GLUTAMINSAV-GABA CSEREFOLYAMAT A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN (Doktori Értekezés)
Héja László
ELTE TTK, Kémia Doktori Iskola (Dr. Inzelt György, D.Sc.) Szintetikus Kémia, Anyagtudomány, Biomolekuláris Kémia Doktori Program (Dr. Horváth István Tamás, D.Sc.)
Témavezető:
Dr. Kardos Julianna, D.Sc. tudományos tanácsadó
MTA, Kémiai Kutatóközpont Biomolekuláris Kémiai Intézet Neurokémiai Osztály
2007
Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ........................................................................................................... 4 ÁBRAJEGYZÉK ................................................................................................................... 4 TÁBLÁZATJEGYZÉK ............................................................................................................ 7 1.
BEVEZETŐ.................................................................................................................. 8
1.1.
Ingerületátvitel a központi idegrendszerben ................................................................. 8
1.2.
Glutaminsav transzporterek .......................................................................................... 9
1.2.1. A glutaminsav transzport mechanizmusa ............................................................................ 10 1.2.2. A glutaminsav transzporterek fiziológiás és patológiás szerepe.......................................... 12
1.3.
GABA transzporterek ................................................................................................... 13
1.3.1. A GABA transzport mechanizmusa ...................................................................................... 14 1.3.2. A GABA transzporterek fiziológiás és patológiás szerepe .................................................... 15
1.4.
A glutaminsav és GABA rendszerek közötti kölcsönhatás ........................................... 16
2.
CÉLKITŰZÉSEK.......................................................................................................... 18
3.
FELHASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ................................................................. 19
3.1.
Felhasznált oldatok és vegyszerek ............................................................................... 19
3.2.
Radioaktív nyomjelzéses mérések ............................................................................... 20
3.2.1. GABA felvétel meghatározása NPMV frakcióban ................................................................ 20 3.2.2. GABA felvétel meghatározása hippokampális agyszeletben ............................................... 21 3.2.3. GABA felvétel meghatározása GAT-3 transzportert expresszáló sejtvonalon ..................... 21 3.2.4. GABA kibocsátás meghatározása hippokampális agyszeletből ........................................... 22
3.3.
In vivo mikrodialízis ...................................................................................................... 23
3.4.
Mikrofluorimetria ........................................................................................................ 24
3.5.
Kiértékelés.................................................................................................................... 25
4.
EREDMÉNYEK .......................................................................................................... 26
4.1.
Új szekoergolin vegyületek hatása a glutaminsav és GABA felvételre ........................ 26
4.2.
Glutaminsav transzporter ligandumok hatása a GABA felvételre ............................... 28
4.2.1. EAAT ligandumok hatása patkány agyhomogenátumban ................................................... 28 4.2.2. Agyterület-specifikus hatás humán agyhomogenátumokban ............................................. 31 4.2.3. EAAT ligandumok hatása hippokampális agyszeletben ....................................................... 32
4.3.
Glutaminsav transzporter ligandumok hatása a GABA kibocsátásra .......................... 33
4.4.
Glutaminsav transzporter ligandumok hatása in vivo ................................................. 34
4.5.
A GABA kibocsátás mechanizmusának vizsgálata ....................................................... 35
4.5.1. A Glu és GABA receptorok szerepe ...................................................................................... 36 4.5.2. A fehérjeszintézis szerepe .................................................................................................... 38 4.5.3. A Glu dekarboxiláz szerepe .................................................................................................. 39 4.5.4. A csökkentett [Ca2+] hatása .................................................................................................. 41 4.5.5. A GABA kibocsátásban szerepet játszó transzporterek ....................................................... 42 4.5.6. A Glu transzporterek blokkolásának hatása......................................................................... 45 4.5.7. A GABA transzporterek blokkolásának hatása .................................................................... 46 4.5.8. Az intracelluláris [Na+] változása az EAAT aktiválást követően ............................................ 48
5.
AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE .................................................................................. 50
5.1.
Glutaminsav által kiváltott GABA kibocsátás mechanizmusa ...................................... 51
5.2.
Glutaminsav által kiváltott GABA kibocsátás fiziológiás jelentősége .......................... 56
5.3.
Glutaminsav által kiváltott GABA kibocsátás patofiziológiás jelentősége ................... 58
5.4.
Konklúzió ...................................................................................................................... 59
ÖSSZEGZÉS ..................................................................................................................... 60 SUMMARY ...................................................................................................................... 61 FELHASZNÁLT IRODALOM ............................................................................................... 62 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................................. 75 MELLÉKLET ..................................................................................................................... 76
Rövidítésjegyzék
ATP
Adenozin-trifoszfát
Baklofén
(R)-4-amino-3-(4-klórfenil)butánsav
Bikukullin
[R-(R*,S*)]-5-(6,8-dihidro-8-oxofuro[3,4-e]-1,3-benzodioxol-6-yl)-5,6,7,8tetrahydro-6,6-dimetil-1,3-dioxolo[4,5-g]izokinolinium jodid
DHK
Dihidrokainsav
EAAT
Glutaminsav transzporter
GABA
γ-amino-vajsav
Gabakulin
3-amino-2,3-dihidrobenzoesav
GAD
Glutaminsav dekarboxiláz
GAT
GABA transzporter
GAT-2/3
GAT-2 és/vagy GAT-3
Gln
Glutamin
Glu
Glutaminsav
NNC-711
1,2,5,6-tetrahidro-1-[2-[[(difenilmetilén)amino]oxi]etil]-3-piridinkarbonsav
t-PDC
L-trans-pirrolidin-2,4-dikarbonsav
PKC
Protein kináz C
SBFI
‘Nátrium-kötő’ benzofurán izoftalát
SKF89976A
1-(4,4-difenil-3-butenil)-3-piperidinkarbonsav
SNAP-5114
1-[2-[tris(4-metoxifenil)metoxi]etil]-(S)-3-piperidinkarbonsav
SR101
Szulforodamin 101
TBOA
threo-β-benziloxiaszparaginsav
Tiagabine
1-[4,4-bis[(3-metil-2-tienil)]but-3-enil]piperidin-3-karbonsav
4
Ábrajegyzék
1. ábra
Glu és GABA transzporterek szubcelluláris lokalizációja és relatív szerepe
10
a neurotranszmitterek visszavételében 2. ábra
A
visszavételi
kísérletekben
hatékonynak
bizonyult
szekoergolin
26
származékok szerkezete 3. ábra
Szekoergolin származék vegyületek hatása a Glu és GABA felvételre
27
4. ábra
Glutaminsav hatása a [3H]GABA felvételre
29
5. ábra
Glutaminsav transzporter ligandumok hatása a [3H]GABA felvételre
30
6. ábra
Glutaminsav és t-PDC hatása a [3H]GABA felvételre humán agymintákban
31
7. ábra
Glutaminsav és t-PDC hatása a [3H]GABA felvételre hippokampális
32
agyszeletben 8. ábra
Glutaminsav hatása az intra- és extracelluláris GABA szintre
33
9. ábra
NNC-711 és t-PDC hatása az extracelluláris GABA szintre patkány
35
hipokampuszban in vivo 10. ábra
Glu receptor antagonisták hatása a Glu által kiváltott GABA
37
felszabadulásra 11. ábra
GABAA receptor ligandumok hatása a Glu által kiváltott GABA
38
felszabadulásra 12. ábra
A fehérjeszintézis-gátlás hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra
39
13. ábra
A Glu dekarboxiláz enzim gátlásának hatása a Glu által kiváltott GABA
40
felszabadulásra 14. ábra
A csökkentett [Ca2+] hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra
41
15. ábra
Glutaminsav hatása a [3H]β-alanin felvételre
43
16. ábra
β-alanin hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra
44
17. ábra
Glutaminsav, t-PDC és TBOA hatása a [3H]GABA felvételre GAT-2
45
transzportert expresszáló HEK293 sejtvonalban 18. ábra
Nem transzportábilis EAAT inhibitorok hatása a Glu által kiváltott GABA
46
felszabadulásra
5
19. ábra
Nem transzportábilis, szelektív GAT-2/3 inhibitor hatása a Glu által
47
kiváltott GABA felszabadulásra 20. ábra
Az intracelluláris [Na+] változása kapcsolatot teremt a glutaminsav és
49
GABA transzporterek aktivációja között 21. ábra
A Glu által kiváltott GABA felszabadulás modellje
53
6
Táblázatjegyzék
1. táblázat A GABA transzporterek nevezéktana
13
2. táblázat A patkány kortikális NPMV frakció farmakológiai profilja
42
7
1. Bevezető
1.1. Ingerületátvitel a központi idegrendszerben Az idegsejtek közötti információ átadás szinte kizárólagos módja a kémiai jelátvitel, mely a szinapszisokban történik. A kémiai jelátvitel három fő szakaszra osztható. Az első lépésben az akciós potenciál a preszinaptikus idegvégződésbe érkezik, majd ennek hatására neurotranszmitterek szabadulnak fel belőle. Ezt követően a neurotranszmitterek diffuzió útján a posztszinaptikus sejtfelszínhez jutnak, és a membránban található receptorokat aktiválják. A harmadik fázis a kibocsátott neurotranszmitterek
visszavétele,
melyet
a
túlnyomórészt
a
preszinaptikus
idegvégződések vagy az idegsejteket körülvevő gliasejtek membránjában található neurotranszmitter transzporterek végeznek.
Míg a neurotranszmitterek kibocsátása és különösen a receptorok aktiválása hosszú idő óta az idegrendszeri kutatások fókuszában áll, a transzporterek szerepe a jelátviteli folyamatokban kevésbé ismert. Egészen az 1990-es évekig uralkodott az a nézet, miszerint a transzporterek feladata a jelátvitel lezárására és a transzmittereket tároló preszinaptikus vezikulák újrafeltöltésére korlátozódik. Az utóbbi évtizedben azonban világossá vált, hogy a transzporterek sokkal komolyabb mértékben képesek a neurotranszmisszió
befolyásolására,
elsősorban
a
nyugalmi
extracelluláris
neurotranszmitter koncentráció szabályozásával.
Az idegsejtek tüzelési valószínűsége két tényező függvénye. Az őket beidegző más idegsejtek aktivitásától függő, időben elkülönülő szinaptikus gátló, illetve serkentő áramok a tüzelés valószínűségét csökkentik, illetve növelik. A tüzelési valószínűség alapértékét azonban a neurotranszmitterek nyugalmi extracelluláris koncentrációja határozza meg, melyet elsősorban a transzporterek szabályoznak.
8
A
központi
idegrendszer
működésének
folyamatos
biztosításához
nélkülözhetetlen a serkentő és gátló folyamatok összehangolt működése. Ezen belül is kiemelt szerepet játszanak az agy fő serkentő (glutaminsav) és gátló (γ-amino-vajsav) neurotranszmitterei. A fent leírtaknak megfelelően ezen összehangolt működésben kiemelt szerepet játszanak a glutaminsav (Glu) és γ-amino-vajsav (GABA) transzporterek.
1.2. Glutaminsav transzporterek A jelátvitelt követően a serkentő Glu eltávolítása az extracelluláris térből kulcsfontosságú az idegrendszer működésének biztosítása szempontjából (Danbolt, 2001). Ezt a feladatot látják el a Glu transzporterek (excitatory amino acid transporter, EAAT). Mivel a Glu metabolikus konverziója extracellulárisan elenyésző mértékű (Schousboe & Waagepetersen, 2006), a Glu transzporterek a gyors és hatékony felvétel érdekében rendkívül nagy kapacitású rendszert alkotnak, mely az agykéregben a teljes energiafelhasználás 2 százalékáért felelős (Attwell & Laughlin, 2001).
Jelenleg 5 különböző EAAT altípust ismerünk (EAAT1-5), melyek aminosav szekvenciáikban 50-60 %-os homológiát mutatnak (Danbolt, 2001; Beart & O’Shea, 2007). Ezen altípusok eltérő mértékben járulnak hozzá a Glu felvételéhez. Az EAAT1 és EAAT2 altípusok felelősek a Glu felvétel jelentős részéért a központi idegrendszer minden vizsgált régiójában (Danbolt, 2001). Mivel ezek az altípusok a gliasejteken lokalizálódnak (1. ábra), aktivitásuk jelentős mértékben járul hozzá a glia neuroprotektív szerepéhez. Jóval kisebb súlyt képvisel a Glu felvételből a neuronokon preszinaptikusan elhelyezkedő EAAT3 altípus. Az EAAT4 csak a kisagyi Purkinje sejtek posztszinaptikus dendritjein fejeződik ki (Amara & Fontana, 2002), míg az EAAT5 kizárólag a retinában található (Gadea & Lopez-Colome, 2001).
9
1. ábra Glu és GABA transzporterek szubcelluláris lokalizációja és relatív szerepe a neurotranszmitterek visszavételében. A preszinaptikus idegsejt kisülését követően a GABA visszavételét elsősorban a preszinaptikus idegvégződésen elhelyezkedő GAT1 transzporter végzi. A Glu visszavétele ezzel szemben meghatározóan a környező gliasejteken lokalizálódó EAAT1 és EAAT2 transzportereken keresztül zajlik. Az ábrán az egyes transzporterek mérete a megfelelő neurotranszmitter felvételében betöltött szerepükkel arányos.
A Glu felvétele és újrahasznosítása a Glu-Gln ciklus mentén zajlik (Daikhin & Yudkoff, 2000). A gliasejtekbe felvett Glu-t a Gln szintetáz nevű enzim alakítja glutaminná, majd a keletkezett Gln a gliából kibocsátódik, az idegsejtek felveszik és a glutamináz enzim segítségével ismét Glu-t állítanak elő belőle (Schousboe & Waagepetersen, 2006).
1.2.1. A glutaminsav transzport mechanizmusa A Glu transzporterek 8 transzmembrán régiót tartalmazó membránfehérjék, melyek külön családot képeznek a transzporter fehérjék között (Slotboom et al., 1999). A Pyrococcus horikoshii baktériumból kristályosított EAAT homológ alapján (Yernol et al., 2004) háromimenziós szerkezetük meghatározása a közelmúltban kapott lendületet. A 10
transzporter egy trimer struktúrának bizonyult, melynek mindhárom tagja önnálóan képes a Glu és a kotranszportálódó ionok megkötésére. A kötőhely (Simon et al., 2008) egy molekuláris „kád” mélyén helyezkedik el, mely a membrán közepéig nyúlik be és könnyen elérhető az extracelluláris folyadék számára (Yernol et al., 2004). A háromdimenziós modell alapján feltételezett transzport mechanizmus az „alternatív hozzáférés” mechanizmusát (Jardetzky, 1966) támaszotta alá. A ligandum kötődését követő konformációs változások az extracelluláris tér felé nyitott állapotból a transzmembrán hélixek átrendeződésével az intracelluláris térre nyíló konformációba fordítják át a fehérjét (Yernol et al., 2004, Kanner, 2007).
A transzport folyamat a sejtmembrán két oldala között felépülő [Na+] és [K+] gradienseket használja fel hajtóerőként, ezen ionok passzív, a gradienssel megegyező irányú transzportjából nyerve energiát a Glu koncentráció gradienssel szembeni, aktív felvételére. 1 Glu molekula transzportja 3 Na+ ion és 1 H+ ion felvételével, valamint 1 K+ ion kibocsátásával jár együtt (Zerangue & Kavanugh, 1996). A folyamat ennek következtében elektrogén. Megjegyzendő, hogy a termodinamikailag kapcsolt Glu/Na+/K+ transzport mellett Na+ ion-függő, de Glu-független Cl- ion áram is létezik az EAAT-ken keresztül (Seal & Amara, 1999), vagyis a transzporterek egyben ioncsatornaként is funkciolnálnak.
A 4 ion (3 Na+ ion és 1 K+ ion) gradienssel megegyező transzportjából adódó meglehetősen nagy termodinamikai hajtóerő következtében a Glu transzporterek igen hatékonyan képesek az extracelluláris Glu felvételére. Egy transzport ciklus mintegy 6080 ms alatt zajlik le (Auger & Attwell, 2000). Szintén a Glu eltávolítás hatékonyságát segíti az EAAT-k nagy száma. A transzporterek sűrűsége a hippokampusz gliasejtjein 2300-8500 EAAT molekula/μm2 (Lehre & Danbolt, 1998), és mivel nem egyenlenletesen oszlanak el, hanem a szinaptikus rés környékén koncentrálódnak (Takayasu et al., 2005; Chaudry et al., 1995), az aktív helyen a transzporterek sűrűsége még ennél is nagyobb lehet. Ez a rendkívül nagy sűrűség összevethető a szinapszisban felszabaduló Glu molekulák számával (4000-5000 Glu molekula/vezikula) (Clements, 1996; Barbour & Häusser, 1997). Számítások szerint az EAAT-k felvételi kapacitása 290000 Glu 11
molekula/sec (Lehre & Danbolt, 1998). Az EAAT-k nagy számának és hatékony működésének köszönhető, hogy az extracelluláris Glu koncentráció a neurotoxikus érték alatt tartható. In vivo és in vitro adatok alapján az extracelluláris Glu koncentráció 20-800 nM körül alakul (Nyitrai et al., 2006; Hermann & Jahr, 2007).
1.2.2. A glutaminsav transzporterek fiziológiás és patológiás szerepe Mivel a Glu a központi idegrendszer fő serkentő neurotranszmittere és mind a gyors jelátvitelben, mind az agyi plaszticitásban kiemelkedő szerepet játszik, extraszinaptikus idegrendszeri
koncentrációjának működés
szabályozása
biztosításához.
