyákon (T-score: –5.44, Z-score:-3.9) szignifikánsan csökkentek. 57 éves korára a kalcium, D-vitamin szupplementáció, kalcitonin és bisphophonate (Fosamax) kezelés ellenére több helyen összeroppantak a csigolyái, csípoje eltört, mozgáskorlátozottá vált. Primer biliáris cirrhosisa progrediált, az évek folyamán elérte a IV. stádiumot. Évente ellenoriztük a beteget ultrahang vizsgálattal, félévente laboratóriumi kontrollt végeztünk. Az évek folyamán vér-, és plazmamintákat tettünk félre tudományos céllal. A minták gyujtése a beteg hozzájárulásával, etikai standardok figyelembe vételével, a regionális etikai bizottság engedélyével történt. 18 évvel a PBC diagnózisa után hepatocelluláris carcinomát dia gnosztizáltunk. Az éves ultrahang kontroll során a 2,5 cm-es fokális lézió látszott az V. szegmentumban, amely gyorsan növekedett.

A gócból vett vékonytubiopsziás minta citológiai vizsgálata

megerosítette a HCC gyanúját. A tumor növekedésével párhuzamosan folyamatosan ellenoriztük a beteg ALP, GGT, és szérum AFP szintjét. A tumor kialakulása elott az AFP érték a normális tartományban (13 ng/mL) maradt, míg a daganat növekedésével párhuzamosan, fokozatosan emelkedett (426 ng/mL), a beteg halála elott elérte a 3480 ng/ml értéket. A beteg visszautasított mindenféle tumorellenes kezelést, és késobb is csupán szupportív kezelést és fájdalomcsillapítókat fogadott el. A daganat mérete elérte a 12 cm-t, beszurte az V., VII., VIII. és részben a IV. májszegmentumot. Metasztázis nem volt kimutatható, de a májdaganat centrális nekrózisára utalt az ultrahang kép. A beteg tumoros cachexia következtében elhunyt 19 hónappal a HCC diagnózisának felállítása után. A boncolás mind a PBC IV. stádiumát, mind a HCC-t megerosítette. Az ismertetett eset egy újabb példa a primer biláris cirrhosisban jelentkezo hepatocelluláris carcinomára, és megerosíti azokat a megfigyeléseket, hogy a HCC foként a PBC III. illetve IV. stádiumában alakul ki. Az általunk leírt esetben a HCC-t 18 évvel a PBC diagnózisa után diagnosztizáltuk ki és 2 éven belül a beteg halálához vezetett. A súlyos osteoporosis gyakori PBC-ben, de számos szerzo szerint nem specifikus szövodménye a PBC-nek. 228,

229

Betegünkben az alapbetegség és a korai

menopausa együtt vezetett olyan súlyos csontritkuláshoz, hogy a beteg élete végéig mozgáskorlátozottá vált. Az alacsony szérum osteocalcin szint alacsony turnoveru

52

osteoporosist jelzett. A betegben, más PBC-s betegekhez hasonlóan magas szérum osteoprotegerin (OPG) és az alacsony RANKL szinteket mértünk. 230 A normális értéket kétszer meghaladó osteoprotegerin szint ellenére folyamatos csontvesztés volt tapasztalható. Mások is megerosítették, hogy PBC-ben magas az OPG és alacsony a RANKL szint, de ez nem függ össze az osteoporosissal. 231 A tumor kialakulása elott az AFP érték a normális tartományban (13 ng/mL) maradt, míg a daganat növekedésével párhuzamosan, fokozatosan emelkedett (426 ng/mL), a beteg halála elott elérte a 3480 ng/ml értéket. A plazma N/OFQ szint normális tartományban (9.2? 1.8 pg/mL) a tumormentes stádiumban (10,6 pg/ml), míg késobb progresszíven emelkedett a tumor növekedésével párhuzamosan (15.8, 65.8, 103.7, 128 pg/mL). A beteg halála elott elérte a legmagasabb értéket (172.2 pg/ml). (1. diagram.)

AFP

pg/ml

NC

pg/ml

UH: 11 cm fokális lézió

180

3500

UH: 2.5 cm fokális lézió

3000 AFP (ng/mL)

200 160 140

2500

120

2000

100

1500

80 60

1000

N/OFQ (pg/mL)

4000

40

500

20 0

10 .20 00 12 .20 00 02 .20 01 04 .20 01 06 .20 01 08 .20 01 10 .20 01 12 .20 01 02 .20 02 04 .20 02 06 .20 02 08 .20 02 10 .20 02 12 .20 02

0

Time (month/year)

10. ábra. A plazma nociceptin, és a szérum alfa- foetoprotein szintjének változása egy primer biliáris cirrhosis talaján kialakult hepatocelluláris carcinomás betegben a daganat kialakulásával párhuzamosan

Az autopszia során vett cirrhotikus és tumoros májszövetben is megmértük a neuropeptid szintjét. Tizenhatszor magasabb nociceptin koncentrációt találtunk a daganatban (160 fg/mg) összehasonlítva a daganatmentes, de cirrhotikus résszel (10 fg/mg).

53

N/OFQ tartalom (fg/mg)

160 140 120 100 80 60 40 20 0

Hepatocelluláris carcinoma szövet

Cirrhotikus májszövet

Sz.Z. 68 é

11. ábra. A hepatocelluláris carcinoma szövet és az azt körülvevo cirrhotikus májszövet nociceptin tartalma a PBC talaján kialakult HCC- s betegben

C.

H EPATOCELLULÁRIS CARCINOMA

ÉS

CIRRHOSIS

MODELL

FISCHER-344

PATKÁNYBAN

A kísérlet 16 hete alatt az állatok elhullása 16,25%-os volt (n=13). Makroszkóposan látható hepatocelluláris carcinoma és szövettanilag igazolható májcirrhosis alakult ki a 16. hétre abban a csoportban, amelyben az állatok diethylnitrózamin, phenobarbitál és széntetraklorid (DEN+PB+CCl4) kezelést kaptak (3. csoport).

54

12. ábra. Makroszkópos kép a májról, léprol és herékrol a különbözo csoportokban kísérletes májcirrhosisban és hepatocelluláris carcinomában patkányban. (Kontroll,

P=Phenobarbitál,

DP=

Diethylnitrózamin+Phenobarbitál,

és

DPC=diethylnitrózamin+Phenobarbitál+széntetra-klorid)

A többi csoportban nem tudtunk HCC-t igazolni. Cirrhosist, zsíros degenerációt és neoplasztikus nodulusokat mutattunk ki szövettanilag ugyanebben a csoportban (DEN+PB+CCl4) a 8. héten. A neoplasztikus nodulus nagyjából kör alakú, döntoen acidophil és basophil hepatocytákat tartalmazó képlet, torzult architektúrával, a környezo szövettol demarkációs határ választja el, de nem mutatja a carcinoma szövettani jeleit. A hisztológiai eltéréseket mind a 8., mind a 16. héten a 6. táblázat tartalmazza. A boncolás során jelentosebb mennyiségu ascitest, vérzést az állatoknál nem tapasztaltunk.

6. táblázat. A 8. és 16 héten igazolt szövettani eltérések a különbözo csoportokban. 8.hét Kontroll Den+ Pb Den+Pb+CCl4 16. hét Kontroll Den+ Pb Den+Pb+CCl4

(Kontroll,

Degeneratio adiposa

Cirrhosis

Fókusz

Neoplasztikus nodulus

HCC

n=8 n=5 n=8

0/8 0/5 8/8

0/8 0/5 0/8

0/8 0/5 0/8

0/8 0/5 5/8

0/8 0/5 0/8

n=6 n=5 n=8

0/6 0/5 0/8

0/6 0/5 8/8

0/6 0/5 4/8

0/6 0/5 5/8

0/6 0/5 8/8

P=Phenobarbitál,

DP=

Diethylnitrózamin+Phenobarbitál,

DPC=diethylnitrózamin+Phenobarbitál+széntetra-klorid)

55

és

A testtömeg, máj, lép és here súlyváltozások a korábban leírt eredményektol nem különböznek szignifikánsan. 224 (7. táblázat)

7. táblázat. A 8. és 16. héten mért test-, máj-, lép- és heretömegek a különbözo csoportokban. (g)

Testtömeg

8. hét Kontroll DEN+PB DEN+PB+CCl4 16. hét Kontroll DEN+PB DEN+PB+CCl4

Májtömeg

Léptömeg

Heretömeg

n=8 241.5±13.8 n=5 269.4±12.1 n=8 227.4±16.46*

8,7±1.82 11.76±0.47 10.97±1.63

0.46±0.05 0.49±0.03 0.76±0.14*

2.64±0.15 2.83±0.08 1.32±0.63*

n=6 321.83±48.94 n=5 310±15.25 n=8 290±15.2

11.07±2.34 9.19±0.88 10.79±0.93

0.59±0.09 0.56±0.07 0.87±0.12

3.12±0.41 3.11±0.26 2.57±0.25

* p<0.001 vs DP és kontroll

(Kontroll,

P=Phenobarbitál,

DP=

Diethylnitrózamin+Phenobarbitál,

és

DPC=diethylnitrózamin+Phenobarbitál+széntetra-klorid)

Adataink azt mutatják, hogy a kísérlet 8. héten a cirrhotikus állatok (DEN+PB+CCl4) állatok test-, lép és heretömege szignifikánsan alacsonyabb volt mind a kontroll, mind a DEN+PB kezelt állatokhoz képest. A 16. héten sem a kontroll sem a kezelt csoportokban a testtömegek között 95%-os szignifikancia szintnél nem volt különbség, bár a daganatos (egyben cirrhosisos) állatok testtömege a kontrollhoz képest átlagosan 31 grammal alcsonyabb volt (321? 48,94 vs. 290? 15,2). *

Testtömeg (g)

400 350 300 250 200 150 100 50 0 n=8

n=7

n=5

n=5

n=8

n=8

8.hét

16. hét

8.hét

16.hét

8. hét

16. hét

Kezelés nélkül

DEN+PB

Kontroll

Kezelt

DEN +PB +CCl4 Cirrhosis

HCC

13. ábra. A testtömeg változások a különbözo csoportokban 8. és 16 héten. *p<0,001

56

A cirrhosisos (DPC) csoport májtömege a 8. héten 10,97? 1,63 és a 16. héten 10,79? 0,93 volt, amely nem különbözött jelentos mértékben a phenobarbitált kapott kontroll csoporttól (8. hét: 11,76? 0.41 és 16. hét: 9,19? 0.88). A kontroll állatok májtömegének átlaga a 8. héten alacsonyabb volt a DPC állatok májtömegeinél (8,7? 1,82). A 16. héten magasabbak (11,07? 2,34) értékeket mértünk. Ez a különbség 95%-os szignifikancia szint mellett nem mutatott jelentos eltérést. A májtömegek növekedése a kezelt csoportnál a phenobarbital-kezelés enzim- induktor hatásának tulajdonítható. 16

Májtömeg (g)

14 12 10 8 6 4 2 0 n=8

n=7

n=5

n=5

n=8

n=8

8.hét

16. hét

8.hét

16.hét

8. hét

16. hét

Kezelés nélkül

DEN+PB

Kontroll

Kezelt

DEN +PB +CCl4 Cirrhosis

HCC

14. ábra. A májtömeg változások a különbözo csoportokban 8. és 16 héten. *p<0,001

A heretömegek átlaga és szórása a kontroll csoportban a 8. és a 16. héten sem különbözött jelentosen (8. hét: kontroll 2,64? 0,15; 16. hét: kontroll 3,13? 0,41). A cirrhosisos állatoknál azonban a heretömegekben szignifikáns (p? 0,001) csökkenést (8. hét: 2,64? 0,15 vs. 1,32? 0,63; 16. hét: 3,12? 0,41 vs. 2,46? 0,09) figyelhettünk meg a kontroll csoporthoz viszonyítva. Krónikus májcirrhosisban szenvedo betegeknél gyakran figyelheto meg a gynecomastia, illetve hereatrophia amely a máj funkcionális zavarára utal. A máj metabolikus aktivitásának csökkenésével csökken a szexuálszteroidok metabolizációja is, ennek hatására a magasabb tesztoszteron-szint okozta feed-back reakció a gonádok sorvadásához vezet. 232

57

*

4 Heretömeg (g)

3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 n=8

n=7

n=5

n=5

n=8

n=8

8.hét

16. hét

8.hét

16.hét

8. hét

16. hét

Kezelés nélkül

DEN+PB

Kontroll

Kezelt

DEN +PB +CCl4 Cirrhosis

HCC

15. ábra. A heretömeg változások a különbözo csoportokban 8. és 16 héten. *p<0,001

A cirrhosisos állatok léptömege majdnem kétszerese volt a kontrollokénak a 8. és a 16. héten egyaránt (0,46? 0,05; 0,59±0,09 vs. 0,76? 0,14; 0,87±0,12). A cirrhosisos állatokban megfigyelheto splenomegáliát a portális hypertensio következményének tartjuk.

*

1,2

Léptömeg (g)

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 n=8

n=7

n=5

n=5

n=8

n=8

8.hét

16. hét

8.hét

16.hét

8. hét

16. hét

Kezelés nélkül

DEN+PB

Kontroll

Kezelt

DEN +PB +CCl4 Cirrhosis

HCC

16. ábra. A léptömeg változá sok a különbözo csoportokban 8. és 16 héten. *p<0,001

A kórfolyamat alakulását a laboratoriumi paraméterek változása is jól mutatta. A kisérlet 8. és 16. hetében mért klinikai labor értékeket a 8. táblázatban foglaltuk össze.

58

8. táblázat.

A laboratóriumi paraméterek alakulása a kísérlet 8. és 16. hetében a

különbözo csoportokban. 8. hét Kontroll DEN+PB DEN+PB+CCl4

Bilirubin ALP ?µmol/L) (U/L)

GOT (U/L)

GPT (U/L)

GGT (U/L)

Albumin AFP g/L) (ng/mL)

n=8 n=5 n=8

1.76±1.1

734.7±82.8

118.7±21

75.6±19.4

0.0±0.0

33±0.5

0.0±0.0

2.14±1.2

488±43.3

167.6±68.4

194.6±84.9 0.0±0.0

33±1.9

0.0±0.0

54.4±72.4

1435.6±1242

7743±5909

5649±3942 72.12±16.2 27.3±3.1

0.±0.0

n=6 n=5 n=8

2.1±1.3

619.5±96.3

158.8±40.9

107.8±12.9 2.7±2.6

34.7±1.03

0.0±0.0

0.9±0.34

399.6±106.5

138.6±54.3

113±100.1

0.0±0.0

38±1.2

0.0±0.0

1.41±0.5

468.1±118.6

117.5±14.5

83.5±18.5

0.75±1.5

35±1.511

0.0±0.0

16. hét Kontroll DEN+PB DEN+PB+CCl4

Nem találtunk összefüggést a nociceptin szintje és a laboratóriumi májparaméterek között.