Az
elengedhetetlen
EAAT
transzporterek
a
normális
diszfunkciója
következtében beálló megnövekedett extracelluláris Glu szint a Glu receptorok túlzott mértékű aktivitásához vezet, és ennél fogva neurotoxikus hatású. A Glu transzporterek aktivitásának gátlása inhibitor vegyületekkel (Maragakis & Rothstein, 2004) vagy ’antisense’ oligonukleotidokkal (Rothstein et al., 1996) egyaránt az idegsejtek károsodásához
vezet.
Az
EAAT2-t
nem
expresszáló,
genetikailag
módosított
egértörzsekben ugyanezen okból kifolyólag spontán halálos epilepsziás rohamok alakulnak ki (Tanaka et al., 1997).
Annak ellenére, hogy jelen ismereteink szerint nem kellően tisztázott, hogy a Glu transzporterek
diszfunkciója
az
idegrendszeri
betegségek
kiváltó
oka
vagy
következménye, számos kórkép esetén egyértelműen kapcsolat lelhető fel a Glu transzport zavarai és az adott betegség megjelenése között. Ezen betegségek közül is kiemelkedik az epilepszia (Ferrie et al., 1999; During & Spencer, 1993; Hoogland et al., 2004), az ischémia (Rossi et al., 2000; Jabaudon et al., 2000), az Alzheimer kór (Marakagis et al., 2004) vagy az amiotróf laterális szklerózis (Rothstein et al., 1995; Rothstein et al., 2005).
12
1.3. GABA transzporterek A jelátvitelt követően a GABA eltávolítását a szinaptikus résből a GABA transzporterek (GAT) végzik, melyeknek 4 altípusát ismerjük jelenleg (Sarup et al., 2003a). A GABA felvétel mintegy 90 százalékáért a preszinaptikus terminálisokon elhelyezkedő GAT1 transzporter altípus a felelős. A vezikulárisan kibocsátott GABA visszavételét
és
a
neuronális
GABA
tárolókapacitás
feltöltését,
vagyis
a
neurotranszmitter transzporterek „klasszikus” feladatait szinte kizárólag ez az altípus végzi (Dalby, 2003; Kanner, 2006). A GAT1 dominanciájának és az ebből következő kiterjedtebb vizsgálatoknak köszönhetően a GAT1 funkciója és farmakológiája alaposan tanulmányozott terület. Jóval kevesebb ismerettel rendelkezünk azonban a többi GAT altípus szerepéről. Ezek közül a GAT-3 altípus a legnagyobb súllyal előforduló transzporter, amely kisebb részben a preszinaptikus terminálisokon, nagyobbrészt azonban a gliasejteken lokalizálódik (Conti et al., 2004) (1. ábra). Szintén a gliasejteken található a GAT-2 (1. ábra), de ez az altípus a GAT-3-nál kevesebb agyterületen fordul elő (Dalby, 2003). A negyedik GABA transzporter altípus, a BGT-1 – bár széleskörűen előfordul az agyban és más testi szövetekben is – a többi altípusnál kisebb affinitású, ennélfogva a GABA felvételben játszott szerepe kevésbé jelentős. Megjegyzendő, hogy történeti okok miatt a különböző fajokban a GABA transzporterek nomenklatúrája meglehetősen ellentmondásos. Két különböző nevezéktan is használatban van (Sarup et al., 2003b). Dolgozatomban a szélesebb körben elterjedt, patkányra és emberre vonatkoztatott nevezéktant fogom alkalmazni. Az ebben kötőjellel írt GAT altípusok a következőképpen felelnek meg a másik nomenklatúra által alkalmazott jelöléseknek: GAT1 = GAT1, GAT-2 = GAT3, GAT-3 = GAT4, BGT-1 = GAT2 (1. táblázat).
1. táblázat A GABA transzporterek nevezéktana GABA transzporter altípus megnevezése Egér
GAT1
GAT2
GAT3
GAT4
Patkány
GAT1
BGT-1
GAT-2
GAT-3
Ember
GAT1
BGT-1
nincs klónozva
GAT-3
13
Jelen munka szempontjából kiemelkedő jelentőségű az a tény, hogy a minor GABA transzporterek (1.ábra) szinaptikus GABA felvételben játszott marginális szerepe folytán ezen transzporterek idegrendszeri funkciója nem tisztázott.
1.3.1. A GABA transzport mechanizmusa A GABA transzporterek a Na+/Cl- ion-függő transzporterek családjába tartozó, 12 transzmembrán szakaszt tartalmazó fehérjék (Kanner, 2006). A családba tartozó más neurotranszmitter transzporterekkel (dopamin-, szerotonin-, norepinefrin transzporter) 40-60 százalékos szekvencia homológiát mutatnak (Chen et al., 2004). Egy Na+/Cl- ionfüggő transzporter, az Aquifex aeolicus-ból kristályosított leucin transzporter (LeuTAa) szerkezete nemrégen vált ismertté, mely a GABA transzporterekkel 20-25 százalékos homológiát mutat (Yamashita et al., 2005). A LeuTAa szerkezete alapul szolgált a GAT1 transzporter
modelljének
felépítéséhez
(Palló
et
al.,
2007),
mely
képes
molekulamechanikai számítások alapján előrejelezni ligandumok GAT1 gátló képességét.
1 GABA molekula transzportja a GABA transzportereken keresztül 2 Na+ ion és 1 Cl- ion felvételével jár együtt. A folyamat tehát elektrogén, bár kisebb mértékben, mint a Glu transzporterek esetében. A transzlokációs folyamat első lépése az egyik Na+ ion kötődése a transzporterhez. Ez egyben a folyamat sebességmeghatározó lépése is (Lu & Hilgemann, 1999). Ezt követi a másik Na+ ion, a Cl- ion (Zomot et al., 2007) és a GABA kötődése, majd maga a transzlokáció, mely a Glu transzporthoz hasonlóan az ’alternatív hozzáférés’ modellje szerint zajlik le (Yamashita et al., 2005).
A Glu transzporterek 2300-8500 EAAT molekula/μm2 (Lehre & Danbolt, 1998) sűrűségével szemben a GAT1 transzporterek száma hippokampális interneuronok idegvégződésein 800-1300 GAT1 molekula/µm2 (Chiu et al., 2002). Ennek ellenére szintén rendkívül hatékonyan képesek a kibocsátott GABA visszavételére, köszönhetően annak, hogy a felvétel nagy részéért felelős GAT1 altípus a preszinaptikus idegvégződéseken helyezkedik el. Mivel így a kibocsátási hely közvetlen közelében tudják végezni a visszavételt, a GABA – a Glu-val szemben – kevésbé képes diffúzió útján
14
eltávozni a szinaptikus résből. Az extracelluláris GABA koncentráció ennek köszönhetően 40-80 nM körül alakul (Nyitrai et al., 2006).
1.3.2. A GABA transzporterek fiziológiás és patológiás szerepe A központi idegrendszer fő gátló neurotranszmitterének, a GABA-nak visszavétele és újra felhasználása elengedhetetlen a serkentő és gátló jelátviteli folyamatok egyensúlyának biztosításához. Azon idegrendszeri megbetegedések, melyek a gátló és serkentő folyamatok egyensúlyának megbomlásával járnak gyakran vezethetők vissza a GABA felvétellel kapcsolatos elváltozásokra, illetve kezelhetők a GABA transzporterek befolyásolásával (Dalby, 2003; Schousboe & Waagepetersen, 2007; Gether et al., 2006).
Az egyik legszéleskörűbben vizsgált betegség, az epilepszia esetében a serkentő folyamatok túlsúlyba kerülnek (Gutierrez & Heinemann, 2006; Shao et al., 2004; Wu & Leung, 2003). Ilyenkor az egyik lehetséges terápiás kezelés a gátló GABAerg folyamatok elősegítése, melynek egyik módja a GABA felvételének gátlása, ezzel a GABA által okozott gátlás időbeli meghosszabbítása. Ezen terápiás stratégia – a klinikai gyakorlatban is alkalmazott – eredménye a GAT1 gátlószer 1-[4,4-bis[(3-metil-2-tienil)]but-3enil]piperidin-3-karbonsav (Tiagabine) kifejlesztése (Krogsgaard-Larsen et al., 2000; Sills, 2003; Pedersen, 2001).
Egy további általánosan vizsgált betegség, az agyi oxigén hiány következtében fellépő – az epilepsziához hasonlóan kórosan fokozott serkentéssel járó – ischémia vonatkozásában szintén több esetben írták le a betegség összefüggését a GABAerg aktivitás csökkenésével (Mittmann et al., 1994; Schiene et al., 1996). A fokális ischémia egy modelljében pedig a GAT-3 transzporter altípus felszíni kifejeződésének megnövekedését mutatták ki patkányokban (Melone et al., 2003).
A Gluerg és GABAerg rendszerek, illetve közvetlenül a Glu és GABA transzporterek diszfunkciója tehát egyaránt szerepet kaphat az olyan – fokozott serkentéssel jellemzett – betegségek kialakulásában, mint az epilepszia vagy az ischémia.
15
Mindez annak a ténynek a következménye, hogy a normális agyi működés biztosításához a gátló és serkentő folyamatok jól szabályozott összehangoltságára van szükség. Ezen összehangolt működés biztosításában pedig jelentős szerepet kapnak a Glu és GABA transzporterek.
1.4. A glutaminsav és GABA rendszerek közötti kölcsönhatás A neurotranszmitter rendszerekre hosszú időn keresztül mint különálló, egymástól független rendszerekre tekintettek (Dale, 1952; Strata & Harvey, 1999). Az utóbbi évtizedben azonban számos új eredmény került napvilágra, melyek kapcsolatot tártak fel különböző neurotranszmitter rendszerek között (Héja et al., 2006). Bizonyítást nyert mind a Glu jelenléte a GABAerg sejtek idegvégződéseiben (Somogyi et al., 2004), mind a GABA előfordulása a korábban egyértelműen Gluerg sejtekként ismert szemcsesejtekben (Gutierrez, 2003; Sonnewald et al., 2004; Gutierrez & Heinemann, 2006). A GABA és a Glu intracelluláris vezikulákba történő felvételéért felelős transzporterek kolokalizációját figyelték meg a hippokampuszban és az agykéregben (Somogyi et al., 2004), mely felveti annak lehetőségét, hogy egy idegvégződésből különböző
típusú
neurotranszmitterek
szabadulhatnak
fel.
A
Glu
és
GABA
plazmamembrán transzporterekről szintén kimutatták, hogy azonos idegvégződésekben lokalizálódnak több különböző sejttípus esetében is (Bonanno et al., 2006).
A kolokalizáción túlmenően a Glu és GABA rendszerek között funkcionális kapcsolat is fennáll. Hippokampális CA3 neuronokban írták le például azt a mechanizmust, mely a Gluerg beidegzések fokozott működése esetén megvédi a sejteket a túlzott mértékű serkentéstől (Cohen-Kfir et al., 2005). A preszinaptikus terminálisból történő Glu felszabadulás során ugyanis a Glu-val együtt Zn2+ ionok is ürülnek, melyek hatékonyan gátolják a GAT-3 transzportert (Cohen-Kfir et al., 2005).
A fenti összefüggéseken túl számos esetben írtak le olyan vegyületeket, melyek mind a Glu, mind a GABA transzporterek aktivitását befolyásolják. Ezen szabályozás egyik eszköze a transzporterek felszíni expressziójának módosítása. Az antipszichotikus
16
szerként alkalmazott clozapine és haloperidol emberben és patkányban is szignifikánsan csökkenti az EAAT2 és EAAT3 szinteket (Schmitt et al., 2003), és ezzel párhuzamosan serkenti a GAT1 és gátolja a GAT-3 fehérjék felszíni kifejeződését (Zink et al., 2004). Egy másik, a klinikai gyakorlatban ugyancsak alkalmazott szer, az antiepileptikus hatású clobazam használata pedig az EAAT3 és GAT-3 transzporterek fokozott kifejeződéséhez vezet a többi Glu és GABA transzporter expressziójának változatlanul hagyása mellett (Doi et al., 2005). Szintén a transzporterek expressziójának szabályozásában vesz részt a protein kináz C (PKC) enzim, melynek egy aktivátoráról, a forbol-12-mirisztát-13acetátról (PMA) leírták, hogy növeli mind az EAAT1 (Susarla et al., 2004), mind a GAT1 (Corey et al., 1994) aktivitását. Egyes szekoergolin származékokról, melyek szerkezetükben mind a Glu, mind a GABA bioizoszter motívumot tartalmazzák mi írtuk le, hogy azonos mértékben gátolják a Glu és GABA transzporter funkciót (Héja et al., 2004). Mindezen észleletek rámutatnak arra, hogy lehetséges akár egyetlen ágenssel is befolyásolni a különböző neurotranszmitter transzporterek működését.
Jelen dolgozat szempontjából kiemelkedő jelentőségű az a megfigyelés, mely szerint egészséges embereknél in vivo Glu adagolás (5 mM) hatására az extracelluláris GABA koncentráció a nyugalmi szint 4,6-szeresére növekszik (During et al., 1995). A szerzők feltételezik, hogy ez a Ca2+ ion-független GABA felszabadulás a neuronális és/vagy gliális GABA transzportereken keresztül zajlik. Temporális lebenyi epilepsziában szenvedő betegeknél ez a Glu hatására bekövetkező GABA felszabadulás nem szignifikáns mértékű, valószínűsítve azt, hogy a folyamat hiánya hozzájárulhat a temporális lebenyi epilepszia kialakulásához (During et al., 1995).
17
2. Célkitűzések
Munkám során arra a kérdésre kerestem választ, hogy az eddig kevéssé vizsgált gliális GABA transzporterek milyen szerepet töltenek be a központi idegrendszer jelátviteli folyamataiban. Meg kívántam vizsgálni annak a lehetőségét, hogy összefüggés áll fenn ezen gliális transzporterek és a szintén a glián lokalizálódó Glu transzporterek működése között. Amennyiben ez az összefüggés létezik, célul tűztem ki a mögötte meghúzódó mechanizmus felderítését. E kérdéseket az alábbi vizsgálatok elvégzésével terveztem megválaszolni:
1. Glu transzporter ligandumok hatásának vizsgálata a GABA felvételre radioizotópos nyomjelzési technika alkalmazásával in vitro.
2. Glu transzporter ligandumok hatásának vizsgálata a GABA kibocsátásra radioizotópos nyomjelzési technika alkalmazásával in vitro.
3. Glu transzporter ligandumok hatásának vizsgálata az extracelluláris GABA szintre in vivo.
4. A potenciális transzporter kölcsönhatás hatásmechanizmusának vizsgálata: i) a
neurotranszmitter
transzporterek
által
szabályozott
anyagáramok
elkülönítése más ismert transzportfolyamatoktól ezen folyamatok specifikus gátlásával; ii) a kölcsönhatásban részt vevő transzporter altípusok azonosítása a folyamat farmakológiai profiljának feltérképezésével; iii) a Glu és GABA transzporterek
hajtóerejét
biztosító
Na+
ion
gradiens
szerepének
meghatározása képalkotó technikák alkalmazásával.
18
3. Felhasznált anyagok és módszerek
3.1. Felhasznált oldatok és vegyszerek Az oldatok összetételét mM-ban tüntettem fel, az elkészítésükhöz felhasznált sók a Sigma-Aldrich (Budapest, Magyarország) és a Reanal (Budapest, Magyarország) cégektől származtak. A felhasznált Wistar patkányokat (Toxicoop, Budapest, Magyarország) a Magyar Állattartási Törvénynek (1998) és az Európai Bizottság 1986. november 24-i rendeletének (86/609/EEC) megfelelően tartottuk és kezeltük.
Pufferek:
HEPES: 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glükóz, 20 HEPES (pH 7,5)
hHEPES: 1 fenilmetilszulfonil-fluorid (PMSF), 0,01 mg/ml aprotinin, 0,005 mg/ml leupeptin, 0,005 mg/ml antipain, 0,005 mg/ml pepstatin A, 0,02 mg/ml butilhidroxitoluén (BHT), 1 ATP, 320 szacharóz, 10 HEPES (pH 7,5)
PBS: 137 NaCl, 2,7 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 4,3 Na2HPO4, 1,4 KH2PO4, 6,5 glükóz (pH 7.4)
ACSF: 129 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,8 MgSO4, 1,6 CaCl2, 21 NaHCO3, 10 glükóz, 95% O2 + 5% CO2 gázeleggyel folyamatosan buborékoltatva
pACSF: 75 szacharóz, 87 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 7 MgSO4, 0,5 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 glükóz, 95% O2 + 5% CO2 gázeleggyel folyamatosan buborékoltatva
vACSF: 144 NaCl, 3 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2 (pH 7,4)
19
3.2. Radioaktív nyomjelzéses mérések 3.2.1. GABA felvétel meghatározása NPMV frakcióban A GABA felvétel meghatározásához 4-6 hetes hím Wistar patkányok agykérgét és fagyasztott humán mintákat (Humán Agyszövetminta Bank, Budapest) használtunk, melyekből natív plazmamembrán vezikula (NPMV) frakciót preparáltunk (Molnár et al., 2007; Kovács et al., 2003). A patkányok agyát lefejezést követően eltávolítottuk, majd az agykérget 2-3 mm-es kockákra daraboltuk. A darabokat 2x15 ml ’hHEPES’ pufferben késes ultrahangos homogenizálóval 20000 min-1 fordulatszámon 5 másodpercig homogenizáltuk. Az így kapott homogenátumhoz 2x15 ml ’HEPES’ puffert adtunk, majd az elegyet 4 percig jégen kevertettük. Ezt követően 270 g gyorsulással 4 percig centrifugáltuk. A felülúszót 20 percig ülepítettük (6500 g), majd az üledéket kézzel 30 ml ’HEPES’ pufferben homogenizáltuk. A szuszpenziót 15 percig tartó centrifugálás (3500 g) után 15 ml ’HEPES’ pufferben homogenizáltuk. Az így kapott NPMV frakció számos különböző formájú és alakú membránvezikulát, kevés sértetlen szinaptoszóma frakciót és szabad mitokondriális frakciót tartalmaz (Kardos et al., 1991).
A felvételi kísérletek a következőképpen zajlottak (Héja et al., 2004): az NPMV frakcióból származó alikvotokat ’HEPES’ pufferben előinkubáltuk a vizsgálandó vegyülettel
100
μM
1,2,5,6-tetrahidro-1-[2-[[(difenilmetilén)amino]oxi]etil]-3-
piridinkarbonsav (NNC-711) jelenlétében 30 °C-on 10 percig (az előinkubálás hatását vizsgáló kísérletekben 0, 10 és 30 percig). Az előinkubált duplikált szuszpenziókat [3H]GABA (10 nM, Amersham) és jelzetlen GABA (90 nM, Sigma) elegyével inkubáltuk 1 percig. Az inkubálás után a mintákat üvegszűrőn szűrtük (Whatman GF/B), majd 4 °C-os ’HEPES’ pufferrel kétszer mostuk. A minták radioaktivitását HiSafe3 szcintillációs elegyben (Perkin-Elmer, Turku, Finnország) határoztuk meg folyadékszcintillációs detektálás segítségével (Wallac 1414 WinSpectral, Perkin-Elmer Life Sciences, Turku, Finnország). Azonos preparátumból végzett kísérletsorozaton belül minden inkubálást kétszer ismételtünk.
20
3.2.2. GABA felvétel meghatározása hippokampális agyszeletben A 400 μm vastagságú hippokampális agyszeleteket 9-15 napos hím Wistar patkányokból preparáltuk (Lasztóczi et al., 2004; Lasztóczi et al., 2006). Az állatok agyát a dekapitálást követően azonnal kivettük, majd 4 oC-os ’pACSF’ pufferbe helyeztük. A kisagy, illetve a nagyagy frontális részeinek eltávolítása után, a mindkét oldali hippokampuszt tartalmazó blokkokat egy platformra ragasztottuk úgy, hogy a dorzális rész nézzen lefelé a kaudális pedig a penge felé. Ezután keresztirányú, 400 μm vastag, hippokampális agyszeleteket vágtunk Vibratome készülék segítségével. Az agyszeletek a teljes hippokampuszt (a gyrus dentatust, és a CA1-4 régiókat), a subiculumot, az entorhinális kérget és a temporális kéreg egy részét tartalmazták. A szeleteket egy ’ACSF’ puffert tartalmazó ’interface’ típusú kamrában egy órán keresztül inkubáltuk 36 oC-on, majd ezt követően 25 oC-on, karbogén atmoszféra alatt.
A felvételi kísérletekben az agyszeletekre 400 μl ’HEPES’ puffert mértünk, mely a vizsgálandó vegyület mellett 100 μM NNC-711-et, 10 nM [3H]GABA-t és 90 nM jelzetlen GABA-t tartalmazott. A 400 μl minta az agyszeletet teljesen elfedte. A szeletet ezután 30 °C-on lassú rázogatás mellett 1 percig inkubáltuk a vizsgálandó vegyülettel, majd a [3H]GABA felvételt 4 ml, 1 mM koncentrációjú, 4 °C-os guvacin oldat hozzáadásával leállítottuk. A szeletett ezután 2x4 ml 4°C-os ’HEPES’ pufferrel mostuk. A felvett radioaktivitás
mértékét
HiSafe3
szcintillációs
elegyben
határoztuk
meg
folyadékszcintillációs detektálás segítségével.
3.2.3. GABA felvétel meghatározása GAT-3 transzportert expresszáló sejtvonalon A GAT-3 transzportert stabilan expresszáló HEK293 sejtvonalat Arne Schousboe (University of Copenhagen) és Nathan Nelson (Tel Aviv University) ajándékaként kaptuk. A transzfekció a White és munkatársai által közölt módon történt (White et al., 2002). A tenyésztő plate-re kitapasztott HEK293 sejteket 37 °C-on 3 percig inkubáltuk ’PBS’ pufferben a vizsgálandó vegyülettel, majd a fel nem vett mennyiség eltávolítása és kétszeri ’PBS’ pufferrel történő mosás után a minták radioaktivitását HiSafe Mix szcintillációs elegyben határoztuk meg. 21
3.2.4. GABA kibocsátás meghatározása hippokampális agyszeletből A 3.2.2 pontban ismertetett módon preparált 400 μm vastag hippokampális agyszeleteket [3H]GABA (100 nM, Amersham) és jelzetlen GABA (900 nM, Sigma) elegyét tartalmazó 200 μl térfogatú ’ACSF’ oldatba helyeztük a GABA transzamináz gátló gabakulin (250 μM, Tocris) jelenlétében 30 °C-on 10 percre. A szeleteket ezután egy nitrocellulóz membránra vittük át és egy saját készítésű mikrotérfogatú (50 μl) kamrába helyeztük. A kamrán keresztül 0,5 ml/perc sebességgel 100 μM NNC-711-es és 250 μM gabakulint
tartalmazó
30 °C
hőmérsékletű
termosztált
(MLW
U7,
Budapest,
Magyarország) ACSF-et áramoltattunk perisztaltikus pumpa (2132 MicroPerpex, LKB Bromma, Svédország) segítségével. A kamrából távozó folyadékot 0,5 ml térfogatú frakciókba gyűjtöttük egy programozható, cseppszámlálós frakciószedővel (2111 Multirac, LKB Bromma, Svédország). 10 perces mosás (0-10 perc) után 10 frakciót gyűjtöttünk (10-15 perc) az alapvonali GABA felszabadulás meghatározására. Ezután a perfúziós oldathoz 100 μM Glu-t adtunk 10 percre (25-35 perc), majd újabb 10 percig (35-45 perc) ismételten ’ACSF’ pufferrel mostuk a szeletet. A frakciók [3H]GABA tartalmát folyadékszcintillációs módszerrel határoztuk meg. A mintákhoz 3 ml HiSafe szcintillációs elegyet adtunk, majd a mintákat homogenizáltuk 1 perces erőteljes keveréssel (vortex).
A kapott eredmények kiértékeléséhez a frakciók radioaktivitás értékét a szelet teljes radioaktivitásának százalékában fejeztük ki. Az így kapott értékeket az idő függvényében ábrázoltuk, majd a 10-15 és 42-45 percben mért minták pontjaira elsőrendű exponenciális görbét illesztettünk. A mért százalékos radioaktivitás értékeket erre az elsőrendű exponenciális görbére normalizáltuk.
22
3.3. In vivo mikrodialízis 300-400 grammos hím Wistar patkányokat 1 % halotánt tartalmazó levegővel elaltattunk. Az inhalációs narkotikumok előnye, hogy a narkózis mélysége pontosan szabályozható és állandó. A mintavétel során a műtét alattinál alacsonyabb szintre lehet szabályozni a narkózist. Kísérleteinkben 1% halotánt tartalmazó levegővel tartottuk fent a narkózist és 1.5 % halotán tartalom alkalmazásával operáltunk. Ezzel minimálisra csökkenthetô a narkotikum hatása méréseinkre. Fontos szempont volt, hogy méréseinkben meghatározandó anyagok szintjét minél kevésbé befolyásolja az altatás. A halotán in vivo mikrodialízis kísérletekben az excitatórikus aminosav-szinteket nem változtatja meg 2 % koncentrációig (Arai et al., 1990; Illievich et al., 1994) és 3 %-os koncentrációig nem befolyásolja a GABA felvételét és felszabadulását (Sze-Chuh & Brunner, 1981).
Az altatást követően az állatokat Kopf gyártmányú sztereotaxikus készülékben rögzítettük, majd a koponyacsont feltárása után megfelelő méretű lyukon keresztül behelyeztük a mintavevőket mindkét oldali hippokampuszba. A mintavevők pozícióját Paxinos és Watson atlasza szerint határoztuk meg. A hippokampusz koordinátái a bregmától számítva: laterális 5 mm, anterior: -5 mm, ventrálisan az agyfelszíntôl -8 mm. A mintavevőket a végső pozícióba igen óvatosan helyeztük be legalább fél óra alatt, hogy a szöveti károsodást a minimumra csökkentsük. Miután a mintavevők a helyükre értek, még 60 percig nem kezdtük el a mintavételt, ez idô alatt az anyagok koncentrációja a mintákban állandósult. A mintavevőkön ezután 1 μl/perc sebességgel ’vACSF’ oldatot perfundáltunk (Kékesi et al., 2000). Ennél a sebességnél az in vitro anyag-visszanyerési görbék alapján (Juhász et al., 1989) 20-30 %-os áteresztéssel számolhatunk. A lefolyó folyadékot 20 percenként gyűjtöttük és -20 °C-on tároltuk. A mintavétel kezdete utáni első órában mindkét oldalon csak ACSF-et áramoltattunk át, így 3-3 kontrol mintát kaptunk, melyek koncentráció-átlagához viszonyítottuk a további minták koncentráció változásait. Az NNC-711 vegyületet (500 μM) 60 percen át bilaterálisan alkalmaztuk, majd ugyanígy az NNC-711 és a t-PDC (2 mM) elegyét újabb 60 percig.
23
Az aminosavak meghatározásához a gyűjtött mintákból ortoftálaldehiddal (OPA, Sigma) származékot képeztünk bázikus körülmények között (pH 10,4) merkaptoetanol jelenlétében. Az aminosav származékok mennyiségét fluoreszcenciás módszerrel határoztuk meg, az emittált fényt 440 nm-en detektálva (gerjesztési hullámhossz: 340 nm). Az aminosav származékokat HP Hypersyl ODS reverz-fázisú, 5 μm méretű C-18 gömb töltőanyagot tartalmazó oszlopon (200 x 2,1 mm) folyadék-grádiens alkalmazásával választottuk el. Az ’A’ eluens 0,5 % (vol/vol) tetrahidrofurán (Merck, Budapest, Magyarország) tartalmú 0,1 M koncentrációjú foszfát puffer volt (pH 5,6), a ’B’ eluens pedig 70 %-os acetonitril (Merck, Budapest, Magyarország) az ’A’ eluensben oldva. A grádiens a következő volt: 12 % ’B’ a 0. percnél, 23 % ’B’ a 9. percnél, 36 % ’B’ a 18. percnél, 100 % ’B’ a 20. percnél, 100 % ’B’ a 25. percnél és 12 % ’B’ a 30. percnél. Az oszlop egyensúlyi ideje 8 perc volt. Minden 20 minta után 10 μM koncentrációjú külső standard aminosavakat adagoltunk. A kromatogrammokat a HP Chem-Station programmal elemeztük. A dializátum mintákban lévő GABA mennyiségét a tesztvegyület adagolását 1 órán keresztül megelőző átlagos GABA mennyiségre vonatkoztattuk és százalékos értékben adtuk meg. A dializátumok alap GABA koncentrációja 75 ± 20 nM volt a patkány hippokampuszban.
3.4. Mikrofluorimetria A 3.2.2 pontban ismertetett módon preparált 250 μm vastagságú hippokampális agyszeleteket 35 μM sodium-binding benzofurán izoftalát acetooxi-metilésztert (SBFIAM, Molecular Probes) és 0,07 % Pluronic-127-et (Molecular Probes) tartalmazó ’ACSF’ pufferben inkubáltuk 37 °C-on 1 órán keresztül egy interface típusú kamrában. A gliasejteket 1 μM szulforodamin 101 (SR101) (Nimmerjahn et al., 2004) tartalmú ’ACSF’ oldatban történő inkubálással (37 °C-on 10 percig) ‘interface’ típusú festőkamrában jelöltük meg. Az SR101 specifikusan jelöli az EAAT-kat expresszáló protoplazmikus (Matthias et al., 2003) asztrocitákat. Az SR101-gyel megjelölt sejtek morfológiáját egy Olympus FV300 pásztázó lézer konfokális mikroszkóp segítségével ellenőriztük. A gerjesztés 543 nm hullámhosszon történt, az emittált fényt 560-600 nm között detektáltuk. A kapott képeket 2 pontos medián szűrővel szűrtük, majd a Z-tengely mentén felvett képeket egymásra vetítettük. 24
A gliális [Na+] koncentráció meghatározásához hagyományos fluoreszcens képalkotó eljárást használtunk digitális képalkotó rendszer (Olympus BX-FLA) segítségével, mely egy upright mikroszkóphoz csatlakozott (Olympus BX50WI, 40x vízimmerziós objektív). Szenzorként egy CCD kamerát alkalmaztunk (Princetown Micromax). A gerjesztő fényt egy nagy sebességű hullámhossz váltó lámpa (Sutter Lambda DG-4) biztosította. A képsorozatokat 0,1 Hz frekvenciával vettük fel számítógép vezérléssel a Metafluor program használatával. Az SR101 segítségével azonosított gliasejtekből az SBFI jelet 525 nm-en detektáltuk miután felváltva 340 és 380 nm hullámhosszon gerjesztettük a festéket. A Na+ ion koncentráció meghatározásához a két hullámhosszon kapott értékek hányadosát használtuk (F340/F380). Minden kísérlet végén a festéket in situ kalibráltuk. Ehhez a sejteket Na+ ionra áteresztővé tevő gramicidint (6 μg/ml, Sigma) és monensint (10 μM, Sigma) használtuk a Na+/K+-ATPase gátló ouabainnal (1 mM, Tocris) együtt. A szeletet ezután 0, 5, 10, 20 és 50 mM Na+ iont tartalmazó oldattal perfundáltuk, miközben a (Na+ + kolin) koncentrációt 150 mM értéken tartottuk. Minden vizsgált sejtre 5 pontos kalibrációs görbét illesztettünk, majd ebből határoztuk meg a sejtek Na+ ion koncentrációját. Az SBFI Kd értékeként 7,52 ± 0,82 mM adódott, ami jó egyezésben van az irodalomból ismert értékekkel (Minta et al., 1989; Meier et al., 2006).
3.5. Kiértékelés A mérések statisztikai kiértékeléshez az Origin program (OriginLab, Northampton, MA, Egyesült Államok) beépített one-way ANOVA-próbáját használtam. Az adatokat mindig átlag ± S.D. értékekként adtam meg. Szignifikáns különbségként a P<0,05 értéket fogadtam el.
25
4. Eredmények
4.1. Új szekoergolin vegyületek hatása a glutaminsav és GABA felvételre A Glu és GABA transzport közötti kapcsolat lehetősége néhány újonnan szintetizált szekoergolin származék neurotranszmitter felvételt gátló hatásának vizsgálata során vetődött fel. Mivel ezek a vegyületek mind Glu (α-karboxil), mind GABA (γ-karboxil) izoszter motívumot tartalmaztak (2. ábra), Glu és GABA felvételt gátló hatásukat egyaránt meghatároztuk.
2. ábra A visszavételi kísérletekben hatékonynak bizonyult szekoergolin származékok szerkezete. A vegyületek a N atomhoz képest α- és γ-helyzetű karboxilcsoportot is tartalmaznak, vagyis mind a Glu (zöld), mind a GABA (piros) izoszter motívum megtalálható bennük.
A vizsgálat során azt találtuk, hogy ezen vegyületek azonos hatékonysággal gátolták mind a Glu, mind a GABA felvételt. Ez a szokatlan viselkedés különösen szembetűnővé válik, ha a vegyületek hatékonyságát jellemző IC50 értékeket (a maximális gátlás 50 %-át kiváltó koncentráció) a két transzportfolyamaton egymás függvényében ábrázoljuk (3. ábra). Látható, hogy a Glu és GABA transzporterek specifikus ligandumaival (t-PDC, illetve guvacin) ellentétben a vizsgált vegyületek mindkét folyamatot nagyon hasonló mértékben gátolták. A B4 vegyület vegyület IC50 értékeként 270 ± 43 μM adódott a GABA, míg 420 ± 57 μM a Glu felvételi folyamatokban. Az IC50 értékek a B5 vegyületre 680 ± 87 μM (GAT) és 660 ± 61 μM (EAAT), a B7 vegyületre pedig 1100 ± 128 μM (GAT) és 1100 ± 105 µM (EAAT). Megjegyzendő, hogy a vegyületek
26
itt nem tárgyalt sztereoizomerjei inaktívnak bizonyultak, valószínűsítve, hogy az aktív vegyületek sztereoszelektív, biológiai célfehérjén keresztül fejtik ki hatásukat.
3. ábra Szekoergolin származék vegyületek hatása a Glu és GABA felvételre. A B4 (n=3), B5 (n=4) és B7 (n=4) vegyületek azonos hatékonysággal gátolták a [3H]GABA és a [3H]D-Asp felvételt patkány agykérgi NPMV frakcióban. Ezzel szemben a specifikus GAT inhibitor guvacin és a specifikus EAAT inhibitor tPDC nem befolyásolja az EAAT illetve a GAT funkciót.