3000

120

2500 100

2000 80

ALP (U/L)

Szérum bilirubin (umol/l)

140

60

40

1500

1000

20

500 0

n=8

n=7

n=5

n=5

n=8

n=8

8.hét

16. hét

8.hét

16.hét

8. hét

16. hét

Kezelés nélkül

DEN+PB

DEN +PB +CCl4

Kontroll

Kezelt

Cirrhosis

0

HCC

n=8

n=7

n=5

n=5

n=8

n=8

8.hét

16. hét

8.hét

16.hét

8. hét

16. hét

Kezelés nélkül

DEN+PB

Kontroll

Kezelt

DEN +PB +CCl4 Cirrhosis

HCC

12000

9000 8000

10000

GPT (U/L)

GOT (U/L)

7000 6000 5000 4000 3000

8000

6000 4000

2000 2000

1000 0

0

n=8

n=7

n=5

n=5

n=8

n=8

n=8

n=7

n=5

n=5

n=8

n=8

8.hét

16. hét

8.hét

16.hét

8. hét

16. hét

8.hét

16. hét

8.hét

16.hét

8. hét

16. hét

Kezelés nélkül

DEN+PB

DEN +PB +CCl4

Kontroll

Kezelt

Cirrhosis

HCC

Kezelés nélkül

DEN+PB

DEN +PB +CCl4

Kontroll

Kezelt

Cirrhosis

HCC

17. ábra. A GOT, GPT szérum bilirubin szintjének változása a különbözo csoportokban a 8. és 16 héten a különbözo csoportokban.

59

Szignifikánsan magasabb nociceptin szintet mértünk a daganatos állatokban a 16. héten mind

a

plazmában

(91.4? 4.8pg/mL),

mind

a

liquorban

(952.2? 68.9pg/mL),

összehasonlítva a 2. csoporttal (9.8? 0.5 and 86.1? 8.6 egyenként) és a kezeletlen állatokkal (9.1? 0.3 and 92.1? 5.2), valamint a daganatmentes cirrhotikus állatokkal (3. csoport a 8. héten, 9.0? 1.0 and 96.4? 11.0)(p<0.0001 minden összehasonlításban). Szoros korrelációt találtunk a plazma és a liquor nociceptin szintje között minden csoportban (R=0.88, p<0.05). 1200

§

Nociceptin szint (pg/ml)

1000

800

600

400

200

# 0 Plazma

Liquor

Plazma

n=8 8.hét

Liquor

Plazma

Liquor

n=7

n=8

16.hét

8.hét

Kezelés nélkül

Plazma

Liquor n=8 16.hét

DEN +PB +CCl4

Kontroll

Cirrhosis

HCC

18. ábra. Plazma, Liquor nociceptin szintek a 8., 16. héten a kezelt és kezeltlen csoportokban. 95 %-os konfidencia határoknál: #: 87.4-95.47, és §: 894.4-1009.7

A daganatszövet nociceptin tartalma szignifikánsan magasabb volt (471.6? 84.3fg/mg), mint a környezo nem malignus, de cirrhotikus májszövet (59.9? 11.6fg/mg) és mint az egészséges állatok májszövetének N/OFQ tartalma (65.7? 26.3 fg/mg, p<0.001 mindkettore).

60

*

600 N/OFQ (fg/mg)

500 400 300 200 100 0 Kontroll

DEN+PB

Den+ PB+CCl4

Kontroll

DEN +PB

Tumomentes májszövet

Carcinoma szövet

Tumoros máj 8. hét

16. hét

19. ábra. A kísérlet 8. és 16 hetében mért nociceptin tartalom a májban. *p<0,001 vs valamennyi csoport.

D.

A NOCISTATIN SZINT KÍSÉRLETES HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMÁBAN

Lehetoségünk

nyílt

a

kontroll

és

hepatocelluláris

carcinomás

állatokban

a

prepronociceptinbol lehasadó másik peptid, a nocistatin mérésére. A nociceptin és nocistatin eredmények erosen korreláltak mindkét csoportban.

9. táblázat. Plazma, liquor és májszövet nociceptin és nocistatin tartalma a kontroll és májdaganatos állatokban. Plazma

Liquor

Nociceptin (pg/ml)

Plazma

Liquor

Nocistatin (pg/ml)

Kontroll 9,1±3,4 92,1±5,2 14,2±3,1 131,6±8,6 HCC 91,4±4,8 925±68,9 82,1±17,1 926,±25,5 *p<0,0001 vs kontroll, R=0,88

61

Májszövet (fg/mg) Nem-tumoros rész Tumoros rész Nociceptin Nocistatin Nociceptin Nocistatin 36,3±8,8 31,1±3,4 59,9±11,6 33,6±3,3 471,6±84,3* 336±53,3*

1000

*

900 800

N/OFQ (pg/ml)

700 600 500 400 300 200 100

HCC

0 Nociceptin (pg/ml) Plazma

Nocistatin (pg/ml) Plazma

Kontroll Nociceptin (pg/ml) Liquor

Nocistatin (pg/ml) Liquor

20. ábra. Plazma és liquor nociceptin és nocistatin szintek a kontroll és HCC-s állatokban. * p<0,0001, R=0,88

E.

A NOCICEPTIN TARTALOM VIZSGÁLATA HUMÁN DAGANATOS MÁJSZÖVETBEN ÉS AZ AZT KÖRÜLVEVO NEM DAGANATOS MÁJSZÖVETBEN A Semmelweis Egyetem II. sz Pathológia Intézetének és I.sz Sebészeti Klinikájának segítségével sikerült hepatocelluláris carcinomás betegek daganatszövet és környezo cirrhotikus májszövetmintáihoz hozzáférni, illetve abban, megmérni nociceptin tartalmat. 10 (6 férfi, 4 no; 44-78 év; 5 alkoholos, 3HCV cirrhosis, 2 ismeretlen etiológiájú) beteget vontunk be a vizsgálatba, akiket vékonytubiopsziás cytológiai vizsgálat után az I.sz. Sebészeti Klinikán operáltak. A tumor mérete 2-15 cm volt. A betegeket a BCLC stádiumbeosztása alapján csoportosítottuk: A1: 5 beteg, A4: 3 beteg, B: 2 beteg. Egészséges,

autóbalesetben

elhunyt

személyek

májmintáit

kontrollnak, amelyeket az Igazságügyi Orvostani Intézetbol kaptunk.

62

(n=2)

használtuk

90 80 N/OFQ (pg/ml)

70 60 50 40 30 20 10 0 A1

A3

A4

B

n=4

n=1

n=3

n=2

21. ábra Nociceptin tartalom a hepatocelluláris carcinomás betegek tumorszövetében. A betegeket a Barcelona Clinic Liver Cancer stádiumbeosztása alapján csoportosítottuk.

Szignifikánsan (p<0.001) magasabb nociceptin tartalmat mértünk a hepatocelluláris carcinoma szövetben (45,41±14,81 fg/mg) összehasonlítva a környezo májszövet N/OFQ tartalmával (2,95±1,19 fg/mg) és egészséges kontroll májszövet nociceptin tartalamához képest (2,71±0,54 fg/mg). * *

70 N/OFQ (fg/mg)

60 50 40 30 20 10 0 Tumormentes rész

Tumoros rész

Control

HCC

HCC

n=2

n=10

n=10

22. ábra. Nociceptin tartalom egészséges személyek má jszövetében, daganatos betegek (HCC) májszövetében és a hozzátartozó tumormentes májszövetben. (p<0,001)

63

F.

NOCICEPTIN SZINTJE KÜLÖNBÖZO ETIOLÓGIÁJÚ DAGANATOKBAN

Annak bizonyítására, hogy az emelkedett plazma nociceptin szint specifikus eltérés-e hepatocelluláris carcinomában, extrahepatikus daganatos betegek, és májmetasztázisos betegek plazmáját gyujtöttük össze. Daganatos betegek heterogén csoportjait vizsgálva, arra kerestük a választ hogy a nociceptinszintben tapasztalt jelentos emelkedést a máj érintettsége, a primer tumor, a metasztázis illetve a fájdalom egy-egy csoporton belül hatással van-e a plazma N/OFQ szintjére. A vizsgálatban 62 beteg vett részt. Az elso csoportba 19 HCC-s betegeket soroltunk (26 férfi és 13 no, átlagéletkoruk 43,5? 7,6 év). A második csoportba 30 különbözo etiológiájú extrahepatikus tumoros betegeket (3 prostatacarcinomás, 2 choledochus-, 6 tüdo-, 3 emlo-, 5 bor-, 5 pancreas-, 3 vesedagantos és 1 Non-hodgkin lymphomás) soroltunk (18 férfi és 12 no, átlagéletkoruk 52,3? 12,7 év). A harmadik csoportba (n=13) különbözo extrahepatikus daganatos, de májba metasztázist adó betegeket (7 férfi és 6 no, átlagéletkoruk 38,5? 14,2 év) választottunk. Mind a hepatocelluláris carcinomás csoportban (105,9? 14,4 pg/ml), mind az extrahepatikus

daganatos

betegcsoportban

(105,47? 16,23

pg/ml),

mind

a

májmetesztázissal rendelkezo betegcsoportban (106,33? 16,10 pg/ml) szignifikánsan magasabb (p<0,0001) plazma nociceptinszintet mértünk a kontrollokhoz képest (9,17? 1,63 pg/ml). A plazma nociceptin értékek a várakozásnak megfeleloen, nem csak a

külön

csoportban

vizsgált

HCC-s

betegekben,

hanem

egyéb

daganatos

megbetegedésekben is a kontrollhoz képest kiugróan magas értéket mutattak. Mivel nem mutatkozott különbség a tumor etiológiája, és a daganat keletkezése (primer vagy metastatikus) szerint, a plazma nociceptin mint lehetséges tumormarker szerepe vetodik fel.

64

140

N/OFQ (pg/ml)

120 100 80 60 40 20 0 HCC

Májmetasztázis

Extrahepatikus daganat

n=19

n=13

n=30

23. ábra. Plazma nociceptin szintek HCC-s, májmetasztázisos és extrahepatikus daganatos betegek plazmájában.

G.

NOCICEPTINTARTALOM KIMUTATÁSA ASCITESBEN

Az ascites a májcirrhosist kíséro gyakori jelenség. Két alkoholos cirrhosis talaján kialakult hepatocelluláris carcinomás betegben, akiben ascites jelent meg igazoltuk az ascitesben a nociceptint. Az irodalomban még nem vizsgálták az ascitesben a N/OFQ tartalmat. Mindkét HCC-s betegben kimutattuk a neuropeptidet, bár lényegesen alacsonyabb volt a N/OFQ szintje az ascitesben (4,14; 7,94 pg/ml), mint a plazmában (101,57; 105,42 pg/ml).

65

Plazma

Ascites

120

N/OFQ (pg/ml)

100 80 60 40 20 0 M.E.

J.S.

24. ábra A ascites és a plazma nociceptin szintje a két hepatocelluláris carcinomás betegben, akiknek ascitese is volt.

66

VI.

MEGBESZÉLÉS

A.

PLAZMA NOCICEPTIN SZINT VIZSGÁLATOK HEPATOLÓGIAI KÓRKÉPEKBEN A nociceptin kimutatható az agyban, a liquorban, a vérben, az granulocytákon,

lymphocytakon, és a gasztrointesztinális traktusban. A nociceptinnek és receptorának szerepérol nincsen adat malignus betegségekben, leszámítva azt a néhány in vitro vizsgálatot, amely neuroblastoma sejtvonalakon történt. 233,

28

Elsoként közöltünk

adatokat a hepatocelluláris carcinoma, májbetegségek és a nociceptinerg rendszer kapcsolatáról. Kiugróan magas plazma nociceptin szintet mértünk hepatocelluláris carcinomában. Bár szignifikánsan magasabb volt a N/OFQ szint Wilson kórban, primer biliáris cirrhosisban és májcirrhosisban is, de egyik malignoma mentes csoportban sem mértünk ilyen mértéku plazma nociceptinszint emelkedést a kontrollokhoz képest. Adataink szerint a magas plazma N/OFQ szint a primer májdaganat egyik indikátora lehet. A hepatocelluláris carcinomás betegek 20-40%-ban az AFP nem emlekedik meg, amely jelentosen hátráltatja a daganat diagnosztizálását. Fontos megemlíteni, hogy a N/OFQ szint magas volt azokban a betegekben is, akikben AFP szint normális volt. A nociceptin emelkedés valamennyi HCC-s betegben kimutatható volt. A daganat mérete fontos prognosztikai paraméter, hiszen a beteg további sorsát és lehetséges terápiás eljárásokat és a túlélést befolyásolhatja a malignus elváltozás nagysága és a gócok száma. 234 A magas plazma N/OFQ szint függetlennek bizonyult a tumor méretétol. A magas plazma nociceptin szint mechanizmusa és klinikai jelentosége HCC-ben tisztázatlan. A megnövekedett neuropetid termelés mellett a csökkent katabolizmus is szerepet játszhat. Több lehetoség is felmerül. Vajon a tumor termeli-e a peptidet, vagy csak jelzést küld az agynak, esetleg a perifériás idegeknek, hogy fokozzák a N/OFQ termelést? További lehetséges magyarázat, hogy a tumor egyszeruen csak akkumulálja a neuropeptidet, azáltal, hogy a saját NOP receptorai fokozottan expresszálódnak, amelyek nagyobb mennyiségben képesek így a fehérjét megkötni. Ezt a lehetoséget megerosíti az a tény,

67

hogy a NOP receptor mRNS-t kimutatták a májban235 , bár nem ismert olyan közlés, amely hepatocelluláris carcinoma szövetben igazolná a receptor mRNS-t. A fájdalom a daganatokat kíséro gyakori jelenség. A HCC-s betegek nagy része eros fájdalomról számol be. Ugyanakkor a betegek egy részében a képalkotó vizsgálat nagyméretu elváltozást ír le, de nem éreznek ezek a betegek fájdalmat. A nociceptin részt vesz a fájdalom feldolgozásában és megélésében. 236,237 Mi nem találtunk különbséget azok között a HCC-s betegek között, akiknek volt fájdalmuk és akiknek nem. Ko és munkatársai arról számoltak be, hogy azokban a betegekben, akik krónikus fájdalomról számoltak be, magasabb volt a plazma nociceptin szint, mint akik akut fájdalomról. Feltételezheto, hogy a nociceptinerg rendszeren belül a magas nociceptin szint egy kompenzációs mechanizmus, amely befolyásolhatja a fájdalom megélését a központi idegrendszerben. Ez a megfigyelés talán magyarázatot adhat arra, hogy elorehaladott stádiumú daganatos betegek magas nociceptin szinttel miért nem éreznek fájdalmat, míg más betegek kisebb daganattal nagy fájdalomról számolnak be. Figyelemre méltó, hogy az általunk mért nociceptin szint májrákos betegekben háromszor magasabb volt, mint Ko és munkatársai195 által közölt legmagasabb N/OFQ szint olyan betegekben, akik 6 hónapnál tovább tartó fájdalomról számoltak be, de malignus betegség nem volt igazolható. További kutatások szükségesek annak tisztázására, hogy a magas plazma nociceptin szint specifikus markere-e a HCC-nek. A nociceptin expresszálódik az immunsejteken, valamint kimutatták, hogy a granulocyták termelnek nociceptint és rendelkeznek NOP receptorral, ezáltal részt vesznek a többi granulocyta chemotaxisának stimulációjában és migrációjának fokozásában. 238 Így a magas N/OFQ szint a szervezet megváltozott immunológia, citokémiai és egyéb biológiai funkciójának indikátora lehet. A bakteriális endotoxin (LPS) és a proinflammatorikus citokinek, mint a TNF-alpha, köztudottan emelkedettek malignus folyamatokban és indukálják az astrocyták mRNS exepresszióját. A nociceptin feltehetoen szerepet játszhat a gyulladásos folyamatok során a neuro- gliális kommunikációban. 189

68

Ca2+

K+

ORL1

TGFa TGF a EGFR

Ga 16 Ga12 Ga14

Ga1/o/z ??