Bár a vegyületek hatékonysága elmaradt a gyógyszerjelölt molekuláktól elvárt értékektől, ennek következtében további tesztelésüket nem folytattuk, szokatlan aspecificitásuk két különböző folyamat gátlásában felhívta a figyelmünket ezen folyamatok esetleges kölcsönhatására. Ezt a lehetséges kölcsönhatást a továbbiakban az egyes transzport folyamatok specifikus gátlószereinek a másik transzport folyamatra gyakorolt hatásával vizsgáltuk.
27
4.2. Glutaminsav transzporter ligandumok hatása a GABA felvételre 4.2.1. EAAT ligandumok hatása patkány agyhomogenátumban Az EAAT ligandumok hatását a GABA transzportra patkány agykéregből származó natív
plazmamembrán-vezikula
(NPMV)
preparátumon
vizsgáltuk
radioaktív
nyomjelzéses technikával. Kontroll körülmények között – a várakozásoknak megfelelően – sem a Glu, sem az EAAT inhibitor L-trans-pirrolidin-2,4-dikarbonsav (t-PDC) nem volt hatással a [3H]GABA felvételre a vizsgált koncentrációtartományban (0,01 – 10000 μM). Kontroll körülmények között azonban elsősorban a GABA visszavétel mintegy 90 %-áért felelős GAT1 altípus hatása mérhető. Ahhoz, hogy a minor GAT-2/3 transzportereket is vizsgálni tudjuk, farmakológiailag izoláltuk azokat egy nem transzportábilis GAT1 gátlószer, az 1,2,5,6-tetrahidro-1-[2-[[(difenilmetilén)amino]oxi]etil]-3-piridinkarbonsav (NNC-711, 100 μM) hozzáadásával. Ilyen körülmények között a Glu meglepetésre részlegesen gátolta a [3H]GABA felvételét (IC50=11 ± 0,4 μM) (4. ábra). Mivel az irodalomból ismert (Kardos et al., 1994; Ali et al., 1985), hogy a ligandummal történő előinkubálás ideje befolyásolhatja a visszavételi kísérletben kapott paramétereket, a hatás részleges jellegének értelmezéséhez a kísérletet elvégeztük más előinkubálási idők mellett is. Azt találtuk, hogy a gátlás mértéke arányos az előinkubálási idő hosszával, és 30 perces előinkubálási idő mellett a [3H]GABA felvétel Glu általi gátlása teljessé tehető (4. ábra).
28
4. ábra Glutaminsav hatása a [3H]GABA felvételre. A Glu koncentráció-függő módon csökkenti az intracelluláris [3H]GABA szintet patkány kortikális NPMV frakcióban 100 μM NNC-711 jelenlétében. Az előinkubálási idő (0, 10 és 30 perc) növelésével a hatás teljessé tehető. 0 perc – maximális hatás: 33 ± 4 %, IC50=25 ± 2 μM (n=4); 10 perc – maximális hatás: 55 ± 1 % (n=2), IC50=11 ± 0,4 μM; 30 perc – maximális hatás: 93 ± 3 %, IC50=30 ± 1 μM (n=2).
A Glu mellett további EAAT inhibitoroknak is meghatároztuk a [3H]GABA felvételre gyakorolt hatását. Valamennyi vizsgált EAAT szubsztrát (t-PDC, L-Asp, D-Asp, DGlu, ciszteinsav) koncentrációfüggő módon gátolta a [3H]GABA felvételét (5. ábra). Ezzel szemben, a nem transzportábilis EAAT inhibitorok, a dihidrokainsav (DHK) és a threo-βbenziloxiaszparaginsav (TBOA) nem gátolták a [3H]GABA felvételt (5. ábra).
29
5. ábra Glutaminsav transzporter ligandumok hatása a [3H]GABA felvételre. Transzportábilis EAAT ligandok koncentráció-függő módon csökkentik az intracelluláris [3H]GABA szintet patkány kortikális NPMV frakcióban 100 μM NNC-711 jelenlétében (előinkubálás: 10 min). IC50 értékek: t-PDC – 6 ± 0,2 μM (n=3); L-Glu – 11 ± 0,4 μM (n=3); L-Asp – 9 ± 0,3 μM (n=2); D-Glu – 389 ± 15 μM (n=3); D-Asp – 30 ± 2 μM (n=3); ciszteinsav – 4 ± 0,2 μM (n=2). A nemtranszortábilis EAAT ligandok (DHK, TBOA) nem váltják ki az intracelluláris [3H]GABA szint csökkenését.
Az EAAT inhibitorok GABA felvételre gyakorolt hatásának specificitását további vegyületek tesztelésével tanulmányoztuk. Azonban sem más vizsgált aminosavak (L-Leu, D-Leu,
L-Ser, D-Ser),
sem a GABA transzporterekkel rokon más transzporterek
szubsztrátjai (szerotonin, dopamin), sem a citrát kör intermedier dikarbonsav (borostyánkősav) nem befolyásolták a [3H]GABA felvételt. Megjegyzendő, hogy az ellenkező irányú folyamat, vagyis a Glu felvétel GABA általi gátlása nem volt kimutatható sem kontroll körülmények között, sem pedig NNC-711 és/vagy TBOA jelenlétében.
30
4.2.2. Agyterület-specifikus hatás humán agyhomogenátumokban A Glu-függő GABA transzport általános szerepének megítélése és esetleges régiófüggőségének meghatározása céljából a fenti kísérletet elvégeztük különböző agyterületekből származó humán mintákban is. Valamennyi vizsgált agyterületen (agykérgi szürke- és fehérállomány, gerincvelői fehérállomány, hippokampusz, choroid plexus és corpus callosum) tapasztalható volt a Glu és t-PDC hatására bekövetkező csökkent [3H]GABA felvétel (6. ábra). A hatás erőteljesebb volt nagyobb asztrocita tartalmú agyterületekből származó mintákban (kortikális fehérállomány, gerincvelői fehérállomány). Ezen mintákban a Glu és t-PDC által kiváltott [3H]GABA felvétel csökkenés NNC-711 alkalmazása nélkül is szignifikáns volt.
6. ábra Glutaminsav és t-PDC hatása a [3H]GABA felvételre humán agymintákban. A Glu (100 μM, zöld oszlop) és a t-PDC (100 μM, piros oszlop) egyaránt csökkentik az intracelluláris [3H]GABA szintet különböző humán agyterületekből származó NPMV frakcióban 100 μM NNC-711 jelenlétében (előinkubálás: 10 min). Vizsgált agyterületek: hippokampusz (HC, n=3), agykérgi szürkeállomány (CGM, n=5), agykérgi fehérállomány (CWM, n=4), gerincvelői fehérállomány (SC, n=4), choroid plexus (CP, n=2) és corpus callosum (CC, n=2). 31
4.2.3. EAAT ligandumok hatása hippokampális agyszeletben Az agyhomogenátumokban végzett kísérleteket követően, meghatároztuk az EAAT szubsztrátok hatását a [3H]GABA felvételre egy komplexebb modellben, a frissen izolált hippokampális agyszeletben. A sejtek közötti kapcsolatot megőrző, a neuronhálózat egészének működését biztosító modellben mind a Glu, mind a t-PDC gátolta a [3H]GABA felvételét (7. ábra). Megjegyzendő, hogy a 100 μM Glu, illetve 100 μM t-PDC által kiváltott gátlás patkány agyszeletben nem tért el szignifikánsan ezen vegyületekre patkány agykérgi NPMV frakcióban kapott értékektől (7. ábra), igazolva azt, hogy az NPMV frakcióban végzett kísérletekből származó eredmények frissen izolált agyszeletben is érvényesek, annak ellenére, hogy az NPMV vezikulák és az intakt idegsejtek mérete és felszín/térfogat aránya egyes esetekben jelentősen eltérő lehet.
7. ábra Glutaminsav és t-PDC hatása a [3H]GABA felvételre hippokampális agyszeletben. A Glu (100 μM) és a t-PDC (100 μM) egyaránt csökkentik az intracelluláris [3H]GABA szintet frissen izolált hippokampális agyszeletben (fekete oszlop, n=18), patkány hippokampális NPMV preparátumban (piros oszlop, n=3) és humán hippokampális NPMV preparátumban (zöld oszlop, n=3) 100 μM NNC-711 jelenlétében.
32
4.3. Glutaminsav transzporter ligandumok hatása a GABA kibocsátásra A fenti kísérletekben az EAAT szubsztrátok [3H]GABA felvételre gyakorolt hatásának meghatározása az intracelluláris [3H]GABA koncentráció mérésével történt a [3H]GABA extracelluláris adagolását követően. A csökkent intracelluláris [3H]GABA koncentráció ([GABA]i) azonban nem csak a gátolt felvétel, hanem a megnövekedett kibocsátás következtében is előállhat. A két lehetőség közötti döntéshez egy új megközelítést alkalmaztunk a már korábban használt patkány agykérgi NPMV preparátumban. A plazmamembrán vezikulákat előzetesen feltöltöttük [3H]GABA-val, majd a spontán felvételi, illetve felszabadulási folyamatok egyensúlyának beállta után Glu adagolást követően meghatároztuk az intra- és extracelluláris [3H]GABA koncentrációt (8.A ábra). A Glu ilyen körülmények között is koncentrációfüggő módon csökkentette az intracelluláris, és párhuzamosan emelte az extracelluláris [3H]GABA koncentrációt ([GABA]o), arra utalva ezzel, hogy nem a felvétel gátlása, hanem a kibocsátás serkentése révén fejti ki hatását.
8. ábra Glutaminsav hatása az intra- és extracelluláris GABA szintre. (A) [3H]GABA-val előzetesen feltöltött patkány agykérgi NPMV frakcióban a Glu koncentráció-függő módon kiváltja a [3H]GABA felszabadulást 100 μM NNC711 jelenlétében (n=3). (B) [3H]GABA-val előzetesen feltöltött frissen izolált hippokampális szeletből Glu (100 μM) adagolás hatására [3H]GABA szabadul fel 100 μM NNC-711 és 250 μM gabakulin jelenlétében (n=5; P<0,001; maximális hatás: 169 ± 12 %; átlagos hatás: 153 ± 11 %). 33
Ezt az eredményt megerősítettük patkány hippokampuszból történő [3H]GABA felszabadulás időbeli követésével mikrotérfogatú szuperfúziós rendszerben. A hippokampusz szeleteket feltöltöttük [3H]GABA-val, majd vizsgáltuk a kibocsátott [3H]GABA mennyiségét. Annak érdekében, hogy a jelzett [3H]GABA metabolikus átalakulását megakadályozzuk és bizonyosak lehessünk abban, hogy az extracellulárisan észlelt radioaktivitás nem valamely metabolitból származik, a feltöltés során és a kísérlet egésze alatt egy specifikus GABA transzamináz gátlót, a gabakulint (250 μM) (Patel et al., 2001) alkalmaztunk. Ilyen körülmények között 100 μM Glu stimulus hatására az extracelluláris [3H]GABA szint szignifikánsan megemelkedett (8.B ábra), igazolva, hogy az intracellulárisan jelenlévő GABA a Glu hatására felszabadul a sejtekből.
4.4. Glutaminsav transzporter ligandumok hatása in vivo Az EAAT szubsztrátok által kiváltott GABA kibocsátás további igazolása és a folyamat fiziológiás jelentőségének meghatározása céljából megvizsgáltuk a t-PDC hatását az extracelluláris GABA szintre patkány hippokampuszban in vivo. A rendkívül szigorúan szabályozott (Nyitrai et al., 2006) extracelluláris GABA szintet a GABA felvétel mintegy 90 százalékáért felelős GAT1 altípus gátlása 500 μM NNC-711-gyel 60 ± 3 %-kal emelte meg. Az EAAT szubsztrát t-PDC (2 mM) alkalmazása ezen felül további 73 ± 18 %os szignifikáns növekményt okozott az extracelluláris GABA koncentrációban (9. ábra), jelezve ezzel, hogy a Glu által kiváltott GABA felszabadulás folyamata jelentős mértékben képes hozzájárulni az extracelluláris GABA szint kialakításához.
Megjegyzendő, hogy a mikrodialízis technika sajátosságai miatt a mintavevőben alkalmazott koncentráció és az extracelluláris térben elért effektív koncentráció között jelentős eltérés van (Juhász et al., 1989). Mivel az in vitro anyag-visszanyerési görbék alapján 20-30 %-os áteresztéssel számolhatunk (Juhász et al., 1989), az alkalmazott vegyületek effektív koncentrációjára 100 µM (NNC-711), illetve 400 µM (t-PDC) becsülhető.
34
9. ábra NNC-711 és t-PDC hatása az extracelluláris GABA szintre patkány hipokampuszban in vivo. Az 500 μM NNC-711 hatására kialakuló 60 ± 3 %-os extracelluláris GABA növekményt 2 mM t-PDC további 73 ± 18 %-kal fokozta (n=5, P<0,001).
4.5. A GABA kibocsátás mechanizmusának vizsgálata Miután különböző komplexitású modellekben kimutattuk az EAAT szubsztrátok hatását az intra- és extracelluláris GABA szintre, megpróbáltuk meghatározni a folyamat mechanizmusát. Első lépésben megvizsgáltuk a már ismert, szóba jöhető folyamatokat, melyek szerepet kaphatnak a Glu által kiváltott GABA felszabadulásban, majd miután ezeket
kizártuk,
feltérképeztük
a
folyamatban
résztvevő
fehérjéket
és
a
mechanizmusban szerepet játszó paramétereket.
35
4.5.1. A Glu és GABA receptorok szerepe Az ismert folyamatok közül elsőként a Glu receptorok szerepét vizsgáltuk meg. A Glu
receptorok
aktiválása
két
módon
is
vezethet
GABA
felszabaduláshoz.
Agyhomogenátumban a preszinaptikus idegvégződésen található Glu receptorok aktiválását követő depolarizáció önmagában is okozhat GABA felszabadulást. Agyszeletben ezen túlmenően a Gluerg sejtek aktivitásának fokozása áttételesen is elvezethet a velük kapcsolatban lévő GABAerg sejtek aktiválásához, következésképpen a GABA kibocsátásához (Li et al., 2004; Flores-Hernandez et al., 1994; Ren et al., 2007).
A kérdés megválaszolását mindkét kísérleti elrendezésben, az előzetesen feltöltött hippokampális agyszeletből történő [3H]GABA felszabadulás vizsgálatával, és az agykérgi NPMV-ben mért [3H]GABA felvételi kísérletekkel is elvégeztük. Sem a GABA felszabadulás, sem a GABA felvétel nem változott szignifikánsan az NMDA (DL-AP5, 50 μM), AMPA/kainate (CNQX, 10 μM) és metabotróp ((S)-MCPG, 500 μM) receptorok antagonistáinak jelenlétében (10. ábra). A Glu által kiváltott GABA felszabadulás tehát a Glu receptoroktól független folyamat eredménye.
36
10. ábra Glu receptor antagonisták hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra. (A) [3H]GABA-val előzetesen feltöltött frissen izolált hippokampális szeletből Glu (100 μM) adagolás következtében felszabaduló [3H]GABA mennyisége nem csökken szignifikáns mértékben a kontrollhoz képest 10 μM CNQX, 50 μM
DL-AP5
és 500 μM (S)-MCPG hatására 100 μM
NNC-711 és 250 μM gabakulin jelenlétében (n=4; P=0,22; maximális hatás: 152 ± 17 %; átlagos hatás: 133 ± 17 %). (B) 500 μM (S)-MCPG, illetve 10 μM CNQX és 50 μM DL-AP5 nem befolyásolja a Glu koncentráció-függő [3H]GABA felvétel gátlását patkány agykérgi NPMV frakcióban 100 μM NNC-711 jelenlétében (n=3; P>0,5).
A Glu receptorok mellett megvizsgáltuk a GABA receptorok esetleges szerepét is. Azonban sem a GABAA receptoron keresztül bekövetkező Cl- ion beáramlás gátlása az antagonista
[R-(R*,S*)]-5-(6,8-dihidro-8-oxofuro[3,4-e]-1,3-benzodioxol-6-yl)-5,6,7,8-
tetrahydro-6,6-dimetil-1,3-dioxolo[4,5-g]izokvinolinium jodiddal (bikukullin), sem a preszinaptikus GABAB receptor által közvetített GABA felszabadulás gátlása az agonista (R)-4-amino-3-(4-klórfenil)butánsavval ((R)-baclofén) nem befolyásolta a Glu által kiváltott GABA kibocsátást (11. ábra).
37
11. ábra GABAA receptor ligandumok hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra. 100 μM bikukullin metojodid (BMI), illetve 100 μM BMI és 100 μM baclofén kombinációja nem befolyásolja a Glu koncentráció-függő [3H]GABA felvétel gátlását kortikális NPMV frakcióban 100 μM NNC-711 jelenlétében (n=3; P>0,5).
4.5.2. A fehérjeszintézis szerepe A Glu hatására megnövekedett GABA kibocsátás egy lehetséges magyarázata, hogy a kibocsátásban résztvevő fehérjék a Glu adagolás következtében fokozott mértékben fejeződnek ki és ennek következtében nagyobb kapacitással képesek a GABAt az extracelluláris térbe juttatni. Ezt a lehetőséget sugallta az a korábbi eredmény, miszerint a preinkubációs idő növelésével a Glu által kiváltott GABA felszabadulás nagyobb mértékű lett (4. ábra).