Pl3K?

Src SOS Ras

Rac

MAPK PKC

protoonkogének JAK2 ERK

JNK

STAT3

c-Jun

c-fos

p38

Elk-1

p108

c-myc CREB

ATF-2

24. ábra A nociceptinerg rendszerben és a hepatocelluláris carcinomában feltételezett közös jelátviteli mecahanizmusok találkozása, amelyek magyarázhatják a magas nociceptin szintet májdaganatos betegekben A 23. ábrán a hepatocelluláris carcinoma keletkezésében feltételezett intracelluláris mechanizmusok, valamint a nociceptinerg rendszer aktivációja által létrejött intracelluláris mechanizmusok láthatóak. A két út több helyen is találkozik. Mindkét ligand, a TGFa és a nociceptin is aktiválja a STAT fehérjecsaládot, valamint a protoonkogéneket. További kutatások szükségesek annak tisztázására, hogy vajon az emelkedett nociceptin szint indítja be ezeket a jelátviteli rendszereket a receptorok upregulációjával, vagy a daganat keletkezése indukálja a fokozott nociceptin termelést és potencírozza a daganatos sejtek szaporodását, csökkenteni azok apoptózisát. Ettol eltéro mechanizmus is lehetséges.

B.

PRIMER BILIÁRIS CIRRHOSIS TALAJÁN KIALAKULT HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMA : A PLAZMA NOCICEPTIN SZINT KÖVETÉSE A DAGANAT KIALAKULÁSÁVAL PÁRHUZAMOSAN: AZ ESET MEGBESZÉLÉS E Az ismertetett eset egy további példa a primer biliáris cirrhosis talaján kialakuló hepatocelluláris carcinomára, és alátámasztja azt a megfigyelést, hogy a HCC többnyire

69

a betegség IV. stádiumában fordul elo. 18 évvel a primer betegség felismerése után jelent meg a daganat és 2 éven belül halálho z vezetett. A PBC gyakori szövodménye az osteoporosis, bár ezt ma már a PBC nem specifikus komplikációjának tartják.228 Az ismertetett esetben az osteoporosist okozó korai menopauza és a PBC együttesen, többszörös csonttörésekhez vezetett, így a beteg súlyosan mozgáskorlátozottá vált. Az alacsony szérum osteocalcin szint alacsony csontújdonképzodéssel járó, úgynevezett low turnover osteoporosist jelzett. A magas szérum osteoprotegerin (OPG) és alacsony RANKL szintet írtak le primer biliáris cirrhosisban239 . Az ismertetett esetben szintén magas OPG és alacsony RANKL szintet mértünk. Progresszív csontvesztést figyeltünk meg a betegben, annak ellenére, hogy a szérum osteoprotegerin szint kétszerese volt a normális tartománynak. Magyarázatul az szolgálhat, hogy a májgyulladás szintén hozzájárulhat az emelkedett osteoprotegerin szinthez. 240 Ez az elso közlemény, amelyben a beteg követése során a plazma nociceptin szint progresszív emelkedését bizonyítottuk, a szérum alfa-fetoprotein szint emelkedésével és a primer májdaganat növekedésével párhuzamosan. A vérmintákat a beteg hozzájárulásával a tumormentes stádiumtól kezdve a tumor kialakulásán és a klinikai állapot rosszabbodásán át lefagyasztottuk, így lehetoség nyílt a plazma

nociceptin

és

szérum

AFP

monitorizálására

daganat

növekedésével

párhuzamosan. A tumor megjelenésékor a N/OFQ 6-szorosa volt a normális tartománynak, amit egészséges egyénekben mértünk (65,8 vs 9,2±1,8 pg/ml, n=29) és daganatmentes PBC-s betegekben (12,1±3,2 pg/ml, n=21). Amikor a tumor mérete meghaladta a 11 cm-t a plazma nociceptin szint a normális szint 17-szerese lett. A daganat szövetben mért magas N/OFQ tartalom, amely 15-szöröse volt a daganatmentes részben mértnek, felveti annak a lehetoségét, hogy a hepatocelluláris carcinoma szövet termeli-e a nociceptint, vagy csak a fokozott receptor expresszió miatt akkumulálja a neuropeptidet.

C.

KÍSÉRLETES MÁJCIRRHOSIS ÉS HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMA

Kísérletünkben a cirrhosis és a hepatocelluláris carcinoma hatását vizsgáltuk a nociceptinerg rendszerre. Az irodalomban nem található adat arra vonatkozóan, hogy ezek a kórképek hogyan befolyásolják a KIR- i és a perifériás, illetve a szöveti nociceptinszinteket alakulását. A Fischer-344 patkányokon kísérletesen létrehozott

70

cirrhosis illetve hepatocelluláris carcinoma a nociceptinerg rendszer szempontjából jól modellezi a humán kórképeket. További kutatások szükségesek, hogy a magas plazma nociceptin jelentoségét tisztázzuk hepatocelluláris carcinomában. A laboratóriumi paraméterek változása, köztük a kiugróan magas szérum bilirubin, GOT, GPT és alkalikus foszfatáz értékek a 8. héten a cirrhotikus állatokban a jelentos fokú májkárosodást támasztják alá. A 16. hétre lecsökkeno értékek a máj szintetikus kapacitásának kimerülését jelzik. A kontroll, fiatalabb állatok magasabb alkalikus foszfatáz értékei az enzim csont eredetére utalhatnak, bár nem mértünk külön máj és csontfrakciókat. A magas plazma, liquor és daganatos májszövet nociceptin szint a daganatos állatokban a megváltozott N/OFQ/NOP rendszer jelzoje. Az állatkísérletes eredmények összhangban

állnak

humán

megfigyeléseinkkel.

Figyelemre

méltó,

hogy

a

szignifikánsan magasabb plazma, liquor és szöveti nociceptin szintek csak abban a csoportban jelentek meg a 16.héten, amelyekben az állatok hármas kezelést kaptak, ugyanakkor közel normális értékeket mértünk az ugyanabban a kezelésben részesülo cirrhotikus állatokban a 8. héten, ahol zsírakkumuláció, cirrhosis és neoplasztikus nodulus alakult ki. A nociceptin szintjének emelkedését nem lehet magyarázni a DEN és a phenobarbitál direkt hatásával, hiszen nem volt emelkedett az N/OFQ szint a 16.héten a diethylnitrózamint és phenobarbitált kapó csoportban, a kontrollokkal összehasonlítva. A nociceptin szint emelkedésének pathomechanzimusa még a mai napig nem tisztázott. Magyarázatul az agy fokozott preproneuropeptid termelése mellett a a hepatocelluláris carcinoma szövet fokozott produkciója és a peptid csökkent lebontása szolgálhat. Az aminopeptidáz N (APN) és az endopeptidáz 24.15 (EP 24.15) olyan katabolikus enzimek, amelyek tészt vesznek a nociceptin lebontásában. Az EP 24.15 a metalloendopetidázok családjába tartozik és a hepatocyták cytosoljában helyezkedik el, ahol a hepatotoxin indukálta nekrózis predomináns. 241 Az APN fokozott expresszióját, ami az epeúti kanalikulusok ektonezimje, a mély icterus erosen serkenti. 242 Icterusa nem volt a boncolt állatoknak, de szövettanilag igazoltuk a cirrhosist a 3. csoportban a 16.héten, néhány esetben pedig az ascitest találtunk. A cirrhosis és a konzekvens cholestasis, amelyet az emelkedett alkalikus foszfátáz szint jelzett, befolyásolhatja az

71

opioiderg rendszert. Bergasa és munkatársai igazolták, hogy az opioidok, mint a proenkephalin, cholestasisos patkányokban akkumulálódnak a kísérleti állatok májban, amely a de novo szintézis helye is lehet.207 Met-enkephalin immunreaktivitást igazoltak primer biliáris cirrhosisos betegek májában, amely alátámaszthatja azt a megfigyelést, hogy a máj cholestasisban az endogén opioidok forrása lehet.198 Ugyanakkor a cirrhosis önmagában nem ad elegendo magyarázatot az emelkedett nociceptin szint okára, kísérletünkben. Mivel a liquorban a N/OFQ egy nagyságrenddel nagyobb koncentrációban mutatható ki, és májrák esetén ez a koncentráció növekszik meg tízszeresére, nagyon valószínu, hogy az

agyban

képzodo

nociceptin

termelodés

fokozódik

ugrásszeruen.

További

vizsgálatokat végzünk annak tisztázására, hogy a hepatocelluláris carcinoma szövetben megno-e

a

nociceptin

receptor

expresszió,

illetve,

hogy

kimutatható-e egy

szignálmechanizmus, aminek következtében májrák esetén az agyban megno a prepronociceptin, illetve N/OFQ képzés. További kutatások szükségesek, hogy a daganatszövetben miért emelkedett a nociceptin tartalom. A megnövekedett de novo szintézis mellett a vérbol felvett, és fokozott expressziójú NOP által megkötött N/OFQ is szerepet játszhat, a többi opioid rendszer analógiájára. A nociceptin receptorának mRNS-t kimutatták a májban235 , de nincs adat arra vonatkozóan, hogy a receptor jelen van-e hepatocelluláris carcinoma szövetben. A nociceptin szekvenciája homológiát mutat a proenkephalinnal és a prodynorphinnal. 4 A morfin és az endogén béta-endorfin éppúgy neuromodulátor, mint immunmodulá tor hatású, amelyet az opioid receptorok közvetítenek. Kimutatták, hogy az interleukin-4 az opioid receptorok transzkriptumainak fokozott megjelenéséhez vezet a perifériás vér sejtes elemeiben, immunsejtvonalakon és dendritikus sejteken. Arjomand és munkatársai a N/OFQ transzkriptumainak jelenlétét mutaták ki lymphocytákban. 25 Igazolták, hogy frissen izolált perifériás neutrophil granulocyták degranulációt követoen expresszálják és szekretálják a nociceptint. Feltételezték, hogy az immun-, és a nociceptinerg rendszer találkozása segíthet a fájdalom és a gyulladásos folyamatok közötti kapcsolat megértésében. 185 A gyulladásos mediátorok az astrocyták fokozott nociceptin expressziójához vezetnek.189 Ezek a gliasejtek fontos szerepet játszanak a gyulladásos- és immunválaszok közvetítésében. Az opioid peptidek fontos jelátvivok az ideg- és az immunrendszer között.

72

Ebben a kísérletben a hepatocelluláris carcinomára fókuszáltunk, de további vizsgálatok szükségesek az emelkedett nociceptin szint okának a tisztázására más malignus tumorokban. Összefoglalva patkányokban kísérletesen létrehozott hepatocelluláris carcinomában kiugróan magas nociceptin szintet mértünk mind a plazmában, mind a liquorban és a daganatos májszövetben is.

D.

A NOCISTATIN SZINT KÍSÉRLETES HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMÁBAN

Az eredményeink, amelyek szerint szintén emelkedett nocistatin szintet mértünk, mind a liquor, plazma, mind a daganatos májszövetben a kontroll állatokhoz képest megerosítik, hogy a nocistatin equimoláris mennyiségben képzodik a nociceptinnel a pre-pronociceptinbol. A korreláció szoros a két neuropeptid szintje között. A magas liquor nociceptin és nocistatin tartalom felveti annak a lehetoségét, hogy a többlet neuropeptid az agyban termelodik, ugyanakkor kimutattuk, hogy a daganatszövetben is párhuzamosan magas mindkettonek a szintje, amely amellett szól, hogy a daganatszövet termeli a többlet neuropeptidet. További kutatások szükségesek, hogy az emelkedett N/OFQ és nocistatin szintjek jelentoségét tisztázzuk hepatocelluláris carcinomában.

E.

A NOCICEPTIN TARTALOM VIZSGÁLATA HUMÁN DAGANATOS MÁJSZÖVETBEN ÉS AZ AZT KÖRÜLVEVO NEM DAGANATOS MÁJSZÖVETBEN Humán hepatocelluláris carcinoma májszövetben mért szignifikáns nagyobb nociceptin tartalom alátámasztja mind az állatkísérletünk, mind humán vizsgálataink eredményét. Több mint tíszer nagyobb nociceptin tartalmat igazoltunk a daganatos részben. A cirrhotikus szövet N/OFQ tartalma nem különbözött szignifikánsan az egészséges májszövet nociceptin tartalmától. Itt sem találtunk összefüggést a nociceptin tartalom és a laboratóriumi paraméterek, valamint a stádiumok között. F.

EXTRAHEPATIKUS DAGANATOK ÉS MÁJMETASZTÁZISOK

Késobb egyéb extrahepatikus malignus daganatokban (emlo-, colon-, pancreas-, tüdodaganat, stb., májmetasztázisok) is kimutattuk a nociceptin szint emelkedését., Lehetséges, hogy a N/OFQ növekedés nemcsak a májrákot, hanem a tumorgenezist kíséro általános jelenség, ezért eredményeink további kutatások kiindulópontjai lehetnek.

73

G.

NOCICEPTINTARTALOM KIMUTATÁSA ASCITESBEN

A két májtumoros beteg ascitesében mérheto mennyiségben jelenlévo nociceptin kimutatását további vizsgálatok kiindulópontjának tekintjük. Nem tumoros ascitesben végzett vizsgálataink folyamatban vannak.

74

VII. KONKLÚZIÓ

Összefoglalva, új adatként kimutattuk, hogy hepatocelluláris carcinomás betegek plazmájában és tumorszövetében nagy koncentrációban mutatható ki nociceptin. Állatkísérletekben is bizonyítottuk a májrák és a nociceptin összefüggését. Adataink azt a lehetoséget támogatják, hogy az emelkedett nociceptin szint a tumormarkerekhez hasonlóan egyes malignus folyamatok, közöttük a HCC biokémiai indikátora lehet. Eredményeink további kutatások kiindulópontja lehet.

75

VIII. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK

Munkámban a nociceptinerg rendszer jelentoségét vizsgáltam különbözo hepatológiai kórképekben, foként hepatocelluláris carcinomában.