A fehérjeszintézis szerepét a specifikus fehérjeszintézis-gátló szer, a cikloheximid alkalmazásával vizsgáltuk. A cikloheximid hatását két különböző adagolás mellett vizsgáltuk. Az egyik adagolási módszernél a cikloheximidet a felvételi kísérletben a 38
preinkubációs időszakban adtuk a patkány agykérgi NPMV frakcióhoz 100 μM koncentrációban. A másik adagolási módszer szerint a cikloheximidet az állat feláldozása előtt 3 órával intraperitoneálisan adtuk be a patkánynak 6 mg/kg dózisban. A fehérjeszintézis gátlása azonban egyik adagolási módszer mellett sem volt hatással a Glu által okozott intracelluláris GABA szint csökkenésre (12. ábra).
12. ábra A fehérjeszintézis-gátlás hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra. A fehérjeszintézis-gátló szer cikloheximid (100 μM a preinkubáció alatt vagy 6 mg/kg intraperitoneálisan 3 órával az állat feláldozása előtt) hatására nem változik szignifikánsan a Glu koncentrációfüggő [3H]GABA felvétel gátlása patkány agykérgi NPMV frakcióban 100 μM NNC-711 jelenlétében (n=3; P=0,29).
4.5.3. A Glu dekarboxiláz szerepe Az elmúlt években több cikk is megjelent az irodalomban, amelyek egy új típusú, receptor-független, metabolikus útvonalat írtak le. Ezen keresztül az extracellulárisan 39
adagolt Glu a [GABA]o növekedéséhez vezet (Liang et al., 2006; Mathews et al., 2003; Sepkuty et al., 2002). A feltételezett folyamat a következő lépésekből áll: i) a Glu neuronális felvétele az EAAT3 transzporter altípuson keresztül, ii) a felvett Glu metabolikus átalakítása GABA-vá a Glu dekarboxiláz (GAD) enzim segítségével, és iii) az újonnan szintetizált GABA vezikuláris kibocsátása. Ezen mechanizmus szerepét a Glufüggő GABA felszabadulásban a GAD specifikus gátlásával vizsgáltuk meg. A GAD gátlószer szemikarbazid sem a Glu-val együtt adagolva (2 mM) (Wu et al., 2001), sem intraperitoneálisan adva (100 mg/kg) (Kumar et al., 1998) nem volt szignifikáns hatással a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra (13. ábra). A fentiek alapján megállípítható, hogy az általunk vizsgált folyamat nem kapcsolódik a metabolikus Glu-GABA átalakuláshoz.
13. ábra A Glu dekarboxiláz enzim gátlásának hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra. (A) [3H]GABA-val előzetesen feltöltött frissen izolált hippokampális szeletből Glu (100 μM) adagolás következtében felszabaduló [3H]GABA mennyisége nem csökken szignifikáns mértékben a kontrollhoz képest a GAD gátlószer szemikarbazid (100 mg/kg intraperitoneálisan az állat feláldozása előtt) hatására 100 μM NNC-711 és 250 μM gabakulin jelenlétében (n=3; P=0,22; maximális hatás: 145 ± 12 %; átlagos hatás: 132 ± 9 %). (B) Szemikarbazid jelenléte (2 mM a preinkubáció alatt vagy 100 mg/kg intraperitoneálisan az állat feláldozása előtt) nem befolyásolja a Glu [3H]GABA felvétel gátlását kortikális NPMV frakcióban 100 μM NNC-711 jelenlétében (n=3; P>0,5).
40
4.5.4. A csökkentett [Ca2+] hatása A
neurotranszmitterek
kibocsátásának
fő
mechanizmusai
a
vezikuláris
felszabadulás és a transzporterek megfordulása révén történő kibocsátás (Attwell et al., 1993). Míg az előbbi az extracelluláris Ca2+ ion jelenlétéhez kötött, utóbbi független attól. A két neurotranszmitter felszabadulási folyamat hozzájárulását a Glu által kiváltott GABA kibocsátáshoz csökkentett Ca2+ ion tartalmú pufferekben végzett kísérletekkel határoztuk meg. A Ca2+ ion megvonás sem az agyszeletből történő GABA kibocsátásra, sem az NPMV frakcióban mért GABA felvétel gátlására nem volt hatással (14. ábra). A Glu stimulus hatására hippokampális agyszeletből felszabaduló GABA mennyiségét továbbá a Ca2+ ioncsatornákat blokkoló Cd2+ ion (50 μM) jelenlétében is meghatároztuk. A kibocsátott GABA mennyisége ez esetben sem tért el szignifikánsan a kontroll értéktől. Mindezek alapján valószínűsíthető, hogy a Glu által kiváltott GABA felszabadulás a neurotranszmitter transzporterek megfordulásához köthető.
14. ábra A csökkentett [Ca2+] hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra. (A) [3H]GABA-val előzetesen feltöltött frissen izolált hippokampális szeletből Glu (100 μM) adagolás következtében felszabaduló [3H]GABA mennyisége nem csökken szignifikáns mértékben a kontrollhoz képest a csökkentett Ca2+ ion tartalmú pufferben 100 μM NNC-711 és 250 μM gabakulin jelenlétében (n=5; P>0,5; maximális hatás: 169 ± 24 %; átlagos hatás: 148 ± 15 %). (B) Csökkentett Ca2+ ion tartalmú puffer alkalmazása nem befolyásolja a Glu [3H]GABA felvétel gátlását kortikális NPMV frakcióban 100 μM NNC-711 jelenlétében (n=3; P=0,49). 41
4.5.5. A GABA kibocsátásban szerepet játszó transzporterek A fenti kísérletek megmutatták, hogy a Glu által kiváltott GABA kibocsátás a transzportereken keresztül történik. A folyamatban szerepet játszó transzporter altípusok, vagy esetleges új típusú transzporterek meghatározásához elkészítettük a patkány kortikális NPMV frakcióban NNC-711 jelenlétében vizsgált GABA transzport farmakológiai profilját (2. táblázat). A farmakológiai profil elkészítéséhez felhasznált – különböző GAT altípusokra szelektív – vegyületek IC50 értékei alapján valószínűsíthető, hogy a folyamatban a GAT-2/3 transzporterek vesznek részt. Az SKF89976A vegyület adatait tekintve e kettő közül is kiemelhető a GAT-2, de megfelelő GAT-2 vagy GAT-3 szelektív inhibitor hiányában ez bizonyossággal nem állapítható meg.
2. táblázat A patkány kortikális NPMV frakció farmakológiai profilja IC50 [μM] GAT1
GAT-2
GAT-3
BGT-1
patkány kortikális NPMV
β-alanin
2920
66
110
1100
26 ± 0,4
taurin
32300
1300
2860
13200
400 ± 7
nipekotinsav
24
113
159
2350
28 ± 0,5
hipotaurin
1010
52
73
536
20 ± 0,4
SKF89976A
0,64
550
4390
7210
372 ± 9
betain
>1000
>1000
>1000
173
>1000
További érvet szolgáltat a Glu által kiváltott GABA felszabadulás GAT-2/3 transzporterekhez való kapcsolása mellett, hogy a Glu nem csak a [3H]GABA, hanem a specifikus GAT-2/3 ligandum [3H]β-alanin felvételét is gátolta (15. ábra). Mivel a β-alanin a GAT1 transzporteren keresztül nem vevődik fel, ebben a kísérletben nem volt szükség az NNC-711 alkalmazására a Glu általi gátlás kimutatásához.
42
15. ábra Glutaminsav hatása a [3H]β-alanin felvételre. A Glu koncentrációfüggő módon csökkenti az intracelluláris [3H]β-alanin szintet patkány kortikális NPMV frakcióban (n=4).
Szintén a GAT-2/3 transzporterek érintettségét támasztja alá a β-alanin hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra hippokampális agyszeletből történő mérésben. β-alanin jelenlétében ugyanis a Glu adagolás hatására létrejövő extracelluláris GABA koncentráció emelkedés maximális szintje a β-alanin távollétében mért érték 230 %-a volt (16. ábra). Ez a jelentős növekedés minden bizonnyal annak köszönhető, hogy a βalanin maga is GAT-2/3 transzporter szubsztrát, így jelenlétében lehetővé válik az intracelluláris [3H]GABA és az extracellulárisan adagolt β-alanin közötti kicserélődés a GAT-2/3 transzportereken keresztül.
43
16. ábra β-alanin hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra. [3H]GABA-val előzetesen feltöltött frissen izolált hippokampális szeletből Glu (100 μM) adagolás következtében felszabaduló [3H]GABA mennyisége szignifikáns mértékben növekszik a kontrollhoz képest β-alanin (1 mM) hatására 100 μM NNC-711 és 250 μM gabakulin jelenlétében (n=4; P>0,5; maximális hatás: 260 ± 75 %; átlagos hatás: 221 ± 58 %).
A GAT-2/3 transzporterek szerepét megpróbáltuk igazolni GAT-2 altípust expresszáló HEK293 sejtvonalon végzett [3H]GABA felvételi kísérletekkel. Ebben a rendszerben azonban sem a Glu, sem a t-PDC, sem a TBOA nem gátolta a [3H]GABA felvételét (17. ábra). Ebből az eredményből arra lehet következtetni, hogy a Glu, illetve a t-PDC nem közvetlenül hatnak a GAT-2/3 transzportereken. A GABA felszabadulás kiváltásában valószínűsíthetően olyan célfehérjék is részt vesznek, melyek a GAT-2 altípust expresszáló HEK293 sejtekben nem találhatók meg.
44
17. ábra Glutaminsav (fekete oszlop), t-PDC (piros oszlop) és TBOA (zöld oszlop) hatása a [3H]GABA felvételre GAT-2 transzportert expresszáló HEK293 sejtvonalban.
4.5.6. A Glu transzporterek blokkolásának hatása Figyelembe véve, hogy a GABA felszabadulást csak transzportábilis EAAT ligandumokkal lehetett kiváltani, a HEK sejtekből hiányzó, de a Glu által kiváltott GABA kibocsátáshoz nélkülözhetetlen fehérjeként az EAAT transzporterek merülhetnek fel. Ezen transzportereket a HEK sejtek genetikai beavatkozás nélkül nem expresszálják (Thomas et al., 2005). A feltételezés vizsgálatához a nem transzportábilis EAAT ligandumokat, a TBOA-t (EAAT1/2/3 gátló) és a DHK-t (EAAT2 gátló) használtuk fel. TBOA, illetve DHK jelenlétében a transzportábilis Glu és t-PDC sem tud átjutni a sejtmembránon a Glu transzportereken keresztül. Patkány agykérgi NPMV-ben DHK (100 μM) jelenlétében a Glu adagolás extracelluláris GABA szintre gyakorolt hatásának szignifikáns csökkenését figyeltük meg (18.B ábra). 100 μM TBOA jelenléte a pufferben még jelentősebb mértékben gátolta a Glu által kiváltott GABA felszabadulást, 1 mM TBOA pedig teljesen megszüntette a hatást (18.B ábra). Hippokampusz szeletben 45
követve az előre feltöltött [3H]GABA felszabadulását szintén kimutattuk a 100 μM és 1 mM TBOA hatására bekövetkező hatáscsökkenést, illetve eliminációt (18.A ábra). A DHK és TBOA hatására bekövetkező csökkent Glu hatásból következik, hogy az EAAT transzportereken
keresztüli
Glu
transzlokáció
előzetes
feltétele
a
GABA
felszabadulásnak, a DHK és a TBOA hatásának különbségéből pedig az, hogy a folyamatban különböző EAAT altípusok altípusok vesznek részt.
18. ábra Nem transzportábilis EAAT inhibitorok hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra. (A) [3H]GABA-val előzetesen feltöltött frissen izolált hippokampális szeletből Glu (100 μM) adagolás következtében felszabaduló [3H]GABA mennyisége szignifikáns mértékben csökken a kontrollhoz képest 100 μM (n=4; P=0,03; maximális hatás: 135 ± 13 %; átlagos hatás: 123 ± 9 %), illetve 1000 μM (n=4; P<0,001; maximális hatás: 122 ± 5 %; átlagos hatás: 109 ± 2 %) TBOA hatására 100 μM NNC-711 és 250 μM gabakulin jelenlétében. (B) DHK (100 μM) és TBOA (100 μM, illetve 1000 μM) alkalmazása szignifikánsan csökkenti a Glu koncentráció-függő [3H]GABA felvétel gátlását kortikális NPMV frakcióban 100 μM NNC-711 jelenlétében (n=3, P<0,01).
4.5.7. A GABA transzporterek blokkolásának hatása Korábban megmutattuk, hogy a GABA felszabadulás nagy valószínűséggel a GAT2/3 transzportereken keresztül zajlik le. Ennek igazolására a Glu hatására hippokampális szeletből történő [3H]GABA kibocsátást vizsgáltuk, ezúttal a nem transzportábilis, 46
specifikus GAT-2/3 transzporter inhibitor SNAP-5114 (100 μM) jelenlétében. Azt tapasztaltuk, hogy ilyen körülmények között a Glu nem volt képes GABA felszabadulást kiváltani (19. ábra). A hatás létrejöttében tehát mind a Glu, mind a GABA transzporterek részt vesznek.
19. ábra Nem transzportábilis, szelektív GAT-2/3 inhibitor hatása a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra. [3H]GABA-val előzetesen feltöltött frissen izolált hippokampális szeletből Glu (100 μM) adagolás következtében felszabaduló [3H]GABA mennyisége szignifikáns mértékben csökken a kontrollhoz képest 100 μM SNAP-5114 hatására 100 μM NNC-711 és 250 μM gabakulin jelenlétében (n=4; P<0,001; maximális hatás: 118 ± 5 %; átlagos hatás: 109 ± 4 %).
47
4.5.8. Az intracelluláris [Na+] változása az EAAT aktiválást követően Mind a Glu, mind a GABA transzporterek részben a transzmembrán [Na+] gradiensből nyerik hajtóerejüket. Annak vizsgálatára, hogy a transzporter működéssel összefüggő [Na+] változások kapcsolatban állnak-e a Glu-GABA csere létrejöttével, hippokampális szeletben követtük az intracelluláris [Na+] változást asztrocita sejtekben. A szulforodamin101 (Nimmerjahn et al.,
2004) festéket használtuk a Glu
transzportereket expresszáló, protoplazmikus asztrociták (Matthias et al., 2003) megjelölésére (20. ábra). Az így megjelölt asztrocitákban egy Na+ ion-érzékeny festék, a nátrium-kötő benzofurán isoftalát (SBFI) segítségével követtem a [Na+] változást a hippokampusz CA3 régiójának stratum radiatum/stratum lacunosum-moleculare rétegében. t-PDC (200 μM) adagolás hatására szignifikánsan (n=3, P<0,001) megnövekedett intracelluláris [Na+] volt megfigyelhető az EAAT-n keresztül a t-PDC-vel együtt beáramló Na+ ionnak köszönhetően (20. ábra). A GAT-2/3 specifikus gátlószer SNAP-5114 jelenlétében az intracelluláris [Na+] tovább növekedett (n=3, P<0,001), igazolva, hogy a Glu transzporterek aktivációját követően a GAT-2/3 transzporterek fordított irányban működnek.
48
20. ábra Az intracelluláris [Na+] változása kapcsolatot teremt a glutaminsav és GABA transzporterek aktivációja között. (A) Frissen izolált hippokampális szelet CA3 régiójának stratum radiatum/stratum lacunosum-moleculare rétegében szulforodamin101 festékkel jelzett asztrocita sejtek konfokális mikroszkópiával készített rekonstrukciója. (B) Az intracelluláris [Na+] változása az (A) ábrán jelzett asztrocitákban t-PDC (200 μM) és SNAP-5114 (100 μM) adagolást követően (n=29 sejt).
49
5. Az eredmények értékelése
Munkám célja annak vizsgálata volt, hogy milyen szerepet töltenek be a gliális GABA transzporterek az idegrendszeri jelátviteli folyamatokban, illetve, hogy ezen transzporterek működése összefüggésben van-e a szintén a glián lokalizálódó Glu transzporterekkel. Kimutattuk, hogy az extracellulárisan jelenlévő Glu felvétele a Glu transzportereken keresztül összefüggésbe hozható a gliális GABA transzporterek (GAT2/3) fordított irányú működésével, és végeredményben a Glu felvétele az extracelluláris GABA szint emelkedéséhez vezet. A folyamat jelenlétét igazoltuk különböző fajokból származó mintákban (patkány, humán), különböző agyterületeken (agykéreg, agykérgi szürke- és fehérállomány, gerincvelői szürkeállomány, hippokampusz, choroid plexus és corpus callosum) és különböző összetettségi szintű modellekben (agyhomogenátum, frissen izolált agyszelet, in vivo mikrodialízis).
Igazoltuk továbbá, hogy a folyamat nem köthető olyan, már ismert mechanizmusokhoz, melyek a Glu jelenléte következtében emelt extracelluláris GABA szintet eredményezhetnek. Mivel a Glu receptorok aktiválása következtében fellépő depolarizáció, illetve a Gluerg sejtek által beidegzett GABAerg neuronok serkentése egyaránt GABA felszabaduláshoz vezethet, megvizsgáltuk a Glu receptorok szerepét a folyamatban. Az ionotróp és metabotróp Glu receptorok gátlása azonban nem változtatta meg szignifikánsan a Glu által kiváltott GABA felszabadulást, miképpen a GABA receptorok gátlása illetve aktiválás sem volt hatással a jelenségre. Megmutattuk, hogy a GABA felszabadulás nem köthető valamely, a GABA kibocsátásban szerepet játszó fehérje fokozott mértékű szintéziséhez. A Glu-GABA konverziót végző GAD enzim gátlása szintén nem volt hatással a folyamatra. A felszabadulás mechanizmusát tovább vizsgálva, csökkentett Ca2+ ion tartalmú puffer alkalmazásával elkülönítettük a vezikuláris és transzporter által közvetített GABA kibocsátást. Mivel a Ca2+ ion megvonása nem volt hatással a Glu által kiváltott GABA felszabadulásra, valószínűsíthető, hogy a kibocsátás transzporerek megfordulása útján történik. A folyamatban résztvevő transzportereket az egyik vizsgált rendszer, a patkány agykérgi NPMV farmakológiai profiljának feltérképezésével határoztuk meg. Az eredmények alapján a GABA felszabadulás a gliális 50
GAT-2/3 transzporterekhez volt köthető. Ezt a hipotézist támasztotta alá az a megfigyelés is, miszerint a Glu képes nem csak a GABA, de GAT-2/3 specifikus ligandum, a β-alanin felvételét is gátolni, valamint a β-alanin által hippokampális szeletben kiváltott fokozott GABA kibocsátás, mely valószínűleg a GAT-2/3 transzportereken keresztül bekövetkező β-alanin-GABA cserének volt köszönhető. A GAT-2/3 transzporterek szerepét a folyamatban végül a specifikus GAT-2/3 gátlószer, a SNAP-5114 alkalmazásával igazoltuk, mely megszüntette a Glu által kiváltott GABA felszabadulást. A Glu felvételét gátolva a nem transzportábilis EAAT inhibitor TBOA-val szintén megszüntethető volt a Glu által kiváltott GABA kibocsátás, igazolva, hogy a folyamat létrejöttének előfeltétele a transzmembrán Glu fluxus. Végül a gliális [Na+] követésével igazoltuk, hogy a Glu és GABA transzporterek aktivációja között a mindkét transzporter típuson a ligandumokkal kotranszportálódó Na+ ion teremti meg a kapcsolatot.
5.1. Glutaminsav által kiváltott GABA kibocsátás mechanizmusa A fent ismertetett megfigyeléseket egy új, eddig feltáratlan idegrendszeri mechanizmus révén magyarázom (21. ábra). Ez a modell azt a tényt használja ki, hogy a GABA felszabadulás csak transzportábilis EAAT ligandumokkal volt kiváltható, vagyis a Glu transzlokáció előfeltétele a GABA felszabadulásnak. A Glu felvétele az EAAT transzportereken keresztül együtt jár 3 Na+ ion és 1 H+ ion felvételével, majd a transzporter eredeti állapotának visszaállítása 1 K+ ion kibocsátásával (Zerangue & Kavanaugh, 1996), mely ionok a transzport folyamat hajtóerejét biztosítják. A fellépő ionáramok
következtében
a
Glu
eltávolítása
az
extracelluláris
térből
a
membránpotenciál megváltozását vonja maga után. Irodalomból is ismert (Chatton et al., 2001; Kirischuk et al., 2007), és a saját kísérleteim (20. ábra) is alátámasztják, hogy Glu adagolást követően szignifikánsan megemelkedik az asztrociták intracelluláris Na+ ion koncentrációja.
A GABA transzporterek szintén a sejtmembrán két olala közötti ionkoncentrációgradienseket használják fel a GABA transzportjához. Egy GABA molekula felvétele 2 Na+ ion és 1 Cl- ion felvételéhez kötött (Keynann & Kanner, 1988; Radian & Kanner, 1983). A
51
koncentráció-gradiensek megváltozása esetén azonban a transzport hajtóerejének iránya megváltozhat, és a GABA transzporterek a sejt belsejéből az extracelluláris térbe pumpálhatják a GABA-t. Azt a membránpotenciált, aminél ez a megfordulás bekövetkezik, megfordulási potenciálnak nevezzük. Ismert, hogy GABA transzporterek esetében ez a megfordulási potenciál közel esik a nyugalmi membránpotenciálhoz (Richerson & Wu, 2003; Wu et al., 2006), vagyis a GABA transzporterek az ionkoncentráció-gradiensekben bekövetkező változás hatására könnyen megfordíthatók. A gliális GAT-2/3 transzporterek megfordulása következményeként a gliasejtekben jelenlévő GABA (Moussa et al., 2007) felszabadulhat, az extracelluláris GABA koncentráció emelkedését okozva ezzel.
A fenti gondolatmenet alapján a kísérleti megfigyelések magyarázataként egy olyan új idegrendszeri mechanizmus létét írom le, amely a Glu felvétellel együtt járó gliális Na+ ion beáramlás következtében a GAT-2/3 transzporterek megfordulásához és ennek hatására az extracelluláris GABA koncentráció emelkedéséhez vezet (21. ábra).
52
21. ábra A Glu által kiváltott GABA felszabadulás modellje. A Glu-val együtt transzportálódó Na+ ionok beáramlása emelt intracelluláris Na+ ion koncentrációt eredményez. Az ennek következtében megforduló GAT-2/3 transzporterek az extracelluláris térbe juttatják a gliában található GABA-t.
A fent leírt mechanizmus magyarázatot nyújt valamennyi a jelen dolgozatban leírt jelenségre.
1) Radioaktív nyomjelzéses visszavételi mérésekben korábban nem mutatták ki a Glu hatását a GABA felvételre. Ennek oka, hogy a GAT1 transzporter blokkolásának hiányában a jelzett GABA túlnyomórészt a neuronokba vevődik fel. A neuronokon azonban jóval kisebb mennyiségben találhatóak Glu transzporterek, így a Glu felvétellel együtt járó Na+ ion beáramlás is csak töredéke a gliasejteken tapasztalható Na+ ion áramnak. A kisebb intracelluláris [Na+] növekedés pedig valószínűleg nem képes a GABA transzporterek megfordítására.
53
2) NNC-711 alkalmazása mellett a Glu képes a jelzett GABA felvételét gátolni, mivel ebben az esetben elsősorban a gliális folyamatokat tudjuk követni (4. ábra).
3) A preinkubációs idő növelésével a jelenség mértéke fokozható (4. ábra). Az NPMV frakcióban ugyanis a Glu felvétel körülbelül 30 perc után telítődik. Ez az az idő, amely az intracelluláris [Na+] maximális növekedéséhez, ennél fogva a GABA felvétel maximális gátlásához szükséges.
4) Nem csak a Glu, de minden vizsgált transzportábilis EAAT inhibitor kiváltja a GABA felszabadulást (5. ábra).
5) A nem transzportábilis EAAT blokkolók nem váltanak ki GABA felszabadulást, mivel nem okoznak Na+ ion beáramlást (5. ábra).
6) Gliasejteket nagyobb mennyiségben tartalmazó agyterületeken fokozott mértékben jelentkezik a Glu által kiváltott GABA felszabadulás (6. ábra).
7) A jelenség független a Glu és GABA receptoroktól (10., 11. ábra).
8) A jelenség létrejöttéhez nem szükséges új fehérjék szintézise (12. ábra).
9) A jelenség független a Glu-GABA metabolikus átalakulástól (13. ábra).
10) A jelenség Ca2+ ion-független, mivel a GABA felszabadulás nem a szinaptikus vezikuláris ürülés következménye (14. ábra).
11) A jelenség létrejötte mind az EAAT, mind a GAT-2/3 transzporterek blokkolásával meggátolható (18., 19. ábra).
54
12) t-PDC adagolást követően a Glu transzporterek a sejt belseje felé, a gliális GABA transzporterek azonban fordított irányban működnek (20. ábra).
A jelen munkában bemutatott észleleteken túlmenően a modell magyarázattal szolgál több, az irodalomból ismert paradox jelenségre is. Több alkalommal is leírták például a transzportábilis és nem transzportábilis EAAT ligandumok idegrendszeri folyamatokra gyakorolt eltérő hatását. A nem transzportábilis EAAT inhibitor TBOA limbikus rohamokat és az idegsejtek pusztulását okozza patkány hippokampuszban in vivo (Montiel et al. 2005). Ezzel szemben a transzportábilis t-PDC alkalmazása nem váltott ki idegsejt pusztulást, és nem okozott változást az elektroenkefalográfiás aktivitásban (Montiel et al. 2005). Hasonlóan, az oxigén/glükóz megvonással kiváltott sejtpusztulás a transzportábilis t-PDC-vel megelőzhető, a nem transzportábilis TBOA-val azonban nem (Martin et al., 2005). A transzportábilis és nem transzportábilis EAAT ligandumok eltérő hatása a fent ismertetett modell alapján magyarázható a t-PDC által kiváltott GABA felszabadulással, melyet a TBOA nem tudott kiváltani.
Szintén a transzportábilis EAAT szubsztrátokhoz köthető neuroprotektív mechanizmus állhat annak a megfigyelésnek a hátterében, mi szerint a t-PDC hippokampuszba történő in vivo adagolása esetén még rendkívül nagy t-PDC koncentráció (25-100 mM) esetén sem volt megfigyelhető az idegsejtek károsodása (Massieu et al., 1995; Sánchez-Carbente & Massieu, 1999; Massieu et al., 2000). Annak ellenére sem, hogy a t-PDC adagolás jelentős mértékben növelte az extracelluláris Glu szintet. Más transzportábilis EAAT szubsztrátok (threo-β-hidroxiaszpartát és L-aszpartátβ-hidroxamát) alkalmazása esetén szintén nem volt megfigyelhető sejtpusztulás (Massieu et al., 1995). Ezzel szemben a nem transzportábilis DHK adagolásának hatására kisebb mértékű extracelluláris Glu koncentráció növekedés is jelentős sejthalálhoz vezetett (Massieu & Tapia, 1997).
A fent ismertetett modell magyarázata lehet továbbá annak a megfigyelésnek, mely szerint EAAT szubsztrátokkal (t-PDC, L-Asp, D-Asp, threo-β-hidroxiaszpartát) történő előinkubálás Glu receptor- és fehérjeszintézis-független módon közel kétszeresére 55
növelte a Glu felvételi kapacitást (Munir et al., 2000). Az előinkubálás során ugyanis a GABA transzporterek megfordulhattak, és a párhuzamos Glu felvétel és GABA kibocsátás révén a Glu transzport hajtóereje, a transzmembrán Na+ ion gradiens a későbbi Glu adagolás során is folyamatosan fennmaradhatott.
A bevezetőben említett jelenség, mely szerint egészséges emberekben in vivo kimutattak Glu adagolás hatására bekövetkező Ca2+ ion-független GABA felszabadulást (During et al., 1995) ugyancsak magyarázható az általunk ismertetett folyamattal. Különös jelentőséget ad a megfigyelésnek az a tény, hogy temporális lebenyi epilepsziában szenvedő betegeknél ez a Glu által kiváltott GABA kibocsátás nem volt megfigyelhető (During et al., 1995).
5.2. Glutaminsav által kiváltott GABA kibocsátás fiziológiás jelentősége A Glu által kiváltott GABA felszabadulásról feltételezzük, hogy mind fiziológiás, mind patofiziológiás körülmények között jelen van. A folyamat fiziológiás jelentősége kísérleti
és
elméleti
megfontolásokkal
is
alátámasztható.
A
kiváltó
inger
valószínűsíthetően maga a Gluerg neuronális aktivitás, melyről ismert, hogy a gliális [Na+] emelkedéséhez vezet (Kirischuk et al., 2007). A Gluerg idegsejtek aktiválódását követően a Glu koncentrációja a szinaptikus résben 1-5 mM (Diamond & Jahr, 1997). A Glu kibocsátást követően ez a koncentráció természetesen csökken a diffúzió miatt, de a szinaptikus rés közelében koncentrálódó EAAT-k (Takayasu et al., 2005; Chaudry et al., 1995) még mindig 160-190 μM extracelluláris Glu koncentrációval szembesülnek (Dzubay and Jahr, 1999). A kísérletekben alkalmazott Glu koncentráció (100 μM) ezen határon belül van, tehát elmondható, hogy a fiziológiásan előforduló Glu koncentráció alkalmazásával a GABA felszabadulás kiváltható.
A Glu és GABA transzportok elméleti analízise szintén alátámasztja azt a hipotézist, miszerint a Glu által kiváltott GABA felszabadulás a normális idegrendszeri funkcióval együttjáró folyamat lehet. A Glu és GABA transzporterek ugyanis eltérő mértékben használják ki a sejtmembrán két oldala közötti [Na+] gradienst. A Glu
56
transzporterek 3 Na+ iont, míg a GABA transzporterek 2 Na+ iont transzportálnak, vagyis a Glu transzportereket erőteljesebb elektrokémiai gradiens működteti. Az elektrokémiai hajtóerők különbözőségéből adódóan elképzelhető olyan membránpotenciál, amelynél a Glu transzporterek a sejt belseje irányába, míg a GABA transzporterek az ellenkező irányban működnek azonos időben. Fiziológiás GABA, Na+ ion és Cl- ion koncentrációk mellett Richerson és Wu (Richerson & Wu, 2003) a Nernst-egyenlet alapján a GABA transzporterek megfordulási potenciálját -62 mV-ra becsülte. Ugyanezt a megközelítést alkalmazva a Glu transzporterek megfordulási potenciálja +47 mV-ra tehető. Megjegyzendő, hogy ezek a megfordulási potenciálok erőteljesen függnek a transzportban résztvevő ionok és ligandumok koncentrációjától, melyek maguk is folyamatosan változnak a transzport során, az abszolút értékek tehát fenntartással kezelendők. Szimulációk alapján azonban kijelenthető, hogy jelentősen különböző, de a fiziológiai értékeken belül lévő [Glu], [GABA], [Na+], [Cl-] és [K+] mellett minden esetben létezik egy olyan széles membránpotenciál-sáv, melyben a Glu transzporterek normál irányban, a GABA transzporterek pedig fordított irányban működnek.
A Glu által kiváltott GABA felszabadulás, vagyis a serkentő Glu cseréje a gátló GABA-ra a negatív visszacsatolás szerepét töltheti be a jelátvitel során. A szinapszisba kiürült Glu-t a glián lokalizálódó, a szinapszis közelében koncentráltan elhelyezkedő (Danbolt, 2001) Glu transzporterek veszik fel.
A Glu transzporterek membránbeli
sűrűsége a hippokampuszban 2300-8500 molekula/μm2 (Lehre & Danbolt, 1998) a teljes gliasejtre vonatkoztatva, vagyis a szinapszis közelében ennek akár többszörösét is elérheti. E rendkívül nagy sűrűségnek köszönhetően gyorsan ki tudják alakítani azt a szükséges intracelluláris [Na+] növekményt, mely elegendő a GABA transzporterek megfordulásához. Mivel a GABA transzporterek a szinapszistól távolabb helyezkednek el (Kinney & Spain, 2002), a leírt mechanizmus során felszabaduló GABA valószínűsíthető szerepe a neuronok tónikus gátlásának szabályozásában (Kinney, 2005) van, megerősítve a glia és a gliális transzporterek szerepét a serkentés és a gátlás közötti egyensúly fenntartásában (Schousboe, 2003).
57
A Glu által kiváltott GABA felszabadulás a fenti negatív visszacsatoláson kívül egy további fontos szerepet is betölthet a Glu és GABA transzportok összekapcsolása révén. A fordított irányú GABA transzport ugyanis nem csak a gátló neurotranszmitter GABA-t juttatja az extracelluláris térbe, hanem egyúttal a Na+ ionok kipumpálásával hozzásegíti a sejtet a nyugalmi Na+ ion gradiens visszaállításához. A Na+ ion gradiens GABA transzporteren keresztüli helyreállítása kettős célt szolgálhat. Egyrészt a sejt energiát takarít meg, mivel csökkenti az ATP-t hasznosító Na+/K+ pumpa terhelését. Másrészt a Na+ ion gradiens visszaállítása lehetőséget biztosít a Glu felvétel meggyorsítására, ami magyarázatot adhat arra az irodalomban leírt jelenségre, miszerint EAAT szubsztrátok a fehérjeszintézis befolyásolása nélkül képesek a Glu transzport aktivitás fokozására (Munir et al., 2000).
5.3. Glutaminsav által kiváltott GABA kibocsátás patofiziológiás jelentősége A Glu által kiváltott GABA felszabadulás a fiziológiás körülmények között észlelt hatáson túl patofiziológiás körülmények között is neuroprotektív szerepet kaphat. A mechanizmus
különösen
jelentőssé
válhat
olyan,
fokozott
serkentéssel
járó
betegségekben, mint például az epilepszia vagy az ischémia, ahol kulcsszerepet játszhat az extracelluláris Glu eltávolítása és/vagy hatásának kompenzálása. Temporális lebenyi epilpesziában szenvedő betegeknél valóban kimutatták a GAT-3 transzporterek expressziójának növekedését (Lee et al., 2006). A folyamat terápiás lehetőségeit tekintve pedig fontos, hogy két klinikai gyakorlatban alkalmazott, antiepileptikus hatású gyógyszerről, a clobazamról (Doi et al., 2005) és a levetiracetamról (Uead et al., 2007) is leírták, hogy hatásukat részben a GAT-3 expresszió fokozásával érik el.