1. Új adatként kimutattuk, hogy a plazma nociceptin szint Wilson kóros, PBC-s, valamint egyéb etiológiájú májcirrhosisos betegekben szignifikánsan magasabb az egészséges kontroll személyekéhez képest. Krónikus hepatitisben is emelkedett N/OFQ szintet mértünk, de ez az eltérés nem volt szignifikáns. Feltételeztük, hogy a nociceptin szint emelkedésében az endogén opioid és immunrendszer kapcsolata játszhat szerepet.

2. HCC-s betegekben a plazma nociceptin szint kiugróan magasabb volt, mind az egészséges kontrollokhoz, mind a Wilson kóros, valamint a PBC-s betegekhez, a krónikus hepatitises és cirrhosisos betegekhez képest (p<0,001). A N/OFQ azokban a májdaganatos betegekben is magas volt, akikben az alfa- foetoprotein érték normális volt. Nem találtunk összefüggést a tumor nagysága, etiológiája, a különbözo kémiai laboratóriumi értékek, a fájdalom jelenléte és a nociceptin szint között. Eredményeink alapján feltétezheto, hogy a magas N/OFQ szint szerepet játszhat abban, hogy elorehaladott stádiumú daganatos betegek miért nem jeleznek fájdalmat.

3. Egy 18 éven át nyomonkövetett PBC-s betegben májrák kialakulását figyeltük meg, ami a diagnózist követoen két éven belül a beteg halálához vezetett. A daganat kialakulása során a N/OFQ fokozatosan, az AFP emelkedéssel párhuzamosan, a normális érték 17-szeresére növekedett a kiindulási értékhez képest. A tumorszövetben 15-ször nagyobb volt a nociceptin koncentrációja, mint ugyanazon máj nem tumoros részében. Ez az adat is megerosítette megfigyelésünket, hogy a magas nociceptin szint a májrák egyik indikátora.

4. Kísérletesen létrehozott hepatocelluláris carcinomás patkányokban tízszer magasabb plazma, liquor és daganat szövet N/OFQ szintet mértünk, mind a kontroll, mind a cirrhotikus állatokhoz képest.

76

Állatkísérletes adataink szerint, a liquorban a N/OFQ egy nagyságrenddel nagyobb koncentrációban mutatható ki. Májrák esetén a neuropeptid szintje 10-szeresére emelkedik. Lehetséges, hogy az agyban képzodo nociceptin termelodés fokozódik ugrásszeruen. Eredményeink további kísérletek kiindulópontja lehet: hepatocelluláris carcinoma

szövetben

megno-e

nociceptin

receptor

expresszió,

illetve,

hogy

kimutatható-e egy szignálmechanizmus, aminek következtében májrák esetén az agyban megno a pre-pronociceptin, illetve N/OFQ képzés. Az adataink összhangban vannak humán megfigyeléseinkkel, amelyek szerint a magas plazma nociceptin a hepatocelluláris carcinoma egyik indikátora.

5. Humán hepatocelluláris carcinoma szövetben tízszer magasabb nociceptin tartalmat mértünk a tumort körülvevo cirrhotikus májszövet N/OFQ tartalmához képest, és az egészséges kontroll májszövethez képest. Mivel humán carcinoma szövetben is magas nociceptin értéket mértünk, felmerült annak a lehetosége, hogy a maga tumorszövet termeli a N/OFQ-t, de az is, hogy a tumor N/OFQ receptort expresszál, és a vérbol felveszi és akkumulálja a nociceptint.

6. Különbözo etiológiájú extrahepatikus daganatos betegek plazmájában is kimutattuk a nociceptin szint emelkedését. Lehetséges, hogy a N/OFQ növekedés nemcsak a májrákot, hanem a tumorgenezist kiséro általános jelenség, ezért eredményeink további kutatások kiinduló pontjai lehetnek.

7. Májcirrhosist, illetve májrákot kíséro ascitesben is kimutattuk a nociceptin jelenlétét alacsonyabb koncentrációban, mint a plazmában.

77

IX. ÖSSZEFOGLALÓ A nociceptin (N/OFQ) egy 17 aminosavból álló polipeptid, amely szerkezetében leginkább a dinorfin- A-hoz hasonlít, de nem kötodik a klasszikus opioid receptorokhoz. Munkacsoportunk korábban emelkedett nociceptin szintet írt le Wilson kórban, majd kiugróan magas N/OFQ szintet mértünk egy Wilson kóros betegben, akiben késobb hepatocelluláris carcinoma (HCC) igazolódott. Ez a véletlen megfigyelés volt további vizsgálataink egyik kiindulópontja. Célunk a nociceptinerg rendszer vizsgálata volt primer hepatocelluláris carcinomában, illetve egyéb hepatológiai betegségekben. Kísérletesen lé trehozott HCC modellen vizsgáltuk a plazma, liquor, májszövet nociceptin tartalmát. Humán hepatocelluláris carcinoma szövetben, valamint azt körülvevo cirrhotikus részben mértük meg a nociceptin

tartalmat.

Vizsgáltuk

a

plazma

nociceptin

szintet

extrahepatikus

daganatokban és acitesben. Kimutattuk, hogy a plazma nociceptin szint Wilson kóros, PBC-s, valamint egyéb etiológiájú májcirrhosisos betegben szignifikánsan magasabb az egészséges kontroll személyekéhez képest. HCC-s betegekben a plazma N/OFQ szint kiugróan magasabb volt, mind az egészséges kontrollokhoz, mind a betegcsoportokhoz képest. Egy 18 éven át nyomon követett PBC-s betegben a májrák kialakulása során a N/OFQ fokozatosan, az AFP emelkedéssel párhuzamosan, a normális érték 17-szeresére növekedett a kiindulási értékhez képest. A tumorszövetben 15-ször nagyobb volt a N/OFQ tartalom, mint ugyanazon máj nem tumoros részében. Kísérletesen létrehozott HCC-ben tízszer magasabb plazma, liquor és daganat szövet N/OFQ szintet mértünk, mind a kontroll, mind a cirrhotikus állatokhoz képest. Humán HCC szövetben tízszer magasabb nociceptin tartalmat mértünk a tumort körülvevo cirrhotikus májszövet N/OFQ tartalmához képest, és az egészséges kontroll májszövethez képest. Hasonlóan magas plazma nociceptin szintet mértünk extrahepatikus daganatokban. Ascitesben is kimutattuk a nociceptint. Az adataink szerint a magas plazma nociceptin a hepatocelluláris carcinoma egyik indikátora lehet. Ugyanakkor lehetséges, hogy a N/OFQ növekedés nemcsak a májrákot, hanem a tumorgenezist kíséro általános jelenség, ezért eredményeink további kutatások kiinduló pontjai lehetnek.

78

SUMMARY Nociceptin (N/OFQ) is a 17 aminoacid polypeptide, resembles mostly dynorphin A, but it does not bind classical opioid receptors. We reported elevated nociceptin level in Wilson disease, and later we measured striking high N/OFQ level in a Wilson disease patient, in whom hepatocellular carcinoma (HCC) developed. This accidental observation stimulated our further research. We aimed to examine the nociceptin system in primary hepatocellular carcinoma and in hepatological disorders. We investigated nociceptin level in experimentally induced hepatocellular carcinoma in plasma, cerebrospinal fluid, and liver tissue. We also measured the nociceptin content in human hepatocellular carcinoma tissue and in the surrounding liver tissue. We studied plasma N/OFQ level in extrahepatic malignancies and in ascites. We showed significantly elevated nociceptin level in patient with Wilson disease, PBC, and other etiological liver cirrhosis compared to healthy controls. However the plasma N/OFQ level was strikingly high in patient with HCC compared to both healthy controls and also to all liver diseased control groups. The nociceptin level rose up to 17-fold above normal level, parallel with the AFP elevation in the patient with PBC who was followed up 18 years during the development of HCC,. The nociceptin content was 15fold higher in the tumorous liver tissue compared the corresponding non- malignant liver tissue. We measured ten fold higher plasma, cerebrospinal fluid, and tumorous liver tissue N/OFQ content compared to both healthy and to cirrhotic animals in experimentally induced HCC. We also found ten-fold higher N/OFQ content in human hepatocellular carcinoma tissue compared the surrounding cirrhotic liver nociceptin content, and to healthy liver tissue. Also high plasma N/OFQ level was found in extrahepatic malignancies. We also proved nociceptin in ascites. According our data the high plasma nociceptin level could be an indicator of hepatocellular carcinoma. It is also conceivable that the elevation of plasma nociceptin level not only the accompaniment of hepatocelular carcinoma, but also tumorgenesis, so our results might stimulate further research.

79

X.

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

Az értekezéshez közvetlenül kapcsolódó, saját közlemények listája: Közlemények: 1. Szalay F, Hantos MB, Horvath A, Lakatos PL, Folhoffer A, Dunkel K, Hegedus D, Tekes K. Increased nociceptin/orphanin FQ plasma levels in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 2004 Jan;10(1):42-5. IF: 3,318 2. Horvath A, Folhoffer A, Lakatos PL, Halasz J, Illyes G, Schaff Z, Hantos MB, Tekes K, Szalay F. Rising plasma nociceptin level during development of HCC: a case report. World J Gastroenterol, 2004 Jan;10(1):152-4. IF: 3,318 Citálható absztraktok: 1. Szalay F, Hantos MB, Horvath A, Lakatos PL, Folhoffer A, Dunkel K, Hegedus D, Tekes K. Striking elevation in plasma nociceptin level in patients with hepatocellular carcinoma Gastroenterol, 2003; 124;4(Suppl):A770-771. IF: 12,718 2. Horváth A, Hantos M, Tekes K , Halász J, Illyés Gy , Schaff Zs , Folhoffer A, Lakatos PL, Szalay F. Hepatocellular carcinoma in a patient with primary biliary cirrhosis. is nociceptin a marker for HCC? Z Gastroenterol, 2003; 41: 439. IF: 0,112 3. Szalay F, Horvath A, Hantos M, Folhoffer A, Lakatos PL, Beko G, Hegedus D, Tekes K. Extremely high plasma nociceptin might be a marker for hepatocellular carcinoma Z Gastroenterol, 2003;41:459. IF: 0,112 4. Szalay F, Horvath A, Folhoffer A, Lakatos PL, Zalatnai A, Hantos MB, Tekes K. Increased liquor, plasma and tissue nociceptin in rats with experimentally induced hepatocellular carcinoma Hepatol, 2003;38.No4.Suppl1,412A. IF: 9,503 5. Horvath A, Szalay F, Hantos MB, Zalatnai A, Folhoffer A, Lakatos PL, Tekes K. High plasma and liquor nociceptin levels in rat with experimental liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma Gut, 2003;52(Suppl VI)A232. IF: 5,883 6. Horvath A, Folhoffer A, Csak T, Lakatos PL, Zalatnai A, Hantos MB, Tekes K, Szalay F. Increased nociceptin and nocistatin in plasma, cerebrospinal fluid and tumor tissue indicates altered opioid system in rats with experimental hepatocellular carcinoma

80

J Hepatol, 2004; 40S: A250.

IF: 5,283

7. Horvath A, Folhoffer A, Csak T, Lakatos PL, Hantos MB, Tekes K, Szíjártó A, Kupcsulik P, Kiss A, Halasz J, Schaff Z, Szalay F. High nociceptin content in human hepatocellular carcinoma tissue Gastroenterol, 2004; 126S2: A-736 IF: 12,718 8. Horvath A, Folhoffer A, Csák T, Zalatnai A, Hantos M, Tekes K, Lakatos PL, Szalay F. Nociceptin in experimentally induced hepatocellular carcinoma Z Gastroenterol, 2004; 42: A49. IF: 0,112

Az értekezéshez közvetve kapcsolódó, saját közlemények listája: Közlemények: 1. Nagy J, Vincze Z, Folhoffer A, Horváth A, Csák T, Zelkó R. A Wilson-kór patomechanismusa és gyógyszeres kezelése. Acta Pharmaceutica Hungarica, 2003; 73(4): 237-241. 2. Folhoffer A, Horváth A, Hegedus D, Firneisz G, Dunkel K, Willheim C, Ferenci P, Lakatos PL, Szalay F. ATP7B génmutációk magyarországi Wilson kóros betegekben; esetismertetések a betegség változatos klinikai megjelenésére Orv Hetil, 2003 Dec 21;144(51):2509-15. 3. Lakatos PL, Bajnok E, Tornai I, Folhoffer A, Horvath A, Lakatos P, Szalay F. Csökkent csontásványianyag-tartalom és génpolimorfizmus primer biliaris cirrhosisban Orv Hetil. 2004 Feb 15;145(7):331-6. 4. Lakatos PL, Bajnok E, Tornai I, Folhoffer A, Horvath A, Lakatos P, Habior A, Szalay F. Insulin-like growth factor I gene microsatellite repeat, collagen type Ialpha1 gene Sp1 polymorphism, and bone disease in primary biliary cirrhosis. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2004 Aug;16(8):753-759. IF: 1,578 5. Keresztes K, Istenes I, Folhoffer A, Lakatos PL, Horváth A, Csak T, Vargha P, Kempler P, Szalay F: Autonomic and sensory nerve dysfunction in primary biliaris cirrhosis. World J Gastroenterol, 2004, 10 (20):3039-3043. IF: 3,318 6. Folhoffer A, Horváth A, Csák T, Nébenführer L, T, Hazslinszky P, Iványi A, Szalay F. Neurofibromatosis, melanoma malignum, hy perthyreosis és HCV pozitivitás esete. Lege Artis Medicinae, 2004; 14(5): 349-352. 7. Szalay F, Telegdy L, Szeli D, Csák T, Folhoffer A, Horváth A, Abonyi M, Szabó O, Rédei Cs, Nemesánszky E. Rifaximin a hepaticus encephalopathia kezelésében.

81

Lege Artis Medicinae, 2004; 14(5): 321-325. 8. Csák T, Folhoffer A, Horváth A, Lengyel G, Kóbori L, Szalay F: Májtranszplantáció utáni krónikus C-hepatitis recidívájának kombinált antivirális kezelése. Orv Hetil, 2004 145(39):2003-2006. 9. Horvath A, Folhoffer A, Csak T, Komoly S, Szalay F. Cryoglobulinaemiával és súlyos fokú polyneuropathiával járó krónikus C hepatitis gyógyult esete Magyar Belorvosi Archívum, 2004; 57: 59-67. Citálható absztraktok: 1. Horvath A, Keresztes K, Folhoffer A, Hegedus D, Lakatos PL, Dunkel K, Kempler P, Szalay F. Autonomic and sensory nerve dysfunction in patients with wilson disease J Hepatol, 2003;38:S2:211. IF: 5,283 2. Lakatos PL, Bajnok E, Folhoffer A, Horváth A, Tornai I, Lakatos P, Szalay F. Collagen type I? 1 gene SP1 polymorphism and bone disease in primary biliary cirrhosis J Hepatol, 2003;38:S2:212. IF: 5,283 3. Lakatos PL, Bajnok E, Folhoffer A, Horvath A, Tornai I, Lakatos P, Szalay F. Insulin-like growth factor (Igf-1) gene microsatellite repe at and collagene type I alpha 1 sp1 polymorphisms and bone disease in hungarian patients with primary biliary cirrhosis (PBC) Z Gastroenterol, 2003;41:444. IF: 0,112 4. Dunkel K, Horvath A, Keresztes K, Folhoffer A, Hegedüs D, Lakatos PL, Kempler P, Szalay F. Altered heart rate variability in patients with wilson disease Z Gastroenterol, 2003;41:434. IF: 0,112 5. Nemesánszky E1 , Szeli D1 , Telegdy L2 , Folhoffer A3 , Horváth A. 3 , Szalay F.3 Rifaximin treatment in portosystemic encephalopathy Z Gastroenterol, 2003;41:449. IF: 0,112 6. Folhoffer A, Horvath A, Lakatos PL, Dunkel K, Beko G, Willheim C, Ferenci P, Szalay F. H1069Q and further mutations of atp7b gene in wilson disease patients from Hungary Z Gastroenterol, 2003;41:436. IF: 0,112 7. Folhoffer A, Horvath A, Hegedus D, Firneisz G, Dunkel K, Willheim-Polli C, Ferenci P, Lakatos PL, Szalay F. H1069Q and other mutations of ATP7B gene in Hungarian patients with wilson disease Gut, 2003;52(Suppl VI)A3. IF: 5,883

82

8. Lakatos PL, Bajnok E, Tornai I, Folhoffer A, Horvath A, Lakatos P, Szalay F. Insulin-like growth factor I (Igf-1) gene microsatellite repeat, collagen type ia1 gene (colia1) sp1 polymorphism and bone disease in primary biliary cirrhosis (pbc) Gut, 2003;52(Suppl VI)A164. IF: 5,883 9. Csák T, Folhoffer A, Horvath A, Szeli D, Lakatos PL, Szalay F. Adie’s syndrome and mesenterial lymphangioma in a patient with celiac disease and autoimmune hepatitis Z Gastroenterol, 2004; 42: P408. IF: 0,112 10. Folhoffer A, Horvath A, Csák T, Lakatos Pl, Szalay F. Neurofibromatosis, cutan melanoma and hyper-thyroidism in a HCV positive patient treated with interferon Z Gastroenterol, 2004; 42:A32. IF: 0,112 11. Szalay F, Folhoffer A, Horvath A, Csak T, Tornai I, Habior A, Speer G, Nagy Z, Lakatos P, Lakatos PL. Serum leptin levels in patients with primary biliary cirrhosis Z Gastroenterol, 2004; 42:P440. IF: 0,112 12. Lakatos PL, Willheim-Polli C, Folhoffer A, Horvath A, Csak T, Österreicher C, Habior A, Tornai I, Ferenci P, Szalay F. NOD2/CARD15, SNP8, 12 and 13 and other exon4 mutations and primary biliary cirrhosis (PBC) in Hungarian and Polish patients Z Gastroenterol, 2004; 42:P423. IF: 0,112 13. Folhoffer, Horvath A, Csak T, Lakatos PL, Abonyi M, Szonyi L, WillheimPolli C, Ferenci P, Szalay F. Liver failure as presenting symptom in wilson disease Gut, 2004;53(Suppl VI) A93. IF: 5,883 14. Szalay F, Folhoffer A, Horvath A, Csak T, Habior A, Tornai I, Speer G, Nagy Z, Lakatos P, Lakatos PL. Low serum leptin level in patients with primary biliary cirrhosis Gut, 2004;53(Suppl VI) A64. IF: 5,883

83

X.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Nehéz egy disszertáció végén köszönetet mondani egy oldalban, hiszen olyan sokan és annyiféleképpen segítettek, hogy elkészülhessen a dolgozat. Ezért a hosszas és részletes köszönetnyílvánítás helyett szeretném kiemelni azokat, akik segítségét jellemezni kevés minden írott szó. Köszönöm Prof. Dr. Szalay Ferencnek, témavezetomnek, hogy megtanított kísérleteket tervezni, kivitelezni, tudományos közleményt írni és egészen másképp szemlélni a tudományos közleményeket, mint ahogyan eddig szemléltem. Mindenben mellettem állt. Köszönöm. Köszönöm Dr. Folhoffer Anikónak és Dr. Csák Tímeának, hogy segítettek a tudományos munkában, a kísérletek tervezésében és kivitelezésében, az adatok feldolgozásában, de talán leginkább azt köszönöm, hogy olyan légkört teremtettek, amiben nagyon- nagyon jó volt dolgozni. Köszönöm. Köszönöm Dr. Hantos Mónikának, a segítségért a kísérletek tervezésében, kivitelezésében, és azért mert bármikor fordulhattam hozzá segítségért. Köszönöm.

Köszönettel tartozom az alábbi személyeknek, akiknek (kérem bocsássák meg nekem) a neveit csak felsorolom, remélem a teljesség igényével: Dr. Abonyi Margit, Dr. Beko Gabriella, Prof. Dr. de Chatel Rudolf, Czermák Zoltán, Divikiné Guth Györgyi, Dr. Dunkel Kinga, Prof. Dr. Farsang Csaba, Dr. Ferencz Viktória, Dr. Halász Judit, Dr. Hegedus Dalma, Dr. Illyés György, Prof. Dr. Kempler Péter, Dr. Keresztes Katalin, Dr, Kiss András, Dr. Kupcsulik Péter, Dr. Lakatos Péter, Dr. Lakatos Péter László, Prof. Dr. Magyar Kálmán, Prof. Dr. Nagy Péter, Prof. Dr. Schaff Zsuzsa, Dr. Szíjártó Attila, Prof. Dr. Szoke Éva, Prof. Dr. Tekes Kornélia, Dr. Vargha Péter, Dr. Zalatnai Attila, A Semmelweis Egyetem I. sz. Belgyógyászti Klinikájának, valamennyi munkatársának, hogy az ösztöndíj ideje alatt részese lehettem az Intézet életének. Végül,

köszönettel

tartozom

családomnak: édesanyámnak

és

édesapámnak,

húgomnak, valamint Balázsnak, akik szeretettel és rettento sok türelemmel, sok lemondással, bíztatással támogattak munkámban.

84

XI. IRODALOMJEGYZÉK 1

Mollereau C, Parmentier M, Mailleux P, Butour JL, Moisand C, Chalon P, Caput D,

Vassart G, Meunier JC. ORL1, a novel member of the opioid receptor family. Cloning, functional expression and localization. FEBS Letters, 1994; 341: 33-38. 2

Meunier JC, Mollereau C, Toll L, Suaudeau C, Moisand C, Alvinerie P, Butour JL,

Guillemot JC, Ferrara P, Monsarrat B. Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature. 1995; 377: 532-534. 3

Heinricher MM. Orphanin FQ/nociceptin: From neural circuitry to behavior. Life Sci.

2003; 73: 813-822. 4

Terenius L, Sandin J, Sakurada T. Nociceptin/orphanin FQ metabolism and bioactive

metabolites. Peptides. 2000; 21: 919-922. 5

Mollereau C, Simons MJ, Soularue P. Soularue P, Liners F, Vassart G, Meunier JC,

Parmentier M. Structure, tissue distribution, and chromosomal localization of the prepronociceptin gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996; 93: 8666-8670. 6

Parkin DM, Whelan SL, Ferlay J, Raymond L, Young J, eds. Cancer incidence in five

continents. Vol VII. Lyon: International Agency Research on Cancer, 1997. 7

Levi F. Cancer Incidence in five continents. Vol.VI. Eur J cancer 1994; 29A: 2315-

2319. 8

Collier J, Sherman M. Screening for hepatocellular carcinoma. Hepatology 1998; 37:

273-278. 9

Peng YC, Chan CS, Chen GH. The effectiviness of serum alpha- fetoprotein level in

anti-HCV positive patients for screening hepatocellular carcinoma. Hepatogastroenterol. 1999; 46: 3208-3211. 10

Dhawan BN, Cesselin F, Raghubir R, reisine T, Bradley PB, Portoghese PS, Hamon

M. Opioid receptors. In the IUPHAR compendium of receptor characterization and classification. 1998; 48: 218-26. 11

Meunier JC. Nociceptin/orphanin FQ and the opioid receptor- like ORL1 receptor. Eur

J Pharmacol. 1997; 340: 1-15.

85

12

Peluso J, LaForge KS, Matthes HW, Krrek MJ, Kieffer BL, Gaveriaux-Ruff C.

Distribution of nociceptin/orphanin FQ receptor transcript in human central nervous system and immun cells. J Neuroimmunol. 1998; 81: 184-192. 13

Neal CR, Akil H, Watson SJ. Expression of orphanin FQ and the opioid receptor- like

(ORL1) receptor in the developing human and rat brain. J Chem Neuroanat. 2001; 22: 219-249. 14

Mao L, Wang JQ. Microinjection of nociceptin (Orphanin FQ) into nucleus tractus

solitarii elevates blood pressure and heart rate in both anesthetized and conscious rats. J Pharmacol Exp ther. 2000; 294: 255-262. 15

Makman MH, Dvorkin B. Presence of nociceptin (orphanin FQ) receptors in rat

retina: comparison with receptors in striatrum. Eur J Pharmacol. 1997; 338: 171-176. 16

Murphy NP, Maidment NT. Orphanin FQ/nociceptin modulatio n of mesolimbic

dopamine transmission determined by microdialysis. J Neurochem. 1999; 73: 179-186. 17

Vaughan CW, Christie MJ. Increase by the ORL1 receptor (opioid-receptor-like 1)

ligand, nociceptin, of inwardly rectifying K? conductance in dorsal raphe nucleus neurones. Br J Pharmacol. 1996; 117: 1609-1611. 18

Mollereau C, Mouledous L. Tissue distribution of opioid receptor-like (ORL-1)

receptor. Peptides, 2000; 21: 907-917. 19

Sbrenna S, Marti M, Morari M, Calo’ G, Guerrini R, Beani L, Bianchi C. Modulation

of 5- hydroxytryptamine efflux from rat cortical synaptosomes by opioids and nociceptin. British Journal of Pharmacology, 2002; 130: 425-433. 20

Rizz A, Rizzi D, Marzola G, Larsen BD, Petersen J, Calo G. Pharmacological

characterization of the novel nociceptin /orphanin FQ receptor ligand, ZP 120: in vitro and in vivo studies in mice. Br J Pharmacol. 2002; 137: 369-374. 21

Nothacker HP, Reinscheid R, Mansour A, henningsen RA, Ardati A, Monsma FJ Jr,

Watson SJ, Civelli O. Primary structure and tissue distribution of the orphanin FQ precursor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996; 93: 8677-8682. 22

Berger H, Albrecht E, Wallukat G, Bienert M. Antagonism by acetyl-RYYRIK-NH2

of G protein activation in rat brain preperations and of chronotropic effect on rat cardiomyocytes evoked by nociceptin/orphanin FQ. Br J Pharmacol. 1999, 126: 555558.

86

23

Wick MJ, Minnerath SR, Roy S, Roy S, Ramakrisham S, Loh HH. Differential

expression of opioid receptor genes in human lymphoid cell lines and peripheral blood lymphocytes. Journal of Neuroimmunol, 1996; 64: 29-36. 24

Sharp BM, Eisenstein T. Expression of opioid receptor by immune cells. Journal of

Neuroimmunol, 1996; 69: 3-13. 25

Arjomand J, Cole S, Evans CJ. Novel orphanin FQ/nociceptin transcripts are

expressed in human immune cells. J Neuroimmunol. 2002; 130: 100-108. 26

Mollereau C, Parmentier M, Mailleux P, Butour JL, Moisand C, Chalon P, Caput D,

Vassart G, Meunier JC. ORL1, a novel member of the opioid receptor family. Cloning, functional expression and localization. FEBS Letter. 1994; 341: 33-38. 27

Reinscheid RK, Nothacker HP, Bourson A, Ardati A, Henningsen RA, Bunzow JR,

Grandy DK, Langen H, Monsma FJ Jr, Civelli O. Orphanin FQ: a neuropeptide that acivates an opioidlike G protein coupled receptor. Science. 1995, 270: 792-794. 28

Sirianni MJ, Fujimoto KI, Nelson CS, pellegrino MJ, Allen RG. Cyclic AMP analogs

synthesis, processing and secretion of prepro nociceptin/orphanin FQ-derived peptides by NS20Y neuroblatoma cells. DNA Cell Biol. 1999; 18: 51-58. 29

Griebel G, Perrault G, Sanger DJ. Orphanin FQ, a novel neuropeptide with anti-

stress-like activity. Brain Res. 1999; 836: 221-224. 30

Jenck F, Ouagazzal AM, Pauly- Evers M, Moreau JL. Orphanin FQ: role in behavioral

fear responses and vulnerability to stress? Mol Psych. 2000; 5: 572-574. 31

Chavkin C, Goldstein A. Specific receptor for the opioid dynorphin: Structure-

activity reletionships. Proc Natl Acad Sci. 1981; 78: 6543-6547. 32

Hruby VJ, Gehrig CA. Recent developments in the design of receptor specific opioid

peptides. Med Res Rev 1989; 9: 343-401. 33

Reinscheid RK, Higelin J, Henningsen RA, Monsma FJ Jr, Civelli O. Structures that

delineate orphanin FQ and dynorphin A pharmacological selectivities. J Biol Chem. 1998; 273: 1490-1495. 34

Okuda-Ashitka E, Ito S. Nocistatin: a novel neuropeptide encoded by the gene for the

nociceptin/orphanin percursor. Peptides. 2000; 392: 286-289. 35

Lee TL, Fung FMY, Chen FG, Chou N, Okuda-Ashitaka E, Ito S, Nishiuchi Y,

Kimura T, Tachibana S. Identification of human, rat and mouse nocistatin in brain and human cerebrospinal fluid. Neuroreport. 1999; 10: 1537-1541.

87

36

Ito S, Okuda-Ashitaka E, Minami T. Central and peripheral roles of prostaglandins in

pain and their interactions with novel neuropeptides nociceptin and nocistatin. Neurosci Res. 2001; 41: 299-332. 37

Inoue M, Kawashima T, Allen RG, Ueda H. Nocistatin asnd prepro-

nociceptin/orphanin FQ 160-187 cause nociception through of Gi/o in capsaicinsensitive and of Gs in capsaicin insensitive nociceptors, respectively. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 306: 141-146. 38

Zeilhofer HU, Muth-Selbach US, Guhring H, Erb K, Ahmadi S. Selective supression

of inhibitory synaptic transmission by nocistatin in the rat spinal cord dorsal horn. J Neurosci. 2000; 20: 4922-4929. 39

Mogil JS, Pasternak GW. The molecular and behavioral pharmacology of the

orphanin FQ/nociceptin peptide and receptor family. Pharmacol Rev. 2001, 53: 381415. 40

Rossi GC, Mathis JP, Pasternak GW. Analgesic activity of orphanin FQ murine

prepro-orphanin FQ 141-157 , in mice. Neuroreport. 1998, 9: 1165-1168. 41

Okuda-Ashitaka E, Minami T, tachibana S, Yoshihara Y, Nishiuchi Y, Kimura T, Ito

S. Nocistatin, a peptide that blocks nociceptin action in pain transmission. Nature (Lond). 1998, 392: 286-289. 42

Varani K, Rizzi A, Calo G, Bigoni R, Toth G, Guerrini R, Gessi S, Salvadori S,

Borea PA, Regoli D. Pha rmacology of (Tyr1)nociceptin analogues: receptor binding and bioassay studies. Naunyn Schmiederbergs Arch Pharmacol. 1999, 360: 270-277. 43

Montcillet-Agius G, Fein J, Anton B, Evans CJ. ORL1 and µ-opioid receptor antisera

label different fibers in areas involved in pain processing. J Comp Neurol. 1998; 399: 373-383. 44

Pan Z, Hirakawa N, Fields HL. A cellular mechanism for the bidirectional pain-

modulating actions of orphanin FQ/nociceptin. Neuron. 2000; 21: 1031-1036. 45

Xu X, Grass S, Hao J, Xu IS, Wiesenfeld-Halin Z. Nociceptin/orphanin FQ in spinal

nociceptive mechanisms under normal and pathological conditions. Peptides. 2000; 21: 1031-1036. 46

Ito S, Okuda-Ashitaka E, Minami T. Central and peripheral roles of prostaglandins in

pain and their interactions with novel neuropeptides nociceptin and nocistatin. Neurosci Res. 2001; 41: 299-332.