A betegségek esetén in situ indukálódó folyamatok megismerése különösen jelentős lehet új gyógyszeres kezelési stratégiák kidolgozásakor. Tekintve, hogy a fent ismertetettek szerint a GAT-3 transzporterek felszíni kifejeződése epilepszia alatt megnő (Lee et al., 2006), az általunk leírt idegrendszeri Glu-GABA cserefolyamat révén a GAT-3 transzportereken keresztül a gátló folyamatok erősíthetőek. Reményeink szerint a Glu áltak kiváltott GABA felszabadulás mechanizmusának megismerése új, potenciálisan
58
patomechanizmus-szelektív gyógymódok kifejlesztéséhez vezethet az olyan, fokozott serkentéssel jellemzett betegségek esetében, mint az epilepszia vagy az ischémia.
5.4. Konklúzió Összefoglalva extracelluláris
GABA
elmondható, koncentráció
hogy
a
Glu
növekedéséhez
transzporterek vezet.
A
aktivációja
folyamatot
az nagy
valószínűséggel a gliális [Na+] változása közvetíti, melynek hatására a GAT-2/3 transzporterek megfordulnak, és GABA-t juttatnak az extracelluláris térbe.
59
Összegzés
A hosszú időn át uralkodó szemlélet szerint a neurotranszmitter transzporterek szerepe a szinaptikus jeláltvitel lezárása és a neurotranszmitterek újbóli elérhetővé tétele a következő jelátviteli folyamathoz. Az utóbbi évtizedben végzett kutatások szerint azonban a transzporterek számos más feladatot is ellátnak. Továbbra sem tisztázott azonban a központi idegrendszer fő gátló transzmitterének, a GABA-nak felvételét szolgáló gliális transzporterek szerepe. Célom az volt, hogy felismerjem ezen transzporterek funkcióját, illetve vizsgáljam a szintén gliasejteken lokalizálódó Glu transzporterekkel való esetleges kölcsönhatásukat.
Különböző
technikák
(felszabadulás
és
visszavétel
követése
radioaktív
nyomjelzéssel, in vivo mikrodialízis, mikrofluorimetria) alkalmazásával azonosítottam egy új típusú, Glu felvételével közvetlenül kiváltható folyamatot, amely GABA-t juttat az extracelluláris térbe. Igazoltam a gliális Glu-GABA cserefolyamat létét in különböző humán és patkány agyszövet szuszpenziókban, patkány hippocampus agyszeletben, valamint patkány hippocampusban in vivo. Megállapítottam, hogy a Glu felvételhez kötődő GABA felszabadulás bármely Glu transzporter szubsztráttal kiváltható és az ismert Glu receptorok gátlása esetén is fennmarad. Farmakológiai profiljából és Ca2+ ion függetlenségéből következően, a folyamat valószínűleg a GAT-2/3 transzporterek altípusokon keresztül zajlik. Nem transzportálódó EAAT blokkolók, valamint specifikus GAT-2/3 gátlók alkalmazásával a GABA felszabadulás meggátolható. Kimutattam továbbá, hogy a Glu és GABA transzporterek aktivációja között a gliális intracelluláris Na+ ion koncentráció változása teremti meg a kapcsolatot.
A kísérleti adatokra támaszkodva felvázoltam az extracelluláris Glu-GABA csere modelljét, mely közvetlen kapcsolatot teremt a központi idegrendszer fő gátló és serkentő folyamatai között, magyarázatot ad a gliális GABA transzporterek funkciójára, valamint új stratégiát nyújthat a fokozott Glu aktivitással járó agyi rendellenességek (pl. epilepszia, ischémia) kezelésében, új célfehérjét vonhat be az ezekkel kapcsolatos gyógyszerkutatásokba. 60
Summary
According to the long standing paradigm, the role of neurotransmitter transporters was to terminate synaptic signaling and replenish neuronal pool of neurotransmitters in order to allow the following transmission process. Accumulating evidence in the past decade have challenged this view of transporters. However, the role for glial transporters of GABA, the major inhibitory neurotransmitter of the central nervous system, has remained undisclosed. My purpose was to recognize the function of these transporters and to investigate the possible interplay between GABA and Glu transporters localized to glial cells.
Applying different techniques (radiotracer relesase and uptake studies, in vivo microdialysis, microfluorometry), a new mechanism was identified by which uptake of Glu by glial transporters is coupled to the subsequent reversal of the GABA transporters and brings about an elevation in the level of extracellular GABA. Evidence was presented on the existence of this glial Glu-GABA exchange process in vitro, using different human and rat brain tissue suspensions or rat hippocampal slices, as well as in the rat hippocampus in vivo. This GABA release can be evoked by substrate activaion of EAATs and is independent of Glu receptors. According to the pharmacological profile and the Ca2+ ion insensitivity of the transport, the GABA release is most probably mediated by GAT-2/3 transporter subtypes, and can be eliminated by non-transportable GAT-2/3 and EAAT blockers. The Glu and GABA transport processes were demondtrated to be coupled by the change of glial intracellular Na+ ion concentration.
Based on the results, I propose a model underlying the exchange of extracellular Glu for GABA. This model establishes a link between the major excitatory and inhibitory processes of the brain and provide a role for the glial GABA transporters. Furthermore, the previously unrecognized interplay between Glu and GABA transport processes may support the development of new pathomechanism-specific treatments for diseases characterized by intense Glu excitation, such as epilepsy or ischemia.
61
Felhasznált irodalom
Ali FE, Bondinell WE, Dandridge PA, Frazee JS, Garvey E, Girard GR, Kaiser C, Ku TW, Lafferty JJ, Moonsammy GI, Oh HJ, Rush JA, Setler PE, Stringer OD, Venlavsky JW, Volpe BW, Yunger LM, Zirkle CL. Orally active and potent inhibitors of γ-aminobutyric acid uptake. J. Med. Chem. 28, 653-660, 1985 Amara SG, Fontana AC. Excitatory amino acid transporters: keeping up with glutamate. Neurochem. Int. 41, 313-318, 2002 Arai T, Aoki M, Murakawa M, Nakao S, Mori K, Kurihara N. The effects of Halothane on the contents of putative transmitter amino acids in whole rat brain. Neurosci. Lett. 117, 353-357, 1990 Attwell D, Barbour B, Szatkowski M. Nonvesicular release of neurotransmitter. Neuron 11, 401-407, 1993 Attwell D, Laughlin SB. An energy budget for signalling in the grey matter of the brain. J. Cereb. Blood Flow. Metab. 21, 1133-1145, 2001 Auger C, Attwell D. Fast removal of synaptic glutamate by postsynaptic transporters. Neuron 28, 547–558, 2000 Barbour B, Häusser M. Intersynaptic diffusion of neurotransmitter. Trends Neurosci. 20, 377-384, 1997 Beart PM, O'Shea RD. Transporters for L-glutamate: an update on their molecular pharmacology and pathological involvement. Br. J. Pharmacol. 150, 5-17, 2007 Bonanno G, Raiteri L, Paluzzi S, Zappettini S, Usai C, Raiteri M. Co-existence of GABA and Glu tarnsporters in the central nervous system. Curr. Top. Med. Chem. 6, 979-988, 2006 Chatton JY, Shimamoto K, Magistretti PJ. Effects of glial glutamate transporter inhibitors on intracellular Na+ in mouse astrocytes. Brain Res. 893, 46-52, 2001
62
Chaudhry FA, Lehre KP, Campagne ML, Ottersen OP, Danbolt NC, Storm-Mathisen J. Glutamate transporters in glial plasma membranes: Highly differentiated localizations revealed by quantitative ultrastructural immunocytochemistry. Neuron 15, 711-20, 1995 Chen NH, Reith ME, Quick MW. Synaptic uptake and beyond: the sodium- and chloridedependent neurotransmitter transporter family SLC6. Eur. J. Phys. 5, 519-531, 2003 Chiu CS, Jensen K, Sokolova I, Wang D, Li M, Deshpande P, Davidson N, Mody I, Quick MW, Quake SR, Lester HA. Number, density, and surface/cytoplasmic distribution of GABA transporters at presynaptic structures of knock-in mice carrying GABA transporter subtype 1-green fluorescent protein fusions. J. Neurosci. 22, 10251-10266, 2002 Clements JD. Transmitter timecourse in the synaptic cleft: its role in central synaptic function. Trends Neurosci. 19, 163-171, 1996 Cohen-Kfir E, Lee W, Eskandari S, Nelson N. Zinc inhibition of γ-aminobutyric acid transporter 4 (GAT4) reveals a link between excitatory and inhibitory neurotransmission. PNAS 102, 6154-6159, 2005 Conti F, Minelli A, Melone M. GABA transporters in the mammalian cerebral cortex: localization, development and pathological implications. Brain Res. Brain Res. Rev. 45, 196-212, 2004 Corey JL, Davidson N, Lester HA, Brecha N, Quick MW. Protein kinase C modulates the activity of a cloned gamma-aminobutyric acid transporter expressed in Xenopus oocytes via regulated subcellular redistribution of the transporter. J. Biol. Chem. 269, 1475914767, 1994 Daikhin, Y., Yudkoff, M. Compartmentation of brain glutamate metabolism in neurons and glia J. Nutr. 130, 1026-1031, 2000 Dalby NO. Inhibition of gamma-aminobutyric acid uptake: anatomy, physiology and effects against epileptic seizures. Eur. J. Pharmacol. 479, 127-37, 2003 Dale, H. Transmission of Effects From Nerve-Endings. Oxford Univ. Press, Oxford, 1952
63
Danbolt NC. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105, 2001 Diamond JS, Jahr CE. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. J. Neurosci. 17, 4672–4687, 1997 Doi T, Ueda Y, Tokumaru J, Willmore LJ. Molecular regulation of glutamate and GABA transporter proteins by clobazam during epileptogenesis in Fe(+++)-induced epileptic rats. Brain Res. Mol. Brain Res. 142, 91-96, 2005 During MJ, Spencer DD. Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain. Lancet 341, 1607–1610, 1993 During MJ, Ryder KM, Spencer DD. Hippocampal GABA transporter function in temporallobe epilepsy. Nature 376, 174-177, 1995 Dzubay JA, Jahr CE. The concentration of synaptically released glutamate outside of the climbing fiber-Purkinje cell synaptic cleft. J. Neurosci. 19, 5265-74, 1999 Ferrie CD, Bird S, Tilling K, Maisey MN, Chapman AG, Robinson RO. Plasma amino acids in childhood epileptic encephalopathies. Epilepsy Res. 34, 221–229, 1999 Flores-Hernandez J, Galarraga E, Pineda JC, Bargas J. Patterns of excitatory and inhibitory synaptic transmission in the rat neostriatum as revealed by 4-AP. J. Neurophysiol. 72, 2246-2256, 1994 Gadea A, López-Colomé AM. Glial transporters for glutamate, glycine and GABA I. Glutamate transporters. J. Neurosci. Res. 63, 453-460, 2001 Gether U, Andersen PH, Larsson OM, Schousboe A. Neurotransmitter transporters: molecular function of important drug targets. Trends Pharmacol. Sci. 27, 375-83, 2006 Gutierrez R. The GABAergic phenotype of the "glutamatergic" granule cells of the dentate gyrus. Prog. Neurobiol. 71, 337-358, 2003 Gutiérrez R, Heinemann U. Co-existence of GABA and Glu in the hippocampal granule cells: implications for epilepsy. Curr. Top. Med. Chem. 6, 975-978, 2006
64
Héja L, Kovács I, Szárics É, Incze M, Temesváriné Major E, Dörnyei G, Peredy-Kajtár M, Gács-Baitz E, Szántay Cs, Kardos J. Novel secoergoline derivatives inhibit both GABA and glutamate uptake in rat brain homogenates: synthesis, in vitro pharmacology and modeling. J. Med. Chem. 47, 5620-5629, 2004 Héja L, Karacs K, Kardos J. Role for GABA and Glu plasma membrane transporters in the interplay of inhibitory and excitatory neurotransmission. Curr. Top. Med. Chem. 6, 989995, 2006 Héja L, Barabás P, Nyitrai G, Kékesi AK, Lasztóczi B, Tőke O, Tárkányi G, Madsen K, Schousboe A, Palkovits M, Kardos J. Sodium symport trades glial GABA in return for extracellular glutamate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA közlésre benyújtva 2007 Herman MA, Jahr CE. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741, 2007 Hoogland G, van Oort RJ, Proper EA, Jansen GH, van Rijen PC, van Veelen CW, van Nieuwenhuizen O, Troost D, de Graan PN. Alternative splicing of glutamate transporter EAAT2 RNA in neocortex and hippocampus of temporal lobe epilepsy patients. Epilepsy. Res. 59, 75–82, 2004 IIllievich UM, Zornow MH, Choi KT, Strnat MA, Scheller MS. Effects of hypotermia or anesthetics on hippocampal glutamate ang glygcine concentrations after repeated transient global cerebral ischemia. Anesthesiology 80, 177-186, 1994 Jabaudon D, Scanziani M, Gahwiler BH, Gerber U. Acute decrease in net glutamate uptake during energy deprivation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5610–5615, 2000 Jardetzky O. Simple allosteric model for membrane pumps. Nature 211, 969–970, 1966 Juhász G, Tarcali J, Pungor K, Pungor E. Electrochemical calibration of in vivo brain dialysis samplers. J. Neurosci. Methods. 29, 131-137, 1989 Kanner BI. Structure and function of sodium-coupled GABA and glutamate transporters. J. Membr. Biol. 213, 89-100, 2006
65
Kanner BI. Gate movements in glutamate transporters. ACS Chem. Biol. 2, 163-166, 2007 Kardos J, Kovács I, Simon-Trompler E, Hajós F. Enantioselectivity at the physiologically active GABAA receptor. Biochem. Pharmacol. 41, 1141-1144, 1991 Kardos J, Kovács I, Blandl T, Cash DJ. Modulation of GABA flux across rat brain membranes resolved by a rapid quenched incubation technique. Neurosci. Lett. 182, 7376, 1994 Keynan S, Kanner BI. γ-Aminobutyric acid transport in reconstituted preparations from rat brain: coupled sodium and chloride fluxes. Biochemistry 27, 12-17, 1988 Kékesi KA, Szilágyi N, Nyitrai G, Dobolyi A, Skuban N, Kardos J. Persistent depolarization and Glu uptake inhibition operate distinct osmoregulatory mechanisms in the mammalian brain. Neurochem. Int. 37, 171-178, 2000 Kinney GA. GAT-3 transporters regulate inhibition in the neocortex. J. Neurophysiol. 94, 4533-4537, 2005 Kinney GA, Spain WJ. Synaptically evoked GABA transporter currents in neocortical glia. Synaptically evoked GABA transporter currents in neocortical glia. J. Neurophysiol. 88, 2899-2908, 2002 Kirischuk S, Kettenmann H, Verkhratsky A. Membrane currents and cytoplasmic sodium transients generated by glutamate transport in Bergmann glial cells. Eur. J. Physiol. 454, 245-252, 2007 Kovács I, Lasztóczi B, Szárics É, Héja L, Sági G, Kardos J. Characterisation of an uridinespecific binding site in rat cerebrocortical homogenates. Neurohem. Int. 43, 101-112, 2003 Kovács I, Simon Á, Szárics É, Barabás P, Héja L, Nyikos L, Kardos J. Cyclothiazide binding to functional AMPA receptors reveals genuine allosteric interaction with agonist binding sites. Neurohem. Int. 44, 271-280, 2004
66
Krogsgaard-Larsen P, Frølund B, Frydenvang K. GABA uptake inhibitors. Design, molecular pharmacology and therapeutic aspects. Curr. Pharm. Des. 6, 1193-1209, 2000 Kumar D, Trent MB, Boor PJ. Allylamine and beta-aminopropionitrile induced aortic medial necrosis: mechanisms of synergism. Toxicology 125, 107-115, 1998 Lasztóczi B, Antal K, Nyikos L, Emri Z, Kardos J. High-frequency synaptic input contributes to seizure initiation in the low-[Mg2+] model of epilepsy. Eur. J. Neurosci. 19, 1361-1372, 2004 Lasztóczi B, Emri Zs, Szárics É, Héja L, Simon Á, Nyikos L, Kardos J. Suppression of neuronal network excitability and seizure-like events by 2-methyl-4-oxo-3H-quinazoline3-acetyl piperidine in juvenile rat hippocampus: Involvement of a metabotropic glutamate receptor. Neurochem. Int. 49, 41-54, 2006 Lee TS, Bjornsen LP, Paz C, Kim JH, Spencer SS, Spencer DD, Eid T, de Lanerolle NC. GAT1 and GAT3 expression are differently localized in the human epileptogenic hippocampus. Acta Neuropathol. (Berl.) 111, 351-363, 2006 Lehre KP, Danbolt NC. The number of glutamate transporter subtype molecules at glutamatergic synapses: chemical and stereological quantification in young adult rat brain. J. Neurosci. 18, 8751-8757, 1998 Li T, Qadri F, Moser A. Neuronal electrical high frequency stimulation modulates presynaptic GABAergic physiology. Neurosci. Lett. 371, 117-121, 2004 Liang SL, Carlson GC, Coulter DA. Dynamic regulation of synaptic GABA release by the glutamate-glutamine cycle in hippocampal area CA1. J. Neurosci. 26, 8537-8548, 2006 Lu CC, Hilgemann DW. GAT1 (GABA:Na+:Cl-) cotransport function. Steady state studies in giant Xenopus oocyte membrane patches. J. Gen. Physiol. 114, 429-444, 1999 Maragakis NJ, Dykes-Hoberg M, Rothstein JD. Altered expression of the glutamate transporter EAAT2b in neurological disease. Ann. Neurol. 55, 469–477, 2004