88

47

Meunier JC, Mollereau C, Toll L, Suaudeau C, Moisand C, Alvenerie P, Butour JL,

Guillemot JC, ferrara P, Monsarrat B, Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature. 1995; 377: 532-535. 48

Reinscheid RK, Ardati A, Mosma FJ Jr, Civelli O. Structure-activity relationship

studies on the novel neuropeptide orphanin FQ. J Biol Chem. 1996; 271: 14163-14168. 49

Lou LG, Ma L, Pei G. Nociceptin/orphanin FQ activates protein kinase C, and this

effect is mediated through phospholipase C/Ca2+ pathway. Biochem Biophys Res Commun. 1997, 240: 304-308. 50

Chan JS, Chiu TT, Wong YH. Activation of type II adenylyl cyclase by the cloned µ-

opioid receptor: Coupling to multiple G proteins. J Neurochem. 1995; 65: 2682-2689. 51

Tsu RC, Chan JS, Wong YH. Regulation of multiple effectors by the cloned d-opioid

receptor: Stimulation of phospholipase C and type II adenylyl cyclase- J Neurochem. 1995, 64: 2700-2707. 52

Armstead W. NOC/oFQ activates PKC and generates superoxide to impair

hypotensive cerebrovasodilatation after hypoxia/ischaemia. Med Sci Monit 2002; 8:BR8-BR14. 53

Price MA, Cruzalegui FH, Treisman R. The p38 and ERK MAP kinase pathways

cooperate to activate ternary complex factors and c-fos transcription in response to UV. EMBO J. 1996; 15: 6552-6563. 54

Han J, Lee JD, Bibbs L, Ulevitch RJ. A MAP kinase targeted by endotoxin and

hyperosmolarity in mammalian cells. Science. 1994; 265: 808-811. 55

Kyriakis JM, Banerjee P, Nikolakaki E, Dai T, Rubie EA, Ahmad MF, Avruch J,

Woodgett JR. The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases. Nature. 1994; 239: 156-160. 56

Bevan N, Scott S, Shaw PE, Lee MG, Marshall FH, Rees S. Nociception activates

Elk-1 and Sap1a following expression of the ORL1 receptor in Chinese hamster ovary cells. Neuroreport. 1998; 9: 2703-2708. 57

Fukuda K, Shoda T, Morikawa H, kato S, Mori K. Activation of mitogen-activated

protein kinase by the nociceptin receptor expressed in Chinese hamster ovary cells. FEBS Lett. 1997, 412: 290-294.

89

58

Lou LG, Zhang Z, Ma L, Pei G. Nociceptin/orphanin FQ activates mitogen-activated

protein kinase in Chinese hamster ovary cells expressing opioid receptor- like receptor. J Neurochem. 1998, 70: 1316-1322. 59

Saito Y, Maruyama K, Saido TC, Kawashima S. N23K, a gene transiently up-

regulated during neuronal differentiation, encodes a precursor protein for a newly identified neuropeptide nociceptin. Biochem Biophys Res Commun. 1995; 217: 539545. 60

Connor M, Yeo A, Henderson G. The effect of nociceptin on Ca2+ channel current

and intracellular Ca2+ in the SH-SY5Y human neuroblstoma cell line. Br J Pharmacol. 1996; 118: 205-207. 61

Abdulla FA, Smith PA. Nociceptin inhibits T-type Ca2+ channel current in rat

sensory neurons by a G-protein- independent mechanism. J Neurosci. 1997, 17: 87218728. 62

Borgland SL, Connor M, Christie MJ. Nociceptin inhibits calcium channel currents in

a subpopulation of small nociceptive trigeminal ganglion neuron sin mouse. J Physiol. (Lond) 2001; 536: 35-47. 63

Matthes H, Seward EP, Kieffer B, North RA. Functional selectivity of orphanin FQ

for its receptor coexpressed with potassium channel subunits in xenopus laevis oocytes. Mol Pharmacol. 1996, 50: 447-450. 64

Ikeda K, Kobayashi K, Kobayashi T, Ichikawa T, Kumanashi T, Kishida H, Yano R,

manabe T. Functional coupling of the nociceptin/orphanin FQ receptor with the Gprotein-activated K+ (GIRK) channel. Brain Res Mol Brain Res. 1997; 45: 117-126. 65

Vaughan CW, Ingram SL, Christie MJ.

Actions of the ORL1 receptor ligand

nociceptin on membrane properties of rat periaqueductal ray neurons in vitro. J Neurosci. 1997; 17: 996-1003. 66

Sandin J, Georgieva J, Silberring J, Terenius L. In vivo metabolism of

nociceptin/orphanin FQ in rat hippocampus. Neuroreport. 1999; 10: 71-76. 67. Montiel JL, Corrille F, Roques BP, Noble F. Nociceptin/orphanin FQ metabolism: Role of aminopeptidase and endopeptidase 24.15. J Neurochem. 1997; 68: 354-61. 68

Suder P, Kotlinska J, Smoluch MT, Sallberg M, Silberring J. Metabolic fate of

nociceptin/orphanin FQ in rat spinal cord and biological activity of its released fragment. Peptides. 1999; 20: 239-247.

90

69

Vlaskovska M, Kasakov L, Suder P, Silberring J, Terenius L. Biotransformation of

nociceptin/orphanin FQ by enzime activity from morphine-naive and morphine-treated cell cultures. Brain Res. 1999; 818: 212-220. 70

Yuan L, Han Z, Chang JK, Han JS. Accelerated release and production of orphanin

FQ in brain of chronic morphine tolerant rats. Brain Res. 1999; 826: 330-334. 71

Yu J, Chait BT, Toll L, Kreek MJ. Nociceptin in vitro biotransformation in human

blood. Peptides. 1996; 17: 873-876. 72

Sakurada T, Sakurada S, Katsuyama S, Sakurada C, Tan-No K, Terenius L.

Nociceptin (1-7) antagonizes nociceptin- induced hyperalgesia in mice. Br J Pharmacol. 1999, 128: 941-944. 73

Sclicker E, Werthwein S, Kathmann M, Bauer U. Nociceptin inhibits noradrenalin

release in the mouse brain cortex via presynaptic ORL1 receptors. NaunynSchimiederberg’s Arch Pharmacol. 1998; 358: 418-422. 74

Siniscalchi A, Rodi D, Sbrenna S, Marti M, Bianchi C. Species difference in

nociceptin inhibition of cortical noradrenalin release in vitro. Regul Pept. 1999; 80: 127. 75

Wertwein S, BauerU, Nakazi M, Karthamnn M, Sclicker E. Further characterization

of the ORL1 receptor mediated inhibition of noradrenalin release in the mouse brain. Br J Pharmacol. 1999; 127: 300-308. 76

Schlicker E, Werthwein S, Kthmann M. Orphan opioid receptor –mediated inhibition

of noradrenaline, dopamine and serotonin release in the mouse, rat and guinea-pig brain. Naunyn- Scmiederberg’s Arch Pharmacol. 1998; 357(Suppl.): R90. 77

Siniscalchi A, Rodi D, Beani L, Bianchi C. Inhibitory effect of nociceptin in (3H)-5-

HT release from rat cerebral cortex slices. Br J Pharmacol. 1999; 128: 119-123. 78

Maneuf JP, Hughes J, McKnight AT. Different actions of ORL1 agonist on K3-

evoked (3H)-5-HT release from rat cortical slices. Soc Neurosci Abstr. 1999; 25: 433. 79

Nicol B, Lambert DG, Rowbotham DJ, Smart D, McKnuight AT. Nociceptin induced

inhibition of K+-evoked glutamate release from rat cerebrocortical slices. Br J Pharmacol. 1996; 119: 1081-1083. 80

Schlicker E, Morari M. Nociceptin/orphanin FQ and neurotransmitter release in the

central nervous system. Peptides. 2000; 21: 1023-1029.

91

81

Taguchi K, Hagiwara Y, Suzuki Y, Kubo T. Effects of morphine on release of

acetylcholine in rat striatum: an in vivo microdialysis study. Naunyn Schmiedeberggs Arch Pharmacol. 1993; 347: 9-13. 82

Wichmann T, Starke K. Modulation by muscarin and opioid receptors of acetilkolin

release in slices from striato-striatal grafts in the rat. Brain Res. 1990; 510: 296-302. 83

Dourmap N, Clero E, Costentin J. Involvement of cholinergic neurons in the release

of dopamin elicited by stimulation of ? -opioid receptors in striatum. Brain Res. 1997; 749: 295-300. 84

Dassesse D, Ledent C, Meunier JC, Parmentier M, Schiffmann SN. Regulation of

nociceptin mRNA expression in the septum by dopamine and adenosine systems. NeuroReport. 2000; 11: 3243-3246. 85

Meis S, Pape HC. Controll of glutamate and GABA release by nociceptin/orphanin

FQ in the rat lateral amygdala. J Physiol. 2001; 532: 701-712. 86

Eriksson KS, Stevens DR, Haas HL. Opposit modulation of histaminergic neurons by

nociceptin and morphine. Neuropharmacol. 2000; 39: 2492-2498. 87

Murphy NP, Ly HT, Maidment NT. Intracerebroventricular orphanin FQ/nociceptin

supresses dopamine release in the nucleus accumbens of anasthetized rats. Neuroscience. 1996; 75: 1-4. 88

Murphy NP, Maidment NT. Orphanin FQ/nociceptin blocks acquisition of morphine

place preference. Brain Res. 1999; 832: 168-170. 89

Jenck F, Moreau JL, Martin JR, Kilpatrick GJ, Reinscheid RK, Monsma FJ Jr,

Nothacker HP, Civelli O. Orphanin FQ acts as an anxiolytic to attenuate behavioral responses to stress. Proc Nat Acad Sci USA. 1997; 94: 14854-14858. 90

Neal MJ, Cunningham JR, Paterson SJ, McKnight AT. Inhibition by nociceptin of the

light-evoked release of Ach from retinal cholinergic neurones. Br J Pharmacol. 1997; 120: 1399-1400. 91

Yazdani A, Takahashi T, Bagnol D, Watson SJ, Owyang C. Functional significance

of a newly discovered neuropeptid, orphanin FQ, in rat gastrointestinal motility. Gastroenterol. 1999; 116: 108-117. 92

Palkovits M. Az agy és a fájdalom: az érzékelés és a válasz agypályái és

transzmitterei. Orv Hetol. 2000; 141: 2231-2239.

92

93

Mogil JS, Grisel JE, Reinscheid RK, Civelli O, Belknap JK, Grandy DK. Orphanin

FQ is a functional antiopioid peptide. Neurosci. 1996, 75: 333-337. 94

Mogil JS, Grisel JE, Zhangs G, Belknap JK, Grandy DK. Functinal antagonism of µ-,

d-, and ?-opioid antinociception by orphanin FQ. Neurosci Lett. 1996; 214: 131-134. 95

King M, Chang A, Pasternak GW. Funcional blockade of opioid analgesia by

orphanin FQ/nocicptin. Biochem Pharmacol. 1998, 55: 1537-1540. 96

Yang Z, Zhang Y, Wu G. Distinct effect of orphanin FQ in nucleus raphe magnus and

nucleus renticularis gigantocellularis ont he rat tail flick reflex. Neurosci Lett. 2001, 306: 69-72. 97

Shane R, Lazar DA, Rossi GC, Paternak GW, Bodnar RJ. Analgesia elicited by

OFQ/nociceptin and its fragments from the amygdala in rats. Brain Res. 2001; 907: 109-116. 98

Bytner B, Huang YH, Yu LC, Lundeberg T, Nylander I, Rosen A.

Nociceptin/orphanin FQ into the rat periaqueductal gray decreases the withdrawal latency to heat and loading, an effect reversed by (Nphe(1))nociceptin(1-13)NH(2). Brain Res. 2001; 129: 1183-1193. 99

Heinricher MM, McGaragauthy S, Grandy DK. Circuitry underlying antiopioid

actions of orphanin FQ in the rostral ventromedial medulla. J Neurophysiol. 1997, 78: 3351-3358. 100

Pan Z, Hirakawa N, Fields HL. A cellular mechanism for the bidirectional pain-

modulating actions of orphanin FQ/nociceptin. Neuron. 2000, 26: 515-522. 101

Grisel JE, Mogil JS, Belknap JK, Grandy DK. Orphanin FQ acts as a supraspinal,

but not a spinal, anti-opioid peptide. NeuroReport, 1996; 7: 2125-2129. 102

Xu IS, Grass S, Calo G, Guerrinin R, Wieseneld- hallin Z, Xu XJ. Intrathecal

(Nphe1)nociceptin(1-13)NH2 selectively reduces the spinal inhibitory effect of nociceptin. Life Sci. 2002, 70: 1151-1157. 103

Stanfa LC, Chapman V, Kerr N, Dickenson AH. Inhibitory action of nociceptin on

spinal dorsal horn neurones of the rat, in vivo. Br J Pharmacol. 1996; 118: 1875-1877. 104

Yu TP, Fein J, Phan T, Evans CJ, Xie CW. Orphanin FQ inhibits synaptic

transmission and long-term potentiation in rat hippocampus. Hippocampus. 1997; 7: 8894.

93

105

Xu IS, Grass S, Wiesenfeld-Hallin Z, Xu XJ. Effects of intrathecal orphanin FQ on a

flexor reflex in the rat after inflammation or peripheral nerve section. Eur J Pharmacol. 1999; 370: 17-22. 106

Courteix C, Coudore-Civiale, Privat A, Pelissier T, Eschalier A, Fialip J. Evidence

for an exclusive antinociceptive effect of nociceptin/orphanin FQ, an endogenous ligand for the ORL1 receptor, in two animal models of neuropathic pain. Pain. 2004; 110: 236245. 107

Darland T, Heinricher MM, Grandy DK. Orphanin FQ/nociceptin: a role in pain and

analgesia, but so much more. Trends Neurosci. 1998; 21: 215-221. 108

Mamiya T, Noda Y, Nishi M, Takeshima H, Nabeshima T. Enhancement of spatial

in nociceptin receptor-knockout mice. Brain Res. 1998; 783: 236-240. 109

Mamiya T, Noda Y, Nishi M, Tekeshima H, Nabeshima T. Nociceptin system plays

a role in the memory retention: involvement of naloxone benzoylhydrasone binding site. NeuroReport. 1999; 10: 1171-1175. 110

Manabe T, NodaY, Mamiya T, Katagiri H, houtani T, Nishi M, Noda T, Takahashi

T, Sugimoto T, Nabeshima T, Takeshima T. Facilitation of long-term potentiation and memory in mice lacking nociceptin receptor. Nature, 1998; 394: 577-581. 111

Yu TP, Xie CW. Orphanin FQ/nociceptin inhibits synaptic transmission and long-

term potentiation in rat dentate gyrus through postsynaptic mechanisms. J Neurophysiol. 1998, 80: 1277-1284. 112

Mamiya T, Yamada K, Miyamoto Y, Konig N, Watanabe Y, Noda Y, Nabeshima T.

Neuronal mechanism of nociceptin- induced modulation of learning and memory: involvement of N- methyl- D-aspartate receptors. Mol Psychiatry. 2003; 8: 752-765. 113

Murphy NP, Ly HT, Maidment NT. Intracerebroventricular orphanin FQ/nociceptin

supress dopamine release in the nucleus accumbens of anaesthetized rats. Neurosci. 1996; 75: 1-4. 114

Sakoori K, Murphy NP. Central administration of nociceptin/orphanin FQ blocks the

aquisition of conditioned place preference to morphine and cocaine, but not conditioned place aversion to naloxone in mice. Psychopharmacol (Berl). 2004; 172: 129-136. 115

Pomonis JD, Billington CJ, Levine AS. Orphanin FQ, agonist of orphan opioid

receptor ORL1, stimulates feeding in rats. NeuroReport. 1996; 8: 369-371.

94

116

Stratford TR, Holahan MR, Kelley AE. Injections of nociceptin into nucleus

accumbens shell or ventromedial hypothlamic nuc leus increase food intake. Neuroreport. 1997; 8: 423-426. 117

Polidori C, de Caro G, Massi M. The hyperphagic effect of nociceptin/orphanin FQ

in rats. Brain Res. 2000; 855: 171-175. 118

Bomberg EM, Grace MK, levine AS, Olszewski PK. Interaction between

nociceptin/orphanin FQ and melanocortins in feeding regulation. Peptides. 119

Ciccocioppo R, Biondini M, Antonelli L, Wichmann J, Jenck F, Massi M. Reverseal

of stress- and CRF- induced anorexia in rats by the synthetic nociceptin/orphanin FQ receptor agonist. J Neurosci. 2003; 23: 9445-9451. 120

Marti M, Mela F, Veronesi C, Guerrinin R, Salvadori S, Federici M, Mercuri NB,

Rizzi A, Franchi G, Beani L, Bianchi B, Morari M. Blockade of nociceptin/orphanin FQ receptor signaling in rat substantia nigra pars reticulata stimulates nigrostriatal dopaminergic transmission and motor behavior. J Neurosci. 2004; 24: 6659-6666. 121

Florin S, Suaudeau C, Meunier JC, Constentin J. Nociceptin stimulates locomotion

and exploratory behaviour in mice. Eur J Pharmacol. 1996; 317: 9-13. 122

Devine DP, Taylor L, Reinscheid R, Monsma FJ Jr, Civelli O, Akil H. Rats rapidly

develop tolerance to the locomotor- inhibitory effects of the novel neuropeptide orphanin FQ. Neurochem Res. 1996; 21: 1387-1396. 123

Sandin J, Georgieva J, Schött PA, Ogren SO, Terenius L. Nociceptin/orphanin FQ

microinjected into hippocampus impairs spatial learning in rats. Eur J Neurosci. 1997; 9: 194-197. 124

Nishi MM, Houtani T, Noda Y,Mamiya T, Sato K, Doi T, Kuno J, Takeshima H,

Nukada T, Nabeshima T, Yamashita T, Noda T, Sugimoto T. Unrestrained nociceptive response and disregulation of hearing ability in mice lacking the nociceptin/orphanin FQ receptor. EMBO J. 1997; 16: 1858-1864. 125

Bluet-Pajot MT, Meunier JC, Epelbaum J. Effects de la nociceptine en injection

intacérébroventiculaire sur les sécrétions antéhypophyseaires de GH, prolactine et ACTH. 3éme Colloque de la Société des Neurosciences (Bordeaux, France), No. E-18, p.122.

95

126

Mitsuma T, Hirooka Y, Mori Y, Kayama M, Adachi K, Rhue N, Ping J, Ikai R,

Nakayashiki A, Nogimoro T. Nociceptin stimulates thyreotropin secretion in rats. Horm Res. 1999; 52: 140-144. 127

Ciccocioppo

R,

Cippitelli

A,

Economidou

D,

Fedeli

A,

Massi

M.

Nociceptin/orphanin FQ acts as a functional antagonist of corticotropin-releasing factor inhibit its anorectic effect. Physiol Behav. 2004; 82: 63-68. 128

Devine DP, Watson SJ, Akil H. Nociceptin/orphanin FQ regulates neuroendocrine

function of the limbic-hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Neurosci. 2001; 102: 541553. 129

Fernandez F, Misilmeri MA, Felger JC, Devine DP. Nociceptin/orphanin FQ

increases anxiety-related behavior and circulating levels of corticosterone during neophobic test of anxiety. Neuropsychopharmacol. 2004; 29: 59-71. 130

Ciccocioppo R, Economidou D, Fedeli A, Massi M. The nociceptin/orpanin

FQ/NOP receptor system as a target for treatment of alcohol abuse: a review of recent work in alcoho l-preferring rats. Phys Behav. 2003; 79: 121-128. 131

Ciccocioppo R, Economidou D, Fedeli A, Angeletti S, Weiss F, Heilig M, Massi M.

Attenuation of ethanol self-administration and of conditioned reinstatement of alcoholseeking behavior by the antiopioid peptide nociceptin/orphanin FQ in alcohol-preferring rats. Psychopharmacol. (Berl). 2004; 172: 170-178. 132

Calo G, Rizzi A, Bodin M. Pharmacological characterization of nociceptin receptor

an in vitro study. Can J Physiol Pharmacol. 1997; 75: 713-718. 133

Giuliani S, Lecci A, Maggi CA. Nociceptin and neurotransmitter release in the

periphery. Peptides. 2000; 21: 977-984. 134

Fischer A, Forssmann WG, Undem BJ. Nociceptin- induced inhibition tachykinergic

neurotransmission in guinea pig bronchus. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 285: 902-907. 135

Jia Y, Wang X, Aponte SI, Rivelli MA, Yang R, Rizzo CA, Corboz MR, Priestley T,

Hey JA. Nociceptin/orphanin FQ inhibits capsaicin- induced guinea-pig airway contraction through an inward-rectifier potassium channel. Br J Pharmacol. 2002; 1358: 764-770. 136

Faisy C, naline E, Rouget C, Risse PA, Guerot E, Fagon JY, Roche N, Advenier C.

Nociceptin inhibits vanilloid TRPV-1-mediated neurosensitization induced by fenoterol in human isolated bronchi. Naunyn Schiedebergs Arch Pharmacol. 2002; 370: 167-175.

96

137

Shah S, Page CP, Spina D. Nociceptin inhibits non-adrenergic non-cholinergic

contraction in guinea-pig airway. Br J Pharmacol. 1998; 125: 510-516. 138

Peiser C, Undem BJ, Fischer A. Nociceptin effects in the airways. Peptides. 2000;

21: 995-998. 139

Groneberg DA, Fischer A. Endogenous opioids as mediators of asthma. Pulm

Pharmacol Ther. 2001; 14: 383-389. 140

Chung KF. Cough: potential pharmacological developments. Expert Opin Investig

Drugs. 2002; 11: 955-963. 141

Chung KF. Chang AB. Therapy for cough: active agents. Pulm Pharmacol Ther.

2002; 15: 335-338. 142

Chung KF. Current and future prospects for drugs to supress cough. IDrugs. 2003; 6:

781-786. 143

Bolser DC, Mcleod RL, Tulshian DB, Hey JA. Antitussive action of nociceptin in

the cat. Eur J Pharmacol. 2001; 26: 107-111. 144

Rouget C, Cui YY, D’Agostino B, Faisy C, Naline E, Bardou M, Advenier C.

Nociceptin inhibits airway microvascular leakage induced by HCl intra-oesophageal installation. Br J Phramacol. 2004; 141: 1077-1083. 145

Malinowska B, Godlewski G, Schlicker E. Function of nociceptin and opioid OP4

receptors in the regulation of the cardiovascular system. J Physiol Pharmacol. 2002; 53: 301-324. 146

Gumusel B, Hao Q, Hyman A, Chang JK, Kapusta DR, Lippton H. Nociceptin: an

endogenous agonist for central opioid-like-1 (ORL1) receptors possesses systemic vasorelaxant properties. Life Sciences Pharmacology Letter, 1997; 60: PL141-PL145. 147. Giuliani S., Tramontana M., Lecci A., Maggi C. A.: Effect of nociceptin on heart rate and blood pressure in anaesthetized rats. Eur J Pharmacol. 1997; 333: 177-179. 148

Malinowska B, Kozlowska H, Berger H, Schlicker E. Acetyl-RYYRIK-NH(2) is a

highly efficious OP(4) receptor agonist in the cardiovascular system of anesthetized rat. Peptides. 2000; 21: 1875-1880. 149

Kapusta DR, Chang J, Kenigs VA. Central administration of (Phe 1 ?(CH2-

NH)Gly2 )Nociceptin(1-13)-NH2 and orphanin FQ/nociceptin (OFQ/N) produce similar cardiovascular and renal responses in concious rats. J Pharm Exp Ther. 1999; 289: 173180.

97

150

Kapusta DR, Dayan LA, Kenigs VA. Nociceptin/orphanin FQ modulates the

cardiovascular, but not renal, responses to stress in spontaneously hypertensive rats. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2002; 29: 254-259. 151

Venkatesan P, Wang J, Evans C, Irnaten M, Mendelowitz D. Nociceptin inhibits

gamma-aminobutyric acidergic inputs to cardiac parasympathetic neurons in the nucleus ambiguus. J Pharmacol Exp Ther. 2002; 300: 78-82. 152

Larsson KP, Olsen UB, Hansen AJ. Nociceptin is a potent inhibitor of N-type

Ca(2+) channels in rat sympathetic ganglion neurons. Neurosci Lett. 2000; 296: 121124. 153

Yamazaki T, Akiyama T, Mori H. Effects of nociceptin on cadiac norepinephrine

and acetylcholine release evoked by oubain. Brain Res. 2001; 15: 153-156. 154

Shah N, Chitravanshi VC, Sapru HN. Cardiovascular responses to microinjections of

nociceptin into a midline area in the comissural subnucleus of the nucleus tractus solitarius of the rat. Brain Res. 2003; 12: 93-103. 155

Kim KW, Chung YJ, Han JH, Woo RS, Park EY, Seul KH, Kim SZ, Cho KW, Kim

SH. Nociceptin/orphanin FQ increases ANP secretion in neonatal cardiac myocytes. Life Sci. 2002; 18: 1065-1074. 156

Maslov LN, Krylatov AV, Lishmanov IB, Berger H, Galo G, Ma L, Beyermann M,

Solenkova NV, Stakheev DL. Role of ORL1 receptors in the regulation of cardiac resistance to arrythmogenic effects. Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova. 2003; 89: 397408. 157

Armstead WM, Leffler CW. Neurohumoral regulation of the cerebral circulation.

Proc Soc Exp Biol Med. 1992; 199: 149-157. 158

Armstead WM, Noc/oFQ contributes to age-dependent impairment of NMDA

induced cerebrovasodilatation after brain injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000; 279: H2188-2195. 159

Ben-Haim G, Armstead WM. Role of cAMP and K(+) channel –dependent

mechanisms in piglet hypoxic/iscemic impaired nociceptin/orphanin FQ- induced cerebrovasodilation. Brain Res. 2000; 24: 51-58. 160

Armstead WM. NOC/oFQ PKC-dependent superoxide generation contributes to

hypoxic-ischemic impairment of NMDA cerebrovasodilatation. Am J Physiol heart Circ Physiol. 2000; 279: H2678-2684.

98

161

Armstead WM. Role of altered cyclooxigenase metabolism in impaired

cerebrovasodilatation to nociceptin/orphanin FQ following brain injury. Brain Res Bull. 2000; 53: 807-812. 162

Armstead WM. NOC/oFQ activates and generates superoxide to impair hypotensive

cerebrovasodilatation after hypoxia/ischemia. Med Sci Monit. 2002; 8: BR8-BR14. 163

Jagolino AL, Armstead WM. PTK, MAPK, and NOC/oFQ impair hypercapnic

cerebrovasodilatation after hypoxia/ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003; 284: H101-H107. 164

Philip S, Armstead WM. Newborn pig nociceptin/orphanin FQ activates protein

tyrosine

kinase

and

mitogen

activated

protein

kinase

to

impair

NMDA

cerebrovasodilatation after ischemia. Neuroreport. 2003; 10: 201-203. 165

Armstead WM, Role of nociceptin/orphanin FQ in the physiological and pathologic

control of the cerebral circulation. Exp Biol Med. 2002; 227: 957-968. 166

Osinski MA, Bass P, Gaumnitz EA. Peripheral and central actions of orphanin FQ

(nociceptin) on murine colon. Am J Physiol. 1999; 276: G125-G131. 167

Yazdani A, Takahashi T, Bagnol D, Watson SJ, Owyang C. Functional significance

of a newly discovered neuropeptide, orphanin FQ, in rat gastrointestinal motility. Gastroenterol. 1999; 116: 108-117. 168

Taniguchi H, Yomota E, Nogi K, Onoda Y, Ikezawa K. The effect of nociceptin, an

endogenous ligand for the ORL1 receptor, on rat colonic contraction and transit. Eur J Pharmacol. 1998; 24: 265-271. 169

Osinski MA, Pampusch MS, Murtaugh MP, Brown DR. Cloning, expression and

functional role of a nociceptin/orphanin FQ receptor in the porcine gastrointestinal tract. Eur J Pharmacol. 1999; 365: 281-289. 170

Takahashi T, Mizuta Y, Owyang C. Orphanin FQ, but not dynorphin A, accelerates

colonic trans it in rats. Gastroenterol. 2000; 119: 71-79. 171

Krowicki

ZK,

Kapusta

DR,

Hornby

PJ.

Orphanin

FQ/nociceptin and

(Phe(1)Psi(CH(2)-NH)Gly(2)) stimulate gastric motor function in anesthetized rats. Br J Pharmacol. 2000; 130: 1639-1645. 172

Osinski MA, Brown DR. Orphanin FQ/nociceptin: a novel neuromodulator of

gastrointestial function. Peptides. 2000; 130: 999-1005.