67
Maragakis NJ, Rothstein JD. Glutamate transporters: animal models to neurologic disease, Neurobiol. Dis. 15, 461–473, 2004 Martin ME, Munoz FM, Dickinson DA, Forman HJ, Martin del Rio R, Salinas M, Fando JL. Protective effect of L-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylic acid preload against cell death induced by oxygen/glucose deprivation in differentiated PC12 cells. J. Neurosci. Res. 82, 93-102, 2005 Massieu L, Morales-Villagran A, Tapia R. Accumulation of extracellular glutamate by inhibition of its uptake is not sufficient for inducing neuronal damage: an in vivo microdialysis study. J. Neurochem. 64, 2262–2272, 1995 Massieu L, Tapia R. Glutamate uptake impairment and neuronal damage in young and aged rats in vivo. J. Neurochem. 69, 1151–1160, 1997 Massieu L, Gómez-Román N, Montiel T. In vivo potentiation of glutamate-mediated neuronal damage after chronic administration of the glycolysis inhibitor iodoacetate. Exp. Neurol. 165, 257–267, 2000 Mathews GC, Diamond JS. Neuronal glutamate uptake contributes to GABA synthesis and inhibitory synaptic strength. J. Neurosci. 23, 2040-2048, 2003 Matthias K, Kirchhoff F, Seifert G, Huttmann K, Matyash M, Kettenmann H, Steinhauser C. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J. Neurosci. 23, 17501758, 2003 Meier SD, Kovalchuk Y, Rose CR. Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: Comparison with SBFI and confocal Na+ imaging. J. Neurosci. Meth. 155, 251-259, 2006 Melone M, Cozzi A, Pellegrini-Giampietro DE, Conti F. Transient focal ischemia triggers neuronal expression of GAT-3 in the rat perilesional cortex. Neurobiol. Dis. 14, 120– 132, 2003
68
Minta A, Tsien RY. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J. Biol. Chem. 264, 1944919457, 1989 Mittmann T, Luhmann HJ, Schimidt-Kastner R, Eysel UT, Weigel H, Heinemann U. Lesioninduced transient suppression of inhibitory function in rat neocortex in vitro. Neuroscience 60, 891– 906, 1994 Molnár T, Barabás P, Héja L, Fekete KE, Lasztóczi B, Szabó P, Nyitrai G, Simon-Trompler E, Hajós F, Palkovits M, Kardos J. Gamma-hydroxybutyrate binds to the synaptic site recognizing succinate monocarboxylate: a new hypothesis on astrocyte-neuron interaction via the protonation of succinate. J. Neurosci. Res. közlésre elfogadva, 2007 Montiel T, Camacho A, Estrada-Sánchez AM, Massieu L. Differential effects of the substrate inhibitor L-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylate (PDC) and the non-substrate inhibitor DL-threo-β-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) of glutamate transporters on neuronal damage and extracellular amino acid levels in rat brain in vivo. Neurosci. 133, 667–678, 2005 Moussa CE, Rae C, Bubb WA, Griffin JL, Deters DA, Balcar VJ. Inhibitors of glutamate transport modulate distinct patterns in brain metabolism. J. Neurosci. Res. 85, 342-350, 2007 Munir M, Correale DM, Robinson MB. Substrate-induced up-regulation of Na+dependent glutamate transport activity. Neurochem. Int. 37, 147-162, 2000 Nimmerjahn A, Kirchhoff F, Kerr JN, Helmchen F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods 1, 31-37, 2004 Nyitrai G, Kékesi KA, Juhász G. Extracellular level of GABA and Glu: in vivo microdialysisHPLC measurements. Curr. Top. Med. Chem. 6, 935-940, 2006 Palló A, Bencsura Á, Héja L, Beke T, Perczel A, Kardos J, Simon Á. Human γAminobutyrate Transporter: In Silico Prediction of Substrate Efficacy. Biochem. Bioph. Res. Co. közlésre elfogadva, 2007
69
Patel AB, Rothman DL, Cline GW, Behar KL. Glutamine is the major precursor for GABA synthesis in rat neocortex in vivo following acute GABA-transaminase inhibition. Brain Res. 919, 207-220, 2001 Pedersen B. Epilepsy in the elderly: the use of tiagabine. Epilepsia 42, 52-54, 2001 Radian R, Kanner BI. Stoichiometry of sodium- and chloride-coupled gammaaminobutyric acid transport by synaptic plasma membrane vesicles isolated from rat brain. Biochemistry 22, 1236-1241, 1983 Ren M, Yoshimura Y, Takada N, Horibe S, Komatsu Y. Specialized inhibitory synaptic actions between nearby neocortical pyramidal neurons. Science 316, 758-61, 2007 Richerson GB, Wu Y. Dynamic equilibrium of neurotransmitter transporters: not just for reuptake anymore. J. Neurophysiol. 90, 1363-1374, 2003 Rothstein JD, Van Kammen M, Levey AI, Martin LJ, Kuncl RW. Selective loss of glial glutamate transporter GLT-1 in amyotrophic lateral sclerosis. Ann. Neurol. 38, 73–84, 1995 Rothstein JD, Dykes-Hoberg M, Pardo CA, Bristol LA, Jin L, Kuncl RW, Kanai Y, Hediger MA, Wang Y, Schielke JP, Welty DF. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron 16, 675686, 1996 Rothstein JD, Patel S, Regan MR, Haenggeli C, Huang YH, Bergles DE, Jin L, Dykes Hoberg M, Vidensky S, Chung DS, Toan SV, Bruijn LI, Su ZZ, Gupta P, Fisher PB. β-Lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporter expression. Nature 433, 73–77, 2005 Rossi DJ, Oshima T, Attwell D. Glutamate release in severe brain ischaemia is mainly by reversed uptake. Nature 403, 316–321, 2000 Sánchez-Carbente MR, Massieu L. Transient inhibition of glutamate uptake in vivo induces neurodegeneration when energy metabolism is impaired. J. Neurochem. 72, 129–138, 1999 70
Sarup A, Larsson OM, Schousboe A. GABA transporters and GABA-transaminase as drug targets. Curr. Drug Targets CNS Neurol. Disord. 2, 269-277, 2003a Sarup A, Larsson OM, Bolvig T, Frolund B, Krogsgaard-Larsen P, Schousboe A. Effects of 3-hydroxy-4-amino-4,5,6,7-tetrahydro-1,2-benzisoxazol
(exo-THPO)
and
its
N-
substituted analogs on GABA transport in cultured neurons and astrocytes and by the four cloned mouse GABA transporters. Neurochem Int. 43, 445-51, 2003b Schiene K, Bruehl C, Zilles K, Qu M, Hagemann G, Kraemer M, Witte OW. Neuronal hyperexcitability and reduction of GABAAreceptor expression in the surround of cerebral phototrombosis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 906– 914, 1996 Schmitt A, Zink M, Petroianu G, May B, Braus DF, Henn FA. Decreased gene expression of glial and neuronal glutamate transporters after chronic antipsychotic treatment in rat brain. Neurosci Lett. 347, 81-84, 2003 Schousboe A. Role of astrocytes in the maintenance and modulation of glutamatergic and GABAergic neurotransmission. Neurochem. Res. 28, 347-352, 2003 Schousboe A, Waagepetersen HS. Glial modulation of GABAergic and glutamat ergic neurotransmission. Curr. Top. Med. Chem. 6, 929-934, 2006 Schousboe A, Waagepetersen HS. GABA: Homeostatic and pharmacological aspects. Prog. Brain Res. 160, 9-19, 2007 Seal RP, Amara SG. Excitatory amino acid transporters: a family in flux. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39, 431–456, 1999 Sepkuty JP, Cohen AS, Eccles C, Rafig A, Behar K, Ganel R, Coulter DA, Rothstein D. A neuronal glutamate transporter contributes to neurotransmitter GABA synthesis and epilepsy. J. Neurosci. 22, 6372-6379, 2002 Shao LR, Dudek FE. Increased excitatory synaptic activity and local connectivity of hippocampal CA1 pyramidal cells in rats with kainate-induced epilepsy. J. Neurophysiol. 92, 1366-1373, 2004
71
Sills GJ. Pre-clinical studies with the GABAergic compounds vigabatrin and tiagabine. Epileptic Disord. 5, 51-56, 2003 Simon Á, Bencsura Á, Palló A, Héja L, Kardos J. Emerging the role of the structure of brain membrane targets recognizing glutamate. Curr. Drug Disc. Tech. 5, 000-000 2008 Slotboom DJ, Konings WN, Lolkema JS. Structural features of the glutamate transporter family. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 293–307, 1999 Somogyi J, Baude A, Omori Y, Shimizu H, Mestikawy SE, Fukaya M, Shigemoto R, Watanabe M, Somogyi P. GABAergic basket cells expressing cholecystokinin contain vesicular glutamate transporter type 3 (VGLUT3) in their synaptic terminals in hippocampus and isocortex of the rat. Eur. J. Neurosci. 19, 552-569, 2004 Sonnewald U, Olstad E, Qu H, Babot Z, Cristofol R, Sunol C, Schousboe A, Waagepetersen H. First direct demonstration of extensive GABA synthesis in mouse cerebellar neuronal cultures. J. Neurochem. 91, 796-803, 2004 Strata P, Harvey R. Dale's principle. Brain Res. Bull. 50, 349-50, 1999 Susarla BT, Seal RP, Zelenaia O, Watson DJ, Wolfe JH, Amara SG, Robinson MB. Differential regulation of GLAST immunoreactivity and activity by protein kinase C: evidence for modification of amino and carboxyl termini. J. Neurochem. 91, 1151-1163, 2004 Sze-Chuh C, Brunner EA. Inhibition of GABA metabolism in rat brain slices by Halothane. Anesthesiol. 55, 26-33, 1981 Takayasu Y, Iino M, Kakegawa W, Maeno H, Watase K, Wada K, Yanagihara D, Miyazaki T, Komine O, Watanabe M, Tanaka K, Ozawa S. Differential roles of glial and neuronal glutamate transporters in Purkinje cell synapses. J. Neurosci. 25, 8788-8793, 2005 Tanaka K, Watase K, Manabe T, Yamada K, Watanabe M, Takahashi K, Iwama H, Nishikawa T, Ichihara N, Kikuchi T, Okuyama S, Kawashima N, Hori S, Takimoto M, Wada K. Epilepsy and exacerbation of brain injury in mice lacking the glutamate transporter GLT-1. Science 276, 1699-1702, 1997 72
Thomas P, Smart TG. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 51, 187-200, 2005 Ueda Y, Doi T, Nagatomo K, Tokumaru J, Takaki M, Willmore LJ. Effect of levetiracetam on molecular regulation of hippocampal glutamate and GABA transporters in rats with chronic seizures induced by amygdalar FeCl3 injection. Brain. Res. 1151, 55-61, 2007 White HS, Sarup A, Bolvig T, Kristensen AS, Petersen G, Nelson N, Pickering DS, Larsson OM, Frolund B, Krogsgaard-Larsen P, Schousboe A. Correlation between anticonvulsant activity and inhibitory action on glial gamma-aminobutyric acid uptake of the highly selective mouse gamma-aminobutyric acid transporter 1 inhibitor 3-hydroxy-4-amino4,5,6,7-tetrahydro-1,2-benzisoxazole and its N-alkylated analogs. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 636-644, 2002 Wu Y, Wang W, Richerson GB. GABA transaminase inhibition induces spontaneous and enhances depolarization-evoked GABA efflux via reversal of the GABA transporter. J. Neurosci. 21, 2630-2639, 2001 Wu K, Leung LS. Increased dendritic excitability in hippocampal ca1 in vivo in the kainic acid model of temporal lobe epilepsy: a study using current source density analysis. Neuroscience 116, 599-616, 2003 Wu Y, Wang W, Richerson GB. The transmembrane sodium gradient influences ambient GABA concentration by altering the equilibrium of GABA transporters. J. Neurophysiol. 96, 2425-2436, 2006 Yamashita A, Singh SK, Kawate T, Jin Y, Gouaux E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437, 215-23, 2005 Yernool D, Boudker O, Jin Y, Gouaux E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature 431, 811-818, 2004 Zerangue N, Kavanaugh MP. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature 383, 634-637, 1996 73
Zink M, Schmitt A, May B, Muller B, Braus DF, Henn FA. Differential effects of long-term treatment
with
clozapine
or
haloperidol
on
GABA
transporter
expression.
Pharmacopsychiatry. 37, 171-174, 2004 Zomot E, Bendahan A, Quick M, Zhao Y, Javitch JA, Kanner BI. Mechanism of chloride interaction with neurotransmitter:sodium symporters. Nature 449, 726-730, 2007
74
Köszönetnyilvánítás
Mindenek előtt köszönöm témavezetőmnek, Kardos Juliannának a kitartó támogatást, a kísérletek tervezése és kivitelezése során nyújtott rengeteg gyakorlati tanácsot, az eredmények értékelése során nyújtott elméleti segítséget és a munkámhoz nélkülözhetetlen dologi és műszeres háttér megteremtését és folyamatos gondos fenntartását. Külön köszönöm a publikációk és a disszertáció elkészítése során végzett fáradhatatlan munkáját.
Köszönetet mondok Pálinkás Gábor főigazgató, Hajós György igazgató és Benussi Silvio Antonio gadasági igazgató uraknak a kutatási feltételek megteremtéséért.
Köszönettel tartozom minden munkatársamnak a hasznos és előremutató, kritikus szakmai vitákért, és a kitartó támogatásért. Külön köszönettel tartozom Barabás Péternek, Nyitrai Gabriellának, Lasztóczi Bálintnak, Kútiné Fekete Erzsébetnek, Simon Ágnesnek,
Tárkányi
Gábornak,
Tőke
Orsolyának
és
Kékesi
Katalinnak,
akik
együttműködően és fáradhatatlanul végezték a kísérletes munkát, és mindig jó tanácsokkal támogattak, ha munkám során technikai vagy intellektuális nehézségekbe ütköztem. Köszönöm Palkovits Miklósnak a humán agyminták biztosítását, Aren Schousboe-nak pedig a GAT-2 fehérjét expresszáló sejtvonal adományozását.
Köszönöm az anyagi támogatást a Kémiai Kutatóközpontnak, az első és a második MediChem projetnek (NKFP1/047 (Medichem); MediChem2 NKFP 1/A/005/2004), a Center of Excellence on Biomolecular Chemistry (QLK2-CT-2002-90436, EU), és a Transzporter Explorer (AKF-050068) pályázatoknak.
75
Melléklet
Héja L, Kovács I, Szárics É, Incze M, Temesváriné Major E, Dörnyei G, Peredy-Kajtár M, Gács-Baitz E, Szántay Cs, Kardos J. Novel secoergoline derivatives inhibit both GABA and glutamate uptake in rat brain homogenates: synthesis, in vitro pharmacology and modeling. J. Med. Chem. 47, 5620-5629, 2004 Héja L, Karacs K, Kardos J. Role for GABA and Glu plasma membrane transporters in the interplay of inhibitory and excitatory neurotransmission. Curr. Top. Med. Chem. 6, 989995, 2006 Héja L, Barabás P, Nyitrai G, Kékesi AK, Lasztóczi B, Tőke O, Tárkányi G, Madsen K, Schousboe A, Palkovits M, Kardos J. Sodium symport trades glial GABA in for extracellular glutamate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA közlésre benyújtva 2007 Kovács I, Lasztóczi B, Szárics É, Héja L, Sági G, Kardos J. Characterisation of an uridinespecific binding site in rat cerebrocortical homogenates. Neurohem. Int. 43, 101-112, 2003 Kovács I, Simon Á, Szárics É, Barabás P, Héja L, Nyikos L, Kardos J. Cyclothiazide binding to functional AMPA receptors reveals genuine allosteric interaction with agonist binding sites. Neurohem. Int. 44, 271-280, 2004 Lasztóczi B, Emri Zs, Szárics É, Héja L, Simon Á, Nyikos L, Kardos J. Suppression of neuronal network excitability and seizure-like events by 2-methyl-4-oxo-3H-quinazoline3-acetyl piperidine in juvenile rat hippocampus: Involvement of a metabotropic glutamate receptor. Neurochem. Int. 49, 41-54, 2006 Molnár T, Barabás P, Héja L, Fekete KE, Lasztóczi B, Szabó P, Nyitrai G, Simon-Trompler E, Hajós F, Palkovits M, Kardos J. Gamma-hydroxybutyrate binds to the synaptic site recognizing succinate monocarboxylate: a new hypothesis on astrocyte-neuron interaction via the protonation of succinate. J. Neurosci. Res. közlésre elfogadva, 2007
76
Palló A, Bencsura Á, Héja L, Beke T, Perczel A, Kardos J, Simon Á. Human γAminobutyrate Transporter: In Silico Prediction of Substrate Efficacy. Biochem. Biophys. Res. Comm. közlésre elfogadva, 2007 Simon Á, Bencsura Á, Palló A, Héja L, Kardos J. Emerging the role of the structure of brain membrane targets recognizing glutamate. Curr. Drug Disc. Tech. 5, 000-000, 2008
77