99

173

Lippl F, Schusdziarra V, Huepgens K, Allescher HD. Inhibitory effect of nociceptin

on somatostatin secretion of the isolated perfused rat stomach. Regul Pept. 2002; 107: 37-42. 174

Broccardo M, Guerrinin R, Petrella C, Improta G. Gastrointestinal effects of

intracerebroventricularly injected nociceptin/orphanin FQ in rats. Peptides. 2004; 25: 1013-1020. 175

Schulz R, Faase E, Wuster M, Hwerz A. Selectiv receptors for ? -endorphin on the

rat vas deferens. Life Sci. 1979; 24: 843-850. 176

Nadel JA. Neutral endopeptidases modulates neurogenic inflammation. Eur Resp J.

1991; 4: 745-754. 177

Bigoni R, Calo G, Guerrini R, Strupish JW, Rowbotham DJ, Lambert DG. Effects of

nociceptin and endomorphine 1 on the electrically stimulated human vas deferens. Br J Clin Pharmacol. 2001; 51: 355-358. 178

Guiliani S, Lecci A, Tramontana M, Maggi CA. The inhibitory effect of nociceptin

on the micturition reflex in anaesthetized rats. Br J Pharmacol. 1998; 124: 1566-1572. 179

Maggi CA, Patacchini R, Eglezos A, Quartara L, Giuliani S, Giachetti A. Tachykinin

receptors in quinea – pig

renal pelvis: activation by exogenous and endogenous

tachykinins. Br J Pharmacol. 1992; 107: 27-33. 180

Lecci A, Giuliani S, Tramontana M, Meini S, Santicioli P, Maggi CA. Tachykinin –

mediated effect of nociceptin in the rat urinary bladder in vivo. Eur J Pharmacol. 2000; 389: 99-102. 181

Hadrup N, Peterson JS, Praetorius J, Meier E, Graebe M, Brond L, Staahltoft D,

Nielsen S, Christensen S, Kapusta DR, Jonassen TE. Opioid receptor- like 1 stimulation in the collecting duct induces aquaresis through vasopressin- independent aquaporin-2 downregulation. Am J Physiol Renal Physiol. 2004; 287: F160-F168. Epub 2004 182

Szolcsányi J. Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensory-

efferent function. In: Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation, edited by Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F. Budapest, Akedemiai Kiado, 1984.p. 26-52. 183

Inoue M, Kobayashi M, Kozaki S, Zimmer A, Ueda H. Nociceptin/orphanin FQ-

induced nociceptive responses thrugh substance P release from peripheral nerve endings in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 10949-10953.

100

184

Nishi M, Houtani T, Noda Y, Mamiya T, Sato K, Doi T, Kuno J, Takeshima H,

Nukada T, Nabeshima T, Yamashita T, Noda T, Sugimoto T. Unrestrained nociceptive response and disregulation of hearing ability in mice lacking the nociceptin/orphanin FQ receptor. EMBO J 1997; 16:1858-1864. 185

Fiset ME, Gilbert C, Poubelle PE, Pouliot M. Human neutrophils as a source of

nociceptin: a novel link between pain and inflammation. Biochem. 2003; 42: 1049810505. 186

Pampusch MS, Serie JR, Osinki MA, Seybold VS, Murtaugh MP, Brown DR.

Expression of nociceptin/OFQ and prepro- nociceptin/OFQ in lymphoid tissues. Peptides 2000; 21: 1865-1870. 187

Arjomand J, Cole S, Evans CJ. Novel orphanin FQ/nociceptin transcripts are

expressed in human immune cells. J Neuroimmunol 2002; 130: 100-108. 188

Zhao H, Wu GC, Cao XD. Immunomodulatory activity of orphanin FQ/nociceptin

on traumatic rats. Acta Pharmacil Sin. 2002; 23. 343-348. 189

Buzas B, Symes AJ, Cox BM. Regulation of nociceptin/orphanin FQ gene

expression by neuropoietic cytokines and neurotrophic factors in neurons and astrocytes. J Neurochem. 1999;72:556-63. 190

Anderberg UM, Liu Z, Berglund L, Nyberg F. Plasma levels on nociceptin in female

fibromyalgia syndrome patients. Z Rheumatol. 1998; 57 Suppl 2: 77-80. 191

Baraniuk JN, Whalen G, Cunningham J, Clauw DJ. Cerebrospinal fluid opioid

peptides in fibromyalgia and chronic low back pain. BMC Muscoskeletal Disord. 2004; 5: 48. 192

Brooks H, Elton CD, Smart D, Rowbotham DJ, McKnight AT, Lambert DG.

Identification of nociceptin in human cerebrospinal fluid: comparison of levels in pain and non-pain states. 1998; 78: 71-73. 193

Ertsey C, Hantos M, Bozsik G, Tekes K. Circulating nociceptin levels during the

cluster headache period. Cephalalgia. 2004; 24: 280-283. 194

Mork H, Hommel K, uddman R, Edvinsson L, Jensen R. Does nociceptin play a role

in pain disorders in man? Peptides. 2002; 23: 1581.-1587. 195

Ko MH, Kim YH, Woo RS, Kim KW. Quantitative analysis of nociceptin in blood

of patients with acute and chronic pain. Neuroreport. 2002; 13: 1361-1633.

101

196

Auld DS. Removal and replacement of metal ions in metallopeptidase. Meth

Enzymol. 1995; 248: 228-242. 197

Plotnikoff NP, Faith RE, Murgo AJ, Herberman RB, Good RA. Methionine

enkephalin: a new cytokine-human studies. Clin Immunol Immunpathol. 1997, 82: 93101. 198

Bergasa NV, Liau S, Homel P, Ghali V. Hepatic met-enkephalin immunoreactivity is

enhanced in primary bliary cirrhosis. Liver. 2002; 11: 107-113. 199

Thornton JR, Losowsky MS. Plasma leucin enkephalin is increased in liver disease.

Gut. 1989, 30: 1392-1395. 200

Thornton JR, Losowsky MS. Plasma endorphine in cirrhosis and renal failure. Gut.

1991, 32: 306-308. 201

Spivey JR, Jorgensen RA, Gore GJ, Lindor KD. Methionine-enkephalin

concentrations correlate with stage of disease but not pruritus in patients with primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol. 1994; 89: 2028-2032. 202

Bergasa NV, Rothman RB, Vergalla J, Xu H, Swain MG, Jones EA. Central mu-

opioid receptors are down-regulated in a rat model of cholestasis. J Hepatol. 1992, 15: 220-224. 203

Swain MG, Rothman RB, Xu H, Vergalla J, Bergasa NV, Jones EA. Endogenous

opioids accumulate in plasma in a rat model of acute cholestasis. Gastroenterol. 1992; 103: 630-635. 204

Swain MG, Vergalla J, Bergasa NV, Jones EA. Sympathetic nerves, but not the

adrenal gland, contribute to elevated plasma levels of met-enkephalin in rats with acute cholestatic rats. Regul Pept. 1993; 46: 535-542. 205

Wahler JB, Swain MG, Carson R, Bergasa NV, Jones EA. Blood-brain-barrier

permeability is markedly decreased inn choleastasis in the rat. Hepatol. 1993, 17: 11031108. 206

Swain MG, Heyes MP, Vergalla J, Jones EA. Methionine enkephalin accumulates in

plasma but not in brain or cerebrospinal fluid of rats with acute toxic hepatitis. Neurosci Lett. 1992; 141: 243-246. 207

Bergasa NV, Vergalla J, Swain MG, jones EA. Hepatic concentrations of

proenkephalin-derived opioids are increased in a rat model of cholestasis. Liver. 1996; 16: 298-302.

102

208

Bosch FX, Ribes J, Diaz M, Cleries R. Primary liver cancer: Worldwide incidence

and trends. Gastroenterol. 2004; 127: S5-S16. 209

Bosch FX, Ribes J, Borras J. Epidemiology of primary liver cancer. Semin Liver

Dis. 1999; 19: 271-285. 210

Sherman M, Peltekian KM, Lee C. Screening for hepatocellular carcinoma in

chronic carriers of hepatits B virus: incidence and prevalence of hepatocellular carcinoma in North American urban population. Hepatol. 1995; 22: 432-438. 211

Collier J, Sherman M. Screening for hepatocellular carcinoma. Hepatol. 1998; 37:

273-273. 212

Nguyen MH, Garcia RT, Simpson PW, Wright TL, Keeffe EB. Racial differences in

effectiveness of alpha- fetoprotein for diagnosis of hepatocellular carcinoma in hepatitis C virus cirrhosis. Hepatol. 2002; 36: 410-417. 213

Koteish A, Thuluvath P. Screening for Hepatocellular Carcinoma. J Vasc Interv

Radiol. 2002; 13: 185-190. 214

Lee YH, Yun Y. HBx protein of hepatitis B virus activates Jak1-STAT signaling. J

Biol Chem. 1998; 273: 25510-25515. 215

Yoshida T, Hanada T, Tokuhisha T, Kosai K, Sata M, Kohara M, Yoshimura A.

Activation of STAT3 by hepatitis C virus core protein leads to cellular transformation. J Exp Med. 2002; 196: 641-653. 216

Bromberg J, Darnell JE. The role of STAT sin transcriptional control and their

impact on cellular function. Oncogene. 2000; 19: 2468-2473. 217

Nakajima K, Yamanaka Y, Nakae K, Kojima H, Ichiba M, Kiuchi N, Kitaoka T,

Fukuda T, Hibi M, Hirano T. A central role for STAT3 and IL-6-induced regulation of growth and differentiation in M1 leukemia cells. EMBO J. 1996; 15: 3651-3658. 218

Ni Z, Lou W, Leman ES, Gao AC. Inhibition of constitutively activated STAT3

signaling pathway supresses growth in prostate cancer cells. Cancer Res. 2000; 60: 1225-1228. 219

Song JI, Grandis JR. STAT signaling in head and neck cancer. Oncoge ne. 2000; 19:

2489-2495. 220

Sharif M, Saskawa N, Hanley MR. Malignant transformation by G-protein-coupled

hormone receptors. Mol Cell Endocrinol. 1994; 100: 115-119.

103

221

Factor V, Oliver AL, Panta GR, Thoirgersson SS, Sonenshein GE, Arsura M. Roles

of Akt/PKB and IKK complex in constitutive induction of NF?B in hepatocellular carcinomas of transforming growth factor a/c-myc transgenic mice. Hepatol. 2001; 7: 2958-2970. 222

Sanchez A, Nagy P, Thoirgeirsson SS. STAT-3 activity in chemically- induced

hepatocellular carcinoma. Eur J Cancer. 2003; 39: 2093-2098. 223

. Zalatnai A, Lapis K. Decreased hepaticarcinogenic effect of diethylnitosamine in

experimentally induced liver cirrhosis in rat: dealy or inhibition? Cancer Lett. 1994; 79: 1-7. 224

Zalatnai A, Lapis K. Simulatneous induction of liver cirrhosis and hepatocellular

carcinomas in F-344 rats: establishement of a short hepatocarcinogenesis model. Exp Toxic Pathol. 1994; 46: 215-222. 225

Llovet JM, Bru C, Bruix J. Prognosis of hepatocellular carcinoma: the BCLC staging

classification, Semin Liver Dis 1999; 19: 329-37. 226

The Cancer of the Liver Italian Program (CLIP) Investigators. A new prognostic

system for hepatocellular carcinoma: a retrospective study of 435 patients. Hepatology 1998; 28: 751-5. 227

Zhao WH, Ma ZM, Zhou XR, Feng YZ, Fang BS. Predictio n of recurrence and

prognosis in patients with hepatocellular carcinoma after resection by use of CLIP score. World J Gastroenterol. 2002; 8: 237-42. 228

Newton J, Francis R, Prince M, James O, Bassendine M, Rawlings D, Jones D.

Osteoporosis in primary biliary cirrhosis revisited. Gut. 2001; 49: 282-287. 229

Floreani A. Osteoporosis is not a specific complication of primary biliary cirrhosis

(PBC). Gut. 2002; 50: 898; author reply 898-9. 230

Szalay F, Hegedus D, Lakatos PL, Tornai I, Bajnok E, Dunkel K, Lakatos P. High

serum osteoprotegerin and low RANKL in primary biliary cirrhosis. J Hepatol. 2003; 38: 395-400. 231

Pares A, Guanabens N, Alvares L. High osteoprotegerin and low RANKL levels in

primary biliary cirrhosis. Relationship with severity of liver disease but not with osteoporosis. Hepatol. 2004; 40(Suppl 1): 463A (absztrakt). 232

Green R. Mechanism of hypogonadism in cirrhotic males. Gut. 1977, 18: 843-853.

104

233

Spampinato S, Di Toro R, Qusem AR. Nociceptin- induced internalization of the

ORL1 receptor in human neuroblastoma cells. Neuroreport. 2001;12:3159-63. 234

Bruix J, Llovet JM. Prognostic assessment and evaluation of the benefits of

treatment. J Clin Gastroenterol. 2002; 35(Suppl 2): S1 38-42. 235

Wang JB, Johnson PS, Imai Y, Persico AM, Ozenberger BA, Eppler CM, Uhl GR.

cDNA cloning of an orphan opiate receptor gene family member and its splice variant. FEBS Lett. 1994; 348: 75-9. 236

Inoue M, Kawashima T, Takeshima H, Calo G, Inoue A, Nakata Y, Ueda H. In vivo

pain-inhibitory role of nociceptin/orphanin FQ in spinal cord. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 305: 495-501. 237

Meunier JC. Utilizing functional genomics to identify new pain treatments: the

example of nociceptin. Am J Pharmacogen. 2003; 3: 117-30. 238

Serhan CN, Fierro IM, Chiang N, Pouliot M. Cutting edge: Nociceptin stimulates

neutrophil chemotaxis and recruitment: inhibition by aspirin- triggered-15-epi- lipoxin A4 . J Immunol. 2001; 166: 3650-54. 239

Szalay F, Hegedus D, Lakatos PL, Tornai I, Bajnok E, Dunkel K, Lakatos P. High

serum osteoprotegerin and low RANKL in primary biliary cirrhosis. J Hepatol. 2003;38:395-400. 240

Hegedus D, Ferencz V, Lakatos PL, Meszaros S, Lakatos P, Horvath C, Szalay F.

Decreased bone density, elevated serum osteoprotegerin, and ? -cross-laps in Wilson disease. J Bone Miner Res. 2002; 17: 1961-1967. 241

Giolo-Pereira L, Fontenele-Neto JD, Borges DR, Kouyoumdijan M. Localization of

EP24.15, a major liver kininase. J Histochem Cytochem. 2003; 51: 125-127. 242

Liu C, Chiu JH, Chin T, Wang LS, Tai CH, Li AF, Wei C. Expression of

aminopeptidase N in bile canaliculi: a predictor of clinical outcome in biliary atresia and a potential tool to implicate the mechanism of biliary atresia. J Surg Res. 2001, 100: 7683.

105